CN101248169B - 产生l-谷氨酸的细菌和用于产生l-谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

用于产生L-谷氨酸的方法，其包括在培养基中培养具有产生L-谷氨酸的能力并且经修饰以使gluX失活的棒状杆菌型细菌，以在培养基或细胞中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。

Description

产生L-谷氨酸的细菌和用于产生L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵工业，并且本发明涉及使用棒状杆菌型细菌(coryneformbacterium)有效产生L-谷氨酸的方法。

背景技术

通常使用具有产生L-谷氨酸的能力的属于短杆菌属(Brevibacterium)或棒杆菌属(Corynebacterium)等的棒状杆菌型细菌通过发酵来产生L-谷氨酸。为了改进这些棒状杆菌型细菌的生产力，使用从自然界分离的细菌菌株，或它们的人工突变菌株或它们通过基因重组修饰的菌株。

作为通过基因重组技术将产生L-谷氨酸的能力改进的棒状杆菌型细菌，迄今为止已经开发的是将谷氨酸脱氢酶活性、柠檬酸合酶活性和丙酮酸羧化酶活性增强的棒状杆菌型细菌(专利文献1)，将α-酮戊二酸脱氢酶活性、或α-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸裂合酶活性降低的棒状杆菌型细菌(专利文献2和3)等。

同时，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)染色体的完整核苷酸序列已经测定(非专利文献1)。然而，其3099个推定的orf中的大约40％与功能已知的其它微生物的基因显示低同源性，其编码功能未知的蛋白质，并且缺失这些基因的影响至今未知。

专利文献1：International Patent Publication WO00/18935

专利文献2：International Patent Publication WO95/34672

专利文献3：Japanese Patent Laid-open(KOKAI，JP-A)No.01-296994

非专利文献1：Appl.Microbiol.Biotechnol.，62(2-3)，pp.99-109(2003)

发明内容

本发明的目的是提供将产生L-谷氨酸的能力改进的棒状杆菌型细菌，和提供使用这种细菌有效产生L-谷氨酸的方法。

本发明的发明人为了达到上述目的进行了多方面研究。结果，他们发现如果在棒状杆菌型细菌中将gluX基因失活，能够改进该细菌产生L-谷氨酸的能力，并且由此完成了本发明。

即，本发明提供以下各项。

(1)具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，对所述棒状杆菌型细菌进行修饰以使gluX基因失活。

(2)根据(1)的棒状杆菌型细菌，通过将突变引入染色体上的gluX基因或其表达调控区来修饰所述棒状杆菌型细菌，以使gluX基因的表达量降低。

(3)根据(1)或(2)的棒状杆菌型细菌，其中将染色体上的gluX基因破坏。

(4)用于产生L-谷氨酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养根据(1)-(3)任一项的棒状杆菌型细菌以产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。

附图简述

图1：显示质粒pBS3的构建方法的图示。

图2：显示质粒pBS4S的构建方法的图示。

图3：显示用于破坏gluX的质粒pBXGXD的构建方法的图示。

优选实施方式描述

在下文中，将详细说明本发明的实施方式。

<1>本发明的棒状杆菌型细菌

用于本发明的棒状杆菌型细菌包括棒杆菌属细菌，和曾经归类于短杆菌属，但是已经重新归类于棒杆菌属的那些细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且进一步包括属于极其接近棒杆菌属的短杆菌属的细菌。具体实例包括以下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

具体而言，可包括以下菌株：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

醋谷棒杆菌ATCC 15806

烷醇棒杆菌ATCC 21511

美棒杆菌ATCC 15991

谷氨酸棒杆菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060、ATCC 13869

百合花棒杆菌ATCC 15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965

嗜热产氨棒杆菌AJ 12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC 13868

二歧短杆菌ATCC 14020

黄色短杆菌ATCC 13826、ATCC 14067、AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 13869

玫瑰色短杆菌ATCC 13825

解糖短杆菌ATCC 14066

生硫短杆菌ATCC 19240

产氨短杆菌ATCC 6871、ATCC 6872

白色短杆菌ATCC 15111

蜡状短杆菌ATCC 15112

嗜氨微杆菌ATCC 15354

这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)获得。即，给予每个菌株登记号。使用该登记号能够订购菌株。对应于各菌株的登记号列于ATCC的目录。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，将AJ12340菌株于1989年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(Naional Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of international Trade andIndustry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，位于Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并给予登录号FERMBP-1539。根据布达佩斯条约的规定，将AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并给予登录号FERMBP-2205。

在本发明中，“产生L-谷氨酸的能力”的意思是当在培养基中培养本发明的棒状杆菌型细菌时，在培养基中积累L-谷氨酸的能力。本发明的细菌可能具有这种产生L-谷氨酸的能力作为所述棒状杆菌型细菌野生菌株的特性，或所述能力可能是通过培育赋予的性质。此外，可以通过下文描述的方式来修饰细菌以使gluX失活来赋予产生L-谷氨酸的能力。

为了通过培育来赋予产生L-谷氨酸的能力，可以使用通常用于培育棒状杆菌型细菌的方法，例如，用于获得代谢调节突变菌株、构建将目标物质生物合成系统中的酶增强的重组菌株(参考“Amino Acid Fermentation”，the JapanScientific Societies Press[Gakkai Shuppan Center]，1st Edition，published on May30，1986，pp.77-100)等的那些方法。在那些方法中，有待赋予的代谢调节突变，或目标物质合成系统酶的增强等可以单独赋予或进行，或者可以将它们中的两个或更多个组合赋予。可以将代谢调节突变的赋予和生物合成系统酶的增强进行组合。

在下文中，将描述用于赋予产生L-谷氨酸的能力的方法。用于通过培育来赋予产生L-谷氨酸能力的方法的实例包括增强基因的表达，所述基因编码涉及L-谷氨酸生物合成的酶。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸异构酶等。

增强这些基因的表达能够通过以下方法完成：引入扩增质粒，通过在适合的质粒中引入含有这些基因中任一的DNA片段来获得所述质粒，例如，含有至少负责质粒在棒状杆菌型细菌中复制的基因的质粒载体；通过接合、基因转移等增加这些基因在染色体中的拷贝数；将突变引入这些基因的启动子区；或将启动子用更强的启动子替代(参考International Patent PublicationWO00/18935)。

当扩增质粒或染色体中的基因时，用于基因表达的启动子可以是任何启动子，只要选择在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子，而且可为所使用的基因的固有启动子。还能够通过适当地选择启动子来控制基因的表达量。经修饰以使柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、谷氨酸脱氢酶基因和/或异柠檬酸脱氢酶基因的表达增强的棒状杆菌型细菌的实例包括International Patent Publication WO00/18935和European Patent Publication No.1010755中描述的微生物。

此外，也可以通过降低或缺失下述酶的活性来获得赋予产生L-谷氨酸的能力的修饰，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的反应以产生另外的化合物。催化合成除L-谷氨酸以外化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脱氢酶、乙酰磷酸转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、乙酰甲酸转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶(1-pyrroline dehydrogenase)等。

为了降低或缺失上述酶中任一种的活性，可以通过常规诱变方法，将降低或缺失所述酶胞内活性的突变引入染色体上前述酶的基因中。例如，其能够通过缺失染色体上编码所述酶的基因，或通过基因重组修饰表达调控序列如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列、操纵基因、终止子和弱化子来实现。此外，其能够通过引入氨基酸取代的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)或在染色体上的酶编码区中添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变来实现，或通过将基因部分或整体地缺失来实现(Journal of Biological Chemistry，272：8611-8617(1997))。此外，还能够通过构建编码突变酶的基因来使酶活性降低或缺失，其中将编码区缺失，并且通过同源重组等用构建的基因取代染色体上的正常基因。α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的棒状杆菌型细菌的实例包括以下菌株，其在Japanese Patent Laid-open Nos.07-834672、06-237779、01-296994等中描述。

乳发酵短杆菌AS菌株(WO95/34672)

乳发酵短杆菌AJ12821菌株(FERM BP-4172；参见FR9401748)

黄色短杆菌AJ12822菌株(FERM BP-4173；参见FR9401748)

谷氨酸棒杆菌AJ12823菌株(FERM BP-4174；参见FR9401748)

赋予产生L-谷氨酸的能力的其它方法包括赋予对有机酸类似物或呼吸抑制剂的抗性，或赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性。这些方法的实例包括，例如赋予对苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌类(naphtoquinones)的抗性(JP56-1889A)，赋予对HOQNO的抗性(JP56-140895A)，赋予对α-酮丙二酸的抗性(JP57-2689A)，赋予对胍的抗性(JP56-35981A)，赋予对青霉素的敏感性(JP04-88994A)等。

这些细菌的实例包括以下菌株：

黄色短杆菌AJ11355(FERM P-5007；JP56-1889A)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；JP56-1889A)

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)

黄色短杆菌AJ11564(FERM P-5472；JP56-140895A)

黄色短杆菌AJ11439(FERM P-5136；JP56-35981A)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；JP04-88994A)

本发明的棒状杆菌型细菌获得自亲本菌株，所述亲本菌株也可以是在诱导L-谷氨酸产生的条件下产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌，所述条件如限制生物素的条件、添加表面活性剂的条件和添加青霉素的条件(为了方便，在下文中称作“产生L-谷氨酸的条件”)。“产生L-谷氨酸的条件”意指将诱导L-谷氨酸产生的物质添加至培养基的条件，所述培养基含有碳源、氮源、无机盐和痕量有机营养物，例如氨基酸和维生素(如有需要)；和对培养基中抑制L-谷氨酸产生的物质的量进行限制的条件。诱导L-谷氨酸产生的物质包括抗生素如青霉素G和包括饱和脂肪酸的表面活性剂如Tween 40、60等。抑制L-谷氨酸产生的物质包括生物素(Amino Acid Fermentation，Japan ScientificSocieties Press 1986)。

在本文中，在产生L-谷氨酸的条件下培养基中以上物质的浓度如下。生物素的浓度少于30μg/L，优选少于20μg/L，更优选少于10μg/L，并且所述培养基可以完全不含生物素。培养基中青霉素的浓度不少于0.1U/ml，优选不少于0.2U/ml，更优选不少于0.4U/ml。培养基中表面活性剂的浓度不少于0.5g/L，优选不少于1g/L，更优选不少于2g/L。然而，只要诱导L-谷氨酸的产生，这些物质的任何浓度均可以应用。此外，当培养基含有抗生素或表面活性剂时，优选所述培养基含有高浓度的生物素。在这种情况下，优选所述培养基含有多于50μg/L，优选多于100μg/L，更优选多于200μg/L的生物素。

本发明中使用的亲本菌株的实例包括上述的棒状杆菌型细菌的野生型菌株，或以下菌株：

黄色短杆菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)

乳发酵短杆菌AJ11426(FERM P-5123JP56-048890A)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137JP56-048890A)

乳发酵短杆菌AJ11796(FERM P-6402JP58-158192A)

本发明的棒状杆菌型细菌是具有前文所述的产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌，并且经修饰以使gluX基因失活。能够通过修饰具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌以使gluX基因失活来获得本发明的棒状杆菌型细菌。在本发明的棒状杆菌型细菌的培育中，既可以首先进行产生L-谷氨酸能力的赋予，也可以首先进行使gluX基因失活的修饰。

表述“修饰以使gluX基因失活”相应于下述情况：与亲本菌株或野生型菌株相比，由gluX基因编码的GluX蛋白的每细胞分子数降低；每分子GluX蛋白的活性降低；完全不再产生GluX蛋白分子等。例如，该表述意指与未修饰的菌株或野生型菌株相比，由gluX基因编码的蛋白质的量降低；gluX基因的表达量降低；对所述蛋白质的三维结构进行修饰，并且由此不能产生正常的GluX蛋白；或完全不能产生棒状杆菌型细菌的野生型菌株或未修饰菌株能够产生的GluX蛋白。作为参照用于比较的野生型棒状杆菌型细菌是例如谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC 13869或ATCC 13032。

能够通过与野生型或未经修饰的菌株比较gluX的mRNA量来确认gluX基因表达量的降低。用于确认表达量的方法的实例包括Northern杂交和RT-PCR(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)2001)。只要与野生型菌株或未修饰菌株相比有所降低，不对表达量的降低程度作具体限制。然而，期望与野生菌株或未修饰菌株相比降低例如至少75％、50％、25％或10％或更少，或可以将表达完全消除。

能够通过基于使用抗体的Western印迹的检测来确认由gluX基因编码的蛋白质的量的降低(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。只要与野生型菌株或未修饰菌株相比有所降低，不对产量的降低程度作具体限制。然而，期望与野生菌株或未修饰菌株相比降低例如至少75％、50％、25％或10％或更少，或可以将活性完全消除，其意味着完全不产生所述蛋白质。

由gluX基因编码的本发明所指的蛋白质(GluX蛋白)是通过失活染色体上的gluX基因而具有改进L-谷氨酸产量的功能的蛋白质。在本文中，棒状杆菌型细菌的GluX蛋白的实例包括由谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的gluX基因(SEQ ID NO：16的核苷酸号1001至1279)编码的蛋白质(SEQ ID NO：17)。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的gluX基因由登记为Genbank Accession No.NC 003450的基因组序列的核苷酸2475838至2476119编码，并且登记为NCg12252。此外，因为gluX基因的核苷酸序列可能依赖于棒状杆菌型细菌的菌种或菌株而有差异，gluX基因可以是SEQ IDNO：16的核苷酸号1001至1279的核苷酸序列的变体。参照SEQ ID NO：16的核苷酸号1001至1279的核苷酸序列，使用BLAST或类似方法(http://blast.genome.jp/)，能够搜索gluX基因的变体。此外，gluX基因的变体包括gluX基因同源物(homologue)，例如，能够使用棒状杆菌型细菌的染色体作为模板和SEQ ID NOS：13和14的合成寡核苷酸通过PCR扩增的基因。

GluX蛋白的实例包括具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的那些。然而，因为使用的密码子可能依赖于棒状杆菌型的菌种或菌株而有差异，并且所述编码GluX的基因的核苷酸序列可能有差异，gluX可以编码包括取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基的如上所述的氨基酸序列，只要不改变GluX蛋白的功能。在本文中，术语“几个”所指的数目是例如2至20，优选2至10，更优选2至5。前述取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基是保守突变，所述保守突变允许正常产生GluX蛋白。保守突变包括：在芳族氨基酸的情况下Phe、Trp和Tyr的相互取代；在疏水氨基酸的情况下Leu、Ile和Val的相互取代；在极性氨基酸的情况下Gln和Asn的相互取代；在碱性氨基酸的情况下Arg、Lys和His的相互取代；在酸性氨基酸的情况下Asp和Glu的相互取代；和在含羟基氨基酸的情况下Ser和Thr的相互取代。典型的保守突变是保守取代，所述保守取代包括：以Ser或Thr取代Ala，以Gln、His或Lys取代Arg，以Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，以Asn、Glu或Gln取代Asp，以Ser或Ala取代Cys，以Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，以Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，以Pro取代Gly，以Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，以Leu、Met、Val或Phe取代Ile，以Ile、Met、Val、Phe取代Leu，以Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，以Ile、Leu、Val或Phe取代Met，以Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，以Thr或Ala取代Ser，以Ser或Ala取代Thr，以Phe或Tyr取代Trp，以His、Phe或Trp取代Tyr和以Met、Ile或Leu取代Val。

gluX基因的变体还可以是能够与由SEQ ID NO：16的1001至1279组成的核苷酸序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针在严紧条件下杂交的DNA。所述“严紧条件”是形成所谓的特异性杂合体(hybrid)，而不形成非特异性杂合体的条件。严紧条件的实例包括那些条件，在该条件下高度同源的DNA互相杂交，例如，不少于80、90、95或97％同源的DNA相互杂交，并且比以上所述同源性低的DNA不相互杂交；或在相应于常规Southern杂交洗涤的盐浓度和温度下，即1×SSC、0.1％SDS在60℃，优选0.1×SSC、0.1％SDS在60℃，更优选0.1×SSC、0.1％SDS在68℃洗涤一次或优选2或3次。探针的长度可以依赖于杂交条件任意地选择。但是，所述长度通常是100bps至1kbps。

表述“修饰以使gluX基因失活”的意思是进行修饰以使GluX蛋白不发挥正常功能。以这种方式修饰的细菌能够通过培育以下细菌获得：使用试剂等将突变引入GluX蛋白中以使所述蛋白质不正常发挥功能的细菌；通过基因工程技术等将突变引入gluX基因中以使GluX蛋白的量降低的细菌；或不再产生GluX蛋白的细菌等。

这可以通过例如缺失染色体上的gluX基因，或通过修饰表达调控序列例如启动子、Shine Dargarno(SD)序列等来完成。此外，所述修饰还可以通过引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)或在编码区添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或通过缺失部分或完整的基因来完成(Journal ofbiological Chemistry 272：8611-8617(1997)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，USA 955511-5515(1998)，Journal of Biological Chemistry266，20833-20839(1991))。

作为待缺失的区域，可以将N-末端侧的区域或C-末端侧的区域缺失，只要产生不正常发挥功能的GluX蛋白。此外，还能够通过将转座子引入gluX的编码区来获得gluX基因的失活，所述转座子携带抗生素抗性基因或对L-谷氨酸的产生有用的基因。

能够通过例如以下方法实现将如上所述的这些突变引入gluX基因：制备通过修饰获得的缺失型基因，所述修饰使基因包括部分gluX序列的缺失并且不产生正常发挥功能的GluX蛋白；和用含有所述基因的DNA转化棒状杆菌型细菌，以引起缺失型基因和染色体上基因的同源重组，并且因此破坏染色体上的gluX基因。已经确定了这种基于同源重组使用基因取代的基因破坏，并且这种方法的实例包括：Datsenko and Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol.97，No.12，pp.6640-6645)开发的称为“Red-driven整合”的使用线性DNA的方法，或使用含有温度敏感复制起点的质粒的方法(U.S.Patent No.6,303,383，Japanese Patent Laid-open No.05-007491)等。此外，这种如上所述使用同源重组基于基因取代的基因破坏还能够使用质粒进行，所述质粒在宿主中不显示复制能力，或所述质粒能够接合转移至棒状杆菌型细菌。

用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(对于这些参见Japanese Patent Laid-open No.2000-262288)，pHSC4(参见FrenchPatent Laid-open No.2667875，1992and Japanese Patent Laid-open No.5-7491)等。在棒状杆菌型细菌中，这些质粒能够在至少25℃自主复制，但是不能在37℃自主复制。将含有pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在国立生命科学和人体技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human-Technology，the Agency of Industrial Science and Technology，the Ministry ofInternational Trade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，邮编：305-5466))，并得到保藏号FERM P-11763。然后根据布达佩斯条约的规定，在1991年8月26日将所述保藏转化为国际保藏，并得到保藏号FERM BP-3524。

作为不在棒状杆菌型细菌中复制的质粒，优选在大肠杆菌中能够复制的质粒，实例包括pHSG299(Takara Bio Inc.)、pHSG399(Takara Bio Inc.)等。能够接合转移的质粒的实例包括pK19mobsacB(J.Bacteriology，174：5462-65(1992))。经修饰而不产生GluX蛋白的缺失型基因的实例包括：包括SEQ ID NO：16的整体或部分区域缺失的基因；引入错义突变的基因；插入转座子或标记基因的基因；引入无义突变的基因；和引入移码突变的基因；但是实例不限于这些基因。

gluX基因的失活可以通过以下方法进行。gluX基因的缺失型基因能够通过以下方法获得。gluX基因能够如下获得：通过Saito and Miura(参见H.Saitoand K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；Text for BioengineeringExperiments，Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)的方法，从棒状杆菌型细菌制备染色体DNA；和使用寡核苷酸用所述染色体DNA进行PCR，所述寡核苷酸基于已知数据库如Genbank的序列构建，并且能够使用SEQ ID NOS：13和14的合成寡核苷酸克隆基因。能够通过如下获得缺失型基因：用PCR扩增全长gluX基因，并且用切割内部位点的限制酶消化PCR产物；或用PCR扩增gluX基因的编码区部分。

随后，将缺失型基因引入棒状杆菌型细菌中温度敏感的质粒，或在棒状杆菌型细菌中不能复制的质粒；并且用所述重组质粒转化棒状杆菌型细菌。转化可以根据至今已经报导的方法进行。转化方法的实例包括：用氯化钙处理受体细胞以增加DNA透过性，已有报导将该方法用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))；和从处于生长期的细胞制备感受态细胞，接着用DNA转化，已有报导将该方法用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Duncan，C.H.，Wilson，GA.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。或者，也可以采用将重组DNA引入受体细胞，已有报导可将这种方法用于枯草芽孢杆菌、放线菌类和酵母的受体细胞(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，GR.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。此外，也能够通过电脉冲方法进行棒状杆菌型细菌的转化(JP2-207791A)。当使用在棒状杆菌型细菌中不复制的质粒进行转化时，在如上所述获得的转化体中质粒上的gluX基因和染色体上的gluX基因进行重组。当使用温度敏感质粒时，将转化体在温度敏感复制起点不发挥功能的温度(25℃)培养以获得引入所述质粒的菌株。将引入所述质粒的菌株在高温培养以消除温度敏感质粒，并且将这种菌株涂布在含有抗生素的平板上。由于温度敏感质粒不能在高温增殖，将质粒消除的菌株无法在含有抗生素的平板上生长，但是质粒上的gluX基因和染色体上的gluX基因重组的菌株将出现，尽管这种菌株出现的概率极低。

在如上所述染色体中引入了重组DNA的菌株中，引起与原先存在于染色体上的gluX基因序列的重组，并且因此在染色体中插入染色体gluX基因和缺失型gluX基因的两种融合基因，和所述融合基因之间的重组DNA的其它部分(载体部分、温度敏感复制起点和药物抗性标记)。

然后为了在染色体DNA上只保留缺失型gluX基因，将gluX基因与载体部分(包括温度敏感复制起点和药物抗性标记)一起从染色体DNA上消除。在这种情况下，将正常gluX基因保留在染色体DNA上，并且将缺失型gluX基因切除；或与之相反，将缺失型gluX基因保留在染色体DNA上，并且将正常gluX基因切除。通过用PCR或Southern杂交来选择将缺失型gluX基因保留在染色体上的菌株，能够获得将gluX基因破坏的菌株。

此外，在棒状杆菌型细菌中发挥致死功能的编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因，也可以用作同源重组的标记(Schafer，A.et al.，Gene，145，pp.69-73(1994))。即，如果果聚糖蔗糖酶在棒状杆菌型细菌中表达，由蔗糖同化产生的果聚糖发挥致死功能，因而所述细菌不能生长。因此，如果将编码果聚糖蔗糖酶的载体保留在染色体上的菌株在含有蔗糖的平板中培养，所述菌株不能生长，因此只有消除所述载体的菌株能够在含有蔗糖的平板上选出。

作为sacB基因或其同源基因，可以使用以下序列。

枯草芽孢杆菌：sacB GenBank Accession Number X02730(SEQ ID NO：7)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)：sacB GenBank AccessionNumber X52988

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)：sacB GenBank Accession NumberL33402

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)：surB GenBank AccessionNumber U34874

Lactobacillus sanfranciscensis：frfA GenBank Accession Number AJ508391

Acetobacter xylinus：lsxA GenBank Accession Number AB034152

Gluconacetobacter diazotrophicus：lsdA GenBank Accession NumberL41732

除了前文所述的将染色体上编码gluX的基因缺失之外，还能够通过引入通过修饰表达调控序列如启动子、Shine-Dalgamo(SD)序列、操纵基因、终止子和弱化子等而使gluX失活的突变来实现gluX的失活。使用基因分析软件如Genetix，或用于表达分析的载体如启动子探针载体，或基于已知信息如获得自Genbank等的信息，能够确定染色体上的表达调控序列。使glux活的突变是例如：用较弱启动子取代gluX启动子区的突变，或使启动子远离共有序列的突变。使用温度敏感质粒或不具有复制能力的质粒能够实现这些突变的引入，如前文所述的情况。

除了前文所述的基因操作方法之外，用于使gluX失活的方法的实例包括，例如，用紫外照射或用于常规诱变的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理棒状杆菌型细菌，并且选择gluX失活的菌株。此外，还能够通过用基于易错PCR、DNA改组或StEP-PCR(Firth AE，Patrick WM，Bioinformatics，2005Jun 2，Statistics of protein library construction)的基因重组人工将突变引入gluX来获得失活的gluX基因。

<3>使用本发明的棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸

能够通过如下方法有效地产生L-谷氨酸：在培养基中培养如上所述获得的棒状杆菌型细菌，以在培养基中产生和积累L-谷氨酸；和从所述培养基中收集L-谷氨酸。

为了使用本发明的棒状杆菌型细菌产生L-谷氨酸，可以通过常规方法使用普通培养基进行培养，所述普通培养基含有碳源、氮源、无机盐和任选地有机微量营养物(micronutrients)如氨基酸和维生素。可以使用合成培养基或天然培养基。可以使用任何种类的碳源和氮源，只要它们能够被所培养的菌株利用。

糖类例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等可以用作碳源。另外，有机酸例如乙酸和柠檬酸，和醇例如乙醇也可以单独使用或与其它碳源组合使用。

氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸盐等可以用作氮源。

可将氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，和含有这些物质的胨、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母提取物和大豆蛋白分解物用作有机微量营养物。当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌株时，优选加入这样的所需的营养物。

磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等可以用作无机盐。通过将发酵温度控制在20至45℃并且将培养基的pH调节至5-9来进行需氧培养。在培养期间当pH降低时，通过添加碱例如碳酸钙或氨气来中和培养基。培养大约10至大约120小时导致在培养基中积累可观量的L-谷氨酸，其通过利用丙酮酸作为中间物的生物合成途径产生。

当用于本发明的棒状杆菌型细菌是在诱导L-谷氨酸产生的条件如限制生物素的条件、添加表面活性剂的条件和添加青霉素的条件下产生L-谷氨酸的棒状杆菌型细菌时，优选将培养基调节至这些L-谷氨酸产生条件中的任一。在本文中，以上物质在培养基中的浓度如下。生物素的浓度少于30μg/L，优选少于20μg/L，更优选少于10μg/L，并且所述培养基可以完全不含生物素。培养基中青霉素的浓度不少于0.1U/ml，优选不少于0.2U/ml，并且更优选不少于0.4U/ml。培养基中表面活性剂的浓度不少于0.5g/L，优选不少于1g/L，更优选不少于2g/L。然而，只要诱导L-谷氨酸的产生，这些物质的任何浓度均可应用。将抗生素或表面活性剂加入培养基时，优选所述培养基含有足够量的生物素。在这种情况下，优选所述培养基含有多于50μg/L，优选多于100μg/L，并且更优选多于200μg/L的生物素。

此外，还能够使用液体培养基以在培养基中使L-谷氨酸析出的方式进行培养，将所述液体培养基调节至L-谷氨酸在培养基中析出的条件。L-谷氨酸析出的条件的实例包括pH 5.0-4.0，优选pH 4.5至4.0，更优选pH 4.3至4.0，特别优选pH 4.0。

在培养之后可以通过已知方法从培养基中收集L-谷氨酸。例如，通过从培养基中去除细胞，和通过浓缩引起结晶，通过离子交换层析等来完成收集。当在L-谷氨酸析出的条件下进行培养时，可通过离心或过滤来收集培养基中析出的L-谷氨酸。在这种情况下，可以将溶解在培养基中的L-谷氨酸析出然后一起分离。

实施例

在下文中，将参考以下实施例对本发明进行具体说明。然而，本发明不限于所述实施例。

实施例1：用于破坏sacB基因的载体的构建

(A)pBS3的构建

使用枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板和SEQ ID NOS：1和2的寡核苷酸作为引物通过PCR获得sacB基因(SEQ ID NO：7)。使用LA Taq(TaKaRa)进行PCR，在94℃温育5分钟，并且将94℃变性30秒、49℃退火30秒和72℃延伸2分钟的循环重复25次。将PCR产物以常规方式纯化，然后通过用BglII和BamHI的消化来平端化。将这种片段插入已经用AvaII切割并且平端化的pHSG299。使用这种DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，并且将所述细胞涂布在含有25μg/ml卡那霉素(以下简写为Km)的LB培养基上，培养过夜。其后，收集出现的菌落，并且分离独立的单菌落以获得转化体。从所得转化体提取质粒，并且将插入了目标PCR产物的质粒命名为pBS3。pBS3的构建方案示于图1。

(B)pBS4S的构建

由于pBS3中存在的卡那霉素抗性基因中含有限制酶SmaI的识别位点，通过交换PCR获得携带SmaI位点被破坏的卡那霉素抗性基因的质粒，所述破坏通过不引起氨基酸取代的核苷酸取代进行。首先，使用pBS3作为模板和SEQID NOS：3和4的合成DNA作为引物进行PCR以获得卡那霉素抗性基因N末端侧序列的扩增产物。然后，为了获得Km抗性基因C末端侧序列的扩增产物，使用pBS3作为模板和SEQ ID NOS：5和6的合成DNA作为引物进行PCR。目标PCR产物能够通过使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)如下进行PCR来获得：在98℃温育5分钟，并且将98℃变性10秒、57℃退火30秒和72℃延伸1分钟的循环重复25次。SEQ ID NOS：4和5的序列彼此部分互补，并且曾经存在于这些序列中的SmaI位点已通过不引起氨基酸取代的核苷酸取代破坏。其后，为了获得将SmaI位点破坏的突变卡那霉素抗性基因片段，将前述卡那霉素抗性基因的N末端侧序列和C末端侧序列的基因产物以基本上等摩尔地混合，并且使用这种混合物作为模板和SEQ ID NOS：3和6的合成DNA作为引物进行PCR，以获得引入了突变的Km抗性基因的扩增产物。能够通过使用Pyrobest DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)如下进行PCR来获得PCR产物：在98℃温育5分钟，并且将98℃变性10秒、57℃退火30秒和72℃延伸1.5分钟的循环重复25次。

将PCR产物以常规方式纯化，然后用BanII消化，并且插入上述pBS3的BanII位点。用获得的DNA转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Bio Inc.)，并且将细胞涂布在含有25μg/ml卡那霉素的LB培养基上，并培养过夜。其后，将单菌落从出现的菌落中分离以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒，并且将插入了目标PCR产物的质粒命名为pBS4S。pBS4S的构建方案示于图2。

实施例2：谷氨酸棒杆菌ATCC 13869的gluX缺陷型菌株的制备

制备用于缺失gluX基因的质粒。使用Bacterial Genomic DNA Purif.Kit(MS Techno Systems)从谷氨酸棒杆菌ATCC 13869提取染色体，并且使用这种染色体作为模板，以及SEQ ID NOS：9和10的引物组合，和SEQ ID NOS：11和12的引物组合，分别扩增大约650bp的片段。使用Ex Taq(Takara Bio Inc.)进行PCR，其中将94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸1分钟的循环重复25次。设计引物SEQ ID NOS：9和10以扩增SEQ ID NO：16的核苷酸号401至1040的区域，并且设计引物SEQ ID NOS：11和12以扩增SEQ ID NO：16的核苷酸号1241至1920的区域。其后，将这两种片段混合制成溶液，使用这种溶液作为模板和SEQ ID NOS：13和14的引物进行PCR以扩增大约1.3kb的片段。使用ExTaq(Takara Bio Inc.)进行PCR，其中将94℃变性30秒、55℃退火10秒和72℃延伸1.5分钟的循环重复25次。设计引物SEQ ID NOS：13和14以将BamHI序列添加至5’端，并且扩增SEQ ID NO：16的核苷酸号441至1870的区域(包括核苷酸号1041至1240区域的缺失)。将扩增的片段用BamHI完全消化，并且连接至已经相似地用BamHI完全消化的实施例1中所述的pBS4S载体(使用LigationKit Ver.2(Takara Bio Inc.))，以构建gluX破坏的载体pBSGXD。构建方案示于图3。

将pBSGXD通过电脉冲方法(Japanese Patent Laid-open No.2-207791)引入谷氨酸棒杆菌ATCC 13869，并且将细胞涂布在含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/l葡萄糖、10g/l聚胨、10g/l酵母提取物、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、3g/l尿素、1.2g/l大豆蛋白水解物、20g/l琼脂，用NaOH调节至pH 7.5)上。在31.5℃进行培养，然后通过PCR确认了生长的菌株是通过同源重组将pBSGXD并入染色体中的一次重组菌株(one time-recombinant strain)。能够使用菌株的染色体作为模板，pBS4S上的特异性序列(SEQ ID NO：15)和染色体上的序列(SEQ IDNO：9)作为引物通过进行PCR来简单地确认候选菌株是否为一次重组菌株。由于pBS4S的序列不存在于非重组菌株的染色体上，PCR扩增的任何片段都不会出现于(appear for)非重组菌株，由此能够进行鉴别。

将获得的一次重组菌株在含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex液体培养基中在31.5℃培养一整天，并且将这种培养液适当地稀释，再涂布至S10平板上(具有上述CM-Dex培养基的成分，其中将5g/l葡萄糖用100g/l蔗糖替换)。选择了几个在S10平板上生长并且表现出卡那霉素敏感性的菌株，并且使用这些菌株的染色体作为模板和SEQ ID NOS：13和14的序列作为引物进行PCR，确认了它们之中的一个菌株是目标的gluX缺陷型菌株。由于在缺陷型菌株中缺失核苷酸号1041至1240的区域，所以扩增的片段短于非缺陷型菌株的扩增片段，因此能够进行鉴别。将如所述获得的缺陷型菌株命名为ATCC 13869ΔgluX。

实施例3：ATCC 13869ΔgluX菌株的谷氨酸产量的测量

通过使用Sakaguchi摇瓶进行培养来检验ATCC 13869ΔgluX菌株的谷氨酸产生能力。将ATCC 13869和ATCC 13869ΔgluX菌株在31.5℃在CM-2B琼脂培养基(10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl、10μg/l生物素、20g/l琼脂，用KOH调节至pH 7.0)上培养一整天，并且接种至20ml种子培养基(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/l MnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、0.48g/l大豆蛋白水解物、300μg/l生物素，用KOH调节至pH 8.0)中。将1g事先经过干热灭菌的碳酸钙添加至培养基，其后在31.5℃以115rpm的速度摇动进行培养。在确认了全部糖被完全消耗之后，将1ml种子培养液接种至20ml主培养基中(50g/l葡萄糖、30g/l硫酸铵、1g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、0.01g/l FeSO₄·7H₂O、0.01g/lMnSO₄·4-5H₂O、200μg/l维生素B1、0.48g/l大豆蛋白水解物、300μg/l生物素，用KOH调节至pH 8.0)，其后添加1g事先经过干热灭菌的碳酸钙，然后在31.5℃以115rpm的速率摇动进行培养。在开始培养2.5小时之后，添加4g/lTween 40(Sigma)。17.5小时后的细胞量(在620nm测量吸光度)、积累的谷氨酸量和残余的糖量示于表1。

确认了ATCC13869ΔgluX菌株的谷氨酸积累与ATCC13869相比有增加，并且由此确认了gluX基因的缺失对于改进谷氨酸产生有效。

表1

	OD620nm	谷氨酸(g/l)	残余的糖(g/l)
				ATCC13869ATCC13869ΔgluX	44.88±0.7743.81±0.46	21.5±0.423.3±0.1	0.00.0

工业实用性

根据本发明，在使用棒状杆菌型细菌通过发酵产生L-谷氨酸的方法中能够将L-谷氨酸的发酵收率(fermentation yield)增加。此外，本发明能够用于培育产生L-谷氨酸的细菌。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

 

<120>产生L-谷氨酸的细菌和用于产生L-谷氨酸的方法

 

<130>C584C7324

 

<150>JP2005-245213

<151>2005-08-26

 

<160>17

 

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>sacB引物1

 

<400>1

cgggatcctt tttaacccat caca                                      24

 

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>sacB引物2

 

<400>2

gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt                                 29

 

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>sacB引物3

 

<400>3

ccttttgaag atcgaccagt tgg                                       23

 

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>sacB引物4

 

<400>4

tacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc                44

 

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>sacB引物5

 

<400>5

cctgggaaaa cagcattcca ggtattag                                       28

 

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>sacB引物6

 

<400>6

tgcaggtcga ctctagagga tcc                                            23

 

<210>7

<211>2014

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

 

<220>

<221>CDS

<222>(464)..(1885)

<223>sacB

 

<400>7

gatccttttt aacccatcac atatacctgc cgttcactat tatttagtga aatgagatat  60

tatgatattt tctgaattgt gattaaaaag gcaactttat gcccatgcaa cagaaactat  120

aaaaaataca gagaatgaaa agaaacagat agatttttta gttctttagg cccgtagtct  180

gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa atagaccagt tgcaatccaa  240

acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc gggtttgtta ctgataaagc  300

aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc ccttacatat  360

tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct tcaaacagga gggctggaag  420

aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga acg atg aac atc aaa    475

                                            Met Asn Ile Lys

                                            1

aag ttt gca aaa caa gca aca gta tta acc ttt act acc gca ctg ctg    523

Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr Thr Ala Leu Leu

5                   10                  15                  20

gca gga ggc gca act caa gcg ttt gcg aaa gaa acg aac caa aag cca    571

Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys Pro

                25                  30                  35

tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg ctg    619

Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met Leu

            40                  45                  50

caa atc cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa ttc    667

Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu Phe

        55                  60                  65

gat tcg tcc aca att aaa aat atc tct tct gca aaa ggc ctg gac gtt    715

Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val

    70                  75                  80

tgg gac agc tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac tat    763

Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn Tyr

85                  90                  95                  100

cac ggc tac cac atc gtc ttt gca tta gcc gga gat cct aaa aat gcg    811

His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ala

                105                 110                 115

gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act tct    859

Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr Ser

            120                 125                 130

att gac agc tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac agc gac aaa    907

Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys

        135                 140                 145

ttc gat gca aat gat tct atc cta aaa gac caa aca caa gaa tgg tca    955

Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser

    150                 155                 160

ggt tca gcc aca ttt aca tct gac gga aaa atc cgt tta ttc tac act    1003

Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr

165                 170                 175                 180

gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gca caa    1051

Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln

                185                 190                 195

gtt aac gta tca gca tca gac agc tct ttg aac atc aac ggt gta gag    1099

Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val Glu

            200                 205                 210

gat tat aaa tca atc ttt gac ggt gac gga aaa acg tat caa aat gta    1147

Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Asn Val

        215                 220                 225

cag cag ttc atc gat gaa ggc aac tac agc tca ggc gac aac cat acg    1195

Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His Thr

    230                 235                 240

ctg aga gat cct cac tac gta gaa gat aaa ggc cac aaa tac tta gta    1243

Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His Lys Tyr Leu Val

245                 250                 255                 260

ttt gaa gca aac act gga act gaa gat ggc tac caa ggc gaa gaa tct    1291

Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu Glu Ser

                265                 270                 275

tta ttt aac aaa gca tac tat ggc aaa agc aca tca ttc ttc cgt caa    1339

Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser Phe Phe Arg Gln

            280                 285                 290

gaa agt caa aaa ctt ctg caa agc gat aaa aaa cgc acg gct gag tta    1387

Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg Thr Ala Glu Leu

        295                 300                 305

gca aac ggc gct ctc ggt atg att gag cta aac gat gat tac aca ctg    1435

Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Thr Leu

    310                 315                 320

aaa aaa gtg atg aaa ccg ctg att gca tct aac aca gta aca gat gaa    1483

Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu

325                 330                 335                 340

att gaa cgc gcg aac gtc ttt aaa atg aac ggc aaa tgg tac ctg ttc    1531

Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe

                345                 350                 355

act gac tcc cgc gga tca aaa atg acg att gac ggc att acg tct aac    1579

Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly Ile Thr Ser Asn

            360                 365                 370

gat att tac atg ctt ggt tat gtt tct aat tct tta act ggc cca tac    1627

Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu Thr Gly Pro Tyr

        375                 380                 385

aag ccg ctg aac aaa act ggc ctt gtg tta aaa atg gat ctt gat cct    1675

Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met Asp Leu Asp Pro

    390                 395                 400

aac gat gta acc ttt act tac tca cac ttc gct gta cct caa gcg aaa    1723

Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Ala Lys

405                 410                 415                 420

gga aac aat gtc gtg att aca agc tat atg aca aac aga gga ttc tac    1771

Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Gly Phe Tyr

                425                 430                 435

gca gac aaa caa tca acg ttt gcg cca agc ttc ctg ctg aac atc aaa    1819

Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Leu Asn Ile Lys

            440                 445                 450

ggc aag aaa aca tct gtt gtc aaa gac agc atc ctt gaa caa gga caa    1867

Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu Glu Gln Gly Gln

        455                 460                 465

tta aca gtt aac aaa taa aaacgcaaaa gaaaatgccg atatcctatt           1915

Leu Thr Val Asn Lys

    470

ggcattttct tttatttctt atcaacataa aggtgaatcc catatgaact atataaaagc  1975

aggcaaatgg ctaaccgtat tcctaacctt ttgaagatc                         2014

 

<210>8

<211>473

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>8

Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr

1               5                   10                  15

Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr

            20                  25                  30

Asn Gln Lys Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg

        35                  40                  45

His Asp Met Leu Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln

    50                  55                  60

Val Pro Glu Phe Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys

65                  70                  75                  80

Gly Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr

                85                  90                  95

Val Ala Asn Tyr His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp

            100                 105                 110

Pro Lys Asn Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val

        115                 120                 125

Gly Glu Thr Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys

    130                 135                 140

Asp Ser Asp Lys Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr

145                 150                 155                 160

Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg

                165                 170                 175

Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu

            180                 185                 190

Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile

        195                 200                 205

Asn Gly Val Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr

    210                 215                 220

Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly

225                 230                 235                 240

Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His

                245                 250                 255

Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln

            260                 265                 270

Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser

        275                 280                 285

Phe Phe Arg Gln Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg

    290                 295                 300

Thr Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr

                325                 330                 335

Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys

            340                 345                 350

Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly

        355                 360                 365

Ile Thr Ser Asn Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu

    370                 375                 380

Thr Gly Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met

385                 390                 395                 400

Asp Leu Asp Pro Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val

                405                 410                 415

Pro Gln Ala Lys Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn

            420                 425                 430

Arg Gly Phe Tyr Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu

        435                 440                 445

Leu Asn Ile Lys Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu

    450                 455                 460

Glu Gln Gly Gln Leu Thr Val Asn Lys

465                 470

 

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>gluX引物1

 

<400>9

ggcagcgatg aagcattgct                                                       20

 

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>gluX引物2

 

<400>10

agggcaatga agtcaagcag ctggacggat cgtggagatc                                 40

 

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>gluX引物3

 

<400>11

gatctccacg atccgtccag ctgcttgact tcattgccct                                 40

 

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>gluX引物4

 

<400>12

ttccgtttgc gctggtgttg                                                       20

 

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>gluX引物5

 

<400>13

gccgggatcc ttcccgctgc atccgcgagc tgtaccgcat                                 40

 

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>gluX引物6

 

<400>14

gccgggatcc ttatccacag acccagccgc tattcgacaa                                 40

 

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>gluX引物7

 

<400>15

gcttccggct cgtatgttgt g                                              21

 

<210>16

<211>2283

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

 

<220>

<221>CDS

<222>(1001)..(1279)

 

<400>16

gggtacttcg ccaggggtgg gggtgtattc cacacgagtt aacccaaggc gactttccgt    60

attcctattc accaccacgc cgatcttcca cagattgccc agcatttcta cggcacgctg    120

cgctttgccg ggtccggaaa actctttata tataaggttt ggttcggtga cagatccgag    180

acgcctgcgc cacatatcct gattttcctg aaagtccggc gccacggcgt catcgcttcc    240

cggctccaca tcggtgtgct gataaaaaat ctcaatctca gggatagcga tcattagtgg    300

gtgcgcagtt tcagaaggct ggaacccaaa cgagcgccat tcagaatcgc tgcgcacatc    360

gagcttgcca atcaggctgg tcagcgcgtc aaaggtgtca ggcagcgatg aagcattgct    420

tgtcgacgca ccccccttgg ttcccgctgc atccgcgagc tgtaccgcat caagaagttg    480

gatagccaac gatgcacctt gtttggtggt caagttgggt agtgcacgta ctgtttccac    540

aatgaactgt tccacgcggc ttcgggctgc gggatcttgt tctttagaga tccgatcgat    600

ggttgtttcg aaatcattca tggccggccc ctgtccttct taagcttgtc tctggtttct    660

aagcataggc ataagcgcag ttcaataggg gaaatgacca ggaaacaagt tttattcaca    720

ccctgggggt gattctagtc actaagttta gctaaggtgt cctgagttgc tttttgggta    780

gcttaagtag ccttgacctg ctgttatgtt tttttgcggt ctggtataaa ttgtgccgat    840

ttaaggattt tgtgggggtg gattgaaatt agttggcccg atcccactac ttttcgcctg    900

gagtgcttgt aggttgatag aaagtaaact aaagtaaaca tcaggttaac agccgggggt    960

tcaagtatta actccctcgg aaacagaaag gaacacgaca atg gct acc aca gct      1015

                                            Met Ala Thr Thr Ala

                                            1               5

tcc aag atc tcc acg atc cgt cca gca cag caa gat gct ctt tgg agc    1063

Ser Lys Ile Ser Thr Ile Arg Pro Ala Gln Gln Asp Ala Leu Trp Ser

                10                  15                  20

gta cgt gag gat ctt cac gct cgc ttc gat ggc ctg gtc gat cct gtc    1111

Val Arg Glu Asp Leu His Ala Arg Phe Asp Gly Leu Val Asp Pro Val

            25                  30                  35

cag gta gac gca att ttg gac cat gtc gca tct aac cgc gaa gcc aag    1159

Gln Val Asp Ala Ile Leu Asp His Val Ala Ser Asn Arg Glu Ala Lys

        40                  45                  50

atc acc gtc ttc agc aag att ttc atc gct cgc gag gca acc gct gca    1207

Ile Thr Val Phe Ser Lys Ile Phe Ile Ala Arg Glu Ala Thr Ala Ala

    55                  60                  65

ctt cag cag att gct ggc aac gtt aac gca gac ctg ctt gac ttc att    1255

Leu Gln Gln Ile Ala Gly Asn Val Asn Ala Asp Leu Leu Asp Phe Ile

70                  75                  80                  85

gcc ctc aac cgt ggc atg gca gca taagttttag ctgcccataa attaactaaa   1309

Ala Leu Asn Arg Gly Met Ala Ala

                90

ggccgggatt cactcgatgt gaatcccggc ctttagtttt tagtcttgtg ctcagagttt  1369

ccagatacag accaagcggc caataaagcc tattcggatt gtttcttagc cacctagttt  1429

ggctattacg ccttggacac caaactaggc agccgaagac ttcccgaaac tcacctcatc  1489

ggtcacatag gacggtcacg agggcactga gcaaacaaaa tagctgggat tcacatggtg  1549

tgaatcccag ccagtcgcta ttttttaatc ctttttcgcg tctacttcgc cttcttcggt  1609

cgattctggt gtccaaccat cggcccattt gccggtggtg aagtcataat caacatcatt  1669

gccttcttcg tcggtgcgct gataccagtc ggtgacgtga tcagcggtgg aatcgaaggt  1729

agcacccgct ccacgacctt cctctgcagg ttcgatggag agctcgaagt cgtcgccgtg  1789

ttcttccaag ccacgaacca ccgcgttaga gatggctgcc tttgcatagc gttgtcgaat  1849

agcggctggg tctgtggata aatccttaat aaaggcaata gccatcacga tcaacaccag  1909

cgcaaacgga atggcgatca aaatggtgag gttctgcaga ccagtcagcg cggattcgcc  1969

accagtaagc agcatgacca ccgcgatgcc catcatgcac agtccccaga acaccacgat  2029

caatttgttt ggtgcagggt taccttggga gctcatcgtt cccatcacca cggaggcgga  2089

atcggcagag gtaacaaaga atactgccag cacaaagatc aaaatgaacg gtgtgatcga  2149

gtacagcgga aggttgctga acatatcaaa cagcacctgt tccttggatg aactgccgtc  2209

aaaaccatct acgttctcgc ggttcatcgt gatggcagtt ccaccgaaaa tggtgaacgc  2269

caggatcaaa atga                                                    2283

 

<210>17

<211>93

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

 

<400>17

Met Ala Thr Thr Ala Ser Lys Ile Ser Thr Ile Arg Pro Ala Gln Gln

1               5                   10                  15

Asp Ala Leu Trp Ser Val Arg Glu Asp Leu His Ala Arg Phe Asp Gly

            20                  25                  30

Leu Val Asp Pro Val Gln Val Asp Ala Ile Leu Asp His Val Ala Ser

        35                  40                  45

Asn Arg Glu Ala Lys Ile Thr Val Phe Ser Lys Ile Phe Ile Ala Arg

    50                  55                  60

Glu Ala Thr Ala Ala Leu Gln Gln Ile Ala Gly Asn Val Asn Ala Asp

65                  70                  75                  80

Leu Leu Asp Phe Ile Ala Leu Asn Arg Gly Met Ala Ala

                85                  90

Claims (3)

1.用于产生L-谷氨酸的方法，所述方法包括将经修饰以使染色体上的gluX基因破坏的具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌在培养基中培养以产生和积累L-谷氨酸，和从所述培养基中收集L-谷氨酸，其中所述gluX基因编码由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1的方法，其中所述gluX基因由SEQ ID NO：16第1001至1279位的核苷酸组成。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述棒状杆菌型细菌是谷氨酸棒杆菌。

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