JP2002330763A - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents
発酵法による目的物質の製造法Info
- Publication number
- JP2002330763A JP2002330763A JP2001135517A JP2001135517A JP2002330763A JP 2002330763 A JP2002330763 A JP 2002330763A JP 2001135517 A JP2001135517 A JP 2001135517A JP 2001135517 A JP2001135517 A JP 2001135517A JP 2002330763 A JP2002330763 A JP 2002330763A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- maltose
- protein
- microorganism
- mutation
- residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title abstract description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title abstract description 13
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 73
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims abstract description 73
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 52
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 61
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 41
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 19
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 19
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 19
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 11
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 9
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 9
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical group CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 8
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 6
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 16
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 11
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 11
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 abstract description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 abstract description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 40
- 101150003248 malK gene Proteins 0.000 description 32
- 101150001544 crr gene Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 101100455969 Bacillus subtilis (strain 168) mdxK gene Proteins 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N (2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound [C@]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)(N1C=NC=2C(O)=NC=NC12)C(=O)O AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101000779368 Bacillus subtilis (strain 168) Aspartokinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000790917 Dioxys <bee> Species 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 1
- 241001319148 Pharmacis Species 0.000 description 1
- 108010067275 Phosphoenolpyruvate Sugar Phosphotransferase System Proteins 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100465559 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRE7 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010000730 factor III(Glc) Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- ZDPUTNZENXVHJC-UUOKFMHZSA-N guanosine 3'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O ZDPUTNZENXVHJC-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 239000004226 guanylic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 description 1
- 229940028843 inosinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 108010060845 lactose permease Proteins 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 1
- 230000037435 normal mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 101150076896 pts1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- GUGNSJAORJLKGP-UHFFFAOYSA-K sodium 8-methoxypyrene-1,3,6-trisulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=C2C(OC)=CC(S([O-])(=O)=O)=C(C=C3)C2=C2C3=C(S([O-])(=O)=O)C=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 GUGNSJAORJLKGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/222—Phenylalanine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 発酵法により微生物を利用して物質を製造す
るに際して、デンプン分解液等のグルコース及びオリゴ
糖を含む炭素源を用いたときに、前記微生物のオリゴ
糖、特にマルトースに対する資化性を向上させること。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採取す
る、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記
微生物として、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失した微生物を用いる。
るに際して、デンプン分解液等のグルコース及びオリゴ
糖を含む炭素源を用いたときに、前記微生物のオリゴ
糖、特にマルトースに対する資化性を向上させること。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採取す
る、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記
微生物として、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失した微生物を用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、最終目
的産物である物質の生産性を改善するための手段を開示
するものである。
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、最終目
的産物である物質の生産性を改善するための手段を開示
するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的
なものとして、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知
られている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用
いられるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合
物のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用
飼料添加物として、製薬業および化学工業における試薬
として、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなど
のＬ−アミノ酸産生のための成長因子として利用され
る。発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物と
しては、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス
属細菌、セラチア属細菌等が知られている。
なものとして、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知
られている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用
いられるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合
物のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用
飼料添加物として、製薬業および化学工業における試薬
として、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなど
のＬ−アミノ酸産生のための成長因子として利用され
る。発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物と
しては、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス
属細菌、セラチア属細菌等が知られている。
【０００３】上記のような発酵法による目的物質の製造
においては、原材料として廃糖蜜などの糖を含んだもの
が大半を占めるといってよい。アミノ酸発酵や核酸発酵
においても例にもれず、糖を原料として培養を実施して
いる。サトウキビなどにはデンプンが多く含有されてい
るが、原料としてそのまま使用することは稀であり、ほ
とんどがそれらに含まれているデンプンを単糖あるいは
二単糖程度にまで分解したものが用いられている。分解
方法としては、一般的にアミラーゼなどの糖化酵素液を
使用するが、それにより、多糖であるデンプンはグルコ
ース、マルトースあるいはマルトトリオースといった比
較的、低分子の糖に分解される。
においては、原材料として廃糖蜜などの糖を含んだもの
が大半を占めるといってよい。アミノ酸発酵や核酸発酵
においても例にもれず、糖を原料として培養を実施して
いる。サトウキビなどにはデンプンが多く含有されてい
るが、原料としてそのまま使用することは稀であり、ほ
とんどがそれらに含まれているデンプンを単糖あるいは
二単糖程度にまで分解したものが用いられている。分解
方法としては、一般的にアミラーゼなどの糖化酵素液を
使用するが、それにより、多糖であるデンプンはグルコ
ース、マルトースあるいはマルトトリオースといった比
較的、低分子の糖に分解される。
【０００４】エシェリヒア・コリ（E. coli）等のグラ
ム陰性腸内細菌を用いた発酵では、これらのデンプン分
解液を用いるときには問題が生じる。例えば、E. coli
は、主成分として存在するグルコースを消費するが、マ
ルトース等の二単糖以上のオリゴ糖はグルコースを消費
し切ってからでないと消費しないという、いわゆるグル
コース抑制を受ける。そのため、デンプン分解液の主成
分であるグルコースのみを消費した時点で発酵を終了し
た場合、マルトースなどのオリゴ糖は資化されずに無駄
に残存することになる。また、グルコースを消費後、オ
リゴ糖を消費させた場合には、その分、培養時間を延長
しなくてはならず、そのために光熱費などを無駄に費や
すことになる。
ム陰性腸内細菌を用いた発酵では、これらのデンプン分
解液を用いるときには問題が生じる。例えば、E. coli
は、主成分として存在するグルコースを消費するが、マ
ルトース等の二単糖以上のオリゴ糖はグルコースを消費
し切ってからでないと消費しないという、いわゆるグル
コース抑制を受ける。そのため、デンプン分解液の主成
分であるグルコースのみを消費した時点で発酵を終了し
た場合、マルトースなどのオリゴ糖は資化されずに無駄
に残存することになる。また、グルコースを消費後、オ
リゴ糖を消費させた場合には、その分、培養時間を延長
しなくてはならず、そのために光熱費などを無駄に費や
すことになる。
【０００５】E. coli やサルモネラ・チフィムリウム
（Salmonella typhimurium）では一般に、グルコース抑
制を受けることが知られている。すなわち、グルコース
と他の炭素源、例えば、ラクトース、マルトースやグリ
セロールなどを資化させる場合、グルコースがはじめに
資化され、後に他の炭素源が資化される。モノーらは、
ラクトースとグルコースを炭素源にした場合、２段階増
殖、いわゆるジオキシーが観察されることを発見した
（Monod, J. 1947. Growth, 11, 223-247）。分子生物
学的研究により、その機構が明らかになりつつある。す
なわち、グルコース−ホスホエノールピルビン酸−糖ホ
スホトランスフェラーゼ系（Phosphoenolpyruvate-Suga
r Phosphotransferase System）、いわゆるPTS系で資化
される際に、リン酸カスケードにおけるグルコースへの
リン酸供与体であるIIAGlc（グルコースＰＴＳエンザイ
ムII）は、脱リン酸化された状態で存在する。その脱リ
ン酸化されたIIAGlcが、その他の糖の取り込みを阻害す
る、いわゆる、インデュサーイクスクルージョン（Indu
cer exclusion）を引き起こす（Postma, P. W., Lengel
er, J. W. and Jacobson, G. R. 1996. : in Escherich
ia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Bio
logy (ed. Neidhardt, F. C.), pp1149-1174, ASM Pres
s, Washington D. C.）。
（Salmonella typhimurium）では一般に、グルコース抑
制を受けることが知られている。すなわち、グルコース
と他の炭素源、例えば、ラクトース、マルトースやグリ
セロールなどを資化させる場合、グルコースがはじめに
資化され、後に他の炭素源が資化される。モノーらは、
ラクトースとグルコースを炭素源にした場合、２段階増
殖、いわゆるジオキシーが観察されることを発見した
（Monod, J. 1947. Growth, 11, 223-247）。分子生物
学的研究により、その機構が明らかになりつつある。す
なわち、グルコース−ホスホエノールピルビン酸−糖ホ
スホトランスフェラーゼ系（Phosphoenolpyruvate-Suga
r Phosphotransferase System）、いわゆるPTS系で資化
される際に、リン酸カスケードにおけるグルコースへの
リン酸供与体であるIIAGlc（グルコースＰＴＳエンザイ
ムII）は、脱リン酸化された状態で存在する。その脱リ
ン酸化されたIIAGlcが、その他の糖の取り込みを阻害す
る、いわゆる、インデュサーイクスクルージョン（Indu
cer exclusion）を引き起こす（Postma, P. W., Lengel
er, J. W. and Jacobson, G. R. 1996. : in Escherich
ia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Bio
logy (ed. Neidhardt, F. C.), pp1149-1174, ASM Pres
s, Washington D. C.）。
【０００６】E. coliでのマルトースの取り込みはグル
コース抑制を受けるが、これは脱リン酸化されたIIAGlc
とマルトースの非ＰＴＳ（non-PTS）による取り込み系
を構成するMalKタンパク質との相互作用によるものであ
る。すなわち、グルコースを取り込んでいるときは、II
AGlcが細胞内に過剰に存在し、それが、MalKタンパク質
と結合してマルトースの取り込みを抑制するのである。
また、グルコースアナログ存在下でのマルトースの取り
込みが向上した変異株が取得されているが、その変異株
はMalKタンパク質をコードするmalK遺伝子内に変異が存
在することが知られている（Dean, D. A. et al. 1990.
Regulation of the Maltose TransportSystem of Esch
erichia coli by the Glucose-specific Enzyme III of
the Phosphoenolpyruvate-Sugar Phosphotransferase
System. J. Biol. Chem., 265(34), 21005-21010； Kuh
nau, S. et al. 1991. The Activities of the Escheri
chia coli MalK Protein in Maltose Transport, Regul
ation, and Inducer Exclusion Can Be Separated by M
utations. J. Bacteriol., 173(7), 2180-2186）。
コース抑制を受けるが、これは脱リン酸化されたIIAGlc
とマルトースの非ＰＴＳ（non-PTS）による取り込み系
を構成するMalKタンパク質との相互作用によるものであ
る。すなわち、グルコースを取り込んでいるときは、II
AGlcが細胞内に過剰に存在し、それが、MalKタンパク質
と結合してマルトースの取り込みを抑制するのである。
また、グルコースアナログ存在下でのマルトースの取り
込みが向上した変異株が取得されているが、その変異株
はMalKタンパク質をコードするmalK遺伝子内に変異が存
在することが知られている（Dean, D. A. et al. 1990.
Regulation of the Maltose TransportSystem of Esch
erichia coli by the Glucose-specific Enzyme III of
the Phosphoenolpyruvate-Sugar Phosphotransferase
System. J. Biol. Chem., 265(34), 21005-21010； Kuh
nau, S. et al. 1991. The Activities of the Escheri
chia coli MalK Protein in Maltose Transport, Regul
ation, and Inducer Exclusion Can Be Separated by M
utations. J. Bacteriol., 173(7), 2180-2186）。
【０００７】また、IIAGlcについても、非ＰＴＳ糖の一
つであるラクトースの取り込み酵素であるラクトース透
過酵素との結合が低下した変異タンパク質を保持する変
異株が報告されている（Zeng, G. A. et al., 1992. Mu
tational analysis of the enzyme IIIGlc of the phos
phoenolpyruvate phosphotransferease system in Esch
erichia coli. Res. Microbiol., 143, 251-261）。
つであるラクトースの取り込み酵素であるラクトース透
過酵素との結合が低下した変異タンパク質を保持する変
異株が報告されている（Zeng, G. A. et al., 1992. Mu
tational analysis of the enzyme IIIGlc of the phos
phoenolpyruvate phosphotransferease system in Esch
erichia coli. Res. Microbiol., 143, 251-261）。
【０００８】しかしながら、上述の変異株がグルコース
存在下でマルトースを同時に資化しているかについては
不明である。
存在下でマルトースを同時に資化しているかについては
不明である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、発酵法によ
り微生物を利用して物質を製造するに際して、デンプン
分解液等のグルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用い
たときに、前記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対
する資化性を向上させることを課題とする。
り微生物を利用して物質を製造するに際して、デンプン
分解液等のグルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用い
たときに、前記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対
する資化性を向上させることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、IIＡGlcタン
パク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタン
パク質との相互作用が弱化または消失した微生物が、グ
ルコース存在下でもマルトースを資化し得ることを見い
出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
以下のとおりである。
を解決するために鋭意研究を行った結果、IIＡGlcタン
パク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタン
パク質との相互作用が弱化または消失した微生物が、グ
ルコース存在下でもマルトースを資化し得ることを見い
出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
以下のとおりである。
【００１１】（１）微生物を培地中に培養し、該培地中
に目的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採
取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、
前記微生物は、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失し、かつ、グルコース
とマルトースの取り込みが可能な微生物であることを特
徴とする方法。 （２）マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質がＡＴＰ分解活性を有するマルトースキャリアプロ
テインである（１）記載の方法。 （３）前記タンパク質がＭａｌＫタンパク質である
（２）記載の方法。 （４）前記微生物が保持するＭａｌＫタンパク質が、１
２４位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異、及び
３２７位のＬｅｕ残基がＧｌｎ残基に置換する変異から
選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質
とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質
との相互作用が弱化または消失したことを特徴とする
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。 （５）前記微生物が保持するIIＡGlcタンパク質が、４
７位のＧｌｙ残基がＳｅｒ残基に置換する変異、及び７
６位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異から選ば
れる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質とマ
ルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との
相互作用が弱化または消失したことを特徴とする（１）
〜（４）のいずれかに記載の方法。 （６）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）〜
（５）のいずれかに記載の方法。 （７）前記目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ
−フェニルアラニンから選ばれる（６）記載の方法。 （８）前記微生物がエシェリヒア属細菌である（１）〜
（７）のいずれかに記載の方法。
に目的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採
取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、
前記微生物は、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失し、かつ、グルコース
とマルトースの取り込みが可能な微生物であることを特
徴とする方法。 （２）マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質がＡＴＰ分解活性を有するマルトースキャリアプロ
テインである（１）記載の方法。 （３）前記タンパク質がＭａｌＫタンパク質である
（２）記載の方法。 （４）前記微生物が保持するＭａｌＫタンパク質が、１
２４位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異、及び
３２７位のＬｅｕ残基がＧｌｎ残基に置換する変異から
選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質
とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質
との相互作用が弱化または消失したことを特徴とする
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。 （５）前記微生物が保持するIIＡGlcタンパク質が、４
７位のＧｌｙ残基がＳｅｒ残基に置換する変異、及び７
６位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変異から選ば
れる変異を有することにより、IIＡGlcタンパク質とマ
ルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との
相互作用が弱化または消失したことを特徴とする（１）
〜（４）のいずれかに記載の方法。 （６）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）〜
（５）のいずれかに記載の方法。 （７）前記目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ
−フェニルアラニンから選ばれる（６）記載の方法。 （８）前記微生物がエシェリヒア属細菌である（１）〜
（７）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明において微生物によって生産される目的物質
は、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、
Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ酸である。
Ｌ−アミノ酸として特に好ましいものは、Ｌ−リジン、
Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンである。その
他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン
類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、従来より
微生物により生産されてきたものであって、炭素源とし
てグルコース、及びマルトース等のオリゴ糖を含む培地
を用いて生産されるものであれば、特に制限されない。
また、現在微生物を利用して生産されていない物質であ
っても、その生合成において炭素源が必要とされるもの
であれば、本願発明が利用できることはいうまでもな
い。
本願発明において微生物によって生産される目的物質
は、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、
Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ酸である。
Ｌ−アミノ酸として特に好ましいものは、Ｌ−リジン、
Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンである。その
他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン
類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、従来より
微生物により生産されてきたものであって、炭素源とし
てグルコース、及びマルトース等のオリゴ糖を含む培地
を用いて生産されるものであれば、特に制限されない。
また、現在微生物を利用して生産されていない物質であ
っても、その生合成において炭素源が必要とされるもの
であれば、本願発明が利用できることはいうまでもな
い。
【００１３】本願発明において利用される微生物は、グ
ルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルトースの
非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互作用に
より、マルトース資化が調節される微生物である。具体
的には、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細
菌、クレブシエラ属細菌等の腸内細菌群に属する細菌、
コリネホルム細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等
が挙げられる。好ましくは、遺伝子置換が可能な微生物
である。本発明に利用できる微生物であるか否かは、例
えば、微生物の野生株について、グルコースとマルトー
スを炭素源として含む培地における生育を追跡し、２段
階増殖いわゆるジオキシーが観察されるか否かによっ
て、判定することができる。ジオキシーが観察されれ
ば、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルト
ースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互
作用により、マルトース資化が調節されると考えられ
る。
ルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルトースの
非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互作用に
より、マルトース資化が調節される微生物である。具体
的には、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細
菌、クレブシエラ属細菌等の腸内細菌群に属する細菌、
コリネホルム細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等
が挙げられる。好ましくは、遺伝子置換が可能な微生物
である。本発明に利用できる微生物であるか否かは、例
えば、微生物の野生株について、グルコースとマルトー
スを炭素源として含む培地における生育を追跡し、２段
階増殖いわゆるジオキシーが観察されるか否かによっ
て、判定することができる。ジオキシーが観察されれ
ば、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質と、マルト
ースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質との相互
作用により、マルトース資化が調節されると考えられ
る。
【００１４】本発明に用いることができる微生物として
具体的には、例えば目的物質がＬ−リジンの場合はエシ
ェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-154
3)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許
第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−スレオニンの場合
はエシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 1867)(米国特
許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,
188,949号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場
合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604（FERM BP-3579)
(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)
(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等であ
り、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ1
2624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,17
8号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参
照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コ
リ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397号参照）、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（F
ERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等であり、
Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（V
KPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブ
レビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)
(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−バリンの
場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧
州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米
国特許第5,188,948号参照）等である。
具体的には、例えば目的物質がＬ−リジンの場合はエシ
ェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-154
3)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許
第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−スレオニンの場合
はエシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 1867)(米国特
許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,
188,949号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場
合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604（FERM BP-3579)
(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)
(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等であ
り、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ1
2624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,17
8号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参
照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コ
リ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397号参照）、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（F
ERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等であり、
Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（V
KPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブ
レビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)
(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−バリンの
場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧
州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米
国特許第5,188,948号参照）等である。
【００１５】また、目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン又はＬ−フェニルアラニンの場合は、後述する実施
例に記載のE. coli W3100 (tyrA)に各々のアミノ酸の生
産に関与する遺伝子を組み込んだプラスミドpVIC40、pC
ABD2、又はpMGAL1を導入した株も、好適に使用すること
ができる。
ニン又はＬ−フェニルアラニンの場合は、後述する実施
例に記載のE. coli W3100 (tyrA)に各々のアミノ酸の生
産に関与する遺伝子を組み込んだプラスミドpVIC40、pC
ABD2、又はpMGAL1を導入した株も、好適に使用すること
ができる。
【００１６】さらに、本発明に用いる微生物は、目的物
質に応じて、当該目的物質の産生に関与するタンパク質
の活性が高められていてもよく、当該目的物質の分解等
に関与するタンパク質の活性が低下させられていてもよ
い。
質に応じて、当該目的物質の産生に関与するタンパク質
の活性が高められていてもよく、当該目的物質の分解等
に関与するタンパク質の活性が低下させられていてもよ
い。
【００１７】本発明に用いる微生物は、上記のような微
生物を親株とする変異株又は組換え株であって、IIＡ
Glcタンパク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与
するタンパク質との相互作用が弱化または消失し、か
つ、グルコースとマルトースの取り込みが可能な微生物
である。すなわち、本発明においては、IIＡGlcタンパ
ク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質は、各々の相互作用は弱化又は消失しても、グルコ
ース及びマルトースの取り込みには実質的に影響がない
ような変異を有する。
生物を親株とする変異株又は組換え株であって、IIＡ
Glcタンパク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与
するタンパク質との相互作用が弱化または消失し、か
つ、グルコースとマルトースの取り込みが可能な微生物
である。すなわち、本発明においては、IIＡGlcタンパ
ク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパ
ク質は、各々の相互作用は弱化又は消失しても、グルコ
ース及びマルトースの取り込みには実質的に影響がない
ような変異を有する。
【００１８】IIＡGlcタンパク質は、エシェリヒア・コリ
ではcrr遺伝子によってコードされている。また、マル
トースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質として
は、エシェリヒア・コリではmalK遺伝子によってコード
されるMalKタンパク質が挙げられる。
ではcrr遺伝子によってコードされている。また、マル
トースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク質として
は、エシェリヒア・コリではmalK遺伝子によってコード
されるMalKタンパク質が挙げられる。
【００１９】IIＡGlcタンパク質とマルトースの非ＰＴ
Ｓ取り込みに関与するタンパク質との相互作用が弱化ま
たは消失させるには、これらのタンパク質をコードする
遺伝子の一方又は両方に、これらのタンパク質の相互作
用が弱化または消失するような変異を導入すればよい。
Ｓ取り込みに関与するタンパク質との相互作用が弱化ま
たは消失させるには、これらのタンパク質をコードする
遺伝子の一方又は両方に、これらのタンパク質の相互作
用が弱化または消失するような変異を導入すればよい。
【００２０】上記のような変異を有するcrr遺伝子又はm
alK遺伝子は、例えばマルトースを炭素源とし、２−デ
オキシグルコース等のグルコースアナログを含有する培
地で生育できる変異株からcrr遺伝子又はmalK遺伝子を
単離することによって、取得することができる。このよ
うにして得られる変異型malK遺伝子としては、コードさ
れるMalKタンパク質の124位のAla残基がThr残基に置換
する変異を有する変異型malK遺伝子が知られている（De
an, D. A. et al. 1990, J. Biol. Chem., 265(34), 21
005-21010； Kuhnau, S. et al. 1991, J. Bacteriol.,
173(7), 2180-2186）。また、本発明者により取得され
た、327位のLeu残基がGln残基に置換する変異（L327Q型
変異）を有するMalKタンパク質をコードする変異型malK
遺伝子も、本発明に好適に用いることができる。さら
に、124位のAla残基がThr残基に置換する変異、及び327
位のLeu残基がGln残基に置換する変異の両方を有する変
異型MalKをコードするmalK遺伝子も、本発明に用いるこ
とができる。
alK遺伝子は、例えばマルトースを炭素源とし、２−デ
オキシグルコース等のグルコースアナログを含有する培
地で生育できる変異株からcrr遺伝子又はmalK遺伝子を
単離することによって、取得することができる。このよ
うにして得られる変異型malK遺伝子としては、コードさ
れるMalKタンパク質の124位のAla残基がThr残基に置換
する変異を有する変異型malK遺伝子が知られている（De
an, D. A. et al. 1990, J. Biol. Chem., 265(34), 21
005-21010； Kuhnau, S. et al. 1991, J. Bacteriol.,
173(7), 2180-2186）。また、本発明者により取得され
た、327位のLeu残基がGln残基に置換する変異（L327Q型
変異）を有するMalKタンパク質をコードする変異型malK
遺伝子も、本発明に好適に用いることができる。さら
に、124位のAla残基がThr残基に置換する変異、及び327
位のLeu残基がGln残基に置換する変異の両方を有する変
異型MalKをコードするmalK遺伝子も、本発明に用いるこ
とができる。
【００２１】一方、変異型crr遺伝子としては、コード
されるIIＡGlcタンパク質の47位のGly残基がSer残基に
置換する変異、もしくは76位のAla残基がThr残基に置換
する変異、又はこれらの両方が挙げられる。
されるIIＡGlcタンパク質の47位のGly残基がSer残基に
置換する変異、もしくは76位のAla残基がThr残基に置換
する変異、又はこれらの両方が挙げられる。
【００２２】上記変異の位置は、開始コドンに対応する
Met残基を１番目としたときのものである。尚、malK遺
伝子又はcrr遺伝子に本発明に係る変異以外の変異が存
在し、コードされるMalKタンパク質又はIIＡGlcタンパ
ク質にアミノ酸残基の欠失、置換、又は挿入が生じるこ
とがある。そのようなmalK遺伝子又はcrr遺伝子であっ
ても、MalKタンパク質とIIＡGlcタンパク質との相互作
用が弱化又は消失し、かつ、グルコース及びマルトース
の取り込みには実質的に影響がない限り、本発明に用い
ることができる。MalKタンパク質又はIIＡGlcタンパク
質にアミノ酸残基の欠失又は挿入がある場合には、上記
の変異の位置は変化する。例えば、MalKタンパク質の32
7位のLeu残基は、それよりもN末端側で一アミノ酸残基
の欠失があると326位になる。そのような場合であって
も、326位のLeu残基は、野生型タンパク質の327位のLeu
残基に相当する。したがって、本明細書においては、変
異の位置は野生型遺伝子又は野生型タンパク質における
位置に相当する位置を示すものとする。
Met残基を１番目としたときのものである。尚、malK遺
伝子又はcrr遺伝子に本発明に係る変異以外の変異が存
在し、コードされるMalKタンパク質又はIIＡGlcタンパ
ク質にアミノ酸残基の欠失、置換、又は挿入が生じるこ
とがある。そのようなmalK遺伝子又はcrr遺伝子であっ
ても、MalKタンパク質とIIＡGlcタンパク質との相互作
用が弱化又は消失し、かつ、グルコース及びマルトース
の取り込みには実質的に影響がない限り、本発明に用い
ることができる。MalKタンパク質又はIIＡGlcタンパク
質にアミノ酸残基の欠失又は挿入がある場合には、上記
の変異の位置は変化する。例えば、MalKタンパク質の32
7位のLeu残基は、それよりもN末端側で一アミノ酸残基
の欠失があると326位になる。そのような場合であって
も、326位のLeu残基は、野生型タンパク質の327位のLeu
残基に相当する。したがって、本明細書においては、変
異の位置は野生型遺伝子又は野生型タンパク質における
位置に相当する位置を示すものとする。
【００２３】malK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に、上記
の変異を導入するには、部位特異的変異法等によって目
的の変異をmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に導入して
変異型遺伝子を作製し、得られた変異型遺伝子を、相同
組換えを利用した遺伝子置換により、微生物の染色体上
のmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子と置換する方法が挙
げられる。
の変異を導入するには、部位特異的変異法等によって目
的の変異をmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に導入して
変異型遺伝子を作製し、得られた変異型遺伝子を、相同
組換えを利用した遺伝子置換により、微生物の染色体上
のmalK遺伝子及び／又はcrr遺伝子と置換する方法が挙
げられる。
【００２４】遺伝子置換は、例えば後述の温度感受性プ
ラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことがで
きる。エシェリヒア・コリの温度感受性プラスミドとし
ては、pMAN031（J.Bacteriol., 162, 1196(1985)）、及
びpMAN997（WO99/03988）等が挙げられる。これらのプ
ラスミドは、エシェリヒア・コリ中で少なくとも30℃で
は自律複製することができるが、37〜42℃では自律複製
できないまた、malK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に目的
の変異を有する変異株は、微生物を紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理し、２−デオキシグルコース等のグルコ
ースアナログを含有する培地で生育できる株を選択する
ことによっても、取得することができる。
ラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことがで
きる。エシェリヒア・コリの温度感受性プラスミドとし
ては、pMAN031（J.Bacteriol., 162, 1196(1985)）、及
びpMAN997（WO99/03988）等が挙げられる。これらのプ
ラスミドは、エシェリヒア・コリ中で少なくとも30℃で
は自律複製することができるが、37〜42℃では自律複製
できないまた、malK遺伝子及び／又はcrr遺伝子に目的
の変異を有する変異株は、微生物を紫外線照射またはN
−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）
もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異
剤によって処理し、２−デオキシグルコース等のグルコ
ースアナログを含有する培地で生育できる株を選択する
ことによっても、取得することができる。
【００２５】得られた候補株が目的の変異株であること
は、候補株からmalK遺伝子又はcrr遺伝子を単離し、変
異点付近の塩基配列を調べることによって、確認するこ
とができる。
は、候補株からmalK遺伝子又はcrr遺伝子を単離し、変
異点付近の塩基配列を調べることによって、確認するこ
とができる。
【００２６】本発明に係る微生物を培養するのに用いる
培地は、利用される微生物に応じて従来より用いられて
きた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、
窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を
含有する通常の培地である。但し、炭素源として、グル
コース及びマルトース等のオリゴ糖を含有する培地を用
いることが好ましい。
培地は、利用される微生物に応じて従来より用いられて
きた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、
窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を
含有する通常の培地である。但し、炭素源として、グル
コース及びマルトース等のオリゴ糖を含有する培地を用
いることが好ましい。
【００２７】グルコース及びマルトース以外の炭素源と
しては、ラクトース、ガラクトース、でんぷんの加水分
解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのア
ルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機
酸類等を用いることができる。
しては、ラクトース、ガラクトース、でんぷんの加水分
解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのア
ルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機
酸類等を用いることができる。
【００２８】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００２９】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３０】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
【００３１】培養終了後の培地液からの代謝産物の採取
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。以下の実施例において、試薬は特に指定しな
い限り和光純薬、あるいはナカライテスク社製のものを
用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとお
りである。
説明する。以下の実施例において、試薬は特に指定しな
い限り和光純薬、あるいはナカライテスク社製のものを
用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとお
りである。
【００３３】〔Ｌ培地〕バクトトリプトン（ディフコ社
製）10g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、NaCl 5g
/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。
製）10g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、NaCl 5g
/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。
【００３４】〔Ｌ寒天培地〕Ｌ培地、バクトアガー（デ
ィフコ社製）15g/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行っ
た。
ィフコ社製）15g/L。120℃、20分間の蒸気滅菌を行っ
た。
【００３５】〔SOC培地〕バクトトリプトン（ディフコ
社製）20g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、10mM
NaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2、20mMグル
コース。マグネシウム溶液及びグルコースを除いて、蒸
気滅菌（120℃、20分間）した後、予め0.22μmのフィル
ターを通した2Mのマグネシム保存液（1M MgSO4、1M MgC
l2）並びに2Mグルコース溶液を加え、再び0.22μmのフ
ィルターを通した。
社製）20g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5g/L、10mM
NaCl、2.5mM KCl、10mM MgSO4、10mM MgCl2、20mMグル
コース。マグネシウム溶液及びグルコースを除いて、蒸
気滅菌（120℃、20分間）した後、予め0.22μmのフィル
ターを通した2Mのマグネシム保存液（1M MgSO4、1M MgC
l2）並びに2Mグルコース溶液を加え、再び0.22μmのフ
ィルターを通した。
【００３６】〔M9最少培地〕Na2HPO4・12H2O 80g/L、KH2
PO4 15g/L、NaCl 2.5g/L、NH4Cl 5g/L、MgSO4・7H2O246.
48mg/L、糖（グルコースもしくはマルトース又はそれら
を適当な割合で混ぜた混合物）5g/L, pH 7.0。MgSO4、
およびグルコースは、別に殺菌（120℃、20分間）して
加えた。また、必要に応じて適量のアミノ酸およびビタ
ミンを添加した。pHはNaOHで調整した。
PO4 15g/L、NaCl 2.5g/L、NH4Cl 5g/L、MgSO4・7H2O246.
48mg/L、糖（グルコースもしくはマルトース又はそれら
を適当な割合で混ぜた混合物）5g/L, pH 7.0。MgSO4、
およびグルコースは、別に殺菌（120℃、20分間）して
加えた。また、必要に応じて適量のアミノ酸およびビタ
ミンを添加した。pHはNaOHで調整した。
【００３７】〔M9最少寒天培地〕M9最少培地、バクトア
ガー（ディフコ社製）15g/L。
ガー（ディフコ社製）15g/L。
【００３８】〔アミノ酸生産培地〕(NH4)2SO4 20g/L、K
H2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、M
nSO4・5H2O 10mg/L、酵母エキス（ディフコ社製）2g/L、
糖（グルコースあるいはマルトースあるいはそれらを適
当な割合で混ぜた混合物）40g/L、Ｌ−チロシン 100mg
/L、CaCO3（日本薬局方）30g/L、ストレプトマイシン 5
0mg/L。糖、MgSO4・7H2O、CaCO3、ストレプトマイシンは
別殺菌した。それ以外のものを混合し、KOHにてｐHを7.
0に調整し、115℃、10分間オートクレーブした。CaCO 3
は180℃、2日間乾熱滅菌した。ストレプトマイシンは濾
過滅菌した。
H2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、M
nSO4・5H2O 10mg/L、酵母エキス（ディフコ社製）2g/L、
糖（グルコースあるいはマルトースあるいはそれらを適
当な割合で混ぜた混合物）40g/L、Ｌ−チロシン 100mg
/L、CaCO3（日本薬局方）30g/L、ストレプトマイシン 5
0mg/L。糖、MgSO4・7H2O、CaCO3、ストレプトマイシンは
別殺菌した。それ以外のものを混合し、KOHにてｐHを7.
0に調整し、115℃、10分間オートクレーブした。CaCO 3
は180℃、2日間乾熱滅菌した。ストレプトマイシンは濾
過滅菌した。
【００３９】
【実施例１】malK遺伝子への変異導入とマルトース資化
性向上確認 E. coli W3100のコロニーをＬ培地5mlに植菌し、一夜振
盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic DNA Purific
ation kit（Promega社）を使用して、染色体DNAを調製
した。この染色体DNAを鋳型として、以下に示すプライ
マーを用いてPCR反応を実施した。
性向上確認 E. coli W3100のコロニーをＬ培地5mlに植菌し、一夜振
盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic DNA Purific
ation kit（Promega社）を使用して、染色体DNAを調製
した。この染色体DNAを鋳型として、以下に示すプライ
マーを用いてPCR反応を実施した。
【００４０】 〔Primer-1〕 5’-GGCGGTAATGTGGAGATGCGCACATAAAATCGCC-3’（配列番号１） 〔Primer-2〕 5’-CCTGAGTCATTGCTTTTCTTTTTTCACATCACCTGTGAC-3’（配列番号２）
【００４１】PCR反応は、宝酒造（株）製のPyrobest DN
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、宝酒造（株）製のBKL kitを
用いて、増幅産物の平滑末端化とリン酸化を行った。得
られた増幅断片を、pSTV28（宝酒造（株））を制限酵素
SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化したもの
と、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用いて連結
した。このライゲーション反応液を用いて、Hanahanら
の方法（Hanahan, D. 1983. Studies on transformatio
n of Escherichia coli with plamids, J. Mol. Biol.,
166, 557-580）により、E. coli JM109を形質転換し
た。50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）と0.2mMのI
PTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）と40μg
/mlのX-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galacto
side）を含むＬ寒天培地上で、形質転換体を選択した。
常法に従い、形質転換体よりプラスミドを抽出し、挿入
断片の塩基配列を決定し、pSTV28のSmaI 部位にmalK遺
伝子が挿入されていることを確認した。このプラスミド
をpSTVmalKと命名した。
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、宝酒造（株）製のBKL kitを
用いて、増幅産物の平滑末端化とリン酸化を行った。得
られた増幅断片を、pSTV28（宝酒造（株））を制限酵素
SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化したもの
と、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用いて連結
した。このライゲーション反応液を用いて、Hanahanら
の方法（Hanahan, D. 1983. Studies on transformatio
n of Escherichia coli with plamids, J. Mol. Biol.,
166, 557-580）により、E. coli JM109を形質転換し
た。50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）と0.2mMのI
PTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）と40μg
/mlのX-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galacto
side）を含むＬ寒天培地上で、形質転換体を選択した。
常法に従い、形質転換体よりプラスミドを抽出し、挿入
断片の塩基配列を決定し、pSTV28のSmaI 部位にmalK遺
伝子が挿入されていることを確認した。このプラスミド
をpSTVmalKと命名した。
【００４２】pSTVmalK上のmalK遺伝子の塩基置換を、以
下のようにして実施した。370位の塩基であるGをAに置
換する（MalKタンパク質の124位のAla残基をThrに置換
する）塩基置換を導入することとした。なお、ここで表
記したDNA塩基配列における位置は、開始コドンのATGの
Aを１番目とし、アミノ酸残基の位置は上記開始コドン
に対応するMet残基を１番目としたときのものである。
下のようにして実施した。370位の塩基であるGをAに置
換する（MalKタンパク質の124位のAla残基をThrに置換
する）塩基置換を導入することとした。なお、ここで表
記したDNA塩基配列における位置は、開始コドンのATGの
Aを１番目とし、アミノ酸残基の位置は上記開始コドン
に対応するMet残基を１番目としたときのものである。
【００４３】まず、プラスミド上の塩基置換には、Quic
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。malK変異を導入するのに用いたプラ
イマーの配列を以下に示す。
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。malK変異を導入するのに用いたプラ
イマーの配列を以下に示す。
【００４４】 〔Primer-3〕 5’-CGGAAGTGCTACAACTGACGCATTTGCTGGATCGC-3’（配列番号３） 〔Primer-4〕 5’-GCGATCCAGCAAATGCGTCAGTTGTAGCACTTCCG-3’（配列番号４）
【００４５】変異導入は、前記キットに添付のプロトコ
ールに従い、当該部位の塩基配列を決定することで変異
導入を確認した。作製したプラスミドをpSTVmalK-A124T
と命名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRIとHindIII
（いずれも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製
開始起点を有するプラスミドベクターpTS1の同じ制限酵
素部位に連結した。
ールに従い、当該部位の塩基配列を決定することで変異
導入を確認した。作製したプラスミドをpSTVmalK-A124T
と命名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRIとHindIII
（いずれも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製
開始起点を有するプラスミドベクターpTS1の同じ制限酵
素部位に連結した。
【００４６】pTS1は、pMAN031（Matsuyama, S and Mizu
shima, S. 1985. Construction andcharacterization o
f a deletion mutant lacking micF, a proposed regul
atory gene for OmpF synthesis in Escherichia coli.
J. Bacteriol. 162(3), 1196-1202）とpBR322（宝酒造
（株）製）のそれぞれPstI-HindIII断片を繋ぎ換えたも
のである（図１）。作製したプラスミドをpTSmalK-A124
Tと命名した。
shima, S. 1985. Construction andcharacterization o
f a deletion mutant lacking micF, a proposed regul
atory gene for OmpF synthesis in Escherichia coli.
J. Bacteriol. 162(3), 1196-1202）とpBR322（宝酒造
（株）製）のそれぞれPstI-HindIII断片を繋ぎ換えたも
のである（図１）。作製したプラスミドをpTSmalK-A124
Tと命名した。
【００４７】上記プラスミドpTSmalK-A124Tの温度感受
性を利用し、一般的な相同性組換えの手法（Matsuyama,
S and Mizushima, S. 1985. J. Bacteriol. 162(3), 1
196-1202）により、E. coli W3100 (tyrA)（欧州特許公
開第488424号公報を参照）の染色体上のmalKと相同組換
えを実施した。
性を利用し、一般的な相同性組換えの手法（Matsuyama,
S and Mizushima, S. 1985. J. Bacteriol. 162(3), 1
196-1202）により、E. coli W3100 (tyrA)（欧州特許公
開第488424号公報を参照）の染色体上のmalKと相同組換
えを実施した。
【００４８】簡単に説明すると、pTSmalK-A124T を用い
て、Hanahanらの方法（J. Mol. Biol., 166, 557-580）
にてE. coli W3100 (tyrA)を形質転換した。30℃の培養
により出現したコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを
含むＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一
夜振盪培養した。この培養液を103〜104倍に希釈し、そ
の希釈液0.1mlを50μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天
培地に塗布し、42℃で一夜培養した。出現したコロニー
をＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一夜
振盪培養した。この培養液0.1mlをＬ培地を5ml張り込ん
だ試験管に植菌し、37〜42℃で3〜4時間振盪培養した。
この培養液を103〜107倍に希釈し、その希釈液0.1mlを
Ｌ寒天培地に塗布し、37〜42℃で一夜培養した。出現し
たコロニーのアンピシリン感受性を確認した。
て、Hanahanらの方法（J. Mol. Biol., 166, 557-580）
にてE. coli W3100 (tyrA)を形質転換した。30℃の培養
により出現したコロニーを、50μg/mlのアンピシリンを
含むＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一
夜振盪培養した。この培養液を103〜104倍に希釈し、そ
の希釈液0.1mlを50μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天
培地に塗布し、42℃で一夜培養した。出現したコロニー
をＬ培地を5ml張り込んだ試験管に植菌し、30℃で一夜
振盪培養した。この培養液0.1mlをＬ培地を5ml張り込ん
だ試験管に植菌し、37〜42℃で3〜4時間振盪培養した。
この培養液を103〜107倍に希釈し、その希釈液0.1mlを
Ｌ寒天培地に塗布し、37〜42℃で一夜培養した。出現し
たコロニーのアンピシリン感受性を確認した。
【００４９】目的の遺伝子置換株の変異点の確認は以下
の通り行った。前記コロニーを鋳型として、Pyrobest D
NA polymeraseを用いてPCR反応を実施した。プライマー
はPrimer-1とPrimer-2を使用し、PCR反応は酵素に添付
のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残存
プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いた
カラムは、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Ph
armacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物は、malK遺伝
子置換株の変異型malK遺伝子である。この遺伝子の変異
点を含む領域を中心に、塩基配列を決定した。こうして
目的どおりの変異がmalK遺伝子に導入されたことを確認
した変異株を、E. coli W3100 (tyrA)malK1と命名し
た。
の通り行った。前記コロニーを鋳型として、Pyrobest D
NA polymeraseを用いてPCR反応を実施した。プライマー
はPrimer-1とPrimer-2を使用し、PCR反応は酵素に添付
のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残存
プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いた
カラムは、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Ph
armacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物は、malK遺伝
子置換株の変異型malK遺伝子である。この遺伝子の変異
点を含む領域を中心に、塩基配列を決定した。こうして
目的どおりの変異がmalK遺伝子に導入されたことを確認
した変異株を、E. coli W3100 (tyrA)malK1と命名し
た。
【００５０】E. coli W3100 (tyrA)malK1について、M9
培地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した
培地における生育を、OD測定により追跡した（図２）。
対照には、E. coli W3100 (tyrA)を用いた。図２からわ
かるように、E. coli W3100(tyrA)では２段階増殖いわ
ゆるジオキシーが観察されるが、malK変異導入株E. col
i W3100 (tyrA)malK1では２段階増殖は認められなかっ
た。すなわち、malK変異導入により、インデュサーイク
スクルージョンが起こらず、グルコース資化と同時にマ
ルトースが資化されていることがわかった。
培地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した
培地における生育を、OD測定により追跡した（図２）。
対照には、E. coli W3100 (tyrA)を用いた。図２からわ
かるように、E. coli W3100(tyrA)では２段階増殖いわ
ゆるジオキシーが観察されるが、malK変異導入株E. col
i W3100 (tyrA)malK1では２段階増殖は認められなかっ
た。すなわち、malK変異導入により、インデュサーイク
スクルージョンが起こらず、グルコース資化と同時にマ
ルトースが資化されていることがわかった。
【００５１】
【実施例２】crr遺伝子への変異導入とマルトース資化
性向上確認 MalKタンパク質とcrr遺伝子産物IIAGlcの相互作用を弱
化させる目的で、本実施例ではcrr遺伝子に変異を導入
することとした。
性向上確認 MalKタンパク質とcrr遺伝子産物IIAGlcの相互作用を弱
化させる目的で、本実施例ではcrr遺伝子に変異を導入
することとした。
【００５２】E. coli W3100のコロニーをＬ培地5mlに植
菌し、一夜振盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic
DNA Purification kit（Promega社）を使用して、染色
体DNAを調製した。この染色体DNAを鋳型として、以下に
示すプライマーを用いてPCR反応を実施した。
菌し、一夜振盪培養して得た細胞より、Wizard Genomic
DNA Purification kit（Promega社）を使用して、染色
体DNAを調製した。この染色体DNAを鋳型として、以下に
示すプライマーを用いてPCR反応を実施した。
【００５３】 〔Primer-5〕 5’-GATTTCTTTAGTATCGGCACCAATGATTTAACGC-3’（配列番号５） 〔Primer-6〕 5’-AAATTGCCGCGATCTAGACAGTGCCATTGC -3’（配列番号６）
【００５４】PCR反応は、宝酒造（株）製のPyrobest DN
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、反応液を用いて宝酒造（株）
製のBKL kitを用いて平滑末端化とリン酸化を行った。
得られた増幅断片を、pMW219（ニッポンジーン製）を制
限酵素SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化した
ものと、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用い
て連結した。このライゲーション反応液を用いて、Hana
hanらの方法によりE. coli JM109を形質転換した。25μ
g/mlのカナマイシン（Km）と0.2mMのIPTG（Isopropyl-
β-D-thiogalactopyranoside）と40μg/mlのX-gal（5-B
romo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside）を含むＬ
寒天培地上で形質転換体を選択した。常法に従い、形質
転換体よりプラスミドを抽出し、挿入断片の塩基配列を
決定し、pMW219のSmaI部位にcrr遺伝子が挿入されてい
ることを確認した。このプラスミドをpMWcrrと命名し
た。
A polymeraseを用い、同酵素に添付のプロトコールに従
って行った。反応終了後、反応液を用いて宝酒造（株）
製のBKL kitを用いて平滑末端化とリン酸化を行った。
得られた増幅断片を、pMW219（ニッポンジーン製）を制
限酵素SmaI（宝酒造（株））で処理後、脱リン酸化した
ものと、Ligation kit ver.2（宝酒造（株））を用い
て連結した。このライゲーション反応液を用いて、Hana
hanらの方法によりE. coli JM109を形質転換した。25μ
g/mlのカナマイシン（Km）と0.2mMのIPTG（Isopropyl-
β-D-thiogalactopyranoside）と40μg/mlのX-gal（5-B
romo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside）を含むＬ
寒天培地上で形質転換体を選択した。常法に従い、形質
転換体よりプラスミドを抽出し、挿入断片の塩基配列を
決定し、pMW219のSmaI部位にcrr遺伝子が挿入されてい
ることを確認した。このプラスミドをpMWcrrと命名し
た。
【００５５】pMWcrr上のcrr遺伝子の塩基置換を以下の
ように実施した。226位のGをAに置換する（76位のAla残
基をThrに置換する）塩基置換を導入することとした（Z
eng,G. A. et al., 1992. Mutational analysis of the
enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvate phosphot
ransferease system in Escherichia coli. Res. Micro
biol., 143, 251-261）。なお、ここで表記したDNA塩基
配列における位置号は、開始コドンのATGのAを1番目と
し、アミノ酸残基の位置は上記開始コドンに対応するMe
t残基を１番目としたときのものである。
ように実施した。226位のGをAに置換する（76位のAla残
基をThrに置換する）塩基置換を導入することとした（Z
eng,G. A. et al., 1992. Mutational analysis of the
enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvate phosphot
ransferease system in Escherichia coli. Res. Micro
biol., 143, 251-261）。なお、ここで表記したDNA塩基
配列における位置号は、開始コドンのATGのAを1番目と
し、アミノ酸残基の位置は上記開始コドンに対応するMe
t残基を１番目としたときのものである。
【００５６】まず、プラスミド上の塩基置換には、Quic
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。crr変異を導入するのに用いたプライ
マーの配列を以下に示す。
kChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGEN
E社）を使用した。crr変異を導入するのに用いたプライ
マーの配列を以下に示す。
【００５７】 〔Primer-7〕 5’-GAAACCAACCACACATTCTCTATCGAATCTGATAGCGGCG -3’（配列番号７） 〔Primer-8〕 5’-CGCCGCTATCAGATTCGATAGAGAATGTGTGGTTGGTTTC -3’（配列番号８）
【００５８】変異導入は、前記キットに添付のプロトコ
ールに従い、当該部位の塩基配列決定することで変異導
入を確認した。作製したプラスミドをpMWcrr-A76Tと命
名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRI とXbaI（いず
れも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製開始起
点を有するプラスミドベクターpMAN997（WO99/03988号
国際公開パンフレット参照）の同じ制限酵素部位に連結
した。
ールに従い、当該部位の塩基配列決定することで変異導
入を確認した。作製したプラスミドをpMWcrr-A76Tと命
名した。当該プラスミドを制限酵素EcoRI とXbaI（いず
れも宝酒造（株）製）で消化し、温度感受性複製開始起
点を有するプラスミドベクターpMAN997（WO99/03988号
国際公開パンフレット参照）の同じ制限酵素部位に連結
した。
【００５９】作製したプラスミドをpMANcrr-A76Tと命名
した。このプラスミドを用いて、malK変異株を取得した
のと同様の方法を用いて、E. coli W3100 (tyrA)染色体
上のcrr遺伝子と相同性組換えを行い、crr遺伝子に変異
の導入した株を取得した。
した。このプラスミドを用いて、malK変異株を取得した
のと同様の方法を用いて、E. coli W3100 (tyrA)染色体
上のcrr遺伝子と相同性組換えを行い、crr遺伝子に変異
の導入した株を取得した。
【００６０】目的の遺伝子置換株の変異点の確認は、ma
lK変異株取得のときと同様に行った。アンピシリン耐性
のコロニーを鋳型として、Ex Taq polymerase（宝酒造
（株）製）を用いてPCR反応を実施した。プライマー
は、Primer-5とPrimer-6を使用し、PCR反応は酵素に添
付のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残
存プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用い
たカラムはMicroSpinTMS-400HR Columns（Amersham Pha
rmacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物はcrr遺伝子置
換株の変異型crr遺伝子である。この遺伝子の変異点を
含む領域を中心に塩基配列を決定した。こうして目的ど
おりの変異が得られた変異株を、E. coli W3100 (tyrA)
crr3と命名した。
lK変異株取得のときと同様に行った。アンピシリン耐性
のコロニーを鋳型として、Ex Taq polymerase（宝酒造
（株）製）を用いてPCR反応を実施した。プライマー
は、Primer-5とPrimer-6を使用し、PCR反応は酵素に添
付のプロトコールに従った。反応終了後、反応液中の残
存プライマーを除去する目的でゲル濾過を行った。用い
たカラムはMicroSpinTMS-400HR Columns（Amersham Pha
rmacia Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付の
プロトコールに従った。得られたPCR産物はcrr遺伝子置
換株の変異型crr遺伝子である。この遺伝子の変異点を
含む領域を中心に塩基配列を決定した。こうして目的ど
おりの変異が得られた変異株を、E. coli W3100 (tyrA)
crr3と命名した。
【００６１】E. coli W3100 (tyrA)crr3について、M9培
地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した培
地における生育を、OD測定により追跡した（図３）。対
照にはE. coli W3100 (tyrA)を用いた。図３からわかる
ように、E. coli W3100 (tyrA)では２段階増殖いわゆる
ジオキシーが観察されるが、crr変異導入株E. coliW310
0 (tyrA)crr3では２段階増殖は認められなかった。すな
わち、crr変異導入により、インデュサーイクスクルー
ジョンが起こらず、グルコース資化と同時にマルトース
が資化されていることがわかった。また、139位のGをA
に（47位のGly残基をSerに置換する）する塩基置換を導
入しても、同様の現象が観察された。
地にグルコースを0.05%とマルトースを0.45%添加した培
地における生育を、OD測定により追跡した（図３）。対
照にはE. coli W3100 (tyrA)を用いた。図３からわかる
ように、E. coli W3100 (tyrA)では２段階増殖いわゆる
ジオキシーが観察されるが、crr変異導入株E. coliW310
0 (tyrA)crr3では２段階増殖は認められなかった。すな
わち、crr変異導入により、インデュサーイクスクルー
ジョンが起こらず、グルコース資化と同時にマルトース
が資化されていることがわかった。また、139位のGをA
に（47位のGly残基をSerに置換する）する塩基置換を導
入しても、同様の現象が観察された。
【００６２】
【実施例３】グルコースアナログ耐性株の取得、同耐性
株の変異点の同定、及び当該変異のE. coli W3100 (tyr
A)への導入 E. coli W3100 (tyrA)のコロニーを5mlのL培地を含む試
験管に植菌し、一夜振盪培養した。培養菌体を生理食塩
水5mlで２回洗浄し同量の生理食塩水に懸濁した。この
懸濁液を、マルトースを炭素源とするM9寒天培地に懸濁
液0.1mlを塗布し、表面を乾燥させた。プレート上に一
白金耳分の２−デオキシグルコースを静置させ、2〜3日
間37℃にて培養した。 E. coli W3100 (tyrA)はマルト
ースを炭素源とすることができるが、グルコースアナロ
グ例えば、２−デオキシグルコースが存在すると、抑制
がかかり生育できなくなる。この場合、グルコースアナ
ログを静置した地点を中心に生育阻止円が形成される。
2〜3日間培養を行うと、その阻止円の中に、ある頻度で
生育可能なコロニーが出現する。こうして、グルコース
アナログ耐性株を取得した。
株の変異点の同定、及び当該変異のE. coli W3100 (tyr
A)への導入 E. coli W3100 (tyrA)のコロニーを5mlのL培地を含む試
験管に植菌し、一夜振盪培養した。培養菌体を生理食塩
水5mlで２回洗浄し同量の生理食塩水に懸濁した。この
懸濁液を、マルトースを炭素源とするM9寒天培地に懸濁
液0.1mlを塗布し、表面を乾燥させた。プレート上に一
白金耳分の２−デオキシグルコースを静置させ、2〜3日
間37℃にて培養した。 E. coli W3100 (tyrA)はマルト
ースを炭素源とすることができるが、グルコースアナロ
グ例えば、２−デオキシグルコースが存在すると、抑制
がかかり生育できなくなる。この場合、グルコースアナ
ログを静置した地点を中心に生育阻止円が形成される。
2〜3日間培養を行うと、その阻止円の中に、ある頻度で
生育可能なコロニーが出現する。こうして、グルコース
アナログ耐性株を取得した。
【００６３】グルコースアナログ耐性株のうち、malK#1
とmalK#2のmalK遺伝子上の変異を調べた。変異点の確認
は以下の通り行った。当該菌株のコロニー形成させ、そ
のコロニーを鋳型として、Pyrobest DNA polymeraseを
用いてPCR反応を実施した。PCR反応は、プライマーはPr
imer-1とPrimer-2を使用し、酵素に添付のプロトコール
に従って行った。反応終了後、反応液中の残存プライマ
ーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いたカラム
は、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Pharmaci
a Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付のプロト
コールに従った。得られたPCR産物は、各々、グルコー
ス耐性株malK#1とmalK#2のmalK遺伝子であり、これらの
遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、両株ともに98
0位のTがAに置換しており、これに伴い327位のLeu残基
がGlnに置換していることがわかった。これは、これま
でには知られていない変異である。この変異をL327Q型
変異と命名した。
とmalK#2のmalK遺伝子上の変異を調べた。変異点の確認
は以下の通り行った。当該菌株のコロニー形成させ、そ
のコロニーを鋳型として、Pyrobest DNA polymeraseを
用いてPCR反応を実施した。PCR反応は、プライマーはPr
imer-1とPrimer-2を使用し、酵素に添付のプロトコール
に従って行った。反応終了後、反応液中の残存プライマ
ーを除去する目的でゲル濾過を行った。用いたカラム
は、MicroSpinTM S-400HR Columns（Amersham Pharmaci
a Biotech 社製）であり、方法はカラムに添付のプロト
コールに従った。得られたPCR産物は、各々、グルコー
ス耐性株malK#1とmalK#2のmalK遺伝子であり、これらの
遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、両株ともに98
0位のTがAに置換しており、これに伴い327位のLeu残基
がGlnに置換していることがわかった。これは、これま
でには知られていない変異である。この変異をL327Q型
変異と命名した。
【００６４】L327Q型変異を、E. coli W3100 (tyrA)へ
上述の方法で導入した。取得した変異導入株を、E. col
i W3100 (tyrA)malK327と命名した。同様に、E. coli W
3100(tyrA)malK327について、M9培地にグルコースを0.0
5%とマルトースを0.45%添加した培地における生育を、O
D測定により追跡した（図４）。対照にはE. coli W3100
(tyrA)を用いた。図４からわかるように、E. coli W31
00 (tyrA)では２段階増殖いわゆるジオキシーが観察さ
れるが、malK変異導入株E. coli W3100 (tyrA)malK327
では２段階増殖は認められなかった。すなわち、新規ma
lK変異導入により、インデュサーイクスクルージョンが
起こらず、グルコース資化と同時にマルトースが資化さ
れていることがわかった。
上述の方法で導入した。取得した変異導入株を、E. col
i W3100 (tyrA)malK327と命名した。同様に、E. coli W
3100(tyrA)malK327について、M9培地にグルコースを0.0
5%とマルトースを0.45%添加した培地における生育を、O
D測定により追跡した（図４）。対照にはE. coli W3100
(tyrA)を用いた。図４からわかるように、E. coli W31
00 (tyrA)では２段階増殖いわゆるジオキシーが観察さ
れるが、malK変異導入株E. coli W3100 (tyrA)malK327
では２段階増殖は認められなかった。すなわち、新規ma
lK変異導入により、インデュサーイクスクルージョンが
起こらず、グルコース資化と同時にマルトースが資化さ
れていることがわかった。
【００６５】
【実施例４】malK変異株のＬ−アミノ酸生産性の評価 E. coli W3100 (tyrA)malK327に、pVIC40（WO90/0463
6）、pCABD2（WO95/16042）、およびpMGAL1（特開平5-3
44881）を導入し、各々Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、
およびＬ−フェニルアラニンの生産能を調べた。
6）、pCABD2（WO95/16042）、およびpMGAL1（特開平5-3
44881）を導入し、各々Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、
およびＬ−フェニルアラニンの生産能を調べた。
【００６６】pVIC40は、スレオニンオペロンを含むプラ
スミドであり、同プラスミドを保持するE. coli VKPM B
-3996株（USSR Antibiotics Research Institute (VNII
A)に、登録番号 RIA1867 のもとに寄託されている）か
ら調製することができる（WO90/04636）。
スミドであり、同プラスミドを保持するE. coli VKPM B
-3996株（USSR Antibiotics Research Institute (VNII
A)に、登録番号 RIA1867 のもとに寄託されている）か
ら調製することができる（WO90/04636）。
【００６７】pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由
来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードす
るDNA(dapA*24) と、L-リジンによるフィードバック阻
害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来の
アスパルトキナーゼIIIをコードするDNA(lysC*80)と、
エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼをコードするDNA(dapB)と、及びブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デ
ヒドロゲナーゼをコードするDNA(ddh)を有している（WO
95/16042）。
ク阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由
来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードす
るDNA(dapA*24) と、L-リジンによるフィードバック阻
害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来の
アスパルトキナーゼIIIをコードするDNA(lysC*80)と、
エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼをコードするDNA(dapB)と、及びブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デ
ヒドロゲナーゼをコードするDNA(ddh)を有している（WO
95/16042）。
【００６８】pMGAL1は、フィードバック阻害が解除され
たエシェリヒア属由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘ
プツロン酸−７−リン酸シンターゼをコードする遺伝
子、及びフィードバック阻害が解除されたエシェリヒア
属由来のコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラ
ターゼを有している（特開平5-344881号）。
たエシェリヒア属由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘ
プツロン酸−７−リン酸シンターゼをコードする遺伝
子、及びフィードバック阻害が解除されたエシェリヒア
属由来のコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラ
ターゼを有している（特開平5-344881号）。
【００６９】各々のプラスミドを用いて、Hanahanらの
方法によりE. coli W3100 (tyrA)malK327を形質転換し
た。得られた各形質転換体を、50μg/mlのストレプトマ
イシンを含むＬ培地5mlに植菌し、37℃にて一夜振盪培養
した後、培養液50μlを50μg/mlのストレプトマイシン
を含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一夜培養した。グ
ルコースとマルトースの混合物を炭素源としたアミノ酸
生産培地（グルコース36g/L、マルトース5.8g/L）を500
ml容の坂口フラスコに20ml張り込み、先の寒天培地に生
育した菌体を1/8プレート分かきとり植菌した。培養終
了後、各アミノ酸濃度と、残存するグルコースおよびマ
ルトースを定量した。対照としてはE. coli W3100 (tyr
A)に各プラスミドを導入した形質転換体を用いた。結果
を表１に示す。
方法によりE. coli W3100 (tyrA)malK327を形質転換し
た。得られた各形質転換体を、50μg/mlのストレプトマ
イシンを含むＬ培地5mlに植菌し、37℃にて一夜振盪培養
した後、培養液50μlを50μg/mlのストレプトマイシン
を含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一夜培養した。グ
ルコースとマルトースの混合物を炭素源としたアミノ酸
生産培地（グルコース36g/L、マルトース5.8g/L）を500
ml容の坂口フラスコに20ml張り込み、先の寒天培地に生
育した菌体を1/8プレート分かきとり植菌した。培養終
了後、各アミノ酸濃度と、残存するグルコースおよびマ
ルトースを定量した。対照としてはE. coli W3100 (tyr
A)に各プラスミドを導入した形質転換体を用いた。結果
を表１に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】E. coli W3100 (tyrA)を宿主とした場合
は、グルコースを消費した時点でまだマルトースを資化
していないのに対して、E. coli W3100 (tyrA)malK327
を宿主とした場合には、同様の培養時間でマルトースを
資化しており、マルトースの消費がグルコース抑制を受
けていないことがわかった。
は、グルコースを消費した時点でまだマルトースを資化
していないのに対して、E. coli W3100 (tyrA)malK327
を宿主とした場合には、同様の培養時間でマルトースを
資化しており、マルトースの消費がグルコース抑制を受
けていないことがわかった。
【００７２】また、pVIC40、pCABD2、およびpMGAL1を保
持するE. coli W3100 (tyrA)malK327株は、それぞれの
プラスミドを保持するE. coli W3100 (tyrA)に比べて、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニン
生産能が向上していた。
持するE. coli W3100 (tyrA)malK327株は、それぞれの
プラスミドを保持するE. coli W3100 (tyrA)に比べて、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニン
生産能が向上していた。
【００７３】
【発明の効果】本発明により、発酵法により微生物を利
用して物質を製造するに際して、デンプン分解液等のグ
ルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用いたときに、前
記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対する資化性を
向上させることができる。
用して物質を製造するに際して、デンプン分解液等のグ
ルコース及びオリゴ糖を含む炭素源を用いたときに、前
記微生物のオリゴ糖、特にマルトースに対する資化性を
向上させることができる。
【００７４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 発酵法による目的物質の製造法 <130> P-8452 <140> <141> 2001-05-02 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００７５】 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 ggcggtaatg tggagatgcg cacataaaat cgcc 34
【００７６】 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 cctgagtcat tgcttttctt ttttcacatc acctgtgac 39
【００７７】 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 cggaagtgct acaactgacg catttgctgg atcgc 35
【００７８】 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 gcgatccagc aaatgcgtca gttgtagcac ttccg 35
【００７９】 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gatttcttta gtatcggcac caatgattta acgc 34
【００８０】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 aaattgccgc gatctagaca gtgccattgc 30
【００８１】 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 gaaaccaacc acacattctc tatcgaatct gatagcggcg 40
【００８２】 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 cgccgctatc agattcgata gagaatgtgt ggttggtttc 40
【図１】 温度感受性複製開始起点を有するプラスミド
ベクターpTS1の構造を示す図。
ベクターpTS1の構造を示す図。
【図２】 グルコース及びマルトースを含む培地におけ
るE. coli W3100 (tyrA)malK1の生育を示す図。
るE. coli W3100 (tyrA)malK1の生育を示す図。
【図３】 グルコース及びマルトースを含む培地におけ
るE. coli W3100 (tyrA)crr3の生育を示す図。
るE. coli W3100 (tyrA)crr3の生育を示す図。
【図４】 グルコース及びマルトースを含む培地におけ
るE. coli W3100 (tyrA)malK327の生育を示す図。
るE. coli W3100 (tyrA)malK327の生育を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 伊藤 久生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA71 BA72 BA73 CA04 DA06 EA04 GA11 GA25 HA01 HA12 4B064 AE10 AE25 AE29 CA02 CA19 CC24 CD09
Claims (8)
- 【請求項１】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該培養物から目的物質を採取す
る、微生物を利用した目的物質の製造法において、 前記微生物は、グルコースＰＴＳのIIＡGlcタンパク質
と、マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用により、マルトース資化が調節される微
生物の変異株又は組換え株であって、IIＡGlcタンパク
質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタンパク
質との相互作用が弱化または消失し、かつ、グルコース
とマルトースの取り込みが可能な微生物であることを特
徴とする方法。 - 【請求項２】 マルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与す
るタンパク質がＡＴＰ分解活性を有するマルトースキャ
リアプロテインである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記タンパク質がＭａｌＫタンパク質で
ある請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記微生物が保持するＭａｌＫタンパク
質が、１２４位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変
異、及び３２７位のＬｅｕ残基がＧｌｎ残基に置換する
変異から選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタ
ンパク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタ
ンパク質との相互作用が弱化または消失したことを特徴
とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記微生物が保持するIIＡGlcタンパク
質が、４７位のＧｌｙ残基がＳｅｒ残基に置換する変
異、及び７６位のＡｌａ残基がＴｈｒ残基に置換する変
異から選ばれる変異を有することにより、IIＡGlcタン
パク質とマルトースの非ＰＴＳ取り込みに関与するタン
パク質との相互作用が弱化または消失したことを特徴と
する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求
項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記目的物質がＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン、Ｌ−フェニルアラニンから選ばれる請求項６記載
の方法。 - 【請求項８】 前記微生物がエシェリヒア属細菌である
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001135517A JP2002330763A (ja) | 2001-05-02 | 2001-05-02 | 発酵法による目的物質の製造法 |
| DE60208459T DE60208459T3 (de) | 2001-05-02 | 2002-04-11 | Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure mittels Fermentation |
| EP02008316A EP1254957B2 (en) | 2001-05-02 | 2002-04-11 | Method for producing an L-amino acid substance by fermentation |
| US10/121,693 US7097999B2 (en) | 2001-05-02 | 2002-04-15 | Method for producing target substance using microorganisms with reduced interactions between MalK and IIAGlc |
| BR0201520-0A BR0201520A (pt) | 2001-05-02 | 2002-04-30 | Método para produzir uma subst ncia de marcação utilizando um microorganismo |
| BRPI0201520-0A BRPI0201520B1 (pt) | 2001-05-02 | 2002-04-30 | Method for producing a l-amino acid using a microorganism |
| US11/275,900 US8497087B2 (en) | 2001-05-02 | 2006-02-02 | Method for producing target substance by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001135517A JP2002330763A (ja) | 2001-05-02 | 2001-05-02 | 発酵法による目的物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002330763A true JP2002330763A (ja) | 2002-11-19 |
| JP2002330763A5 JP2002330763A5 (ja) | 2007-09-20 |
Family
ID=18982967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001135517A Pending JP2002330763A (ja) | 2001-05-02 | 2001-05-02 | 発酵法による目的物質の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7097999B2 (ja) |
| EP (1) | EP1254957B2 (ja) |
| JP (1) | JP2002330763A (ja) |
| BR (2) | BRPI0201520B1 (ja) |
| DE (1) | DE60208459T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009088049A1 (ja) * | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2012132335A1 (ja) * | 2011-03-25 | 2012-10-04 | カルピス株式会社 | 培地の製造方法及び該方法により製造された培地 |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001046067A (ja) * | 1999-08-04 | 2001-02-20 | Ajinomoto Co Inc | 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子 |
| US7723081B1 (en) | 2000-01-21 | 2010-05-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same |
| JP2002330763A (ja) * | 2001-05-02 | 2002-11-19 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| US7241600B2 (en) * | 2001-07-06 | 2007-07-10 | Degussa Ag | Process for the preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| US7335496B2 (en) * | 2003-06-05 | 2008-02-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance |
| JP4665451B2 (ja) * | 2003-07-29 | 2011-04-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンまたはｌ−スレオニンの製造法 |
| JP4380305B2 (ja) * | 2003-11-21 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE102004003411A1 (de) * | 2004-01-23 | 2005-09-01 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| US7344874B2 (en) * | 2004-03-04 | 2008-03-18 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid |
| US7300776B2 (en) * | 2004-04-26 | 2007-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid |
| US7482140B2 (en) * | 2004-06-15 | 2009-01-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine |
| US7205132B2 (en) * | 2004-09-10 | 2007-04-17 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid |
| RU2004137719A (ru) * | 2004-12-23 | 2006-06-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| US7794989B2 (en) * | 2004-12-28 | 2010-09-14 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid |
| US7547531B2 (en) | 2005-01-18 | 2009-06-16 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing microorganism which has been modified to inactive the fimH gene, and a method for producing I-amino acid |
| US20070004014A1 (en) * | 2005-06-29 | 2007-01-04 | Yuichiro Tsuji | Method for producing l-threonine |
| JP2008283863A (ja) | 2005-08-26 | 2008-11-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6047692A (ja) * | 1983-08-25 | 1985-03-15 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 |
| JPS61212285A (ja) * | 1985-03-12 | 1986-09-20 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | キシロースイソメラーゼ |
| JPS63157986A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-06-30 | Sagami Chem Res Center | 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| JPH03277269A (ja) * | 1990-03-27 | 1991-12-09 | Shiseido Co Ltd | 新規微生物およびそれを用いるビオチン類の製造方法 |
| JPH09511406A (ja) * | 1994-11-08 | 1997-11-18 | ザ ピルスバリー カンパニー | 異化代謝産物非抑制性の基質限定性酵母菌株 |
| WO2001012833A2 (en) * | 1999-08-18 | 2001-02-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the biological production of 1,3-propanediol |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5618596A (en) * | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-lysine through fermentation process |
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
| JPH03501682A (ja) | 1988-10-25 | 1991-04-18 | 味の素株式会社 | Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株 |
| DE69133587D1 (de) | 1990-11-30 | 2008-01-03 | Ajinomoto Kk | Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback-Inhibition, Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, transformierte Mikroorganismen, nützlich für Produktion aromatischer Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation |
| US5508047A (en) * | 1991-07-18 | 1996-04-16 | The Pillsbury Company | Catabolite non-repressed substrate-limited yeast strains and method of making |
| JP2812153B2 (ja) | 1993-06-28 | 1998-10-22 | 住友金属工業株式会社 | Ｎｅａｒβ型チタン合金の熱処理方法 |
| DE19846499A1 (de) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen |
| JP2002330763A (ja) * | 2001-05-02 | 2002-11-19 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
-
2001
- 2001-05-02 JP JP2001135517A patent/JP2002330763A/ja active Pending
-
2002
- 2002-04-11 EP EP02008316A patent/EP1254957B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-11 DE DE60208459T patent/DE60208459T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-15 US US10/121,693 patent/US7097999B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 BR BRPI0201520-0A patent/BRPI0201520B1/pt unknown
- 2002-04-30 BR BR0201520-0A patent/BR0201520A/pt active IP Right Grant
-
2006
- 2006-02-02 US US11/275,900 patent/US8497087B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6047692A (ja) * | 1983-08-25 | 1985-03-15 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 |
| JPS61212285A (ja) * | 1985-03-12 | 1986-09-20 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | キシロースイソメラーゼ |
| JPS63157986A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-06-30 | Sagami Chem Res Center | 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法 |
| JPH03277269A (ja) * | 1990-03-27 | 1991-12-09 | Shiseido Co Ltd | 新規微生物およびそれを用いるビオチン類の製造方法 |
| JPH09511406A (ja) * | 1994-11-08 | 1997-11-18 | ザ ピルスバリー カンパニー | 異化代謝産物非抑制性の基質限定性酵母菌株 |
| WO2001012833A2 (en) * | 1999-08-18 | 2001-02-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the biological production of 1,3-propanediol |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009088049A1 (ja) * | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
| US8617852B2 (en) | 2008-01-10 | 2013-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a target substance by fermentation |
| US9228215B2 (en) | 2008-01-10 | 2016-01-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a target substance by fermentation |
| WO2012132335A1 (ja) * | 2011-03-25 | 2012-10-04 | カルピス株式会社 | 培地の製造方法及び該方法により製造された培地 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60208459D1 (de) | 2006-03-30 |
| US20060205043A1 (en) | 2006-09-14 |
| US20030077764A1 (en) | 2003-04-24 |
| US7097999B2 (en) | 2006-08-29 |
| EP1254957A3 (en) | 2003-09-17 |
| EP1254957B2 (en) | 2012-01-18 |
| US8497087B2 (en) | 2013-07-30 |
| BR0201520A (pt) | 2003-06-10 |
| EP1254957A2 (en) | 2002-11-06 |
| DE60208459T3 (de) | 2012-04-05 |
| DE60208459T2 (de) | 2006-10-05 |
| EP1254957B1 (en) | 2006-01-04 |
| BRPI0201520B1 (pt) | 2017-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8497087B2 (en) | Method for producing target substance by fermentation | |
| CN100415874C (zh) | 具有产生l-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌以及生产l-氨基酸的方法 | |
| EP0745671B1 (en) | Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation | |
| KR101208480B1 (ko) | 말산 효소 활성이 감쇠된 에스케리키아 세균을 사용하는ｌ-라이신 또는 ｌ-트레오닌의 생산방법 | |
| AU782560B2 (en) | Method for producing substance utilizing microorganism | |
| JP4088982B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| EP2083083B1 (en) | Method for production of l-amino acid | |
| EP1217076B1 (en) | Method of producing a target substance by fermentation | |
| EP0733712A1 (en) | Process for producing substance | |
| US20070004014A1 (en) | Method for producing l-threonine | |
| EP1896599B1 (en) | Method for producing l-threonine | |
| JP2011067095A (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 | |
| KR20150046778A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| KR20150113965A (ko) | 발효에 의한 아미노산 생산을 위한 미생물 및 방법 | |
| EP2471942A1 (en) | Process for production of l-amino acid | |
| EP3147351B1 (en) | Microorganism having improved intracellular energy level and method for producing l-amino acid using same | |
| US7163810B2 (en) | Method for producing target substance | |
| EP2049676B1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the ydin gene or the ydib gene or combination thereof | |
| JP4019706B2 (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 | |
| JP2022516111A (ja) | 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性ｌ－アミノ酸またはその塩の製造方法 | |
| EP1020526A2 (en) | Process for producing L-Threonine by fermentation | |
| JP2004173685A (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070807 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070807 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100817 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101018 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110208 |