CN103068978B

CN103068978B - 具有前导序列功能的多核苷酸

Info

Publication number: CN103068978B
Application number: CN201180041006.8A
Authority: CN
Inventors: 宇田川裕晃; 平理佳子; 高木忍
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-23
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2031-06-23
Also published as: DK2585591T3; US20130095525A1; US9222095B2; CN103068978A; WO2011161206A1; EP2585591A1; EP2585591B1; US20160068847A1; US9657300B2

Abstract

本发明涉及具有前导序列功能的分离的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用所述多核苷酸产生多肽的方法。

Description

具有前导序列功能的多核苷酸

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及具有前导序列功能的多核苷酸。具体而言，本发明涉及在真菌宿主细胞中具有前导序列功能的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。

背景技术

在真菌宿主细胞，特别是丝状真菌宿主细胞如曲霉属(Aspergillus)细胞中异源蛋白的重组产生，可对于以商业上重要的量产生所述蛋白提供更理想的媒介。

异源蛋白的重组产生一般通过下述实现：构建表达盒，其中编码所述蛋白的DNA置于启动子的表达调控下，所述启动子是从受调节的基因切出的，且适于宿主细胞。将所述表达盒导入宿主细胞。然后，通过在表达盒上所包含的启动子的正常功能所需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现异源蛋白的产生。

蛋白的重组表达的改善一般需要新的调节序列的可用性，所述调节序列适于在宿主细胞中调控所述蛋白的表达。所述调节序列可为合适的前导序列，其为对于宿主细胞翻译重要的mRNA的未翻译区。前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。

用于丝状真菌宿主细胞的公知的前导序列之前已从例如对于米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)丙糖磷酸异构酶的基因获得。

本发明的一个目的是提供用于在真菌宿主细胞中使用的新前导序列，并进一步提供用于在真菌宿主细胞中使用所述新前导序列产生多肽的改善的方法。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及具有前导序列功能的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1或2具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性；

(b)多核苷酸，其在优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:1或2的多核苷酸杂交；

(c)SEQ ID NO:1或2的包含一个或多个(几个)核苷酸的取代、缺失和/或插入的变体。

本发明进一步涉及包含本发明的第一个方面的分离的多核苷酸的核酸构建体如表达载体和质粒，以及宿主细胞。

最后，本发明涉及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。

定义

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trendsin Genetics16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有作为前导序列发挥功能的能力。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列或其同源序列的至少10个核苷酸，更优选至少25个核苷酸，和甚至更优选至少50个核苷酸，且最优选75个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(多核苷酸的功能无变化)或其可导致改变的多核苷酸的功能。具有前导序列功能的多核苷酸的等位变体是来源于基因的等位变体、具有前导序列功能的多核苷酸。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”在本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面，所述变体如通过琼脂糖凝胶电泳测定的，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，更优选至少80%纯，且最优选至少90%纯。

核酸构建体：如用于本文中术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：在本文中术语“调控序列”定义为包括在本发明的方法中对多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于多核苷酸序列可以是天然的或异源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或异源的。这些调控序列包括但不限于聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

启动子：术语“启动子”在本文中定义为由宿主细胞识别用于表达可操作连接于所述启动子的的多核苷酸序列的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导所述多核苷酸序列转录的转录调控序列。所述启动子可为任何在所选的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并可从同源于或异源于宿主细胞、编码胞外或胞内多肽的基因获得。启动子具有复杂的区段-模块结构，并含有许多小的功能元件如转录因子结合位点、RNA聚合酶识别位点、mRNA起始位点。这些序列不具有准确的统一位置，并分散于转录起始的mRNA起始位点上游多至1kb的5’-侧翼区。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文中表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导该多肽的编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文中定义为线性的或环状的DNA分子，其包含具有编码本发明的多肽的多核苷酸，并与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：“宿主细胞”用于本文中包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

发明详述

5’未翻译区(5’UTR)的前导序列

前导序列通常理解为mRNA的未翻译区，意指其被转录，但不被翻译。相应的DNA序列位于启动子和基因的编码序列之间，且该前导序列对于宿主细胞的翻译是重要的。所述前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。启动子序列是由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导所述多肽表达的转录调控序列。本发明的前导序列(或5’未翻译区)在+1位置的转录起始位点开始，并正好在编码区的起始密码子(通常为AUG)之前结束。因此，其会在mRNA起始位点的下游和编码多肽的结构基因的上游。其通常含有核糖体结合位点。前导序列的选择如上所述会影响下游基因的表达水平。之前，对于在丝状真菌中最优表达的优选的前导序列已从对于米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

在一个优选的方面，本发明的核苷酸序列包含或组成为SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2。

本发明亦涉及分离的多核苷酸，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少60%，优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%或至少99%序列同一性程度，且具有前导序列功能。

可对于显示为SEQ ID NO:1的核苷酸序列进行修饰，例如其亚序列，和/或通过导入一个或几个核苷酸取代，而不显著影响其功能。SEQ ID NO:2代表此种修饰，因为其为从相同菌种黑曲霉的另一个菌株分离的相同前导序列的另一个变体。

本发明亦涉及分离的多核苷酸，其通过以下获得：(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中等-高、高或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的核苷酸序列杂交。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与编码序列和一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导所述编码序列的表达。

调控序列可为启动子序列，其为由用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导所述多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶。大多数这些启动子会天然地与位于启动子及其调控的基因之间的非翻译前导序列相联。预见将该前导序列用本发明的前导序列替代。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,MolecularCellular Biology15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽的氨基端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸，启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达编码序列的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。

可以将包含本发明的多核苷酸的多于一个拷贝的核酸构建体插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸的拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸可操作地连接于编码序列和一个或多个(几个)调控序列。将包含本发明多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞亦可为例如真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属细胞(Yarrowia)。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母细胞(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,Journal of Bacteriology153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA75:1920。

产生方法

本发明亦涉及产生感兴趣的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞为曲霉属、镰孢属或木霉属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是黑曲霉、米曲霉、禾本科镰孢或里氏木霉的细胞。在一个最优选的方面，所述细胞是黑曲霉细胞。

在本发明的产生方法中，在适于使用本领域公知的方法产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。若该多肽分泌到营养培养基中，则该多肽能够从所述培养基中直接回收。若该多肽不分泌至培养基中，其可从细胞裂解液回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于确定如本文中所述的多肽的活性。

所得多肽可使用本领域已知方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

使用本发明的多核苷酸产生的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视为对本发明的范围的限制。

实施例

材料和方法

方法

分子克隆技术描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecularcloning:a laboratory manual(第2版)Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York。

酶

用于DNA操作的酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等)可从New EnglandBiolabs,Inc.获得，并可根据生产商的指示使用。

培养基和试剂

用作缓冲液和底物的化学品为分析级的商品。

Cove-N(tf)平板组成为342.3g的蔗糖，20ml的Cove盐溶液，3g的NaNO₃，和30g的Noble Agar，加水至1升。

Cove-N平板组成为30g的蔗糖，20ml的Cove盐溶液，3g的NaNO₃，和30g的NobleAgar，加水至1升。

COVE盐溶液组成为26g KCl，26g MgSO₄·7H₂O，76g KH₂PO₄和50mlCove痕量金属，加水至1升。

COVE的痕量金属溶液组成为0.04g NaB₄O₇·10H₂O，0.4g的CuSO₄·5H₂O，1.2g的FeSO₄·7H₂O，1.0g的MnSO₄·H₂O，0.8g的中性淀粉酶II MoO₂·2H₂O，和10.0g的ZnSO₄·7H₂O，加水至1升。

Cove-N顶层琼脂糖(top agarose)组成为342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，3g的NaNO₃，和10g的低熔点琼脂糖，加水至1升。

淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液组成为6.8g ZnCl₂·7H₂O，2.5g CuSO₄·5H₂O，0.24gNiCl₂·6H₂O，13.9g FeSO₄·7H₂O，13.5g MnSO₄·H₂O和3g柠檬酸，加水至1升。

YPG组成为4g的酵母提取物，1g的KH₂PO₄，0.5g的MgSO₄·7H₂O和15g的葡萄糖(pH6.0)，加水至1升。

STC缓冲液组成为0.8M的山梨糖醇，25mM的Tris(pH8)，和25mM的CaCl₂，加水至1升。

STPC缓冲液组成为STC缓冲液中的40%PEG4000。

MLC组成为40g葡萄糖，50g大豆粉，4g/柠檬酸(pH5.0)，加水至1升。

MSS组成为70g蔗糖，100g大豆粉(pH6.0)，加水至1升。

MU-1组成为260g的麦芽糊精，3g的MgSO₄·7H₂O，5g的KH₂PO₄，6g的K₂SO₄，淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液0.5ml和尿素2g(pH4.5)，加水至1升。

购买的材料(大肠杆菌，质粒和试剂盒)

将大肠杆菌DH5-alpha(Toyobo)用于质粒构建和扩增。将商业性质粒/载体TOPOCloning Kit(Invitrogen)和pBlue script II SK-(Stratagene#212206)用于克隆PCR片段。扩增的质粒用Plasmid Kit(Qiagen)回收。连接用DNA Ligation Kit(Takara)或T4DNA连接酶(Boehringer Mannheim)进行。聚合酶链式反应(PCR)用Expand ^TM PCR系统(Boehringer Mannheim)进行。将QIAquick^TM Gel Extraction Kit(Qiagen)用于从琼脂糖凝胶纯化PCR片段和提取DNA片段。

菌株

将构巢曲霉菌株NRRL1092用作木聚糖酶基因启动子和硝酸还原酶基因终止子的供体。

表达宿主菌株黑曲霉QMJi016-14-1由Novozymes分离，且为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。QMJi016-14-1经遗传修饰以破坏ku70、oah和pyrG的表达。

表达宿主菌株黑曲霉NN059180(pyrG–)由Novozymes分离并为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。NN059180经遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性的表达。黑曲霉NN059180中的中性蛋白酶I基因由大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因打断。

米曲霉Bech2描述于WO00/39322实施例1。

描述于WO2006069289的米曲霉菌株#13-1由Novozymes分离。

质粒

表达盒质粒pJaL790(描述于专利公开WO2005070962)

表达盒质粒pHUda440(描述于专利公开WO2006/069289)

表达盒质粒pCBPhycutiprepro(描述于专利公开WO2008/017646)

pJaL574描述于WO07045248中的实施例9

黑曲霉的转化

曲霉属菌种的转化可使用一般的用于酵母转化的方法实现。对于本发明的优选步骤如下所述。

将黑曲霉宿主菌株接种至补充10mM尿苷的100ml的YPG培养基，并在32℃以80rpm温育16小时。收集沉淀，并用0.6M KCl洗涤，并重悬于含有20mg每ml的最终浓度的商业性β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX^TM,Novozymes A/S,Denmark)的20ml0.6M KCl。将悬液在32℃以80rpm温育直至形成原生质体，然后用STC缓冲液洗涤两次。将原生质体用血细胞计数器计数，并重悬，并调整于STC:STPC:DMSO为8:2:0.1溶液中至2.5x10⁷个原生质体/ml的终浓度。将大约4μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体悬液，轻柔的混合，并在冰上温育30分钟。添加一ml的SPTC，并将原生质体悬液在37℃温育30分钟。在添加10ml的50℃Cove-N顶层琼脂糖之后，将反应倾至Cove-N(tf)琼脂平板上，并将平板在32℃温育5日。

PCR扩增

PCR条件

用于葡糖淀粉酶产生的SF培养

将选定的转化体的孢子接种于100ml的MLC培养基并在30℃培养2日。将10ml的MLC接种至100ml的MU-1培养基，并在30℃培养7日。上清通过离心获得。

用于肌醇六磷酸酶产生的SF培养

将选定的转化体的孢子接种于100ml的MSS培养基并在30℃培养2日。将10ml的MSS接种至100ml的MU-1培养基，并在32℃培养3日。上清通过离心获得。

Southern杂交

将选定的转化体的菌丝体从100ml YPG培养基中的过夜培养收获，用蒸馏水漂洗，干燥，并冻结于-80℃。将磨碎的菌丝体用蛋白酶K和RNaseA在65℃温育1小时。回收基因组DNA，即酚/CHCl3提取两次，接着进行EtOH沉淀，并重悬于蒸馏水。

非放射性探针使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis IN)遵循生产商的指示合成。将DIG标记的探针使用QIAquickTM GelExtraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的指示进行凝胶纯化。

将五微克的基因组DNA用合适的限制性酶完全消化16小时(40μl总体积，4U酶/μlDNA)，并在0.8%琼脂糖凝胶上运行。将DNA在凝胶中通过用0.2M HCl处理来片段化，变性(0.5M NaOH,1.5M NaCl)，和中和(1M Tris,pH7.5;1.5M NaCl)，以供后续在20X SSC中转移至Hybond N+膜(Amersham)。将DNA UV交联于膜，并在42℃在20ml DIG Easy Hyb(RocheDiagnostics Corporation,Mannheim,Germany)中预杂交1小时。将变性的探针直接添加于DIG Easy Hyb缓冲液，并进行在42℃的过夜杂交。在后杂交洗涤(在2X SSC中在室温进行两次，每次5分钟，和在0.1X SSC中在68℃进行两次，每次15分钟)之后，遵循生产商的指示进行使用DIG检测系统和CPD-Star(Roche)的化学发光检测。将DIG标记的DNA MolecularWeight Marker II(Roche)用作标准物标记。

肌醇六磷酸酶测定法

1FYT-V是在下述标准条件下每分钟释放1μmol无机磷酸的酶量。

将75μl/孔酶溶液(稀释于0.25M乙酸钠，0.005%Tween-20，pH5.5)分配于96孔微滴定板，然后添加75μl底物(0.25M乙酸钠缓冲液pH5.5中10mg/ml来自大米的肌醇六磷酸钠(Aldrich274321;MW923.8))并将平板在37℃温育15分钟。反应通过添加75μl终止试剂(10.9%硝酸中2.5%七钼酸铵和0.06%钒酸铵)来终止。

对于96孔微滴定板中的100μl样品测量在405nm的吸光度。

葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性以淀粉葡糖苷酶单位(AGU)测量。AGU定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为：37℃，pH4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M乙酸，反应时间5分钟。

可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加至葡萄糖脱氢酶试剂使得任何存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在上述反应中与β-D-葡萄糖起特异性反应，形成NADH，其使用光度计在340nm作为原始葡萄糖浓度的量度来确定。

淀粉葡糖苷酶温育：

颜色反应：

实施例1：在黑曲霉中通过中性淀粉酶II启动子与不同的5’未翻译区序列组合调控的柠檬酸杆菌属(Citrobacter)肌醇六磷酸酶的表达

pHUda666的构建

基于WO2006069289中的核苷酸序列信息，设计下述引物TCGA-F和TCGA-R(其分别导入BamHI和XhoI位点)以分离TC葡糖淀粉酶的cDNA。

TCGA-F：tgggggatccaccatgcgtttcacgctcct(SEQ ID NO:3)

TCGA-R：ctcgagttaattaactaccgccaggtgtcgttc(SEQ ID NO:4)

使用引物对TCGA-F和TCGA-R进行用米曲霉菌株#13-1(公开于WO2006069289)的cDNA作为模板的PCR反应。将反应产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上分离，并从凝胶切出1.7kb产物条带。将1.7kb扩增的DNA片段用BamHI和XhoI消化，并连接入用BamHI和XhoI消化的曲霉属表达盒pJaL790。

具有终止子重复序列的构巢曲霉pyrG基因的克隆

基于构巢曲霉的基因组数据库中的核苷酸序列信息设计下述引物nidP-f和nidP-r(其分别导入NheI/SpeI和XbaI/SphI位点)以扩增构巢曲霉pyrG基因。

nidP-f：tttgctagcactagttactaaatgacgtttgtgaac(SEQ ID NO:5)

nidP-r：ttgcatgctctagaggagcgaaccaattctc(SEQ ID NO:6)

用引物对nidP-F和nidP-R进行用构巢曲霉NRRL1092的基因组DNA作为模板的PCR反应。将反应产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上分离，并从凝胶切出1.8kb产物条带。

将1.8kb扩增的DNA片段使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)遵循生产商的指示连接。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建质粒pHUda795。

基于构巢曲霉的基因组数据库中的核苷酸序列信息设计下述引物nidPT-f和nidPT-r(其分别导入SpeI和XbaI位点)以扩增构巢曲霉pyrG基因终止子区。

nidPT-f：tttactagtacgagaaaagagttggact(SEQ ID NO:7)

nidPT-r：tttctagagcgaaccaattctctcccagc(SEQ ID NO:8)

用引物对nidPT-F和nidPT-R进行用构巢曲霉NRRL1092的基因组DNA作为模板的PCR反应。将反应产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上分离，并从凝胶切出0.3kb产物条带。将0.3kb扩增的DNA片段用SpeI和XbaI消化，并连接入用SpeI消化的pHUda795。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建质粒pHUda797。

pTrapyrG的构建

通过NheI和SphI消化从pHUda797回收含有构巢曲霉pyrG基因及其终止子重复序列的2.1kb DNA片段。将回收的2.1kb片段连接入XbaI和SphI消化的pHUda666。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒pTrapyrG。质粒pTrapyrG包含TC葡糖淀粉酶的表达盒，该表达盒基于三个拷贝的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(置于同一方向)，构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译5’未翻译区序列，其融合于最后一个黑曲霉中性淀粉酶II启动子(三重NA2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG及其终止子重复序列。

pTK的构建

通过HindIII和SpeI消化从pJaL574回收含有单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的2.5kb DNA片段。将回收的2.5kb片段连接至HindIII和SpeI消化的pBlue script IISK-。将连接混合物转移至大肠杆菌DH5α以构建表达载体pTK。

pTK-5NA1的构建

基于黑曲霉的基因组数据库中的核苷酸序列信息设计了下述引物5NA1F和5NA1R(其分别导入PmeI和NheI/SpeI位点)以扩增中性淀粉酶I(NAI)基因的黑曲霉5’侧翼区。

5NA1F：gtttaaacctatctgttccctccccccc(SEQ ID NO:9)

5NA1R：tttactagtgctagctgacttctatataaaaatgagta(SEQ ID NO:10)

用引物对5NA1F和5NA1R进行用黑曲霉NN059180的基因组DNA作为模板的PCR反应。将反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上分离，并将1.8kb产物条带从凝胶切出。将1.8kb扩增的DNA片段用PmeI和NheI消化，并连接至PmeI和SpeI消化的pTK。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建质粒pTK-5NA1。

pTK-5NA1-3NA1的构建

基于黑曲霉的基因组数据库中的核苷酸序列信息设计了下述引物3NA1F和3NA1R(其分别导入XbaI和NotI位点)以扩增中性淀粉酶I(NAI)基因的黑曲霉3’侧翼区。

3NA1F：tttctagagtatatgatggtactgctattc(SEQ ID NO:11)

3NA1R：gcggccgcgcattctcctagttactgatgact(SEQ ID NO:12)

用引物对3NA1F和3NA1R进行用黑曲霉NN059180的基因组DNA作为模板的PCR反应。将反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上分离，并将1.4kb产物条带从凝胶切出。将1.4kb扩增的DNA片段用XbaI和NotI消化，并连接至XbaI和NotI消化的pTK-5NA1。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建质粒pTK-5NA1-3NA1。

pIH142的构建

通过NheI和XbaI从pTrapyrG回收含有TC葡糖淀粉酶表达盒和pyrG及其来自构巢曲霉的终止子重复序列的的6.2kb DNA片段。将回收的6.2kb片段连接至XbaI消化的pTK-5NA1-3NA1。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒pIH142。

prika156的构建

使用pCBPhy-cutiprepro作为模板，用引物对p384和p387，或者p385和p386扩增与腐质霉属角质酶信号序列融合的合成的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的一部分。从琼脂糖凝胶回收两种获得的PCR片段。然后，使用用p384和p387，以及p385和p386扩增的PCR片段，用引物对p384和p386进行SOE-PCR(通过重叠延伸PCR的剪接)。从琼脂糖凝胶回收获得的含有信号+pro+柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的PCR片段，并用NheI和PacI消化。将回收的1.3kb片段连接于经NheI和PacI消化的pIH142。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒prika156。

p384aagtcagctagccgtcggtgtgatggaaatcc(SEQ ID NO:13)

p385tcaaaattgaggatttagtcttgatcggatctccaccatgaagttctt(SEQ ID NO:14)

p386acccggatcttaattaactactctgtgac(SEQ ID NO:15)

p387aagaacttcatggtggagatccgatcaagactaaatcctcaattttga(SEQ ID NO:16)

prika161的构建

使用引物p264和p310通过PCR扩增与来自黑曲霉CBS513.88SEQ IDNO:1的推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区组合的不含其5’未翻译区的黑曲霉中性淀粉酶II启动子。

p264ttcgctagcatggtgttttgatc(SEQ ID NO:17)

p310tggtggatccgatcaagactaaatcctcaattttgaagaatttgtgttgtctgagttcagactcgagatgaattgatattggtgttctgagattgttgctccaagcatggcatccctt(SEQ ID NO:18)

基于黑曲霉CBS513.88的序列信息设计了推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区的序列，且该序列示于SEQ ID NO:1。

将获得的、与推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区组合的不含其5’未翻译区的黑曲霉中性淀粉酶II启动子的0.6kb PCR片段从琼脂糖凝胶回收，并用NheI和BamHI消化，并连接入用BglII和NheI消化的prika156。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒prika161。prika161包含基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的表达盒，推定的烷基硫酸酯酶基因的黑曲霉5’未翻译区，其融合于黑曲霉中性淀粉酶II启动子(NA2/pas启动子)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG及其终止子重复序列，在构巢曲霉甘油磷酸脱氢酶(gpd)启动子和涉及色氨酸生物合成的trpC基因的终止子之间的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因，黑曲霉中性淀粉酶I的5’和3’侧翼区。

prika162的构建

使用p264和p310通过PCR扩增与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的5’未翻译区组合的不含其5’未翻译区的黑曲霉中性淀粉酶II启动子。

p262tcggctagcatggtgttttgatcatttt(SEQ ID NO:19)

p263cgggatcccccagttgtgtatatagagg(SEQ ID NO:20)

将获得的、与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的5’未翻译区组合的不含其5’未翻译区的黑曲霉中性淀粉酶II启动子的0.6kb PCR片段从琼脂糖凝胶回收，并用NheI和BamHI消化，并连接入用BglII和NheI消化的prika156。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒prika162。prika162包含基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的表达盒，丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉5’未翻译区，其融合于黑曲霉中性淀粉酶II启动子(NA2/tpi启动子)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG及其终止子重复序列，在构巢曲霉甘油磷酸脱氢酶(gpd)启动子和涉及色氨酸生物合成的trpC基因的终止子之间的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因，黑曲霉中性淀粉酶I的5’和3’侧翼区。

prika163的构建

使用引物p264和p310通过PCR扩增与来自JGI基因组数据库、具有SEQID NO:2的推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区组合的不含其5’未翻译区的黑曲霉中性淀粉酶II启动子。

p264ttcgctagcatggtgttttgatc(SEQ ID NO:21)

p270ggtggatccgatcaaaactaaatcctcaattctgaagggattttgttgtttgggttcagactcgagatgaattgatatcgctgttctgagattgttgctccaagcatggcatccctt(SEQ ID NO:22)

基于JGI基因组数据库的序列信息设计了推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区的序列，且其示于SEQ ID NO:2。

将获得的、与推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区组合的不含其5’未翻译区的黑曲霉中性淀粉酶II启动子的0.6kb PCR片段从琼脂糖凝胶回收，并用NheI和BamHI消化，并连接入用BglII和NheI消化的prika156。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒prika163。prika163包含基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的表达盒，推定的烷基硫酸酯酶基因的黑曲霉5’未翻译区，其融合于黑曲霉中性淀粉酶II启动子(NA2/pas-J启动子)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG及其终止子重复序列，在构巢曲霉甘油磷酸脱氢酶(gpd)启动子和涉及色氨酸生物合成的trpC基因的终止子之间的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因，黑曲霉中性淀粉酶I的5’和3’侧翼区。

将prika161、prika162和prika163导入黑曲霉菌株QMJi016-14-1。从Cove-N(tf)培养基选择转化体。将随机选择的转化体接种入含2.5μM5-氟-2-脱氧尿苷(FdU)的Cove-N平板，5-氟-2-脱氧尿苷是杀灭表达携带于prika161、prika162和prika163的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的细胞的药剂。纯化在含有2.5μM FdU的Cove-N平板上生长良好的菌株，并对其进行Southern印迹分析以确认prika160、prika161或prika162中的表达盒是否在限定的基因座正确整合。

将从161-6,11,15(prika161的转化体)，162-3,5,7(prika162的转化体)和163-5,11,12(prika163的转化体)提取的基因组DNA通过NcoI消化。

使用下述的引物组合成非放射性探针以分析选择的转化体。对于5’NA1侧翼区，正向引物：aatccggatcctttcctata(SEQ ID NO:23)，反向引物：gatggagcgcgcctagaagc(SEQID NO:24)，对于来自柠檬酸杆菌属的肌醇六磷酸酶，正向引物：ttcaccaccatcctcagcac(SEQ ID NO:25)，反向引物：tcttgacctgcaaagtgttg(SEQ ID NO:26)。

通过正确的整合事件，用5’NA1侧翼区探查，通过NcoI消化的2.9kb大小的杂交信号迁移至4.4kb，而用柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶探针探查，检测出4.4kb的条带。在给出正确整合事件的菌株中，从每个构建体选择了三个菌株161-6,11,15，162-3,5,7，和163-5,11,12。确定了每个转化体的上清的肌醇六磷酸酶活性。

表1显示了选定的转化体的平均肌醇六磷酸酶活性，相对于prika162的转化体的平均活性。

表1：表达结果

菌株	质粒	启动子	5’未翻译区	肌醇六磷酸酶相对活性
					161-6,11,15	prika161	NA2	SEQ ID NO:1	1.21
162-3,5,7	prika162	NA2	TPI	1.00
					163-5,11,12	prika163	NA2	SEQ ID NO:2	1.09

实施例2：在黑曲霉中通过与推定的烷基硫酸酯酶基因序列的5’UTR组合的过氧化氢酶启动子调控的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的表达

prika157和prika158的构建

通过NheI和BamHI消化pHiTe8(描述于实施例4)和prika150R(描述于实施例4)，并将pHiTe8中的黑曲霉过氧化氢酶启动子的1.0kb区或融合于prika150R中的推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:1)的不含其5’未翻译区的黑曲霉过氧化氢酶启动子的1.0kb区从琼脂糖凝胶回收，并连接入用BglII和NheI消化的prika156。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒prika157和prika158。prika157包含基于黑曲霉过氧化氢酶启动子的柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶的表达盒，推定的烷基硫酸酯酶基因的黑曲霉5’未翻译区(SEQ ID NO:1)，其融合于黑曲霉过氧化氢酶启动子和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG及其终止子重复序列，在构巢曲霉甘油磷酸脱氢酶(gpd)启动子和涉及色氨酸生物合成的trpC基因的终止子之间的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因，黑曲霉中性淀粉酶I的5’和3’侧翼区。prika158是与prika157相同的构建体，但是携带黑曲霉过氧化氢酶启动子替代prika157中的黑曲霉过氧化氢酶启动子和融合于黑曲霉过氧化氢酶启动子的推定的烷基硫酸酯酶基因的黑曲霉5’未翻译区(SEQ IDNO:1)。

将prika157和prika158导入黑曲霉菌株QMJi016-14-1。从Cove-N(tf)培养基选择转化体。将随机选择的转化体接种于含2.5μM5-氟-2-脱氧尿苷(FdU)的Cove-N平板，5-氟-2-脱氧尿苷是杀灭表达携带于prika157和prika158的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的细胞的药剂。纯化在含有2.5μMFdU的Cove-N平板上生长良好的菌株，并对其进行Southern印迹分析以确认prika157和prika158中的表达盒是否在限定的基因座正确整合。

使用下述组的引物分析选择的转化体。对于5’NA1侧翼区，正向引物：aatccggatcctttcctata(SEQ ID NO:23)，反向引物：gatggagcgcgcctagaagc(SEQ IDNO:24)，对于来自柠檬酸杆菌属的肌醇六磷酸酶，正向引物：ttcaccaccatcctcagcacttcaccaccatcctcagcac(SEQ ID NO:25)，反向引物：tcttgacctgcaaagtgttg(SEQ ID NO:26)。

将从157-1,2,5(prika157的转化体)和158-14,16,18(prika158的转化体)提取的基因组DNA通过NcoI消化。

使用下述的引物组合成非放射性探针以分析选择的转化体。对于5’NA1侧翼区，正向引物：aatccggatcctttcctata(SEQ ID NO:23)，反向引物：gatggagcgcgcctagaagc(SEQID NO:24)，对于来自柠檬酸杆菌属的肌醇六磷酸酶基因，正向引物：ttcaccaccatcctcagcac(SEQ ID NO:25)，反向引物：tcttgacctgcaaagtgttg(SEQ ID NO:26)。

通过正确的整合事件，用5’NA1侧翼区探查，通过NcoI消化的2.9kb大小的杂交信号迁移至4.4kb，而用柠檬酸杆菌属肌醇六磷酸酶探针探查，检测出4.4kb的条带。在给出正确整合事件的菌株中，从每个构建体选择了三个菌株157-1,2,15和158-14,16,18。确定了每个转化体的上清的肌醇六磷酸酶活性。

表2显示了选定的转化体的平均肌醇六磷酸酶活性，相对于prika158的转化体的平均活性。

表2.表达结果

菌株	质粒	启动子	5’未翻译区	肌醇六磷酸酶相对活性
					157-1,2,15	prika157	过氧化氢酶	SEQ ID NO:1	1.09
158-14,16,18	prika158	过氧化氢酶	过氧化氢酶	1.00

实施例3：在黑曲霉中用与不同的5’未翻译区组合的中性淀粉酶II启动子调控的葡糖淀粉酶的表达

pHuda440+pyrG的构建

使用pHI142(描述于实施例1)作为模板，用引物对ppyrG F和ppyrG R通过PCR扩增含有构巢曲霉pyrG基因启动子区和编码区的1.2kb DNA片段。

ppyrG F acttctagaatagcgacaagccgaacggc(SEQ ID NO:27)

ppyrG R taccgccaggtgtcagtcaccctcaaagtccaactcttttct(SEQ ID NO:28)

使用pIH142作为模板，用引物对pTamg F和pTamg R通过PCR扩增含有黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子区和FRT-F3靶位点的0.8kb DNA片段。

pTamg F agaaaagagttggactttgagggtgactgacacctggcggta(SEQ ID NO:29)

pTamg R gcttgcatgcactagctagttgaagttcctatactatttgaagaataggaactcggaataggaacttcaacctagaggagagagttgaac(SEQ ID NO:30)

将两种获得的PCR片段从琼脂糖凝胶回收，然后使用黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子区的PCR片段用ppyrG F和pTamg R的引物对进行SOE-PCR。

将获得的pyrG启动子、pyrG基因编码区、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子和用于FLP的FRT-F3靶位点的1.9kb PCR片段从琼脂糖凝胶回收，并用XbaI和SphI消化，并连接入用XbaI和SphI消化的pHUda440。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒pHuda440+pyrG。

pHUda440+pyrG+FLP的构建

使用pHI142作为模板，用引物对pTer F和pTer R通过PCR扩增含有黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子的0.7kb DNA片段。

pTer F gtccaggttcaactctctccactagcaaagtattttcggtacgattt(SEQ ID NO:31)

pTer R gcttgcatgcactagctagttgaagttcctatactatttgaagaataggaactcggaataggaacttcaacctagaggagagagttgaac(SEQ ID NO:32)

为了克隆米曲霉硝酸还原酶(niaD)基因的0.5kb终止子区，使用米曲霉Bech2的基因组DNA作为模板用引物对pTer F(pTniaD F)和pTer R(pTniaD R)通过PCR进行PCR。

pTniaD F agaaaagagttggactttgagggtgactgacacctggcggta(SEQ ID NO:33)

pTniaD R ctcctacatcaaccgccgcatctgagtcgagattatccaagggaatgactt(SEQ IDNO:34)

将两种获得的PCR片段从琼脂糖凝胶回收，然后使用黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子区的0.7kb片段和米曲霉硝酸还原酶终止子的0.5kb用pTer F和pTniaD R的引物对进行SOE-PCR。将获得的、含有黑曲霉终止子+米曲霉硝酸还原酶终止子的1.2kb片段从凝胶回收并命名为片段1。

遵循对于米曲霉α-淀粉酶的密码子选择设计了酵母2u FLP重组酶基因的合成基因。2u FLP重组酶基因的编码区在DNA2.0(DNA2.0USA,1430O’Brain Drive,Suite E,MentoPark,CA94025USA)合成。使用含有1.3kb密码子优化的酵母2u FLP重组酶基因的质粒pJaL1008-G0184作为模板，用引物对pFLP F和pFLP R进行PCR。

pFLP F taagtcattcccttggataatctcgactcagatgcggcggttgatgtagga(SEQ ID NO:35)

pFLP R ccaacaacccaactgacaggggatcgatccaccatgccccagttcgatatcct(SEQ IDNO:36)

为了克隆构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的0.7kb启动子区，用引物对ppxyF和ppxyR使用构巢曲霉NRRL1092的基因组DNA作为模板进行PCR。

ppxy F aggatatcgaactggggcatggtggatcgatcccctgtcagttgggttgttgg(SEQ IDNO:37)

ppxy R ggatggatccggaagtgcgttgatcattat(SEQ ID NO:38)

将两种获得的PCR片段从琼脂糖凝胶回收，然后使用密码子优化的酵母2u FLP重组酶基因的PCR片段和构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的启动子区的PCR片段，用引物对pFLPF和ppxy R进行SOE-PCR。将获得的、含有密码子优化的酵母2u FLP重组酶基因+构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的启动子区的1.9kb片段从凝胶回收并命名为片段2。

然后使用片段1和2，用引物对pTer F和ppxy R进行SOE-PCR。将获得的、含有黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子+米曲霉硝酸还原酶终止子+合成的酵母2u FLP重组酶基因+构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的启动子区的3.1kb片段从琼脂糖凝胶回收，并用XhoI和BamHI消化，并连接入用XhoI和BglII消化的pHUda440+pyrG。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒pHuda440+pyrG+FLP。

prika113的构建

为了在NA2/tpi启动子上游导入酵母FLP重组酶靶位点FRT，使用pHuda440+pyrG+FLP作为模板用引物对pFRT F和pFRT R进行PCR。

pFRT F tttttacgtaaatatcagccctaacgtaatcggtaagcgagttgcccgcgcaagcgagttgcccaccacccgccatataaaaatttaaaatgatcaaaacaccatgctagcgaagttcctatactttctagagaataggaactcggaataggaacttcaagatgaattcgcggccgcggc(SEQ ID NO:39)

pFRT R gcaccatatgcggtgtgaaataccgcacag(SEQ ID NO:40)

将获得的、含有酵母FLP重组酶靶位点FRT和黑曲霉中性淀粉酶II启动子一部分的0.4kb片段从琼脂糖凝胶回收，并用NdeI和SnaBI消化，并连接入用NdeI和SnaBI消化的pHUda440+pyrG+FLP。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒prika113。prika113包含基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子的TC葡糖淀粉酶的表达盒，黑曲霉丙糖磷酸异构酶基因的5’未翻译区，其融合于黑曲霉中性淀粉酶II启动子和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，在构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的启动子区和米曲霉硝酸还原酶终止子之间的合成的酵母2u FLP重组酶基因，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG。所有上述提及的基因在两端侧翼为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2u FLP重组酶的FRT-F和FRT-F3靶序列。

prika117和prika133的构建

使用prika113作为模板用引物对pNA2F和pb-pas(J)R，或者pNA2F和pb-pas(D)R扩增融合于推定的烷基硫酸酯酶基因的不含其5’未翻译区(SEQ ID NO:2)的中性淀粉酶II启动子或与推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:1)组合的不含其5’未翻译区的中性淀粉酶II启动子。将两种获得的、含有融合于推定的烷基硫酸酯酶基因的不含其5’未翻译区(SEQ ID NO:2)的中性淀粉酶II启动子或与推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQID NO:1)组合的不含其5’未翻译区的中性淀粉酶II启动子的0.6kb DNA片段从琼脂糖凝胶回收，用NheI和BamHI切割，并导入用NheI和BamHI消化的prika113。质粒制备在大肠杆菌DH5α中进行。所得的质粒命名为prika117和prika133。

pNA2F cttcgctagcatggtgttttgatcatttt(SEQ ID NO:41)

pb-pas(J)R tggtggatccgatcaaaactaaatcctcaattctgaagggattttgttgtttgggttcagactcgagatgaattgatatcgctgttctgagattgttgctccaagcatggcatccctt(SEQ ID NO:42)

pb-pas(D)R atggtggatccgatcaagactaaatcctcaattttgaagaatttgtgttgtctgagttcagactcgagatgaattgatattggtgttctgagattgttgctccaagcatggcatccctt(SEQ ID NO:43)

prika117包含基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子的TC葡糖淀粉酶的表达盒，推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:2)，其融合于黑曲霉中性淀粉酶II启动子(NA2/pas)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，在构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的启动子区和米曲霉硝酸还原酶终止子之间的合成的酵母2u FLP重组酶基因，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG。所有上述提及的基因在两端侧翼为酿酒酵母2u FLP重组酶的FRT-F和FRT-F3靶序列。prika133是与prika117相同的构建体，除了携带推定的烷基硫酸酯酶基因的黑曲霉5’未翻译区(SEQ ID NO:1)替代prika117中推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:2)。

将prika113、prika117和prika133导入黑曲霉NN059180。从补充1%D-木糖培养基的Cove-N(tf)选择转化体。

将随机选择的转化体接种入含有0.2g/l潮霉素B的Cove-N平板上，潮霉素B为杀灭不表达位于黑曲霉NN059180的NA1基因座的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因的细胞的药剂。纯化不在含潮霉素B的Cove-N平板上生长的菌株，并对其进行Southern印迹分析以确认prika113、prika117和prika133中的表达盒是否在限定的基因座正确整合。

用NcoI消化从113-2,5(prika113的转化体)，117-3,4(prika117的转化体)，和133-3,7(prika133的转化体)提取的基因组DNA。

使用下述引物组合成非放射性探针以分析选定的转化体。对于5’NA1侧翼区，正向引物：aatccggatcctttcctata(SEQ ID NO:23)，反向引物：gatggagcgcgcctagaagc(SEQ IDNO:24)，对于葡糖淀粉酶基因，正向引物：tgattgcaagtccgagcaca(SEQ ID NO:44)，反向引物：gaggtttgtccgatgcgatt(SEQ IDNO:45)。

通过正确的整合事件，用5’NA1侧翼区探查，通过NcoI消化的3.1kb大小的杂交信号迁移至3.6kb，而用葡糖淀粉酶探针探查，检测出3.6kb条带。在给出正确的整合事件的菌株中，选择来自每个构建体的两个菌株113-2,5，117-3,4，和133-3,7。确定了每个转化体的上清的葡糖淀粉酶活性。

表3显示了选定的转化体的平均葡糖淀粉酶活性，相对于prika113的转化体的平均活性。

表3：表达结果

菌株	质粒	启动子	5’未翻译区	葡糖淀粉酶相对活性
					113-2,5	prika113	NA2	TPI	1.00
117-3,4	prika117	NA2	SEQ ID NO:2	1.32
					133-3,7	prika133	NA2	SEQ ID NO:1	1.39

实施例4：在黑曲霉中通过与推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区组合的过氧化氢酶启动子调控的葡糖淀粉酶的表达

pHiTe8、prika150R和prika154的构建

使用黑曲霉NN059180的基因组DNA作为模板，用引物对pHiTe08F和pHiTe08R、p354和p355、或p354和p361通过PCR扩增黑曲霉过氧化氢酶启动子，融合于推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:1)的不含其5’未翻译区的黑曲霉过氧化氢酶启动子和融合于推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:2)的不含其5’未翻译区的黑曲霉过氧化氢酶启动子的1.0kb区。

pHiTe08F ctagctagccgtcggtgtgatggaaatc(SEQ ID NO:46)

pHiTe08R cgcggatccgaagggaaggggggaagttg(SEQ ID NO:47)

p354ttcgctagccgtcggtgtgatgga(SEQ ID NO:48)

p355ggtggatccgatcaagactaaatcctcaattttgaagaatttgtgttgtctgagttcagactcgagatgaattgatattggtgttctgagattgttgaagatgaggcaattggagca(SEQ ID NO:49)

p361ggtggatccgatcaaaactaaatcctcaattctgaagggattttgttgtttgggttcagactcgagatgaattgatatcgc tgttctgagattgttgaagatgaggcaattggagcag(SEQ ID NO:50)

将获得的、含有黑曲霉过氧化氢酶启动子，融合于推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:1)的黑曲霉过氧化氢酶启动子或融合于推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:2)的黑曲霉过氧化氢酶启动子的PCR从琼脂糖凝胶回收，并用NheI和BamHI消化，并连接入用BglII和NheI消化的prika113。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒pHiTe8、prika150R或prika154。pHiTe8包含基于黑曲霉过氧化氢酶启动子的葡糖淀粉酶的表达盒，和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)，位于构巢曲霉木聚糖酶(xlnA)基因的启动子区和米曲霉硝酸还原酶终止子之间的密码子优化的酵母2u FLP重组酶基因，来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG。所有上述提及的基因在两端侧翼为酿酒酵母2u FLP重组酶的FRT-F和FRT-F3靶序列。prika150R是与pHiTe8相同的构建体，但是携带黑曲霉过氧化氢酶启动子和推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:1)，其融合于黑曲霉过氧化氢酶启动子而非pHiTe8中的黑曲霉过氧化氢酶启动子。prika154是与prika150R相同的构建体，但是携带推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:2)而非推定的烷基硫酸酯酶基因的5’未翻译区(SEQ ID NO:1)。

将pHiTe8、prika150R和prika154导入黑曲霉NN059180。从补充1%D-木糖培养基的Cove-N(tf)选择转化体。

将随机选择的转化体接种入含有0.2g/L的Hygromycin B的Cove-N平板，潮霉素B为杀灭不表达位于黑曲霉NN059180的NA1基因座的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因的细胞的药剂。纯化不在含潮霉素B的Cove-N平板上生长的菌株，并对其进行Southern印迹分析以确认pHiTe8、prika150R和prika154中的表达盒是否在限定的基因座正确整合。

用NcoI消化从8-1,6(pHiTe8的转化体)，150-1,9(prika150R的转化体)，和154-1,5(prika154的转化体)提取的基因组DNA。

使用下述引物组合成非放射性探针以分析选定的转化体。对于5’NA1侧翼区，正向引物：aatccggatcctttcctata(SEQ ID NO:23)，反向引物：gatggagcgcgcctagaagc(SEQ IDNO:24)，对于葡糖淀粉酶基因，正向引物：tgattgcaagtccgagcaca(SEQ ID NO:44)，反向引物：gaggtttgtccgatgcgatt(SEQ ID NO:45)。

通过正确的整合事件，用5’NA1侧翼区探查，通过NcoI消化的3.1kb大小的杂交信号迁移至4.0kb，而用葡糖淀粉酶探针探查，检测出4.0kb条带。在给出正确的整合事件的菌株中，选择来自每个构建体pHiTe8，prika150R，和prika154的两个菌株。确定了每个转化体的上清的葡糖淀粉酶活性。

表4显示了选定的转化体的平均葡糖淀粉酶活性，相对于pHiTe8的转化体的平均活性。

表4：表达结果

菌株	质粒	启动子	5’未翻译区	葡糖淀粉酶相对活性
					8-1,6	pHiTe8	过氧化氢酶	过氧化氢酶	1.00
150-1,9	prika150R	过氧化氢酶	SEQ ID NOI:1	1.82
					154-1,5	prika154	过氧化氢酶	SEQ ID NO:2	1.57

Claims

1.一种核酸构建体，其包含至少一个第一核酸序列，所述第一核酸序列包含在第二核酸序列上游的启动子，所述第二核酸序列包含一个对于所述启动子是外源的前导序列，所述前导序列为SEQ ID NO:1或2的多核苷酸；

所述多核苷酸可操作地连接于第三核酸序列，所述第三核酸序列编码感兴趣的多肽，并位于所述第二核酸序列的下游；所述前导序列在+1位置的转录起始位点开始，并正好在编码区的起始密码子之前结束。

2.权利要求1的核酸构建体，其中所述启动子选自下组：任何来源于淀粉酶基因的启动子，任何来源于蛋白酶基因的启动子，任何来源于氧化酶基因的启动子，任何来源于编码糖酵解酶的基因的启动子，任何来源于核糖体蛋白的启动子，或任何来源于编码热激蛋白、乙酰CoA乙酰转移酶、翻译延伸因子、CipC-样抗生素响应蛋白(CipC-like antibioticresponse protein)、转化酶或外切菊粉酶(exo-inulinase)的基因的启动子。

3.权利要求2的核酸构建体，其中所述来源于淀粉酶基因的启动子为黑曲霉中性淀粉酶II启动子。

4.权利要求2或3的核酸构建体，其中所述淀粉酶是葡糖淀粉酶、中性淀粉酶或酸性淀粉酶。

5.权利要求2或3的核酸构建体，其中所述蛋白酶基因是pepA、pepB、pepC、pepD或pepE。

6.权利要求2或3的核酸构建体，其中所述氧化酶是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或单氧化酶(mono-oxidase)。

7.权利要求2或3的核酸构建体，其中所述糖酵解酶是烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶或己糖激酶。

8.一种重组表达载体，其包含权利要求1-7任一项的核酸构建体。

9.一种重组宿主细胞，其包含权利要求1-7任一项的核酸构建体。

10.一种产生感兴趣的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养权利要求9的宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

11.权利要求10的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌。

12.权利要求11的方法，其中所述丝状真菌选自下组：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。

13.权利要求12的方法，其中所述曲霉选自下组：泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。

14.权利要求13的方法，其中所述曲霉是黑曲霉。

15.权利要求13的方法，其中所述曲霉是米曲霉。

16.权利要求10-15任一项的方法，其中所述多肽是酶。

17.权利要求16的方法，其中所述酶选自下组：蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、肌醇六磷酸酶、氧化酶、氧还酶和果胶酶。