CN110964073B

CN110964073B - 用于捕获胎儿特有dna甲基化修饰结合蛋白的探针及方法

Info

Publication number: CN110964073B
Application number: CN201911188858.4A
Authority: CN
Inventors: 金莉萍; 郑青亮
Original assignee: Shanghai First Maternity and Infant Hospital
Current assignee: Shanghai First Maternity and Infant Hospital
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110964073A

Abstract

本发明公开了用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针及方法。该探针由长度为10‑490个碱基组成，探针的3′或5′具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合。捕获结合蛋白的方法具体为：制备探针‑磁珠复合物：使用BSA(牛血清白蛋白)和tRNAs封闭链霉亲和素标记的磁珠进行预处理；提取并预沉淀细胞总蛋白：向提取总蛋白样品中加入未预处理的磁珠进行孵育，去除磁珠并收集上清；捕获结合蛋白。本发明的胎儿特有的DNA甲基化修饰探针序列，能够有效捕获胎儿DNA甲基化修饰结合蛋白，显著提高对特异性结合蛋白的富集。

Description

用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针及方法

【技术领域】

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针及方法。

【背景技术】

临床上通过检测母体血浆中循环无细胞胎儿DNA(cff-DNA)是目前实现无创性产前诊断的重要方法。早在1997年，卢煜明教授等就报告母体血浆中存在cff-DNA，显示胎儿来源的DNA在怀孕2周后的母体血浆中可以被检测到，并且在分娩后2小时内迅速从母体血浆中清除并消失(Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA inmaternal plasma and serum.Lancet 1997；350:485-7)。因此，母亲血浆的cff-DNA已成为非侵入性产前诊断的重要靶点。然而，cff-DNA只占母体血浆中的一小部分(约10％)，其余的均来源于母体血细胞；目前利用cff-DNA进行无创性产前诊断主要是基于父系遗传标记，如SYR基因(Chiu RW,Lo YM.Non-invasive prenatal diagnosis by fetal nucleic acidanalysis in maternal plasma:the coming of age.Semin Fetal Neonatal Med 2011；16:88-93.)。

最近，研究人员试图开发与胎儿遗传无关的胎儿DNA多态性标记。其中一个重要方法是在母体血浆中检测胎儿的表观遗传标记物，显示胎儿组织与母体血细胞间存在不同的DNA甲基化模式(Chan KC,Ding C,Gerovassili A,et al.Hypermethylated RASSF1A inmaternal plasma:a universal fetal DNA marker that improves the reliability ofnoninvasive prenatal diagnosis.Clin Chem 2006；52:2211-8.)。DNA甲基化通常指胞嘧啶核苷酸的5′碳上存在甲基化，随后紧跟鸟嘌呤核苷酸，组成一种CpG二核苷酸。目前通过甲基化芯片发现胎儿组织中存在485,577个CpG修饰位点，它们存在于UTR区，启动子区或基因编码区。有证据表明，母体外周血中的胎儿循环DNA主要来源于胎盘，因为它是母子间营养物质转运的唯一通道。因此，有可能根据不同DNA甲基化模式的标记开发母体和胎儿组织之间特异的分子标记。

目前还未见有胎儿相关特异性的DNA甲基化探针设计的报道，因此开发设计一种胎儿特有的DNA甲基化探针以及用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的操作方法就显得非常重要，将对胎儿早产、反复自然流产等妊娠相关疾病的机制研究和临床干预找到新的药物靶标。

【发明内容】

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针及方法。

本发明的目的是通过以下方式来实现的：

本发明提供了一种用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)甲基化探针的碱基序列：

5′-biotin-TGCC(5-mC)GGACTCTGC(5-mC)GCTCTTTGG(5-mC)GAGGGCAGG(5-mC)GGCCAGGAG(5-mC)GTCCGCATT(5-mC)GCCCCGGGT(5-mC)GGCAGTGCC(5-mC)GGACTCTGC(5-mC)GCTCTTTGG(5-mC)GAGGGCAGG(5-mC)GGCCAGGAG(5-mC)GTCCGCATT(5-mC)GCCCCGGGT(5-mC)GGCAG-3′；

对照非甲基化探针的碱基序列：

5′-biotin-TGCCCGGACTCTGCCGCTCTTTGGCGAGGGCAGGCGGCCAGGAGCGTCCGCATTCGCCCCGGGTCGGCAGTGCCCGGACTCTGCCGCTCTTTGGCGAGGGCAGGCGGCCAGGAGCGTCCGCATTCGCCCCGGGTCGGCAG-3′；

2)在所述探针5′端与第一个甲基化位点之间、3′端与第二个甲基化位点之间插入序列为人类基因组无关序列，且插入序列不与探针中其他序列形成互补。

进一步，所述的探针由碱基茎环结构组成，探针的3′或5′具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合。

进一步，所述探针的长度是10-490bp，优选是140bp。

进一步，所述探针的5′端到第一个甲基化位点的长度为1-70bp，优选是4bp。

进一步，所述探针的3′端到第十四个甲基化位点的长度为1-70bp，优选是5bp。

进一步，所述探针的甲基化修饰位点的数目为1-49个，优选是14个。

进一步，所述甲基化探针上包含14个胞嘧啶(C)甲基化修饰位点，所述胞嘧啶甲基化(5-mC)是指胞嘧啶5'碳位上发生偶联甲基化修饰。

进一步，所述的5′-biotin是指在序列的5′端偶联上生物素标记。

本发明还提供了一种用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的方法，具体包括如下步骤：

(1)制备探针-磁珠复合物：使用BSA和tRNAs封闭链霉亲和素标记的磁珠；将预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；

(2)提取并预处理细胞总蛋白：用裂解Buffer提取总蛋白样品，再向其中加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；

(3)捕获结合蛋白：将步骤2制备的细胞总蛋白样品上清加入到步骤1制备的探针-磁珠复合物中，加入结合Buffer并孵育，收集磁珠，用结合Buffer洗涤磁珠三次，获得蛋白-探针-磁珠复合物。

进一步，步骤(1)中所述BSA的质量体积百分浓度为0.05-0.5％。

优选地，所述BSA的质量体积百分浓度为0.2％。

进一步，所述的tRNAs的浓度为30-60μg/mL。

优选地，所述的tRNAs的浓度为40μg/mL。

进一步，步骤(2)中所述裂解buffer配方为：10mM Tris-Cl(pH7.5)、10mM NaCl、2mM EDTA和0.5％TritonX-100。

进一步，步骤(3)中所述结合buffer配方为：10mM Tris-Cl(pH7.5)、1.5mM MgCl2、150mM KCl、0.5mM DTT和0.05％NP-40。

本发明为更好的模拟细胞内胎儿DNA特有的甲基化结构，我们根据胎儿基因上特有的甲基化修饰位点周边序列并结合一些插入序列，从而使序列的二级结构呈茎环状。

本发明的特点和有益效果如下：

1)本发明通过模拟细胞内天然存在的胎儿特异的DNA甲基化修饰结构，使DNA探针上的修饰更易富集结合蛋白。

2)本发明通过预先使用BSA和tRNAs封闭磁珠，能分别降低磁珠与非特异性蛋白和基因组DNA的结合，又不会影响探针与目的蛋白的结合。

3)本发明中磁珠首先与探针孵育，去除多余探针后再与总蛋白孵育，较传统探针先与蛋白孵育再与磁珠孵育或探针、蛋白和珠子同时孵育极大的节约了磁珠的使用量，节约实验成本。本发明采用磁珠取代了琼脂糖珠，省掉离心的步骤，节约时间并降低非特异性沉淀。同时，采用磁珠法洗涤取代了琼脂糖珠离心的步骤，可以使上清液去除的更加彻底，提高反应的特异性。

综上所述，本发明特异的DNA甲基化修饰探针序列及二级结构能够有效捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白，显著提高对特异性结合蛋白的富集。

【附图说明】

图1是是本发明探针设计原理图。

图2是应用本发明探针捕获的结合蛋白图。

【具体实施方式】

结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1一种用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针设计方法，包括以下步骤：

1)甲基化探针的碱基序列：

对照非甲基化探针的碱基序列：

所述的探针由碱基茎环结构组成，探针的3′或5′具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合。

所述探针的长度是140bp。

所述探针的5′端到第一个甲基化位点的长度为4bp。

所述探针的3′端到第十四个甲基化位点的长度为5bp。

所述探针的甲基化修饰位点的数目为14个。

所述甲基化探针上包含14个胞嘧啶(C)甲基化修饰位点，所述胞嘧啶甲基化(5-mC)是指胞嘧啶5'碳位上发生偶联甲基化修饰。

所述的5′-biotin是指在序列的5′端偶联上生物素标记。

具体原理图如图1所示。

实施例2一种利用实施1中的探针捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的方法

具体步骤如下：

(1)制备探针-磁珠复合物：用1mL 1×TBST洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TBST洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和tRNAs的1×TBST，室温孵育1h后去除TBST溶液的上清；将2-5μg DNA探针加入预处理的磁珠中，并加入100μL 1×TBST，4℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TBST洗涤磁珠两次，去除TBST。

其中，所述1×TBST的配方为：10mM Tris-HCl，10mM NaCl，0.1％Tween-20；所述1×TBST中BSA的浓度为0.05-0.5％，tRNAs的浓度为20-70μg/mL。

(2)提取并预处理细胞总蛋白：用预冷1×PBS洗涤2×107个细胞两次，每次4℃、1200rpm离心5min，弃上清；加入800μL预冷裂解Buffer、8μL10mg/mL的PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液、8μL protease inhibitor cocktail和4μL100 mM DTT(二硫苏糖醇)溶液，剧烈涡旋20秒钟充分混匀并重悬沉淀，冰浴30min；每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12,000g-16,000g离心15min，弃沉淀，上清为细胞总蛋白提取物；向总蛋白提取物中加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转60min；上清液为预处理的总蛋白。所述裂解Buffer的配方为：10mM Tris-Cl(pH7.5)、10mM NaCl、2mM EDTA和0.5％TritonX-100；

(3)捕获结合蛋白：将步骤2制备的总蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入200μL结合Buffer、5μL protease inhibitor cocktail、5μL10mg/mL的PMSF溶液和5μL 0.5MEDTA溶液；4℃旋转混合孵育60-120min，收集磁珠，4℃，加入1000μL结合Buffer、10μL10mg/mL的PMSF溶液和10μL protease inhibitor cocktail，洗涤磁珠，再重复洗涤三次，即为探针-蛋白复合物。所述结合Buffer的配方为：10mM Tris-Cl(pH7.5)、1.5mM MgCl2、150mM KCl、0.5mMDTT和0.05％NP-40；

将上述探针-蛋白复合物用6×蛋白loading buffer在100℃下煮样变性10min，制备电泳样品，用5％-25％的梯度聚丙烯酰胺大胶将pulldown样品进行电泳分离，再通过银染的方法显示蛋白电泳条带(如图2所示)，结果显示，与非甲基化探针相比，甲基化探针能有效捕获与胎儿特有DNA甲基化探针特异性结合的蛋白(如图2所示)，再将这些特异结合的蛋白条带割胶回收进行质谱鉴定，获得与胎儿特有DNA甲基化修饰探针的结合蛋白。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白的探针设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)甲基化探针的碱基序列：

对照非甲基化探针的碱基序列：

2)在所述探针5′端与第一个甲基化位点之间、3′端与第二个甲基化位点之间插入序列为人类基因组无关序列，且插入序列不与探针中其他序列形成互补；

其中，所述的探针由碱基茎环结构组成，探针的3′或5′具有生物素标记，能与磁珠上的亲和素结合；所述探针的长度是10-490bp；

所述探针的5′端到第一个甲基化位点的长度为1-70bp；所述探针的3′端到第十四个甲基化位点的长度为1-70bp；

所述探针的甲基化修饰位点的数目为1-49个；

所述甲基化探针上包含14个胞嘧啶(C)甲基化修饰位点，所述胞嘧啶甲基化(5-mC)是指胞嘧啶5′碳位上发生偶联甲基化修饰；所述的5′-biotin是指在序列的5′端偶联上生物素标记。

2.根据权利要求1所述的用于捕获胎儿特有DNA甲基化修饰结合蛋白探针的设计方法，其特征在于，所述探针的长度是140bp，探针的5′端到第一个甲基化位点的长度为4bp，所述探针的3′端到第十四个甲基化位点的长度为5bp，所述探针的甲基化修饰位点的数目为14个。