CN101180076B - 流感病毒及水包油乳液佐剂在制备诱导cd-4 t细胞和/或改善的b-记忆细胞应答的免疫原性组合物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及流感疫苗制剂和用于免疫对抗流感疾病的疫苗接种方案。具体地说，本发明涉及含水包油乳液佐剂和任选的3D-MPL的疫苗制剂、其在药物中的用途，尤其是其在增强对流感抗原的免疫应答方面的用途，并涉及制备方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代谢油和乳化剂。

Description

流感病毒及水包油乳液佐剂在制备诱导CD-4 T细胞和/或改善的B-记忆细胞应答的免疫原性组合物中的用途

技术领域

本发明涉及流感疫苗制剂和用于免疫对抗流感疾病的接种方案。具体地说，本发明涉及含水包油乳液佐剂和任选的3D-MPL的疫苗制剂、其在药物中的用途，尤其是其在增大对流感抗原的免疫应答方面的用途，并涉及制备方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代谢油和乳化剂。 

技术背景

流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感产生重大的经济负担、发病率乃至死亡率。 

流感病毒是RNA包膜病毒，颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为：内部为与核蛋白结合的核糖核酸(RNA)核衣壳或核心，外部包绕着脂质双层结构和外层糖蛋白的病毒被膜。病毒被膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。流感病毒包含两种表面抗原：糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，它们以10-12nm长的刺突显露在颗粒表面上。就是这些表面蛋白、尤其是血细胞凝集素，决定了流感亚型的抗原特异性。 

这些表面抗原渐进地、有时快速地经历某些导致流感病毒抗原性变异的改变。这些抗原性改变称为‘漂移’和‘转换’，是不可预见的，由免疫学观点看可能具有显著的影响，因为它们最终导致出现新流感株，能使病毒逃逸免疫系统，几乎每年都引起众所周知的流行病。 

每个季节加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO协同国家卫 生管理局以及疫苗生产商共同确定。 

HA是确定不同流感株的血清学特异性的最重要的抗原。此75-80kD的蛋白包含众多的抗原决定簇，其中几个位于在不同毒株中经历序列改变的区域中(毒株特异性决定簇)，其余的位于许多HA分子共有的区域中(共同决定簇)。 

流感病毒几乎每年冬天都引起大流行，甲(A)型或乙(B)型病毒的感染率在6周的时间段内高达40％。流感感染产生各种病症，由亚临床感染至轻微的上呼吸道感染到严重的病毒性肺炎。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。疾病的严重性主要由宿主的年龄、其免疫状况和感染部位决定。 

65岁和以上的老年人尤其易受攻击，占发达国家所有流感相关死亡的80-90％。患有基础性慢性疾病的个体也非常有可能经历这种并发症。幼儿也可能患严重疾病。因此，这些群体尤其需要受保护。除了这些‘风险’群体以外，卫生当局还推荐对与老年人接触的健康成人接种。 

接种对控制每年的流感大流行起关键作用。目前可用的流感疫苗是失活流感疫苗或减毒活流感疫苗。失活流感疫苗由3种可能形式的抗原制备物组成：失活全病毒、其中纯化的病毒颗粒被去污剂或其它试剂破坏以溶解脂质包膜的亚病毒体(所谓的“裂解疫苗”)或纯化的HA或NA(亚单位疫苗)。这些失活疫苗肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)给予。 

所有种类的流感疫苗通常都是三价疫苗。一般来说，它们含有的抗原得自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株。据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：An improved single radialimmunodiffusion technique for the assay of influenza haemaggiutininantigen：adaptation for potency determination of inactivated whole virusand subunit vaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，International collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemaggiutininantigen of influenza virus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330)的检测，在大多数情况下，标准0.5 ml注射剂量含有每种毒株的15μg血细胞凝集素抗原组分。 

目前可用的流感疫苗被认为在所有年龄组都是安全的(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，很少有证据表明当前的流感疫苗在2岁以下的儿童中有作用。而且，预防典型的已确认流感疾病的疫苗效力的报告比率对老年人为23-72％，这显著低于对较年轻成年人所报告的60-90％的有效率(Govaert，1994，J.Am.Med.Assoc，21，166-1665；Gross，1995，Ann Intern.Med.123，523-527)。业已表明，流感疫苗的有效性与针对病毒株的血凝反应抑制(HI)抗体的血清滴度相关，几个研究已发现较年长的成年人在流感免疫后表现出的HI滴度低于较年轻成年人(Murasko，2002，Experimental gerontology，37，427-439)。 

因此，仍需要具有改良的免疫原性的新疫苗。疫苗抗原和有效佐剂的制剂是一种有可能增强对亚病毒体抗原的免疫应答的方法。 

用水包油乳液形式的佐剂MF59佐剂化的亚单位流感疫苗已商品化，已表现出其诱导高于无佐剂亚单位疫苗所获抗体滴度的抗体滴度的能力(De Donato等，1999，Vaccine，17，3094-3101)。但是，在后来的出版物中，相同疫苗没有表现出其相比无佐剂裂解疫苗改善的模式(Puig-Barbera等，2004，Vaccine 23，283-289)。 

仍需要改良的流感疫苗，尤其是对于老年人群。 

发明陈述 

在本发明的第一个方面，提供(a)流感病毒或其抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于在人中诱导抗所述病毒或抗原性组合物的以下至少一种：i)改善的CD4 T-细胞免疫应答，ii)改善的B-记忆细胞应答，其中所述 水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂。 

适宜地，所述甾醇是α-生育酚。在一个具体实施方案中，所述水包油乳液佐剂包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。 

在一个具体实施方案中，相比于用无佐剂抗原或抗原性组合物获得的应答，所述免疫原性组合物能够诱导改善的CD4 T-细胞免疫应答和改善的B-记忆细胞应答。 

在本发明的第二个方面，提供(a)流感病毒或其抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于接种人免疫应答受损个体或群体，例如高风险成人或老年人，以对抗流感，其中所述水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂。 

在一个优选实施方案中，所述水包油乳液佐剂包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。 

在本发明的第三个方面，提供流感病毒或其抗原性制备物在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用流感病毒或其抗原性制备物接种的人，所述流感病毒或其抗原性制备物用水包油乳液佐剂配制，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇(适宜地为α-生育酚)和乳化剂。优选地，再接种在已于前一季接种对抗流感的受试者中进行。通常，再接种在第一次接种后至少6个月进行，优选8-14个月后进行，更优选在约10-12个月后进行。 

优选地，提供(a)流感病毒或其抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇(例如α-生育酚)和乳化剂，所述免疫原性组合物用于再接种先前用流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人，其中所述水包油乳液佐剂包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm 径。 

在另一个优选实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物，它们与用于第一次接种感病毒或其病毒抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位或共B细胞表位或两者。 

在本发明的第四个方面，提供(a)第一流感株的流感病毒或其抗制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，水包油乳液包含可代谢油、甾醇和乳化剂，所述免疫原性组合于对抗流感株引起的流感感染的保护作用，所述流感株是所述流感株的变体。在一个优选实施方案中，所述水包油乳液佐剂至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。 

在另一方面，提供一种用免疫原性组合物接种免疫应答受损人本或群体(例如高风险成人或老年人)的方法，所述免疫原性组合含流感病毒或其抗原性制备物和如上文定义的水包油乳液佐在再另一个实施方案中，本发明提供一种再接种先前用流感病其病毒抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人的方法，其中水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇和乳化剂，所述方法包括所述人含有佐剂或无佐剂流感病毒的免疫原性组合物。适宜地，甾醇是α-生育酚。 

在再一个实施方案中，提供一种方法：接种人群或个体对抗一感病毒株，接着再接种所述人或群体对抗变体流感病毒株，所   包括给予所述人：(i)第一种组合物，其包含第一流感病毒株的病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂，所述水包油乳液佐  可代谢油、甾醇和乳化剂，和(ii)第二种免疫原性组合物，其所述第一个流感病毒株的流感病毒株变体。适宜地，所述甾醇  育酚。 

在另一个实施方案中，本发明提供流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂的用途，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇和乳化剂。适宜地，所述甾醇是α-生育酚。 

在再另一方面，本发明提供一种设计流感疫苗的方法，包括： 

1)选择含CD4+表位的流感抗原，和 

2)组合所述流感抗原和如上定义的水包油乳液，其中所述疫苗在哺乳动物中给予时能够在所述哺乳动物中诱导增强的CD4应答。 

本发明的其它方面和优势在以下优选实施方案的详述中进一步描述。 

附图说明

图1：依据PCS检测的SB62水包油乳液的油滴粒度分布。图1A显示了用Malvern Zetasizer 3000HS检测的SB62批号1023的粒度测量结果：A＝稀释度1/10000(Rec22至Rec24)(用Contin和适合的光学模型1.5/0.01分析)；B＝稀释度1/20000(Rec28至Rec30)(用Contin和适合的光学模型1.5/0.01分析)。图1B显示了依据强度的记录22(上部)和记录23(下部)的示意图。 

图2：MPL原液制备的示意图。 

图3：AS03+MPL佐剂制备的示意图。 

图4：Explo Flu-001临床实验。针对裂解流感抗原的CD4 T细胞应答(Q1＝第一四分位数，Q3＝第三四分位数)。 

图5：Explo Flu-001临床实验。针对裂解流感抗原的CD8 T细胞应答(Q1＝第一四分位数，Q3＝第三四分位数)。 

图6：Explo Flu-001临床实验。在用Fluarix+AS03接种后针对裂解流感病毒抗原的交叉反应性CD4 T-细胞应答。 

图7：Explo Flu-001临床实验。接种后的B细胞记忆应答。 

图8：Explo Flu-002临床实验。再接种后抗裂解流感抗原的CD4T细胞应答。 

图9：Explo Flu-002临床实验。再接种后的抗HI滴度。 

图10：雪貂研究I。温度监测(初免和攻击)。图10A是初免，图10B是攻击。 

图11：雪貂研究I。病毒脱落。 

图12：雪貂研究II。温度监测(初免和攻击)。图12A是初免，图12B是攻击。 

图13：雪貂研究II。病毒脱落。 

图14：雪貂研究II。对H3N2 A/巴拿马(疫苗株)(图14A)和H3N2A/怀俄明(攻击株)(图14B)的HI滴度。 

图15：小鼠研究。使用全失活病毒作为再刺激抗原(免疫后7天)的情况下C57BI/6初免小鼠中CD4 T细胞的频率。 

图16：小鼠研究。使用全失活病毒作为再刺激抗原(免疫后7天)的情况下C57BI/6初免小鼠中CD8 T细胞的频率。 

图17：小鼠研究。使用全失活病毒作为再刺激抗原(免疫后7天)的情况下用异源毒株初免的C57BI/6小鼠中CD4 T细胞(上部)和CD8T细胞(下部)的频率。 

图18：人临床实验。老年人接种Fluarix、Fluarix+AS03、Fluarix+AS03+MPL后的B细胞记忆应答(接种前和接种后之间的差异)。 

图19：雪貂研究III。攻击前和攻击后的温度监测。 

图20：雪貂研究III。攻击前和攻击后的病毒脱落。 

图21：雪貂研究III。针对H3N2A/怀俄明(疫苗株)的HI滴度。 

图22：雪貂研究III。针对H3N2A/巴拿马(攻击株)的HI滴度。 

图23：人临床实验。在接种后21天、90天和1 80天时的HI滴度(GMT)(持续性)。 

图24：人临床实验。CD4应答-all double(产生至少两种细胞因子的细胞)检验-在接种后21天、90天和180天时的混合抗原(持续性)。 

图25：人临床实验。与Fluarix相比在使用AS03+MPL的再接 种临床实验中的HI滴度。 

图26：人临床实验。CD4应答的CMI-all double检验-在接种后0和21天时的混合抗原。 

图27：采用两个浓度的AS03+MPL的人临床实验。在0和21天的HI滴度。 

图28：采用两个浓度的AS03+MPL的人临床实验。反应原性。 

发明详述 

本发明人已经发现，相比于用无佐剂病毒或其抗原性制备物获得的应答，含流感病毒及其抗原性制备物连同水包油乳液佐剂的流感制剂能够在人中改善抗所述抗原或抗原性组合物的CD4 T-细胞免疫应答和/或B细胞记忆应答，所述水包油乳液佐剂含可代谢油、甾醇如α-生育酚和乳化剂。要求保护的制剂有利地用于诱导抗流感的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子提呈的流感表位。本申请人现在已发现，该制剂有效靶向细胞介导的免疫系统，以便增加对同源和漂移的流感株的反应性(在接种和感染时)。 

本发明的有佐剂流感组合物具有几个优势： 

1)改善的免疫原性：它们允许将老年人(50岁以上，通常65岁以上)中的弱免疫应答恢复至在年轻人中可见的水平(抗体和/或T细胞应答)； 

2)改善的交叉保护模式：增加抗变异(漂移)流感株的交叉保护作用； 

3)它们还允许使用减少的抗原剂量获得相似的应答，因此确保了紧急情况下(例如大流行)增加的效力。 

具体地说，根据满足流感相关性保护作用的人受试者数目的评价，本发明的组合物已能够在再免疫后提供更好的抗流感血清保护作用。而且，本发明使用的组合物还能够诱导以下趋势：相比于无佐剂组合物，第一次接种人受试者后的B细胞记忆应答较高，以及 再接种后的体液应答较高。 

本发明人还已经能够表明，相比于用无佐剂组合物获得保护性抗体水平的个体，要求保护的有佐剂组合物能够在更多的个体中诱导而且保持对抗疫苗中存在的全部3种毒株的保护性抗体水平(例如参见表43)。 

因此，在再另一个实施方案中，要求保护的组合物能够确保抗流感相关疾病的持续性免疫应答。具体地说，所述持续性指HI抗体免疫应答能够在接种至少3个月后、优选至少6个月后满足管理标准。具体地说，要求保护的组合物能够在至少3个月后在＞70％的个体中、适宜地在＞80％的个体中或适宜地在＞90％的个体中，诱导针对疫苗中存在的至少一种流感株、优选所有毒株的保护性抗体水平。在一个具体方面，在接种后至少6个月获得抗疫苗组合物中存在的至少一种、适宜地两种或全部毒株的＞90％的保护性抗体水平。 

流感病毒株和抗原 

按照本发明使用的流感病毒或其抗原性制备物可为裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物。在一个替代实施方案中，流感病毒制备物可包含另一类型的失活流感抗原，例如失活全病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)，或流感病毒颗粒。在再另一个实施方案中，流感病毒可为减毒活流感病毒制备物。 

适宜地，按照本发明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物为失活病毒制备物，其中病毒颗粒用溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏。适宜地，裂解病毒或其裂解病毒抗原性制备物如下制备：用溶解浓度的有机溶剂或去污剂片段化感染性或失活的全流感病毒，随后去除全部或大部分溶解剂和某些或大部分病毒脂质物质。所述其裂解病毒抗原性制备物指相对于裂解病毒可能已经受了一定程度的纯化而保留了裂解病毒组分的大部分抗原特性的裂解病毒制备物。例如，当在卵中生产时，裂解病毒可由卵杂蛋白中去 除，或者在细胞培养物中生产时，裂解病毒可由宿主细胞杂质中去除。裂解病毒抗原性制备物可包含一种以上病毒株的裂解病毒抗原性组分。含裂解病毒的疫苗(称为‘裂解流感疫苗’)或含裂解病毒抗原性制备物的疫苗一般包含残余的基质蛋白和核蛋白，有时包含脂质以及膜包膜蛋白。这种裂解病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒结构蛋白，但不一定和它们在全病毒中存在的比例相同。 

或者，流感病毒可为全病毒疫苗形式。对于大流行情况来说，其可表现出超越裂解病毒疫苗的优势，因为其避免了有关针对新流感病毒株是否可成功地产生裂解病毒疫苗的不确定性。对于某些毒株来说，用于生产裂解病毒的常规去污剂可损伤病毒，并使其无用。尽管经常有可能使用不同的去污剂和/或开发不同的裂解疫苗生产方法，但这会耗时，在大流行情况下可能不可用。全病毒法除了较大程度的确定性以外，还有比裂解病毒大的疫苗生产能力，因为在制备适宜裂解疫苗必需的额外纯化步骤中有相当大量的抗原损失。 

在另一个实施方案中，流感病毒制备物为纯化的亚单位流感疫苗形式。亚单位流感疫苗一般包含两种主要的包膜蛋白HA和NA，可能具有超越全病毒体疫苗的额外优势，因为它们一般无反应原性，尤其是在年轻的接种者中。亚单位疫苗可重组生产，或者可由破裂的病毒颗粒纯化。 

在另一个实施方案中，流感病毒制备物为病毒体形式。病毒体是球形的单层囊泡，其保留了真实构象的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA，插入病毒体的磷脂双层膜中。 

所述流感病毒或其抗原性制备物可为卵源的或组织培养源的。 

例如，本发明的流感病毒抗原或其抗原性制备物可来源于常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的尿囊液。卵可在短时间内大量累积。或者，它们可来源于任何使用组织培养物的新生产方法，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基质包括例如狗肾细胞，例如MDCK或MDCK克 隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括Vero细胞，合适的猪细胞系，或适于生产疫苗用途的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基质还包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如原初细胞，如小鸡胚成纤维细胞，还包括禽细胞系。 

流感病毒抗原或其抗原性制备物可通过众多商业方法中的任一种生产，例如在专利号DD 300833和DD 211444(通过引用结合到本文中)中描述的裂解流感病毒法。裂解流感病毒传统上使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚组合Tween^TM(称作“Tween-醚”裂解)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它裂解剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆汁盐，例如在专利号DD155875(通过引用结合到本文中)中描述的脱氧胆酸钠。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)；其它离子去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子去污剂，如上述的一种，包括Triton X-100(例如在Lina等，2000，Biologicals 28，95-103描述的方法中)和Triton N-101；或者任何两种或多种去污剂的组合。 

裂解疫苗的制备方法可包括众多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交换)步骤，以及任选的例如采用热、甲醛或β-丙酸内酯或紫外线的失活步骤，其可在裂解前或后进行。裂解过程可以分批、连续或半连续过程进行。用于裂解免疫原性组合物的优选裂解和纯化方法描述于WO02/097072。 

本发明的优选裂解流感疫苗抗原制备物包括生产过程剩余的残余量的Tween 80和/或Triton X-100，但这些物质可在裂解抗原制备后加入或调整其浓度。优选地，Tween 80和Triton X-100都存在。疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为：Tween 80：0.01-1％，更优选约0.1％(体积/体积) 

Triton X-100：0.001-0.1％(重量/体积)，更优选0.005-0.02％(重量/体积)。 

在一个具体实施方案中，Tween 80的终浓度在0.045％-0.09％(重量/体积)的范围内。在另一个具体实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Tween 80浓度在0.045％-0.2％(重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。 

在另一个具体实施方案中，Triton X-100的终浓度在0.005％-0.017％(重量/体积)的范围内。在另一个具体实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Triton X-100浓度在0.005％-0.034％(重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。 

优选地，流感病毒制备物在低水平硫柳汞存在下制备，或优选地在没有硫柳汞的情况下制备。优选地，获得的流感制备物在没有有机汞防腐剂的情况下是稳定的，具体地说，所述制备物不含残余硫柳汞。具体地说，流感病毒制备物包含在没有硫柳汞的情况下或在低水平硫柳汞(一般为5μg/ml或以下)的情况下稳定的血细胞凝集素抗原。具体地说，乙型流感毒株的稳定利用α生育酚衍生物如α生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯，即VES)来实施。这种制备物及其制备方法公开于WO 02/097072。 

优选的组合物含3种失活的裂解病毒体抗原，它们由适宜流感季的WHO推荐毒株制备。 

优选地，流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂包含在同一容器中。这被称为‘单瓶法’。优选地，所述瓶为预填充注射器。在一个替代实施方案中，流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂包含在单独的容器或瓶中，并在给予给受试者之前不久或给予给受试者时混合。这被称为‘双瓶法’。作为实例，当疫苗为0.7ml总剂量体积的2组分疫苗时，浓缩的抗原(例如浓缩的三价失活裂 解病毒体抗原)存在于1个瓶(335μl)(抗原容器)中，预填充注射器含佐剂(360μl)(佐剂容器)。在注射时，使用含佐剂的注射器将含浓缩的三价失活裂解病毒体抗原的瓶中的内容物取出，接着轻微混合注射器。在注射前，使用的针用肌内针替换，体积调整到530μl。一剂重配有佐剂流感疫苗候选物相当于530μl。 

水包油乳液佐剂 

本发明的佐剂组合物包含水包油乳液佐剂，优选地所述乳液包含可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。 

为了使任何水包油组合物适于人给予，乳液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢可定义为‘能够通过代谢被转化’(Dorland′s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。所述油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成油，它们对接受者是无毒的，能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常用的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括商品化油，例如NEOBEE

等。特别合适的可代谢油是鲨烯。鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的特别优选的油。鲨烯是可代谢油缘于以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(Merck index，第10版，编目流水号8619)。 

水包油乳液自身在本领域众所周知，已表明可用作佐剂组合物(EP 399843；WO 95/17210)。 

适宜地，可代谢油以免疫原性组合物总体积的0.5％至20％(终浓度)的量存在，优选以总体积的1.0％至10％的量存在，优选以总体积的2.0％至6.0％的量存在。 

在一个具体实施方案中，可代谢油以免疫原性组合物总体积的 约0.5％、1％、3.5％或5％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，可代谢油以免疫原性组合物总体积的约0.5％、1％、3.57％或5％的最终量存在。 

优选地，本发明的水包油乳液系统具有亚微米范围的小油滴粒度。适宜地，油滴的直径大小在120-750nm的范围内，更优选直径大小在120-600nm的范围内。最优选地，水包油乳液包含油滴，其至少70％(以强度计)的直径低于500nm，更优选至少80％(以强度计)的直径低于300nm，更优选至少90％(以强度计)的直径在120-200nm的范围内。 

本发明的油滴粒度，即直径，以强度给出。有几种方法测定以强度计的油滴直径大小。强度使用粒度测量仪检测，适宜地通过诸如Malvern Zetasizer 4000或优选Malvern Zetasizer 3000HS的动态光散射检测。详细的方法在实施例II.2给出。第一个可能性是通过动态光散射(PCS-光子相关光谱法)测定z平均直径ZAD；该方法额外给出了多分散指数(PDI)，ZAD和PDI这二者均用累积量算法计算。这些值不需要粒子折射率的信息。第二种方法是通过另一种算法Contin或NNLS或者自动化“Malvern”法(由粒度测量仪提供的默认算法)测定全颗粒大小分布来计算油滴直径。多半情况下由于复杂组合物的粒子折射率是未知的，所以只能考虑强度分布，如果有需要，由该分布获得强度平均值。 

水包油乳液包含甾醇。甾醇在本领域众所周知，例如胆固醇是周知的，例如公开于Merck Index，第11版，341页，为动物脂肪中天然存在的甾醇。其它适宜的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、α-生育酚和麦角钙化甾醇。所述甾醇适宜地以免疫原性组合物总体积的0.01％至20％(重量/体积)的量存在，优选以0.1％至5％(重量/体积)的量存在。优选地，当甾醇为胆固醇时，其以免疫原性组合物总体积的0.02％至0.2％(重量/体积)的量存在，更优选以0.5ml疫苗剂量体积的0.02％(重量/体积)的量存在，或者以0.5ml疫苗剂量体积的 0.07％(重量/体积)的量存在，或者以0.7ml疫苗剂量体积的0.1％(重量/体积)的量存在。 

适宜地，甾醇是α-生育酚或其衍生物，例如α-生育酚琥珀酸酯。优选地，α-生育酚以免疫原性组合物总体积的0.2％至5.0％(体积/体积)的量存在，更优选以0.5ml疫苗剂量体积的2.5％(体积/体积)的量存在，或者以0.5ml疫苗剂量体积的0.5％(体积/体积)的量存在，或者以0.7ml疫苗剂量体积的1.7-1.9％(体积/体积)、优选1.8％的量存在。为明晰起见，以体积/体积给出的浓度可通过应用以下转换系数转变为以重量/体积表示的浓度：5％(体积/体积)α-生育酚浓度等于4.8％(重量/体积)α-生育酚浓度。 

水包油乳液还可含有乳化剂。以免疫原性组合物重量计(重量/重量)乳化剂可以0.01-5.0％的量存在，优选以重量计(重量/重量)以0.1-2.0％的量存在。以总组合物的重量计优选的浓度为0.5-1.5％(重量/重量)。 

乳化剂可适宜地为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)。在一个具体实施方案中，0.5ml疫苗剂量体积含1％(重量/重量)Tween80，0.7ml疫苗剂量体积含0.7％(重量/重量)Tween 80。在另一个具体实施方案中，Tween 80的浓度是0.2％(重量/重量)。 

水包油乳液佐剂可用于其它佐剂或免疫刺激剂，因此本发明的重要实施方案是含鲨烯或另一种可代谢油、α-生育酚和tween 80的水包油制剂。水包油乳液还可包含span 85和/或卵磷脂。典型地，水包油包含免疫原性组合物总体积的2-10％的鲨烯，2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween 80，并可按照WO 95/17210中描述的方法生产。优选地，鲨烯：α-生育酚的比率等于或小于1，因为其提供了更稳定的乳液。Span 85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯)也可例如以1％的水平存在。 

用于本发明第一次接种的免疫原性组合物的免疫原性特性 

在本发明中，相比于用无佐剂(即不含任何外源佐剂)的对应组合物(本文称为‘普通组合物’)获得的CD4 T-细胞免疫应答，流感组合物能够诱导抗至少一种组成抗原或抗原性组合物的改善的CD4 T-细胞免疫应答。 

所述‘改善的CD4 T-细胞免疫应答’指在给予有佐剂免疫原性组合物之后在人类患者中获得的CD4应答高于在给予无佐剂的相同组合物后获得的免疫应答。例如，与给予无佐剂的、含流感病毒或其抗原性制备物的免疫原性组合物之后诱导的应答相比，在给予含流感病毒或其抗原性制备物连同水包油乳液佐剂的免疫原性组合物时于人类患者中获得较高的CD4 T-细胞应答，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇如α-生育酚和乳化剂。这种制剂将有利地用于诱导抗流感病毒的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子提呈的流感表位。 

优选地，由用于本发明的有佐剂裂解流感病毒组合物诱导的所述免疫应答高于用任何其它无佐剂常规流感疫苗(例如亚单位流感疫苗或全流感病毒疫苗)诱导的免疫应答。 

具体地但非排它性地，所述‘改善的CD4 T-细胞免疫应答’在免疫学上未初免的患者(即对所述流感病毒或抗原为血清阴性的患者)中获得。此血清阴性可能是从未面对此病毒或抗原的所述患者(所谓的‘原初’患者)的结果，或者替代性地是在遭遇时不能对所述抗原应答的所述患者的结果。优选地，所述改善的CD4 T-细胞免疫应答在免疫应答受损受试者中获得，所述免疫应答受损受试者例如为老年人，通常为65岁或以上，或者是具有高风险医疗状况的小于65岁的成人(‘高风险成人’)，或者是2岁以下的儿童。 

改善的CD4 T-细胞免疫应答可通过检测产生任何以下细胞因子的细胞数来评价： 

·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞 

·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞 

·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞 

·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞 

·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞 

当和给予无佐剂组合物相比在给予有佐剂组合物后产生任何以上细胞因子的细胞量较高时，将存在改善的CD4 T-细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少一种、优选两种将被实现。在一个具体实施方案中，与无佐剂组相比，有佐剂组中生产全部4种细胞因子的细胞将以更高量存在。 

由本发明的有佐剂流感组合物赋予的改善的CD4 T-细胞免疫应答实际上可在单次给予后获得。例如在快速发展的爆发情况下单剂方法将有极为重大的意义。在某些情况下，尤其是对于老年人群，或者对于首次抗流感接种的小孩(9岁以下)，给予两剂相同的该季组合物可能是有益的。第二剂所述相同组合物(仍被看作是‘用于首次接种的组合物’)可在初始免疫应答正在发展的过程中给予，并有足够的时间间隔。通常，第二剂组合物在首剂后数周或约1个月(例如2周、3周、4周、5周或6周)给予，以帮助触发无应答或低应答个体中的免疫系统。 

在一个具体实施方案中，与在无佐剂组合物免疫个体中诱导的B记忆细胞应答相比，给予所述免疫原性组合物在给予有佐剂免疫原性组合物的患者中替代地或额外地诱导改善的B-记忆细胞应答。改善的B-记忆细胞应答意指在遭遇抗原时能够分化为抗体分泌性浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率增加，这通过体外分化刺激检测(参见实施例部分，例如Elispot B细胞记忆的方法)。 

在再另一个具体实施方案中，用有佐剂的首次接种用组合物接种对CD8应答无可检测的影响。 

本申请人已令人惊奇地发现，含用水包油乳液佐剂配制的流感病毒或其抗原性制备物的组合物在免疫受损人群中有效促进T细胞应答，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇如α生育酚和乳化剂。 本申请人已表明，根据在老年人群中进行抗流感再接种后流感疫苗保护作用的关联性评价，与用无佐剂流感疫苗接种提供的血清保护作用相比，给予单剂如本发明所述的首次接种用免疫原性组合物能够提供更好的血清保护作用。相比于无佐剂制剂获得的免疫应答，要求保护的有佐剂制剂还能够诱导抗流感病毒的改善的CD4 T-细胞免疫应答。该观察结果可能与接种或面对流感抗原性接触的感染时增加的应答性相关。而且，其还可能与交叉反应性相关，即对变体流感株应答的能力较高。这种改善的应答可能在免疫受损的人群如老年人群(65岁和以上)以及尤其是高风险老年人群中特别有益。这可导致降低整体的发病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感样疾病的紧急入院。这还可对婴儿群体(5岁以下，优选2岁以下)有益。而且，与用无佐剂制剂诱导的应答相比，其允许诱导时间更持久的CD4 T细胞应答，例如在首次接种后仍存在1年。 

优选地，CD4 T-细胞免疫应答，例如在未初免受试者中获得的改善的CD4 T-细胞免疫应答，包括诱导交叉反应性CD4 T辅助应答。具体地说，交叉反应性CD4 T细胞的量增加。所述‘交叉反应性’CD4应答指CD4 T-细胞靶向流感株之间的共有表位。 

通常，可用的流感疫苗仅有效对抗具有相似抗原性特征的血细胞凝集素的流感病毒感染株。当感染(循环)性流感病毒已经历了表面糖蛋白(具体地说是血细胞凝集素)的微小变化(例如点突变或点突变的累积，导致氨基酸改变)时(抗原漂移变体病毒株)，疫苗仍可提供一些保护作用，但其可能仅提供有限的保护作用，因为新产生的变体可能逃脱先前流感感染或接种诱导的免疫性。抗原漂移是两次大流行期间发生的年度流行的原因(Wiley&Skehel，1987，Ann.Rev.Biochem.56，365-394)。交叉反应性CD4 T细胞的诱导为本发明组合物提供了额外的优势，因为其还可提供交叉保护作用，换句话说是抗异源感染的保护作用，所述异源感染即由循环流感病毒株引起的感染，该循环流感病毒株为免疫原性组合物中包含的流感病毒株的 变体(例如漂移变体)。这在循环毒株难以在卵中繁殖或难以在组织培养物中生产时可能是有利的，使漂移株用作备选工作株。这在受试者以几个月或一年间隔接受第一次和第二次接种时也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性组合物中的流感株是用于首次接种的组合物中使用的毒株的漂移变体株。 

用流感疫苗接种后交叉反应性CD4 T-细胞的检测 

在给予经典的三价流感疫苗后(3周)，对抗原性毒株制备物(全病毒或裂解抗原)应答的外周血CD4 T-细胞的频率显著增加，所述抗原性毒株制备物与疫苗中存在的一种抗原(H3N2：A/巴拿马/2007/99；H1N1：A/新喀里多尼亚/20/99；B：B/山东/7/97)(参见实施例III)同源。如果用分类为漂移株(H3N2：A/悉尼/5/97，H1N1：A/北京/262/95，B：B/山梨/166/98)的流感株再刺激外周血CD4 T-细胞，则可以见到相当大的频率增加。 

相反，如果用本领域专家分类为漂移株(H2N2：A/新加坡/1/57；H9N2：A/香港/1073/99)的流感株再刺激外周血CD4 T-细胞，则在接种后没有可观测的增加。 

能够同时识别同源和漂移的流感株的CD4 T-细胞在本文件中已命名为“交叉反应性”。要求保护在本发明中的用途的有佐剂流感组合物已能够显示出异亚型的交叉反应性，因为存在抗漂移流感株的可观测的交叉反应性。 

与以上观测结果相一致，已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4T-细胞表位(Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995 J Virol.199569(12)：7497-506)。 

在一个具体实施方案中，有佐剂组合物可提供额外利益，该利益提供了抗循环毒株的更好保护作用，所述循环毒株经历了血细胞凝集素的大改变(例如基因重组，例如两个不同物种之间的基因重 组)(抗原漂移)，目前可用疫苗对其无效。 

其它佐剂 

组合物可包含另外的佐剂，具体地说为TRL-4配体佐剂，适宜地为脂质A的无毒衍生物。适宜的TRL-4配体为3脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。其它适宜的TLR-4配体为脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。 

在一个实施方案中，所述组合物可另外包括Toll样受体(TLR)4配体，例如脂质A的无毒衍生物，具体地说是单磷酰脂质A，或者更具体地说是3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。 

3D-MPL由Corixa公司以商标MPL销售(本文称为MPL)，主要促进具有IFNγ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。其可按照GB 2 220211 A中公开的方法生产。在化学上，其是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选地，在本发明组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的颗粒大小使得其可通过0.22μm滤器除菌过滤。此制备描述于WO94/21292和实施例II。 

3D-MPL可以例如每个组合物剂量1-100μg(重量/体积)的量使用，优选以每个组合物剂量10-50μg(重量/体积)的量使用。合适量的3D-MPL例如为每个组合物剂量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50μg(重量/体积)中的任一个。更优选地，3D-MPL的量在每个组合物剂量25-75μg(重量/体积)的范围内。通常，组合物剂量将在约0.5ml至约1ml的范围内。典型的疫苗剂量为0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1ml。在一个优选实施方案中，每ml疫苗组合物包含50μg3D-MPL的终浓度，或每0.5ml疫苗剂量25μg 3D-MPL的终浓度。在其它优选实施方案中，每ml疫苗组合物包含35.7μg或71.4μg3D-MPL的终浓 度。具体地说，0.5ml疫苗剂量体积每剂含25μg或50μg 3D-MPL。 

MPL的剂量适宜地能够在人中增强针对抗原的免疫应答。具体地说，相比于无佐剂组合物，或相比于用另一种MPL量作佐剂的组合物，适宜的MPL量改善所述组合物的免疫效力，同时反应原性模式可接受。 

合成的脂质A衍生物是已知的，其中一些被描述为TLR-4激动剂，其包括但不限于： 

OM174  (2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026) 

OM 294 DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462) 

OM 197  MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO 01/46127) 

其它合适的TLR-4配体例如为脂多糖及其衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和呼吸道合胞体病毒的F蛋白。 

用于本发明的另一种合适的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美奎拉雅属皂树(Quilaja Saponaria Molina)的皂苷制备物，首先由Dalsgaard等在1974年描述(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamte Virusforschung，44卷，Springer Verlag，Berlin，243-254页)具有佐剂活性。已通过HPLC分离了Quil A的纯化片段，其保留了佐剂活性，没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS-21是一种来源于奎拉雅属皂树(Quilaja Saponaria Molina)树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答，在本发明范围内是优选的皂苷。 

业已描述了QS21的具体制剂，它们是特别优选的，这些制剂还包含甾醇(WO96/33739)。构成本发明一部分的皂苷可为水包油乳液形式(WO 95/17210)。 

再接种和用于再接种的组合物(加强组合物) 

本发明的一个方面提供流感抗原在流感免疫原性组合物生产中的用途，所述流感免疫原性组合物用于再接种先前用以水包油乳液佐剂配制的流感病毒或其抗原性制备物或其变体接种的人，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇如α-生育粉和乳化剂。 

通常，再接种于首次接种后至少6个月进行，优选8-14个月后进行，更优选约10-12个月后进行。 

用于再接种的免疫原性组合物(加强组合物)可包含任何类型的抗原制备物，其或者是失活的，或者是减毒活性的。其可包含相同类型的抗原制备物，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制备物、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒，作为首次接种用的免疫原性组合物。或者，加强组合物可包含首次接种所使用流感抗原类型之外的另一种类型的流感病毒抗原，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制备物、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒。加强组合物可有佐剂或无佐剂。无佐剂的加强组合物可为肌内给予的Fluarix^TM/α-Rix

/Influsplit

。所述制剂包含3种由WHO推荐的适宜流感季毒株制备的失活裂解病毒体抗原。 

因此，在一个优选实施方案中，本发明提供(a)流感病毒或其抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇和乳化剂。所述水包油乳液佐剂优选包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。适宜地，所述甾醇为α-生育酚。 

在一个具体实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物(下文也称为‘加强组合物’)包含流感病毒或其抗原性制备物，它们与用于首次接种的流感病毒或其抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。共同的CD4 T-细胞表位意指可由相同的CD4细胞识别的不同抗原的肽/序列/表位(参见例如以下描述的表位：Gelder C等，1998，IntImmunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 J Virol.70(7)：4787-90；Gelder CM等，1995 J Virol.1995 69(12)：7497-506)。 

在一个优选实施方案中，流感株可与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的潜力。具体地说，当疫苗是多价疫苗如二价疫苗或三价疫苗时，至少一种毒株与大流行爆发相关，或者具有与大流行爆发相关的潜力。合适的毒株为但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。 

在本发明的另一个方面，提供(c)第一流感株的流感病毒或其抗原性制备物和(d)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇和乳化剂，所述免疫原性组合物用于抗由流感株引起的流感感染的保护作用，所述流感株为所述第一流感株的变体。所述水包油乳液佐剂优选包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％-20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有低于1μm的直径。适宜地，所述甾醇为α-生育酚。 

通常，加强组合物在使用时于下一个流感季给予，例如在第一免疫原性组合物之后约1年给予。加强组合物还可随后每年给予(第三次、第四次、第五次接种等)。加强组合物可与用于首次接种的组合物相同。适宜地，加强组合物包含流感病毒或其抗原性制备物，其为用于首次接种的流感病毒的变体株。具体地说，流感病毒株或其抗原性制备物按照世界卫生组织发布的参考材料选择，使得它们适合于在再接种年循环的流感株。 

用于再接种的流感抗原或抗原性组合物优选包含适宜地如上所述的佐剂或水包油乳液。所述佐剂可为如上文所述的水包油乳液佐 剂，其是优选的，可选地包含额外的佐剂，例如TLR-4配体，如3D-MPL或皂苷，或者可为另一种合适的佐剂，例如铝或铝替代物，例如聚磷腈。 

优选地，相比于用无佐剂流感病毒或其抗原性制备物第一次接种后诱导的对等应答，再接种诱导以下的任何、优选两个或全部：(i)抗流感病毒或其抗原性制备物的改善的CD4应答，或(ii)改善的B细胞记忆应答或(iii)改善的体液应答。优选地，用本文定义的有佐剂流感病毒或其抗原性制备物再接种后诱导的免疫应答高于用无佐剂组合物再接种后诱导的对应应答。优选地，在用有佐剂流感病毒组合物、优选裂解流感病毒组合物首次接种的人群中，用无佐剂流感病毒、优选裂解的流感病毒再接种后诱导的免疫应答高于在用无佐剂流感病毒组合物、优选裂解流感病毒组合物首次接种的人群中的对应应答。 

本申请人已表明，用含流感病毒和如本文定义的水包油乳液佐剂的加强组合物再接种受试者，显示出的抗体滴度高于用无佐剂组合物首次接种并用无佐剂组合物加强的人群中的对应值，其中所述水包油乳液佐剂包含可代谢油、甾醇如α生育酚和乳化剂。佐剂增强针对再接种的抗体应答的效力在已知对流感病毒接种或感染具有低应答的老年人中尤其重要。就改善再接种后的CD4 T-细胞应答而言，有佐剂组合物相关的利益也是显著的。 

相比于对照疫苗赋予的保护作用，本发明的有佐剂组合物能够诱导抗漂移株(下一流感季的流感株)的更好交叉响应性。所述交叉响应性表现出的持久性比用无佐剂制剂获得的持久性高。 

在实施例3中给出的临床前数据例如显示了本发明组合物抗异型流感感染和根据体温读数确定的疾病的保护能力。在再接种研究中获得的临床实验数据适用相同的结论。 

流感病毒株及其抗原 

所述流感病毒或其抗原性制备物适宜地为单价的或多价的，例如二价或三价或四价。优选地，流感病毒或其抗原性制备物是三价的或四价的，具有来自3种不同流感毒株的抗原。 

或者，至少一种毒株与大流行爆发相关，或者具有与大流行爆发相关的潜力。 

作为背景，在大流行之间的时间段内，与之前大流行的流感病毒相关的流感病毒传播。病毒以和生命早期感染不同的免疫性水平在人之间传播。在通常2-3年的时间段内，这种传播促进对已改变得足以在一般群体中再引起流行病的新毒株的选择；此过程称为‘抗原漂移’。‘漂移变体’在任一年中在不同的社区、地区、国家或洲都具有不同影响，尽管在几年内其总体影响经常是相似的。换句话说，当出现人群对其没有免疫性的新流感病毒时，发生流感大流行。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率增加，证据是住院率或死亡率增加。老年人或患有基础性慢性疾病的人最有可能体验此并发症，而幼儿也可能患严重疾病。 

在不可预见的间隔内出现新流感病毒，其具有与之前季节流行的毒株完全不同亚型的关键表面抗原血细胞凝集素。此时，产生的抗原可以与先前于人中循环的毒株的对应蛋白有20％至50％的变化。这可导致病毒逃逸‘群体免疫’，并产生大流行。此现象称为‘抗原转换’。一般认为，至少在过去已发生了大流行，当时不同物种的流感病毒如禽或猪流感病毒已穿过种间屏障。如果这些病毒具有人与人之间传播的潜力，它们可在数月至一年内全球扩散，导致大流行。例如，在1957年(亚洲流感大流行)，H2N2亚型病毒取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少从首先分离到该病毒的1918年开始就在人群中循环。H2HA和N2 NA在1957年至1968年之间经历了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出现的H3N2流感病毒亚型替代，此后N2 NA连同H3 HA继续漂移(Nakajima等，1991，Epidemiol.Infect.106，383-395)。 

给予其引起大流行爆发潜力的流感病毒株特征是：与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素，其可伴有或不伴有神经氨酸酶亚型的改变；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如在鸟中发现的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的乃至整个群体以前都没有遇到抗原，在免疫学上对抗原是原初态的。 

一般来说，在大流行环境下，某些群体被流感感染的风险增加。老年人、慢性疾病和小孩尤其易感，但许多年轻人和表面上健康的人也有风险。对于H2流感，1968年后出生的部分群体承受的风险增加。对这些群体重要的是尽快地和以简单的方式有效地被保护。 

承受增加的风险的另一个人群是旅行者。今天，人们比以往任何时候都更常旅行，出现最多新病毒的地区中国和东南亚在近些年已成为受欢迎的旅行目的地。传播模式的这种改变能使新病毒在约数周内而不是数月或数年内到达全球。 

因此，对于这些人群来说，在大流行情况下或潜在大流行的情况下特别需要接种保护来对抗流感。适宜的毒株是但不限于：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。 

或者，所述组合物可包含3价以上，例如两种非大流行毒株加一种大流行毒株。或者，所述组合物可包含3种大流行毒株。 

在再一个实施方案中，本发明涉及一种接种方案，其中首次接种使用含至少一种流感毒株的裂解流感组合物进行，其中所述流感毒株可潜在地引起大流行爆发，再接种用或者为流行株或者为经典株的循环毒株进行。 

HA中的CD4表位 

此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经 氨酸酶(NA)的表位区。已知被病毒用于逃避宿主免疫系统的适应性应答的不同流感株之间CD4和B细胞表位的任何差异都将在流感接种中起重要作用，并确实如此。 

已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4 T-细胞表位(参见例如：Gelder C等，1998，Int Immunol.10(2)：211-22；Gelder CM等，1996 JVirol.70(7)：4787-90；和Gelder CM等，1995 J Viroi.1995 69(12)：7497-506)。 

在一个具体的实施方案中，再接种使用含流感病毒或其抗原性制备物的加强组合物进行，所述流感病毒或其抗原性制备物与用于第一次接种的流感病毒抗原或其抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。因此，本发明涉及含流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂的免疫原性组合物在生产多剂量疫苗的首次接种组分中的用途，所述水包油乳液佐剂含可代谢油、甾醇如α-生育酚和乳化剂，所述多剂量疫苗还包含作为加强剂量的流感病毒或其抗原性制备物，它们与第一次接种时所给予剂量的流感病毒抗原或其病毒抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。 

接种方法 

本发明的组合物可通过任何合适的传递途径给予，例如皮内、粘膜如鼻内、口服、肌内或皮下。其它传递途径在本领域众所周知。 

肌内传递途径对有佐剂流感组合物是优选的。 

皮内传递是另一个适宜的途径。任何合适的装置都可用于皮内传递，例如在US 4,886,499、US 5,190,521、US 5,328,483、US5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662中描述的短针装置。皮内疫苗还可通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的装置给予，例如描述于WO99/34850和EP1092444的装置及其功能等同物，这两个文献通过引用结合到本文中。快速注射装置也是适宜的，其经液体快速注射器或经刺穿角质层并产生到达真皮 的射流的针传递液体疫苗至真皮。快速注射装置描述于例如US5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。喷射粉末/颗粒传递装置也是适宜的，其使用压缩气体加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规注射器可用于皮内给予的经典结核菌素皮内试验法。 

另一个合适的给予途径是皮下途径。任何合适的装置都可用于皮下传递，例如经典的针。优选地，使用例如在WO 01/05453、WO01/05452、WO 01/05451、WO 01/32243、WO 01/41840、WO 01/41839、WO 01/47585、WO 01/56637、WO 01/58512、WO 01/64269、WO01/78810、WO 01/91835、WO 01/97884、WO 02/09796、WO 02/34317中公开的无针快速注射器服务。更优选地，所述装置用液体疫苗制剂预填充。 

或者，疫苗鼻内给予。典型地，疫苗局部给予于鼻咽部，优选没有吸入到肺中。理想的是使用将疫苗制剂传递入鼻咽部而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内传递装置。 

本发明疫苗的优选鼻内给予装置是喷雾装置。适宜的商用鼻喷雾装置包括Accuspray^TM(Becton Dickinson)。雾化器产生非常细小的雾滴，其可被轻易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。 

用于鼻内用途的优选喷雾装置为性能与使用者提供的压力无关的装置。这些装置称为压力域装置。只有在提供临界压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压力域装置在本领域是已知的，描述于例如WO 91/13281和EP 311 863 B和EP 516 636，这些文献通过引用结合到本文中。这种 装置可由Pfeiffer GmbH购买，还描述于Bommer，R.PharmaceuticalTechnology Europe，1999年9月。 

优选的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体检测)范围为1-200μm，优选10-120μm。小于10μm存在吸入风险，因此理想的是10μm以下的液滴不超过约5％。120μm以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120μm以上的液滴不超过约5％。 

双剂量传递是用于本发明疫苗的鼻内传递系统的更优选特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔给予一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于一个容器中，装置的构造允许每次有效传递单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置给予本发明疫苗。 

或者，本发明还设想了表皮或透皮接种途径。 

在本发明的一个具体实施方案中，首次给予的有佐剂免疫原性组合物可肌内给予，有佐剂或无佐剂的加强组合物可通过不同途径给予，例如皮内、皮下或鼻内。在另一个具体实施方案中，首次给予的组合物可包含每个流感毒株15μg的标准HA含量，加强组合物可包含低剂量的HA，即低于15μg，并根据给予途径可以较小体积给予。 

接种群体 

接种的目标群体可为免疫受损的人。和健康成人相比，免疫受损的人一般不能很好地对抗原、尤其是流感抗原应答。 

优选地，目标群体是未对流感初免的群体，他们或者是原初态的(例如相对于大流行毒株)，或者先前不能对流感感染或接种应答。优选地，目标群体是老年人，适宜地为65岁和以上；较年轻的高风险成人(即18-64岁)，例如在保健机构工作的人；或者具有高风险因素如心血管病和肺病或糖尿病的年轻成人。另一个目标群体是所有6个月和以上的儿童，尤其是6-23个月龄的儿童，他们经历了相对高的流感相关住院率。优选地，目标群体是65岁以上的老年人。 

接种方案、给药和附加的效力标准 

适宜地，本发明的免疫原性组合物在大部分情况下为标准0.5ml注射剂量，据据单辐射免疫扩散(SRD)(J.M.Wood等：J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等，J.Biol.Stand.9(1981)317-330)检测，含各个流感株的15μg血细胞凝集素抗原组分。适宜地，疫苗剂量体积在0.5ml至1ml之间，具体地说是标准0.5ml或0.7ml疫苗剂量体积。根据原液样品中的HA浓度，可常规地轻微调整剂量体积。 

适宜地，所述免疫原性组合物含低剂量的HA抗原-例如每流感株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14μgHA中的任一个。适宜的低剂量HA在每流感株1-7.5μgHA之间，适宜地在每流感株3.5-5μg HA之间，例如每流感株3.75μg HA，典型地约每流感株5μgHA。 

有利地，本发明的疫苗剂量，尤其是低剂量疫苗，可以以比一般为每剂约0.5、0.7或1ml的常规注射裂解流感疫苗小的体积提供。本发明的小体积剂量优选每剂不到500μl，更优选每剂不到300μl，最优选每剂不超过约200μl或以下。 

因此，按照本发明一个方面的优选小体积疫苗剂量是在小体积中具有低抗原剂量的剂量，例如在约200μl体积中有约15μg或约7.5μgHA或约3.0μg HA(每毒株)。 

本发明的流感药物优选满足疫苗的某些国际标准。 

国际上提出了检测流感疫苗效力的标准。在下表1中显示了有效抗流感疫苗的欧盟官方标准。理论上，为满足欧盟要求，对疫苗中包含的所有流感株来说，流感疫苗仅需满足表中的一项标准。本发明的组合物适宜地满足这些标准中的至少一项。 

然而，在实践中，所有病毒株必须满足所述标准中的至少两项或全部三项，特别是对于新型疫苗(例如经不同途径传递的新型疫苗)而言。在某些情况下，两项标准可能足够了。例如，可以接受所有 病毒株满足三项标准中的两项，而部分但不是全部病毒株满足第三项标准(例如三种病毒株中的两种)。对成年人群体(18-60岁)和老年人群体(大于60岁)的要求是不同的。 

表1 

^*血清阳转率定义为接种后针对每种疫苗株的血清血细胞凝集素抑制(HI)滴度增加达至少4倍的接种者的百分率。 

^**转变因子定义接种后针对每种疫苗株的血清HI几何平均滴度(GMT)的增加倍数。 

^***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于或高于1∶40的接种者的百分率，通常可被看作指示保护作用。 

再一方面，本发明提供一种针对已知要通过CD4+T细胞活化治愈或治疗的疾病设计疫苗的方法，其包括： 

1)选择含CD4+表位的抗原，和 

2)组合所述抗原和上文定义的水包油乳液佐剂，其中所述疫苗在所述哺乳动物中给予时能够在所述哺乳动物中诱导增强的CD4T细胞应答。 

本申请的所有参考文献(包括专利申请和已授予专利)的教导都通过引用完全结合到本文中。 

为避免疑惑，本发明人意图是本文的术语‘包含’在每种情况下都任选地可被术语“由......组成”替代。 

可选实施方案 

在一个可选实施方案中，具体地但非排它性地可在使用裂解流感抗原或其抗原性制备物时使用任何水包油乳液佐剂。因此，在本 发明背景下还设想了以下具体实施方案： 

1.-(a)裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物在人中诱导抗所述抗原或其裂解病毒抗原性制备物的以下至少一种：i)改善的CD4 T-细胞应答，ii)改善的B细胞记忆应答。 

2.-(c)裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和(a)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于接种人免疫受损个体或群体，例如高风险成人或老年人，以对抗流感。 

3.-有佐剂或无佐剂的流感病毒或其抗原性制备物在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人。优选地，再接种在前一季已进行抗流感接种的受试者中进行。典型地，再接种在首次接种后至少6个月进行，优选首次接种后8-14个月进行，更优选在首次接种后10-12个月进行。 

4.-优选地，提供(a)裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人。 

5.-(e)来自第一流感毒株的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和(f)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于抗由流感毒株引起的流感感染的保护作用，所述流感毒株为所述第一流感毒株的变体。 

6.-在另一个具体实施方案中，用于再接种的免疫原性组合物包含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物，它们与用于首次接种的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物共有共同的CD4 T-细胞表位。 

7.-一种用免疫原性组合物接种免疫受损的人类个体或群体(例如高风险成人或老年人)的方法，所述免疫原性组合物包含裂解流感 病毒或其裂解病毒抗原性制备物和如上文定义的水包油乳液佐剂。 

8.-一种再接种先前用裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人的方法，包括给予所述人有佐剂或无佐剂的含流感病毒的免疫原性组合物。 

9.-一种对人类群体或个体进行抗一种流感病毒株的接种、接着对所述人或群体进行抗变体流感病毒株的再接种的方法，所述方法包括给予所述人(i)含第一流感病毒株的裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制备物和水包油乳液佐剂的第一组合物，和(ii)第二免疫原性组合物，其包含所述第一流感病毒株的流感病毒株变体。 

10.-一种设计流感疫苗的方法，包括 

1)选择含CD4+表位的流感抗原，和 

2)组合所述流感抗原和如上定义的水包油乳液，其中所述疫苗在哺乳动物中给予时能够在所述哺乳动物中诱导增强的CD4应答。 

在一个具体实施方案中，与无佐剂抗原或抗原性组合物获得的应答相比，免疫原性组合物还能够诱导改善的CD4 T-细胞应答和改善的B-记忆细胞应答这二者。 

在所有这些实施方案中，所述水包油乳液佐剂适宜地包含至少一种可代谢油，其量为总体积的0.5％至20％，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有小于1μm的直径。 

本发明将参考以下的非限制性实施例进一步描述： 

实施例I描述了在小鼠、雪貂和人研究中使用的免疫解读方法。 

实施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐剂制剂的制备和表征。 

实施例III描述了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗进行的临床实验。 

实施例IV描述了第二个临床实验-再接种实验-在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗进行。 

实施例V显示了有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前 评价(研究I和研究II)。检测温度监测、病毒脱落和CD4 T-细胞应答。 

实施例VI显示了有佐剂和无佐剂的流感疫苗在C57BI/6原初小鼠和初免小鼠中的临床前评价。 

实施例VII显示了有佐剂和无佐剂的裂解和亚单位流感疫苗在用异源毒株初免的C57BI/6小鼠中的临床前评价。 

实施例VIII描述了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验，所述制备物含AS03佐剂、AS03+MPL佐剂或没有外源佐剂。 

实施例IX显示了有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价(研究III)。检测温度监测、病毒脱落和HI滴度。 

实施例X显示了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验：在90天和180天时的免疫原性持久性数据，所述制备物含AS03，有或没有MPL佐剂。 

实施例XI显示了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验，所述制备物含AS03和MPL佐剂。 

实施例XII显示了在65岁以上老年人群中用含裂解流感抗原制备物的疫苗进行的临床实验，所述制备物含AS03和两个浓度的MPL佐剂。 

实施例I-免疫解读方法 

I.1.小鼠法 

I.1.1.血凝反应抑制测试 

测试程序 

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体抑制通过流感病毒血细胞凝集素(HA)的小鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。热失活血清预先用高岭土和小鸡RBC处理，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温 育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶20，所以不可检测水平记录为等于10的滴度。 

统计学分析 

使用UNISTAT对接种后的HI滴度进行统计学分析。用于分析方差的方法可如下简述： 

■数据的对数转换 

■对各个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性 

■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性 

■对各组进行的双因素方差分析 

■用于多重比较的Tukey HSD检验 

I.1.2胞内细胞因子染色

该技术允许根据细胞因子产量定量抗原特异性T淋巴细胞：效应子T细胞和/或生产IFN-γ的效应子-记忆T细胞和/或生产IL-2的中枢记忆性T细胞。在免疫后7天收集PBMC。 

在分泌性抑制剂(Brefelldine)存在下体外再刺激淋巴样细胞。 

然后使用荧光抗体(CD4、CD8、IFN-γ和IL-2)通过常规免疫荧光法处理这些细胞。结果表示为CD4/CD8 T细胞中细胞因子阳性细胞的频率。在第二次免疫后7天对PBMC进行T细胞的胞内细胞因子染色。由小鼠收集血液，并合并在肝素化培养基RPMI+添加物中。对于血液，RPMI+添加物稀释的PBL悬浮液按照推荐的方法(于室温以2500rpm离心20分钟)在Lympholyte-Mammal梯度上分层。去除分界面处的单核细胞，用RPMI+添加物清洗2次，用RPMI 5％胎牛血清将PBMC悬浮液调整至2×10⁶个细胞/ml。 

用Whole FI(1μg HA/毒株)以1×10⁷个细胞/ml(管式FACS)的终 浓度对PBMC进行体外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(均为1μg/ml)的情况下于37℃温育2小时。 

在抗原再刺激步骤后，在Brefeldin(1μg/ml)存在下于37℃过夜温育PBMC，以抑制细胞因子分泌。IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色如下进行：清洗细胞悬浮液，重悬浮在含2％Fc封闭试剂(1/50；2.4G2)的50μl PBS 1％FCS中。于4℃温育10分钟后，加入抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8 perCp(3/50)的50μl混合物，于4℃温育30分钟。在PBS 1％FCS中清洗后，通过重悬浮在200μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)中并于4℃温育20分钟使细胞透化。然后用Perm Wash(Kit BD)清洗细胞，并用以Perm Wash稀释的抗-IFN-γ APC(1/50)+抗-IL-2 FITC(1/50)的50μl混合物重悬浮。于4℃温育最少2小时最长过夜后，用PermWash清洗细胞并重悬浮在PBS 1％FCS+1％多聚甲醛中。通过FACS进行样品分析。门控(FSC/SSC)活细胞，对CD4+T细胞上的约20,000事件(淋巴细胞)或35,000个事件进行探测。针对CD4+和CD8+门控的群计算IFN-γ+或IL2+的百分率。 

I.2.雪貂法 

I.2.1.血凝反应抑制测试(HI)

测试程序 

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体抑制通过流感病毒血细胞凝集素(HA)的小鸡红细胞(RBC)血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热失活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。 

统计学分析 

使用UNISTAT对HI滴度(41天，攻击前)进行统计学分析。用于分析方差的方法可如下简述： 

■数据的对数转换 

■对各个群体(组)进行的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性 

■Cochran检验，以便确定不同群体(组)之间的方差均一性 

■对单因素ANOVA的交互作用的检验 

■用于多重比较的Tukey HSD检验 

I.2.2.体温监测

在攻击期间用传感器并通过遥测法记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI(Data Sciences International，Centaurusweg 123，5015 TC Tilburg，The Netherlands)进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。 

在攻击前4天直至攻击后7天每15分钟记录温度。 

I.2.3.鼻清洗

通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于干冰上的样品容器中。 

鼻清洗液的病毒滴定 

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染物。将50μl连续10倍稀释度的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育5-7天。 

在5-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20 WST-1的培养基，再温育18小时。 

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲

染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3 OD(0.3 OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD<截取值时定义为阳性得分，相反，OD>截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID50/ml。 

I.3.评价人中免疫应答的测定 

I.3.1.血凝反应抑制测定

使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta，USA(1991)描述的方法通过检测HI抗体测定免疫应答。 

使用4个血凝反应抑制单位(4 HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬浮液，用标准的和综合验证过的微量法对融化的冷冻血清样品进行抗体滴度检测。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。 

评价所获血清的HI抗体水平。以1∶10起始稀释度开始制备连续稀释度(乘以因数2)，直至最终稀释度1∶20480。把显示完全抑制(100％)血凝反应的最高稀释度步骤视为滴定终点。所有实验都以双份进行。 

I.3.2.神经氨酸酶抑制测定

在包被胎球蛋白的微量滴定板中进行测定。制备2倍连续稀释度的抗血清，与标准化量的甲型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。测试基于由胎球蛋白酶解释放神经氨酸的神经氨酸酶生物活性。在切下末端神经氨酸后，β-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出来。向各孔加入来自落花生的辣根过氧化物酶(HRP)标记的花生凝集素，其特异性结合半乳糖结构。可在底物反应中用四甲基联苯胺 (TMB)检测和定量结合凝集素的量。表明仍抑制病毒神经氨酸酶活性达至少50％的最高抗体稀释度为NI滴度。 

I.3.3.中和抗体测定

对融化的冷冻血清样品进行中和抗体检测。包含在血清中的抗体的病毒中和以微量中和实验来测定。血清在实验中无需进一步处理即可使用。各个血清以三重测定进行测试。将标准化量的病毒与连续稀释的血清混合并温育，以使抗体结合病毒。然后将含限定量的MDCK细胞的细胞悬浮液加入病毒和抗血清的混合物中，于33℃温育。在温育期后，通过小鸡红细胞的凝集反应显现病毒复制。利用Reed and Muench的方法计算血清的50％中和滴度。 

I.3.4.通过细胞因子流式细胞仪(CFC)评价细胞介导的免疫性

外周血抗原特异性CD4和CD8 T细胞可在体外被再刺激，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFN，如果与其对应抗原温育。因此，抗原特异性CD4和CD8 T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞仪计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或CD8 T细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8T细胞的频率。 

I.3.5.统计方法

I.3.5.1.主要终点 

·在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中诉求的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同接种的关联。 

·在接种后的21天随访期(即接种日和随后20天)以及整个过程中主动诉求的局部和全身征兆和症状的百分率、强度以及同与接种的关联。 

·整个研究过程中严重不良事件的发生。 

I.3.5.2.次要终点 

对于体液免疫应答： 

观测变量： 

·在0天和21天：血清血凝反应抑制(HI)和NI抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。 

·在0天和21天：中和抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试。 

衍生变量(具有95％置信区间)： 

·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMT) 

·21天时具有95％CI的血清阳转率^*

·21天时具有95％CI的转变因子^**

·21天时具有95％CI的血清保护率^***

·在所有时间点的血清NI抗体GMT(具有95％置信区间) 

^*血清阳转率定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI滴度时增加达至少4倍的接种者百分率。 

^**转变因子定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。 

^***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度等于40的接种者百分率，通常将该百分率看作指示保护作用。 

对于细胞介导的免疫(CMI)应答 

观测变量 

在第0天和21天：不同测试中每10⁶当中细胞因子阳性的CD4/CD8细胞的频率。每个测试都定量CD4/CD8 T细胞针对以下物质的应答： 

·肽流感(pf)抗原(这些抗原的精确性质和来源不需要给出/解释) 

·裂解流感(sf)抗原 

·全流感(wf)抗原 

衍生变量： 

·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞 

·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞 

·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞 

·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞 

·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞 

I.3.5.3.免疫原性分析 

免疫原性分析基于整个接种人群。对于每个治疗组，计算以下参数(具有95％置信区间)： 

·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT) 

·在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT) 

·21天时的转变因子 

·21天时的血清阳转率(SC)，定义为相比于第0天在第21天时血清HI滴度增加达至少4倍的接种者百分率。 

·21天时的保护率定义为血清HI滴度＝1∶40的接种者百分率。 

·在各个时间点(第0天、第21天)针对每个接种组和针对每种抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和全流感(wf)抗原)总结CD4/CD8T-淋巴细胞分泌应答的频率(描述统计)。 

·在各5种不同测试中对于每个接种组和每种抗原(pf、sf和wf)，在时间点(接种后-接种前)之间个体应答差异的描述性统计。 

·使用无参数检验(Kruskall-Wallis检验)比较3组之间的局部差异，在各5种不同测试中计算每种抗原的统计学p-值。所有统计学检验都是双尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是统计学显著的。实施例II-水包油乳液和佐剂制剂的制备和表征 

除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的油/水乳液包含2种油(α-生育酚和鲨烯)组成的有机相和含Tween 80作为乳化剂的PBS水相。除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的水包油乳液佐剂制剂都制成含以下的水包油乳液组分(给出终浓度)：2.5％鲨烯(体积/体积)、2.5％α-生育酚(体积/体积)、0.9％聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(体积/体积)(Tween 80)，参见WO 95/17210。该乳液在随后的实施例中称为AS03，如下制备为2倍浓缩物。 

II.1.乳液SB62的制备 

II.1.1.实验室规模的制备

将Tween 80溶解在磷酸缓冲盐水(PBS)中，获得2％的PBS溶液。为提供100ml的2倍浓缩乳液，涡旋5g DLα生育酚和5ml鲨烯，以彻底混合。加入90ml PBS/Tween溶液，彻底混合。然后将获得的乳液通过注射器，最后使用M110S微流控设备微射流。获得的油滴具有约120-180nm的大小(表示为通过PCS检测的Z均值)。将其它佐剂/抗原组分加入为单一混合物的乳液中。 

II.1.2.放大规模的制备

通过在强搅拌下混合由疏水组分(α-生育酚和鲨烯)组成的油相和含水溶性组分(Tween 80和PBS mod(改良型)，pH 6.8)的水相，制备SB62乳液制备物。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转移至水相(9/10总体积)，于室温搅拌混合物15分钟。然后在微流控器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000 PSI， 8个循环)，以产生亚微米油滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。然后使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将除菌的乳化原液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或氩气)通入SB62乳化半成品容器的死体积，持续至少15秒。 

SB62乳液的最终组成如下： 

Tween 80：1.8％(体积/体积)19.4mg/ml；鲨烯：5％(体积/体积)42.8mg/ml；α-生育酚：5％(体积/体积)47.5mg/ml；PBS-mod：NaCl 121mM，KCl 2.38mM，Na2HPO4 7.14mM，KH2PO4 1.3mM；pH 6.8±0.1。 

II.2.油滴粒度的动态光散射检测 

II.2.1.简介

油滴直径的大小按照以下方法并在以下实验条件下测定。油滴粒度检测以强度检测提供，并表示为通过PCS检测的z均值。 

II.2.2.样品制备

对水包油乳液佐剂进行粒度检测，所述水包油乳液佐剂为：按照放大规模方法制备的SB62、AS03和AS03+MPL(50μg/ml)，后两种临用前制备。样品的组成在下文给出(参见章节II.2.4)。样品用PBS7.4稀释4000倍至8000倍。 

作为对照，用10mM NaCl稀释PL-Nanocal粒度标准品100nm(目录号6011-1015)。 

II.2.3.Malvern Zetasizer 3000HS粒度检测

所有的粒度检测都用两台Malvern Zetasizer 3000HS检测。样品以合适的稀释度(通常为4000倍至20000倍的稀释度，取决于样品浓度)在用于Malvern分析的塑料比色皿中检测，并采用两种光学模式： 

-或者真实的粒子折射率0和假想折射率0。 

-或者真实的粒子折射率1.5和假想折射率0.01(按照在文献中可 见的值，对乳液采用适合的光学模式)。 

技术条件是： 

-激光波长：532nm(Zeta3000HS)。 

-激光功率：50mW(Zeta3000HS)。 

-于90°检测的散射光(Zeta3000HS)。 

-温度：25℃， 

-持续时间：由软件自动确定， 

-次数：3次连续检测， 

-z均值直径：通过累积量分析 

-粒度分布：通过Contin或自动化方法。 

自动化Malvern算法使用累积量、Contin和非负最小二乘(NNLS)算法的组合。 

由于Mie理论，强度分布可转变为体积分布。 

II.2.4.结果(参见表2)

累积量分析(Z均值直径)： 

表2 

(^*)如下制备：注射用水、PBS 10x浓缩液、250μl SB62乳液和25μg MPL混合在一起，以达到280μl终体积。 

Z均值直径(ZAD)大小以样品中各种粒度的散射光量来度量。该值与样品的单形态分析相关，主要用于重现目的。 

计数率(CR)是散射光的检测结果：其对应于每秒成千上万的光子。 

多分散性(Poly)指数是分布的宽度。其是分布广泛性的无量纲检测结果。 

Contin和自动化分析： 

已按照以上阐述并带有微小改变的方法制备和评价两种另外的SB62制备物(2倍浓缩的AS03)： 

在为获得用于Zetasizer 3000HS的最佳计数率值而确定的两个稀释度：10000x和20000x，在用于Malvern分析的塑料比色皿中检测样品。 

结果示于表3。 

表3 

“-”此时获得的值不一致。 

这些结果的示意图示于图1的制剂1023。由其可见，大部分粒子(例如至少80％)以强度计具有小于300nm的直径。 

II.2.5.整体结论

用Malvern Zetasizer 3000HS和两种光学模式检测不同稀释度的SB62制剂。以上评价的制剂的粒度ZAD(即通过累积量分析获得的强度平均值)约为150-155nm。 

当使用累积量算法时，我们观察到稀释度对ZAD和多分散性没有影响。 

II.3.含MPL的AS03的制备 

II.3.1.MPL液体悬浮液的制备

MPL(在整个文件中使用，其是3D-MPL即3-O-脱酰单磷酰脂质A的缩写)原液由MPL冻干粉制备。MPL原液是稳定的原料浓(约1mg/ml)水分散体，其随时可用于疫苗或佐剂配制。制备过程的示意图在图2中给出。 

对于最大批量12g，MPL原液制品储存在无菌玻璃容器中。MPL的分散由以下步骤组成： 

-将MPL粉末悬浮在注射用水中 

-通过加热解聚任何大的聚集物(热处理) 

-通过微射流将粒度缩小至100nm至200nm 

-用Sartoclean预过滤装置0.8/0.65μm预过滤制品 

-于室温除菌过滤制品(Sartobran P装置，0.22μm) 

MPL粉末通过微射流冻干，产生稳定的胶体水性分散体(MPL粒度小于200nm)。MPL冻干粉末分散在注射用水中，以便获得粗制的10mg/ml悬浮液。然后在搅拌下对悬浮液进行热处理。冷却至室温后，开始微射流处理，以便降低粒度。使用微流控装置M110EH，以限定压力通过微射流相互作用腔连续循环分散液达最小通过量(循环次数：n_min)进行微射流。代表循环次数的微射流持续时间基于检测的流速和分散体积计算。对于给定压力下的给定设备，获得的流速可在一个至另一个相互作用腔之间以及特定相互作用腔的整个活动周期中有所变化。在本实施例中，使用的相互作用腔是F20Y型微流 控器。由于微射流效力与压力-流速对相关，所以处理时间可在一批至另一批之间变化。1次循环需要的时间基于流速计算。所认定的流速是就在将MPL导入装置前用注射用水检测的流速。1次循环被定义为MPL总体积通过装置1次所需要的时间(以分钟表示)。如下计算获得n次循环需要的时间： 

n×要处理的MPL的量(ml)/流速(ml/分钟)

由此相应地修改循环次数。描述了对所用的优选设备和相互作用腔要实施的最小循环量(n_min)。根据n_min循环后进行的粒度检测结果确定要实施的总循环量。基于历史数据确定粒度限制(d_lim)。检测通过光子相关光谱法(PCS)技术实现，d_lim表示为单模式结果(Z_均值)。在该限制之下，可在n_min循环后终止微射流。在该限制之上，继续微射流，直至获得满意的粒度减小，最多再进行50个循环。 

如果在微射流后不立即开始过滤，则分散的MPL储存在+2至+8℃，等待转移至过滤区域。 

在微射流后，用注射用水稀释分散液，通过0.22μm滤器在层流下除菌过滤。最后的MPL浓度是1mg/ml(0.80-1.20mg/ml)。 

II.3.2.AS03+MPL佐剂化疫苗的制备：单瓶法

向AS03佐剂制剂中加入MPL，终浓度在每剂疫苗10-50μg之间。 

将PBS10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween、TritonX-100和VES(维生素E琥珀酸酯)的SB62混合物加入注射用水中。考察流感株中存在的去污剂的量，以便达到目标终浓度：750μg/mlTween 80、110μg/ml Triton X-100和100μg/ml VES。在5分钟搅拌后，加入15μg的每种目标流感株(例如在经典3价疫苗中的毒株H1N1、H3N2和B)。在15分钟搅拌后，加入250μl SB62乳液，然后加入25μg或50μgMPL。 

制备过程的示意图在图3中给出。表4给出了每个人体剂量中 含MPL的AS03的最终组成。 

表4 

^*PBS mod 10x浓缩液pH 6.8＝KH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、KCl-HCl 

^**MPL是每剂25μg或50μg 

II.3.3.AS03+MPL佐剂化疫苗的制备：双瓶法

可通过混合2倍浓缩的抗原或抗原制备物和AS03(SB62 250μl)或AS03+MPL(SB62 250μl+25μg或50μg MPL)佐剂，由双瓶法制备相同制剂。在此情况下，其如下进行。AS25-佐剂化流感疫苗的生产由3个主要步骤组成： 

1)配制无佐剂的三价半成品(2x浓缩)并分装入抗原容器中 

2)制备AS03+MPL佐剂 

3)AS03+MPL佐剂化裂解病毒疫苗即时重配。 

1)配制无佐剂的三价半成品(2x浓缩)并分装入抗原容器中 

3种单价原液的体积基于配制前各个单价原液中检测的HA含量，并基于1100ml的目标体积。浓缩的磷酸缓冲盐水以及Tween 80、Triton X-100和α-生育酚氢琥珀酸酯的预混合物稀释在注射用水中。然后将3种浓缩的单价原液(A/新喀里多尼亚、A/纽约、B/江苏)连续 稀释入获得的磷酸缓冲盐水/Tween 80-Triton X-100-α-生育酚氢琥珀酸酯溶液(pH 7.4，1 37mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.47mM KH₂PO₄，990μg/ml Tween 80，150μg/ml Triton X-100和130μg/mlα-生育酚氢琥珀酸酯)中，以便具有39.47μg A毒株(H1N1、H3N2)的HA/ml三价半成品(15μg HA/A毒株/380μl三价半成品)和46μg B毒株的HA(17.5μg HA/B毒株/380μl三价半成品)的终浓度。在加入每种单价原液之间，于室温搅拌混合物达10-30分钟。在加入最后一种单价原液后，搅拌15-30分钟，检查pH，并用HCl或NaOH将pH调节至7.2±0.2。 

抗原的三价半成品无菌分装入3-ml无菌I型(欧洲药典)玻璃瓶中。每瓶含470μl体积(380μl+90μl过充)。 

2)制备AS03/MPL佐剂原液并分装入佐剂容器中。 

通过混合两种组分制备佐剂AS03/MPL：SB62乳液(章节II.1.2中的方法)和MPL(章节II.3.1中的方法)。1倍浓缩的PBS mod(通过将10x浓缩的PBS mod稀释在注射用水中制备)和SB62原液和1mg/ml的MPL原液。测定MPL浓度，以便达到10-50μg的最终含量，适宜地为每个最终人用疫苗剂量约25μg。混合物于室温搅拌5-30分钟，用NaOH(0.05或0.5 M)/HCl(0.03 M或0.3 M)将pH调节至6.8±0.1。于室温再搅拌5-30分钟后，将混合物通过0.22μm膜过滤除菌。实施无菌惰性气体(氮气)通入，以在最少1分钟的过程中在分装容器中产生惰性顶空气体。无菌AS03+MPL佐剂储存在+2-8℃，直至无菌分装入1.25-ml无菌I型(欧洲药典)玻璃注射器中。每个注射器含80μl超量体积(320μl+80μl过充)。 

在注射时，将含佐剂的预填充注射器的内容物注入含浓缩的三价失活裂解病毒体抗原的小瓶中。在混合后，将内容物吸入到注射器中，针用肌内针替换。1剂重配的AS25佐剂化流感候选疫苗相当于0.7mL。 

II.4.在水包油乳液制剂中含流感抗原和任选MPL的免疫原性组合物的制备 

向II.1的SB62乳液中加入等体积的2倍浓缩的裂解流感抗原(Fluarix^TM)(15μg每种毒株的HA)并混合。适宜时将其与50μg/ml MPL混合，获得最终制剂。 

实施例III-在65岁以上的老年人中用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗进行的临床实验(Explo-Flu-001) 

在2003年于65岁以上的老年人群中进行I期开放随机研究，以便评价含佐剂AS03的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性。在肌内给予1剂AS03佐剂化疫苗或WV疫苗后21天检测体液免疫应答(即抗血细胞凝集素抗体滴度、中和抗体滴度和抗神经氨酸酶抗体滴度)和细胞介导的免疫应答(CD4和/或CD8 T细胞应答)。Fluarix^TM用作参比。 

III.1.研究设计 

3组受试者平行地肌内接受以下疫苗： 

■1组50名受试者接受1剂重配和有佐剂的SV流感疫苗(FluAS03) 

■1组50名受试者接受1剂全病毒流感疫苗(FIuWVV) 

■1组50名受试者接受1剂Fluarix^TM(Fluarix)＝对照接种程序：在第0天注射1次流感疫苗，收集血样，在21天进行解读分析(HI抗体测定、NI抗体测定、中和抗体测定和CMI分析)和得出研究结论。 

在该研究中使用的标准3价裂解流感疫苗-Fluarix^TM是一种在2003年由GlaxoSmithKline Biologicals开发并生产的商品化疫苗。 

III.2.疫苗组成和给予(表5) 

III.2.1.疫苗制备

AS03佐剂化流感疫苗 

AS03佐剂化的流感疫苗候选物是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶(335μl)(抗原容器)中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含SB62乳液的预填充I型玻璃注射器(335μl)(佐剂容器)组成。在注射时，抗原容器的内容物借助于SB62乳液预填充注射器被取出，接着轻微混合注射器。SB62乳液与疫苗抗原混合重配AS03佐剂。在注射前，使用的针被肌内针替换，并将体积调整到500μl。 

1剂重配的AS03佐剂化流感疫苗相当于0.5ml，含在已注册的Fluarix^TM/α-Rix疫苗中的每种流感病毒株的15μg HA，并包含10.68mg鲨烯、11.86mg DL-α生育酚和4.85mg聚山梨醇酯80(Tween 80)。 

制备 

AS03佐剂化的流感疫苗的生产由3个主要步骤组成： 

1)配制无佐剂的3价半成品并分装入抗原容器中 

3种单价原液的体积基于配制前各个单价原液中检测的HA含量，并基于800ml的目标体积。浓缩的磷酸缓冲盐水以及Tween 80、Triton X-100和α-生育酚氢琥珀酸酯的预混合物稀释在注射用水中。然后将3种浓缩的单价原液(毒株A/新喀里多尼亚-、毒株A/巴拿马-、毒株B/山东-)连续稀释入获得的磷酸缓冲盐水/Tween 80-Triton X-100-α-生育酚氢琥珀酸酯溶液(pH 7.4，137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.47mM KH₂PO₄，1500μg/ml Tween 80，220μg/mlTriton X-100和200μg/mlα-生育酚氢琥珀酸酯)中，以便具有60μg A毒株的HA/ml三价半成品(15μg HA/A毒株/250μl三价半成品)和70μg B毒株的HA(17.5μg HA/B毒株/250μl三价半成品)的终浓度。在加入每种单价原液之间，于室温搅拌混合物达10分钟。在加入最后一种单价原液后，搅拌15分钟，检查pH，并用HCl或NaOH将pH调节至7.2±0.1。 

将抗原的3价半成品无菌分装入3-ml I型无菌玻璃瓶中。每瓶含34％体积超出量(335μl总体积)。 

2)制备SB62乳液无菌原液并分装入佐剂容器中 

·水相：在搅拌的同时，将902ml Tween 80与44105ml PBS-mod缓冲液混合(用HCl调节后pH＝6.8)。 

·油相：在搅拌的同时，将2550ml鲨烯加入2550mlα-生育酚中。 

·混合水相和油相：在搅拌的同时，将5000ml油相(1/10总体积)转移至45007ml水相(9/10总体积)。混合物于室温搅拌15分钟。 

·乳化：在微流控器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000 PSI，8个循环)，以产生亚微米液滴(分布在100-200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。 

·除菌过滤：使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将无菌乳化原液冷冻储存于2-8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或氩气)通入SB62乳化半成品容器的死体积达至少15秒。 

给出的所有成分的量都用于制备50 L乳液，并以体积给出。实际上，量以成分的密度计量。PBS的密度被视为等于1。 

SB62乳液的最终组成如下： 

表5 

然后将无菌SB62乳化原液无菌分装入1.25-ml无菌I型玻璃注 射器中。每个注射器含34％的体积超出量(335μl总体积)。 

3)AS03佐剂化裂解病毒疫苗的即时重配。 

在注射时，含浓缩3价失活裂解病毒体抗原的瓶的内容物借助于含SB62乳液的注射器被取出，接着轻微混合注射器。SB62乳液与疫苗抗原混合重配AS03佐剂。 

III.2.2.疫苗组成(表6)和给予 

表6 

疫苗肌内给予于非惯用臂的三角肌区。密切观察接种者至少30分钟，对于给予疫苗后罕有的过敏性反应实施容易利用的适宜医学治疗。 

III.3.研究群体结果 

该研究总共招录了148名受试者：49名受试者在FluAS03组，49名受试者在Fluarix组，50名受试者在FIuWVV组。总接种人群的平均年龄在接种时为71.8岁，标准偏差6.0岁。受试者的平均年龄和性别分布在3个疫苗组之间是相似的。 

III.4.安全性结论 

在研究群体(即65岁以上的老年人)中给予用AS03佐剂化的流感疫苗是安全的，在临床上是良好耐受的。 

III.5.免疫原性结果 

对总接种人群的免疫原性进行分析。 

III.5.1.体液免疫应答

为了评价由AS03佐剂化疫苗诱导的体液免疫应答，计算每个治疗组的以下参数(具有95％置信区间)： 

·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT) 

·在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT) 

·21天时的血清阳转率(SC)，定义为相比于第0天在第21天时的血清HI滴度增加达至少4倍的接种者百分率。 

·21天时的转变因子，定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。 

·21天时的保护率定义为血清HI滴度＝1∶40的接种者百分率。 

III.5.1.1抗血细胞凝集素抗体应答 

a)HI几何平均滴度(GMT) 

具有95％CI的HI抗体的GMT示于表7(抗HI抗体的GMT)。 

3个组中针对所有疫苗株的接种前抗体GMT处于相同范围内。在接 种后，抗血细胞凝集素抗体水平显著增加。在接种后有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3种疫苗株的HI抗体的GMT较高，尽管Fluarix组和FIuWVV组之间的95％CI有一些重叠。 

表7 

N＝结果可用的受试者数目； 

95％CI＝95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限； 

MIN/MAX＝最小/最大； 

PRE＝接种前第0天； 

PI(D21)＝接种后第21天 

b)抗HI抗体滴度的转变因子、血清保护率和血清阳转率(与人中的保护作用相关) 

结果示于表8。 

转变因子代表相比于第0天在第21天时针对各个疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。转变因子根据病毒株和疫苗由6.1至13.6变化。此转变因子大大地优于欧洲官方要求的2.0倍GMT增加。 

血清保护率代表在第21天时血清HI滴度≥40的受试者比例。在研究开始时，所有组的一半受试者(范围在34.0％-69.4％之间)对所有毒株都具有保护性抗体水平。在第21天时，3个组中对不同病毒株的血清保护率在88.0％至100％的范围内。就保护作用而言，这意味着超过88％的受试者在接种后具有≥40的血清HI滴度，被认为具有抗3种毒株的保护作用。该比率大大地优于欧洲官方要求的≥60岁老年人群中60％的血清保护率。 

血清阳转率代表相比于第0天在第21天时血清HI滴度具有达至少4倍增加的受试者比例。对3种毒株的整体应答率在3个组中基本上是相等的。为了被认为有效和符合欧盟标准，疫苗应当在＝60岁的老年人群中诱导超过30％的阳转率。在该研究中，3个组的阳转率超过50％。 

表8 

N＝受试者总数 

总结： 

·在接种后有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3种疫苗株的HI抗体的GMT较高，尽管Fluarix组和FIuWVV组之间的95％CI有一些重叠。 

·转变因子根据病毒株和疫苗由6.1至13.6变化。此转变因子大大优于欧洲官方要求的2.0倍GMT增加。 

·在第21天时，3个组中对不同病毒株的血清保护率在88.0％至100％的范围内。该比率大大优于欧洲官方要求的≥60岁老年人群中60％的血清保护率。 

·在该研究中，3个组的血清阳转率超过50％。对3种毒株的整体应答率在3个组中基本上是相等的。 

III.5.1.2中和抗体滴度 

为了更好地表征老年人中针对流感接种的免疫应答，评价针对中和抗原的血清抗体应答。结果示于表9(血清保护率和抗中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT))和表10(在接种后21天抗中和的阳转率(增加倍数＝4))。 

检测免疫前和免疫后血清中抗3种流感株的中和抗体滴度。测定以下参数： 

·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清中和抗体的几何平均滴度(GMT) 

·在21天时具有95％CI的阳转率，定义为相比于第0天在第21天时HI滴度具有达至少4倍增加的接种者百分率。 

表9 

组1：Flu疫苗混合佐剂2x浓缩的Flu疫苗； 

组2：Flu疫苗Flu疫苗； 

组3：Flu疫苗FluWVV疫苗； 

N＝结果可用的受试者数目； 

n/％＝滴度在特定范围内的受试者的数目/百分率； 

95％CI＝95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限； 

PRE＝接种前第0天；PI(D21)＝接种后第21天 

表10 

组1：Flu疫苗(DFLU58A16)混合佐剂(D621024A8)2x浓缩的Flu疫苗； 

组2：Flu疫苗(1885489)Flu疫苗； 

组3：Flu疫苗(DFLU59A2)Flu WVV疫苗； 

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目； 

n＝应答者数目； 

％＝应答者百分率(n/N×100)； 

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限； 

主要的发现是： 

·对于3种疫苗，在21天时，对两种A毒株获得100％的血清保护率。对于B毒株，3组中的血清保护率在92％至100％的范围内。 

·接种后，3个组中针对所有毒株的GMT都有显著增加。然而，有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3个疫苗株的中和抗体的GMT比在FIuWVV中高，尽管Fluarix组和FIuWVV组之间的95％CI有一些重叠。 

·对于血清阳转率，针对3种毒株的总体应答率在3个组中基本上相等。 

在所有组中，结果都与针对抗血细胞凝集素抗体进行分析所获得的结果相一致。 

III.5.1.3神经氨酸酶(NA)抗体滴度 

为了更好地表征在老年人群中对流感接种的免疫应答，评价对神经氨酸酶抗原的血清抗体应答。与HI抗体滴度类似，测定以下终点： 

·GMT(采用对数滴度转化平均值的反对数) 

·血清阳转率，定义为相比于第0天在21天时对每种疫苗株的HI滴度具有达至少4倍增加的接种者百分率。 

在表11(抗NA抗体GMT)和表12(接种后的NA血清阳转率(第21天)(4倍增加))中显示了具有95％CI的NI抗体的GMT和血清阳转率。 

表11 

FluAS03：与AS03佐剂(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16) 

Fluarix：Flu疫苗(18854B9) 

FluWVV：Flu WVV疫苗(DFLU59A2) 

PRE＝接种前，PI(D21)＝接种后第21天 

95％CI、LL和UL＝95％置信区间、下限和上限 

表12 

FluAS03：与AS03佐剂(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16)，Fluarix：Flu疫苗(18854B9)，FluWVV：Flu WVV疫苗(DFLU59A2) 

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目； 

n＝应答者数目； 

％＝应答者比例(n/N×100)； 

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限；UL＝上限 

主要发现是： 

·对血细胞凝集素观察到的GMT和血清阳转率的值高于对神经氨狻酶观察到的值。 

·在3个组中针对所有疫苗株的接种前抗体GMT都在相同范围内。在接种后，抗神经氨酸酶抗体水平显著增加。至于HI抗体滴度，在接种后有一种趋势：在FluAS03和Fluarix组中针对全部3种疫苗株的HI抗体的GMT较高，尽管Fluarix组和FIuWVV组之间的95％CI有一些重叠。 

·关于血清阳转率，在3个组中以及对3种毒株来说，针对3种毒株的总体应答率基本上是相等的。 

我们的结果表明，在该研究中抗流感接种的健康老年人发展出针对神经氨酸酶的良好抗体应答，无论哪种流感疫苗。但是，针对神经氨酸酶抗原的应答低于针对血细胞凝集素抗原的应答。 

III.5.2.细胞免疫应答

可在体外再刺激外周血抗原特异性CD4和CD8 T细胞，以产生IL-2、CD40L、TNF-α和IFNγ，如果与其对应抗原温育。因此，抗原特异性CD4和CD8 T细胞可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生产后通过流式细胞仪计数。在本研究中，流感疫苗抗原以及来源于特定流感蛋白的肽用作抗原来再刺激流感特异性T细胞。在表13-18中提供了CD4和CD8 T细胞应答的结果。 

表13以产生至少两种不同细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4T-细胞应答：对接种前和接种后的CD40L/IL2/TNF-α/IFN-γ的描述性统计(总接种人群) 

[0528] 

组1：FluAS03：Flu疫苗Fluarix^TM，与AS03佐剂混合 

组2：Fluarix：Flu疫苗Fluarix^TM

组3：FIuWVV：Flu WVV疫苗 

SD＝标准偏差；Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数；Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

P-值＝Kruskall-Wallis检验(非参数方法)，测试3组之间于第21天时的局部差异(Wilcoxon秩和检验) 

表14以产生至少两种不同细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述性统计(总接种人群) 

[0539] 表15以产生至少CD40L和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种人群) 

[0542] 表16已产生至少IFNγ和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种人群) 

[0545] 表17以产生至少IL2和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种人群) 

[0548] 表18以产生至少TNFα和另一种细胞因子的细胞表示的抗原特异性CD4 T-细胞应答：对接种前和接种后差异的描述统计(总接种人群) 

[0551] 结果还表示为CD4或CD8 T细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8 T细胞的频率，并示于图4和图5。 

在相似的分析中，使用漂移株(A/H1N1/北京/262/95(H1N1d)、A/H3N2/悉尼/5/97(H3N2d)、B/山梨/166/98(Bd))或转换株(A/新加坡/1/57(H2N2)、A/香港/1073/99(H9N2))的流感抗原评价交叉反应性CD4 T-细胞应答。结果表示为细胞因子阳性的CD4 T细胞的频率，示于图6。 

主要发现是： 

·用Fluarix和全病毒接种稍微加强CD4 T-细胞应答。用Flu AS03接种诱导强CD4 T-细胞应答(图4)，其在统计学上是显著的。在用裂解抗原或全病毒在体外刺激后得出相同的结论，对研究的所有细胞因子(IL-2、IFNγ、TNFα和CD40L)也是如此。 

·大部分个体具有抗全流感病毒的CD8 T-细胞应答，但是接种对CD-8 T细胞应答没有可检测的影响(即接种前＝接种后)，无论哪一个研究组(图5)。 

用Fluarix接种仅诱导低水平的交叉反应性CD4 T-细胞应答(图6)。用FluAS03接种诱导抗漂移流感株的强CD4 T-细胞应答，其在统计学上是显著的(图6)。基本没有检测到抗转换株的应答。 

III.5.3.B-细胞ELISPOT记忆

III.5.3.1目标 

为了更好地表征由AS03佐剂化流感疫苗诱导的CMI应答，评价使用流感疫苗株或抗人免疫球蛋白体外诱导分化为浆细胞的B-细胞Elispot记忆应答，以便计数抗流感或分泌IgG的浆细胞。结果描述于表19和表20以及图7。 

选择22名首次接受1剂FluAS03疫苗的受试者和21名首次接受1剂Fluarix疫苗的受试者中的一部分，以使用B-细胞记忆Elispot 技术评价接种对流感特异性记忆B细胞的影响。测定以下终点： 

·在第0天和第21天：已通过B-细胞Elispot检测了所有受试者中的流感特异性记忆B细胞。结果表示为每百万个(10⁶)抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。 

·接种后(第21天)和接种前(第0天)之间的差异也表示为每百万个(10⁶)抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。 

III.5.3.2.统计方法 

各个接种组在第0天和第21天的描述统计表示为每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。第21天和第0天之间(接种后-接种前)个体差异的描述统计为每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。 

Wilcoxon检验用于对比两个组之间的局部差异，计算针对3种毒株(A/新喀里多尼亚、A/巴拿马和B/山东)中的每种的统计学p-值。 

III.5.3.3结果 

相比于Fluarix组，存在一种有利于AS03佐剂化流感疫苗的趋势。对于A/新喀里多尼亚株，相比于Fluarix存在有利于FluAS03的统计学显著差异(p-值＝0.021)。对于A/巴拿马和B/山东株没有观察到两个组之间的统计学差异。 

表19 B-细胞记忆：对接种前(第0天)和接种后(第21天)的描述统计以及10⁶个产IgG浆细胞(一部分受试者)中抗原-浆细胞的接种后(第21天)频率的推论统计 

[0571] 组1：Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐剂 

组2：Flu疫苗Fluarix^TM

SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

P-值＝Wilcoxon检验(非参数方法)，测试第21天时2组之间的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

表20 B-细胞记忆：对10⁶个产IgG浆细胞(一部分受试者)中抗原特异性浆细胞频率在接种后(第21天)和接种前(第0天)之间的差异的描述统计和推论统计 

组1：Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐剂 

组2：Flu疫苗Fluarix^TM

SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

P-值＝Wilcoxon检验(非参数方法)，测试第21天时2组之间的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

III.6.整体结论 

III.6.1.反应原性和安全性结果

尽管流感免疫显著降低了肺炎和相关死亡的风险，但老年人接种仅提供了23-72％的抗流感疾病的保护作用。疫苗抗原和有效佐剂的制剂是一种增强对亚单位抗原的免疫应答的有吸引力方法。本研究设计用于评价(1)用水包油乳液即AS03佐剂化的流感疫苗在健康老年人中安全性和反应原性，(2)抗体和细胞介导的免疫应答。反应原性数据表明，用AS03佐剂化的流感疫苗比其它两种疫苗诱发更多的局部和全身症状。但是，对于主动诉求的不良事件，未观察到3种疫苗之间的差异。由这些结果可得出结论，候选疫苗的反应原性和安全性是令人满意的，在临床上是可接受的。 

III.6.2.免疫原性结果

就免疫应答而言，3种疫苗超出了欧洲官方对每年注册的裂解病毒体流感疫苗的要求(“关于协调流感疫苗要求的指引说明”，用于免疫学评价年度毒株变化-CPMP/BWP/214/96)。在本研究中测试的3种流感疫苗在健康老年人中是免疫原性的，这些老年人对流感血细胞凝集素和中和抗原发展出良好的抗体应答(表21)。 

表21 

对于细胞介导的免疫(CMI)应答，用AS03佐剂化的流感疫苗诱导的CD4应答(包括漂移株)显著强于其它两种疫苗(Fluarix和全流感 病毒疫苗)。但是，接种对CD8应答没有可检测的影响。 

关于B细胞记忆应答，相比于无佐剂疫苗，存在有利于有佐剂流感疫苗的趋势。 

实施例IV-用含裂解流感抗原制备物和AS03佐剂的疫苗在65岁以上的老年人群中的临床实验-Explo-Flu-002 

为评价含佐剂AS03的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗在先前于2003年在Explo-Flu-001临床实验中接种候选疫苗的65岁以上老年人群中的反应原性和免疫原性，已进行了开放、可控的I/II期研究。对于免疫原性和安全性评价，Fluarix^TM疫苗(在比利时称为α-rix^TM)已用作参比。 

IV.1.目标 

在肌内给予1剂AS03佐剂化的疫苗之后21天，检测体液免疫应答(即抗血细胞凝集素抗体滴度)和细胞介导的免疫应答(CD4和/或CD8 T细胞应答)和B记忆细胞应答。Fluarix^TM用作参比。 

目标是： 

1)确定AS03佐剂化的Flu(40名受试者)相对于Fluarix(18名受试者)是否证实了其对CD4-和/或CD8-介导的流感抗原接种个体的免疫性的最强免疫刺激活性； 

2)使用纵向分析研究AS03做佐剂对2004年接种前的免疫应答(正是2003年首次接种后1年的应答)的影响。 

IV.2.研究设计、疫苗组成和终点 

■40名＞65岁的受试者，他们先前在2003年的Explo-Flu-001临床实验中接受了1剂AS03佐剂化的流感疫苗(FluAS03)。 

■1个约20名65岁以上受试者的对照组，他们先前在2003年的Explo-Flu-001临床实验中接受了1剂Fluarix^TM(Fluarix)。 

IV.2.1.疫苗组成

疫苗组成类似于用于研究Explo-Flu-001的疫苗组成，只是包含在疫苗(2004年疫苗)中的流感株不同。毒株如下： 

·A/新喀里多尼亚/20/99(IVR-116)(H1N1)＝A/新喀里多尼亚/(H1N1)-类似毒株 

·A/怀俄明/3/2003(X-147)(H3N2)＝A/福建(H3N2)-类似毒株 

·B/江苏/10/2003＝B/上海-类似毒株 

IV.2.2.免疫原性(HI)终点

·GMT(采用对数滴度转化平均值的反对数) 

·转变因子(相比于第0天在第21天时血清HI GMT的增加倍数) 

·血清阳转率(相比于第0天在第21天时对每种疫苗株的HI滴度具有达至少4倍增加的接种者百分率) 

·保护率(在第21天时血清HI滴度≥1∶40的接种者百分率) 

IV.2.3.CMI-终点

观测变量： 

在第0天和第21天：每10⁶个细胞中针对4种不同细胞因子的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试都定量针对以下的CD4/CD8 T细胞应答： 

■以下3种抗原的混合物 

■新喀里多尼亚抗原 

■怀俄明抗原 

■江苏抗原 

衍生变量： 

在5种不同测试(细胞因子)中由以下表示的抗原特异性CD4 T细胞和CD8 T细胞应答： 

1.产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞 

2.产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞 

3.产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞 

4.产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞 

5.产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞 

IV.2.4.CMI分析

首个CMI分析基于总接种人群(FluAS03组N＝40名受试者，Fluarix组N＝18名受试者)。 

纵向分析基于Explo-Flu-001(裂解蛋白)和Explo-Flu-002(混合的flu抗原)研究的动态人群： 

■接种前：FluAS03组N＝36名受试者，Fluarix组N＝15名受试者。 

■接种后-接种前：FluAS03组N＝34名受试者，Fluarix组N＝15名受试者。 

(a)通过对每种抗原、每种细胞因子、每个疫苗组和每个时间点(接种前和接种后)的描述统计总结CD4/CD8 T-淋巴细胞分泌应答的频率。 

(b)对每种抗原、每种细胞因子和每个疫苗组在时间点(接种前和接种后)之间的个体应答差异的描述统计制表。 

(c)对于接种后和(接种后-前)的时间点，使用非参数Wilcoxon检验比较两个疫苗组之间的局部差异，并就4种不同细胞因子计算以下的统计学p-值： 

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏和3种毒株混合物的CD4 T-细胞应答 

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏和3种毒株混合物的CD8 T-细胞应答 

(d)非参数检验(Wilcoxon-检验)还用于： 

-依据各个疫苗组中Explo-Flu-001和Explo-Flu-002之间特异性 CD4的频率，研究接种前(第0天)免疫应答的动力学 

-依据在Explo-Flu-001和Explo-Flu-002研究的每一个中2个疫苗组之间的特异性CD4的频率，研究接种前(第0天)免疫应答的动力学 

-依据各个疫苗组中Explo-Flu-001和Explo-Flu-002之间特异性CD4的频率差异(接种后-接种前)，研究免疫应答的动力学 

-依据在Explo-Flu-001和Explo-Flu-002研究的每一个中2个疫苗组之间的特异性CD4的频率差异(接种后-接种前)，研究免疫应答的动力学 

所有显著性检验都是双尾的。小于或等于0.05的P-值被认为是统计学显著的。 

IV.3.结果 

结果表示为CD4或CD8 T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或CD8T细胞的频率。 

IV.3.1.抗原特异性CD4 T-淋巴细胞

通过对每种抗原、每种细胞因子、每个疫苗组和每个时间点(接种前和接种后)的描述统计总结抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。 

在表22中显示了对于每种抗原、各5种不同的细胞因子和每个疫苗组在时间点(接种后-接种前)之间CD4 T-淋巴细胞应答个体差异的描述统计。 

表22接种后(在第21天)和接种前(在第0天)之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答差异的描述统计(总接种人群) 

[0656] SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的测试受试者的数目 

疫苗诱导的CD4 T细胞显示出能够持续至少1年，因为用Fluarix接种的个体和前一年用Fluarix/AS03接种的个体之间相比，接种前CD4 T-细胞应答水平存在可观测的差异。结果还示于图8，表明了再接种之前和之后针对裂解流感病毒抗原的CD4 T-细胞应答。D0对应于首年接种后12个月，因此指示持续性。 

相比于接种后2个组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异(依据Wilcoxon检验)，几乎所有的p-值都小于0.05，在统计学上被认为是显著的(参见表23)，这有利于FluAS03组。 

表23推论统计：在第21天来自Wilcoxon秩和检验的2个疫苗组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p值(总接种人群) 

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试第21天时2个组之间的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

通过Wilcoxon检验对比2个组之间抗原特异性CD4-T淋巴细胞应答频率的个体差异(接种后-接种前)，以下抗原-细胞因子组合出现小于0.05并被认为是统计学显著的p-值：混合的流感病毒抗原-alldouble、混合的流感病毒抗原-IFNγ和江苏-IFNγ，这有利于FluAS03 组(表24)。 

表24推论统计：通过Wilcoxon秩和检验计算的不同组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答在接种后(第21天)和接种前(第0天)之间差异的p值(总接种人群) 

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

IV.3.2.抗原特异性CD8 T-淋巴细胞

通过对每种抗原、每种细胞因子、每个疫苗组和每个时间点(接种前和接种后)的描述统计总结抗原特异性CD8 T-淋巴细胞分泌应答的频率，类似于对CD4 T细胞应答采用的方法。 

通过Wilcoxon检验对比接种后2个组之间抗原特异性CD8 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都高于0.05，被认为不是统计学显著的。通过Wilcoxon检验对比2个组之间抗原特异性CD8 T-淋巴细胞应答频率的个体差异(接种后-接种前)，所有p-值都高于0.05，被认为不是统计学显著的。 

IV.3.3.动力学分析：接种前(于2003年首次接种后1年)的免疫应答

通过对表25中每种细胞因子和每个疫苗组和两个研究的每一个的描述统计、对表27中的两个研究的每一个和每个疫苗组的描述统计，总结接种前抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。推理统计在表16和表28中给出。 

表25对接种前(第0天)特异性CD4 T淋巴细胞应答接种的描述统计(动力学) 

SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

通过Wilcoxon检验对比2个研究之间各个疫苗组的抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异，仅对于FluAS03组和采用TNFα细胞因子的情况出现小于0.05并被认为是统计学显著的p-值(有利于Explo-Flu-002)(参见表26)。 

表26推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同研究之间第0天抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p-值(动力学) 

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间在第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

表27对接种前(第0天)特异性CD4 T淋巴细胞应答接种的描述统计(动力学) 

SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

通过各个研究的Wilcoxon检验对比2个疫苗组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞频率的差异，Explo-Flu-002的所有p值都小于0.05，被认为是统计学显著的(有利于FluAS03)(参见表28)。 

表28推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同组之间第21天抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p-值(动力学) 

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间在第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

IV.3.4.动力学分析：接种后减去接种前的免疫应答

通过对表29中每种细胞因子和每个疫苗组和每个研究的描述统计、对表31中的每个研究和每个疫苗组的描述统计，总结在(接种后-接种前)时间点的抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。推理统计在表30和表32中给出。 

表29接种后(第21天)和接种前(第0天)之间特异性CD4 T淋巴细胞应答接种的描述统计(动力学) 

SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

通过各个疫苗组的Wilcoxon检验对比2个研究之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞频率的差异，FluAS03组的所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的(有利于Explo-Flu-001)(参见表30)。 

表30对接种后(第21天)和接种前(第0天)之间差异的推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同研究之间第21天抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p-值(动力学) 

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

表31对接种后(第21天)和接种前(第0天)之间特异性CD4 T淋巴细胞应答接种差异的描述统计(动力学) 

SD＝标准偏差 

Min、Max＝最小，最大 

Q1＝第一四分位数 

Q3＝第三四分位数 

N＝结果可用的受试者数目 

通过各个研究的Wilcoxon检验对比2个疫苗组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞频率的差异，仅Explo-Flu-001的p值小于0.05，被认为是统计学显著的(有利于FluAS03)(参见表32)。 

表32推理统计：来自Wilcoxon秩和检验的不同组之间第21天抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的p-值(动力学) 

P-值：Wilcoxon检验(非参数方法)测试2个组之间在第21天的局部差异(Wilcoxon秩和检验)。 

IV.4.HI滴度 

结果示于图9和表33-36。 

表33：抗HI滴度的几何平均滴度(GMT)和血清阳性率(GMT针对接种的受试者计算) 

PRE＝接种前 

PI(D21)＝接种后21天 

95％CI、LL和UL＝95％置信区间、下限和上限 

S+＝血清阳性受试者的数目 

表34：抗HI滴度的转变因子(所有接种的受试者) 

N＝受试者总数 

GMR＝几何平均比率(第21天/第0天滴度比率的平均对数的反对数) 

95％CI＝95％置信区间 

表35：抗HI滴度的血清保护率(所有接种的受试者) 

PRE＝接种前 

PI(D21)＝接种后21天 

N＝结果可用的受试者数目 

n＝滴度在特定范围内的受试者数目 

％＝滴度在特定范围内的受试者百分率 

表36：在PI第21天的血清阳转率(增加倍数＝4)(全部接种的受试者) 

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目 

n＝应答者数目 

％＝应答者比例(n/N×100) 

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限 

IV.5.整体结论 

由此临床研究证实，就流感特异性CD4 T细胞的频率而言，也就至再接种研究D0(Explo Flu 002，即±1年后)为止首次Flu-AS03接种(在Explo Flu 001中的初免接种)激发的免疫应答的持久性而言，有佐剂疫苗Flu-AS03优于对等的无佐剂疫苗Fluarix。而且，该应答能够识别新疫苗中存在的漂移流感株，并识别2004年流感疫苗的毒株。 

与第一年接种相反，再接种时先前用有佐剂Fluarix^TM接种的个体时显示出比无佐剂Fluarix^TM接种的个体增加的HI滴度响应性。可观察到一种趋势：抗H1N1和H3N2毒株的HI滴度增加至1.5-2倍，抗B毒株的HI滴度具有已表明的统计学增加。 

实施例V-有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价 

第一个研究-新制剂AS03和AS03+MPI的效力

V.1.基本原理和目标 

就感染的敏感性和临床应答这二者而言，雪貂模型中的流感感染酷似人流感。 

在先前未进行病毒株免疫的情况下，雪貂对甲型流感和乙型流感这二者的感染极为敏感。因此，其为研究由给予的流感疫苗赋予的保护作用提供了极佳的模型系统。 

该研究研究了有佐剂或无佐剂的各种3价裂解疫苗对用同源毒株攻击的雪貂的减少病征(体温)和鼻分泌物中病毒脱落的效力。 

该实验的目标是表明有佐剂流感疫苗相比于普通(无佐剂)疫苗的效力。 

终点是： 

1)主要终点：减少同源攻击后鼻清洗液中的病毒脱落； 

2)次要终点：通过IHA分析体液应答以及监测初免和攻击前后的温度。 

V.2.实验设计 

V.2.1.治疗/组别(表37)

由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))(6只雪貂/组)。雪貂在第0天用异种亚型毒株H1N1 A/斯德哥尔摩/24/90(4 Log TCID₅₀/ml)初免。在第21天，用全人剂量(500μg疫苗剂量，15μg HA/毒株)的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97的组合肌内注射雪貂。然后在第41天通过鼻内途径用同型毒株H3N2 A/巴拿马/2007/99(4.51 Log TCID₅₀/ml)攻击雪貂。 

表37 

V.2.2.疫苗制剂的制备

制剂1：三分普通(无佐剂)制剂(500μl)： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，按顺序加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

制剂2：用AS03佐剂化的三价裂解流感制剂(500μl)： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μlSB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

制剂3：用AS03+MPL佐剂化的三价裂解流感制剂 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和17.5μgB毒株，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。再搅拌混合物15分钟，之后由如实施例II.3.1的教导制备的悬浮液立即加入25μg MPL。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

备注：在每种制剂中，加入PBS 10倍浓缩液至等渗，在最终体积中为1倍浓缩液。计算H₂O体积以达到目标体积。 

V.2.3.解读(表38)

表38 

[0776] In＝单独的/Po＝混合的 

V.3.结果 

结果的示意图在图10和图11中给出。 

V.3.1.温度监测

用传感器并通过遥测记录(按照在I.2.2中详述的方法)监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。 

在攻击前3天直至攻击后5天每15分钟记录温度，由日中计算出平均值。基线至基线体温的结果示于图10A(显示了-1至+3天的结果)和10B(显示了-2至+3天的结果)。 

在攻击后，仅在用三价裂解普通疫苗或PBS免疫后观察到体温峰值。在用AS03或AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗免疫后未观察到峰值。 

V.3.2.病毒脱落(图11)

对每组6只动物进行鼻清洗液的病毒滴定。 

通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于-80℃(干冰)的样品容器中。 

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵ 个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育，直至对照细胞达到细胞汇合，例如5-7天。在6-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。 

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲腊染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长 (450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3 OD(0.3 OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD<截取值时定义为阳性得分，相反，OD>截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。 

相比于三价裂解普通疫苗或PBS，在用AS03或AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗攻击后观察到较低的病毒脱落。采用AS03的保护作用比AS03+MPL稍好(参见攻击后第2天)。由于每组的动物数量少，所以不能确定统计学显著性。 

V.3.3.实验结论

相比于三价裂解普通疫苗，用AS03或AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗观察到针对全部3种毒株的较高体液应答(HI滴度)(对3种毒株中的2种(即H3N2和B毒株)至少为2倍)。 

就在雪貂中的保护效力而言，AS03和AS03+MPL制剂显示出额外的利益(较低的病毒脱落和温度)(图10和11)。 

攻击后，用AS03或AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗免疫后没有观察到体液应答的加强。 

第二个研究-在雪貂中的异型攻击研究：表明测试的新制剂的效力

V.4.基本原理和目标 

本研究通过减轻病征(体温)的能力及其对异源攻击后免疫雪貂鼻分泌物中的病毒脱落的作用，研究了有佐剂或无佐剂的各种三价裂解疫苗的效力。 

V.5.实验设计 

由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))(6只雪貂/组)。测试4个小组： 

^*Fluarix 

^*三价裂解疫苗AS03 

^*三价裂解疫苗AS03+MPL 

^*PBS 

雪貂在第0天用异种亚型毒株H1N1 A/斯德哥尔摩/24/90(4 LogTCID₅₀/ml)初免。在第21天，用全人剂量(500μg疫苗剂量，15μg HA/毒株)的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97(17.5μg HA)的组合肌内注射雪貂。然后在第43天通过鼻内途径用异种亚型毒株H3N2 A/怀俄明/3/2003(4.51 Log TCID₅₀/ml)攻击雪貂。 

V.6.结果 

结果的示意图在图12和图13中给出。 

V.6.1.温度监测

在攻击期间用传感器并通过遥测记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。 

结果(图12)表明： 

-在初免前后观察一组与另一组之间的高可变性。基线看起来在初免前比初免后高。 

-尽管体温存在高可变性，但仅在PBS(6/6雪貂)、三价裂解普通疫苗(5/6雪貂)和AS03佐剂化三价裂解疫苗(2/6雪貂)免疫的雪貂中于攻击后观测到峰值。在用AS03+MPL佐剂化三价裂解疫苗免疫后未观测到峰值(0/6雪貂)。 

-就发热预防而言，抗异源毒株AS03看起来不如AS03+MPL有效。我们不能断定佐剂间差异是源于不同的攻击前抗体水平的可能性。 

V.6.2.病毒脱落(图13)

通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于-80℃(干冰)的样品容器中。 

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵ 个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育，直至对照细胞达到细胞汇合，例如达5-7天。在6-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20 WST-1的培养基，再温育18小时。 

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲腊染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3 OD(0.3 OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD<截取值时定义为阳性得分，相反，OD>截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。 

初免后的病毒脱落 

检测初免前第1天至初免后第7天12只血貂的病毒脱落。结果以混合方式表示。 

在初免后7天观测所有雪貂中的病毒清除。 

攻击后的病毒脱落 

检测6只雪貂/租由攻击前1天至攻击后7天的病毒脱落。 

攻击后2天，相比于用三价裂解普通疫苗和PBS免疫的雪貂，在用AS03和AS03+MPL佐剂化三价裂解疫苗免疫的雪貂中观测到统计学显著较低的病毒滴度(与普通疫苗相比，佐剂组AS03/AS03+MPL的差异分别为1.25/1.22 log和1.67/1.64 log)。 

在第50天，在鼻清洗液中未检测到病毒。 

V.6.3.血凝反应抑制测试(HI滴度)(图14A和B)

在初免前1天、初免后21天、免疫后22天和攻击后14天收集血清样品。 

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对H3N2流感病毒(疫苗株和攻击株)的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制小鸡红细胞(RBC)的血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，并热失活，以去除非特异性抑制剂。预处理后，将2倍稀释度的血清与4个血凝单位的每种流感毒株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的最高血清稀释度的倒数。由于第一个血清稀释度为1∶10，所以将不可检测的水平记录为等于5的滴度。 

结果： 

结果示于图14A和14B。在用H3N2 A/巴拿马免疫后，在用AS03或AS03+MPL佐剂化三价裂解疫苗免疫的雪貂中观测到的体液应答(HI滴度)比用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)免疫雪貂后观测到的体液应答高。 

在用AS03或AS03+MPL佐剂化的H3N2 A/巴拿马免疫的雪貂中观测到相似的HI滴度。 

仅在用AS03或AS03+MPL佐剂化的含A/巴拿马H3N2毒株的疫苗免疫后，观测到针对异源毒株A/怀俄明H3N2的交叉反应性HI滴度(在用三价裂解普通疫苗免疫后未观测到)。 

在用异源毒株A/巴拿马H3N2免疫并用A/怀俄明H3N2攻击的雪貂中观测到A/怀俄明特异性HI滴度的增强。正如所料，与同源攻击相反，异源攻击导致用AS03和AS03+MPL佐剂化的A/巴拿马H3N2免疫的雪貂中A/巴拿马特异性HI滴度增加。 

V.6.4.该实验的结论

正如所料，与同源攻击后的情况(无加强)相比，在异源攻击后观测到抗H3N2 HI滴度的加强。 

但是，在异源和同源攻击后观测到相似的保护作用(病毒脱落)。实施例VI-有佐剂和无佐剂的流感疫苗在C57BI/6初免小鼠中的临床前评价 

VI.1.实验设计和目标 

与Fluarix普通(无佐剂)疫苗相比，在Explo-Flu-001临床研究(参见实施例III)中观察到针对三价流感裂解疫苗AS03的CD4 T细胞应答显著较高。在这两个组之间未观察到CD8 T细胞和体液应答这二者的差异。 

目标是选择解读方式，以在小鼠中诱导类似于人中观察到的CMI应答。具体地说，目标是通过使用裂解疫苗AS03或裂解疫苗AS03+MPL在小鼠中显示出比裂解普通疫苗高的CMI应答。 

VI.1.1.治疗/组别

由Harlan Horst，Netherland获得6-8周龄的雌性C57BI/6小鼠(15只小鼠/组)。测试组是： 

-三价裂解普通疫苗 

-三价裂解疫苗AS03 

-三价裂解疫苗AS03+MPL 

-PBS 

小鼠在第0天用异种亚型毒株(5μg HA全失活H1N1 A/约翰内斯堡/82/96、H3N2 A/悉尼/5/97、B/哈尔滨/7/94)初免。在第28天，用1.5μg HA三价裂解疫苗(A/新喀里多尼亚/20/99、A/巴拿马/2007/99、B/山东/7/97)普通疫苗或有佐剂疫苗(参见以下组别)肌内注射小鼠。 

VI.1.2.疫苗制剂的制备

在每种制剂中，加入PBS 10倍浓缩液以达到等渗，在最终体积中为1倍浓缩液。甲酸H₂O体积以达到目标体积。 

裂解三价普通(无佐剂)制剂： 

制剂1(达500μl)：将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、Triton X-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μgTween 80、110μg Triton X-100和100μg VES。5分钟搅拌后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

用水包油乳液佐剂AS03佐剂化的裂解三价制剂： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μlSB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

用AS03+MPL佐剂化的三价裂解制剂 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有750μg Tween 80、110μg TritonX-100和100μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μlSB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入25μg MPL。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

VI.1.3.解读

CMI分析(ICS：CD4/CD8、IL-2/IFNg染色) 

在免疫后7天收集初免小鼠的PBMC。在混合物/组别中测试它们。 

VI.2.结果 

通过使用C57BI/6初免小鼠和作为再刺激抗原的全失活病毒1μg/ml，确定显示出较高CD4和CD8+T细胞频率以及较低背景的条件。结果示于图15(CD4 T-细胞应答)和图16(CD8 T-细胞应答)。 

在这些条件下，有可能诱导： 

·相比于裂解普通疫苗针对裂解AS03疫苗的较高CD4 T细胞应答，如在人中所观察到的。 

·相比于裂解普通疫苗针对裂解AS03+MPL疫苗的较高CD4 T细胞应答。 

·在裂解普通疫苗和裂解AS03疫苗之间相似的CD8 T细胞应答，如在人中所观察到的。 

·与裂解AS03疫苗或裂解普通疫苗相比针对AS03+MPL的CD8 T细胞应答较高的趋势。 

实施例VII-在用异源毒株初免的C57BI/6小鼠中有佐剂和无佐剂的裂解和亚单位流感疫苗的临床前评价 

VII.1.实验设计和目的 

与Fluarix普通(无佐剂)疫苗相比，在Explo-Flu-001临床研究(参见实施例III)中观察到针对三价流感病毒裂解AS03疫苗的CD4 T细胞应答显著较高。在这两个组之间未观察到CD8 T细胞和体液应答这二者的差异。 

使用异源毒株初免的C57BI/6小鼠开发出一种动物模型，该模型重现了在人中观察到的相似的免疫模式。对于ICS(胞内细胞因子 染色)，再刺激用失活全病毒进行。 

目的是比较GlaxoSmithKline商用裂解疫苗(Fluarix^TM)相对于亚单位疫苗(Chiron的疫苗Fluad^TM)诱导的CMI应答以及用AS03或AS03+MPL或另一种水包油乳液佐剂(OW)佐剂化的这些疫苗获得的CMI应答。 

VII.1.1.治疗/组别

由Harlan Horst，Netherland获得6-8周龄的雌性C57BI/6小鼠(24只小鼠/组)。小鼠在第0天用异种亚型毒株(5μg HA全甲醛失活H1N1A/约翰内斯堡/82/96、H3N2 A/悉尼/5/97、B/哈尔滨/7/94)鼻内初免。在第29天，用1.5μg HA三价裂解(A/新喀里多尼亚/20/99、A/怀俄明/3/2003、B/江苏/10/2003)普通疫苗或有佐剂疫苗(参见以下表39中的组别)肌内注射小鼠。 

表39 

^*Fluarix^TM

^**如在以下部分中的阐述生产的OW 

VII.1.2.疫苗制剂的制备

OW的制备

按照在Chiron Behring FIuAd疫苗中包含的说明书小册子中公布的处方制备称为OW的水包油乳液。 

将注射用水、36.67mg柠檬酸和627.4mg柠檬酸钠二水合物混合在一起，将体积调整至200ml。将470mg Tween 80与94.47ml该缓冲液混合，此混合物称为“溶液A”。通过在磁力搅拌下混合3.9g鲨烯和470mg Span 85制备油性混合物。然后将溶液A加入油性混合物中，获得的终体积是100ml。然后，混合物首先通过18G×11/2针，然后被以两个样品放入M110S微流控器(得自Microfluidics)中，以减小油滴大小。当每个样品获得约150nm的粒度时，合并两个样品，经0.2μm滤器过滤。在T0时对合并的样品获得143nm的z均值，多分散性为0.10，在4℃储存4个月后获得145nm的z均值，多分散性为0.06。该粒度使用Zetasizer 3000HS(得自Malvern)在以下技术条件下获得： 

-激光波长：532nm(Zeta3000HS) 

-激光功率：50mW(Zeta3000HS) 

-于90°检测的散射光(Zeta3000HS) 

-温度：25℃ 

-持续时间：由软件自动确定 

-次数：3次连续检测 

-z均值直径：利用累积量分析 

组1的制剂(对于1ml)： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/mlVES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组2的制剂(对于1ml)： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl OW乳液。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组3的制剂(对于1ml)： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组4的制剂(对于1ml)： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中，以达到终浓度：375μg/ml Tween 80、55μg/ml Triton X-100和50μg/ml VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入25μg MPL。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组5的制剂(对于1ml)： 

混合等体积的PBS和FluAdTM/Gripguard^TM疫苗(商用疫苗)。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组6的制剂(对于1ml)： 

将250μl PBS mod pH 7.4加入1剂500μl的Aggripal^TM(商用疫苗)中。搅拌15分钟后，加入250μl SB62(按照对大规模生产详述的方法制备)。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组7的制剂(对于1ml)： 

将PBS mod pH 7.4加入1剂500μl的Aggripal^TM(商用疫苗)中(以达到终体积1ml)。搅拌15分钟后，加入250μl SB62(按照对大规模生产详述的方法制备)。然后加入25μg MPL。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组8的制剂(对于1ml)： 

将250μl PBS mod pH 7.4加入1剂500μl的Aggripal中。搅拌15分钟后，加入250μl如组2制备的OW，搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

组9的制剂(对于1ml)： 

混合等体积的PBS mod pH 7.4和Aggripal。搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

VII.1.3.解读(表40)

CMI(ICS)：免疫后7天。 

IHA/中和测定：免疫后21天。 

表40 

In＝单独的/Po＝混合的 

CMI分析(ICS：CD4/CD8、IL-2/IFNg染色) 

在免疫后7天由24只小鼠/组收获PBMC，在混合物/组别中测试。 

VII.2.结果 

VII.2.1.体液免疫性

在鼻内异源初免后14天和免疫后16天检测24只动物/组的血清中抗3种疫苗株的血凝反应抑制活性。 

对于3种毒株和所有组，在免疫后观测到加强的HI滴度。 

·对于相同佐剂和3种毒株，亚单位疫苗和裂解疫苗诱导相似的HI滴度。 

·对于3种毒株，和Aggripal OW相比对Fluad观测到相似的HI滴度。 

·对于H1N1和B毒株，没有观察到Fluarix和Aggripal之间的差异。 

·对于3种毒株，与普通流感疫苗相比，用有或没有MPL的AS03佐剂化流感疫苗(裂解疫苗或亚单位疫苗)的时观察到统计学上显著较高的HI滴度。 

·与普通流感疫苗相比，仅对于A/怀俄明毒株用OW佐剂化的流感疫苗(裂解疫苗或亚单位疫苗)的HI滴度在统计学上显著较高。 

VII.2.2.细胞介导的免疫应答(在免疫后7天的ICS)

CD4 T细胞应答-图17上部 

在免疫后7天收集24只小鼠/组的PBMC，并在1个混合物/组中测试。失活的三价全病毒(1μg/ml)用作再刺激抗原。结果示于图17上部。 

就表达IL-2、IFN-γ或这两种细胞因子的流感全病毒特异性CD4+T细胞而言(图17上部)： 

1.GSK佐剂显示出和先前观测(实施例VI)相同的趋势：AS03+MPL优于AS03，AS03又优于用普通疫苗获得的结果。对于裂解疫苗或亚单位疫苗这二者均观察到此趋势。 

2.无论哪种制剂(普通疫苗、AS03或AS03+MPL)，裂解疫苗都诱导比亚单位疫苗高的CD4+T细胞应答。 

3.Fluad(亚单位+水包油乳液OW-参见制备部分)看起来诱导与Fluarix普通疫苗相似的频率。 

4.制剂三价裂解疫苗/AS03或三价裂解疫苗/AS03+MPL诱导高于制剂亚单位/水包油乳液OW的CD4+T细胞应答。 

CD8 T细胞应答-图17下部 

在免疫后第7天由24只小鼠/组收集PBMC，并在1个混合物/组中测试。失活的三价全病毒(1μg/ml)用作再刺激抗原。 

就表达IL-2、IFN-γ或两种细胞因子的流感全病毒特异性CD8+T细胞而言(图17下部)： 

·该实验的截取值相对较高，原因是对PBS阴性对照组观测到的背景高。 

·但是，与其它疫苗制剂相比，对于用三价裂解疫苗/AS03+MPL免疫的小鼠观测到较高的特异性CD8 T细胞应答。 

VII.3.结果概述和结论 

获得以下结果： 

1)在免疫后7天通过ICS获得的流感病毒特异性CD4+T细胞表明： 

1.与Fluarix相比对Fluad获得相似的应答。 

2.与无佐剂疫苗相比，对于裂解流感疫苗(如在人中观测到的)和亚单位疫苗(Aggripal)(在人中未评价)这二者来说，有佐剂制剂均诱导较高的免疫应答。补加MPL的水包油乳液佐剂AS03(组4和组9)产生比水包油乳液佐剂AS03(组3和组8)高的应答。 

3.与裂解疫苗/AS03相比，有针对裂解疫苗/AS03+MPL的较高CD4应答的趋势(图17)。 

4.由裂解疫苗诱导的应答优于用亚单位疫苗获得的应答(对比组1-4和组5-9)。 

5.裂解疫苗，无论用有还是用没有MPL的AS03做佐剂(组3和4)，都显示出比亚单位疫苗(Fluad(组5)或者Aggripal+OW(组7))高的CD4+T细胞应答。 

2)在免疫后7天通过ICS获得的流感病毒特异性CD8+T细胞没有显示出在裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗(如在人中观测到的)之间观测到的差异。与裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗相比，使用裂解疫苗/AS3+MPL获得的CD8+T细胞应答有较高的趋势。 

3)对于相同佐剂和3种毒株，亚单位疫苗和裂解疫苗诱导相似的HI滴度。对于3种毒株，与普通流感疫苗相比，当流感疫苗(亚单位疫苗或裂解疫苗)用AS03或AS03+MPL佐剂化时观察到统计学上显著较高的滴度(仅对于A/怀俄明毒株流感疫苗OW>普通流感疫苗)。 

实施例VIII-用含裂解流感抗原制备物和有或没有MPL佐剂的AS03的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验 

VIII.1.实验设计 

在65岁以上(≥65岁)老年人群中进行开放、随机、可控的I期研究，以便评价与Fluarix^TM疫苗(在比利时称为α-Rix^TM)相比，肌内给予的含佐剂AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性。 

评价3个平行组： 

·1组50名受试者接受1剂重配和AS03佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03) 

·1组50名受试者接受1剂重配和Flu AS03+MPL佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03+MPL) 

·1个对照组50名受试者接受1剂Fluarix^TM(Fluarix) 

VIII.2.疫苗组成和给予 

在3种疫苗中使用的毒株是已由WHO推荐用于2004-2005北半 球流感季的毒株，即A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亚/3/2003(H3N2)和B/江苏/10/2003。同Fluarix^TM/α-Rix^TM一样，商用疫苗用作对比物，有佐剂疫苗(AS03或AS03+MPL)每剂含每种流感病毒株的15μg血细胞凝集素(HA)。 

有佐剂流感候选疫苗是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含佐剂(AS03或AS03+MPL)的预填充I型玻璃注射器组成。它们如在实施例II中的详述制备。用于有佐剂流感候选疫苗配制的3种失活裂解病毒体抗原(单价原液)与用于配制商用Fluarix^TM/α-Rix的活性成分完全相同。 

AS03佐剂化的疫苗： 

AS03佐剂化的流感候选疫苗是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶(335μl)(抗原容器)中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含SB62乳液的预填充I型玻璃注射器(335μl)(佐剂容器)组成。AS03候选疫苗的描述和组成阐述于实施例III。 

AS03+MPL佐剂化的疫苗： 

简而言之，AS03+MPL佐剂化的流感疫苗候选物是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶(335μl)(抗原容器)中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含AS03+MPL佐剂的预填充I型玻璃注射器(360μl)(佐剂容器)组成。在注射时，抗原容器的内容物通过使用含AS03+MPL佐剂的注射器由瓶中取出，接着轻微混合注射器。在注射前，使用的针被肌内针替换，并将体积调整到530μl。1剂重配的AS03+MPL佐剂化流感候选疫苗相当于530μl。为在AS03+MPL佐剂化疫苗重配时获得每种流感株的15μg HA，与Fluarix^TM(即30μg HA/ml)相比，失活的裂解病毒体抗原在抗原容器中被浓缩2倍(即60μgHA/ml)。 

1剂重配的有佐剂流感疫苗的组成与表45(参见实施例XI)中报告的相同，只是流感株不同。两种疫苗都肌内给予。 

VIII.3.CMI目标、终点和结果 

CMI目标是确定相对于无任何佐剂的组合物，用AS03或AS03+MPL佐剂化的制剂之间哪种免疫原性组合物对流感抗原接种个体的CD4和CD8介导的免疫性具有最强的免疫刺激活性。 

VIII.3.1.CMI终点和结果

观测变量 

在第0天和第21天：每10⁶个细胞中针对5种不同细胞因子的细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每个测试定量针对以下的CD4/CD8 T细胞应答： 

-以下3种抗原的混合物 

-新喀里多尼亚抗原 

-怀俄明抗原 

-江苏抗原 

衍生变量： 

在5种不同测试中用以下细胞表示的抗原特异性CD4和CD8-T-细胞应答： 

(a)产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞 

(b)产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞 

(c)产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞 

(d)产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞 

(e)产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞 

CMI应答分析： 

CMI分析基于总接种人群。 

(a)对于每个治疗组，针对每个接种组、每个时间点(第0天、第21天)和每种抗原：新喀里多尼亚、怀俄明和江苏以及合并的3种不同毒株测定CD4/CD8 T-淋巴细胞分泌应答的频率。 

(b)针对各5种不同的细胞因子，在时间点(接种后-接种前)之间 对各个接种组和各种抗原的应答的个体差异的描述统计。 

(c)就5种不同细胞因子对比3组的以下方面： 

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏以及合并的3种毒株的CD4 T-细胞应答 

-针对新喀里多尼亚、怀俄明、江苏以及合并的3种毒株的CD8 T-细胞应答 

(d)非参数检验(Kruskall-Wallis检验)用于对比3组间的局部差异，针对各5种不同细胞因子计算各种抗原的统计学p-值。 

(e)Wilcoxon检验分别用于检验Flu AS03+MPL对Fluarix、FluAS03+MPL对Flu AS03以及Flu AS03对Fluarix之间的2组成对比较。 

(f)所有显著性检验都是双尾的。小于或等于0.05的P-值被认为是统计学显著的。 

VIII.3.2.CMI结果

结果表示为CD4或CD8 T细胞亚群中细胞因子阳性的CD4或CD8 T细胞的频率。 

抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率 

(a)与在实施例III中所实施的类似，针对每个接种组、每个时间点(第0天、第21天)和每种抗原(合并的、新喀里多尼亚、怀俄明和江苏)测定抗原特异性CD4 T-淋巴细胞分泌应答的频率。 

(b)通过Kruskall-Wallis检验对比3个组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。 

(c)通过Wilcoxon检验对比Flu AS03+MPL和Fluarix组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。 

(d)通过Wilcoxon检验对比Flu AS03和Fluarix组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。 

(e)通过Wilcoxon检验对比Flu和Flu AS03+MPL组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞的频率差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。 

在时间点(接种后-接种前)之间CD4T-淋巴细胞的个体差异 

(a)与已在实施例III中实施的类似，对于各5种不同细胞因子针对每个接种组和每种抗原在时间点(接种后-接种前)之间的CD4 T-淋巴细胞应答的个体差异做描述统计。 

(b)通过Kruskall-Wallis检验对比3个组之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都小于0.001，被认为是高度统计学显著的。 

(c)使用Wilcoxon检验对比Flu AS03+MPL和Fluarix之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都小于0.05，被认为是统计学显著的。 

(d)使用Wilcoxon检验对比Flu AS03和Fluarix之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都小于0.001，被认为是高度统计学显著的。 

(e)使用Wilcoxon检验对比Flu AS03+MPL和Flu AS03之间抗原特异性CD4 T-淋巴细胞应答的接种后-接种前个体差异，所有p-值都大于0.05，被认为不是统计学显著的。 

VIII.4.B细胞记忆应答目标、终点和结果 

研究的目标是研究与老年人群中的Fluarix相比，用含佐剂AS03+MPL或AS03的流感候选疫苗进行1次肌内接种时，对流感病毒抗原特异性的记忆B细胞的频率是否被显著诱导。记忆B细胞的频 率通过B细胞Elispot测定评价。 

VIII.4.1.B细胞记忆应答终点

终点是： 

(a)在第0、21天时：就百万(10⁶)个产IgG浆细胞中的特异性抗原浆细胞频率而言，在所有受试者中都通过B细胞ELISPOST检测在体外培养的记忆B细胞中产生的细胞。 

(b)在接种后(第21天)和接种前(第0天)之间的差异也表示为每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。 

VIII.4.2.B细胞记忆应答结果

测定每百万(10⁶)个抗体形成细胞中流感特异性抗体形成细胞的频率。结果表明，通过Wilcoxon检验获得的Flu AS03+MPL和Fluarix组之间流感病毒抗原特异性记忆B细胞的频率对B/江苏毒株而言显著(p＜0.05)较高，而对其它两种毒株(A毒株新喀里多尼亚和怀俄明)则不会这样。 

还测定了对流感抗原特异性的记忆B细胞在时间点(接种后-接种前)之间的个体差异。结果表明，通过Kruskall-Wallis检验获得的Flu AS03+MPL和Fluarix组之间流感病毒抗原特异性记忆B细胞频率在时间点(接种后-接种前)之间的个体差异对B/江苏毒株而言显著(p＜0.05)较高，而对其它两种毒株(A毒株新喀里多尼亚和怀俄明)不会这样。 

结果示于图18。 

实施例IX-有佐剂和无佐剂的流感疫苗在雪貂中的临床前评价(研究III) 

IX.1.基本原理和目标 

本研究对比无佐剂的(Fluarix^TM)或用AS03+MPL佐剂化的GSK商用三价裂解流感疫苗和两种其它商用亚单位疫苗： 

-Fluad^TM，Chiron有佐剂亚单位疫苗(佐剂为Chiron的MF59佐剂)， 

-Agrippal^TM，Chiron的无佐剂商用亚单位疫苗，其在本研究中用AS03佐剂做佐剂。 

本实验的目标是评价这些疫苗在用异源毒株攻击的雪貂的鼻分泌物中减轻病征(体温和病毒脱落)的能力。 

终点是： 

1)主要终点：在异源攻击后减轻鼻清洗液中的病毒脱落： 

2)次要终点：通过IHA分析体液应答，并监测初免和异源攻击前后的温度。 

IX.2.实验设计 

IX.2.1.治疗

由MISAY Consultancy(Hampshire，UK)获得14-20周龄的雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo))。雪貂在第0天用异种亚型毒株H1N1 A/斯德哥尔摩/24/90(4 Log TCID₅₀/ml)鼻内初免。在第21天，用全人剂量(1ml疫苗剂量，15μg HA/毒株)的H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2 A/怀俄明/3/2003和B/江苏/10/2003的组合肌内注射雪貂。然后在第42天通过鼻内途径用异型毒株H3N2 A/巴拿马/2007/99(4.51 Log TCID₅₀/ml)通过鼻内途径攻击雪貂。各组(6只雪貂/组)描述于表41。要实施的解读方式详述于表42。 

表41 

IX.2.2.疫苗制剂的制备

三价裂解普通(无佐剂制剂：1ml制剂： 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有375μg Tween 80、55μg TritonX-100和50μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg 每种毒株H1N1、H3N2和17.5μg B毒株，每次加入之间搅拌10分钟。制剂于室温搅拌15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

用AS03+MPL佐剂化的三价裂解制剂：1ml制剂 

将PBS 10倍浓缩液(1倍浓缩时为pH 7.4)以及含Tween 80、TritonX-100和VES的混合物(量计入毒株中存在的去污剂)加入注射用水中。达到的去污剂量如下：每1ml有375μg Tween 80、55μg TritonX-100和50μg VES。搅拌5分钟后，加入15μg每种毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之间搅拌10分钟。搅拌15分钟后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的教导制备)。再搅拌混合物15分钟，之后立即加入25μg MPL。于室温搅拌制剂15分钟，如果不立即给予的话则储存于4℃。 

FluAd^TM制剂：1ml制剂： 

在PBS缓冲液pH 7.4中配制FluAd^TM疫苗的2倍稀释液。Agrippal^TMAS03制剂：1ml制剂： 

将250μl PBS缓冲液pH 7.4加入1剂Aggripal^TM中。混合后，加入250μl SB62乳液(如在实施例II.1中的详述制备)。混合物于室温搅拌。 

IX.2.2.解读

表42 

In＝单独的/Po＝混合的 

IX.3.结果(图19-22) 

IX.3.1.温度监测

用传感器并用通过遥测记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI进行新校准。在这些检测期间所有动物都独立地圈养在单独的笼中。由攻击前2天直至攻击后4天每15分钟记录温度，由日中计算出平均温度。结果示于图19。 

结果： 

攻击后，用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)或亚单位疫苗Fluad^TM(其含MF59水包油乳液)免疫雪貂后观测到体温峰值。在用 AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗和用AS03佐剂化的亚单位Agrippal^TM免疫雪貂后均未观测到峰值。总之，对于裂解和亚单位测试疫苗，均显示出含AS03的疫苗在攻击后防止体温升高的附加价值，与含MF59的疫苗于攻击后不能在雪貂中防止此体温升高相反。 

IX.3.2.病毒脱落

对每组6只动物进行鼻清洗物的病毒滴定。通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集在培养皿中，并置于干冰(-80℃)上的样品容器中。 

所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×10⁵ 个细胞/ml)加入每个孔，并于35℃温育5-7天。在5-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20 WST-1的培养基，再温育18小时。 

在存活细胞还原WST-1时产生的黄色甲腊染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的存活细胞数成比例，并通过在合适波长(450 nm)检测各孔的吸光度定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3 OD(0.3 OD相当于未感染对照细胞OD±3个标准偏差)。OD<截取值时定义为阳性得分，相反，OD>截取值时定义为阴性得分。病毒脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID₅₀/ml。 

结果： 

结果示于图20。与用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)或Fluad^TM亚单位疫苗免疫雪貂后观察到的非常低的病毒脱落减少相比，用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或用AS03佐剂化的Agrippal^TM亚单位疫苗攻击后观察到较低的病毒脱落。 

与针对体温升高所讨论的相类似，相比于含MF59的疫苗观察到含AS03疫苗的附加价值。 

IX.3.3.HI滴度

使用血凝反应抑制测试(HI)测定针对H3N2流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI测试的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制小鸡红细胞(RBC)的血凝反应的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理并热失活，以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后加入小鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不可检测水平记录为等于5的滴度。 

结果： 

在用H3N2 A/怀俄明免疫后，与用无佐剂(普通)三价裂解疫苗(Fluarix^TM)或Fluad^TM亚单位疫苗免疫雪貂后观察到的体液应答相比，在用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或AS03佐剂化的Agrippal^TM 亚单位疫苗免疫的雪貂中观测到较高的体液应答(HI滴度)(图21)。 

在用H3N2 A/怀俄明免疫后，与用三价裂解普通疫苗或Fluad免疫的雪貂相比，在用AS03+MPL佐剂化的三价裂解疫苗或AS03佐剂化的Agrippal^TM免疫的雪貂中，还观测到针对用做攻击株的漂移株H3N2 A/巴拿马的较高体液应答(HI滴度)(图22)。 

用我们的佐剂(AS03或AS03+MPL)观测到的针对异源毒株的此交叉反应与用AS03+MPL佐剂化三价裂解疫苗或AS03佐剂化Agrippal^TM亚单位疫苗免疫并随后用此异源毒株攻击的雪貂中观测到的保护作用相关联。由含AS03的疫苗诱导的针对异源毒株的此交叉反应性不由MF59佐剂化的疫苗(FIuAd^TM)诱导。 

实施例X-用含裂解流感抗原制备物和有或无MPL佐剂的AS03的 疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验：在第90天和180天的免疫原性持久性数据 

X.1.研究设计 

于65岁以上(≥65岁)的老年人群中进行开放、随机、可控的I期研究，以便评价与FluarixTM疫苗相比(在比利时称为α-Rix^TM)，肌内给予的含佐剂AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性。该研究遵循在实施例VIII中报告的研究。 

评价三个平行组： 

·1组50名受试者接受1剂重配和AS03佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03) 

·1组50名受试者接受1剂重配和Flu AS03+MPL佐剂化的SV流感疫苗(Flu AS03+MPL) 

·1个对照组50名受试者接受1剂Fluarix^TM(Fluarix) 

X.2.免疫原性结果 

X.2.1.体液免疫应答终点和结果

为了评价由AS03和AS03+MPL佐剂化的疫苗诱导的体液免疫应答及其持久性，对各个治疗组计算以下参数。 

在第0、21、90和180天：针对在疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种单独测试的血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗体)。 

·在第0、21、90和180天具有95％CI的血清HI抗体GMT 

·在第21、90和180天具有95％CI的血清阳转率 

·在第21天具有95％CI的转变因子 

·在第0、21、90和180天具有95％CI的血清保护率 

结果 

具有95％CI的HI抗体的GMT示于图23。3个组中针对全部3 种疫苗株的抗体的接种前GMT处于相同范围内。在接种后，抗血细胞凝集素抗体水平显著增加。但是，接种后针对3种疫苗株的抗体的接种后GMT对所有疫苗而言都仍在相同的范围内。在第21天，对于A/新喀里多尼亚和B/江苏毒株来说，观察到和Fluarix相比有利于2种有佐剂疫苗的轻微趋势，在两种有佐剂疫苗中，用FLU AS03观察到针对A/怀俄明和B/江苏毒株的较高GMT。 

在第90天观察到相同的趋势。在第180天，对3种疫苗来说，针对3种疫苗株的抗体GMT在相同范围内。 

在60岁以上的受试者中，所有流感疫苗都满足欧洲官方对每年注册的流感失活疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。 

在接种后3个月(90天)和6个月(180天)，无论哪个所考察的研究组，血清保护率都仍高于欧洲官方要求的最低60％的保护率。在第90天，在3个疫苗组中对所有疫苗株都仍达到欧洲官方要求的30％的最低血清阳转率，Fluarix的A/新喀里多尼亚株除外。在第180天，用3种疫苗对A/怀俄明和B/江苏株仍可达到该血清阳转率，但对A/新喀里多尼亚株不行(表43和表44)。 

表43以血清血凝反应抑制滴度优于或等于1∶40的接种者百分率表示的血清保护率(免疫原性的ATP人群) 

N＝结果可用的受试者数目 

n/％＝滴度在特定范围内的受试者的数目/百分率 

PRE＝接种前滴度 

PI(D21)＝在第21天采接种后血样 

PI(D90)＝在第90天采接种后血样 

PI(D180)＝在第180天采接种后血样 

表44代表血凝反应抑制(HI)抗体滴度的血清阳转率，定义为相比于第0天在各个接种后时间点的血清HI滴度具有至少达4倍增加的接种者百分率(免疫原性的ATP人群) 

N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目 

n/％＝具有至少4倍增加的受试者数目/百分率 

95％CI＝精确的95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限 

X.2.2.CMI应答终点和结果

为了评价由有佐剂疫苗诱导的细胞免疫应答及其持久性，对每个治疗组计算以下参数： 

在各个时间点(第0、21、90和180天)：在不同测试中每10⁶个细胞中细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率(在第0天和21天单独考 察的以及合并的新喀里多尼亚、怀俄明和江苏抗原；在第90天和180天单独考察的以及合并的新喀里多尼亚、怀俄明、江苏和纽约抗原)。 

·All double：产生至少两种不同细胞因子的细胞(CD40L、IFN-γ、IL-2、TNF-α)。 

·CD40L：产生至少CD40L和另一种细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α)的细胞。 

·IFN-γ：产生至少IFN-γ和另一种细胞因子(CD40L、IL-2、TNF-α)的细胞。 

·IL-2：产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、IFN-γ、TNF-α)的细胞。 

·TNF-α：产生至少TNF-α和另一种细胞因子(CD40L、IFN-γ、IL-2)的细胞。 

结果 

主要发现是(图24)： 

(a)接种后21天，相比于Fluarix组，在2个有佐剂疫苗组中细胞因子阳性的CD4 T细胞(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)的频率显著较高。但是，在两种佐剂之间没有显著差异。 

(b)有佐剂疫苗和Fluarix之间的所有统计差异保持至第90天和第180天，在第180天以下几项除外： 

·对于All double、CD40L、IFN-γ和IL2(仅怀俄明株)和对于Alldouble、CD40L和TNF-α(仅纽约株)，在FluAS03/MPL和Fluarix之间没有统计学显著差异， 

·对于IL2(仅江苏株)，在FluAS03和Fluarix之间没有统计学显著差异 

(c)至第90天和第180天，证实在两种有佐剂的疫苗之间没有统计学显著的差异。 

(d)对于两种有佐剂的疫苗，接种前和接种后(第21天)之间针对 所研究的所有细胞因子(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)的CD4 T-淋巴细胞应答的差异显著高于Fluarix^TM。但是，在两种佐剂之间没有检测到显著差异。 

(e)接种对CD8应答没有可检测的影响，无论哪一个治疗组。实施例XI-用含裂解流感抗原制备物以及AS03和MPL佐剂的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验 

XI.1.研究设计和目标 

在65岁以上(＞65岁)老年人群中进行开放、可控的I/II期研究，以便评价含AS03+MPL佐剂的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的反应原性和免疫原性，所述老年人群先前于2004年用相同候选疫苗接种。为进行免疫原性和安全性评价，Fluarix^TM疫苗(在比利时称为α-Rix^TM)用作参比。 

评价2个平行组： 

·1组约50名受试者，他们先前已在预先的临床实验中接受了1剂重配的有佐剂流感疫苗 

·1个对照组(Fluarix)约50名受试者，他们在先前的临床实验当中已预先接受了1剂Fluarix 

此研究的1个目标是评价在首次施药后约1年给予有佐剂流感疫苗Flu AS03+MPL进行的再接种的体液免疫应答(抗血细胞凝集素和抗-MPL滴度)。为比较目的，已在先前实验中接受Fluarix^TM的受试者接受1剂商用疫苗，并构成该实验的对照组。 

XI.2.疫苗组成和给予 

在3种疫苗中使用的毒株是由已WHO推荐用于2005-2006北半球流感季的毒株，即A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亚/7/2004(H3N2)和B/江苏/10/2003。同Fluarix^TM/α-Rix^TM一样，商用疫苗用作对比物，AS03+MPL佐剂化的疫苗(后文简称为“有佐剂疫 苗”)每剂含每种流感病毒株的15μg血细胞凝集素(HA)。 

有佐剂的流感候选疫苗是一种2组分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的浓缩3价失活裂解病毒体抗原和含AS03+MPL佐剂的预填充I型玻璃注射器组成。它们已按照实施例II中详述的方法制备。 

在注射时，将含佐剂的预填充注射器的内容物注入含浓缩三价失活裂解病毒体抗原的瓶中。在混合后将内容物吸入到注射器中，针用肌内针替换。1剂重配的有佐剂流感候选疫苗相当于0.7ml。有佐剂流感候选疫苗是无防腐剂的疫苗。 

1剂重配的有佐剂流感疫苗的组成在表45中给出。两种疫苗都肌内给予。 

表45重配有佐剂(AS03+MPL)流感候选疫苗的组成 

XI.3.免疫原性结果 

XI.3.1.抗-HA体液免疫应答终点和结果

观测变量： 

在0天和21天：血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度，分别对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B- 抗体)。 

衍生变量(具有95％置信区间)： 

(f)接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMT) 

(g)21天时具有95％CI的血清阳转率^*

(h)21天时具有95％CI的血清转变因子^**

(i)21天时具有95％CI的血清保护率^***

^*血清阳转率定义为针对每种疫苗株的接种前HI滴度＜1∶10且接种后滴度≥1∶40的接种者百分率，或接种前滴度≥1∶10且接种后滴度增加至最少4倍的接种者百分率。 

^**血清转变因子定义为相比于第0天在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。 

^***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株的)血清HI滴度≥40的接种者百分率，通常将该百分率看作指示保护作用。 

结果 

正如所料，在接种前2个组中的大部分受试者对3种毒株已经是血清阳性的。针对全部3种疫苗株的接种前GMT在2个组中处于相同范围内。相比于Fluarix组，在Flu AS03+MPL组中针对全部3种疫苗株的接种后GMT有较高的趋势，尽管95％CI是重叠的(图25)。 

在60岁以上的受试者中，2种流感疫苗满足欧洲官方对每年注册的流感失活疫苗的要求[关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)](表46)。 

表46在第21天时的血清保护率、血清阳转率和转变因子(免疫原性的ATP人群) 

N＝受试者总数；％＝在第21天时滴度处于特定范围内的受试者百分率；CI＝置信区间 

实施例XII-用含裂解流感抗原制备物、以两个不同浓度的AS03和MPL有佐剂的疫苗在65岁以上老年人群中进行的临床实验 

XII.1.研究设计和目标 

与在成人(18-40岁)中给予的Fluarix^TM(在比利时称为α-Rix^TM)相比，对在老年人群(65岁及以上)中给予的含各种佐剂的GlaxoSmithKline Biologicals流感候选疫苗的细胞介导免疫应答来说，开放、随机的I/II期研究表现出非劣效性。 

评价4个平行组： 

(a)在一个对照组中的75名成人(18-40岁)接受1剂Fluarix^TM (Fluarix组) 

(b)200名老年受试者(65岁及以上)按照3∶3∶2随机分为3组： 

-一组75名受试者，他们接受以AS03+MPL佐剂化的流感疫苗(浓度1-25μg) 

-一组75名受试者，他们接受以AS03+MPL佐剂化的流感疫苗(浓度2-50μg) 

-具有50名受试者的参比Flu组，他们接受1剂Fluarix^TM

首要目标 

首要目标是就产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、TNF-α、IFN-γ)的流感特异性CD4 T-淋巴细胞的频率而言，与在成人(18-40岁)中给予的Fluarix^TM相比，在老年受试者(65岁或以上)中给予的有佐剂流感疫苗在接种后21天表现出非劣效性。 

次要目标 

次要目标是 

(a)评价在老年人(65岁及以上)中肌内给予疫苗后的21天当中用有佐剂候选流感疫苗接种的安全性和反应原性。Fluarix^TM用作参比。 

(b)评价用有佐剂流感候选疫苗接种后21、90和180天的体液免疫应答(抗血细胞凝集素滴度)。Fluarix^TM用作参比。 

第三目标 

第三目标是评价用有佐剂流感疫苗接种后21、90和180天的细胞介导的免疫应答(产生IFN-γ、IL-2、CD40L和TNF-α以及记忆B-细胞应答)。Fluarix^TM用做参比。 

XII.2.疫苗组成和给予 

用AS03+MPL(每剂25μg)系统佐剂化的流感疫苗也用于在实施例XI中阐述的研究。用AS03+MPL(每剂50μg)系统佐剂化的流感疫苗具有相同组成，只是MPL浓度加倍。方法与实施例VIII中针对AS03+MPL佐剂化的流感疫苗描述的方法相同，唯一的区别是MPL浓度加倍。 

对照：全剂量Fluarix^TM，通过IM给予。 

每名受试者进行4次预定随访：于0、21、90和180天的每次随访时收集血样，以评价免疫原性。 

接种程序：在第0天进行1次流感疫苗注射。 

XII.3.免疫原性结果 

XII.3.1.CMI终点和结果

评价的主要终点 

在第21天：在产生至少两种不同细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和CD40L)的测试中，依据每10⁶个细胞中流感特异性CD4 T-淋巴细胞频率的所有受试者的CMI应答 

为评价CMI应答，如下分析流感特异性CD4的频率： 

使用涉及对数变换滴度的ANCOVA模型获得依据有佐剂疫苗和Flu YNG接种的组之间流感特异性CD4频率的GM比率。ANCOVA模型包括作为固定效果的疫苗组和作为回归量的接种前对数变换滴度。GM比率及其98.75％CI来源于模型中相反的对应组的指数变换。调整的GM的98.75％CI通过以上ANCOVA模型的组最小平方法的98.75％CI的指数变换获得。 

结果-推理分析(表47)

在用“合并的抗原II”体外再刺激后，于第21天产生至少两种细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和CD40L)的流感特异性CD4 T-淋巴细胞的调整后GM和GM比率(及其98.75％CI)示于表47。对于每种有佐剂流感疫苗，GM比率的双侧98.75％CI的上限远低于2.0的临床限度。这表明了相比于在18-40岁的成人中给予的Fluarix^TM疫苗给予给老年受试者的两种有佐剂流感疫苗就流感特异性CD40的接种后频率而言的非劣效性。 

表47第21天产生至少两种细胞因子的流感特异性CD4的调整的GM比率(免疫原性的ATP人群) 

调整的GM＝根据基线滴度调整的几何平均抗体；N＝接种前和接种后结果可用的受试者数目；98.8％CI＝调整的GM比率的98.8％置信区间(Ancova模型：对基线调整)；LL＝上限；UL＝下限。 

结果-描述分析(图26)

主要发现是： 

·接种前CMI应答如果在年轻人中比在老年人中高 

·接种后， 

○流感疫苗对年轻成人(18-40岁)中的CMI应答有加强作用 

○在已接受有佐剂流感疫苗的老年人中的CMI应答与年轻成人中的CMI应答相当。 

·当我们对比Fluarix(18-40岁)和FlU/AS03+MPL(浓度1)时，除了IFNγ之外，对于所有测试，与Fluarix^TM(18-40岁)相比，接种前和接种后之间针对所研究的所有细胞因子(IL-2、CD40L、TNF-α和IFN-γ)的CD4 T淋巴细胞应答的差异在采用有佐剂疫苗时都显著较 高。 

应当指出的是，体外刺激用Flu株(i)B/江苏，(ii)A/H3N2/纽约和(iii)A/H3N2/怀俄明进行，而不是包含在疫苗中的A/H1N1/新喀里多尼亚。但是，包含来自一部分受试者的A/H1N1/新喀里多尼亚疫苗株的初步数据表明结果是相似的。 

结果-评价第三终点(表48)

为了评价第三终点，在第0、21、90和180天检测流感特异性CD4/CD8 T-淋巴细胞和记忆B细胞的频率。 

总结了对于每种抗原、每个疫苗组在第0和21天的流感特异性细胞因子阳性的CD4/CD8 T-淋巴细胞的频率(描述统计)。 

非参数检验(Wilcoxon检验)用于对比两个组之间的局部差异(有佐剂流感疫苗对Fluarix^TM)，计算在各个测试中针对每种抗原的统计学p-值。在各个测试中针对每个接种组和每种抗原计算21天/0天(接种后/接种前)之间的应答个体差异的描述统计。 

非参数检验(Wilcoxon检验)用于对比个体差异(接种后/接种前接种)，计算每个不同检验中每种抗原的统计学p-值。 

用于对比流感特异性CD4 T-淋巴细胞频率差异的Wilcoxon检验的p-值示于表48。 

表48推理统计：来自Kruskal-Wallis检验的CD4 T细胞在各个时间点的p-值(免疫原性的ATP人群) 

组1：用AS03+MPL佐剂化的流感疫苗(浓度1) 

组2：用AS03+MPL佐剂化的流感疫苗(浓度2) 

主要结论是： 

(a)流感特异性CD4的接种前GM频率在所有老年受试者组中都是相似的，但在18-40岁的成人中较优。 

(b)在用有佐剂疫苗接种的老年受试者中和在Fluarix^TM接种的18-40岁成人中，流感特异性CD4 T淋巴细胞的接种后(第21天)频率是相似的。 

(c)与Fluarix^TM相比，在用有佐剂疫苗接种后，老年受试者中流感特异性CD4 T淋巴细胞的接种后(第21天)频率显著较高。 

(d)流感特异性CD8 T细胞的接种前和接种后GM频率在所有组中都基本相似。 

结果-评价体液免疫应答终点

观测变量： 

在第0、21、90和180天：血清血凝反应抑制(HI)抗体滴度，针对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种单独测试(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B抗体)。 

抗所有疫苗抗原的HI抗体的截取值在分析前由实验室确定(等于1∶10)。血清阴性受试者是其抗体滴度低于截取值的受试者。血清阳性受试者是其抗体滴度大于或等于截取值的受试者。低于测定截取值的抗体滴度以一半截取值的任何值给出。 

基于HI抗体滴度，计算以下参数： 

(j)在第0天和21天的HI抗体的几何平均滴度(GMT)，采用对数滴度转换平均值的反对数计算 

(k)第21天时的血清转变因子(SF)，定义为相比于第0天在第21天时血清HI GMT的增加倍数。 

(I)第21天时的血清阳转率(SC)，定义为接种前HI滴度＜1∶10且接种后滴度≥1∶40的接种者百分率，或接种前滴度≥1∶10且接种 后滴度有最少达4倍增加的接种者百分率。 

(m)第21天时的血清保护率(SPR)，定义为血清HI滴度≥1∶40的接种者的百分率。 

分别获得每个组的GM的95％CI。假定对数转换滴度以未知方差正态分布，首先获得对数转换滴度平均值的95％CI。然后通过对数转换滴度平均值的95％CI的指数转换获得GM的95％CI。 

具体抗体检测的缺失的血清学结果不被替换。因此，在给定时间点无血清学结果的受试者不影响该时间点的测定分析。     

体液免疫应答结果(图27和表49) 

全部3种疫苗株的HI抗体的接种前GMT在4个治疗组中都处于相同范围内。在接种后，相比于相同群体中的标准Fluarix，增加老年人中的体液应答的2种佐剂有明显的作用。 

GMT是 

·对于AS03+MPL(浓度2)，针对H1N1的GMT显著较高， 

·对于两种佐剂，针对H3N2和B的GMT显著较高， 

接种后21天，Fluarix(18-40岁)受试者对新喀里多尼亚和B/江苏株的HI应答较高。 

如表49所示，在60岁以上的受试者中，有佐剂流感疫苗超出了欧洲官方对每年注册的裂解病毒体流感疫苗的要求[“关于用于免疫学评价年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。 

在接种后，就HI抗体的血清保护率而言，Fluarix(≥65岁)组和以下组具有统计学差异： 

·Flu AS03+MPL(浓度2)，对于A/新喀里多尼亚株 

对于各个疫苗株，2种有佐剂流感疫苗组的血清保护率相比于Fluarix(18-40岁)组处于相同范围内。 

就HI抗体的阳转率而言，Fluarix(≥65岁)组和以下组具有统计 学差异： 

·Flu AS03+MPL(浓度2)，对于A/新喀里多尼亚株 

·Flu AS03+MPL(浓度1)，对于B/江苏株 

对于各个疫苗株，2种有佐剂流感疫苗组的阳转率相比于Fluarix(18-40岁)组处于相同范围内，新喀里多尼亚株除外。 

表49在第21天的血清保护率、阳转率和转变因子(免疫原性的ATP人群) 

N＝受试者总数；％＝在21天时滴度处于特定范围内的受试者百分率；CI＝置信区间 

XII.3.2.免疫原性结论

(a)相比于18-40岁的成人，老年人中的流感特异性CD4的接种前频率明显较差。在用Fluarix^TM接种后，相比于年轻人，老年人中的接种后频率(第21天)仍较差。相反，相比于在18-40岁成人中用Fluarix^TM接种，在用有佐剂疫苗接种老年受试者后表现出流感特异性CD4的接种后频率的非劣效性。 

(b)关于依据HI抗体滴度的体液免疫应答，所有流感疫苗都满足欧洲官方对每年注册的流感失活疫苗的要求[“关于用于免疫学评价 年度毒株变化的协调流感疫苗要求的指引说明”(CPMP/BWP/214/96)]。在老年人中，有佐剂疫苗介导至少一种趋势：针对流感血细胞凝集素的体液免疫应答比Fluarix^TM高。表50总结了相比于Fluarix^TM在老年受试者中由有佐剂疫苗介导的针对每种疫苗株的体液免疫应答之间的差显著异。相比于用Fluarix^TM接种的18-40岁成人，用有佐剂疫苗接种的老年受试者显示出一种趋势：在第21天时抗A/纽约株的接种后GMT和血清转变因子较高。 

表50在老年受试者中有佐剂疫苗和Fluarix之间体液免疫应答的显著差异 

XII.4.反应原性结果 

XII.4.1.不良事件(AE)的记录

记录在7天随访期(接种日和随后的6天)当中出现的诉求症状(参见表51)。还记录了在21天随访期(接种日和随后的20+3天)当中出现的主动诉求症状。如在表52中所述评价以下AE的强度。 

表51诉求的局部/全身不良事件 

注意：温度在晚上记录。在一天中的其它时间应另外进行温度检测，记录最高温度。 

表52成人中诉求症状的强度等级 

^*发热定义为腋下体温≥37.5℃(99.5

) 

局部注射部位发红/肿胀的最大强度如下记录： 

0是0mm；1是＞0至≤20mm；2是＞20至≤50mm；3是＞50 mm。 

如下记录发热的最大强度： 

1是＞37.5至≤38.0℃；2是＞38.0至≤39.0℃；3是＞39.0℃。 

研究者针对所有其它AE进行强度判断，其它AE即主动诉求的症状，包括在研究当中报告的SAE。评价基于研究者的临床判断。记录的每种AE的强度分配为以下的一种类别： 

1(轻微)＝受试者容易耐受的AE，引起最低的不适，且不干扰日常的活动； 

2(中等)＝不适足以干扰每日正常活动的AE； 

3(严重)＝阻碍每日正常活动的AE(在成人/青少年中，这种AE例如会阻碍工作/上学，应必须给予正确的治疗)。 

XII.4.2.记录不良事件(AE)

就局部和全身症状这二者来说，发现采用有佐剂疫苗在老年受试者中观察到的反应原性比相同群体中用Fluarix^TM观察到的高。但是，其显示出与成人群体中观察到的水平相似。相比于用Fluarix^TM 在老年受试者中观察到的反应原性相比，症状的发病率和强度在用有佐剂疫苗接种后增加(图28)。在所有情况下，症状都快速消退。 

3级症状表现出一种趋势：与接受有佐剂疫苗(其中MPL为较低浓度)的组别相比，接受最高MPL浓度有佐剂的疫苗的组别较高。但是，在所有情况下，症状都快速消退。 

Claims (39)

1.(a)流感病毒或其抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于在人中诱导抗所述病毒或抗原性组合物的以下至少一种：i)改善的CD4T-细胞免疫应答，ii)改善的B-记忆细胞应答，其中所述水包油乳液包含鲨烯、α-生育酚和Tween 80，所述流感病毒或其抗原性制备物包含CD4T-细胞表位或B细胞表位或两者。

2.流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于接种老年人对抗流感，其中所述水包油乳液包含鲨烯、α-生育酚和Tween 80，所述流感病毒或其抗原性制备物包含CD4T-细胞表位或B细胞表位或两者。

3.权利要求2的用途，其中所述组合物在所述老年受试者中诱导抗所述病毒或抗原性组合物的改善的CD4T-细胞免疫应答。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少70％以强度计直径低于1μm。

5.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少70％以强度计直径低于500nm。

6.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少80％以强度计直径低于300nm。

7.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少90％以强度计直径在120-200nm的范围内。

8.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述α-生育酚以所述免疫原性组合物总体积的1.0％至20％的量存在。

9.权利要求8的用途，其中所述α-生育酚以所述免疫原性组合物总体积的1.0％至5.0％的量存在。

10.权利要求1-3中任一项的用途，其中鲨烯以所述免疫原性组合物总体积的0.5％至20％的量存在。

11.权利要求10的用途，其中鲨烯以所述免疫原性组合物总体积的1.0％至10％的量存在。

12.权利要求11的用途，其中鲨烯以所述免疫原性组合物总体积的2.0％至6.0％的量存在。

13.权利要求1-3中任一项的用途，其中鲨烯∶α-生育酚的比例等于或低于1。

14.权利要求1-3中任一项的用途，其中Tween 80以所述免疫原性组合物的0.01％至5.0％重量(重量/重量)的量存在。

15.权利要求14的用途，其中Tween 80以所述免疫原性组合物的0.1％至2.0％重量(重量/重量)的量存在。

16.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述水包油乳液佐剂具有以下组成：2-10％重量的鲨烯、2-10％重量的α-生育酚和0.3-3％重量的Tween 80。

17.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物还包含3D-MPL。

18.权利要求17的用途，其中3D-MPL以每剂组合物10-50μg的量存在。

19.权利要求18的用途，其中3D-MPL以每剂组合物25μg的量存在。

20.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物的给予额外地诱导改善的CD4T-细胞免疫应答和改善的B-记忆细胞应答二者。

21.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述CD4T-细胞免疫应答包括诱导交叉反应性CD4T辅助应答。

22.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述目标群体为50岁以上。

23.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述目标群体为65岁以上的老年人。

24.流感病毒或其抗原性制备物在生产免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再接种先前用流感病毒或其抗原性制备物和水包油乳液佐剂接种的人，所述水包油乳液佐剂包含鲨烯、α-生育酚和Tween 80，所述流感病毒或其抗原性制备物包含CD4T-细胞表位或B细胞表位或两者。

25.权利要求24的用途，其中所述用于再接种的组合物包含3D-MPL。

26.权利要求24-25中任一项的用途，其中所述水包油乳液佐剂如权利要求1、2和4-18中任一项的定义。

27.权利要求24-25中任一项的用途，其中所述用于再接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制备物，所述流感病毒或其抗原性制备物与用于第一次接种的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制备物共有以下至少一种：i)共同的CD4T-细胞表位，ii)共同的B细胞表位。

28.权利要求24-25中任一项的用途，其中再接种后的免疫应答是以下的任何一种或两种或全部：抗流感病毒或其抗原性制备物的改善的CD4应答，或改善的体液应答或改善的B细胞记忆应答。

29.(a)流感病毒或其抗原性制备物和(b)水包油乳液佐剂在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于对抗作为所述流感病毒漂移变体的流感病毒引起的流感感染的保护作用，其中所述水包油乳液包含鲨烯、α-生育酚和Tween 80，所述流感病毒或其抗原性制备物包含CD4T-细胞表位或B细胞表位或两者。

30.权利要求1、2、24和29中任一项的用途，其中所述流感病毒或其抗原性制备物是单价的、二价的或三价的。

31.权利要求30的用途，其中所述流感病毒或其抗原性制备物来自三种不同的流感株。

32.权利要求31的用途，其中至少一种毒株与大流行爆发相关，或者具有与大流行爆发相关的潜力。

33.权利要求32的用途，其中所述大流行毒株选自：H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。

34.权利要求24的用途，其中第一次接种用含可潜在地引起大流行爆发的流感株的裂解流感组合物进行，所述再接种用循环大流行毒株进行。

35.权利要求1、2、24和29中任一项的用途，其中所述免疫原性组合物包含少于15μg的HA抗原。

36.权利要求1、2、24和29中任一项的用途，其中所述流感抗原或其抗原性制备物是卵源的或组织培养源的。

37.一种设计疫苗的方法，所述疫苗针对已知要通过CD4+T细胞活化治愈或治疗的流感疾病，所述方法包括：

1)选择含CD4+表位的流感病毒抗原，和

2)组合所述抗原和在权利要求1、2、4-16中任一项定义的水包油乳液佐剂，其中所述疫苗在给予所述哺乳动物时能够在所述哺乳动物中诱导抗流感病毒或其抗原性制备物的增强的CD4应答。

38.权利要求1、2、24、29和37中任一项的用途，其中所述流感病毒选自：裂解流感病毒、全流感病毒、亚单位流感病毒、流感病毒颗粒及其抗原性制备物。

39.权利要求38的用途，其中所述流感病毒是裂解流感病毒抗原或其抗原制备物。

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