CN101250585B - 一种检测dna,rna和超微量蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测DNA，RNA和超微量蛋白质的方法，首先利用磁珠捕获探针上的捕获探针1(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测靶分子，再利用磁铁吸附磁珠，很容易去除未结合的探针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA，可把检测靶分子成千上万倍放大；每分子条码DNA利用链亲和素-生物素系统可结合3分子含T7RNA启动子的DNA序列，从而可用TMA技术定量检测条码DNA，而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T7RNA启动子的DNA序列，TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA，相应地把条码DNA扩增一万倍。
Description
技术领域
本发明涉及采用DNA条码一纳米金-T7RNA转录扩增(Bio-DNA TMA)方法检测DNA，RNA和超微量蛋白质的技术。
背景技术
临床分子水平定量检测DNA，RNA和蛋白质已广泛应用于疾病诊断，疾病疗效和预后的判断。目前一般采用荧光定量PCR和RT-PCR，T7RNA转录介导的杂交保护发光(TMA-HPA)检测DNA和RNA含量，发光ELISA检测微量蛋白质。另外，还有一类不需靶分子扩增的核酸检测方法如分支DNA杂交技术(bDNA)，捕获杂交技术(Hybrid Capture，HC)。近年以纳米材料发展的检测DNA，RNA，微量蛋白质技术引人注目，如Mirkin CA等发明的DNA条码-纳米金技术(Bio-coded nanoparticles technology)检测DNA，RNA和超微量蛋白质。各种技术都有其优缺点，核酸扩增技术灵敏度高，但易产生假阳性和假阴性，并且实验条件要求高；杂交技术简便易自动化，重复好，但灵敏度较低，试剂成本昂贵；纳米技术灵敏高，方便，成本较低，但定量需特需仪器，不易标准化和大规模检测。
发明内容
为了吸取各方法的优点，避免其缺陷，本发明提供一种既具有PCR法的高敏感性，又要避免PCR的缺陷，且简便易行的DNA条码-纳米金-T7RNA转录扩增(Bio-DNA TMA)方法检测DNA，RNA和超微量蛋白质，用于科研和临床分子诊断。
DNA条码-纳米金-T7RNA转录扩增(Bio-DNATMA)方法主要综合利用纳米技术和TMA扩增技术的优点，克服各自的缺陷，建立的一种新的分子水平检测DNA，RNA和超微量蛋白质技术。此技术首先利用磁珠捕获探针上的捕获探针1(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测靶分子，再利用磁铁吸附磁珠，很容易去除未结合的探针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA，可把检测靶分子成千上万倍放大；每分子条码DNA利用链亲和素-生物素系统可结合3分子含T7RNA启动子的DNA序列，从而可用TMA技术定量检测条码DNA，而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T7RNA启动子的DNA序列，TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA，相应地把条码DNA扩增一万倍。转录的RNA用高灵敏度的荧光染料RiboGreen荧光光度法检测(可检测0.2ng的RNA)，通过上述三步放大反应，可把靶分子扩增约3×108倍，可与PCR相媲美。
Bio-DNA TMA吸收了纳米金技术和TMA技术的扩增优点，灵敏度可达PCR技术水平，理论上可检测一个靶分子。由于Bio-DNATMA不是直接扩增靶分子，因而避免了PCR技术的假阳性问题，且操作简单，重复性好，易于大规模检测，也不需要贵重仪器，成本相对较低。此技术可应用于检测DNA，RNA和超微量蛋白质，特别是现在还没有成熟的分子水平检测体液中超微量蛋白质技术，因而Bio-DNA TMA具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为磁珠捕获探针和纳米结合探针的制备示意图；
图2为磁珠捕获探针和纳米结合探针夹心ELISA检测靶DNA的过程示意图；
图3为生物素-链亲和素桥连TMA的过程示意图
图4为TMA扩增反应示意图；
图5为RiboGreen荧光定量检测RNA的示意图；
图6为Bio-DNATMA检测RNA原理示意图；
图7为Bio-DNATMA检测超微量蛋白质的原理示意图。
具体实施方式
原理
1.磁珠捕获探针的制备：表面带有游离-NH3的磁珠，与末端带有-SH的捕获探针1(3末端带有-SH，中间带有PEG和10个连续的A，作为间隔桥梁序列，5末端为与检测靶DNA 3末端互补的18-25bp碱基序列)用戊二醛的方法连接氨基和巯基，使捕获探针1标记到磁珠表面，制成磁珠捕获探针(图1)。
2.纳米结合探针的制备：纳米金颗粒的金原子与5末端带有-SH的捕获探针2和条码DNA(条码DNA/捕获探针2为100∶1)在水溶液中形成共价键，牢固结合在纳米金的表面，逐步加NaCl到终浓度为0.3M，使捕获探针2和条码DNA在纳米金表面伸展(捕获探针2其5末端带有-SH，中间带有PEG和10个连续的A，作为间隔桥梁序列，3末端为与检测靶DNA 5末端互补的18-25bp碱基序列；条码DNA其5末端带有-SH，中间带有10个连续的A，作为间隔桥梁序列，3末端为一段与检测DNA不互补且无关的18-25bp DNA，并用生物素标记)，制备纳米结合探针(图1)。
3. 生物素标记的含T7启动子的DNA序列的制备：设计引物：F：5-BIOTIN-GAGAGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3(5末端用生物素标记，下划线部分为T7启动子序列)；R：5-ATC TTG CAA GAA AAC AGA TGG CAA GCA TGA CTC GAG GCG CCT TGT CCC AAG-3(下划线部分为T7RNA酶终止序列).以pcDNA-HCCR质粒(HCCR基因cDNA克隆入pET-30a表达质粒)为模板，PCR扩增HCCR基因的500bp序列，扩增产物纯化后作为生物素标记的含T7启动子的DNA序列。
4. Bio-DNA TMA法检测靶DNA原理：磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶DNA3末端互补，纳米结合探针捕获探针2与检测DNA 5末端互补，在杂交缓冲液中夹心法结合靶DNA，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的纳米结合探针和其他杂质(图2)。再加入杂交缓冲液重悬磁珠，以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37℃，温育30分钟，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列(图3)。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA聚合酶和四种核苷酸(UTP，ATP，GTP，CTP)，37℃，温育3小时，转录RNA(图4)，RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧光光度计定量检测(图5)。
5. Bio-DNA TMA法检测DNA的扩增原理：
第一次扩增：直径200nm的纳米结合探针可结合约10000条DNA条码，可把靶DNA放大104倍。第二次扩增；每一条条码DNA可通过链亲和素结合3条生物素标记的含T7启动子的DNA序列，放大3倍。第三次扩增：每一条含T7启动子的DNA序列在T7RNA聚合酶作用下，3小时可合成约104个RNA分子，此步放大104倍。RiboGreen荧光染料最低能够检测0.2ng RNA，约对应于108个500bp的RNA分子。一分子检测靶DNA通过三次放大反应可放大到3×108倍，恰够RiboGreen荧光染料检测最低极限，因而理论上Bio-DNATMA法可检测到一分子靶DNA。
6.Bio-DNA TMA法检测RNA原理：磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶RNA3末端互补，纳米结合探针上捕获探针2与检测靶RNA 5末端互补，在杂交缓冲液中夹心法结合靶RNA，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的纳米结合探针和其他杂质。再加入杂交缓冲液重悬磁珠，以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37℃，温育30分钟，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA聚合酶和四种核苷酸(UTP，ATP，GTP，CTP)，37℃，温育3小时，转录RNA，RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧光光度计定量检测(图6)。
7.Bio-DNATMA法检测超微量蛋白的原理：与检测DNA，RNA不同的是，用针对检测靶蛋白的两株结合位点不同的单抗，分别替代捕获探针1和捕获探针2，制备磁珠捕获探针和纳米结合探针。磁珠捕获探针上的抗体1与纳米结合探针上抗体2夹心法结合靶蛋白，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的纳米结合探针和其他杂质。再加入结合缓冲液重悬磁珠，以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37℃，温育30分钟，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA聚合酶和四种核苷酸(UTP，ATP，GTP，CTP)，37℃，温育3小时，转录RNA，RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧光光度计定量检测(图7)。
实施例1：DNA的检测
1.引物设计：以检测EBV的BamHI-W片段DNA为例(NCBI genbankaccession No：M15973)。
检测BamHI-W片段DNA的序列：
2091 CCATCCCTGA AGACCCAGCG GCCATTCTCT CTGGTAACGA GCAGAGAAGA
AGTAGAGGCC CGCGGCCATT GGGCCCAGAT TGAGAGACCA GTCCAGGGGC CCGAGGTTGG
AGCCAGCGGG CACCCGAGGT CC 2222。
(1)，捕获探针1：5-GGG CTT GGC CGG GTC TAA-PEG-AAAAAAAAAA-SH-(C6)-3.(下划线部分与EBV BamHI-W片段DNA结合)。
(2)，捕获探针2：5-SH-(C6)-AAAAAAAAAA-PEG-GGA GGG ACC GGG TGC TGG-3(下划线部分与EBV BamHI-W片段DNA结合)。
(3)条码DNA：5-SH-(C6)-AAA AAA AAA A-PEG-GGA TTC TCA ACTCGT AGC T-Biotin-3.
(4)阳性检测靶DNA：以EBV BamHI-W片段DNA为模板，合成一段阳性对照引物，5-CCA GCA CCC GGT CCC TCC AAA AAA AAA TTA GAC CCGGCC AAG CCC-3(下划线为桥联序列)。
2.磁珠捕获探针的制备：
(1)取1ml直径1μm表面带有游离-NH3的磁珠，加4ml PBS(0.01M，pH 7.4)充分摇匀，用磁铁吸附磁珠，去上清；重复三次，去上清。
(2)用PBS配制新鲜的5％戊二醛溶液。
(3)在磁珠中加入新鲜配制的5ml 5％戊二醛溶液，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇3小时。
(4)用磁铁吸附磁珠，去上清；加5ml PBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三洗次。
(5)加入5OD的捕获探针1(过量)，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇24小时。
(6)用磁铁吸附磁珠，去上清；加5ml PBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三洗次。
(7)加入1M的甘氨酸5ml，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇3小时，封闭非结合位点。
(8)用磁铁吸附磁珠，去上清；加5ml PBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三洗次。最后用1ml PBS重悬，4℃保存。
(9)260nm测定OD值，验证捕获探针1是否标记上。
2.纳米结合探针的制备：
(1)捕获探针2和条码DNA引物用纯水溶解，按条码DNA/捕获探针2为100∶1的比例混匀。
(2)取5ml直径100nm的纳米金溶液，加入总量为5OD的条码DNA和捕获探针2混和液，充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。
(3)加热至60度，加入5M NaCl 50ul，10％SDS 50ul，混匀，室温旋转摇床摇2h。加热至60度，加5M NaCl 50ul混匀，室温旋转摇床摇2h；重复四次。使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。
(4)10000rpm离心10分钟，去上清；加入PBS含0.3M NaCl，0.1％SDS，重悬。同样离心洗涤3次，最后加入用5ml PBS含5％BSA，0.3M NaCl，0.1％SDS重悬，37℃，摇2h，封闭未结合位点。10000rpm离心10分钟，去封闭液，加1ml PBS(含0.3M NaCl，0.1％SDS)重悬，4℃保存。
(5)260nm测定OD值，验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。
(6)260nm-800nm光谱扫描，在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收峰)，根据560nm OD值估算纳米金的数量。
(7)取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取1ul点在醋酸纤维薄膜上，37℃烤干，用5％的奶粉(含0.3M NaCl，0.1％SDS)37℃封闭2h；加HRP标记的链亲和素，37℃30分钟，用PBS含0.3M NaCl，0.1％SDS洗膜四次，加DAB显色。验证条码DNA标记效率。
3.Bio-DNA TMA法检测EBV DNA：
(1)，取EDTA抗凝血浆500μl，用QIAamp DNA Blood MiniKit(Qiagen)试剂盒提取DNA，用50μl纯水洗脱。
(2)，50μl样本DNA，50μl阳性对照DNA，50μl PBS阴性对照，分别加入10μl 5×杂交液(含0.5％SDS，5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白V，1.5M NaCl，0.5M Tris-Hcl，pH 8.0)95℃5min，取出马上加入50μl磁珠捕获探针和50μl纳米结合探针，60℃10min，然后55℃旋转杂交2小时。
(3)磁分离器吸附磁珠30秒，弃去上清液，加入500μlPBS(0.3MNaCl，0.1％SDS)洗3次。
(4)磁珠重悬于50μl PBS(0.3M NaCl，0.1％SDS)，依次加入50μl链亲和素(终浓度为5μg/ml，50μl生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml)37℃，摇动30min。PBS(0.3M NaCl，0.1％SDS)，同上洗4次。
(5)磁珠重悬于50μl T7RNA转录液(1×T7RNA转录缓冲液，60U T7RNA聚合酶，RNA酶抑制剂200U，1.25μM NTP)，37℃，摇动3小时。
(6)加入20μl RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释200倍为工作液)，激发光为485nm，发射光535nm测定荧光。
4.标准曲线的制作：
(1)把阳性检测靶DNA用PBS(0.3M NaCl，0.1％SDS)倍比稀释，使终浓度依次为100/ml，101/ml，102/ml，103/ml，104/ml，105/ml，106/ml，107/ml，按上面步骤操做，每一浓度做三个平行孔，测定荧光。
(2)取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。
(3)样品结果从标准曲线计算得去。
实施例2：RNA的检测
1.引物设计：以检测HCV的RNA为例(NCBI accession No：EU482888，检测对应序列nt 1-216)。
(1)，捕获探针1：5-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC-PEG-AAAAAAAAAA-SH-(C6)-3.(下划线部分与HCV 5-UTR nt 1-18 RNA结合)。
(2)，捕获探针2：5-SH-(C6)-AAAAAAAAAA-PEG-CCC AAC ACT ACT CGG CTA G-3(下划线部分与HCV 5-UTR nt 198-216RNA结合)。
(3)条码DNA：5-SH-(C6)-AAAAAAAAAA-PEG-GGA TTC TCA ACT CGTAGC T-Biotin-3.
(4)阳性检测靶RNA：WHO HCV标准品。
2.磁珠捕获探针的制备：
(1)取1ml直径1μm表面带有游离-NH3的磁珠，加4ml PBS(0.01M，pH 7.4，)充分摇匀，用磁铁吸附磁珠，去上清；重复三次，去上清。
(2)用PBS配制新鲜的5％戊二醛溶液。
(3)在磁珠中加入新鲜配制的5ml 5％戊二醛溶液，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇3小时。
(4)用磁铁吸附磁珠，去上清；加5ml PBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三洗次。
(5)加入5OD的捕获探针1(过量)，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇24小时。
(6)用磁铁吸附磁珠，去上清；加5ml PBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三次。
(7)加入1M的甘氨酸5ml，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇3小时，封闭非结合位点。
(8)用磁铁吸附磁珠，去上清；加5ml PBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三洗次。最后用1ml PBS(含RNA酶抑制剂100U)重悬，4℃保存。
(9)260nm测定OD值，验证捕获探针1是否标记上。
2.纳米结合探针的制备：
(1)捕获探针2和条码DNA引物用纯水溶解，按条码DNA/捕获探针2为100∶1的比例混匀。
(2)取5ml直径100nm的纳米金溶液，加入总量为50D的条码DNA和捕获探针2混和液，充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。
(3)加热至60度，加入5M NaCl 50ul，10％SDS 50ul，混匀，室温旋转摇床摇2h。加热至60度，加5M NaCl 50ul混匀，室温旋转摇床摇2h；重复四次。使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。
(4)10000rpm离心10分钟，去上清；加入PBS含0.3M NaCl，0.1％SDS，重悬。同样离心洗涤3次，最后加入用5ml PBS含5％BSA，0.3M NaCl，0.1％SDS重悬，37℃，摇2h，封闭未结合位点。10000rpm离心10分钟，去封闭液，加1ml PBS(含0.3M NaCl，0.1％SDS，RNA酶抑制剂100U)重悬，4℃保存。
(5)260nm测定OD值，验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。
(6)260nm-800nm光谱扫描，在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收峰)，根据560nm OD值估算纳米金的数量。
(7)取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取1ul点在醋酸纤维薄膜上，37℃烤干，用5％的奶粉(含0.3M NaCl，0.1％SDS)37℃封闭2h；加HRP标记的链亲和素，37℃30分钟，用PBS含0.3MNaCl，0.1％SDS洗膜四次，加DAB显色。验证条码DNA标记效率。
3.Bio-DNA TMA法检测HCV RNA：
(1)，取EDTA抗凝血浆500μl，用QIAamp RNA Blood MiniKit(Qiagen)试剂盒提取RNA，用50μl无RNA酶纯水洗脱。
(2)，50μl样本RNA，50μl阳性对照HCV RNA，50μl PBS阴性对照，分别加入10μl 5×杂交液(含0.5％SDS，5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白V，RNA酶抑制剂500U，1.5M NaCl，0.5M Tris-Hcl，pH 8.0)65℃，15min，取出马上加入50μl磁珠捕获探针和50μl纳米结合探针，60℃10min，然后55℃旋转杂交2小时。
(3)磁分离器吸附磁珠30秒，弃去上清液，加入500μl PBS(0.3M NaCl，0.1％SDS，RNA酶抑制剂100U)洗3次。
(4)磁珠重悬于50μl PBS(0.3M NaCl，0.1％SDS，RNA酶抑制剂100U)，依次加入50μl链亲和素(终浓度为5μg/ml，50μl生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml)37℃，摇动30min。PBS(0.3MNaCl，0.1％SDS，RNA酶抑制剂100U)，同上洗4次。
(5)磁珠重悬于50μl T7RNA转录液(1×T7RNA转录缓冲液，60U T7RNA聚合酶，RNA酶抑制剂200U，1.25μM NTP)，37℃，摇动3小时。
(6)加入20μl RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释200倍为工作液)，激发光为485nm，发射光535nm测定荧光。
4.标准曲线的制作：
(1)把WHO HCV标准品用PBS(0.3M NaCl，0.1％SDS)倍比稀释，使终浓度依次为100/ml，101/ml，102/ml，103/ml，104/ml，105/ml，106/ml，107/ml，按上面步骤操做，每一浓度做三个平行孔，测定荧光。
(2)取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。
(3)测定样品结果从标准曲线计算得去。
实施例3：微量蛋白的检测
1.引物设计：以检测血清Her-2蛋白为例。
(1)条码DNA：5-SH-(C6)-AAA AAA AAA A-PEG-GGA TTC TCA ACTCGT AGC T-Biotin-3.
2.抗Her-2单抗(克隆号6E2，Oncogene Sciences)包被ELISA板：
(1)Her-2单抗用pH9.0的碳酸盐缓冲液稀释成1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。
(2)去包被液，加5％奶粉200μl/孔，4℃过夜，封板。
(3)去封闭液，用PBST缓冲液洗3次，放4℃备用。
2.纳米结合抗体的制备：
(1)条码DNA引物用纯水溶解，混匀。
(2)取5ml直径100nm的纳米金溶液，加入5OD的条码DNA和500ng/mlHer-2单抗(克隆号A18，Oncogene Sciences)混和，充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。
(3)加入5M NaCl 50ul，10％SDS 50ul，混匀，室温旋转摇床摇2h。加5M NaCl50ul混匀，室温旋转摇床摇2h；重复四次。使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。
(4)10000rpm离心10分钟，去上清；加入PBS含0.3M NaCl，0.1％SDS，重悬。同样离心洗涤3次，最后加入用5ml PBS含5％BSA，0.3MNaCl，0.1％SDS重悬，37℃，摇2h，封闭未结合位点。10000rpm离心10分钟，去封闭液，加1ml PBS(含0.3MNaCl，0.1％SDS)重悬，4℃保存。
(5)260nm测定OD值，验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。280nm测定OD值，验证Her-2单抗是否标记上。
(6)260nm-800nm光谱扫描，在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收峰)，根据560nm OD值估算纳米金的数量。
(7)取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取1ul点在醋酸纤维薄膜上，37℃烤干，用5％的奶粉(含0.3M NaCl，0.1％SDS)37℃封闭2h；加HRP标记的链亲和素，37℃30分钟，用PBS含0.3M NaCl，0.1％SDS洗膜四次，加DAB显色。验证条码DNA标记效率。
(8)取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取1ul点在醋酸纤维薄膜上，37℃烤干，用5％的奶粉(含0.3M NaCl，0.1％SDS)37℃封闭2h；加HRP标记的抗鼠IgG，37℃ 30分钟，用PBS含0.3M NaCl，0.1％SDS洗膜四次，加DAB显色。验证Her-2单抗标记效率。
3.Bio-DNA TMA法检测血清Her-2蛋白：
(1)，100μl血清，100μl阳性对照Her-2蛋白，100μl PBS阴性对照，分别加入包被好的ELISA板中，再加入100μl纳米结合抗体，37℃摇床摇120min。
(3)弃去孔中液体，加入200μl PBST(03M NaCl，0.1％SDS，0.1％Tween20)洗4次。
(4)依次加入50μl链亲和素(终浓度为5μg/ml，50μl生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml)37℃，摇动30min。PBST同上洗4次。
(5)加入50μl T7RNA转录液(1×T7RNA转录缓冲液，60U T7RNA聚合酶，RNA酶抑制剂200U，1.25μM NTP)，37℃，3小时。
(6)加入20μl RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释200倍为工作液)，激发光为485nm，发射光535nm测定荧光。
4.标准曲线的制作：
(1)把Her-2蛋白(Oncogene Sciences)倍比稀释，使终浓度依次为1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。按上面步骤操做，每一浓度做三个平行孔，测定荧光。
(2)取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。
(3)测定样品结果从标准曲线计算得去。
Claims (5)
1.一种检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，按照以下步骤进行：
(1)制备磁珠捕获探针1以及结合有生物素标记的调码DNA的纳米结合探针；
(2)利用磁珠捕获探针上的捕获探针1，以及纳米结合探针上捕获探针2在液相中夹心ELISA检测靶分子；
(3)利用磁铁吸附磁珠，洗涤去除杂质；
(4)加入链亲和素以及生物素标记的含T7RNA启动子的DNA序列，使条码DNA与生物素标记的含T7RNA启动子的DNA序列结合；
(5)利用磁铁吸附磁珠，洗涤去除杂质；
(6)对含T7RNA启动子的DNA序列进行转录后检测转录的RNA产物。
2.按权利要求1所述的检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于：所述的纳米结合探针为纳米金探针。
3.按权利要求1或2所述的检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于：用做检测DNA时，磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶DNA3末端或者5末端互补，纳米结合探针捕获探针2则相应地与检测DNA的另外一个末端互补。
4.按权利要求1或2所述的检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于：用作检测RNA时，磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶RNA3末端或5末端互补，纳米结合探针上捕获探针2则相应地与检测靶RNA的另外一个末端互补。
5.按权利要求1或2所述的检测DNA，RNA或超量蛋白质的方法，其特征在于：用作检测蛋白质时，磁珠捕获探针上的捕获探针1以及纳米结合探针上捕获探针2分别是针对检测靶蛋白的两株结合位点不同的单抗。
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