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CN105828835A - 避免流感疫苗中的发作性嗜睡病风险 - Google Patents

避免流感疫苗中的发作性嗜睡病风险 Download PDF

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CN105828835A CN201480039584.1A CN201480039584A CN105828835A CN 105828835 A CN105828835 A CN 105828835A CN 201480039584 A CN201480039584 A CN 201480039584A CN 105828835 A CN105828835 A CN 105828835A
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Abstract

本发明提供了流感疫苗和改进流感疫苗的安全性的方法，进一步具体涉及佐剂化疫苗中导致发作性嗜睡病的风险。

Description

避免流感疫苗中的发作性嗜睡病风险
本申请要求美国临时申请61/822,228(2013年5月10日提交)、61/859,113(2013年7月26日提交)和61/862,807(2013年8月6日提交)和欧洲专利申请13181429.5(2013年8月23日提交)和14158999.4(2014年3月11日提交)的权益，其完整内容各自通过引用纳入本文用于所有目的。
技术领域
本发明的技术领域是提供流感疫苗和用于生成流感疫苗的方法，其中还降低了疫苗接受者中发作性嗜睡病的风险。
背景技术
在2009年抗战H1N1猪流感疫苗后，芬兰的国家健康和福利研究所(NationalInstituteofHealthandWelfare)在4-19岁的儿童和青少年中检测到与使用AS03佐剂化H1N1疫苗(PandemrixTM，GSK生物公司(GSKBiologicals))与发作性嗜睡病之间的流行病学相关性[1-3]。发作性嗜睡病的发生率是在接种疫苗的群体中9/100000，与之相比在未接种疫苗的个体中是0.7/100000，比率为12.7，其大约在接种疫苗后2个月发生[4]。随后，在法国、爱尔兰、挪威、瑞典和大不列颠存在关于AS03佐剂化H1N1疫苗的类似报道。从2011年起，芬兰的详细后续研究进一步强化了初始关联[5]。因此，清楚地显示了PandemrixTM与发作性嗜睡病之间的统计学关联。有趣的是，在接受FocetriaTM疫苗的患者中没有观察到发作性嗜睡病发生率的上升，所述FocetriaTM疫苗针对同一H1N1流感毒株进行保护但包含不同的水包油乳液佐剂。
虽然对流感疫苗产生应答而发生发作性嗜睡病的风险非常小，但仍需要进一步降低发作性嗜睡病的风险。
发明内容
本发明因此提供了降低患者对流感疫苗产生应答而发生发作性嗜睡病的可能性的方法和疫苗。
PandemrixTM和FocetriaTM具有不同的水包油乳液佐剂的事实导致以下广泛传播的假论：佐剂可能与发作性嗜睡病的发展有关。然而，发明人出乎意料的发现，该诱因却可能是两种疫苗中不同的核蛋白，其在PandemrixTM中可模拟食欲素受体(参见图1)。发作性嗜睡病易于生成食欲素(也称作下丘脑分泌素)的神经元损失相关。此外，所有PandemrixTM诱导的发作性嗜睡病病例都发现于携带HLADQB1*0602单倍型(一种MHCII型受体β链蛋白：UniProtKB/Swiss-Prot:P01920.2)的患者中，且这类个体特别可能发生发作性嗜睡病(该单倍型发生于超过85％的诊断患有具有猝倒的发作性嗜睡病的患者中和50％的患有较不严重的发作性嗜睡病形式的患者中)。因此，不受理论的限制，发明人提出，观察到的发作性嗜睡病的增加可能由包含HLADQB1*0602的MHCII型受体结合流感病毒的NP蛋白或其片段导致，其可触发自身免疫反应，导致破坏下丘脑分泌素信号的传递和/或通过表达食欲素受体的细胞的损失，继而导致发作性嗜睡病。为支持这一理论，本文中提供的数据显示，衍生自PandemrixTM疫苗中发现的核蛋白变体的某些肽显示与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体之间的稳定结合，而来自另一核蛋白的相应肽不显示。相反地，这些相同的肽与另一HLA亚型的结合更不稳定，所述另一HLA亚型未与发作性嗜睡病相关。
本发明因此提供了进一步降低包含核蛋白的疫苗涉及发作性嗜睡病的发展的可能性的方法和疫苗。
一种方法是选择与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体不发生结合或具有减少的结合的甲型流感核蛋白。所得疫苗组合物将因此缺少显示与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体显著结合的核蛋白，从而降低在易感个体中触发发作性嗜睡病发展的风险。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-118的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如组合物中的所有甲型流感核蛋白都包含或衍生自SEQIDNO:12所示序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。在具体的实施方式中，所述核蛋白的片段对应于SEQIDNO:2的氨基酸106-126。
其中组合物中的所有(甲型流感)核蛋白都包含或衍生自SEQIDNO:12所示序列的已知疫苗组合物的一个示例是FocetriaTM，其因此被特别排除。
在一个相关方面中，本发明提供了一种包含一种或多种甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白均不包含下述等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的片段，所述片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性等于或高于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如组合物中的所有甲型流感核蛋白都包含或衍生自SEQIDNO:12所示序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。在具体的实施方式中，所述核蛋白均不包含下述等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的片段，所述片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性比具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽高一半、三分之一或四分之一。
在另一个相关方面中，本发明还提供了一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如组合物中的所述核蛋白包含或衍生自SEQIDNO:12所示氨基酸序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。在具体的实施方式中，不是组合物中的所有甲型流感核蛋白都包含或衍生自SEQIDNO:12所示序列。
在一个相关的实施方式中，并非组合物中的所有甲型流感核蛋白均包含SEQIDNO:3所示序列。
上述多个方面和实施方式中提及的术语“衍生自”表示可由于例如蛋白质降解而存在较短的片段。
发明人鉴定得到，涉及甲型流感病毒与HLADQB1*0602结合的可能的关键序列是对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处的异亮氨酸残基。因此，需要在疫苗生产期间使用该位置处缺少异亮氨酸的甲型流感核蛋白。
因此，本发明还提供了一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸残基，前提是如果组合物中的所有核蛋白都包含SEQIDNO:12所示序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。
在一个相关实施方式中，本发明涉及一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸或甲硫氨酸残基。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白不包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:12所示序列。该核蛋白还优选不包含SEQIDNO:13所示序列。在一个相关实施方式中，所述核蛋白不包含SEQIDNO:3所示序列。在另一个相关实施方式中，所述核蛋白不包含SEQIDNO:10所示序列。
应注意，在所有上述实施方式中，提及甲型流感病毒核蛋白表示组合物中存在的基本所有或所有甲型流感病毒核蛋白，无论该核蛋白是来自单个还是多个来源。“基本所有”通常表示组合物所基于的来自甲型流感毒株的核蛋白应符合本发明所述要求但可以存在少量来自其他来源的核蛋白。因此，“基本所有”通常表示组合物中存在的至少99％的甲型流感病毒核蛋白。
因此，例如，表达本发明的第一方面的其他方式：
(i)一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，对于组合物中存在的所有甲型流感病毒核蛋白，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如组合物中的所有甲型流感病毒核蛋白都包含或衍生自SEQIDNO:12所示氨基酸序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。
(ii)一种包含来自单个或多个来源的甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如组合物中的所有甲型流感病毒核蛋白都包含或衍生自SEQIDNO:12所示氨基酸序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。(ii)一种包含来自单个或多个来源的甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白包含等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的所述核蛋白的片段，且存在于组合物中的所有所述甲型流感病毒核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性都低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如组合物中的所有核蛋白都包含SEQIDNO:12所示氨基酸序列，则该疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。
基于本发明所示发现结果，本领域技术人员能够获取现有或新鉴定的核蛋白序列并对其进行修饰，使得与未修饰的核蛋白相比，所得核蛋白与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合降低或没有结合。
因此，本发明还提供了一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，该核蛋白经修饰从而与未修饰的核蛋白相比降低或消除其与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合。
在一个优选的实施方式中，该核蛋白经修饰以改变或删除对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置处的异亮氨酸残基。在一个替代性实施方式中，该核蛋白经修饰以改变或删除一个或多个氨基酸，使得(a)在对应于SEQIDNO:2的氨基酸108的位置中不存在脂族氨基酸；和/或(b)在对应于SEQIDNO:2的氨基酸110的位置中不存在脂族氨基酸；和/或(c)在对应于SEQIDNO:2的氨基酸111的位置中不存在疏水性氨基酸。这两个实施方式还可合并。因此，所得核蛋白通常将具有不同于野生型核蛋白序列的氨基酸序列。
另一种避免或降低发作性嗜睡病风险的方法是降低最终疫苗组合物中存在的核蛋白的量。裂解病毒体和全疫苗具体而言可能会含有大量的残留核蛋白。
因此，在第二方面中，本发明提供了一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，(i)该组合物是裂解病毒体疫苗且存在的甲型流感病毒核蛋白的量是小于3μg核蛋白/10μg血凝素或(ii)该组合物是亚单位疫苗且存在的核蛋白的量是小于0.5μg核蛋白/10μg血凝素。下文给出了所需核蛋白水平的进一步指导。
本发明的第一和第二方面可合并。因此，在其中存在甲型流感核蛋白的混合物(多价疫苗)的具体实施方式中，可能仅需要将核蛋白量降低至本文所描述的水平以下，前提是意图避免的核蛋白符合本发明第一方面给出的定义。其他核蛋白(例如毒株X-181的核蛋白)可以例如任何特定类型疫苗中的通常水平包含在组合物内。因此，在该实施方式中，仅需要在一些毒株而非其他毒株的抗原的制造过程中应用较严格的纯化测量，这取决于特定核蛋白的序列/结合特性。因此，本发明可应用于单价批量产品，其可随后与不需要进行任何特定测量的其他单价批量产品合并以生成具有多种核蛋白的多价疫苗。
在本发明的第一和第二方面的具体实施方式中，该疫苗组合物还包含佐剂，例如水包油乳液。由于在GSK的佐剂化PandemrixTM疫苗中观察到发作性嗜睡病的发生率上升，可通过存在佐剂提高该影响且因此对佐剂化疫苗(季节性或大流行性)应用本发明的教导显得尤为重要。佐剂(如水包油乳液)还可包含生育酚，如同GSK的佐剂化PandemrixTM疫苗中使用的AS03佐剂中的情况。在一个具体实施方式中，排除水包油乳液MF59作为佐剂。
处理变化也会对某些核蛋白具有潜在有害的影响。例如，使用的去垢剂类型可具有影响。因此，在本发明的第一和第二方面的一个实施方式中，该疫苗组合物还包含曲通(如曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)或吐温(如吐温-80或聚山梨酯80)或其组合。这类疫苗组合物可以是佐剂化的或未佐剂化的，例如前述段落中所述。
本发明的第一和第二方面的疫苗组合物可以是针对一种或多种大流行性流感毒株和/或针对一种或多种季节性流感毒株的疫苗。在一个实施方式中，该疫苗组合物是一种单价组合物，例如仅含有一种大流行性流感毒株。在一个相关实施方式中，该疫苗组合物仅包含甲型流感毒株。
在本发明的第一和第二方面的一个实施方式中，该疫苗是四价疫苗。
本发明的第一和第二方面的疫苗组合物可以是例如全病毒疫苗、裂解病毒体疫苗或亚单位疫苗。在一个实施方式中，该疫苗组合物是裂解病毒体疫苗。
在另一个实施方式中，当本发明的疫苗组合物针对大流行性病毒时，这些疫苗组合物不获自重配病毒NYMCX-157、X163、X-163A、X-163B、X-173、X-173A、X-173B、X-173C、X-177、X-177A、X-177B、X-179、X-179A、X-181或X-181B。
在另一个实施方式中，当本发明的疫苗组合物针对季节性病毒时，这些疫苗组合物不获自重配病毒NYMCX-157、X163、X-163A、X-163B、X-173、X-173A、X-173B、X-173C、X-177、X-177A、X-177B、X-179、X-179A、X-181或X-181B。
在一个实施方式中，该疫苗针对H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8或H9毒株，如大流行性H1、H3、H5、H6、H7或H9毒株。具体的示例是H1N1、H5N1、H5N3、H7N9、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3和H7N1。
其他特定实施方式公开于下文：
发作性嗜睡病和使用MF59佐剂化流感疫苗进行免疫之间未检测到显著关联。因此，如果使用具有额外的免疫刺激剂的水包油佐剂，则NP蛋白可能会是特别的风险。这类额外的免疫刺激剂可以是例如生育酚/生育酚衍生物(AS03)，或TLR激动剂，例如合成的TLR4激动剂吡喃葡糖基脂A(GLA；参见WO2009/143457)。因此，使用所述水包油佐剂佐剂化的流感疫苗应优选不含甲型流感NP蛋白。因此，本发明的一个实施方式是：
(a)一种灭活、佐剂化流感疫苗，其不含有甲型流感NP蛋白，或所含甲型流感NP蛋白小于疫苗中总流感病毒蛋白的15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(以质量计)。在优选的实施方式中，该佐剂是水包油乳液，其含有额外的免疫刺激剂，如生育酚、生育酚衍生物、MPL、GLA或另一种TLR激动剂。在替代性实施方式中，该疫苗是铝盐佐剂化的且含有类似于吸附型TLR激动剂的免疫刺激剂。在一个优选的实施方式中，该疫苗是亚基或裂解疫苗。
在水包油乳液的上下文中，‘额外的免疫刺激剂’指除形成乳液的去垢剂和基础油外还包含的免疫刺激剂。添加额外的免疫刺激剂以提高乳液的佐剂作用。出于本专利的目的，由角鲨烯、司盘和吐温组成的MF59不应理解为含有额外的免疫刺激剂。AS03中含有的生育酚应理解为是额外的免疫刺激剂。出于本专利的目的，通常用于形成和/或稳定乳液的表面活性剂不被视为‘额外的免疫刺激剂’，即使这些去垢剂具有某些内在佐剂活性。因此，以下去垢剂不应理解为是额外的免疫刺激剂：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。另一方面，出于本专利的目的TLR激动剂被视为额外的免疫刺激剂，即使其以油或表面活性剂的化学形式添加时也是如此。具体而言，下文佐剂部分中描述的TLR激动剂应理解为额外的免疫刺激剂。
或者，如果在使用水包油乳液或铝盐和额外的免疫刺激剂佐剂化的疫苗中无法完全避免甲型流感NP蛋白的存在，应使用不同于PandemrixTM中所含NP蛋白的NP蛋白。因此，本发明的一个实施方式是：
(b)一种含有来自甲型流感病毒的NP蛋白的佐剂化流感病毒疫苗，其特征在于：
(i)该NP蛋白在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸残基；和/或
(ii)等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-118(通常是氨基酸106-126)的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽，
其中，该佐剂是水包油乳液或铝盐和额外的免疫刺激剂。
在一个优选的实施方式中，该佐剂是水包油乳液且该额外的免疫刺激剂是生育酚、生育酚衍生物、GLA、MPL或另一种TLR激动剂。在替代性实施方式中，该佐剂是铝盐(如氢氧化铝或磷酸铝)且含有TLR激动剂。
如果无法避免存在PandemrixTM中所使用的具有序列SEQIDNO:2的NP蛋白(例如因为不可获得替代性主链)，则疫苗应仅使用不含有额外的免疫刺激剂的佐剂进行佐剂化。这具体应用于：(i)裂解疫苗(其含有相对高含量的NP)、(ii)四价或更高价疫苗(随着NP含量的增加)、(iii)待给予儿科群体和/或青少年群体的疫苗(因为大多数发作性嗜睡病病例在这些群体中检测到)、(iv)待给予具有发展与流感疫苗接种相关的自身免疫疾病的遗传倾向的群体的疫苗(如具有HLADQB1*0602的对象；因为发作性嗜睡病仅发生于这些对象中)，以及(v)含有曲通的抗原(因为发作性嗜睡病主要是对含有曲通的抗原产生应答而发生)。因此，本发明的一个实施方式如下：
(c)一种佐剂化裂解流感疫苗，这些疫苗含有来自至少4种不同流感病毒的抗原和来自至少一种甲型流感病毒的NP蛋白(具有SEQIDNO:2)，其特征在于，该佐剂是不含有额外的免疫刺激剂的水包油乳液佐剂，且该组合物含有曲通。
在一个优选的实施方式中，该疫苗用于儿科群体(0-36月龄)和/或青少年群体(4-19岁)和/或具有发展与流感疫苗接种相关的自身免疫疾病的遗传倾向的对象，优选具有HLADQB1*0602的对象。
一个替代性实施方式是：
(d)一种治疗0-72月龄儿童和/或青少年(4-19岁)和/或具有发生流感疫苗接种相关的自身免疫疾病的遗传倾向的对象(优选具有HLADQB1*0602的对象)的方法，该儿童和/或青少年和/或对象使用佐剂化分裂流感疫苗接种，这些疫苗含有来自4种不同流感病毒的抗原和具有SEQIDNO:2的来自至少一种甲型流感病毒的NP蛋白，其特征在于，该佐剂是不含有额外的免疫刺激剂的水包油乳液佐剂，且该组合物含有曲通。其他的实施方式是：
(e)一种灭活的流感疫苗，其含有(i)AS03佐剂和(ii)含有曲通X-100和吐温80的抗原组分，但其(a)不含核蛋白或(b)含有核蛋白，但核蛋白的量小于疫苗中流感病毒蛋白总质量的1％。
(f)一种灭活的分裂流感疫苗，其含有(i)AS03佐剂和(ii)含有曲通X-100和吐温80的抗原组分，且含有核蛋白，但其不含有结合包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的核蛋白或核蛋白片段。该疫苗优选针对大流行相关的流感毒株和选自下组的流感毒株：H1N1、H7N9、H9N2、H5N1、H5N3、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7和H7N1。
(g)一种针对大流行相关流感毒株的灭活的分裂流感疫苗，其含有(i)AS03佐剂和(ii)含有曲通X-100和吐温80的抗原组分，且含有核蛋白，但其不含有在与SEQIDNO:2的氨基酸116对应的位置中具有异亮氨酸的核蛋白或核蛋白片段。该疫苗优选针对大流行相关的流感毒株和选自下组的流感毒株：H1N1、H7N9、H9N2、H5N1、H5N3、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7和H7N1。
(g)一种针对大流行相关流感毒株的灭活的分裂流感疫苗，其含有(i)AS03佐剂和(ii)含有曲通X-100和吐温80的抗原组分，且含有核蛋白，但其不含有包含序列LXLYXXXIXXXXXX(SEQIDNO:9)的核蛋白或核蛋白片段，其中X是任何氨基酸。该疫苗优选针对大流行相关的流感毒株和选自下组的流感毒株：H1N1、H7N9、H9N2、H5N1、H5N3、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7和H7N1。
在一个实施方式中，上文所述非佐剂化疫苗的抗原组分可用于具有水包油佐剂(特别是AS03)的制剂。
(i)一种含有来自甲型流感病毒的NP蛋白的单价流感疫苗，其特征在于：
(i)该NP蛋白在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸残基；和/或
(ii)等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-118(或106-126)的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽，
其中，该疫苗含有少于7.5毫克HA/剂量，且任选含有佐剂。
(j)一种含有来自至少4种不同流感病毒的抗原和来自至少一种甲型流感病毒的NP蛋白的流感疫苗，其特征在于：
a.这些NP蛋白均不在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处具有异亮氨酸残基；和/或
b.等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-118的所述至少一种核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽，
其中，该疫苗任选含有佐剂。
(k)一种包含甲型流感病毒核蛋白的佐剂化灭活裂解流感疫苗，该疫苗不含(i)在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处具有异亮氨酸残基的甲型流感病毒核蛋白以及(ii)来自A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181的甲型流感病毒核蛋白。如本发明他处解释的那样，该疫苗可不含来自以下任意毒株的核蛋白：NYMCX-157、X163、X-163A、X-163B、X-173、X-173A、X-173B、X-173C、X-177、X-177A、X-177B、X-179、X-179A、X-181或X-181B。该疫苗可包含水包油乳液佐剂，如MF59或AS03。该疫苗可以是单价的或多价的(如3价或4价)。
(l)一种包含甲型流感病毒核蛋白的佐剂化灭活裂解流感疫苗，该疫苗不含(i)在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处具有异亮氨酸残基的甲型流感病毒核蛋白以及(ii)来自特定甲型流感病毒毒株的血凝素，所述特定甲型流感病毒毒株已在2013年10月1日前被世界卫生组织或疫苗和相关生物产品咨询委员会推荐纳入流感疫苗。该疫苗还可不含(iii)来自特定乙型流感病毒毒株的血凝素，所述特定乙型流感病毒毒株已在2013年10月1日前被世界卫生组织或疫苗和相关生物产品咨询委员会推荐纳入流感疫苗。WHO的毒株推荐可在线获得[6]，且用于2014南半球流感季的毒株公布于2013年9月26日。来自FDA的VRBPAC的推荐也可类似地在线获得[7]，且用于2013/14流感季的毒株公布于2013年2月27日。因此，可容易地确定特征(ii)所定义的毒株。该疫苗可包含水包油乳液佐剂，如MF59或AS03。该疫苗可以是单价的但优选是多价的(如3价或4价)。如果该疫苗是4价的，其理想情况下包含来自两种甲型和两种乙型毒株的血凝素，其中两种甲型毒株具有不同的血凝素亚型(例如来自H1和H3，如H1N1毒株和H3N2毒株)且两种乙型毒株具有不同的谱系(即B/维多利亚/2/87样毒株和B/山行/16/88样毒株)。参见下文。
如上文所述，需要测试现有的核蛋白且特别是流感疫苗生产中使用的新潜在核蛋白对于MHCII型受体异源二聚体(其中β亚基是HLADQB1*0602)的结合。
因此，本发明提供了一种测试甲型流感病毒的疫苗生产适用性的方法，包括以下步骤：确定该流感病毒的核蛋白或其片段或由该流感病毒的基因组区段编码的核蛋白或其片段与HLADQB1*0602的结合亲和性在相同条件下低于来自H1N1毒株X-179A的核蛋白；流感病毒适用于疫苗生产的条件是其核蛋白与HLADQB1*0602的结合亲和性在相同条件下低于来自X-179A的核蛋白。本领域技术人员应理解，在本说明书的全文中，提及‘结合HLADQB1*0602’表示结合其中β亚基是HLADQB1*0602的MHCII型受体异源二聚体。
还提供了一种测试甲型流感病毒的疫苗生产适用性的方法，包括以下步骤：(a)测定该流感病毒的核蛋白或编码该流感病毒的编码该核蛋白的基因组区段的序列；以及(b)确定该核蛋白是否具有特定序列，所述特定序列允许其与HLADQB1*0602的结合亲和性在相同条件下低于来自毒株X-179A的核蛋白；该流感病毒适用于疫苗生产的条件是其核蛋白与HLADQB1*0602的结合亲和性在相同条件下低于来自毒株X-179A的核蛋白。
如上文所述，病毒的NP蛋白与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合可涉及疾病发展且因此需要在疫苗中选择其NP蛋白对HLADQB1*0602的结合亲和性低于毒株X-179A(其用于PandemrixTM)的甲型流感病毒。该NP蛋白具有新生氨基酸序列SEQIDNO:2，且下文的分析显示用于结合HLADQB1*0602的该序列的一个重要部分是RELILYDKEEIRRIWRQANNG(SEQIDNO:1)。
FocetriaTM中使用的流感病毒的NP蛋白(其不触发发作性嗜睡病)与PandemrixTM的NP蛋白的不同点在于其在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中不含有异亮氨酸(参见图1)且因此需要避免在该位置中具有异亮氨酸的NP蛋白。有趣的是，我们对数千已知NP蛋白的数据库序列的分析显示，该区域显示高度保守性且大部分已知NP蛋白(特别是发现于用于疫苗生产的重配病毒中的那些)在该位置或对应位置处具有异亮氨酸。
本发明还提供了一种测试甲型流感病毒的疫苗生产适用性的方法，包括以下步骤：(a)测定该甲型流感病毒的核蛋白或该流感病毒的编码该核蛋白的基因组区段的序列；以及(b)测定对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置处该核蛋白的氨基酸；该流感病毒适用于疫苗生产的条件是其NP蛋白在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中不含有异亮氨酸。
因此，本发明还提供了一种适用于制备本发明的疫苗组合物的种子病毒。在一个实施方式中，本发明的种子病毒包含甲型流感病毒核蛋白，其中，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-118的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。优选地，如果该种子病毒中的甲型流感核蛋白包含SEQIDNO:12所示序列，则该种子病毒不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。在具体的实施方式中，所述核蛋白的片段对应于SEQIDNO:2的氨基酸106-126。
评估一种甲型流感病毒是否适用于疫苗生产时，还需要检查病毒的核蛋白是否包含以下一种或多种氨基酸：(a)对应于SEQIDNO:2中氨基酸108的位置中的脂族氨基酸；和/或(b)对应于SEQIDNO:2中氨基酸110的位置中的脂族氨基酸；和/或(c)对应于SEQIDNO:2中氨基酸111的位置中的疏水性氨基酸。结合HLADQB1*0602的核蛋白的核心结合基序位于SEQIDNO:2的氨基酸108、110、111、113和116处，当氨基酸108和110是脂族氨基酸且位置111处的氨基酸是疏水性氨基酸时能够特别良好地进行结合。在这些位置处避免这类氨基酸因此降低了NP蛋白可结合HLADQB1*0602的可能性，这进一步降低了NP蛋白将导致发作性嗜睡病的可能性。一种流感病毒被认为特别适用于疫苗生产的条件是其不含有一种、两种或全部这些特定氨基酸。位置111处的结合口袋已显示对于结合特别重要且因此NP蛋白优选在该位点处不含有疏水性氨基酸。特别优选的是，该蛋白质在该位置中不含有酪氨酸，因为已知的强结合物示例具有该氨基酸[8]。位置108和/或110处的氨基酸优选不是亮氨酸。流感病毒被认为适用于疫苗生产的条件还可以是其不包含序列LXLYXXXIXXXXXX(SEQIDNO:9)，其中X是任意氨基酸。
本发明还提供了一种制备流感病毒的方法，包括以下步骤：(a)通过本发明所述方法测试流感病毒对于疫苗生产的适用性；(b)用步骤(a)中的流感病毒感染培养宿主；以及(c)培养来自步骤(b)的宿主以产生其他病毒；和可选地(d)纯化步骤(c)中获得的病毒。在这些方法种，病毒可用于疫苗生产的前提是其通过本发明的方法的评估被认为适用于疫苗生产。
本发明还提供了一种确认包含甲型流感核蛋白或其片段的疫苗适用于给予人的方法，包括以下步骤：确定该蛋白质是否在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中具有异亮氨酸；该疫苗被认为适用于给予人的条件是该核蛋白在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中不含有异亮氨酸。
如同上文所讨论的那样，该方法还包括测试病毒的核蛋白是否包含以下一种或多种氨基酸：(a)对应于SEQIDNO:2中氨基酸108的位置中的脂族氨基酸；和/或(b)对应于SEQIDNO:2中氨基酸110的位置中的脂族氨基酸；和/或(c)对应于SEQIDNO:2中氨基酸111的位置中的疏水性氨基酸。该方法可包括测试病毒的核蛋白是否包含所有这些氨基酸。
如上文所述，其NP蛋白(或其片段)可结合HLADQB1*0602，或其NP蛋白在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中具有异亮氨酸的甲型流感病毒已与发作性嗜睡病相关。因此需要避免存在这类NP蛋白或片段，因为这将进一步提高甲型流感疫苗的信心并还将进一步提高疫苗的安全性。因此，当可结合HLADQB1*0602和/或在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中具有异亮氨酸的甲型流感病毒被用于疫苗生产时，优选测试所得疫苗以确保NP蛋白(或其片段)不存在于最终疫苗中。
因此，本发明还提供了一种确认流感疫苗可安全地给予人的方法。该方法可包括以下步骤：(a)从其中核蛋白结合HLADQB1*0602的流感病毒中制备流感疫苗(例如，其NP是SEQIDNO:2的毒株)；以及(b)测试该疫苗是否存在核蛋白；该疫苗可安全地给予人的条件是其不含能够结合HLADQB1*0602的核蛋白。或者，该方法可包括以下步骤：(a)从其中核蛋白在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中具有异亮氨酸的流感病毒中制备流感疫苗；以及(b)测试该疫苗是否存在核蛋白；该疫苗被认为可安全地给予人的条件是其不含能够结合HLADQB1*0602的核蛋白。
如上文所讨论的那样，所有对PandemrixTM产生应答的发作性嗜睡病病例都发生于具有HLADQB1*0602单倍型的患者中，且因此需要特别注意该患者群体。因此需要在给予疫苗前考虑患者的HLA单倍型。
因此本发明还提供一种向对象给予疫苗的方法，包括以下步骤：(a)确定该对象是否具有发展疫苗相关的自身免疫疾病的遗传倾向；以及(b)如果发现对象不处于风险下则给予疫苗。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种向对象给予疫苗的方法，包括以下步骤：(a)测定该对象是否具有某些HLA单倍型；以及(b)如果发现该对象对所述单倍型为阴性则向该对象给予疫苗。在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种向对象给予流感疫苗的方法，包括以下步骤：(a)测定该对象是否具有HLADQB1*0602单倍型；以及(b)如果发现该对象对HLADQB1*0602为阴性则向该对象给予流感疫苗。
本发明还提供了一种免疫接种对象的方法，该方法包括向该对象给予疫苗，该对象对具有发展与所述疫苗相关的自身免疫疾病的风险的HLA为阴性。在优选的实施方式中，该疫苗是甲型流感疫苗和/或该对象对HLADQB1*0602为阴性。
或者，本发明提供了一种用于具有HLA单倍型的对象的疫苗，所述HLA单倍型具有发展与所述疫苗相关的自身免疫疾病的风险，疫苗中基本不含结合该HLA单倍型的疫苗组分。在一个优选的实施方式中，该疫苗针对甲型流感病毒和HLA型DQB1*0602，且该疫苗不含有NP蛋白，或含有在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸残基的NP蛋白，和/或该NP蛋白或相对于SEQIDNO:2的氨基酸106-118的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO1所示氨基酸序列的肽。在一个优选的实施方式中，除去NP蛋白或其片段。在较优选的实施方式中，该流感疫苗不是重组疫苗。
本发明还提供了一种针对流感免疫对象的方法，该方法包括向对象给予流感疫苗，该对象对，该疫苗针对甲型流感病毒和HLA型DQB1*0602，且该疫苗不含有流感NP蛋白，或含有在对应于SEQIDNO:2所示核蛋白序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸残基的流感NP蛋白，和/或该NP蛋白或相对于SEQIDNO:2的氨基酸106-118的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO1所示氨基酸序列的肽。在一个优选的实施方式中，该疫苗是重组疫苗。
本发明还提供了一种用于具有HLADQB1*0602的对象的含有NP的流感疫苗，该NP蛋白包含序列SEQIDNO:2。
本发明还提供了一种从流感病毒制备的流感疫苗，其核蛋白或其片段可结合HLADQB1*0602，该疫苗不含有可结合HLADQB1*0602的核蛋白或其片段。在一个优选的实施方式中，该流感疫苗不是重组疫苗。
还提供了从流感病毒制备的流感疫苗，测试了其核蛋白与HLADQB1*0602结合的能力，其结合亲和性等于或高于包含SEQIDNO:1的序列的核蛋白，该疫苗不包含核蛋白。在一个优选的实施方式中，本发明的流感疫苗不是重组疫苗。
还提供了从流感病毒制备的流感疫苗，测试了其核蛋白与HLADQB1*0602结合的能力，其结合亲和性等于或高于来自毒株X-179A的核蛋白，该疫苗不包含核蛋白。在一个优选的实施方式中，本发明的流感疫苗不是重组疫苗。
还提供了一种由流感病毒制备的流感疫苗，测试了其核蛋白或其片段中在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中是否存在亮氨酸，该疫苗不包含核蛋白或其片段。在一个优选的实施方式中，本发明的流感疫苗不是重组疫苗。
本发明还提供了一种裂解病毒体流感疫苗，相对于HA，其含有的来自甲型流感病毒的核蛋白量少于PandemrixTM疫苗。这可以是一种重要的安全性测量，尤其当核蛋白未如本发明所述进行测试时，因为较少量的核蛋白使核蛋白较不可能引发发作性嗜睡病。在具体的实施方式中，本发明提供了裂解病毒体疫苗组合物，其中，存在的核蛋白的量小于3μg核蛋白/10μg血凝素，例如小于3μgNP/10μgHA，小于2.5μgNP/10μgHA，小于2μgNP/10μgHA，小于1.5μgNP/10μgHA，小于1μgNP/10μgHA，小于0.5μgNP/10μgHA，或小于0.1μgNP/10μgHA。
测定组合物中蛋白质含量的方法是本领域技术人员已知的。然而，由于NP和NA的分子量基本相同(约60kDa)，其通常在非还原胶中共迁移。经典的SDS凝胶电泳可能因此不是测定NP含量的适当方法[9]。一种测定疫苗批次中NP含量的方法是双向电泳以及后续的密度分析。然而，优选使用同位素标记的合成肽进行同位素稀释质谱，参见参考文献10。该方法使用采用同位素稀释的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)以及多重反应监测(MRM)。该方法通过代表分析物蛋白质的化学计量比形式的样品蛋白水解消化来量化靶向肽释放。稳定的同位素标记的参考肽插入样品中作为内部标准品(IS)。通过比较同位素比较的参考肽与内源性靶肽的峰区域来实现NP的定量。该方法允许同时定量多种蛋白质，前提是对各特定的靶标而言均包含标记的肽。
或者，使用无标记物质谱(LC/MSE)进行定量，优选四极杆-飞行时间(Q-Tof)质谱[11]。出于此，LC/MS分析期间低碰撞能量与高碰撞能力的交替扫描被用于获得单次实验中的蛋白质性质和含量。基于实验数据进行量化，其显示对于任何给定蛋白质，LC/MSE所测量的三个最强胰蛋白酶肽的平均信号强度在给定浓度下保持恒定，这与蛋白质类型和大小无关。由于信号强度与浓度成比例，所有可估计混合物中任何蛋白质的含量。
本发明还提供了一种裂解病毒体流感疫苗，其中通过以下试验评估得到核蛋白与血凝素的比例小于1.5(例如小于1.4，小于1.3，小于1.2，小于1.1，或甚至小于1.0)：沉淀疫苗中的蛋白质；收集、还原并使用丙酰胺烷基化沉淀的蛋白质；使用胰蛋白酶和LysC(来自产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)的丝氨酸胞内蛋白酶，其在Lys残基的羧基侧特异性水解)的混合物对烷基化的蛋白质在37℃下消化过夜；使用甲酸酸化；使用C18反相树脂纯化蛋白水解片段；对纯化的片段进行HPLC-MSMS(高效液相色谱串联质谱)，选择15种最强的多重带电前体离子进行片段化；使MS谱峰与流感病毒蛋白匹配；选择MS谱中丰度最高的10种蛋白质；以及计算这10种丰度最高的蛋白质内核蛋白MS信号与血凝素MS信号的比率。如下文所述，在本发明的裂解疫苗种，该试验评估得到的NP与MS比率是大于1.5。
本发明还提供了一种裂解病毒体流感疫苗，其中通过以下试验评估得到核蛋白与血凝素的比例小于0.3(例如小于0.28，小于0.26，小于0.25，小于0.20，或甚至小于0.10)：沉淀疫苗中的蛋白质；收集、还原并使用丙酰胺烷基化沉淀的蛋白质；使用胰蛋白酶和LysC(来自产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)的丝氨酸胞内蛋白酶，其在Lys残基的羧基侧特异性水解)的混合物对烷基化的蛋白质在37℃下消化过夜；使用甲酸酸化；使用C18反相树脂纯化蛋白水解片段；对纯化的片段进行HPLC-MSMS(高效液相色谱串联质谱)，选择15种最强的多重带电前体离子进行片段化；通过与疫苗中已知存在的毒株的精确序列匹配来使MS谱峰与流感病毒核蛋白和血凝素序列匹配；选择MS谱中丰度最高的10种蛋白质；以及计算这10种丰度最高的蛋白质内核蛋白MS信号与血凝素MS信号的比率。
本发明还提供了一种亚基流感疫苗，其包含降低的甲型流感核蛋白水平，注意亚单位疫苗中核蛋白水平应低于裂解病毒体疫苗，因为进行了额外的纯化步骤。具体而言，本发明提供了一种亚单位疫苗，其中，存在的核蛋白的量小于0.5μgNP/10μgHA，如小于0.1μgNP/10μgHA。前述段落中的疫苗是有利的，其原因在于，当已经从流感病毒中制备疫苗时(所述流感病毒的NP蛋白与用于生产导致发作性嗜睡病的流感疫苗的另一流感病毒的NP蛋白具有相同特征)，需要确保该疫苗不包含发作性嗜睡病相关浓度的NP蛋白。
通常，前述段落中描述的疫苗使用水包油乳液佐剂进行佐剂化。在这类疫苗中，如PandemrixTM，特别有利的是对疫苗进行测试，因为如下文所述，佐剂可导致NP肽触发发作性嗜睡病的较高风险。在一个最优选的实施方式中，该水包油乳液佐剂包含额外的免疫刺激剂，如生育酚、生育酚衍生物、GLA或TLR激动剂，特别是α-生育酚。
这些流感疫苗由流感病毒制得，所述流感病毒已针对上述段落中讨论的特征进行测试。该测试步骤可在生产过程期间的任意阶段处进行。其可以在例如种子病毒上进行，所述种子病毒用于起始生产疫苗的病毒培养物。其还可在取自病毒培养物的样品上进行。该测试还可在未用于生产过程的流感病毒上进行，例如使用一批病毒毒株进行测试并使用另一批相同病毒毒株来生产疫苗。该测试无需在任何生产循环中进行。其也无需通过生产流感疫苗的同一实体进行。例如，可以由一个实体来测试病毒并使测试结果可用于其他实体，例如在数据库中。当通过获得流感病毒的序列信息来进行测试时该选项特别有吸引力，因为可简单地使这类信息在公共数据库中可获得。
还提供了一种制备甲型流感疫苗的方法，包括以下步骤：(a)制备第一前疫苗组合物；(b)除去或减少模拟来自第一疫苗的食欲素受体1和/或食欲素受体2的组合物结构的量，从而提供第二前疫苗；以及(c)从第二前疫苗制备疫苗。模拟来自第一疫苗的食欲素受体1和/或食欲素受体2的组合物结构的量优选降低大于90％，更优选降低大于95％且最优选降低大于99％。作为一个示例，步骤(b)中的除去可通过色谱进行。本发明还提供了一种从病毒中制备病毒亚基的方法，这些亚基制备为不含模拟食欲素受体1和/或食欲素受体2的结构。该方法可包括其他步骤如制备疫苗，任选地混合疫苗与佐剂、填充、包装并标记疫苗。
本发明还提供了一种从流感病毒中制备疫苗的方法，所述流感病毒的核蛋白序列包含氨基酸序列RELILYDKEEMRRIWRQANNG(SEQIDNO:3)，该方法包括除去任何包含所述氨基酸序列的核蛋白或其片段的步骤以提供疫苗。在另一个实施方式中，本发明的疫苗由以下流感病毒制备，所述流感病毒的核蛋白序列包含氨基酸序列RELILYDKEEIRRIWRQANNG(SEQIDNO:3)，该方法包括除去任何包含所述氨基酸序列的核蛋白或其片段的步骤以提供疫苗。这些方法可包括其他步骤如制备疫苗，任选地混合疫苗与佐剂、填充、包装并标记疫苗。
本发明还提供了一种灭活或活减毒甲型流感疫苗，该疫苗不包含可结合HLADQB1*0602的核蛋白或其片段。本发明还提供了一种灭活或活减毒甲型流感疫苗，该疫苗不包含模拟食欲素受体1和/或食欲素受体2的核蛋白或其片段。还提供了一种包含核蛋白的甲型流感疫苗，但核蛋白的量小于3μgNP/10μgHA，小于2.5μgNP/10μgHA，小于2μgNP/10μgHA，小于1.5μgNP/10μgHA，小于1μgNP/10μgHA，小于0.5μgNP/10μgHA，或小于0.1μgNP/10μgHA。本发明还提供了一种不包含核蛋白或其片段的灭活甲型流感病毒。该段落中描述的疫苗优选由含有可结合HLADQB1*0602的核蛋白或其片段的甲型流感病毒开始生产。此外或或者，所述疫苗使用水包油乳液进行佐剂化，特别是含有额外的免疫刺激剂的那些。
本发明还提供了一种制备甲型流感疫苗的方法，包括以下步骤：除去或减少模拟食欲素受体1和/或食欲素受体2或其片段的组合物结构的量。模拟食欲素受体1和/或食欲素受体2的结构的量优选降低大于90％，更优选降低95％且最优选降低大于99％。本发明还提供了一种制备甲型流感疫苗的方法，包括以下步骤：除去或降低核蛋白或其片段的量。核蛋白或片段的量优选降低大于90％，更优选降低95％且最优选降低大于99％。从制备物中除去蛋白质的方法是本领域熟知的。作为示例，除去或降低核蛋白或其片段的量可通过色谱或免疫沉淀进行。
由于发作性嗜睡病大多数在儿童(0-36月龄)和青少年(4-19岁)群体中检测到，在一个实施方式中，本发明所述的所有疫苗都用于儿童(0-36月龄)和青少年(4-19岁)群体。
当水包油乳液与本发明所述抗原联用时，疫苗的抗原和佐剂组分可预先混合或可置于单独的容器中以由终端用户/医疗服务人员在给药前混合。抗原和佐剂组分可在相同或不同的生产位点处生产。本发明的一个方面是用于与佐剂组分一起配制和/或包装至试剂盒中的抗原组分的应用。本发明的另一个方面是用于与抗原组分一起配制和/或包装至试剂盒中的佐剂组分的应用。
发明详述
核蛋白
本发明提供了允许本领域技术人员基于病毒核蛋白的某些特征评估一种甲型流感病毒是否适用于疫苗生产的方法，所述特征是例如与HLADQB1*0602的结合或检查序列中是否存在某些氨基酸。
当本发明以测试(或测序、分析等)核蛋白的形式定义时，这可涉及测试全长核蛋白，但将通常涉及测试核蛋白的片段，因为该核蛋白预期在由抗原呈递细胞进行胞内加工后以片段形式结合MHCII型受体。这些片段的长度可以是小于200个氨基酸，例如小于100个氨基酸，小于90个氨基酸，小于80个氨基酸，小于70个氨基酸，小于60个氨基酸，小于50个氨基酸，小于40个氨基酸，小于30个氨基酸，或小于20个氨基酸。本领域技术人员应理解，片段的长度应通常为至少约12或13个氨基酸以结合MHCII型受体，例如长度为至少18、19、20或21个氨基酸。优选使用长度小于30个氨基酸的片段来实践本发明的方法，因为这类片段较易于操作。此外，在对片段进行测序时，如果分析较短序列，则这些方法还将较便宜。
在本发明的方法中使用片段时，该片段应包含对应于SEQIDNO:2的氨基酸108-116的氨基酸，优选对应于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的氨基酸，因为该序列是结合含有HLADQB1*0602的MHCII型受体的核心序列。因此，可用于本发明的片段的最小长度为9个氨基酸，但如上文所述长度通常为至少约12或13个氨基酸以结合MHCII型受体，例如长度为至少18、19、20或21个氨基酸。在该上下文中提及SEQIDNO:2中的氨基酸108-116和106-118和106-126不表示本发明只可使用与对应于SEQIDNO:2中氨基酸108-116或106-118或106-126完全相同的氨基酸序列进行。而是，这向本领域技术人员提供了参考以发现其他核蛋白序列中的相应氨基酸(如毒株X-181中的SEQIDNO:3)，从而在任意甲型流感病毒NP中鉴定相应片段。
当使用来自某一毒株的片段时，应针对来自该毒株的相应片段与另一毒株进行任意比较，例如比较具有SEQIDNO:1的肽与具有SEQIDNO:3的肽，而非来自毒株X-181的较长或较短的肽。
本发明还可使用编码流感NP蛋白或片段的基因组区段进行，如前文段落中所述。因此，可在不进行蛋白质测序的情况下进行各方法，但替代地使用核酸测序(或甚至使用已单独获得的序列信息)。
可通过测试其与HLADQB1*0602的结合能力来分析NP蛋白或片段，所述HLADQB1*0602是MHCII型受体的β链亚基。因此，本领域技术人员应理解，测试NP蛋白或片段与HLADQB1*0602的结合是基于与功能性MHCII型受体异源二聚体(其中β亚基是HLADQB1*0602)的结合。α亚基通常是DQA1亚基，如HLADQA1*0102(其是高加索美国人中通常最与HLADQB1*0602相关的DQA1亚基)。可使用例如重组表达技术出于测试目的获得这类异源二聚体。合适的用于表达可溶性MHCII型受体异源二聚体的方法描述于参考文献12。HLADQB1*0602的氨基酸序列可获自UniProtKB/Swiss-Prot:P01920。另一种合适的方法描述于参考文献13。
这些实验中的参考点是SEQIDNO:2的NP蛋白，或更通常是前述段落中讨论的序列片段，如SEQIDNO:1所示片段。具有该序列的NP蛋白已与发作性嗜睡病相关。与HLADQB1*0602的结合亲和性低于该蛋白质的NP蛋白(在相同实验条件下)较不可能结合HLADQB1*0602且因此较不可能导致发作性嗜睡病。如上文所述，通常，使用相应的片段进行比较。例如，当NP片段是SEQIDNO:1所示片段时，测试NP片段将获自氨基酸106-126或相应区域，应考虑不同的NP蛋白的长度可能不是完全一致且可具有缺失或插入。
用于测试结合亲和性的合适试验是本领域已知的，例如，使用NMR、过滤结合试验、凝胶排阻试验、置换/竞争试验、反向双杂交、表面等离振子共振和光谱。合适的肽结合试验的示例描述于参考文献12。在试验的具体示例中，测试肽(如来自毒株X-179A的NP蛋白片段(如包含或由SEQIDNO:1所示氨基酸序列组成的片段))使用可检测标记物(如生物素)标记并连接含有HLADQB1*0602的MHCII型受体(通常具有HLADQA1*0102作为异源二聚体的其他组分)。随后使未标记的测试肽与受体标记的肽复合物孵育。该测试肽能否成功地竞争结合参考经标记肽可通过测量仍结合的经标记肽的含量来确定。如果测试肽与含有HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合较不强，则其将不会成功地竞争结合经标记的参考肽且因此这提供了一种简便的方法来鉴定与含有HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合强度低于来自毒株X-179A的NP蛋白的NP蛋白。
其他试验描述于参考文献13和参考文献88(例如实施例中使用的REVEALTM前免疫(ProImmune)技术，其测量合成的测试肽稳定MHC-肽复合物的能力，其中通过特异性单克隆抗体检测是否存在MHC-肽复合物的天然构型)。
在一个实施方式中，测试的NP蛋白(例如对应于SEQIDNO:2的氨基酸106-118或对应于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的片段)与含有HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性比来自X-179A的NP蛋白(如由SEQIDNO:2的氨基酸106-118组成或由SEQIDNO:2的氨基酸106-126组成的片段)低至少两倍，例如与含有HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低三倍、四倍、五倍或十倍。测试的MHCII型受体优选是HLADQA1*0102和HLADQB1*0602的异源二聚体。
该NP蛋白还可通过测定其序列或片段的序列来分析，如先前的段落中描述的那样。还可通过分析编码NP蛋白或其片段的病毒区段的序列来进行这些方法。用于对肽和核酸进行测序的合适试验是本领域熟知的且包括例如埃得曼降解试验和桑格测序。分析核酸时，可在测序前扩增核酸，例如通过聚合酶链式反应(PCR)。
在一个实施方式中，做出的分析是病毒的核蛋白是否包含以下一种或多种氨基酸：(a)对应于SEQIDNO:2中氨基酸108的位置中的脂族氨基酸；和/或(b)对应于SEQIDNO:2中氨基酸110的位置中的脂族氨基酸；和/或(c)对应于SEQIDNO:2中氨基酸111的位置中的疏水性氨基酸。结合HLADQB1*0602的核蛋白的核心结合基序位于SEQIDNO:2的氨基酸108、110、111、113和116处，当氨基酸108和110是脂族氨基酸且位置111处的氨基酸是疏水性氨基酸时能够特别良好地进行结合。在这些位置处避免这类氨基酸因此降低了NP蛋白可结合HLADQB1*0602的可能性，这进一步降低了NP蛋白将导致发作性嗜睡病的可能性。一种流感病毒被认为特别适用于疫苗生产的前提是其不含有一种、两种或全部这些特定氨基酸。位置111处的结合口袋已显示对于结合特别重要且因此NP蛋白优选在该位点处不含有疏水性氨基酸。特别优选的是，该蛋白质在该位置中不含有酪氨酸，因为已知的强结合物示例具有该氨基酸[8]。位置108和/或110处的氨基酸优选不是亮氨酸。流感病毒被认为适用于疫苗生产的条件还可以是其不包含序列LXLYXXXIXXXXXX(SEQIDNO:9)，其中X是任意氨基酸。还可通过替代性方式分析蛋白质序列。例如，在分析基因组区段时，可使用特异性检测在结合基序中特别相关的氨基酸的探针来分析这些区段。类似地，可使用免疫化学方法(如western印迹分析或免疫荧光)来分析NP蛋白。当在本发明中使用这类分析方法时，应使用能够特异性检测序列LILYDKEEI(SEQIDNO:8，对应于SEQIDNO:2中的氨基酸108-116)的抗体进行这些方法。如上文所述，特别优选的情况是该NP蛋白在位置111中不具有酪氨酸，因此该抗体可以是特异性检测位置111中酪氨酸的抗体。或者或此外，该抗体可特异性检测位置108和/或110处的亮氨酸。获得可在相关序列之间做出区分的抗体的方法是本领域技术人员已知的。
检测核蛋白
在一些方面中，本发明提供了不包含甲型流感核蛋白的灭活流感疫苗。本领域技术人员应理解，通常不可能从最终疫苗中除去所有NP且疫苗(特别是裂解疫苗)仍含有残留的NP含量。例如，FocetriaTM疫苗仍含有某些量的NP蛋白，但这些蛋白质不会产生问题，因为其含量比PandemrixTM中低得多。
因此，如果本发明的疫苗包含核蛋白，其优选占疫苗中总流感病毒蛋白的小于15％(以质量计)，例如小于12％、小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。该疫苗可包含小于3μgNP/10μgHA，小于2.5μgNP/10μgHA，小于2μgNP/10μgHA，小于1.5μgNP/10μgHA，小于1μgNP/10μgHA，小于0.5μgNP/10μgHA或小于0.1μgNP/10μgHA。NP含量按上文所述测定。
如上文所述，在其中存在甲型流感核蛋白的混合物的实施方式中，可能仅需要将核蛋白量降低至本文所描述的水平以下，前提是意图避免的核蛋白符合本发明第一方面给出的定义。因此，在该实施方式中，上文所述NP含量的评估仅需要相对于这类核蛋白(如毒株X-179A的核蛋白)做出。其他核蛋白(例如毒株X-181的核蛋白)可以例如任何特定类型疫苗中的通常水平包含在组合物内。因此，在该实施方式中，仅需要在一些毒株而非其他毒株的制造过程中应用较严格的纯化测量，这取决于特定核蛋白的序列/结合特性。一旦合并至最终疫苗组合物中，NP的总量可超过上文给出的限值，前提是需要减少的NP类型的含量未减少。
测定组合物中蛋白质含量的方法是本领域技术人员已知的。然而，由于NP和NA的分子量基本相同(约60kDa)，其通常在非还原胶中共迁移。经典的SDS凝胶电泳可能因此不是测定NP含量的适当方法(参见Chaloupka等，1996,EurJClinMicrobiolInfectDis.1996年2月；15(2):121-7)。一种测定疫苗批次中NP含量的方法是双向电泳以及后续的密度分析。然而，优选使用同位素标记的合成肽进行同位素稀释质谱，参见Williams等，Vaccine30(2012)2475–2482。该方法使用采用同位素稀释的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)以及多重反应监测(MRM)。该方法通过代表分析物蛋白质的化学计量比形式的样品蛋白水解消化来量化靶向肽释放。稳定的同位素标记的参考肽插入样品中作为内部标准品(IS)。通过比较同位素比较的参考肽与内源性靶肽的峰区域来实现NP的定量。该方法允许同时定量多种蛋白质，前提是对各特定的靶标而言均包含标记的肽。
或者，使用无标记物质谱(LC/MSE)进行定量，优选四极杆-飞行时间(Q-Tof)质谱[11]。出于此，LC/MS分析期间低碰撞能量与高碰撞能力的交替扫描被用于获得单次实验中的蛋白质性质和含量。基于实验数据进行量化，其显示对于任何给定蛋白质，LC/MSE所测量的三个最强胰蛋白酶肽的平均信号强度在给定浓度下保持恒定，这与蛋白质类型和大小无关。由于信号强度与浓度成比例，所有可估计混合物中任何蛋白质的含量。
培养宿主
通常使用细胞系生产流感病毒，但原代细胞可用作替代。该细胞通常为哺乳动物细胞，但也可使用禽类或昆虫细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于人、仓鼠、牛、灵长类和犬细胞。在一些实施方式中，该细胞是人非肾细胞或非人细胞。可以使用多种细胞，如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的示例是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是例如非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系[14-16]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系中。合适的禽类细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[17]。
其他合适的细胞包括但不限于：CHO；293T；MRC5；PER.C6[18]；FRhL2；WI-38；等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[20]、Coriell细胞库[19]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81.2、CRL1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。
本发明使用的细胞优选源自马达二氏(MadinDarby)犬肾的MDCK细胞[21-23]。原始MDCK细胞可以CCL34获自ATCC。优选地，使用这些或其他MDCK细胞的衍生物。这类衍生物描述于例如参考文献21中，其公开了适合悬浮培养的MDCK细胞('MDCK33016'或‘33016-PF’，保藏号DSMACC2219)。此外，参考文献24公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞('B-702'，保藏号FERMBP-7449)。在一些实施方式中，所使用的MDCK细胞系可为致瘤性的，但也可考虑使用非致瘤性MDCK细胞。例如，参考文献25公开了非致瘤性MDCK细胞，包括'MDCK-S'(ATCCPTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCCPTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCCPTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。参考文献26公开了对感染有高度易感性的MDCK细胞，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCCCRL12042)。
在本发明的方法中可使用一种以上细胞类型的混合物，但优选使用单一细胞类型如使用单克隆细胞。
本发明的方法中使用的细胞是优选的细胞，其适用于生产用于给予人的流感疫苗。这类细胞可来源于获批准用于疫苗生产并由国家控制机构注册的细胞库系统，且必须处于允许用于疫苗生产的最大传代数内(对于总结参见参考文献27)。已被批准用于疫苗生产的合适细胞的示例包括MDCK细胞(如MDCK33016；参见参考文献21)、CHO细胞、Vero细胞和PER.C6细胞。本发明的方法优选不使用293T细胞，因为这些细胞未获批准用于疫苗生产。
优选地，用于制备病毒的细胞和用于制备疫苗的细胞属于相同的细胞类型。例如，该细胞可以都是MSCK、Vero或PerC6细胞。这是优选的，因为其促进监管批准，因为获得批准需要仅针对单个细胞系。其他的优势是可避免竞争培养选择压力或不同细胞培养条件。本发明的方法还可自始至终使用相同的细胞系，例如MDCK33016。
这些流感病毒还可在鸡蛋中增殖。目前培养流感病毒用于疫苗的标准方法采用含胚SPF鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。也可通过鸡蛋对病毒传代并随后在细胞培养物中繁殖，反之亦然。
病毒制备
本发明提供了一种制备流感病毒的方法，包括以下步骤：(a)通过上文所述方法测试流感病毒对于疫苗生产的适用性；(b)用步骤(a)中的流感病毒感染培养宿主；以及(c)培养来自步骤(b)的宿主以产生其他病毒；和可选地(d)纯化步骤(c)中获得的病毒。
该培养宿主可以是细胞或含胚鸡蛋，如上文段落中讨论的那样。本发明此方面中用细胞作培养宿主时，已知细胞培养条件(如温度、细胞密度、pH值等)根据所用细胞系和病毒在较宽的范围内变化且可根据应用需求调整。因此下述信息仅代表指南。
该细胞优选在无血清情况下培养以避免常见污染源。本领域技术人员已知用于真核细胞培养的各种无血清培养基(如伊可夫氏(Iscove's)培养基、超CHO培养基(BW公司(BioWhittaker))、EX-CELL(JRH生物科学公司(JRHBiosciences)))。此外，可用无蛋白培养基，如PF-CHO(JRH生物科学公司)。另外，用于复制的细胞也可在常规含血清培养基中(如含0.5％-10％胎牛血清的MEM或DMEM培养基)培养。
细胞的繁殖可按照本领域技术人员已知的方法进行。例如，可在使用常规支持方法如离心或过滤的灌注系统中培养细胞。此外，可根据本发明于感染前在分批进料系统中繁殖细胞。在本发明的内容中，培养系统指分批进料系统，其中该细胞初始培养于分批系统中且通过控制浓缩营养的进料来补偿培养基中营养物(或部分营养物)的消耗。在感染前的细胞繁殖期间将培养基的pH值值调节为pH6.6-pH7.8，特别是pH7.2-pH7.3是有利的。细胞培养优选在30-40℃的温度进行。在培养受感染细胞(步骤c)时，所述细胞优选在30℃-36℃或32℃–34℃或33℃的温度下培养。这是特别优选的，因为已显示在该温度范围内孵育受感染细胞能生产配入疫苗时功效改善的病毒[28]。
感染前培养中的氧分压优选调节为25％-95％且特别为35％-60％的值。本发明内容中的氧分压值基于空气饱和度。在分批系统中细胞密度优选约8-25x105个细胞/mL时或在灌注系统中优选约5-20x106个细胞/mL时进行细胞感染。该细胞可用10-8至10，优选0.0001-0.5的病毒剂量(MOI值，“感染复数”，等同于感染时每细胞的病毒单位数量)感染。
可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。可采用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。
本发明所述方法还包括收获和分离病毒或其产生的蛋白。分离病毒或蛋白期间，通过标准方法如分离、过滤或超滤从所述培养基中分离细胞。之后按照本领域技术人员充分已知的方法如梯度离心、过滤、沉淀、色谱等浓缩病毒或蛋白，然后纯化。根据本发明，优选在纯化期间或之后对病毒进行灭活。可在纯化过程中任何点用例如β-丙内酯或甲醛进行病毒灭活。
疫苗
流感疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗是本发明优选的，且这些疫苗可基于完整病毒体、‘裂解’病毒体或基于纯化的表面抗原。抗原也可以病毒体形式存在。可使用本发明制造任意这些类型的疫苗。但其特别适用于制造流感疫苗，所述流感疫苗通常包含核蛋白。这类流感疫苗包括或病毒，全病毒克隆或裂解病毒体流感疫苗。本发明所涵盖的疫苗是核蛋白存在于一个或多个处理/生产步骤中的那些，且因此可以想到在最终疫苗组合物中含有核蛋白，这可提高易感个体中自身免疫应答的发现，除非进行某些步骤以降低或避免NP与特定MHCII型受体亚型的结合。
在本发明的第一方面中，本发明的疫苗具有甲型流感NP蛋白，这些NP蛋白(或其片段)与HLADQB1*0602的结合亲和性低于毒株X-179A的NP蛋白(或其片段，因此例如包含或由SEQIDNO:2中所示序列的氨基酸106或108至118或120或126组成的片段)。换言之，这类疫苗的NP蛋白缺少与HLADQB1*0602的亲和性等于或高于毒株X-179A的NP蛋白的区域(或其片段，因此例如包含或由SEQIDNO:2中所示序列的氨基酸106或108至118或120或126组成的片段)。
在本发明的第二方面中，本发明的疫苗具有在对应于SEQIDNO:2的氨基酸残基116的位置处缺少异亮氨酸的甲型流感NP蛋白。例如，这些甲型流感NP蛋白存在于疫苗组合物中。
如先前所述，清楚的是，由于本发明旨在避免存在与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体具有显著结合的NP，所有提及本发明的组合物中的甲型流感核蛋白时必须考虑组合物中的总甲型蛋白核蛋白。采用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒体、分裂病毒体或纯化的表面抗原(对于流感，包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯(BPL)、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。还可使用不同方法的组合来灭活流感病毒。例如BPL和UV光的组合是可用的。
迄今为止，仅在使用PandemrixTM的德累斯顿(Dresden)抗原(参见下文)进行疫苗接种的对象中检测到高于背景发生率的发作性嗜睡病病例。该德累斯顿抗原含有曲通和吐温。为降低含有水包油乳液佐剂以及抗原(其含有吐温和曲通X-100去垢剂)的流感疫苗衍生的发作性嗜睡病的风险，可考虑两种方法：(i)使用不含NP或NP含量大幅降低的抗原组分，如在亚单位疫苗中，或(ii)使用用于疫苗生产的种子病毒，其不含可结合HLADQB1*0602的NP或其片段。
因此，本发明的一个方面是一种水包油佐剂化、灭活流感疫苗，其不含有甲型流感NP蛋白或含有的甲型流感NP蛋白的质量占疫苗中总流感病毒蛋白质量的小于15％，例如小于12％、小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％，或小于1％。在一个实施方式中，该佐剂含有额外的免疫增强剂生育酚、GLA或TLR激动剂。在一个优选的实施方式中，该佐剂是AS03。在一个实施方式中，该病毒是甲醛灭活的。在一个实施方式中，该疫苗含有硫柳汞。在一个优选的实施方式中，该疫苗的抗原组分含有去垢剂，具体是吐温80和/或曲通X-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。曲通X-100与HA之间的重量/体积比是1.5至15。曲通-100TM浓度优选是10至500μg/ml。在一个特别优选的实施方式中，该疫苗是使用AS03佐剂化的纯化的亚单位疫苗。疫苗的抗原和佐剂组分可预先混合或可置于单独的容器中以由终端用户/医疗服务人员在给药前混合。本发明的一个方面是用于与水包油佐剂(特别是AS03)一起配制的上文所述抗原组分的应用。
本发明的另一个方面是一种AS03佐剂化、灭活、裂解甲型流感疫苗，其含有NP蛋白，但不含有可结合HLADQB1*0602的NP蛋白或NP片段。实现这一目的的前提是使用的主链类似于Foecetria(X-181)中使用的主链，但不同于PandemrixTM中使用的主链。在优选的实施方式中，该疫苗针对H1、H3、H5、H7或H9毒株，在特别优选的实施方式中，其针对大流行H1、H3、H5、H7或H9毒株。在一个实施方式中，该病毒是甲醛灭活的。在一个实施方式中，该疫苗含有硫柳汞；在一个替代性实施方式中，其不含防腐剂。该疫苗的抗原组分含有去垢剂，具体是吐温80和/或曲通X-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。曲通X-100与HA之间的重量/体积比是1.5至15。曲通-100TM浓度优选是10至500μg/ml。该疫苗可含有类似或相同浓度的表WO2011/051235中所示的赋形剂(参见下文)。疫苗的抗原和佐剂组分可预先混合或可置于单独的容器中以由终端用户/医疗服务人员在给药前混合。本发明的一个方面是用于与水包油佐剂(特别是AS03)一起配制的上文所述抗原组分的应用。
本发明的另一个方面是一种AS03佐剂化、灭活、裂解甲型流感疫苗，其含有的NP蛋白与HLADQB1*0602的结合亲和性在相同条件下低于来自毒株X-179A的核蛋白。在优选的实施方式中，该疫苗针对H1、H3、H5、H7或H9毒株，在特别优选的实施方式中，其针对大流行H1、H3、H5、H7或H9毒株。该疫苗的抗原组分含有去垢剂，具体是吐温80和/或曲通X-100。该疫苗可含有类似或相同浓度的表WO2011/051235中所示的赋形剂(参见下文)。疫苗的抗原和佐剂组分可预先混合或可置于单独的容器中以由终端用户/医疗服务人员在给药前混合。本发明的一个方面是用于与水包油佐剂(特别是AS03)一起配制的上文所述抗原组分的应用。
本发明的另一个方面是一种AS03佐剂化、灭活、裂解甲型流感疫苗，其含有的NP蛋白在对应于SEQIDNO:2的氨基酸116的位置中不含有异亮氨酸(参见图1)。在优选的实施方式中，该疫苗针对H1、H3、H5、H7或H9毒株，在特别优选的实施方式中，其针对大流行H1、H3、H5、H7或H9毒株。该疫苗的抗原组分含有去垢剂，具体是吐温80和/或曲通X-100。该疫苗可含有类似或相同浓度的表WO2011/051235中所示的赋形剂(参见下文)。疫苗的抗原和佐剂组分可预先混合或可置于单独的容器中以由终端用户/医疗服务人员在给药前混合。本发明的一个方面是用于与水包油佐剂(特别是AS03)一起配制的上文所述抗原组分的应用。
本发明的另一个方面是一种AS03佐剂化、灭活、裂解甲型流感疫苗，其含有的NP蛋白不含有序列LXLYXXXIXXXXXX(SEQIDNO:9)，其中X是任意氨基酸。在优选的实施方式中，该疫苗针对H1、H3、H5、H7或H9毒株，在特别优选的实施方式中，其针对大流行H1、H3、H5、H7或H9毒株。该疫苗可含有类似或相同浓度的表WO2011/051235中所示的赋形剂(参见下文)。疫苗的抗原和佐剂组分可预先混合或可置于单独的容器中以由终端用户/医疗服务人员在给药前混合。本发明的一个方面是用于与水包油佐剂(特别是AS03)一起配制的上文所述抗原组分的应用。
可通过各种方法由含病毒液体(如尿囊液或细胞培养物上清)收获病毒体。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒体的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒体以获得裂解病毒体，从而产生亚病毒体制品，包括‘吐温-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法为本领域熟知，例如参见参考文献29-34等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化全病毒来裂解该病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、6-O-(N-庚甲酰)-甲基-α-D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞弗伦(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质体转染试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒体初始纯化期间进行(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒体的材料(以去除非病毒体物质)，浓缩收获的病毒体(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒体材料中分离全病毒体，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒体(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解病毒体重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。裂解流感疫苗的示例是BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品。
纯化的流感病毒表面抗原(糖蛋白)疫苗包含表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备这些纯化形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品是流感亚单位疫苗。相对于裂解疫苗，纯化的表面糖蛋白疫苗可特别有利，引物其包含更低水平的NP蛋白。
另一种形式的灭活抗原是病毒体[35](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。其可通过使用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。一种用于制备病毒体的替代性方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。
本发明的方法还可用于生产活疫苗。通常通过从含病毒体的流体中纯化病毒体来制备这类疫苗。例如，该流体可通过离心澄清并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。目前可以获得各种形式的活减毒流感病毒疫苗(例如参见参考文献36的第17和18章)。活疫苗包括FLUMISTTM产品。
当本发明涉及活疫苗时，组合物中是否存在特定的甲型流感病毒核蛋白也可应用于疫苗内毒株编码的核蛋白，以及疫苗本身中的核蛋白。例如，甲型流感毒株可编码以下核蛋白，其中，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-118的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽。与X-179A类似，A/安阿伯/6/60主链在116位处具有异亮氨酸(参见AY210074)，且因此有用的本发明的活疫苗包含编码116处具有除异亮氨酸以外的残基(如甲硫氨酸)的NP的甲型流感病毒毒株。
该病毒可以是减毒的。该病毒可以是温度敏感型的。该病毒可以是冷适应性的。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。
HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μgHA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如用于儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8已有应用，更高剂量的(如3x或9x剂量也有使用[37,38])。因此，疫苗可包含0.1-150μgHA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等/株。在优选的实施方式中，该疫苗包含浓度小于30μg/ml的HA。其还可包含浓度小于10μg/单位剂量；7.5μg/单位剂量；小于5μg/单位剂量；或3.75μg/单位剂量的HA。
对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID50)而非HA含量来衡量剂量，且TCID50一般为106至108(优选为106.5-107.5)/株。
本发明所用的流感株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA以去除使病毒在禽类物种中具有高致病性的决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basicregion))。反向遗传学的使用促进了这类修饰。
除了适于针对大流行间期株系的免疫，本发明组合物特别用于免疫抵御大流行或潜在大流行株系。本发明适用于免疫人以及非人动物。
其抗原可有用地包含在所述组合物中的其它株系是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[39]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行株系[40]。
本发明组合物可包含来自一种或多种(如1、2、3、4或更多)流感病毒株系的抗原，包括A型流感病毒和/或B型流感病毒。当疫苗包含超过一种流感的毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合超过一种流感毒株的抗原的步骤。三价疫苗是典型的，其包含来自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株的抗原。也可用四价疫苗[41]，其包含来自两种甲型流感病毒毒株和两种乙型流感病毒毒株、或者三种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原。
流感疫苗可仅具有来自季节性流感毒株的可以，或可仅具有来自大流行毒株的可以(单价)。因此，该疫苗组合物可以是仅具有一种甲型毒株的单价大流行毒株。其还可具有来自季节性和大流行流感毒株的抗原。例如，该疫苗可以是四价疫苗，包含来自三种季节性流感毒株(例如两种甲型和一种乙型毒株)和一种大流行流感毒株。三级季节性流感疫苗还可与单价大流行流感疫苗共同给予。
在一个优选的实施方式中，该疫苗包含来自4种或更多种流感病毒毒株的抗原。在一个具体的优选实施方式中，该疫苗含有2种甲型和2种乙型毒株，例如(i)H1N1毒株；(ii)H3N2毒株；(iii)B/维多利亚/2/87-样毒株；和(iv)B/山行/16/88-样毒株。在另一个特别优选的实施方式中，一种毒株是大流行毒株如H5N1或H7N9毒株，其与例如(i)A/H1N1毒株；(ii)A/H3N2毒株；和(iii)乙型毒株联用。4价或更高价的疫苗可以是佐剂化的。
甲型流感病毒目前显示18种HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。目前具有九种NA亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在包含两种甲型流感病毒毒株的疫苗中，这些毒株通常来自不同的HA亚型(如H1和H3)和不同的NA亚型(如N1和N2)，因此疫苗可包含来自例如H1N1毒株和H3N2毒株的抗原。
乙型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株属于两种不同的谱系。这些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA[42]。当本发明的疫苗包含来自两种B型流感病毒株的抗原，所述毒株通常可为一种B/维多利亚/2/87样毒株和一种B/山行/16/88样毒株。通常可从抗原性区分这些毒株，但氨基酸序列的差异也可以区分这两种谱系，例如B/山行/16/88样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对'Lee40'HA序列进行编号)的HA蛋白[43]。
药物组合物
如本发明所述制备的疫苗组合物是药学上可接受的。它们通常还包含抗原外的其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献44。
疫苗组合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可为干燥形式，如可注射固体或贴片上的干燥或聚合制品的形式。
疫苗组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[33,45]。更优选无汞的疫苗。可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物[33]。特别优选不含防腐剂的疫苗。
为了控制张力，优选包含生理盐(如钠盐)。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是1-20mg/ml。可以存在的其它盐，包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
疫苗组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[46]，但优选将渗透压保持在此范围内。
疫苗组合物可含有一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(尤其是含氢氧化铝佐剂时)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般为5至20mM的范围。
疫苗组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。
该疫苗组合物优选无菌。该疫苗组合物优选无热原，如小于1EU/剂量(内毒素单位，标准量度)，优选小于0.1EU/剂量。该疫苗组合物优选不含谷蛋白。
本发明的疫苗组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为'吐温')、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵('CTAB')或脱氧胆酸钠，特别用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中可包含各自的含量小于1mg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
疫苗组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，该组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。
流感疫苗的给药剂量体积(单位剂量)一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。
组合物和药盒优选储存于2℃-8℃。其不应冷冻。理想情况下应避直射光保存。
宿主细胞DNA
由细胞系分离和/或培养病毒时，标准实践是使最终疫苗中残留的细胞系DNA含量最小化，以最小化该DNA的潜在致癌活性。
因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有每剂量低于10ng(优选低于1ng，更优选低于100pg)的残留宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。
任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。
在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如色谱法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来提高对残留宿主细胞DNA的去除。参考文献47和48公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理，这一步可以在病毒生长过程中使用，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理，这一步可以在病毒体破坏过程中使用。也可利用烷化剂(如β-丙内酯)处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒体[49]。当使用DNA酶或烷化剂进行DNA去除时，该DNA酶或烷化剂(优选BPL)还可在生产过程期间添加超过一次(例如两次)。还可使用DNA酶和烷化剂的组合实现DNA去除。
佐剂
本发明组合物宜包含佐剂，其作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。优选的佐剂包含水包油乳液。已知多种这类佐剂，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
所述乳液可以包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其是本文特别优选的。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。
对于一些实施方式，另一种优选的油是α-生育酚。D-α-生育酚和DL-α-生育酚都可使用，但优选的α-生育酚是DL-α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。如果采用这种生育酚的盐，那么优选的盐是琥珀酸盐。可使用包括角鲨烯和生育酚(如DL-α-生育酚)的油的组合，如同AS03佐剂中观察到的那样。然而，如同上文解释的那样，在一些实施方式中，乳液不包含任何额外的免疫刺激剂，在这种情况中乳液将不包含α-生育酚。
包含角鲨烯的水包油乳液是最优选的用于本发明的佐剂，例如MF59或AS03(或缺少生育酚的修饰的AS03)。因此，优选的乳液可基本由以下物质组成：(i)水或缓冲液、(ii)角鲨烯和(iii)聚山梨酯80和/或去水山梨糖醇三油酸酯。
可以使用油的混合物。
表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是适用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂含量(重量百分比)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。
该疫苗含裂解病毒时，优选在水相中含有游离的表面活性剂。这是有利的，因为游离表面活性剂可在抗原上产生‘裂解效果’，因此破坏否则可能存在的任何未裂解病毒体和/或病毒体聚集体。游离的表面活性剂还可避免可能存在的任何未裂解病毒克隆的聚集。这可改善裂解病毒疫苗的安全性[50]。
优选的乳液的平均液滴大小为小于1μm，例如小于等于750nm、小于等于500nm、小于等于400nm、小于等于300nm、小于等于250nm、小于等于220nm、小于等于200nm或更小。可通过某些技术(如微流化)方便地获得这些液滴尺寸。
本发明所用的具体水包油乳剂佐剂包括但不限于：
·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[51-53]，参考文献54的第10章和参考文献55的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液优选包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·包含角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。这些乳剂可含有(以体积计)2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，且角鲨烯:生育酚的重量比优选小于等于1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳剂。角鲨烯和聚山梨酯80可以约5:2的体积比或者约11:5的重量比存在。因此这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。一种这类乳液(‘AS03’[56])每剂量具有4.86mg聚山梨酯80、10.69mg角鲨烯和11.86mgα-生育酚(或其部分，但维持质量比率)，例如在0.5ml体积中。可通过将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5gDL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物相混合，随后使该混合物微流体化来制备AS03。所得乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[57]，例如，以上述比例。
·角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸盐缓冲液。
·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(例如，750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲液。
·角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“PluronicTML121”)的乳液。该乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与苏氨酰基-MDP一起用于“SAF-I”佐剂中[58](0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％PluronicL121和0.2％聚山梨酸酯80)。也可不与Thr-MDP一起使用，例如在“AF”佐剂中[59](5％角鲨烷、1.25％PluronicL121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
·含有角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。所述乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)小于200nm[60]。该乳液也可含有一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。所述乳液可包含TLR4激动剂[61]。可将这类乳液冻干。
·角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[62]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％角鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼克(pluronic)多元醇)和2％Abil-Care85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献63所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献74所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[65]。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[66]。
·包含矿物油、非离子亲脂水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[66]。
在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此组合物以液体含佐剂形式包装。该抗原通常采用水性形式，从而最终通过混合两种液体来制备疫苗。待混合的两种液体的体积比可变(例如5:1-1:5)，但一般是约1:1。在上述具体乳液说明中给出组分浓度时，这些浓度通常用于非稀释组合物，因此所述浓度在混合抗原溶液后会降低。
本发明的组合物可包含额外的免疫刺激剂。在优选的实施方式中，该额外的免疫刺激剂是TLR激动剂，即可使Toll样受体促效的化合物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂。所述TLR激动剂能够激活TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR11中的任何一种；优选其能够激活人TLR4或人TLR7。
本发明的组合物可包含多于一种TLR激动剂。这两种激动剂彼此不同，并且其能够靶向相同的TLR或不同的TLR。
化合物针对任何特定Toll样受体的激动剂活性可通过标准试验来测定。诸如茵姆基因公司(Imgenex)和英杰公司(Invivogen)的公司供应稳定共同转染了人TLR基因和NFκB的细胞系，以及合适的报告基因以供检测TLR激活通路。其为灵敏的、宽工作范围动力学而设计，并且能够用于高通量筛选。此类细胞系中通常存在一种或两种特异性TLR的组成型表达。本领域已知多种TLR激动剂，例如，US-4,666,886描述了某些脂肽分子是TLR2激动剂，WO2009/118296、WO2008/005555、WO2009/111337和WO2009/06708各自描述了TLR7的小分子激动剂种类，而WO2007/040840和WO2010/014913描述了用于治疗疾病的TLR7和TLR8激动剂。
可用于本发明的TLR7激动剂可以是苯并萘啶，例如具有式T1的那些：
其中
R1是H、C1-C6烷基、-C(R5)2OH、-L1R5、-L1R6、-L2R5、-L2R6、-OL2R5或-OL2R6；
L1是–C(O)-或–O-；
L2是C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L2的C1-C6亚烷基和C2-C6亚烯基任选地由1～4个氟基团取代；
L3各自独立地选自C1-C6亚烷基和-((CR4R4)pO)q(CH2)p-，其中L3的C1-C6亚烷基任选被1至4个氟基团取代；
L4是亚芳基或杂亚芳基；
R2是H或C1-C6烷基；
R3选自C1-C4烷基、–L3R5、-L1R5、-L3R7、-L3L4L3R7、-L3L4R5、-L3L4L3R5、-OL3R5、-OL3R7、-OL3L4R7、-OL3L4L3R7、-OR8、-OL3L4R5、-OL3L4L3R5和-C(R5)2OH；
R4各自独立地选自H和氟；
R5是-P(O)(OR9)2，
R6是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R7是–CF2P(O)(OR9)2或-C(O)OR10；
R8是H或C1-C4烷基；
R9各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R10是H或C1-C4烷基；
p各自独立地选自1、2、3、4、5和6，以及
q是1、2、3或4。
这些化合物的其他细节公开于WO2011/049677，且本发明可使用其中的化合物1-28中任一种。优选的式T1的化合物的示例包括：
其他有用的TLR7激动剂包括但不限于WO2009/111337中公开的化合物1-247中任一种或WO2012/031140中公开的化合物1-102中任一种。
可用于本发明的TLR激动剂可以是具有式T2的脂肽：
其中：
R1是H、-C(O)-C7-C18烷基或–C(O)-C1-C6烷基；
R2是C7-C18烷基；
R3是C7-C18烷基；
L1是-CH2OC(O)-、-CH2O-、-CH2NR7C(O)-或-CH2OC(O)NR7-；
L2是-OC(O)-、-O-、-NR7C(O)-或-OC(O)NR7-；
R4是-L3R5或-L4R5；
R5是–N(R7)2、-OR7、-P(O)(OR7)2、-C(O)OR7、-NR7C(O)L3R8、-NR7C(O)L4R8、-OL3R6、-C(O)NR7L3R8、-C(O)NR7L4R8、-S(O)2OR7、-OS(O)2OR7、C1-C6烷基、C6芳基、C10芳基、C14芳基、包含选自O、S和N的1至3个杂原子的5至14元环杂芳基，包含选自O、S和N的1至3个杂原子的5至6元环杂环烷基或C3-C8环烷基，其中R5的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基各自未经取代，或者R5的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基各自被独立地选自-OR9、-OL3R6、-OL4R6、-OR7和-C(O)OR7的1至3个取代基取代；
L3是C1-C10亚烷基，其中L3的C1-C10亚烷基未经取代，或者L3的C1-C10亚烷基被1至4个R6基团取代，或者L3的C1-C10亚烷基在相同碳原子上被两个C1-C6烷基基团取代，这两个C1-C6烷基基团和其连接的碳原子一同形成C3-C8环烷基；
L4是-((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-或-(CR11R11)((CR7R7)pO)q(CR10R10)p-，其中各R11是C1-C6烷基基团，所述C1-C6烷基基团与其相连的碳原子一同形成C3-C8环烷基；
R6各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、被1～2个羟基基团取代的C1-C6烷基、-OR7、-N(R7)2、-C(O)OH、-C(O)N(R7)2、-P(O)(OR7)2、C6芳基、C10芳基和C14芳基；
R7各自独立地选自H和C1-C6烷基；
R8选自–SR7、-C(O)OH、-P(O)(OR7)2和包含选自O和N的1至3个杂原子的5至6元杂环烷基；
R9是苯基；
R10各自独立地选自H和卤素；
p各自独立地选自1、2、3、4、5和6，以及
q是1、2、3或4。
这些化合物的其他细节公开于WO2011/119759，且本发明可使用其中公开的任意化合物，例如其实施例1-92，和其中权利要求17所列举的化合物。另一种有用的TLR激动剂是棕榈酰-Cys(2[R],3-二月桂酰氧基-丙基)-Abu-D-Glu-NH2，其中：Cys是半胱氨酸残基，Abu是氨基丁酸残基且Glu是谷氨酸残基。该化合物公开于US-4,666,886的实施例16，且具有式T3a：
式T1或T2或T3a的激动剂所存在的形式可以是：药学上可接受的盐、药学上可接受的溶剂合物(如水合物)、N-氧化物衍生物、异构体(包括互变异构体或对映异构体)或异构体的化合物等。一种特别有用的盐是化合物T1c的精氨酸盐，其可用作精氨酸盐单水合物。
其他有用的TLR激动剂是以下化合物：
多种有用的TLR4激动剂是本领域已知的，其中许多是单磷酰脂质A(‘MPLA’)或内毒素或脂多糖(LPS)的类似物。例如，用于本发明的TLR4激动剂可以是：
(i)3d-MPL(即3-O-去酰化的单磷酰基脂质A；也称为3-去氧-酰化单磷酰基脂质A或3-O-去酰化-4'-单磷酰基脂质A)。该内毒素的单磷酰基脂质A部分的衍生物含有葡糖胺还原性末端的3位脱酰化位点。其已由明尼苏达沙门菌(Salmonellaminnesota)的无庚糖突变体制备，并且在化学上类似于脂质A但缺少酸不稳定性的磷酰基基团和碱不稳定性的酰基基团。3d-MPL的制备最初在GB-A-2220211中有描述，并且该产品已被科雷莎公司(CorixaCorporation)生产并出售。其存在于GSK公司的“AS04”佐剂中。其他细节可参见Myers等(1990)《内毒素反应的细胞和分子机理》(Cellularandmolecularaspectsofendotoxinreactions)的第145-156页，Johnson等(1999)JMedChem42:4640-9；Baldrick等(2002)RegulatoryToxicolPharmacol35:398-413
(ii)吡喃葡糖基脂A(GLA)(Coler等(2011)PLoSONE6(1):e16333)或其铵盐，例如
(iii)氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529或CRX-524(Johnson等(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278；Evans等(2003)ExpertRevVaccines2:219-229；Johnson等(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278；Evans等(2003)ExpertRevVaccines2:219-229；Bazin等(2006)TetrahedronLett47:2087-92)。RC-529和CRX-524具有如下结构，区别在于其R2基团：
R1＝H，R2＝n-C13H27CO，n＝1(RC-529)
R1＝H，R3＝n-C9H19CO，n＝1(CRX-527)
(iv)含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，如E5564(Wong等(2003)JClinPharmacol43(7):735-42,US2005/0215517)。
(v)如WO03/105769中定义的式I、II或III的化合物或其盐，如化合物‘ER803058’、‘ER803732’、‘ER804053’、‘ER804058’、‘ER804059’、‘ER804442’、‘ER804680’、‘ER803022’、‘ER804764’或‘ER804057’。ER804057也被称为E6020，其具有如下结构：
而ER803022具有如下结构：
(vi)Peppoloni等(2003)ExpertRevVaccines2:285-93所公开的多肽配体中的一种。
优选的TLR4激动剂是单磷酰基脂质A(MPL)的类似物。
其他免疫增强剂还可包括不通过TLR发挥作用的免疫增强剂(SMIP)。具体而言，可用于本发明的SIMP可使C型凝集素受体(CLR)或CD1d而非TLR(或除TLR以外)促效。因此，本发明包括参考TLR激动作用的上文所述内容，但其中TLR激动剂(或类似物)被CLR激动剂或CD1d激动剂取代。
CLR激动剂包括但不限于：海藻糖-6,6'-二霉菌酸酯(TDM)、其合成类似物D-(+)-海藻糖-6,6'-二山嵛酸酯(TDB)以及海藻糖和脂肪酸的其他6,6'-二酯。因此，本发明可应用于作为CLR激动剂的海藻糖酯和二酰基海藻糖。这些激动剂可具有式(C)：
其中R1C(O)-和R2C(O)-是相同或不同的且是酰基基团。合适地酰基基团可以是饱和或不饱和的。其可选自霉菌酸、白喉菌酸(corynomycolicacid)、2-十四烷基-3-羟基十八烷酸、2-二十烷基-3-羟基二十四烷酸、布尔吉尼克酸(bourgeanicacid)、山萮酸、棕榈酸等的酰基残基。有用的霉菌酸包括α-、甲氧基-和酮基-霉菌酸，其可以是顺式或反式形式。
CD1d激动剂包括但不限于α-糖基神经酰胺(DeLibero等，NatureReviewsImmunology,2005,5:485-496；美国专利5,936,076；Oki等，J.Clin.Investig.,113:1631-1640US2005/0192248；Yang等，Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43:3818-3822；WO2008/047249；WO2008/047174)如α-半乳糖基神经酰胺。因此，本发明可应用于作为CD1d激动剂的糖基神经酰胺，包括α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1,3,4-十八烷三醇、OCH、KRN7000、CRONY-101、3"-O-硫代-半乳糖基神经酰胺等等。
在一些实施方式中，本发明使用‘铝盐’佐剂(例如与上文所述TLR激动剂联用)。术语‘铝盐’在本发明中指铝的盐，且有用的铝盐包括但不限于氢氧化铝和磷酸铝佐剂。此类盐在参考文献54的第8和第9章中有描述。包括氢氧根离子的铝盐是本发明优选的铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝(其包含羟基磷酸铝)。氢氧化铝佐剂是最优选的。组合物可包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物。用于给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于1mg/ml，且优选0.85mg/单位剂量的最大值。
疫苗组合物的包装
适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷雾等。这些容器应无菌。
组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在加入组合物之前，摇瓶优选已灭菌。为了避免胶乳过敏患者的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。该药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量(‘多剂量’药瓶)，如10个剂量。优选地，药瓶由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如鲁尔(Luer)锁)，从而预填装注射器可插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中复溶冻干物质)，并可以将药瓶的内容物移回注射器中。从药瓶移出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子移除后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶可装有允许无菌取出其内含物的瓶帽。
将某一组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器中的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时意外脱出。注射器可以具有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，且该顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选地装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名“Tip-Lok”TM销售的注射器。
容器可标注显示半剂量体积，例如以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可有显示0.25ml体积的标记。
在使用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警示，例如准备好肾上腺素溶液以防疫苗接种后发生过敏反应等。
治疗方法和疫苗的给药
在一个方面中，本发明提供了一种向患者给予流感疫苗的方法，所述患者已被发现为HLADQB1*0602单倍型阴性，优选的疫苗包含至少一种甲型流感病毒。在2009年，所有在给予PandemrixTM疫苗后发生发作性嗜睡病症状的患者都被发现具有该表型且因此需要对该患者组特别小心。
患者测试和给予流感病毒疫苗可基本同时进行(例如在同一次访问健康专业机构期间)。然而，更常见的是患者在接受流感疫苗前一些时间被测试。例如，测试步骤和给药步骤可彼此相隔数天、数月或甚至数年。
测试患者的HLADQB1*0602单倍型的方法是本领域已知的。这些方法可涉及例如单倍型的测序或至少一部分HLA的PCR扩增。还可使用单倍型特异性探针进行(例如在Southern印迹试验中)，所述探针可区分不同的HLA单倍型。该患者可以是对HLADQB1*0602纯合的；或该患者可以是对HLADQB1*0602单倍型杂合的，其中仍可有利地将这类患者排除出接受流感疫苗。
本发明提供了一种根据本发明生产的疫苗。这些疫苗组合物适合给予人类或非人动物对象如猪或鸟类，且本发明提供了在对象中产生免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予所述对象的步骤。本发明还提供用作药物的本发明组合物，并提供本发明组合物在生产在对象中产生免疫应答的药物中的应用。
这些方法和应用产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价给出对同源病毒感染产生约50％保护作用)[67]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。
可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[68-70]、口服[71]、皮内[72,73]、经皮、透皮[74]等。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，人对象可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选对象是老年人(例如大于等于50岁、大于等于60岁，优选大于等于65岁)、年轻人(如小于等于5岁)、住院对象、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病对象、免疫缺陷对象、在接受该疫苗7天前接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的对象、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而该疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。对于大流行毒株，优选给予所有年龄组。
本发明优选组合物满足1、2或3个CPMP功效标准。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：
(1)大于等于70％血清保护；(2)大于等于40％血清转化；和/或(3)GMT增加大于等于2.5倍。在老年人(大于60岁)中，这些标准是：(1)大于等于60％血清保护；(2)大于等于30％血清转化；和/或(3)GMT增加大于等于2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。
可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种抵御新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等基本同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本同时给药。
相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一用药咨询或就诊期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2,6-脱水-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒药物是(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸，乙酯和磷酸盐(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU)TM)。
概述
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。
与两种氨基酸或氨基酸序列相关时，术语“对应于”指通过成对比对算法进行序列比对时彼此对齐的氨基酸。确定相同性百分比的优选成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[75]，使用默认参数(例如，缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62计分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[75]。与序列比较相关时，相同的原则应用于术语“等同于”，即确定给定序列是否具有等同于SEQIDNO:1或2的氨基酸106-126的序列将通常涉及上文所述比对。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将组合与第三种组分合并等。
本方法的各步骤可在相同或不同时间、相同或不同地理位置如国家以及由相同或不同人或实体进行。
将动物(且特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的条件下培养细胞。
将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物或可由合适的前药替代。
两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献77的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献78中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
两个核酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同碱基的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献77的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对程序是GCGGap(威斯康星州的遗传计算机组(GeneticsComputerGroup)，套件版本10.1)，优选使用以下默认参数：开放缺口＝3；延伸缺口＝1。
附图说明
图1来自表3的核衣壳X-179A/X-181序列片段与食欲素受体2(Ox1R)和食欲素受体1(Ox2R)之间的史密斯-沃特曼比对。没有其他的流感片段与食欲素家族序列之间的比对小于0.4。该比对使用来自具有默认参数的FASTA包的程序搜索生成。比对中显示Ox2R和Ox1R的区域在Uniprot中标注为胞外。
实施例
发作性嗜睡病和H1N1大流行
分子模拟(molecularmimicry)是一种进化适应，其中病毒和细菌尝试欺骗机体使其能够自由进入宿主组织。这类模拟通过向免疫系统显示看上去类似于本身的氨基酸段(stretch)来起作用。在对微生物产生应答的过程中，免疫系统易于攻击相应自身组分(例如多发性硬化中的腺病毒2型和髓磷脂碱性蛋白)。
自身免疫疾病和自然感染
管理自身免疫疾病患者的临床医师通常观察到，自然感染可触发和扩大自身免疫疾病活性的严重程度。类似地，自然感染被认为在诱导遗传易感宿主中的疾病方面起重要作用。在H1N1大流行中，截止2009年5月在中国北京有153名对象感染H1N1，这一数字在2009年11月上升至估计118万名感染对象。截止11月，已向1700万人的群体给予了136万次剂量的无佐剂化H1N1疫苗(即0.8％的群体接受疫苗接种)。H1N1感染高峰之后的6个月，据报道在北京组中新发作性嗜睡病病例增加了3至4倍(n＝142)，其中仅5.6％的患者被报道接受疫苗接种。这向发明人表明，PandemrixTM治疗的患者中观察到的发作性嗜睡病可能与H1N1毒株本身相关，可能是由于分子模拟。
与PandemrixTM疫苗抗原相关的病理学模拟
如上文所述，PandemrixTM疫苗与发作性嗜睡病相关而在使用FocetriaTM进行疫苗接种后没有观察到发作性嗜睡病的增加。用于PandemrixTM的疫苗抗原的来源是高产甲型H1N1重配X-179A而用于FocetriaTM的疫苗抗原的来源是高产甲型H1N1重配X-181。
对于大流行H1N1疫苗制备，通过以下方法生成X-179A(用于PandemrixTM)：杂交高产毒株X-157(其具有可追踪至A/波多黎各/8/1934(PR8)的内部蛋白质)与A/加利福尼亚/07/2009(H1N1亚型)(其促进表面抗原HA和NA，和内部蛋白质PB1)。出于不合适产量的考虑，在2009年7月14日将32倍产出的X-179A通过与X-157再次杂交进行再重配，从而生成64倍产出的X-181(用于FocetriaTM和其他季节性疫苗)。该功能性差别不仅与来自重配株的基因区段组合相关，而且与已有变体和适应于鸡蛋宿主(胚蛋接种)期间选择的病毒突变相关。类似的结果发生于1976年针对猪流感制备的X-53和X-53a重配株，其不是抗原上可区分的但在X-53a的HA基因中具有单个氨基酸变化，其将产量提高了16倍。因此，与用于FocetriaTM的X-181相比，用于PandemrixTM的X-179A可能具有其他性质上的差别，如同将在下文中解释的那样。
PandemrixTM和FocetriaTM的纯化过程具有显著差异。裂解病毒体疫苗(如PandemrixTM)和亚单位疫苗(如FocetriaTM)在生产技术方面在世界卫生组织的文件中被定义为流感疫苗，如下文所述：
大部分流感疫苗是‘裂解’疫苗，其通过去垢剂处理纯化的流感病毒生产。裂解过程分解病毒以允许相关抗原部分纯化(第8页)……与全病毒制备物相比，裂解疫苗能更好地表征，含有较少卵清蛋白并声称反应原性较低(第13页)。如同裂解病毒那样生产了亚基或表面抗原疫苗，但进行较严格的纯化使得该疫苗几乎排外地由高度纯化的HA和NA组成并具有最低含量的污染性N、基质蛋白、核蛋白和脂质。
与HA相比，完整流感病毒中核蛋白和基质蛋白含量分别高2倍和6倍，使得这两种内部蛋白质最可能继续存在，这取决于用于富集HA和NA的纯化过程的类型。实际上，先前的研究表征了裂解病毒体疫苗Fluzone和MFV-Ject和纯化的抗原/亚基流感疫苗Fluviri和Influvac(其在1992时可于英国获得)[78]。基于电子显微镜，病毒核蛋白在裂解病毒体疫苗中容易变得明显，且通过SDS-PAGE胶可在所有疫苗中检测到处于变化的水平(裂解病毒体大于纯化的抗原/亚基)。
由于发作性嗜睡病中涉及食欲素受体的突变和食欲素细胞的损失，我们假设PandemrixTM中的疫苗抗原可具有独特的特性导致食欲素(下视丘分泌素)或其受体的分子模拟。因此，对来自X-179A、X-181的流感蛋白和食欲素相关序列(食欲素、食欲素A、食欲素B、食欲素受体1、食欲素受体2和HLA-DQB1)进行序列分析。由于PandemrixTM毒株X-179A涉及发作性嗜睡病病例但FocetriaTM不涉及，所以首先比较流感蛋白中疫苗病毒毒株X-179A(Pandremix相关)和X-181(FocetriaTM相关)之间的差异，其可以解释与发作性嗜睡病之间的关联。根据先前描述的电子显微镜和SDS-PAGE研究，仅包括预期存在于疫苗制备物中的蛋白质(HA、NA、NP和M1)。
为确定潜在的氨基酸变化，通过适当毒株名称(X-179A、X-181、A/加利福尼亚/07/2009(H1N1))进行查询从NCBI的流感病毒资源[79]中提取流感序列并除去重复序列。预期存在于疫苗制备物中的各流感蛋白(HA、NP、M1、M2、NA)跨毒株进行比较以鉴定其中X-179A与X-181相差至少一个残基的序列。发现三个氨基酸差异，其中一个在HA中且两个在NP中(表1)：
随后使用史密斯-沃特曼比对将差异前后包含10个残基的子序列与食欲素相关序列比较。仅四项比对的e值低于0.4(第二最佳e值大于0.4，使得最佳e值比对与第二最佳的比率为10:1，这是所示比对与其他比对的良好分离)。比对是在来自X-179A和X-181的核衣壳蛋白片段(含有单个残基差异)和食欲素受体1和2之间进行(图1)。由于X-179A形式的核衣壳片段与免疫表位数据库(www.iedb.org)中报道的多种表位重叠，其与食欲素受体1和2(其涉及发作性嗜睡病)的重叠表明模拟的潜力且可以解释给予PandemrixTM疫苗后某些欧洲国家中观察到的发作性嗜睡病。有趣的是，X-179A形式的核衣壳片段还与来自H1N1感染的那些相同(符合报道的感染与发作性嗜睡病之间的联系)[80]，而X-181形式(FocetriaTM相关)的相同核衣壳片段含有可解释缺少FocetriaTM与发作性嗜睡病关联的单个氨基酸取代。
具有PandemrixTM相关发作性嗜睡病的患者均不例外是HLADQB1*0602。因此，在瑞典，所有28个疫苗接种后发作性嗜睡病病例都是HLADQB1*0602。在芬兰，2010年使用PandemrixTM接种的所有34名HLA型发作性嗜睡病患者都是HLADQB1*0602。HLADQB1*0602的结合基序是已知的。HLADQB1*0602的核心结合基序位于位置1、3、4、6和9处。存在一种食欲素受体1和2的登记物与该基序契合良好，对于肽LILYDKEEIRRIWRQANNG(SEQIDNO:10)，在位置1和3处具有脂族氨基酸且在位置4处具有疏水性氨基酸。虽然位置6不契合该基序，但位置9是脂族的且提供良好的契合[81]。在发作性嗜睡病中，具有最大体积的P4结合口袋对于易感性至关重要，且一些已知的0602的强结合物的示例在P4处具有酪氨酸[8]。
PandemrixTM疫苗还可包含H1N1感染剂的某些组分，其负责对导致发作性嗜睡病的自身抗原(下丘脑分泌素或其受体)的分子模拟物产生应答。然而，必须在得出定义性结论之前仍保持适当警觉，原因在于与AS03佐剂化PandemrixTM疫苗和AS03佐剂化H1N1大流行疫苗Arepanrix(在加拿大给予且没有报道接种相关发作性嗜睡病的增加)相关的发作性嗜睡病信号的不一致。这可能表明，简单存在致病性抗原可能无法单独解释该联系，或者AS03佐剂化疫苗中裂解疫苗抗原的存在或展示中可能因为生产位点的裂解/纯化过程中的差异而具有差异(德累斯顿的PandemrixTM和加拿大的魁北克)。估计德累斯顿制造的3080万次剂量的GSKAS03佐剂化H1N1疫苗已用于超过47个国家，这起始于2009年10月，在一些国家(包括芬兰、瑞典、挪威和爱尔兰)的覆盖程度高。魁北克制造的GSKAS03佐剂化H1N1疫苗在加拿大的覆盖程度高(Arepanrix)，其中预计1200万次剂量被给予，且也在若干其他国家进行给药。加拿大正在进行的流行病学研究将在适当时机报道发作性嗜睡病与AS03佐剂化H1N1疫苗(Arepanrix)之间的任何联系。
德累斯顿抗原含有聚山梨酯80(吐温80)和曲通X-100，而魁北克抗原不含有这些赋形剂。推测这些去垢剂可能影响发作性嗜睡病的发展(参见评估报告《大流行疫苗之间的免疫学差异》(Immunologicaldifferencesbetweenpandemicvaccines)EMA/687578/2012)。因此，在由含有吐温80和/或曲通X-100的抗原(如德累斯顿抗原)生产的疫苗中避免存在NP蛋白特别重要。这具体应用于使用水包油乳液(如MF59或AS03)佐剂化的疫苗，因为发作性嗜睡病未出现于非佐剂化的衍生自德累斯顿抗原的季节性疫苗中(参见下文)。
下文表2显示德累斯顿中制备的2种不同的灭活裂解病毒体H1N1抗原组分的组成(WO2011/051235第41页)。
GSK非佐剂化H1N1季节性流感疫苗中不存在发作性嗜睡病
虽然由GSK制造的大流行和季节性流感疫苗都含有相同的H1N1抗原，但在季节性疫苗中使用非佐剂化H1N1抗原未报道发作性嗜睡病信号，这将立即导致怀疑通过佐剂产生的过量免疫刺激是发作性嗜睡病的病因。然而，在前文关于裂解病毒疫苗中是否的隐蔽抗原的讨论下，也可解释发作性嗜睡病与病理学抗原之间不符合的关联，所述病理学抗原通过AS03佐剂被优先或更有效地呈递至免疫系统–应注意改进的抗原呈递是使用任何佐剂所需和期待的作用。佐剂可以以下若干种方式发挥作用：1)递送抗原至免疫系统，2)增强抗原呈递细胞(APC)对抗原的摄取，或3)使用疫苗改变抗原的结构构象，从而允许逐步释放、延迟的清除和更好地暴露于免疫系统。水包油乳液的作用模式被较好地理解且目前被认为涉及调控先天炎症应答、APC招募和激活、注射位点处抗原持续性的增强、调控抗原呈递至免疫活性细胞，以及引发不同的细胞因子模式。
免疫学解释
来自使用免疫表位数据库和分析资源(IEDB)的关于甲型流感病毒的抗体和T细胞表位的2007年公开的保守性分析的相关发现是，与T细胞表位相比缺少抗体表位，其中最高的T细胞表位数目来源于血凝素蛋白和核蛋白[82]。此外，T细胞表位比抗体表位更保守，其中在人H1N1毒株至80％相同性水平下50％保守，表明流感中T细胞表位的显著的毒株间交叉反应性水平。甲型流感的核蛋白可有效地由I型和II型主要组织相容性复合物呈递且能够扩增CD8+和CD4+特异性效应T淋巴细胞分泌性γ干扰素和肿瘤坏死因子[83]。交叉反应性抗甲型流感细胞毒性淋巴细胞(CTL)的主要靶抗原和含有PR8核蛋白基因的重组疫苗病毒都可刺激和促进强力的二级交叉反应性CTL应答[84]。正是出于这个原因，与较纯的亚单位疫苗相比，含有大量非表面蛋白的裂解病毒体流感疫苗将预期提高细胞介导的免疫应答。然而，这是一把双刃剑，因为对定义的病毒(或疫苗改性的)核蛋白的表位生成强力交叉反应性CTL应答的相同免疫学机制可以是有问题的，前提是其模拟导致T细胞介导的自身免疫的宿主组织(如食欲素受体)，所述自身免疫在遗传易感宿主(如DBQ1*0602)中退化为自身免疫疾病(如发作性嗜睡病)。PandemrixTM核蛋白片段与食欲素受体的比对是有趣的，因为还在食欲素2受体敲除小鼠和食欲素敲除小鼠中生成了不同的发作性嗜睡病综合征(可能通过缺陷的食欲素至食欲素1受体信号转导)[85]。有趣的是，如果FocetriaTM中存在痕量的免疫原性核蛋白，则在与食欲素受体对齐的核蛋白片段中存在一个氨基酸取代(甲硫氨酸)，使其与PandemrixTM核蛋白和H1N1感染的片段区分(两者都具有异亮氨酸)。FocetriaTM中含有的核蛋白中的这一氨基酸取代(继承自X-181疫苗毒株)可在功能上与流感病毒中的类似，其中，与高度保守的基质蛋白相反，核蛋白中的多个氨基酸取代促使从CTL介导的免疫监控中逃逸[86]。
HLA单倍型结合试验
通过使用无细胞REVEALTMII型结合技术分析多种HLA-DRB1*单倍型与肽的结合(参见参考文献87)。该技术测量合成的测试肽稳定MHC-肽复合物的能力。检测是基于是否存在MHC-肽复合物的天然构象，其通过特异性单抗进行检测。对各肽给出相对于阳性对照肽的评分，所述阳性对照肽是已知的T细胞表位。该评分定量报道为与阳性对照肽相比测试肽生产的信号的百分比。在时间零处评估评分并在24小时后再次评估。该分析还生成稳定性指数，其代表各肽与测试的MHCII复合物的结合的稳定性。
总共测试了18种肽，加一个阳性对照：
测试了两种HLA单倍型：DQA1*0102:DQB1*0602；和DQA1*0101:DQB1*0501。如上文讨论的那样，DQB1*0602单倍型与发作性嗜睡病存在已知的联系，但基于患者的HLA分型研究，DQB1*0501单倍型似乎针对发作性嗜睡病的发展进行保护。
结合结果如下所示：
存在四种DQB1*0602HLA单倍型的强结合物，即肽#1、#5、#9和#11(大于阳性对照信号的15％)。与在时间0处且24小时后仍强力结合的X179-A肽(#1)不同，来自X181的相应片段(#2)在两个时间点处都是较差的结合物。
突出，所有肽与DQB1*0501单倍型的结合稳定性都较弱。肽#1仍良好地结合但在24小时后明显较不稳定。肽#3(肽#1的较短形式)与该单倍型的结合优于DQB1*0602，而#4(#2的较短形式)是0501单倍型的较差的结合物。因此，与清楚地与发作性嗜睡病患者相关的DQB1*0602相比，这些NP肽与似乎针对发作性嗜睡病的发展进行保护的单倍型(DQB1*0501)的结合较差。
15聚体食欲素片段(#10)不结合任一种HLA单倍型，但具有Thr→Ile突变的该肽的经修饰形式(#11)是强结合物。鉴于参考文献8的报道，肽#10的结果并不令人吃惊，参考文献8报道了该片段需要15氨基酸接头以‘促进与DQB1*06:02HLA形成复合物’。Thr→Ile突变将肽转化为强结合物的能力支持毒株X179-A的NP中异亮氨酸在赋予对DQB1*06:02HLA单倍型的亲和性方面的重要性。
肽#12的结果显示，将肽#10中的苏氨酸变为甲硫氨酸不会允许或改进与HLADQB1*0602(与发作性嗜睡病相关的等位基因)的结合且因此确认了使用DQB1*0602相关肽#1和#2所观察到的结果。
总体而言，这些结果显示肽#1和#2显示与HLA-DQA1*01:02DQB1*06:02显著不同的结合。肽1与该等位基因具有良好结合，且其高稳定性评分表面该结合是强的。相反，肽#2显示低初始结合，且仅非常小部分的复合物在24小时后保留，表明较短的结合半衰期和不稳定的复合物。因此，与肽#2(X-181核蛋白的氨基酸106-126且在位置116处含有甲硫氨酸残基)相比，肽#1(X-179A核蛋白的氨基酸106-126且在氨基酸位置116处含有异亮氨酸残基)更强地结合且具有更好的稳定性。因此，这些数据支持我们的以下假说，即X-179A核蛋白而非X-181核蛋白可涉及特异性针对具有HLA-DQB1*06:02单倍型的个体的自身免疫应答。
使用食欲素对肽相互作用进行建模
食欲素(下丘脑分泌素)片段1-13(SEQIDNO:16)已知与HLADQB1*0602强相互作用[8]。分析显示Leu-3、Thr-6和Val-8是相互作用的关键残基。这三个残基与其中流感NP肽处于反向取向的X-179A核蛋白片段(SEQIDNO:17)的12聚体片段形成良好的3D结构比对，其中Ile-6对齐食欲素Thr-6且Ile-9对齐食欲素Leu-3。NPIle-6是在SEQIDNO:1(X-179A)与3(X-181)之间不同的残基。计算机建模显示，SEQIDNO:17显示在DQ0602晶体结构的结合沟内的非常良好的契合。X-179A中的Ile-6残基在针对食欲素的Thr-6的HLA蛋白的结合空腔内契合良好，但SEQIDNO:3的相应12聚体片段中的X-181A甲硫氨酸残基与HLA蛋白存在严重的空间冲突。
对于该建模，使用PyMol(薛定谔公司(SchrodingerInc))对PDB文件1uvq进行。详细进行下丘脑分泌素肽(SEQIDNO:16)与HLA蛋白之间的分子间相互作用分析，通过观察或通过使用SiteMap软件(薛定谔公司)。来自肽的X射线结构的三个残基被鉴定为对驱动与HLA的结合至关重要，最可能通过疏水相互作用进行结合(Leu-3、Thr-6和Val-8)。
进行核蛋白的片段(SEQIDNO:17)的比对且其显示许多冲突和不可能结合的位置，直至其固定于反向取向。推定的结合模式被评估为极性和范德华冲突方面的HLA-DQB1*0602的结合位点，且当Ile-6对齐食欲素Thr-6且NPIle-9对齐Leu-3时观察到良好的匹配。为避免掺入噪音或偏向比对评估，进行以下过程：(i)使用PyMol的突变模块将食欲素肽逐碱基突变为NP肽；(ii)在各位点处，评估NP肽的各残基的最佳构象异构体以通过其接近HLA蛋白的范德华表面来使其契合或不契合结合口袋。使用默认正常外表面通过PyMol生成表面；(iii)针对NP肽生成的模型应尽可能接近地契合食欲素模板的位置。通过该方法生产满意的模型。进一步评估比对中发生的一个极性错配(NPGlu-4对比食欲素Val-8)，但在HLA蛋白的结合沟内Glu残基是空间耐受的(未观察到与蛋白质表面的冲突)。
为进一步研究该结合假说，根据上文详述的相同原理在结合口袋中评价Ile/Met突变(SEQIDNO:1和3)。当Ile残基突变为Met时，未发现任何不与HLA蛋白的表面严重冲突的Met的构象异构体。从该分析中，可总结得到，在所提出的结构比对内该口袋中Met突变是不可忍受的。
平行地，在DQB1*0302(PDB1jk8)中对两种序列(即Ile和Met变体)进行建模且容纳该残基的口袋(其在公开的序列中契合来自胰岛素的Tyr残基)是挠性的且因此不因区分Ile和Met。
类似地，NP序列和食欲素片段都在HLA-DQ2结构中进行建模(PDB1s9v)。该食欲素肽契合DQ2沟，其松散契合且没有严重冲突。相反地，两种NP肽都具有非常严重的冲突，其通过DQ2表面突出，且该冲突无法在任何旋转异构体中得到解决。
因此，这些建模研究与MHC肽结合研究一致：对于建模的三种HLA分子，仅DQB1*0602可区分差异是Ile/Met变化的NP肽。
因此，MHC肽结合研究和建模研究都指向某些X-179A对比X-181核蛋白衍生的肽对DQB1*0602而非其他HLA亚型的差异结合。
因此，该计算机模拟建模的分选可用于鉴定NP内的氨基酸取代，所述NP应避免与DQB1*0602单倍型存在强结合。
流感疫苗的质谱分析
使用质谱来鉴定并定量五种灭活裂解流感疫苗中的NP，这些疫苗包含来自X-179A毒株的HA。
通过添加10μL50％甲酸水来酸化100μl疫苗样品。将疫苗涡旋并在超声水浴中超声10分钟。通过添加500μL-80℃丙酮并在-80℃下储存2小时进行蛋白质沉淀。将样品在4℃下10000rpm离心15分钟。弃去上清液并将蛋白质沉淀在冷冻干燥机中干燥10分钟。在20μL8M脲、50mM碳酸氢铵和20μL0.5％蛋白酶、50mM碳酸氢铵中重建疫苗。使用DTT至5mM的终浓度来进行还原，在55℃下还原30分钟。将样品置于室温并使用丙酰胺在10mM的终浓度下室温烷基化30分钟。向各样品中加入60μL的50mM碳酸氢铵并随后加入300ng的胰蛋白酶/LysC混合物。将样品在37℃下消化过夜，随后通过加入10μL含10％甲酸的水来进行酸化。在C18微量离心柱上纯化肽并在冷冻干燥机中干燥至小于3μL。
随后在15μL0.2％甲酸、2％乙腈、97.8％水中重建各样品用于HPLC-MSMS并将其注射至自动包装的熔凝二氧化硅25cmC18反相柱上。流速是300nL/分钟，线性梯度为90分钟内8％流动相B至50％流动相B。质谱仪是LTQOrbitrapVelos，设置为数据依赖获取(DDA)模式以片段化15种强度最高的多重带电前体离子，其中将这些离子置于排除列表(exclusionlist)中60秒。使用ByonicTM在序列数据库上检索结果，公差设置为前体离子10ppm和片段离子0.25Da。采用使用反向诱饵数据库方法(reversedecoydatabaseapproach)的1％FDR。该数据库含有来自NCBI的所有疫苗相关蛋白质序列(310,490)。对于各疫苗，通过质谱计数分选蛋白质并通过加和各疫苗中质谱计数鉴定到的10种强度最高的蛋白质来进行相对丰度计算。10种强度最高的蛋白质中每一种的报道的强度除以这10种蛋白质的强度总和，乘以100并表示为最高10种丰度的百分比。
来自X-179毒株的NP和HA的质谱计数和百分比丰度值是：
在进一步的分析中，通过疫苗中已知存在的毒株的序列来对通过MS鉴定的肽进行精确匹配，而非通过特异性。使用该方法的结果如下：
疫苗 NP计数 HA计数 NP:HA
FluzoneTM3价 328 258 1.27
FluzoneTM4价 320 335 0.96
FluarixTM3价 146 282 0.52
FluarixTM4价 142 187 0.76
AfluriaTM3价 212 604 0.35
应理解，通过实施例只是描述了本发明，可对实施例作一些修改但仍属于本发明的范围和构思。
序列
SEQIDNO:1(X-179ANP片段106-126)
RELILYDKEEIRRIWRQANNG
SEQIDNO:2(X-179ANP全长；498aa)
SEQIDNO:3(X-181NP片段106-126)
RELILYDKEEMRRIWRQANNG
SEQIDNO:4(X-179ANP片段130-150)
WRQANNGDDAAAGLTHMMIWH
SEQIDNO:5(X-181NP片段130-150)
WRQANNGDDATAGLTHMMIWH
SEQIDNO:6(X-179AHA片段136-157)
KTSSWPNHDSNKGVTAACPHA
SEQIDNO:7(X-181HA片段136-158)
KTSSWPNHDSDKGVTAACPHA
SEQIDNO:8(X-179ANP片段108-116)
LILYDKEEI
SEQIDNO:9
LXLYXXXIXXXXXX
SEQIDNO:10(X-179ANP片段108-126)
LILYDKEEIRRIWRQANNG
SEQIDNO:11
LILYDKEEX
SEQIDNO:12(X-181NP全长；498aa)
SEQIDNO:13(PR/8/34NP全长；498aa)
SEQIDNO:149(Ox2R片段)
SEQIDNO:15(Ox1R片段)
SEQIDNO:16(食欲素片段)
MNLPSTKVSWAAV
SEQIDNO:17(SEQIDNO:1的片段)
YDKEEIRRIWRQ
SEQIDNO:18(X-179ANP片段)
LILYDKEEIRRIWRQ
SEQIDNO:19(X-181NP片段)
LILYDKEEMRRIWRQ
SEQIDNO:20(X-179ANP片段)
VGKMIGGIGRFYIQM
SEQIDNO:21
SGAAGAAVKGVGTMV
SEQIDNO:22
EKATNPIVPSFDMSN
SEQIDNO:23
IDPFKLLQNSQVVSL
SEQIDNO:24
LILYDKEERRRRWRQ
SEQIDNO:25
MNLPSTKVSWAAVTL
SEQIDNO:26
MNLPSIKVSWAAVTL
SEQIDNO:27
MNLPSMKVSWAAVTL
SEQIDNO:28
LTVAAWSVKTSPLNM
SEQIDNO:29
GAGNHAAGILTLGKR
SEQIDNO:30
ASGNHAAGILTMGRR
SEQIDNO:31
AMERNAGSGIIISDT
SEQIDNO:32
ALNRGSGSGIITSDA
SEQIDNO:33
ALSRGFGSGIITSNA
参考文献
[1]ZaracostasJ.；BMJ.2011Feb9；342:d909
[2]Nohynek等PLoSOne2012；7(3):e33536.
[3]Partinen等PLoSOne2012；7(3):e33723.
[4]Dauvilliers等Sleep2010；33(11):1428-1430.
[5]Szakacs等Neurology2013；80(14):1315-1321.
[6]http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/en/
[7]http://www.fda.gov/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandOtherBiologics/VaccinesandRelatedBiologicalProductsAdvisoryCommittee/default.htm
[8]Siebold等ProcNatlAcadSciUSA2004；101(7):1999-2004.
[9]Chaloupka等1996,EurJClinMicrobiolInfectDis.1996年2月；15(2):121-7
[10]Williams等2012,Vaccine30:2475–2482.
[11]Getie-Kebtie等2013,InfluenzaandOtherRespiratoryViruses7(4),521–530.
[12]Kalandadze等1996,J.BiolChem.271(33):20156-20162.
[13]Justesen等2009,ImmunomeResearch5:2
[14]Kistner等(1998)Vaccine16:960-8.
[15]Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110.
[16]Bruhl等(2000)Vaccine19:1149-58.
[17]WO2006/108846.
[18]Pau等(2001)Vaccine19:2716-21.
[19]http://www.atcc.org/
[20]http://locus.umdnj.edu/
[21]WO97/37000.
[22]Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100.
[23]Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7.
[24]EP-A-1260581(WO01/64846).
[25]WO2006/071563.
[26]WO2005/113758.
[27]Grachev等(1998)Biologicals；26(3):175-93.
[28]WO97/37001
[29]WO02/28422.
[30]WO02/067983.
[31]WO02/074336.
[32]WO01/21151.
[33]WO02/097072.
[34]WO2005/113756.
[35]Huckriede等(2003)MethodsEnzymol373:74-91.
[36]Vaccines(《疫苗》)(Plotkins和Orenstein编)第4版，2004,ISBN:0-7216-9688-0
[37]Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70.
[38]Keitel等(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10.
[39]Herlocher等(2004)JInfectDis190(9):1627-30.
[40]Le等(2005)Nature437(7062):1108.
[41]WO2008/068631.
[42]Rota等(1992)JGenVirol73:2737-42.
[43]GenBank序列GI:325176.
[44]Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明顿：药学科学与实践》)第20版，ISBN:0683306472.
[45]Banzhoff(2000)ImmunologyLetters71:91-96.
[46]Nony等(2001)Vaccine27:3645-51.
[47]EP-B-0870508.
[48]US5948410.
[49]WO2007/052163.
[50]WO2007/052061
[51]WO90/14837.
[52]Podda和DelGiudice(2003)ExpertRevVaccines2:197-203.
[53]Podda(2001)Vaccine19:2673-2680.
[54]VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach(《疫苗设计：亚基和佐剂方法》)(Powell和Newman编)，普莱南出版社(PlenumPress)1995(ISBN0-306-44867-X).
[55]VaccineAdjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)(分子药学中的方法系列第42卷)ISBN:1-59259-083-7.O’Hagan编.
[56]等(2012)ExpertRevVaccines11:349-66.
[57]WO2008/043774.
[58]Allison和Byars(1992)ResImmunol143:519-25.
[59]Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9.
[60]US-2007/014805.
[61]US-2007/0191314.
[62]Suli等(2004)Vaccine22(25-26):3464-9.
[63]WO95/11700.
[64]美国专利6,080,725.
[65]WO2005/097181.
[66]WO2006/113373.
[67]Potter和Oxford(1979)BrMedBull35:69–75.
[68]Greenbaum等(2004)Vaccine22:2566-77.
[69]Zurbriggen等(2003)ExpertRevVaccines2:295-304.
[70]Piascik(2003)JAmPharmAssoc(WashDC).43:728-30.
[71]Mann等(2004)Vaccine22:2425-9.
[72]Halperin等(1979)AmJPublicHealth69:1247-50.
[73]Herbert等(1979)JInfectDis140:234-8.
[74]Chen等(2003)Vaccine21:2830-6.
[75]Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48,443-453.
[76]Rice等(2000)TrendsGenet16:276-277.
[77]CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编，1987)增刊30.
[78]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489.
[79]RenfreyS,WattsA.Vaccine1994；12(8):747-752.
[80]Carlson等ArthritisRheum1999；42(12):2705-2709.
[81]Han等AnnNeurol2011；70(3):410-417.
[82]Ettinger等JImmunol2006；176(3):1988-1998.
[83]Bui等ProcNatlAcadSciUSA2007；104(1):246-251
[84]Doucet等JGenVirol2011；92(Pt5):1162-1171.
[85]Yewdell等ProcNatlAcadSciUSA1985；82(6):1785-1789.
[86]Willie等Neuron2003；38(5):715-730.
[87]Berkhoff等JVirol2005；79(17):11239-11246.
[88]Steinitz等Blood2012；119(17):4073-4082.

Claims (20)

1.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的所述核蛋白的片段与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性低于具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的肽，前提是如果所述组合物中的所有甲型流感核蛋白都包含SEQIDNO:12所示的氨基酸序列，则所述疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。
2.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白均不包含等同于SEQIDNO:2的氨基酸106-126的片段，其与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合亲和性等于或高于具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的肽，前提是如果所述组合物中的所有甲型流感核蛋白都包含SEQIDNO:12所示的序列，则所述疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。
3.如权利要求1或2所述的流感疫苗组合物，并非所述组合物中的所有核蛋白都包含SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的流感疫苗组合物，并非所述组合物中的所有核蛋白都包含SEQIDNO:3所示氨基酸序列。
5.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白在对应于SEQIDNO:2所示的核蛋白氨基酸序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸残基，前提是如果所述组合物中的所有甲型流感核蛋白都包含SEQIDNO:12所示的氨基酸序列，则所述疫苗组合物不基于毒株A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)衍生的毒株NYMCX-181。
6.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白在对应于SEQIDNO:2所示的核蛋白氨基酸序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸，前提是如果所述核蛋白全部都在对应于SEQIDNO:2所示的核蛋白氨基酸序列的氨基酸116的位置处包含甲硫氨酸，则所述核蛋白不具有SEQIDNO:12所示的序列。
7.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白在对应于SEQIDNO:2所示的核蛋白氨基酸序列的氨基酸116的位置处不具有异亮氨酸或甲硫氨酸残基。
8.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白不包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:12或SEQIDNO:13所示的氨基酸序列。
9.一种包含甲型流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，所述核蛋白已被修饰，从而与未经修饰的核蛋白相比，该已被修饰的核蛋白与包含HLADQB1*0602的MHCII型受体的结合减少或消除。
10.一种包含流感病毒核蛋白的流感疫苗组合物，其中，(i)所述组合物是裂解病毒体疫苗，并且存在的核蛋白的量小于3μg核蛋白/10μg血凝素或(ii)所述组合物是亚单位疫苗，并且存在的核蛋白的量小于0.5μg核蛋白/10μg血凝素。
11.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包含佐剂。
12.如权利要求11所述的疫苗组合物，所述佐剂是水包油乳液。
13.如权利要求12所述的疫苗组合物，所述佐剂还包含生育酚。
14.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包含曲通或吐温，或其组合。
15.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物是针对一种或多种大流行流感毒株的疫苗。
16.如权利要求11-14中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物是单价疫苗组合物。
17.如前述权利要求中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物是裂解病毒体疫苗。
18.一种佐剂化裂解流感疫苗，所述疫苗包含来自至少4种不同流感病毒的抗原和来自至少一种甲型流感病毒的具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的核蛋白，其特征在于，所述佐剂是不含有额外的免疫刺激剂的水包油乳液佐剂，并且由此所述组合物含有曲通。
19.如前述权利要求中任一项所述的疫苗或疫苗组合物，所述疫苗或疫苗组合物用于儿科群体(0-36月龄)和/或青少年群体(4-19岁)和/或具有发展与流感疫苗接种相关的自身免疫疾病的遗传倾向的对象。
20.一种测试甲型流感病毒的疫苗生产适用性的方法，所述方法包括以下步骤：测定所述流感病毒的核蛋白或其片段与HLADQB1*0602的结合亲和性是否在相同条件下低于来自H1N1毒株X-179A的核蛋白；其中，如果所述流感病毒的核蛋白与HLADQB1*0602的结合亲和性在相同条件下低于来自毒株X-179A的核蛋白，则所述流感病毒适用于疫苗生产。
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WO (1) WO2014180999A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111803625A (zh) * 2020-09-09 2020-10-23 天津中逸安健生物科技有限公司 一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用
WO2025021112A1 (zh) * 2023-07-24 2025-01-30 佳吾益(北京)科技有限公司 开发mhc新抗原的工程化细胞

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201509265SA (en) 2013-05-10 2015-12-30 Novartis Ag Avoiding narcolepsy risk in influenza vaccines
EP3416981A1 (en) * 2016-02-18 2018-12-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Polypeptides for preparing drug conjugates capable of promoting apoptosis in a cell expressing an orexin receptor
CA3080656A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Baxalta GmbH Environmentally compatible detergents for inactivation of lipid-enveloped viruses
US11428638B2 (en) 2018-01-12 2022-08-30 The Regents Of The University Of California Spectroscopic biological material characterization
WO2020132063A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for diagnosing narcolepsy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007052061A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines
CN101180076A (zh) * 2005-03-23 2008-05-14 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 流感病毒及水包油乳液佐剂诱导cd-4 t细胞和/或改善的b-记忆细胞应答的用途

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3485094D1 (de) 1983-01-25 1991-10-31 Ciba Geigy Ag Neue peptidderivate.
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5936076A (en) 1991-08-29 1999-08-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha αgalactosylceramide derivatives
AU5543294A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
DE19612966B4 (de) 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
DE19612967A1 (de) 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
TW570803B (en) 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
US6080725A (en) 1997-05-20 2000-06-27 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulating and vaccine compositions employing saponin analog adjuvants and uses thereof
US20030130212A1 (en) 1999-01-14 2003-07-10 Rossignol Daniel P. Administration of an anti-endotoxin drug by intravenous infusion
EP1214054B1 (en) 1999-09-24 2007-10-31 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Intranasal influenza virus vaccine
US6825036B2 (en) 2000-03-03 2004-11-30 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Cell usable in serum-free culture and suspension culture and process for producing virus for vaccine by using the cell
GB0024089D0 (en) 2000-10-02 2000-11-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
JP2004536785A (ja) 2001-02-23 2004-12-09 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規なワクチン
EP2269639B1 (en) 2001-02-23 2018-11-28 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
MY134424A (en) 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
WO2003105769A2 (en) 2002-06-13 2003-12-24 New York University Synthetic c-glycolipid and its use for treating cancer infectious diseases and autoimmune diseases
US7771726B2 (en) 2003-10-08 2010-08-10 New York University Use of synthetic glycolipids as universal adjuvants for vaccines against cancer and infectious diseases
ES2409782T3 (es) 2004-04-05 2013-06-27 Zoetis P Llc Emulsiones de aceite en agua microfluidificadas y composiciones de vacuna
WO2005113756A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method
AU2005245943A1 (en) 2004-05-20 2005-12-01 Id Biomedical Corporation Process for the production of an influenza vaccine
CA2592120A1 (en) 2004-12-23 2006-07-06 Medimmune Vaccines, Inc. Non-tumorigenic mdck cell line for propagating viruses
KR20070116650A (ko) * 2005-03-23 2007-12-10 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 조성물
FR2884255B1 (fr) 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
US7691368B2 (en) 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
TWI382019B (zh) 2005-08-19 2013-01-11 Array Biopharma Inc 作為類鐸受體（ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）調節劑之胺基二氮雜呯
CA2627971A1 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg. Cell-derived viral vaccines with low levels of residual cell dna by beta-propiolactone treatment
FR2896162B1 (fr) 2006-01-13 2008-02-15 Sanofi Pasteur Sa Emulsion huile dans eau thermoreversible
AR061839A1 (es) 2006-07-07 2008-09-24 Gilead Sciences Inc Compuestos y composiciones farmaceuticas que activan selectivamente a receptores tipo toll 7(tlr7), y uso de los mismos como agentes antivirales
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
KR101151202B1 (ko) 2006-10-12 2012-06-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신
WO2008047174A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Centre National De La Recherche Scientifique Alpha-galactosylceramide analogs, their methods of manufacture, intermediate compounds useful in these methods, and pharmaceutical compositions containing them
SG177141A1 (en) 2006-12-06 2012-01-30 Novartis Ag Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
PE20091236A1 (es) 2007-11-22 2009-09-16 Astrazeneca Ab Derivados de pirimidina como immunomoduladores de tlr7
CA2716706C (en) 2008-03-03 2014-02-18 Irm Llc Compounds and compositions as tlr activity modulators
ES2667054T3 (es) 2008-03-24 2018-05-09 Biontech Ag Nuevas imidazoquinolinas sustituidas
CA2732437C (en) 2008-08-01 2017-11-21 Ventirx Pharmaceuticals, Inc. Toll-like receptor agonist formulations and their use
ES2675771T3 (es) * 2008-12-16 2018-07-12 Ology Bioservices, Inc. Producción de vacunas contra el virus de la gripe
CA2763440A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Novartis Ag Assays for influenza virus hemagglutinins
TWI445708B (zh) 2009-09-02 2014-07-21 Irm Llc 作為ｔｌｒ活性調節劑之化合物及組合物
GB0918830D0 (en) 2009-10-27 2009-12-09 Glaxosmithkline Biolog Niederl Process
WO2011119759A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Irm Llc Compounds (cystein based lipopeptides) and compositions as tlr2 agonists used for treating infections, inflammations, respiratory diseases etc.
ES2458355T3 (es) 2010-09-01 2014-05-05 Novartis Ag Adsorción de inmunopotenciadores sobre sales metálicas insolubles
SG11201509265SA (en) 2013-05-10 2015-12-30 Novartis Ag Avoiding narcolepsy risk in influenza vaccines

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101180076A (zh) * 2005-03-23 2008-05-14 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 流感病毒及水包油乳液佐剂诱导cd-4 t细胞和/或改善的b-记忆细胞应答的用途
WO2007052061A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SMITH,G.J.D 等: "nucleoprotein, partial [Influenza A virus (A/duck/Guiyang/3009/2005(H5N1))]", 《GENBANK: ABL08508.1》 *
SPIRO,D 等: "RecName: Full=Nucleoprotein; AltName: Full=Nucleocapsid protein; Short=Protein N", 《UNIPROTKB/SWISS-PROT: B4URE0.1》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111803625A (zh) * 2020-09-09 2020-10-23 天津中逸安健生物科技有限公司 一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用
CN111803625B (zh) * 2020-09-09 2020-12-18 天津中逸安健生物科技有限公司 一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用
WO2025021112A1 (zh) * 2023-07-24 2025-01-30 佳吾益(北京)科技有限公司 开发mhc新抗原的工程化细胞

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201509265SA (en) 2015-12-30
US20170216425A1 (en) 2017-08-03
EP2801372A2 (en) 2014-11-12
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