CN104297309B

CN104297309B - 检测致病菌的电化学传感器、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104297309B
Application number: CN201410590803.7A
Authority: CN
Inventors: 薛峰; 滕军; 蒋原; 陈伟; 曾德新; 蒋鲁岩; 袁芳; 夏晓莉; 邵景东
Original assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-10-29
Also published as: CN104297309A

Abstract

本发明提供检测致病菌的电化学传感器、制备方法及其应用，涉及致病菌检测领域。本发明检测致病菌的电化学传感器，包括工作电极，所述工作电极为表面修饰有寡聚核苷酸探针2的波碳电极；所述传感器还包括工作液1和工作液2；所述工作液1为标记有抗致病菌抗体的纳米磁珠分散液；所述工作液2为标记有抗致病菌抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子分散液；所述寡聚核苷酸探针1的5’端修饰有亚甲蓝，寡聚核苷酸探针2的3’端修饰有氨基，所述寡聚核苷酸探针1和2的碱基序列互补。采用本发明传感器检测致病菌，方便快捷，显著提高了检测灵敏度。

Description

检测致病菌的电化学传感器、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及致病菌检测领域，具体涉及一种检测致病菌的电化学传感器、制备方法及其应用。

背景技术

致病菌(Pathogenic bacteria)是指能引起疾病的微生物。致病菌包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。

例如：空肠弯曲菌是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。在它们的生殖道或肠道有大量细菌，故可通过分娩或排泄物污染食物和饮水。空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。主要症状为腹泻和腹痛，有时发热，偶有呕吐和脱水。人群普遍易感，5岁以下儿童的发病率最高，夏秋季多见。空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为3～5天，对人的致病部位是空肠、回肠及结肠。大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，分布在自然界。虽然绝大多数大肠杆菌与人类有着良好合作，但是仍有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力，一旦感染，将造成严重疫情。其中最具代表性的就是代号为O157:H7的大肠杆菌，它是EHEC(肠出血性大肠杆菌)家族中的一员。人体感染EHEC后，会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻，同时伴有发热、呕吐等表现，多为EHEC产生的毒素所致。某些严重感染者毒素随血行播散造成溶血性贫血，红细胞、血小板减少；肾脏受到波及时还会发生急性肾功能衰竭甚至死亡。

目前检测致病菌的常见方法有：平板培养法(张淑红,吴清平,张菊梅,郭伟鹏.显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用[J].微生物学通报,2006,33(06):108-111.)、仪器法(吕艳芳,马春颖,励建荣.实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用[J].食品与发酵科技,2014,50(2):80-84.)、免疫层析试纸条法(夏诗琪,徐超莲,刘道峰,郭琦,吴松松,赖卫华.胶体金免疫层析法联检食品中5种典型沙门氏菌模型的建立和优化[J].食品科学,2014,35(22):154-158.)等。但这些方法操作复杂，对检测环境或仪器要求高，耗时较长，如平板法费时且环境要求严格，仪器法既昂贵又繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测致病菌的电化学传感器，能够简单、快速、灵敏检测致病菌。

本发明的另一目的是提供检测致病菌的电化学传感器的制备方法，该方法简单，效率高。

本发明的再一目的是提供采用所述电化学传感器检测致病菌的方法，该方法简单、快速、灵敏。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

检测致病菌的电化学传感器，包括工作电极，所述工作电极为表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极；所述传感器还包括工作液1和工作液2；所述工作液1为标记有抗致病菌抗体的纳米磁珠分散液；所述工作液2为标记有抗致病菌抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子分散液；所述寡聚核苷酸探针1的5’端修饰有亚甲蓝，寡聚核苷酸探针2的3’端修饰有氨基，所述寡聚核苷酸探针1和2的碱基序列互补。

在本发明中，所述寡聚核苷酸探针1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)为5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’，所述寡聚核苷酸探针2的核苷酸序列(SEQID NO:2)5’-CCGATTCGCGTACCGTGCAC-3’。

在本发明中，所述致病菌可以为空肠弯曲菌。

本发明还提供所述检测致病菌的电化学传感器的制备方法，所述表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极采用如下方法制备：在玻碳电极表面沉积氧化石墨烯薄膜，在所述氧化石墨烯薄膜上修饰寡聚核苷酸探针2。

在本发明中，所述表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极采用如下方法制备：将玻碳电极用氧化铝粉末抛光，在乙醇和水中进行超声清洗；将氧化石墨烯悬浊液滴加在超声清洗后的玻碳电极表面，得到表面沉积有氧化石墨烯薄膜的玻碳电极；表面沉积有氧化石墨烯薄膜的玻碳电极在N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液中进行活化，然后在活化后的玻碳电极表面滴加寡聚核苷酸探针2溶液，所述寡聚核苷酸探针2的3’端修饰有氨基、核苷酸序列(SEQ ID NO:2)为5’-CCGATTCGCGTACCGTGCAC-3’。

在本发明中，所述工作液1采用如下方法制备：纳米磁珠采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺活化，然后加入抗空肠弯曲菌抗体进行反应，得到标记有抗空肠弯曲菌抗体的纳米磁珠分散液。

在本发明中，所述工作液2采用如下方法制备：

(1)在醋酸溶液中加入三(2-羧乙基)膦和3’端修饰有巯基、5’端修饰亚甲蓝的生物探针，所述生物探针的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)为5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’，进行反应；

(2)在步骤(1)反应所得混合物中，加入金纳米粒子进行反应；

(3)在步骤(2)所得反应混合物中，加入抗空肠弯曲菌抗体进行反应；然后加入三磷酸脱氧腺苷和牛血清白蛋白进行反应；

(4)步骤(3)所得反应混合物离心，取沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，得到标记有抗致病菌抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子分散液。

本发明还提供上述电化学传感器检测致病菌的方法，包括如下步骤：

(1)将工作液1与含有不同浓度致病菌的溶液混合，分离纳米磁珠并悬浮于缓冲液中，得到纳米磁珠分散液；

(2)在纳米磁珠分散液中加入工作液2，进行反应；

(3)将步骤(2)获得的混合物滴加到工作电极上进行反应，清洗，在工作电极两端施加电压，检测电流信号，得到致病菌浓度与电流的标准曲线；

(4)将待测样品按照步骤(1)-(3)进行检测，将得到的电流代入标准曲线中，得到待测样品中致病菌的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的原理如图1所示。由于抗原与抗体免疫识别，本发明标记有抗致病菌抗体的纳米磁珠和标记有抗致病菌抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子均能够特异性的识别样品中的致病菌，形成了磁珠-金粒子复合物。磁珠-金粒子复合物的寡聚核苷酸探针1与工作电极表面修饰的寡聚核苷酸探针2互补配对，同时亚甲蓝发生氧化还原反应，从而有电子的迁移转化形成电流而被检测到。本发明采用电化学作为检测手段，方便快捷；采用标记有抗致病菌抗体的纳米磁珠作为富集致病菌的手段，显著提高了检测灵敏度。本发明为通用型方法，只需要替换特异性识别致病菌的单克隆抗体，即可实现对任意致病菌的快速、现场检测，应用范围广，简单易于推广应用。

附图说明

图1显示了本发明检测方法的原理。

图2是空肠弯曲菌浓度与电流强度的标准曲线。

具体实施方式

本发明中室温是指20-25℃。

浓度为10mM的PBS缓冲液(pH7.4)：取137mmolNaCl、2.7mmolKCl、10mmol Na₂HPO₄和2mmol KH₂PO4溶于水，调节pH至7.4，用水定容至1L。

MES缓冲液：100mmol 2-(N-吗啉)乙磺酸溶于水，调节pH至5.9，用水定容至1L。

本发明中化学反应如果没有公开反应温度，均指在室温下反应。

实施例1检测空肠弯曲菌的电化学传感器

(1)工作液1的制备

工作液1为标记有抗空肠弯曲菌单克隆抗体的纳米磁珠分散液，纳米磁珠浓度为10mmol/L，纳米磁珠与抗空肠弯曲菌单克隆抗体的摩尔比为1:6。

取1.08g氯化铁和0.2g柠檬酸三钠溶于20mL乙二醇中，然后加入1.2g乙酸钠，搅拌30min，置200℃油浴中保温10小时，得到浓度为10mM的纳米磁珠分散液。

取10mM的纳米磁珠溶液60μL、0.1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液15μL和0.01mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液15μL，混合，室温下反应10-30分钟，对纳米磁珠进行活化；加入0.01mg抗空肠弯曲菌单克隆抗体(购自abcam，产品编号ab31468，抗空肠弯曲菌单克隆抗体效价1:200，抗空肠弯曲菌单克隆抗体亲和常数1.2×10¹⁰L/M)，混合均匀，室温下反应2-4小时，采用磁力架磁性分离纳米磁珠，用浓度为10mM的PBS缓冲液(pH7.4)重悬，即得抗空肠弯曲菌单克隆抗体标记的纳米磁珠分散液。

(2)工作液2的制备

工作液2是标记有抗空肠弯曲菌单克隆抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子分散液。工作液2中金纳米粒子浓度是0.1mg/mL，抗空肠弯曲菌单克隆抗体、寡聚核苷酸探针1和金纳米粒子之间的摩尔比是1：1：10。寡聚核苷酸探针1的5’端修饰有亚甲蓝，核苷酸序列为5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’。

金纳米粒子分散液的制备方法：在锥形瓶中加5mL、1g/L的氯金酸溶液，然后用灭菌水补足体积到50mL，在搅拌状态下加热至暴沸，加入0.6～1mL浓度为1％(质量百分浓度)的柠檬酸钠溶液，持续搅拌，至溶液颜色稳定至酒红色，得到浓度为0.1mg/mL金纳米粒子分散液。

在玻璃瓶中加入2μL浓度为500mM的醋酸水溶液、3μL浓度为1mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液和20μL浓度为1nM的生物探针1，混合反应1小时。然后加入200μL浓缩10倍的金纳米粒子分散液(pH 8.0)，混合反应1小时。然后加入100μL浓度为0.1mg/mL的抗空肠弯曲菌单克隆抗体(来源同上)，混合反应1小时。加入20μL浓度为100μM的三磷酸脱氧腺苷(dATP)溶液和20μL、10％(w/v)牛血清白蛋白溶液，混合反应半小时。将反应混合物，在9.4g的离心力下离心7分钟，取沉淀重悬于500μLPBS缓冲液(10mM、pH7.4)中，得到标记有抗空肠弯曲菌单克隆抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子分散液，放置于4℃环境中，贮存。

生物探针1：在核苷酸片段5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’的3’端修饰巯基，5’端修饰亚甲蓝(MB)，结构式为MB-5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’-SH，由上海生工生物公司合成。

(3)工作电极的制备

工作电极为表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极。

玻碳电极用粒径为0.05微米的氧化铝粉末抛光，然后在无水乙醇和超纯水中分别超声2分钟。

称取25mg氧化石墨烯加入到50mL浓度为0.1mol/L的PBS溶液中，然后超声30分钟使其形成浓度为0.5mg/mL的均匀棕色氧化石墨烯悬浊液。

在玻碳电极表面滴加20μL上述氧化石墨烯悬浊液，干燥，在玻碳电极表面沉积氧化石墨烯薄膜。

将表面沉积有氧化石墨烯薄膜的玻碳电极置于浓度为1.5mol/L的NaOH溶液中，在1.5V电压下反应5分钟。取出玻碳电极，在电极表面滴加10μL含有100mmol/L N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和400mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液(0.1mol/L、pH5.9)，进行活化反应1小时，然后用MES缓冲液清洗。

在活化后的电极表面滴加10μL浓度为25μM的寡聚核苷酸探针2，反应1小时，用PBS缓冲液(10mM、pH7.4)清洗，获得工作电极。

寡聚核苷酸探针2的3’端修有饰氨基，核苷酸序列为5’-CCGATTCGCGTACCGTGCAC-3’，结构式为5’-CCGATTCGCGTACCGTGCAC-3’-NH₂ ⁺，由上海生工生物公司合成。

(4)Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极。

实施例2检测实际样品中的空肠弯曲菌

1.建立标准曲线

采用实施例1中检测空肠弯曲菌的电化学传感器检测空肠弯曲菌。检测过程均在室温下。

(1)取20μL工作液1加入到1mL添加有不同浓度空肠弯曲菌(ATCC33560，购自北京中原公司)的牛奶溶液中，混合后放置在旋转混合仪上，在25转/分钟条件下，反应10分钟。采用磁力架磁性分离纳米磁珠-空肠弯曲菌复合物，去除上清，加入1mL浓度为10mM的PBS(pH 7.4)溶液，并放在旋转混合仪上清洗3分钟，之后重复清洗3次，最后加入100μL PBS缓冲液(10mM、pH 7.4)重悬，获得纳米磁珠-空肠弯曲菌复合物分散液。

(2)各取20μL免疫磁珠-空肠弯曲菌复合物分散液和工作液2混合，在20转/分钟条件下反应30分钟，获得磁珠-金粒子复合物溶液。

(3)在工作电极表面滴加10μL磁珠-金粒子复合物溶液，反应1小时，用PBS缓冲液(10mM、pH 7.4)清洗。

(4)Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，采用示差脉冲伏安法，在电极两端施加0.0伏到-0.4伏电压，检测工作电极产生的电流。得到空肠弯曲菌浓度与电流强度的标准曲线(图2)，可以看出本发明检测方法的检测范围是5-400cfu/mL。

2.具体样品检测

将具体样品采用本实施例标题1方法检测，将测得电信号(电流)值带入标曲中即可。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120> 检测致病菌的电化学传感器、制备方法及其应用

<130> 20141029

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 寡聚核苷酸探针1的核苷酸序列

<400> 1

gtgcacggta cgcgaatcgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 寡聚核苷酸探针2的核苷酸序列

<400> 2

ccgattcgcg taccgtgcac 20

Claims

1.检测致病菌的电化学传感器，包括工作电极，其特征在于所述工作电极为表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极；所述传感器还包括工作液1和工作液2；所述工作液1为标记有抗致病菌抗体的纳米磁珠分散液；所述工作液2为标记有抗致病菌抗体和寡聚核苷酸探针1的金纳米粒子分散液；所述寡聚核苷酸探针1的5’端修饰有亚甲蓝，寡聚核苷酸探针2的3’端修饰有氨基，所述寡聚核苷酸探针1和2的碱基序列互补。

2.根据权利要求1所述检测致病菌的电化学传感器，其特征在于所述寡聚核苷酸探针1的核苷酸序列为5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’，所述寡聚核苷酸探针2的核苷酸序列5’-CCGATTCGCGTACCGTGCAC-3’。

3.根据权利要求1或2所述检测致病菌的电化学传感器，其特征在于所述致病菌为空肠弯曲菌。

4.权利要求1所述检测致病菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于所述表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极采用如下方法制备：在玻碳电极表面沉积氧化石墨烯薄膜，在所述氧化石墨烯薄膜上修饰寡聚核苷酸探针2。

5.根据权利要求4所述检测致病菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于所述表面修饰有寡聚核苷酸探针2的玻碳电极采用如下方法制备：将玻碳电极用氧化铝粉末抛光，在乙醇和水中进行超声清洗；将氧化石墨烯悬浊液滴加在超声清洗后的玻碳电极表面，得到表面沉积有氧化石墨烯薄膜的玻碳电极；表面沉积有氧化石墨烯薄膜的玻碳电极在N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液中进行活化，然后在活化后的玻碳电极表面滴加寡聚核苷酸探针2溶液，所述寡聚核苷酸探针2的3’端修饰有氨基、核苷酸序列为5’-CCGATTCGCGTACCGTGCAC-3’。

6.根据权利要求4或5所述检测致病菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于所述工作液1采用如下方法制备：纳米磁珠采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺活化，然后加入抗空肠弯曲菌抗体进行反应，得到标记有抗空肠弯曲菌抗体的纳米磁珠分散液。

7.根据权利要求6所述检测致病菌的电化学传感器的制备方法，其特征在于所述工作液2采用如下方法制备：

(1)在醋酸溶液中加入三(2-羧乙基)膦和3’端修饰有巯基、5’端修饰亚甲蓝的生物探针，所述生物探针的核苷酸序列为5’-GTGCACGGTACGCGAATCGG-3’，进行反应；

(2)在步骤(1)反应所得混合物中，加入金纳米粒子进行反应；

8.采用权利要求1-3之一所述电化学传感器检测致病菌的方法，包括如下步骤：

(2)在纳米磁珠分散液中加入工作液2，进行反应；