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CN101175508A - 表皮葡萄球菌多肽抗原的免疫原性组合物 - Google Patents

表皮葡萄球菌多肽抗原的免疫原性组合物 Download PDF

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CN101175508A CNA2005800360186A CN200580036018A CN101175508A CN 101175508 A CN101175508 A CN 101175508A CN A2005800360186 A CNA2005800360186 A CN A2005800360186A CN 200580036018 A CN200580036018 A CN 200580036018A CN 101175508 A CN101175508 A CN 101175508A
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Abstract

本发明涉及免疫原性组合物，其包含从表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)分离的多肽。本发明还涉及编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸和其于免疫原性组合物中的用途。此外，本发明涉及使用所述表皮葡萄球菌多肽和聚核苷酸的免疫原性组合物诱导哺乳动物对表皮葡萄球菌和金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的免疫反应的方法。本发明还涉及用于检测生物样本中的表皮葡萄球菌的方法。

Description

表皮葡萄球菌多肽抗原的免疫原性组合物
技术领域
本发明涉及免疫原性组合物，其包含从表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)分离的多肽。本发明还涉及编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸和其于免疫原性组合物中的用途。此外，本发明涉及使用所述表皮葡萄球菌多肽和聚核苷酸的免疫原性组合物诱导哺乳动物对抗表皮葡萄球菌和金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的免疫反应的方法。本发明还涉及用于检测生物样本中的表皮葡萄球菌的方法。
背景技术
表皮葡萄球菌是皮肤和粘膜上正常人类微生物集落的主要组成部分，且曾经认为其只是由受感染患者培养得到的污染物。参看Heilmann，C.和G.Peters，Biology andpathogenicity of Staphylococcus epidermidis，in Gram-positive pathogens，V.A.Fischetti编辑，2000，American Society for Microbiology：Washington，D.C.第442-449页；von Eiff，C等人，Lancet Infect Dis，2(11)：第677-85页(2002)。现已广泛承认表皮葡萄球菌是一种极其重要的条件致病菌和引起医院血流感染的主要原因。参看Am J Infect Control，27：第520-32页(1999)；Diekema，D.J.等人，Int J Antimicrob Agents，20(6)：第412-8页(2002)；Edmond，M.B.等人，Clin Infect Dis，29(2)：第239-44页(1999)。这些感染主要与诸如静脉导管、人工关节或人工心脏瓣膜等留置外来聚合物体的存在有关。参看Heilmann，C.和G.Peters，Biology and pathogenicity of Staphylococcus epidermidis，in Gram-positivepathogens，V.A.Fischetti，编辑2000，American Society for Microbiology：Washington，D.C.第442-449页；von Eiff，C等人，Lancet Infect Dis，2(11)：第677-85页(2002)。认为感染是在插入人工装置时从患者的皮肤引入表皮葡萄球菌引起的。定殖和随后生物膜的形成可导致可能血行播散(hematogenous spread)到体内其它部位的菌血症。这些感染通常因抗生素和临床分离株抗生素抗性增加于生物膜内引起的杀菌作用降低而难以进行治疗。参看Diekema，D.J.等人，Int J Antimicrob Agents，20(6)：第412-8页(2002)；Edmond，M.B.等人，Clin Infect Dis，29(2)：第239-44页(1999)；Lewis，K.，Antimicrob Agents Chemother，45(4)：第999-1007页(2001)；Raad，I.等人，Clin Infect Dis，26(5)：第1182-7页(1998)。已报导对万古霉素(vancomycin)具有降低的易感性的表皮葡萄球菌。参看Sanyal，D.和D.Greenwood，J Med Microbiol，.39(3)：第204-10页(1993)；Sanyal，D.等人，Lancet，337(8732)：第54页(1991)。治疗这些感染的困难使得使用免疫法作为预防感染的方式成为必要。
生物膜形成是表皮葡萄球菌感染的主要毒力决定因素。因此，有关表皮葡萄球菌表面蛋白的研究已集中于在生物膜形成中所涉及的那些蛋白。基于生物膜形成的两个主要步骤中涉及蛋白，已将这些蛋白再分成以下群组：1)起始附着，葡萄球菌表面蛋白-1(SSP-1)、自溶素(AtlE)、Fbe(SdrG)和GehD；和2)细菌细胞聚集，Bap同源蛋白(Bhp)、聚集相关蛋白(AAP)和自溶素(AtlE)。参看von Eiff，C等人，Lancet Infect Dis，2002.2(11)：第677-85页；Vuong，C等人，J Infect Dis，188(5)：第706-18页(2003)；Veenstra，G.J.等人，J Bacteriol.，178(2)：第537-41页(1996)；Rupp，M.E.等人，J Infect Dis，183(7)：第1038-42页(2001)；Hussain，M.等人，Infect Immun，65(2)：第519-24页(1997)；Nilsson，M.等人，Infect Immun，66(6)：第2666-73页(1998)；Davis，S.L.等人，J Biol Chem，276(30)：第27799-805页(2001)；和Bowden，M.G.等人，J Biol Chem，277(45)：第43017-43023页(2002)。对于暴露到宿主内的环境暗示(environmental cue)时所表达的表面蛋白或宿主-寄生物相互作用中所涉及的蛋白的鉴别已进行比较少的尝试。
表皮葡萄球菌必须经历从共生体到致病菌的转变且适应宿主内的微环境。为使共生体转变成致病菌，其必须进入宿主组织，感觉其环境的改变，改变基因表达，从而使其能够避开宿主防御，附着和粘附到宿主因子上，在不同养分和宿主防御的存在下生长并分裂。细菌表面上的蛋白使其与宿主内的新环境初始接触。这些蛋白的多种功能包括感觉环境；净化和转运养分；抵抗宿主免疫系统；和结合宿主蛋白。表面暴露蛋白也可用作宿主免疫系统的接触点或识别点，且可为对抗细菌的体液免疫反应的目标。Josefsson，E.等人，J Infect Dis，184(12)：第1572-80页(2001)；Swiatlo，E.等人，Infect Immun，71(12)：第7149-53页(2003)；Grifantini，R.等人，Nat Biotechnol，20(9)：第914-21页(2002)。因此，迫切需要鉴别用于免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌蛋白中的有前途候选物，所述免疫原性组合物将诱导对于表皮葡萄球菌中引起疾病的血清型的免疫反应。
发明内容
本发明提供一种免疫原性组合物，其包含具有选自一或多个SEQ ID NO：1到SEQ IDNO：32、其生物等效物或其片段的氨基酸序列的多肽。在特定实施例中，多肽与受表皮葡萄球菌感染的兔的血清中的抗体具免疫反应性。在另一实施例中，多肽与一或多种兔血清蛋白结合。
在某些实施例中，免疫原性组合物另外包含医药学上可接受的载剂。在其它实施例中，本发明的免疫原性组合物还包含一或多种佐剂。在另一实施例中，免疫原性组合物另外包含表皮葡萄球菌多糖抗原。在又一实施例中，免疫原性组合物另外包含金黄葡萄球菌多糖或多肽抗原。
本发明提供免疫原性组合物，其包含从表皮葡萄球菌分离的多肽。
本发明提供一种包含表皮葡萄球菌多肽的免疫原性组合物，其中所述多肽另外包含异源氨基酸。在特定实施例中，多肽是融合多肽。在另一实施例中，多肽是重组多肽。在又一实施例中，本发明提供一种包含表皮葡萄球菌多肽的免疫原性组合物，其中所述多肽包含表皮葡萄球菌的中和表位。在某些实施例中，多肽为脂蛋白。
本发明另外提供包含表皮葡萄球菌多肽的免疫原性组合物，其中所述多肽是由聚核苷酸编码，所述聚核苷酸包含与选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一或其简并变异体或其片段的核苷酸序列。在特定实施例中，表皮葡萄球菌聚核苷酸序列选自由SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：62或其简并变异体或其片段组成的群组。
本发明提供一种免疫原性组合物，其中聚核苷酸是得自表皮葡萄球菌。在特定实施例中，聚核苷酸另外包含异源核苷酸。在另一实施例中，聚核苷酸是在表达载体中。在又一实施例中，表达载体为质粒DNA。在某些实施例中，聚核苷酸为重组聚核苷酸。在另一实施例中，聚核苷酸可操作地连接到一个或多个基因表达调控元件。在又一实施例中，聚核苷酸引导表皮葡萄球菌中和表位的表达。
本发明还提供一种包含由聚核苷酸编码的表皮葡萄球菌多肽的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物另外包含转染促进剂。在特定实施例中，所述转染促进剂为布比卡因(bupivicaine)。
本发明还提供一种诱导对抗表皮葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：具有选自一或多个SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32或其生物等效物或其片段的氨基酸序列的多肽，和医药学上可接受的载剂。
此外，本发明提供一种诱导对抗表皮葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：具有选自一或多个SEQ ID NO：33到SEQID NO：64或其简并变异体或其片段的核苷酸序列的聚核苷酸，和医药学上可接受的载剂。
在一实施例中，本发明提供一种包含聚核苷酸的免疫原性组合物，所述聚核苷酸具有选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一、其简并变异体或其片段的核苷酸序列，且其包含于表达载体中。在另一实施例中，所述聚核苷酸是得自表皮葡萄球菌。在又一实施例中，所述聚核苷酸包含异源核苷酸。
在某一实施例中，本发明提供一种用于检测和/或鉴别生物样本中的表皮葡萄球菌的方法，其包含(a)在允许杂交的条件下，使所述样本与聚核苷酸的寡核苷酸探针接触，所述聚核苷酸包含选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一或其简并变异体或其片段的核苷酸序列；和(b)检测所述样本中杂交复合物的存在，其中杂交复合物表明所述样本中存在表皮葡萄球菌。
在其它实施例中，本发明提供一种用于检测和/或鉴别生物样本中抗表皮葡萄球菌的抗体的方法，其包含(a)在允许形成免疫复合物的条件下，使所述样本与多肽接触，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一或其生物等效物或其片段的氨基酸序列；和检测所述样本中免疫复合物的存在，其中免疫复合物表明所述样本中存在肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)。
在特定实施例中，免疫原性组合物包含选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、其生物等效物或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌多肽序列。在另一实施例中，免疫原性组合物包含选自由SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58、SEQID NO：59、SEQ ID NO：62或其简并变异体或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌聚核苷酸序列。
在又一实施例中，本发明提供一种诱导对抗金黄葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：选自由SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、其生物等效物或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌多肽序列。
在特定实施例中，本发明提供一种诱导对抗金黄葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：选自由SEQ ID NO：40、SEQID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：62或其简并变异体或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌聚核苷酸序列。
附图说明
图1绘示通过2D凝胶电泳比较的在TSB(1A和1C)或70％兔血清(1B和1D)中生长的表皮葡萄球菌0-47的细胞壁片断的蛋白质表达概况。在第一维中于pH 4-7的IPG条带上分离蛋白质，随后在第二维中以SDS-PAGE进行分离，将其转移到硝酸纤维素上，并通过荧光染色进行检测(1A和1C)。以受表皮葡萄球菌0-47感染的兔的免疫血清(1B和ID)显现免疫反应性蛋白。分子量标记标于左侧。
图2绘示生长于70％兔血清中的表皮葡萄球菌0-47的细胞表面片断的荧光染色印迹(2A)和免疫印迹(2B)，所述细胞表面片断是在第一维中于pH 4-7的IPG条带上分离且在第二维中以SDS-PAGE分离。通过质谱分析鉴别斑点中的蛋白质。
图3绘示从生长于TSB或70％兔血清中的表皮葡萄球菌0-47的表面用增加浓度的NaCl或4.0M尿素洗脱的蛋白质。星号表明从在血清存在下生长的表皮葡萄球菌的表面洗脱的富集蛋白质。用TBS随后依次以0.5M和1.0M NaCl和4.0M尿素洗涤细菌3次。测定每一样本的蛋白质浓度，并于4-20％梯度凝胶上跑胶0.75μg。通过蛋白质检定，在从TSB中生长的细菌的表面洗脱的样本(第2-5道)中未检测到蛋白质，故将25μl装载于凝胶上。第1道，兔血清；第2道和第6道-0.15M NaCl洗出液；第3道和第7道-0.5M NaCl；第4道和第8道-1.0M NaCl；第5道和第9道-4.0M尿素。
图4绘示细胞表面蛋白从表皮葡萄球菌的2D转移，针对蛋白质(4A)对所述表皮葡萄球菌荧光染色，并且以从生长于70％兔血清中的表皮葡萄球菌洗脱的生物素化血清蛋白(4B)进行探测。用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶接合物显现斑点。通过质谱法鉴别所述斑点中的蛋白质。
具体实施方式
暴露到宿主的血流中之后，入侵细菌遇到对新环境特异的环境暗示。通过细胞壁纯化蛋白中可检测的蛋白质表达中的细菌和信号适应性改变来检测这些暗示。通常，细菌细胞壁处的蛋白质和碳水化合物是用于包涵于治疗或预防细菌感染的免疫原性组合物中的候选物。无论上调的蛋白质是与宿主相互作用还是在养分获取中起到作用对于细菌而言都极为重要，且因此在细菌存活和发病机理中起到作用。已将细菌于体液(即，血清、腹膜透析液和尿液)中的生长用作模仿细菌在宿主内遇到的某些信号的模型系统。参看Wiltshire，M.D.和S.J.Foster，Infect Immun，69(8)：第5198-202页(2001)；Shepard，B.D.和M.S.Gilmore，Infect Immun，70(8)：第4344-52页(2002)；Smith，D.G.等人，Infect Immun，59(2)：第617-24页(1991)；McDermid，K.P.等人，Infect Immun，61(5)：第1743-9页(1993)。已发现一或多种所述培养条件改变粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄葡萄球菌和表皮葡萄球菌中的基因表达，并且发现经鉴别在变化的培养条件下表达增加的那些蛋白质属于不同种类的具有多种功能的蛋白质。参看Wiltshire，M.D.和S.J.Foster，Infect Immun，69(8)：第5198-202页(2001)；Shepard，B.D.和M.S.Gilmore，Infect Immun，70(8)：第4344-52页(2002)。
表皮葡萄球菌感染的最常见易感因素是植入人工装置。所植入的人工装置经血浆蛋白和基质蛋白包覆，所述血浆蛋白和基质蛋白包括纤维蛋白原、玻连蛋白(vitronectin)、von Willebrand氏因子和粘连蛋白。参看von Eiff，C等人，.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，18(12)：第843-6页(1999)。这些蛋白通常充当表皮葡萄球菌表面蛋白的配体，由此使细菌与人工装置结合并定殖于人工装置上。已知表皮葡萄球菌表达与纤维蛋白原、玻连蛋白和粘连蛋白结合的蛋白质。参看Nilsson，M.等人，A fibrinogen-binding protein ofStaphylococcus epidermidis.Infect Immun，66(6)，第2666-73页(1998)；Davis，S.L.等人，JBiol Chem，276(30)，第27799-805页(2001)；Williams，R.J.等人，Infect Immun，.70(12)，第6805-10页(2002)；Heilmann，C等人，Mol Microbiol，24(5)，第1013-24页(1997)。预期表皮葡萄球菌将结合使共生体转换成致病菌的其它血清蛋白是合乎情理的。
下文所述的本发明解决对于表皮葡萄球菌免疫原性组合物的需求，所述免疫原性组合物有效预防或治疗由表皮葡萄球菌血清型所引起的大部分或所有疾病。本发明另外解决对于诊断表皮葡萄球菌感染的方法的需求。本发明已鉴别出编码抗原多肽的表皮葡萄球菌开放阅读框(下文的ORF)。更具体说来，表皮葡萄球菌ORF编码用作免疫原性组合物中的潜在抗原多肽的多肽。在某些实施例中，本发明包含编码表面定位、暴露、分泌或膜相关的多肽抗原的表皮葡萄球菌聚核苷酸ORF。
在其它实施例中，本发明包含含有ORF序列的载体和经这些载体转化、转染或感染的宿主细胞或动物。本发明还包含表皮葡萄球菌ORF的转录基因产物，诸如mRNA、反义RNA、反义寡核苷酸和核糖酶分子，其可用于抑制或控制微生物的生长。本发明还涉及检测这些核酸或多肽的方法和诊断表皮葡萄球菌感染的试剂盒。本发明还涉及用于预防和/或治疗细菌感染、尤其是由表皮葡萄球菌引起或因其而恶化的感染的免疫原性组合物。在特定实施例中，使用免疫原性组合物治疗或预防由表皮葡萄球菌引起或因其而恶化的全身性疾病。在其它实施例中，使用免疫原性组合物治疗或预防由表皮葡萄球菌引起或因其而恶化的非全身性疾病。
A.表皮葡萄球菌ORF聚核苷酸和多肽
鉴别用于产生供包涵于免疫原性组合物中之用的表皮葡萄球菌多肽的经分离和纯化的表皮葡萄球菌ORF聚核苷酸。更具体说来，在某些实施例中，ORF编码表皮葡萄球菌表面定位、暴露、膜相关或分泌的多肽、尤其是抗原多肽。因此，一方面，本发明鉴别经分离和纯化的聚核苷酸(ORF)，其编码用于包涵于免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌表面定位、暴露、膜相关或分泌的多肽。在特定实施例中，本发明的聚核苷酸为DNA分子，其中DNA可为基因组DNA、染色体DNA、质粒DNA或cDNA。在另一实施例中，聚核苷酸为重组聚核苷酸，其编码表皮葡萄球菌多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一或其片段的氨基酸序列。在另一实施例中，经分离和纯化的ORF聚核苷酸包含与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64、其简并变异体或其补体的ORF核苷酸序列其中之一具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一实施例中，SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的ORF聚核苷酸是包含于质粒载体中，且在原核宿主细胞中得以表达。
如下文所使用，术语“聚核苷酸”意思是由磷酸二酯键连接的核苷酸序列。下文是以5′到3′方向的方向呈现聚核苷酸。本发明的聚核苷酸可包含约10个到约数十万个碱基对。在一实施例中，聚核苷酸包含约10个到约3,000个碱基对。特定聚核苷酸的长度实例陈述于下文中。
本文所述的聚核苷酸可为脱氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子或使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。在聚核苷酸为DNA分子的情况下，所述分子可为基因、cDNA分子或基因组DNA分子。下文通过单字母密码指示核苷酸碱基：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
“经分离”意思是“通过人工”从其天然状态变化而来。如果组合物或物质存在于自然界中，那么为了认为其“经分离”，其必须已经改变或从其原始环境中移除，或两者皆有。举例说来，当将术语用于下文中时，天然存在于活动物中的聚核苷酸或多肽未经“分离”，但与其天然状态的共存物质分离的相同聚核苷酸或多肽“经分离”。
如本文所使用，“经分离”聚核苷酸不含天然与得到核酸的生物体的基因组DNA中的核酸侧接的序列(即，位于所述核酸5′端和3′端的序列)。举例说来，在各种实施例中，经分离表皮葡萄球菌核酸分子可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的天然与得到核酸的细胞的基因组DNA中的核酸侧接的核苷酸序列。然而，表皮葡萄球菌核酸分子可与其它蛋白质编码序列或调控序列融合，且仍认为其经分离。
可使用标准克隆和筛选技术从得自mRNA的cDNA文库获得本文所述的ORF聚核苷酸且从而获得多肽。也可从诸如基因组DNA文库(例如，表皮葡萄球菌文库)的天然来源获得本发明的聚核苷酸，或可使用众所周知和市面有售的技术进行合成。
本文还涵盖因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64(和其片段)所示的核苷酸序列不同且因此编码与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64中所示的核苷酸序列所编码的多肽相同的表皮葡萄球菌多肽的核酸分子。
可使用此项技术中众所周知的方法轻易地鉴别表皮葡萄球菌聚核苷酸的直系同源物(orthologue)和等位基因变异体。聚核苷酸的等位基因变异体和直系同源物将包含通常至少约70-75％、更通常至少约80-85％且最通常至少约90-95％或95％以上与SEQ IDNO：33到SEQ ID NO：64或这些核苷酸序列的片段同源的核苷酸序列。可轻易鉴别所述核酸分子能够在严格条件下与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64或这些核苷酸序列的片段所示的核苷酸序列杂交。
而且，聚核苷酸可仅包含表皮葡萄球菌聚核苷酸或基因的编码区的片段，诸如SEQID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的片段。在某些实施例中，所述片段编码免疫原性片段。
当使用本发明的这些表皮葡萄球菌ORF聚核苷酸重组产生用于包涵于免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌多肽时，所述聚核苷酸可包括成熟多肽的编码序列；其本身；或阅读框中的成熟多肽的编码序列；和其它编码序列，诸如编码前导序列或分泌序列、前蛋白序列或前体蛋白序列或原前体蛋白序列或其它融合肽部分的编码序列。举例说来，可将有助于融合多肽纯化的标记序列与编码序列连接(参看Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824，1989，其是以全文引用的方式并入下文中)。因此，本文涵盖编码允许表达产物的His标签纯化的融合多肽的聚核苷酸的制备。聚核苷酸还可含有非编码5′和3′序列，诸如已转录序列、未翻译序列、剪接信号和聚腺苷酸化信号。
因此，可通过一种方法获得编码用于包涵于本发明的免疫原性组合物中的多肽的聚核苷酸，包括来自除表皮葡萄球菌外的物种(诸如金黄葡萄球菌)的同源物和直系同源物，所述方法包含以下步骤：在严格杂交条件下，用具有SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一、其片段的序列的经标记探针筛选适当文库；和分离含有所述聚核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。所述杂交技术已为所属领域技术人员众所周知。所属领域技术人员将认识到，在许多情况下，经分离cDNA序列将是不完整的，这是因为编码多肽的区域在cDNA的5′端被切短。这是反转录酶作用的结果，使得无法在第一条cDNA链合成期间完成mRNA模板的DNA拷贝，所述反转录酶是一种具有固有地低“处理能力(processivity)”(聚合反应期间酶保持附着到模板上的能力的度量)的酶。
因此，在某些实施例中，本文所提供的聚核苷酸序列信息允许制备能够与下文所公开的所选聚核苷酸基因序列特异性杂交的相对短的DNA(或RNA)寡核苷酸序列。如下文所使用，术语“寡核苷酸”是定义为包含2个或2个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、通常大于3个且通常大于10个且多达100个或100个以上(但优选介于20个与30个之间)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切尺寸将视许多因素而定，于是其视所述寡核苷酸的最终功能或用途而定。因此，在特定实施例中，适当长度的核酸探针是基于所选核苷酸序列(例如，诸如SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64所示的序列的序列)的考虑进行制备。所述核酸探针与编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸特异性杂交的能力使其在多个实施例中特别有用。最重要的是，可将所述探针用于多种用于检测给定样本中互补序列的存在的检定中。
在某些实施例中，使用寡核苷酸引物是有利的。可以任何方式产生这些引物，包括化学合成、DNA复制、反转录或其组合。使用本文所述的聚核苷酸设计所述引物的序列以用于使用聚合酶链式反应(PCR)技术检测、扩增或突变编码来自原核细胞的表皮葡萄球菌多肽的ORF聚核苷酸的规定区段。
在某些实施例中，使用本文所述的聚核苷酸与用于检测杂交体形成的适当标记的组合是有利的。此项技术中已知广泛多种能够提供可检测信号的适当标记，包括放射性、酶或其它配体，诸如亲和素/生物素。
可将与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一或其片段中所含的核苷酸序列相同或足够相同的聚核苷酸用作cDNA和基因组DNA的杂交探针或用作核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本文所述的多肽的全长cDNA和基因组克隆并分离与SEQ IDNO：33到SEQ ID NO：64或其片段中所述的聚核苷酸序列具有高度序列相似度的其它基因(包括编码除表皮葡萄球菌外的物种的同源物和直系同源物的基因)的cDNA和基因组克隆。这些核苷酸序列通常与参考聚核苷酸序列至少约70％相同到至少约95％相同。探针或引物一般将包含至少15个核苷酸，优选至少30个核苷酸，且可具有至少50个核苷酸。特别优选的探针将具有介于30个与50个之间的核苷酸。
存在数种可用且所属领域技术人员众所周知的获得全长cDNA或延长短cDNA的方法，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)法的方法。参看Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，8998-9002，1988。举例说来，近来对MarathonTM技术(Clontech LaboratoriesInc.)所例示的技术的改进已显著简化有关较长cDNA的研究。在MarathonTM技术中，已由从所选组织提取的mRNA和接合于每一端上的“接头”序列制备cDNA。随后，进行核酸扩增(PCR)以使用基因特异性与接头特异性寡核苷酸引物的组合扩增cDNA“缺失”的5′端。接着，使用“套式”引物重复PCR反应，所述套式引物为经设计以于经扩增产物内退火的引物(通常为在接头序列中3′处进一步退火的接头特异性引物和在已知基因序列中5′处进一步退火的基因特异性引物)。可随后通过DNA测序分析这一反应的产物，且全长cDNA可通过将所述产物直接与现存cDNA接合以得到完整序列来构建，或使用有关设计5′引物的新序列信息进行单独的全长PCR来构建。
为提供本发明的某些优点，用于杂交研究或检定的优选核酸序列包括与至少10个到约70个核苷酸长的聚核苷酸区段互补的探针分子，所述聚核苷酸编码表皮葡萄球菌多肽，诸如SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一中所示的多肽。至少10个核苷酸长的尺寸有助于确保片段将具有足够长度以形成稳定且具选择性的双链体分子。然而，一般优选在大于10个碱基长的区段上具有互补序列的分子，以便增加杂交体的稳定性和选择性，且借此改良所获得的特异性杂交体分子的品质和等级。一般将优选设计具有25个到40个核苷酸、55个到70个核苷酸或视需要甚至更长的基因互补区段的核酸分子。可例如通过以化学方式直接合成片段、通过应用诸如PCR技术(美国专利4,683,202，其是以引用的方式并入本文)的核酸复制技术或通过从含有适当插入物和适当限制性酶位点的重组质粒切除所选DNA片段来容易地制备所述片段。
在另一实施例中，预期经分离和纯化的聚核苷酸包含与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的至少10个相邻碱基的区段相同或互补的核苷酸序列，其中所述聚核苷酸与编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸杂交。经分离和纯化的聚核苷酸优选包含与SEQ IDNO：33到SEQ ID NO：64其中之一的至少25个到约70个相邻碱基的区段相同或互补的碱基序列。举例说来，聚核苷酸可包含与已公开核苷酸序列的40个或55个相邻碱基相同或互补的碱基区段。
因此，可使用聚核苷酸探针分子与互补基因区段选择性形成双链体分子的能力。视所预想的应用而定，将需要使用不同杂交条件以达成探针对目标序列的不同选择性程度(参看下表1)。对于需要高选择性程度的应用而言，通常将需要使用相对严格的条件形成杂交体。对于一些应用而言，例如，当需要使用与基础模板杂交的突变体引物链制备突变体时，或当设法从其它细胞、功能性等效物等分离表皮葡萄球菌同源多肽编码序列时，通常需要较低严格度杂交条件以允许形成异源双链体(参看表1)。因此，可相对于对照杂交容易地将交叉杂交物质鉴别为阳性杂交信号。由此，易于操纵杂交条件且因此一般将为视所需结果选择的方法。
对于某些应用而言，例如当需要使用与基础模板杂交的突变体引物链制备突变体时，或当设法从其它细胞、功能性等效物等分离同源多肽编码序列时，通常需要较低严格度杂交条件以允许形成异源双链体。因此，可相对于对照杂交容易地将交叉杂交物质鉴别为阳性杂交信号。在任何情况下，一般应了解，可通过加入渐增量的甲酰胺使条件更为严格，所述渐增量的甲酰胺是用于以与上升温度相同的方式使杂交双链体去稳定。因此，易于操纵杂交条件，且由此一般将为视所需结果选择的方法。
本文中还描述能够在低严格度条件下、更优选在严格条件下且最优选在高度严格的条件下与下文所述的聚核苷酸杂交的聚核苷酸。严格度条件的实例展示于下表1中：高严格度条件为至少与(例如)条件A-F同样严格的条件；严格条件至少与(例如)条件G-L同样严格；且低严格度条件至少与(例如)条件M-R同样严格。
表1
严格度条件
  严格度条件   聚核苷酸杂交体   杂交体长度(bp)1   杂交温度和缓冲液H   洗涤温度和缓冲液H
  A   DNA:DNA   ＞50   65℃；1×SSC或42℃；1×SSC，50％甲酰胺   65℃；0.3×SSC
  B   DNA:DNA   ＜50   TB；1×SSC   TB；1×SSC
  C   DNA:RNA   ＞50   67℃；1×SSC或45℃；1×SSC，50％甲酰胺   67℃；0.3×SSC
  D   DNA:RNA   ＜50   TD；1×SSC   TD；1×SSC
  E   RNA:RNA   ＞50   70℃；1×SSC或50℃；1×SSC，50％甲酰胺   70℃；0.3×SSC
  F   RNA:RNA   ＜50   TF；1×SSC   TF；1×SSC
  G   DNA:DNA   ＞50   65℃；4×SSC或42℃；4×SSC；50％甲酰胺   65℃；1×SSC
 H   DNA:DNA ＜50   TH；4×SSC   TH；4×SSC
 I   DNA:RNA ＞50   67℃；4×SSC或45℃；4×SSC，50％甲酰胺   67℃；1×SSC
 J   DNA:RNA ＜50   TJ；4×SSC   TJ；4×SSC
 K   RNA:RNA ＞50   70℃；4×SSC或50℃；4×SSC；50％甲酰胺   67℃；1×SSC
 L   RNA:RNA ＜50   TL；2×SSC   TL；2×SSC
 M   DNA:DNA ＞50   50℃；4×SSC或40℃；6×SSC，50％甲酰胺   50℃；2×SSC
 N   DNA:DNA ＜50   TN；6×SSC   TN；6×SSC
 O   DNA:RNA ＞50   55℃；4×SSC或42℃；6×SSC，50％甲酰胺   55℃；2×SSC
 P   DNA:RNA ＜50   TP；6×SSC   TP；6×SSC
 Q   RNA:RNA ＞50   60℃；4×SSC或45℃；6×SSC，50％甲酰胺   60℃，2×SSC
 R   RNA:RNA ＜50   TR；4×SSC   TR；4×SSC
(bp)1：杂交体长度为所预期的杂交聚核苷酸中杂交区域的长度。当使聚核苷酸与具有未知序列的目标聚核苷酸杂交时，假定杂交体长度为杂交聚核苷酸的长度。当与具有已知序列的聚核苷酸杂交时，可通过对准聚核苷酸的序列并鉴别具有最佳序列互补性的区域来测定杂交体长度。
缓冲液H：在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可经SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)替换；在杂交完成后进行洗涤15分钟。
TB到TR：预期小于50个碱基对长的杂交体的杂交温度应比杂交体的熔解温度(Tm)低5-10℃，其中Tm是根据以下等式确定。对于小于18个碱基对长的杂交体而言，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于介于18个与49个碱基对长度之间的杂交体而言，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交体中的碱基数，且[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的浓度(1×SSC中[Na+]＝0.165M)。
聚核苷酸杂交的严格度条件的其它实例提供于Sambrook等人，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9章和第11章；和Ausubel等人，1995，Current Protocols in Molecular Biology编辑，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10节和第6.3-6.4节中，所述文献是以引用的方式并入下文中。
B.表皮葡萄球菌多肽
在特定实施例中，本发明提供用于免疫原性组合物中的经分离和纯化的表皮葡萄球菌多肽。用于本发明的免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌多肽优选为重组多肽。在某些实施例中，表皮葡萄球菌多肽包含与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一、其生物等效物或其片段的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
用于本发明的免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌多肽涵盖包含以下各物的多肽：1)SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一中所示的氨基酸序列；2)天然存在的SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32的表皮葡萄球菌多肽的功能性和非功能性变异体或生物等效物；3)SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32的表皮葡萄球菌多肽的重组产生变异体或生物等效物；和4)从除表皮葡萄球菌外的生物体分离的多肽(表皮葡萄球菌多肽的直系同源物)。
所述表皮葡萄球菌多肽的生物等效物或变异体涵盖：1)从表皮葡萄球菌分离的多肽；和2)实质上含有与表皮葡萄球菌多肽的同源性的多肽。
表皮葡萄球菌的生物等效物或变异体包括功能性与非功能性表皮葡萄球菌多肽。功能性生物等效物或变异体为保持在受试者体内引发免疫或抗原反应的能力的表皮葡萄球菌多肽的天然存在的氨基酸序列变异体。功能性变异体通常将仅含有SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的一个或多个氨基酸的保守取代或所述多肽的非关键区域中(例如，不是在含有抗原决定簇或保护性抗原表位的区域中)非关键残基的取代、缺失或插入。
本发明另外提供表皮葡萄球菌多肽的非表皮葡萄球菌直系同源物。表皮葡萄球菌多肽的直系同源物是从非表皮葡萄球菌生物体分离且具有表皮葡萄球菌多肽的抗原能力的多肽。可容易地鉴别表皮葡萄球菌多肽的直系同源物包含与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一实质同源的氨基酸序列。
可对本发明的多肽的结构进行改进和改变，且仍获得具有表皮葡萄球菌抗原性的分子。举例说来，可在序列中以其它氨基酸取代某些氨基酸而不明显损失抗原性。由于多肽的相互作用能力和性质界定所述多肽的生物功能活性，故可在多肽序列(或当然其基础DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列的取代，且仍然获得具类似特性的多肽。
在进行所述改变时，可考虑氨基酸的水合指数(hydropathic index)。此项技术中一般理解氨基酸水合指数于赋予多肽相互作用的生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle，JMol Biol，157：第105-132页，1982)。已知某些氨基酸可经具有类似水合指数或得分的其它氨基酸取代且仍产生具有类似生物活性的多肽。已基于氨基酸的疏水性和电荷特性指派每一氨基酸的水合指数。这些指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺酸(-3.5)；和精氨酸(-4.5)。
认为氨基酸残基的相对水合特性决定所得多肽的二级和三级结构，其接着界定所述多肽与诸如酶、底物、受体、抗体、抗原等其它分子的相互作用。此项技术中已知，氨基酸可经另一具有相似水合指数的氨基酸取代且仍获得功能相当的多肽。在所述改变中，优选水合指数在+/-2以内的氨基酸的取代，特别优选水合指数在+/-1以内的氨基酸的取代，且甚至更特别优选在+/-0.5以内的氨基酸的取代。
也可基于亲水性、尤其在意欲将由此产生的生物功能相当的多肽或肽用于免疫实施例中的情况下对相似氨基酸进行取代。以引用的方式并入下文中的美国专利4,554,101声明，如受相邻氨基酸的亲水性影响的多肽的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与所述多肽的生物学特性相关。
如美国专利4,554,101中所详述，已将以下亲水性值指派给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+3.0)；天冬酰胺酸(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应了解，氨基酸可经另一具有相似亲水性值的氨基酸取代且仍获得生物学上相当且尤其是免疫学上相当的多肽。在所述改变中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，且甚至更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所述，因此，氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基(例如)疏水性、亲水性、电荷、尺寸等的相对相似度。所属领域技术人员众所周知考虑到多种上述特性的示范性取代，且其包括：精氨酸与赖氨酸；谷氨酸与天冬氨酸；丝氨酸与苏氨酸；谷氨酰胺与天冬酰胺酸；和缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸(参看下表2)。因此，本发明涵盖包含如上文所述的表皮葡萄球菌多肽的功能性或生物等效物的免疫原性组合物。
表2
氨基酸取代
原始残基示范性残基取代
也可使用位点特异性突变诱发制备多肽的生物等效物或功能性等效物。位点特异性突变诱发是可通过编码DNA的特异性突变诱发来制备衍生自其序列的第二代多肽或生物功能相当的多肽或肽的有用技术。如上文所述，在需要氨基酸取代的地方可能需要所述改变。所述技术另外提供通过将一或多种核苷酸序列改变引入DNA中来制备和测试序列变异体(例如，并有一或多种前述考虑因素)的现成能力。位点特异性突变诱发允许通过使用编码具有所需突变和足够数量相邻核苷酸的DNA序列的特异性寡核苷酸序列提供具有足够长度和序列复杂度的引物序列以于横越缺失接点两侧上形成稳定双链体，来产生突变体。通常，优选长度为约17个到25个核苷酸的引物，且序列接合点两侧上约5个到10个残基是变化的。
一般说来，此项技术中众所周知位点特异性突变诱发的技术。如将了解的，所述技术通常使用可以单链和双链形式存在的噬菌体载体。通常，通过首先获得序列内包括编码所有或一部分所选表皮葡萄球菌多肽序列的DNA序列的单链载体来进行根据本文的定点突变诱发。制备(例如，合成)具有所需突变序列的寡核苷酸引物。随后，使这一引物与单链载体退火，并通过使用诸如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段的酶进行延长，以完成具有突变的链的合成。因此，形成异源双链体，其中一条链编码未突变的原始序列，且另一条链具有所需突变。随后，使用这一异源双链体载体转化适当的细胞(诸如，大肠杆菌细胞)，并且选择包括具有突变的重组载体的克隆。一起提供市面有售的试剂盒与所有必需的试剂，但寡核苷酸引物除外。
应将用于本发明的免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌多肽或多肽抗原理解为任何表皮葡萄球菌多肽，其包含与包含SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸序列的表皮葡萄球菌多肽的实质序列相似性、结构相似性和/或功能相似性。此外，所述表皮葡萄球菌多肽或多肽抗原不限于特定来源。因此，本发明提供对于各种来源的多肽的通用检测和分离技术。
本发明预期可有利地将表皮葡萄球菌多肽分裂成片段以用于进一步结构或功能分析中或用于产生诸如表皮葡萄球菌相关多肽和表皮葡萄球菌特异性抗体的试剂。这可通过用诸如内切蛋白酶glu-C(Boehringer，Indianapolis，IN)的肽酶处理经纯化或未经纯化的表皮葡萄球菌多肽实现。用CNBr处理是可由天然表皮葡萄球菌多肽产生肽片段的另一种方法。也可使用重组技术产生表皮葡萄球菌多肽的特定片段。
本发明的免疫原性组合物中还包括表皮葡萄球菌多肽的片段。片段是具有完全与氨基酸序列的部分(但非全部)相同的氨基酸序列的多肽。所述片段可包含SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸序列的(例如)至少7个或7个以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或20个以上)相邻氨基酸。片段可为“独立式(freestanding)”或包含在其形成一部分或区域、最优选作为单一连续区域的较大多肽内。在一实施例中，所述片段包括成熟多肽序列的至少一个抗原表位。
“融合蛋白”是指由两个通常不相关的融合基因或其片段编码的蛋白质或多肽。举例说来，已描述包含免疫球蛋白分子恒定区中多个部分连同另一人类蛋白或其部分的融合蛋白或多肽。在许多情况下，使用免疫球蛋白Fc区作为融合蛋白或多肽的一部分对于用于引起(例如)药代动力学特性改良的治疗和诊断中是有利的(例如，参看国际专利申请案EP-A 0232 2621)。另一方面，对于某些用途而言，需要能够在表达、检测和纯化融合蛋白或多肽之后缺失Fc部分。
预期可从表皮葡萄球菌分离或如本文所述重组制备表皮葡萄球菌多肽。
C.表皮葡萄球菌聚核苷酸和多肽变异体
如下文所使用的术语“变异体”是一种分别不同于参考聚核苷酸或多肽但保持基本特性的聚核苷酸或多肽。聚核苷酸的典型变异体的核苷酸序列与另一参考聚核苷酸的核苷酸序列不同。所述变异体核苷酸序列的改变可能改变或可能不改变由参考聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所讨论，核苷酸改变可导致由参考序列编码的多肽中氨基酸取代、添加、缺失、融合和截断。多肽的典型变异体的氨基酸序列与另一参考多肽的氨基酸序列不同。一般会对差异加以限制，从而使参考多肽和变异体的全部序列紧密类似且在许多区域中相同。变异体多肽与参考多肽的不同之处可在于氨基酸序列中一个或多个取代、添加、缺失的任何组合。经取代或插入的氨基酸残基可能是或可能不是遗传密码所编码的氨基酸残基。聚核苷酸或多肽的变异体可天然存在，诸如等位基因变异体；或者其可为并未已知天然存在的变异体。可通过突变诱发技术或通过直接合成制得聚核苷酸和多肽的非天然存在的变异体。
如此项技术中已知，“同一性”是如通过比较两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上聚核苷酸序列所确定的所述序列之间的关系。在此项技术中，“同一性”还指，视情况如通过匹配多肽或聚核苷酸序列链所确定的所述序列之间的序列相关程度。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似度”，所述方法包括(但不限于)(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，NewYork，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第I部，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，yon Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，MStockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988))中所述的方法。设计测定同一性的方法以得到经测试序列之间的最大匹配。将测定同一性和相似度的方法编程成为公开可用的计算机程序。测定两个序列之间的同一性和相似度的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12(1)：387，1984)、BLASTP、BLASTN、TBLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Molec.Biol.215：403-410，1990)。BLASTX程序是从NCBI和其它来源公开可用(BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，J.Molec.Biol.215：403-410，1990)。众所周知的Smith-Waterman算法也可用于测定同一性。
举例说来，本文所述的聚核苷酸序列可与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的参考序列相同，即100％相同；或如与参考序列相比较，其可包括至多特定整数个数的核苷酸变化。所述变化选自由至少一个核苷酸缺失、取代(包括转换和颠换)或插入组成的群组，且其中所述变化可发生于参考核苷酸序列的5′或3′末端位置，或所述末端位置之间的任何地方，独立地分散于参考序列中的核苷酸之间或参考序列内一个或多个相邻基团中。通过使SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一中的核苷酸总数乘以个别同一性百分数的数字百分数(除以100)，并以所述SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的核苷酸总数减去所述乘积来确定核苷酸变化数。
举例说来，经分离的表皮葡萄球菌聚核苷酸包含与SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一、其简并变异体或其片段的核苷酸序列具有至少70％同一性的聚核苷酸序列，其中所述聚核苷酸序列可包括SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的核酸序列的整个聚核苷酸区域内至多nn个核酸变化，其中nn为最大变化数，且其是通过下式计算：
nn≤xn-(xn·y)，
其中，xn为SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的核酸总数，且y值为0.70，其中将xn与y的任何非整数乘积都四舍五入成最接近的整数，随后用xn减去所述乘积。当然，y值也可为0.80(80％)、0.85(85％)、0.90(90％)、0.95(95％)等。编码SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：32中的一个多肽的聚核苷酸序列的变化可在这一编码序列中产生无义、错义或移码突变，且因此改变由所述变化后的聚核苷酸编码的多肽。
类似地，本文所述的多肽序列可与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32的参考序列相同，即100％相同；或如与参考序列相比较，其可包括至多特定整数个数的氨基酸变化，从而使同一性％小于100％。所述变化选自由至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入组成的群组，且其中所述变化可发生于参考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置，或所述末端位置之间的任何地方，独立地分散于参考序列中的氨基酸之间或参考序列内一个或多个相邻基团中。通过使SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一中的氨基酸总数乘以个别同一性百分数的数字百分数(除以100)，且随后以所述SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸总数减去所述乘积或以下式来确定指定同一性％下氨基酸的变化数：
na≤xa-(xa·y)，
其中，na为氨基酸变化的数量，xa为SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸总数，且y为(例如)0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)等，且其中将xa与y的任何非整数乘积四舍五入成最接近的整数，随后用xa减去所述乘积。
D.载体、宿主细胞和重组表皮葡萄球菌多肽
在一实施例中，本发明提供包含ORF聚核苷酸的表达载体，所述ORF聚核苷酸编码用于免疫原性组合物中的表皮葡萄球菌多肽。表皮葡萄球菌表达载体包含编码表皮葡萄球菌多肽的ORF聚核苷酸，所述表皮葡萄球菌多肽包含SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸残基序列。或者，表达载体包含具有SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的核苷酸碱基序列的聚核苷酸。在其它实施例中，本发明的表达载体包含可操作地连接到增强子-启动子的聚核苷酸。在其它实施例中，表达载体包含可操作地连接到原核启动子的聚核苷酸。或者，表达载体包含可操作地连接到为真核启动子的增强子-启动子的聚核苷酸。表达载体另外包含定位于羧基端氨基酸的3′处且在经编码多肽的转录单元内的聚腺苷酸化信号。
原核生物中蛋白质的表达最常是在大肠杆菌中以含有引导融合或非融合蛋白表达的组成性或可诱导启动子的载体进行。融合载体将多个氨基酸添加到其中编码的蛋白质上，通常添加到重组蛋白的氨基端。所述融合载体通常用于三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和3)通过充当亲和纯化中的配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分与重组蛋白的接合处引入蛋白水解分裂位点，以使重组蛋白与融合部分能够分离，随后进行融合蛋白的纯化。所述酶和其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，Gene67：31-40，1988)、pMAL(New England Biolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其将谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A分别与目标重组蛋白融合。
在一实施例中，将表皮葡萄球菌聚核苷酸的编码序列克隆到pGEX表达载体中以产生编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白从N末端到C末端包含GST-凝血酶分裂位点-表皮葡萄球菌多肽。可使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和色谱纯化融合蛋白。未与GST融合的重组表皮葡萄球菌多肽可通过用凝血酶分裂融合蛋白来进行回收。
适当的可诱导非融合型大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，Gene69：301-315，1988)、pET lld(Studier等人，″Gene Expression Technology″Methods inEnzymology 185，60-89，1990)、pBAD和pCRT7。pTrc载体的目标基因表达依赖于从杂交体trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。pET lld载体的目标基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶J7gnl介导的从T7gnl 0-lac融合启动子起始的转录。这一病毒聚合酶是由具有处于lacUV 5启动子转录控制下的T7gnl基因的常驻原噬菌体(residentprophage)的宿主菌株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)提供。
一种使大肠杆菌中重组蛋白的表达最大化的策略是，在具有削弱的蛋白水解分裂重组蛋白的能力的宿主细菌中表达蛋白质。另一策略是，改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，从而使每一氨基酸的个别密码子都是大肠杆菌中优先利用的密码子。所述本发明核酸序列的变化可通过标准DNA突变诱发或合成技术进行。
在另一实施例中，表皮葡萄球菌聚核苷酸表达载体为酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec I(Baldari等人，Embo J，6：第229-234页，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell，第933-943页，1982)、pJRY88(Schultz等人，Gene，54：第113-123页，1987)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
或者，可在昆虫细胞中(例如)使用杆状病毒表达载体表达表皮葡萄球菌聚核苷酸。可用于在所培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，Mol Cell Biol，3：第2156-2165页，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，Virology，170：第31-39页，1989)。
在另一实施例中，本发明的核酸是在哺乳动物细胞中使用哺乳动物表达载体进行表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，Nature，329：第840页，1987)和pMT2PC(Kaufman等人，EMBO J，6：第187-195页，1987)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常是由病毒调控元件提供。
如下文所使用，启动子是通常在转录起始点(即，转录起始位点)前(上游)约100个核苷酸对以内的DNA分子区域。这一区域通常含有在不同基因中位于类似相对位置中的数类DNA序列元件。如下文所使用，术语“启动子”包括此项技术中称为通用真核RNA聚合酶II转录单元的上游启动子区、启动子区或启动子的物质。
另一类不连续转录调控序列元件是增强子。增强子对特定编码区(例如，基因)提供时间、位置和表达水平的特异性。增强子的主要功能是增加细胞中含有一个或多个与所述增强子结合的转录因子的编码序列的转录水平。与启动子不同，只要存在启动子，那么当增强子位于距离转录起始位点不定距离处时都可起作用。
如下文所使用，短语“增强子-启动子”意思是含有增强子元件与启动子元件的复合单元。增强子-启动子可操作地连接到编码至少一种基因产物的编码序列。如下文所使用，短语“可操作地连接”意思是，增强子-启动子是以使所述编码序列的转录受所述增强子-启动子控制和调控的方式与编码序列连接。此项技术中众所周知使增强子-启动子与编码序列可操作地连接的方式。如此项技术中众所周知，相对于转录受控制的编码序列的精确方向和位置特别视增强子-启动子的特殊性质而定。因此，TATA框的最小启动子通常位于转录起始位点上游约25个到约30个碱基对处，且上游启动子元件通常位于转录起始位点上游约100个到约200个碱基对处。相比之下，增强子可位于起始位点下游且可在距离所述位点合理的距离处。
用于本文所述的载体构建体中的增强子-启动子可为驱动待转染的细胞中的表达的任何增强子-启动子。通过使用具有众所周知的特性的增强子-启动子，可使基因产物的表达水平和模式最佳化。
举例说来，常用启动子是得自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于其它用于原核和真核细胞的适当表达系统请参看Sambrook等人，″Molecular Cloning：ALaboratory Manual″第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989第16章和第17章，所述文献是以引用的方式并入下文。
在另一实施例中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，组织特异性调控元件用于表达核酸)。此项技术中已知组织特异性调控元件。适当组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人，GenesDev，1：第268-277页，1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，Adv Immunol，43：第235-275页，1988)(尤其是T细胞受体(Winoto和Baltimore，EMBO J，8：第729-733页，1989)和免疫球蛋白(Banerji等人，Cell，33：第729-740页，1983)(Queen和Baltimore，Cell，33：第741-748页，1983)的启动子)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle，PNAS，86：第5473-5477页，1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人，Science，230：第912-916页，1985)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利4,873,316和国际专利申请案EP 264,166)。也涵盖发育调控的启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss，Science，249：第374-379页，1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，Genes Dev，3：第537-546页，1989)。
本文还提供一种重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的编码表皮葡萄球菌多肽的DNA分子。也就是说，DNA分子以允许与表皮葡萄球菌mRNA反义的RNA分子表达(通过转录DNA分子)的方式与调控序列可操作地连接。可选择可操作地连接到以反义方向克隆的核酸的调控序列，其引导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达。举例说来，可选择引导反义RNA组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子或调控序列。反义表达载体可为反义核酸是在高效调控区的控制下产生的重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其活性可通过引入载体的细胞类型确定。
可将本文所述的重组表达载体插入到任何适当的宿主细胞中。术语“宿主细胞”与“重组宿主细胞”在下文中可互换使用。应了解，所述术语不仅是指特定的受试者细胞，而且也指所述细胞的后代或可能的后代。由于在随后的数代中因突变或环境影响而可能出现某些改变，故实际上，所述后代可能与亲代细胞不同，但仍包括于如下文所使用的术语的范围内。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。举例说来，表皮葡萄球菌多肽可在细菌细胞(诸如，大肠杆菌)、昆虫细胞(诸如Sf9、Sf21)、酵母或哺乳动物细胞(诸如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、VERO、鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast)、BHK细胞或COS细胞)中表达。所属领域技术人员已知其它适当的宿主细胞。
载体DNA是通过常规转化、感染或转染技术引入原核或真核细胞。如下文所使用，术语“转化”和“转染”旨在是指将外来核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的各种技术公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染(lipofection)、超声波处理或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的适当方法可见于Sambrook等人(″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验室手册中。
使用本文所述的宿主细胞(诸如培养中的原核或真核宿主细胞)产生(即，表达)表皮葡萄球菌多肽。因此，本文也描述使用所述宿主细胞产生表皮葡萄球菌多肽的方法。在一实施例中，所述方法包含在适当培养基中培养宿主细胞(其中已引入编码表皮葡萄球菌多肽的重组表达载体)直到产生表皮葡萄球菌多肽。在另一实施例中，所述方法另外包含将表皮葡萄球菌多肽从培养基或宿主细胞中分离。
使表达载体的编码序列可操作地连接到转录终止区。RNA聚合酶经由发生聚腺苷酸化的位点转录编码DNA序列。通常，位于聚腺苷酸化位点下游数百碱基对处的DNA序列用于终止转录。这些DNA序列在下文中被称为转录终止区。这些区域为有效聚腺苷酸化经转录信使RNA(mRNA)所必需。此项技术中众所周知转录终止区。所述转录终止区的实例为SV40和鱼精蛋白基因的聚腺苷酸化信号。
表达载体包含编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸。所述多肽意欲包括编码表皮葡萄球菌多肽的核苷酸碱基序列，所述表皮葡萄球菌多肽的长度足以使所述区段与编码非表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸区段相区别。所述多肽还可编码生物功能性多肽或肽，其具有诸如具有基于(诸如)所交换的氨基酸的相对水合得分的考虑因素而选择的改变的变异体氨基酸序列。这些变异体序列是从天然来源分离或使用诸如定点突变诱发的突变诱发程序在下文所公开的序列中诱导的序列。
在某些实施例中，本文所述的表达载体包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽包含SEQID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸残基序列。表达载体可包括上文所示的任何表皮葡萄球菌多肽的表皮葡萄球菌多肽编码区本身，或者其可含有在所述表皮葡萄球菌多肽的基础编码区中具有所选变化或修饰的编码区。或者，所述载体或片段可编码较大多肽或仍包括基础编码区的多肽。在任何情况下，都应了解，归因于密码子冗余和生物功能的等效性，这一方面不限于与上文所示的多肽序列对应的特定DNA分子。
示范性载体包括pCMV家族的哺乳动物表达载体，包括pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.，Emeryville CA.)。在某些情况下且尤其在这些个别哺乳动物表达载体的情况下，所得构建体可能必需与含有诸如pSV2neo的可选择标记的载体共转染。通过共转染到二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(诸如DG44)中，依靠并入所述表达载体中的DNA表达表皮葡萄球菌多肽的克隆可得以检测。
可通过多种此项技术中众所周知的技术将DNA分子并入载体中。举例说来，已证实载体pUC18对于克隆和表达基因特别有价值。同样，可在本发明的某些实施例中、尤其是在进行双脱氧测序时使用相关载体M13mp18和M13mp19。
本文所述的表达载体可用作制备大量表皮葡萄球菌多肽编码DNA本身的方式，而且也可用作制备经编码多肽和肽的方式。预期当以重组方式制得表皮葡萄球菌多肽时，可使用原核或真核表达载体作为穿梭系统(shuttle system)。
另一方面，重组宿主细胞为原核宿主细胞。本发明的重组宿主细胞优选为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株的细菌细胞。一般说来，优选原核生物起始克隆DNA序列并构建可用于本发明中的载体。举例说来，大肠杆菌K12菌株可特别有用。可使用的其它微生物菌株包括E.coli B和E.colix 1976(ATCC编号31537)。当然，这些实例旨在进行说明而非限制。
可使用上文所提及的菌株，和大肠杆菌W3110(ATCC编号273325)、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Top10；杆状菌(bacilli)，诸如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)；或其它肠杆菌(enterobacteriaceae)，诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(或如美国专利4,837,15中所述的其它减毒沙门氏菌属菌株)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesans)和各种假单胞菌属。
一般说来，含有得自与宿主细胞可相容的种属的复制子和控制序列的质粒载体可与这些宿主组合使用。所述载体通常具有复制位点和能够在经转化细胞中提供表型选择的标记序列。举例说来，可使用pBR322(即，一种得自大肠杆菌种属的质粒)转化大肠杆菌(Bolivar等人，1977)。pBR322含有用于氨比西林(ampicillin)和四环素(tetracycline)抗性的基因，且因此提供鉴别经转化细胞的简便方式。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体也必须含有或经修饰而含有可由微生物生物体用于表达其自身多肽的启动子。
最常用于重组DNA构建中的那些启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人，1978；Itakura.等人，1977；Goeddel等人，1979；Goeddel等人，1980)和色氨酸(TRP)启动子系统(EP 0036776；Siebwenlist等人，1980)。尽管这些启动子最常使用，但已发现并利用其它微生物启动子，且已公开有关其核苷酸序列的细节，使得所属领域技术人员能够将功能性启动子引入质粒载体中(Siebwenlist等人，1980)。
除原核生物外，还可使用真核微生物，诸如酵母。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，但许多其它菌株通常可用。对于酵母菌中的表达而言，例如，通常使用质粒YRp7(Stinchcomb等人，1979；Kingsman等人，1979；Tschemper等人，1980)。这一质粒已含有trpl基因，其提供用于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变体菌株(例如，ATCC编号44076或PEP4-1)的选择标记(Jones，1977)。随后，作为酵母宿主细胞基因组特征的trpl损伤的存在为通过不存在色氨酸时的生长检测转化提供有效环境。
酵母载体中的适当启动子序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman.等人，1980)或其它糖酵解酶(Hess等人，1968；Holland等人，1978)(诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。在构建适当表达质粒时，也将与这些基因有关的终止序列引入待表达序列下游的表达载体中，以使mRNA聚腺苷酸化和终止。具有转录受生长条件控制的其它优势的其它启动子为用于醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶和上文提及的甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。含有酵母可相容启动子、复制起点和终止序列的任何质粒载体都是适合的。
除微生物外，还可将得自多细胞生物体的细胞的培养物用作宿主。原则上，任何所述细胞培养物都可使用，无论是来自脊椎动物还是来自非脊椎动物的培养物。然而，脊椎动物细胞已引起极大兴趣，且近年来，用培养(组织培养)使脊椎动物细胞繁殖已变成常规程序。所述有用的宿主细胞系的实例为AtT-20、VERO、HeLa、NSO、PER C6、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和W138、BHK、COSM6、COS-7、293和MDCK细胞系。用于所述细胞的表达载体通常包括(必要时)复制起点、位于待表达的基因上游的启动子连同任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。
在需要表达重组表皮葡萄球菌多肽且涵盖真核宿主的情况下，使用并有真核复制起点的载体(诸如质粒)是最合乎需要的。此外，出于在真核系统中表达的目的，需要将表皮葡萄球菌编码序列定位于邻近+.o且处于有效的真核启动子(诸如与中国仓鼠卵巢细胞组合使用的启动子)控制下。为使编码序列处于启动子(无论是真核启动子还是原核启动子)的控制下，必须将多肽的适当翻译阅读框的翻译起始区的5′端定位于距离所选启动子3′端或下游约1个与约50个核苷酸之间。而且，当预期进行真核表达时，通常需要将编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸并入转录单元中。
此项技术中众所周知用外源聚核苷酸(诸如DNA分子)转化或转染细胞的方式，且其包括诸如磷酸钙介导或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的转染、直接显微注射和腺病毒感染等技术(例如，参看Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989)。
最常用的方法是由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。尽管相关机制尚不明了，但认为经转染DNA通过内吞作用进入细胞的细胞质并转运到细胞核中。视细胞类型而定，可在任一时间转染多达90％的培养细胞集群。归因于其高效率，由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染成为用于需要在大量细胞中瞬时表达外来DNA的实验的所选方法。磷酸钙介导的转染也用于建立整合外来DNA拷贝的细胞系，所述DNA拷贝通常是以头尾串联阵列排列于宿主细胞基因组中。
在原生质体融合方法中，将得自细菌的具有大量所关注质粒拷贝的原生质体直接与所培养的哺乳动物细胞混合。在细胞膜融合(通常使用聚乙二醇)后，将所述细菌的内容物传递到哺乳动物细胞的细胞质中，且将质粒DNA转运到细胞核中。对于瞬时表达检定常用的许多细胞系而言，原生质体融合不如转染有效，但其对于DNA内吞作用不能有效发生的细胞系有用。原生质体融合经常得到多个串联整合于宿主染色体中的质粒DNA拷贝。
将简短、高电压电子脉冲施加于多种哺乳动物和植物细胞会导致在质膜中形成纳米尺寸的孔。使DNA通过这些孔或因伴随所述孔封闭的膜组份再分布而直接进入细胞质中。电穿孔可极为有效，且可用于瞬时表达经克隆基因和用于建立携带已整合的所关注基因拷贝的细胞系。相比磷酸钙介导的转染和原生质体融合，电穿孔经常使细胞系携带一个或至多数个已整合的外来DNA拷贝。
脂质体转染涉及将DNA和RNA封装于脂质体内，随后使脂质体与细胞膜融合。如何将DNA传递到细胞中的机制尚不明了，但转染效率可高达90％。
将DNA分子直接显微注射到细胞核中具有不将DNA暴露给诸如低pH值内体的细胞区室的优势。因此，显微注射主要用作建立携带已整合的所关注DNA拷贝的细胞系的方法。
此项技术中众所周知使用腺病毒作为细胞转染的载体。已关于多种细胞报导腺病毒载体介导的细胞转染(Stratford-Perricaudet等人，1992)。
经转染细胞可为原核或真核细胞。本发明的宿主细胞优选原核宿主细胞。当希望产生表皮葡萄球菌多肽时，经培养的原核宿主细胞特别引人关注。
本文还涵盖一种制备表皮葡萄萄球菌多肽的工艺或方法，其包含用编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸转化、转染或感染细胞以产生经转化宿主细胞；和在足以表达所述多肽的生物学条件下维持所述经转化宿主细胞。在特定实施例中，经转化宿主细胞为原核细胞。或者，所述宿主细胞为真核细胞。更具体说来，原核细胞为大肠杆菌DH5-α菌株的细菌细胞。或者，转染到经转化细胞中的聚核苷酸包含SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的核酸序列。此外，使用上文所公开的表达载体实现转染。用于所述工艺中的宿主细胞能够表达功能性重组表皮葡萄球菌多肽。
转染后，在培养条件下维持所述细胞一段足以表达表皮葡萄球菌多肽的时间。此项技术中众所周知培养条件，且其包括离子组成和浓度、温度、pH值等。通常，在培养条件下于培养基中维持经转染细胞。此项技术中众所周知用于各种细胞类型的适当培养基。在某些实施例中，培养温度为约20℃到约50℃，更优选约30℃到约40℃且甚至更优选约37℃。
pH值优选为约6.0的值到约8.0的值、更优选为约6.8的值到约7.8的值且最优选为约7.4。摩尔渗透压浓度优选为约每升200毫渗克分子(mosm/L)到约400mosm/L且更优选为约290mosm/L到约310mosm/L。此项技术中众所周知转染和表达经编码蛋白质所需的其它生物学条件。
将经转染细胞维持一段足以表达表皮葡萄球菌多肽的时间。适当时间特别视所使用的细胞类型而定且易于由所属领域技术人员确定。通常，维持时间为约2天到约14天。
从经转染细胞或培养这些细胞的培养基中回收或收集重组表皮葡萄球菌多肽。回收包含分离和纯化表皮葡萄球菌多肽。此项技术中众所周知用于多肽的分离和纯化技术，且其包括诸如沉淀、过滤、色谱、电泳等程序。
E.免疫原性组合物
本发明提供免疫原性组合物，其包含一或多种如下述实例中所述选择的表皮葡萄球菌多肽和生理学上可接受的载剂。在某些实施例中，免疫原性组合物包含一或多种包含一或多个SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32的氨基酸残基序列的表皮葡萄球菌多肽。在其它实施例中，本发明的免疫原性组合物包含编码表皮葡萄球菌多肽的聚核苷酸和生理学上可接受的载剂。举例说来，本发明的免疫原性组合物包含含有一或多个SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32的氨基酸序列的表皮葡萄球菌多肽。或者，免疫原性组合物包含含有一或多个SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64的核苷酸序列的聚核苷酸。
使用多种测试评定本发明多肽的体外免疫原性。举例说来，通过一起培育表皮葡萄球菌细胞、含有抗所讨论的多肽的特异性抗体的热灭活人类血清和外源补体源的混合物来进行体外调理素检定(opsonic assay)。调理吞噬是在培育新近分离的人类多形核细胞(PMN)和抗体/补体/葡萄球菌细胞混合物过程中进行。调理吞噬后，包覆有抗体和补体的细菌细胞被杀死。通过用检定混合物涂布平板来测定幸免于调理吞噬的存活细菌的集落形成单位(cfu)。如通过与检定对照相比较所测定，将滴度报导为得到≥50％细菌杀死率的最大稀释率的倒数。将在所测试的最低血清稀释率(1∶8)下证实小于50％杀死率的试样报导为具有为4的OPA滴度。所测试的最大稀释率为1∶2560。以较高初始稀释率开始，重复在最高稀释率下具有≥50％杀死率的样本。上述方法为Gray法(Gray，ConjugateVaccines Supplement，第694-697页，1990)的改进方法。
每一个别血清中都包括含有测试血清加细菌细胞和热灭活补体的测试血清对照。所述对照是用于评定抗生素的存在或其它血清组份的存在是否能够直接(即，不存在补体或PMN)杀死细菌菌株。将具有已知调理素滴度的人类血清用作阳性人类血清对照。将每一未知血清的调理素抗体滴度都计算为与无血清的对照相比得到50％cfu降低的初始血清稀释率的倒数。
还使用全细胞ELISA检定评定多肽抗原的体外免疫原性和表面暴露，其中将所关注的细菌菌株(表皮葡萄球菌)涂覆于诸如96孔板的平板上，且使来自免疫动物的测试血清与细菌细胞反应。如果对测试多肽抗原具特异性的任何抗体都可与多肽抗原表面暴露的抗原表位反应，那么其可通过所属领域技术人员已知的标准方法加以检测。
随后，在体内动物激发模型中测试证实所需体外活性的任何多肽。在某些实施例中，通过所属领域技术人员已知的免疫方法和途径(例如，鼻内、不经肠、经口、直肠、阴道、经皮、腹膜内、静脉内、皮下等)将免疫原性组合物用于动物(例如，小鼠)免疫中。在用特定表皮葡萄球菌免疫原性组合物使动物免疫后，用表皮葡萄球菌激发动物，并检定对表皮葡萄球菌感染的抗性。
将表皮葡萄球菌聚核苷酸和多肽并入适于投与受试者(例如，人类)的免疫原性组合物中。所述组合物通常包含核酸分子或蛋白质连同医药学上可接受的载剂。如下文所使用，术语“医药学上可接受的载剂”旨在包括可与医药投药相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此项技术中众所周知医药活性物质的所述介质和试剂的使用。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则所述介质都可用于本发明的组合物中。也可将辅助活性化合物并入组合物中。
对本发明的免疫原性组合物加以调配以使其与预期的投药途径相容。投药途径的实例包括不经肠(例如，静脉内、皮内、皮下、腹膜内)、经粘膜(例如，经口、直肠、鼻内、阴道、呼吸)和经皮(局部)。用于不经肠、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组份：无菌稀释剂，诸如注射用水、生理盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节渗透压的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节pH值。可将不经肠制剂密封于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。
适于注射使用的医药组合物包括无菌水溶液(在水溶情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内投药而言，适当载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必须无菌且应具有足够流动性以易于注射。其必须在制造和储存条件下稳定，且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其适当混合物的溶剂或分散介质。举例说来，可通过使用诸如卵磷脂的涂料、通过在分散液情况下维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多种抗菌剂和抗真菌剂实现对于微生物作用的预防，所述抗菌剂和抗真菌剂例如为对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等。在许多情况下，组合物中包括例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠的等渗剂。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来引起对于可注射组合物的延缓吸收。
可通过将所需量的活性化合物(例如，表皮葡萄球菌多肽或抗表皮葡萄球菌抗体)并入具有上文所列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中，视需要随后过滤杀菌来制备无菌可注射溶液。一般说来，通过将活性化合物并入含有基础分散介质和所需来自上文所列举的成分中的其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其将得到活性成分加上来自其先前经无菌过滤的溶液的任何其它所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载剂。可将其密封于明胶胶囊中或压制成片剂。出于经口治疗投与的目的，可将活性化合物与赋形剂合并，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可使用用作漱口药的流体载剂制备口服组合物，其中所述流体载剂中的化合物是经口施用且漱口并吐出或咽下。可包括医药学上可相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等都可含有下述具有类似性质的成分或化合物中的任一种：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶状二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷油、水杨酸甲酯或橙类调味剂。
对于吸入投药而言，化合物是以气雾剂喷雾形式从含有适当推进剂(例如，气体，诸如二氧化碳)的加压容器或分配器或喷雾器传递。全身投药也可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮投药而言，将适于透过屏障的渗透剂用于配方中。所述渗透剂一般为此项技术中所知，且包括(例如)用于经粘膜投药的清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可通过使用鼻喷雾或栓剂实现经粘膜投药。对于经皮投药而言，将活性化合物调配成如此项技术中一般已知的油膏、药膏、凝胶或乳膏。
还可制备栓剂(例如，具有常规栓剂基质，诸如可可油和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式的化合物以用于直肠传递。
在一实施例中，将活性化合物与将保护化合物免于经身体快速去除的载剂一起制备，诸如受控释放配方，包括植入物和微胶囊传递系统。
可使用生物可降解型生物可相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述配方的方法将为所属领域技术人员显而易见。所述材料也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc购得。也可将脂质体悬浮液(包括以具有抗病毒抗原的单克隆抗体的经感染细胞为目标的脂质体)用作医药学上可接受的载剂。这些悬浮液可根据所属领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利4,522,811中所述，所述专利是以引用的方式并入下文中。
将口服或不经肠组合物调配成剂量单位形式对于简化投药和使剂量均匀特别有利。如下文所使用的剂量单位形式是指适于作为整体剂量用于待治疗的受试者的实体离散单位；每一单位都含有经计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需医药载剂。本发明的剂量单位形式的规格是通过且直接视活性化合物的独特特性和将达成的特殊治疗作用和复合所述治疗个体的活性化合物的技术的固有局限性而指示。
通过包括两种或两种以上本发明的多肽，以及通过使一或多种本发明的多肽与一或多种已知的非表皮葡萄球菌多肽(诸如，金黄葡萄球菌多肽)组合来提供组合免疫原性组合物。
下述十二种表皮葡萄球菌多肽序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：30具有与来自金黄葡萄球菌的同源物具至少90％同一性的多肽序列。因此，这十二种多肽也可用于对抗金黄葡萄球菌的免疫原性组合物中。此外，下述十二种编码与金黄葡萄球菌同源物具有至少90％同一性的多肽的表皮葡萄球菌聚核苷酸序列也可用于免疫原性组合物中：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ IDNO：62或其简并变异体或其片段。
在其它实施例中，通过使一或多种本发明的多肽与一或多种已知的表皮葡萄球菌多糖或多糖-蛋白质接合物组合来提供组合免疫原性组合物。例如，参看表皮葡萄球菌和金黄葡萄球菌荚膜多糖粘合素PNSG，即聚N-琥珀酰β-1-6N-乙酰葡糖胺(也称为PIA、PS/A、PNAG)。参看Mckenney，D.等人，Infect.Immun.66：4711(1998)和Mckenney，D.等人，Science 284：1523(1998)，所述文献的公开内容都是以全文引用的方式并入本文中。
在其它实施例中，通过使一或多种本发明的多肽与一或多种已知的金黄葡萄球菌多糖或金黄葡萄球菌多糖-蛋白质接合物组合来提供组合免疫原性组合物。举例说来，在12种已知的金黄葡萄球菌荚膜血清型中，血清型5(CP5)和血清型8(CP8)占所有临床分离株的约85-90％。大部分耐甲氧西林(methicillin)金黄葡萄球菌分离株表达CP5。抗CP5和CP8的抗体通过人类中性多形核白细胞体外诱导类型特异性调理吞噬杀死作用，并且使动物得到保护[Karakawa，W.W.，Sutton，A.等人，Infect Immun 56(5)：1090-1095(1988)；Fattom，A.I.，Sarwar，J.等人，Infection&Immunity64(5)：1659-1665(1996)]。一些实验室已合成由共价连接到蛋白质的CP5和CP8组成的免疫原性接合物。这些接合物在小鼠和人类体内具有高度免疫原性，且诱导调理微胶囊化金黄葡萄球菌吞噬作用的抗体[Fattom，A.，Schneerson，R等人，Infect Immun 61(3)：1023-1032(1993)；Gilbert，F.B.，Poutrel，B.等人，Vaccine 12(4)：369-374(1994)；Reynaud-Rondier，L，Voiland，A.等人，FEMSMicrobiol Immunol 3(4)：193-199(1991)]。含有接合到铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)重组外毒素A的CP5的单价免疫原性组合物具免疫原性且在健康成人和晚期肾病患者体内良好耐受[Welch，P.G.，Fattom，A.，Moore，J.Jr.等人，J.Am.Soc.Nephrol.7：247-253[Abstract](1996)]。在涉及接收血液透析的晚期肾病患者的双盲试验中，由共价结合到铜绿假单胞菌重组外毒素A的CP5和CP8构成的二价接合疫苗赋予对抗金黄葡萄球菌菌血症的部分免疫性持续约40周，此后，保护作用随抗体含量的降低而降低[Shinefield，H.，Black，S.等人，NEngl J Med 346(7)：491-496(2002)]。这一试验的结果表明需要一种可有助于更广泛和更完全保护的改良型免疫原性组合物。
如上文所述，在某些实施例中，通过使一或多种本发明的多肽与一或多种已知的金黄葡萄球菌多糖-蛋白质接合物组合来提供组合免疫原性组合物。碳水化合物-蛋白质接合物的“蛋白质组份”被称为载体蛋白。总的来说，术语“载体蛋白”优选为无毒且无致反应性且可以充足量和纯度获得的蛋白质。载体蛋白应遵从标准接合程序。在本发明的特定实施例中，将CRM197用作载体蛋白。CRM197(Wyeth，Sanford，NC)是从在以酪蛋白氨基酸和酵母提取物为主的培养基中生长的白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)培养物中分离的白喉毒素的无毒变异体(即，类毒素)。CRM197是通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱加以纯化。其它白喉类毒素也适用作载体蛋白。免疫原性组合物可另外包含佐剂，诸如铝基佐剂，诸如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
其它适当的载体蛋白包括已灭活的细菌毒素，诸如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请案WO2004/083251[38]中所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。也可使用细菌外膜蛋白，诸如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白(porin)、转铁结合蛋白(transferrin binding protein)、肺松解术(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。也可将其它蛋白用作载体蛋白，诸如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、胎牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的经纯化蛋白衍生物(PPD)。
通过多种载体和表达系统将包含聚核苷酸的免疫原性组合物传递到接受者。所述系统包括染色体系统、附加体系统和得自病毒的系统，例如得自以下各物的载体：细菌质粒；减毒细菌，诸如沙门氏菌属(Salmonella)(美国专利4,837,151)；噬菌体；转座子；酵母附加体；插入元件；酵母染色体元件；病毒，诸如牛痘和其它痘病毒、腺病毒、杆状病毒、乳多空病毒(诸如SV40)、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录酶病毒、α病毒(诸如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(美国专利5,643,576)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)和西门利克病毒(semiliki forest virus))、不分节段负链RNA病毒(nonsegmented negative-stranded RNA virus)(诸如水疱性口炎病毒(美国专利6,168,94))；和得自其组合的载体，诸如得自质粒和噬菌体遗传元件的载体，诸如柯斯质粒(cosmid)和噬粒。表达系统应包括调控和引起表达的控制区域，诸如启动子和其它调控元件(诸如聚腺苷酸化信号)。一般说来，可使用适于维持、繁殖或表达聚核苷酸以于宿主中产生多肽的任何系统或载体。可通过多种众所周知和常规技术中的任一种将适当的核苷酸序列插入到表达系统中，所述技术诸如Sambrook等人，″Molecular Cloning：ALaboratory Manual″第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述的技术。
医药学上可接受的媒剂应理解为表示进入医药组合物或免疫原性组合物中的化合物或化合物组合，其不引起副作用且使得可能(例如)有助于投与活性化合物、增加其在体内的寿命和/或功效、增加其在溶液中的溶解性或者增强其保存。众所周知这些医药学上可接受的媒剂，且所属领域技术人员将根据所选活性化合物的性质和投药模式对其进行调适。
如下文所定义，“佐剂”是一种用于增强“抗原”或免疫原性组合物的免疫原性的物质，所述免疫原性组合物包含一或多种具有选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一的氨基酸序列的多肽抗原。因此，佐剂通常用于激发或调节免疫反应且为所属领域技术人员众所周知。本发明所涵盖的佐剂的实例包括(但不限于)铝盐(明矾)，诸如磷酸铝和氢氧化铝；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其是从Corixa(Hamilton，MT)购得，且其描述于美国专利第6,113,918号中，一种所述AGP为2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(先前称为RC529)，其经调配为水溶液形式或稳定乳液形式；美国专利第4,912,094号中所述的MPLTM(3-O-脱酰化单磷酰脂A)(Corixa)；合成聚核苷酸，诸如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利第6,207,646号)；多肽；皂角苷，诸如Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics，Framingham，Massachusetts)，其描述于美国专利第5,057,540号中；百日咳毒素(PT)或大肠杆菌不耐热毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129，例如，参看国际专利公开案第WO 93/13302号和第WO 92/19265号；霍乱毒素(野生型或突变体形式，例如，根据已公开的国际专利申请案第WO 00/18434号，其中氨基酸第29位的谷氨酸经另一氨基酸、优选是组氨酸置换)。类似的霍乱毒素突变体描述于已公开的国际专利申请案第WO 02/098368号中(其中仅氨基酸第16位的异亮氨酸经另一氨基酸置换，或连同氨基酸第68位的丝氨酸经另一氨基酸置换；和/或其中氨基酸第72位的缬氨酸经另一氨基酸置换)。其它霍乱毒素突变体描述于已公开的国际专利申请案第WO 02/098369号中(其中氨基酸第25位的精氨酸经另一氨基酸置换；和/或将一个氨基酸插入到氨基酸第49位；和/或将两个氨基酸插入到氨基酸第35位和第36位)。
多种细胞因子和淋巴因子适于用作佐剂。一种所述佐剂为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，其具有如美国专利第5,078,996号中所述的核苷酸序列。已将含有GM-CSF cDNA的质粒转化到大肠杆菌中，且已由美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)(1081University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)以寄存编号39900予以保藏。细胞因子白细胞介素-12(IL-12)是描述于美国专利第5,723,127号中的另一种佐剂。已展示其它细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，包括(但不限于)白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干扰素-α、β和γ、粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α和β，且其都适于用作佐剂。
通常以含有标准、众所周知的生理学上可接受的无毒载剂、佐剂和媒剂(视需要)的单位剂量配方形式不经肠投与本发明的组合物。
可注射制剂(例如，无菌可注射水性或油性悬浮液)是根据已知技术使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂加以调配。无菌可注射制剂也可为无毒不经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。
可使用的可接受的媒剂和溶剂为水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，常规使用无菌的非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可使用包括合成单甘油酯或二甘油酯的任何温和非挥发性油。另外，诸如油酸的脂肪酸也可用于制备可注射物。
优选载剂包括经磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲的中性生理盐水溶液。当然，当投与病毒载体时，需充分纯化载体以使其基本上无不合需要的污染物(诸如缺陷型干扰腺病毒粒子或内毒素和其它热原质)，从而不会于接收载体构建体的个体体内引起任何不恰当的反应。纯化载体的优选方式包括使用浮力密度梯度，诸如氯化铯梯度离心。
载体也可为脂质体。此项技术中众所周知使用脂质体作为传递工具的方式(例如，参看Gabizon等人，1990；Ferruti等人，1986；和Ranade，1989)。
本发明的免疫原性组合物还包含可操作地与控制基因表达的调控序列缔合的本发明的聚核苷酸序列。在将促进DNA表达的调控元件(即，启动子和/或增强子元件)的控制下，将所关注的聚核苷酸序列工程设计到诸如质粒的表达载体中。在优选实施例中，使用人类巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子(美国专利5,168,062)。启动子可具有细胞特异性且仅允许在预定细胞中实质上转录聚核苷酸。
将本发明的聚核苷酸直接引入宿主中，所述聚核苷酸为“裸”DNA(美国专利5,580,859)或与诸如布比卡因和其它局部麻醉剂(美国专利5,593,972)和阳离子聚胺(美国专利6,127,170)的促进剂一起调配成组合物，所述专利是以全文引用的方式并入本文中。
在这一聚核苷酸免疫程序中，本发明的多肽是在体内瞬时表达；并未将遗传物质插入或整合到宿主染色体中。这一程序将与目的是将所关注遗传物质插入或整合到染色体中的基因疗法相区别。使用检定确认通过免疫投与的聚核苷酸不会在宿主中产生经转化表型(美国专利6,168,918)。
H.本发明的用途和方法
在免疫方法中使用本文所述的表皮葡萄球菌聚核苷酸、多肽和多肽同源物。经分离的聚核苷酸将用于表达表皮葡萄球菌多肽(例如，经由用于宿主细胞中或聚核苷酸免疫应用中的重组表达载体)。
如本文的实例中所详细描述，表皮葡萄球菌是在血清存在下生长以刺激可对全身细菌感染具重要意义的细菌细胞壁上蛋白质和碳水化合物表达。结果，将三十二种多肽和对应的聚核苷酸确定为当表皮葡萄球菌于70％血清中生长时由表皮葡萄球菌所表达。此外，已发现这些蛋白质中有二十四种与来自经表皮葡萄球菌感染的兔的免疫血清具反应性。
克隆对应于当表皮葡萄球菌在血清中生长时所表达的蛋白质的基因，并将其用于重组表达蛋白质。使用重组蛋白使小鼠免疫，且二十六种蛋白质中有二十五种将诱导与表皮葡萄球菌的全细胞溶解物反应的抗体。此外，这些血清中有十八种还与金黄葡萄球菌的全细胞溶解物反应。最后，当用表皮葡萄球菌激发经免疫小鼠时，发现十一种所述蛋白质已诱导降低激发后脾中所发现的可检测细菌的量的抗体。
本发明另外提供包含一或多种所述多肽的免疫原性组合物，所述多肽具有选自SEQID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一、其生物等效物或其片段的氨基酸序列。免疫原性组合物可另外包含医药学上可接受的载剂。在某些实施例中，免疫原性组合物将包含一或多种佐剂。
在另一实施例中，本发明提供免疫原性组合物，其包含具有选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64其中之一的核苷酸序列的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸是包含于重组表达载体中。所述载体优选为质粒DNA。聚核苷酸可另外包含异源核苷酸，例如聚核苷酸是可操作地连接到一或多种基因表达调控元件，且另外包含一或多种佐剂。在优选实施例中，免疫原性聚核苷酸组合物引导表皮葡萄球菌的一或多种中和表位的表达。
还提供使宿主免疫以对抗表皮葡萄球菌感染的方法。在优选实施例中，宿主为人类。因此，向宿主或受试者投与免疫量的免疫原性组合物，其包含具有选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32其中之一、其生物等效物或其片段的氨基酸序列的多肽，和医药学上可接受的载剂。免疫原性组合物的免疫量是通过进行剂量反应研究而确定，在所述剂量反应研究中，以逐渐增加量的免疫原性组合物使受试者免疫，且分析免疫反应以确定最佳剂量。所述研究的起始点是由动物模型中的免疫数据推定。剂量可视个体的特定情形而变化。所述量是在常规试验中通过所属领域技术人员已知的方式加以确定。
将免疫学上有效量的免疫原性组合物以适当数量的剂量投与受试者以引发免疫反应。如本文所使用的免疫学上有效量的意思是，将所述作为单一剂量或连续剂量一部分的量投与哺乳动物宿主(优选人类)足以至少引起待治疗个体的免疫系统产生降低细菌感染的临床影响的反应。理想地，所治疗的个体将不会展现出更严重的表皮葡萄球菌或金黄葡萄球菌感染的临床表现。剂量可视个体的特定情形(诸如年龄和体重)而变化。所述量可在常规试验中通过所属领域技术人员已知的方式加以确定。
本文所引用的所有专利和公开案都是以引用的方式并入本文。
实例
以下实例是使用标准技术进行，除此处详细描述的技术外，所述标准技术是众所周知的技术且对于所属领域技术人员而言为常规技术。除非另作说明，否则所有化学制品都是从Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)获得。以下实例是出于说明目的提供，且不应将其解释为以任何方式限制本发明的范围。
实例1
在70％血清中的细菌生长
使用临床分离株表皮葡萄球菌0-47进行以下实例。这一分离株中未加注释的基因组序列可得自Incyte Corporation，Palo Alto，CA。参看Heilmann，C等人，Infect Immun，64(1)：第277-82页(1996)。为刺激可与致病性临床相关的蛋白质的表达，37℃下，于振荡(200rpm)下，使细菌培养物在100％胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)或70：30兔血清：TSB中生长整夜。兔血清是从Life Technologies，Rockville，MD获得。将整夜培养的细菌稀释到OD600约为0.1，并且使其生长4h直到对数生长中期。在对数生长中期，通过离心采集细胞，并如以下实例中所述进行进一步处理。
实例2
制备用于2-D凝胶电泳的细胞壁片断
分离如实例1所述生长的表皮葡萄球菌0-47的细胞壁，且随后对其进行制备以用于二维凝胶电泳。再悬浮细菌小球直到OD600约为20，并在4℃下使用Tris缓冲生理盐水(TBS、20mM Tris(pH 8.0)、150mM NaCl)摇动洗涤两次历时15分钟。通过在4℃下用含有1M NaCl的20mM Tris(pH 8.0)洗涤15分钟来除去结合到细菌表面的血清蛋白。以与处理在血清中生长的细菌的方式相同的方式处理在TSB中生长的细菌。通过离心使细菌再次粒化。为产生原生质体，随后将细菌再悬浮于含有30％蔗糖、100μg/ml溶葡球菌酶、10μg/ml DNase、1μg/ml Pefablock(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、10μg/ml溶菌酶和100单位/毫升变溶菌素的TBS中直到OD600约为40，且在37℃下培育1小时。通过在5000rpm下离心10分钟使所得原生质体粒化，且倾析出含有细胞壁材料的上清液。向所倾析的含有细胞壁片断的上清液中补充Complete Mini蛋白酶抑制剂片剂(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)并在4℃下使用10,000kD MWCO透析膜(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)对水透析整夜。透析后，于-20℃下冷冻细胞壁片断。
分离后，如下制备用于2-D凝胶电泳的细胞壁片断样本：使冷冻细胞壁提取物解冻，且在冰上用70％丙酮使其沉淀4小时。使蛋白质沉淀物粒化，在SpeedVac(Thermo Savant，Holbrook，NY)中干燥且用含有5M尿素、2M硫脲、2％(w/v)CHAPS、2％(w/v)SB3-10、40mM Tris和0.2％Bio-Lyte 3/10的ReadyPrep(BioRad)SEQUENTIALEXTRACTION REAGENT 3溶解。
在室温下整夜培育期间，通过使各样本再水合凝胶条带来将所制备的细胞壁片断样本装载于11cm固定化pH梯度(IPG)条带pH 4-7(BioRad)上。样本尺寸为200μl总体积中250μg。整夜培育期间，用矿物油(BioRad)覆盖所述条带以防止蒸发。完成所述条带的再水合后，将过量矿物油移到已经水饱和的吸墨纸(blotting paper)上，且随后将已水合的条带装载于移相器等电聚焦(pHaser Isoelectric focusing，IEF)设备(GenomicSolutions Inc.，Ann Arbor，Ml)中。在50毫安/条带的电流极限下，以逐渐从250V增加到5,000V的电压使所述条带预先聚焦。接着，使电压在5,000V下保持恒定共计50kVh(约16h)。使用12.5％Criterion预制凝胶(BioRad)进行第二维SDS-PAGE。为进行质谱分析，根据制造商的说明书，用Sypro Ruby蛋白质凝胶染色剂(BioRad)对凝胶染色。
比较在TSB或70％兔血清中生长的表皮葡萄球菌中细胞壁相关蛋白的二维(2D)凝胶概况。参看图1。在70％兔血清中生长导致表皮葡萄球菌中细胞壁相关蛋白的蛋白质表达概况改变，所述改变易于在经荧光染色的2D凝胶转移中检测到(图1A和1B)。
通过荧光染色检测八种在TSB中或在兔血清存在下生长的表皮葡萄球菌之间经差异调控的蛋白质。参看表3和图1。最值得关注的是在70％血清中生长的细胞中介于25kDa与37kDa之间的三种蛋白质条纹带的荧光染色增加(图1B，斑点e、g和h)。
表3
经鉴别的斑点列表a
  b斑点编号   蛋白质   c检测
 SEQ ID NO：   方法
  1，2  12   I，S
  3  12   I，S
  3  19   I，S
  4c  11   I，S
  4  18   I，S
  5-7，9  11   I，S
  8  21   I
  10c  11   I，S
  10  18   I，S
  10  28   I，S
  11  3   I，S
  12  10   I，S
  13  10   I，S
  13  26   I，S
  14  dNGID   I，S
  15-16  10   I，S
  17   25   I
  18   4   I
  19   17   I，S
  19   23   I，S
  20-23，25   17   I，S
  24   30   I，S
  26   30   I，S
  26   8   I，S
  26   7   I，S
  27，30-32   2   I，S
  28，33   22   I，S
  29   5   I，S
  34   13   I，S
  35   NGID   I
  36   NGID   I
  37   NGID   I，S
  38   29   I，S
  38   3   I，S
  39   32   I，S
  40   14   S
  40   20   S
  40   27   S
  41   14   S
  42   6
  43   32   S
  43   16   S
  43   24   S
  44   15   S
a通过与免疫血清的反应性或与血清组份的结合在2D印迹上检测的斑点列表。
b某些斑点含有一种以上蛋白质。
c在转移到硝酸纤维素之后检测斑点的方法，受感染兔的反应性免疫血清为I或结合血清组份为S。
dNGID＝数据库中无基因
实例3
免疫血清和生物素化血清蛋白与细胞壁蛋白质的结合
完成第一维和第二维电泳后，将所述凝胶的蛋白质内容物转移到硝酸纤维素上供结合检定。具体说来，使用半干印迹设备(semi-dry blotting apparatus)(Owl SeparationsSystems，Portsmouth，NH)在12V下将所述凝胶的蛋白质内容物电印迹到硝酸纤维素膜(BioRad)上历时1小时。随后遵循制造商的说明书，用Sypro Ruby蛋白质印迹染色剂(BioRad)对含有蛋白质的硝酸纤维素膜(印迹)染色，且在FluorS Imager(BioRad)中显现。室温下在阻断缓冲液(具有0.05％Tween 20和5％奶粉的PBS)中培育每一印迹，随后与1∶2000稀释的免疫血清(Western印迹法)或40μg/ml生物素化血清蛋白(参看下文)一起培育整夜。培育整夜后，用洗涤缓冲液(具有0.5％Tween 20的PBS)洗涤印迹三次，且在室温下，在阻断缓冲液中与山羊抗兔IgG碱性磷酸酶接合物(BiosourceInternational，Camarillo，CA)或抗生蛋白链菌素碱性磷酸酶接合物(Biosource)一起培育2小时。用洗涤缓冲液再次洗涤印迹三次，并用BCIP/NBT膜磷酸酶底物系统(KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)显现。在FluorS中取得图像。2D凝胶的所有分析都是使用Melanie 3.0软件进行。
使用BioRad蛋白质检定试剂盒(BioRad)检定蛋白质浓度。
通过考察含有从2D凝胶上转移的蛋白质的硝酸纤维素膜的Western印迹，能够使细胞壁相关蛋白的蛋白质表达概况的改变更为明确。在Western印迹法中，将硝酸纤维素膜与从经表皮葡萄球菌0-47反复感染的兔汇集的免疫血清一起培育。参看图1C和1D。这些经上调的蛋白质也具有强免疫反应性，表明其在所述兔感染期间得到表达。在TSB中生长的细胞中，五种来自血清生长细胞的其它免疫反应性条纹带或斑点以较低或不可检测的水平表达。参看图1，斑点a、b、c、d和f。
实例4
分析与表皮葡萄球菌细胞壁相关蛋白质相互作用的血清蛋白
洗脱表皮葡萄球菌的血清蛋白
37℃下，使表皮葡萄球菌0-47在70％兔血清中生长直到OD600约为0.8，并使细胞粒化。在OD600约为20时使细胞再悬浮，并在4℃下，在摇动下用TSB洗涤三次。4℃下，在摇动下依次用含有0.5M NaCl、1.0M NaCl或4.0M尿素的20mM Tris(pH 8.0)洗脱已结合的血清蛋白历时1小时。随后通过离心除去细菌，并收集上清液。上清液含有从细菌表面洗脱的血清蛋白。通过SDS-PAGE使用4-20％梯度Tris-甘氨酸凝胶(Cambrex Biosciences Rockland，Inc.，Rockland，ME)分析在不同条件下洗脱的蛋白质。
生物素化血清蛋白
4℃下，对PBS透析所洗脱的血清蛋白整夜。通过在4℃下与蛋白质G琼脂糖凝胶(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)培育整夜耗尽IgG。假设在洗脱部分中平均蛋白质质量为50kDa，在4℃下用15摩尔过量的
Figure A20058003601800441
NHS-生物素(Pierce Biotechnology)标记所述蛋白质1.5小时。用过量的甘氨酸中止反应，并对PBS透析整夜(10,0000MWCO，Pierce)。
鉴别与表皮葡萄球菌表面结合的血清蛋白
通过SDS-PAGE将在这些条件下从细菌洗脱的血清蛋白与正常的兔血清和从在TSB中生长的表皮葡萄球菌表面洗脱的细菌蛋白相比较。参看图3。用含有0.5NaCl、1M NaCl和4M尿素的缓冲液各自从细菌细胞中洗脱已结合的血清蛋白。这些经洗脱的血清蛋白表示从富集血清蛋白的细菌表面洗脱的蛋白质池。某些细菌蛋白质很可能存在于这一池中，然而，并未从生长于TSB中的细菌洗脱出可通过蛋白质检定检测的细菌蛋白质。尽管通过银染色检测出从生长于TSB中的细菌洗脱出的某些模糊的蛋白质带，但其与从生长于血清中的细菌表面洗脱的经更强烈染色的蛋白质并不对应。用1M NaCl洗脱是洗脱大部分蛋白质的最低变性条件，且用于洗脱以下实例中的蛋白质。
为鉴别结合血清组份中所涉及的细胞壁相关蛋白，使用生物素化血清蛋白通过培育经标记蛋白与从2D凝胶转移的与硝酸纤维素结合的细胞壁蛋白的溶液探测2D转移。为分离与表皮葡萄球菌结合的血清蛋白，用1M NaCl洗涤在70％兔血清中生长的细菌。收集经洗脱的血清蛋白并将其透析到PBS中。然后，通过与蛋白质G琼脂糖凝胶一起培育来耗尽可能存在于经洗脱血清蛋白中的天然存在的免疫IgG。除去IgG会减少鉴别出与宿主抗体具反应性的蛋白质的可能性。随后，如上文所述，以生物素标记已洗脱的血清蛋白，并将其用于探测表皮葡萄球菌细胞表面蛋白的2D印迹。参看图4A和4B。通过这一方法显现三十四个斑点和区域，且可能涉及表皮葡萄球菌与宿主血清蛋白相互作用。始终发现34个斑点都与血清组份相互作用，但发现其中有4个斑点与来自受感染兔的免疫血清反应。参看图2和表3。
生长于血清中的表皮葡萄球菌具有以0.5M和1M NaCl洗脱的与细菌表面蛋白结合的血清蛋白。在相同条件下，从生长于TSB中的细菌中洗脱出极少葡萄球菌蛋白，然而，通过高盐处理洗脱出仅在血清中表达的葡萄球菌蛋白是可能的。
实例5
血清上调蛋白质的质谱鉴别
在随后的蛋白质组学实验和分析中使用在70％血清中生长的细菌，假定改变是在血清中生长期间检测的情况下进行的操作可更为准确地反映因细菌对宿主内所见的环境线索起反应而产生的基因表达的变化。在随后的质谱研究中，首先使从2D凝胶电泳分离上的斑点分离的蛋白质经历飞行时间质谱分析(time-of-flight mass spectroscopy)。如果呈正数，那么获得明确的鉴别，无需进行进一步质谱分析。参看表4。在进行飞行时间质谱分析后仍保留一些不明确部分的情况下，诸如当多种蛋白质在2D凝胶上解析成相同斑点时，则进行电喷雾质谱分析以解析所述不明确部分。参看表4。
表4
通过质谱法鉴别的蛋白质
  蛋白质   DNA   2-D凝胶
  Orf  SEQ ID NO：  SEQ ID NO：   斑点编号
  121  1  33   38
  305  2  34   27，30-32
  321  3  35   11
  373  4  36   18
  554  5  37   29
  639  6  38   42
  608  7  39   26，
  702  8  40   26
  793  9  41   39
  847  10  42   12，13，15，16
  854  11  43   4，5-7，9，10
  1015  12  44   1，2，3
  1069  13  45   34
  1238  14  46   40，41
  1382  15  47   44
  1405  16  48   43
  1450  17  49   19，20-23，25
  1522  18  50   4，10
  1545  19  51   3
  1653  20  52   40，
  1690  21  53   8
  1703  22  54   28，33
  2006  23  55   19
  2180  24  56   43
  2214  25  57   17
  2482  26  58   13
  2580  27  59   40
  2649  28  60   10
  2653  29  61   38
  2736  30  62   24，26
  2907  31  63
  2975  32  64   39，43
样本制备
在进行质谱分析之前，使目标蛋白质斑点经历胶内胰蛋白酶消化(in-gel trypticdigestion)。将蛋白质斑点从凝胶除去，并切成约1mm的小片。在偶尔涡旋下，用10mM碳酸氢铵(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)中的0.2ml 50％(v/v)乙腈(Burdick&Jackson，Muskegon，Ml)洗涤凝胶片三次历时15分钟。用乙腈使凝胶片脱水5分钟，冻干，且在-20℃下冷冻储存。随后，在37℃下，用50μl 12ng/ml测序级经修饰胰蛋白酶(PromegaCorporation，Madison，WI)消化凝胶中的蛋白质整夜。接着，除去胰蛋白酶溶液，且于50μl乙腈中使凝胶再次脱水。接着，在室温下，于超声波仪水浴(Branson CleaningEquipment Co.，Shelton，CT)中，除去含肽乙腈，且在50μl 5％甲酸(Riedel-de 
Figure A20058003601800471
，Seelze，Germany)中洗涤凝胶片15分钟。除去含肽上清液并使其与最初的乙腈洗涤液合并。在乙腈中再次洗涤凝胶，并使上清液与两个先前提取步骤合并，且在SpeedVac(ThermoSavant)中干燥到约10μl，随后用0.1％(v/v)甲酸水溶液稀释到100μl。接着，将样本装载于Zip-TipC18P10柱(Waters Corporation，Milford，MA)上，并于50μl 50％乙腈/0.1％甲酸中洗脱。将样本转移到96×2孔涂覆有特氟隆(Teflon)的不锈钢板(PerSeptiveBiosystems，Framingham，MA)上以用于在将喷雾于离子阱质谱仪(ion trap massspectrometer)的孔中的MALDI-ToF仪器(PerSeptive Biosystems)玻璃制纳米喷雾喷嘴(glass nanospray tip)(New Objective Inc.，Woburn，MA)上进行的质量指纹分析。
使用ToF质谱法进行的肽质量指纹分析
将各样本施加到经特氟隆涂覆的涂敷有α-氰基-4-羟基肉桂酸薄层的不锈钢96×2孔板上。使样本在室温下干燥。于装备有延迟提取技术(delayed extraction technology)和反射器的Voyager DE-STR MALDI-ToF质谱仪(PerSeptive Biosystems)上获取质谱数据。质谱仪上装备有337nm和具有3Hz激光速率(laser rate)的氮分子激光器。加速电压设置为20kV，操作模式(反射器)，提取模式(延迟)，极性(正)，栅极电压(65％)，反射电压比率(mirror voltage ratio)(1.12)，提取延迟时间(200nsec)，质量范围(800-3500Da)和每频谱激光发射数(laser shots per spectrum)(200)。
静态纳米喷雾离子阱质谱法(Static Nanospray Ion Trap-Mass Spectrometry)
在装备有纳米-电喷雾界面的ThermoFinnigan LCQ DECA四级离子阱质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，CA)上获取质谱数据。纳米-电喷雾界面是由二氧化硅喷雾针(New Objective Inc.)组成，所述喷雾针为约27mm长、约120/69μm OD/ID、2μm孔径。将玻璃喷嘴安装于固定在定位于质谱仪检测器前面的基座上的x、y、z轴固定器(ThermoFinnigan)中。将电流施加到玻璃喷嘴的标准涂层上以通过静态电喷雾探针(ThermoFinnigan)上的金属接面给电喷雾界面提供电连接。电喷雾传递20-80nl/min的流量。
使用直接喷雾于质谱仪孔中的电喷雾玻璃喷嘴分析2到5微升胰蛋白酶消化液。在约1kV的易变喷雾电压下操作的LCQ-DECA离子阱质谱仪(Thermofinnigan)上且使用200℃热毛细管温度进行肽分析。使用随所述仪器提供的数据获取软件获取自动化MS/MS模式中的数据组。获取方法包括1MS扫描(400-1800m/z)，随后是对所述MS扫描中前三个最富有离子的部分进行MS/MS扫描。使用动态排除功能增加经分析的肽离子的数量(设置：3amu＝排除宽度，0.5分钟＝排除持续时间)。在样本组中且以手工方式对当前实验进行分析。
使用MSFIT(Protein Prospector)和MASCOT(Matrix Science)软件数据库搜索引擎(其使用Incyte的PathoSeq(c)表皮葡萄球菌0-47数据库)进行质量指纹数据的自动化分析。在利用所述搜索引擎之前，用基线校正、噪声除去和峰去同位素(peak de-isotoping)来处理所得频谱。将数据库搜索参数设置为如下水平：MW(1000-150kDa)、pI(3-10)、消化液(胰蛋白酶)、最大错误分裂数量(2)、错误分裂pfactor(0.4)、静态修饰(经丙烯酰胺修饰的半胱氨酸)、N末端(氢)、C末端(游离酸)、易变模数(甲硫氨酸氧化、N末端乙酰化、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化)、质量(单一同位素)、以300ppm的质量公差进行匹配所需的最小的肽数量(4)，和以15ppm质量公差的反复校准(Intelcast)的应用。通过MOWSE得分和分别通过MS-FIT与MASCOT的95％置信得分确定蛋白质的鉴别。
使用已并入Finnigan Bioworks数据分析包(ThermoFinnigan)的SEQUEST进行MS/MS的自动化分析。参看Eng，J.K.等人，J AmerSoc Mass Spec，5(11)：第976-89页(1994)。软件中允许进行以下可变修饰：半胱氨酸丙烯酰胺修饰和甲硫氨酸氧化。将搜索参数设置在以下规定：质量范围(400-3500Da)、较低强度MS信号(1e+5)、肽公差(2.0Da)、最小片段离子数量(15)、群组中最小扫描数量(1)和错误分裂的最大数量(2)。手工检验所有蛋白质鉴别的准确性。
通过质谱法鉴别蛋白质
定位在生长于70％血清中的表皮葡萄球菌的荧光与免疫染色转移上都检测到的斑点，并对其进行标记以供质谱法鉴别。参看图2A和2B。切下总计40个免疫反应性斑点，并使其经历质谱分析以供鉴别。参看表4。将完整蛋白质序列展示于序列表(SEQ ID NO：1-32)中。将含有蛋白质的凝胶斑点从凝胶上切下，并使用MALDI-TOF进行质量指纹分析，随后搜索Incyte的PathSeq(c)表皮葡萄球菌0-47数据库中对应的编码区来加以鉴别。参看表4。使用静态纳米喷雾进一步分析具有多种蛋白质采样数或可疑信号的斑点。鉴别出总计32种蛋白质，其中某些斑点含有一种以上蛋白质。参看表3和4。24种经鉴别的蛋白质具免疫反应性，26种与血清组份结合，且20种蛋白质具免疫反应性与血清结合性。当结合血清因子所涉及的表皮葡萄球菌表面上大部分蛋白质将可能引发免疫反应时，可预期这一极大重叠。
六种蛋白质始终存在于经免疫染色的印迹中，但荧光染色的转移上并不存在对应的斑点。参看图2B中白色圆形和箭状物。尽管这些蛋白质可能在感染期间表达并引发免疫反应，但在这些实验中所使用的条件下，其不以允许其通过荧光蛋白质染色的水平表达。
实例6
预测蛋白质功能
通过与ATCC12228的完整基因组同源物比较确定预测的蛋白质功能。参看Zhang，Y.Q.等人，Mol Microbiol，49(6)，第1577-93页(2003)。表5所示的预测功能是归因于涉及特定蛋白质的先前公开案或与其它生物体中存在的先前经表征的蛋白质同源的个别ORF。
表5
表皮葡萄球菌蛋白的预测功能
  斑点#   a预测功能  蛋白质SEQID NO：  b检测方法
  1，2   二氢硫辛酰胺脱氢酶   12   I，S
  3   ″   12   I，S
  谷氨酸-1-半醛2，1-氨基变位酶   19   I，S
  4   烯醇酶   11   I，S
  延伸因子TU(EF-TU)   18   I，S
  5-7，9   烯醇酶   11   I，S
  8   磷酸葡萄糖酸脱氢酶   21   I
  10   烯醇酶   11   I，S
  延伸因子TU(EF-TU)   18   I，S
  Na+/H+逆向转运蛋白   28   I，S
  11   丙氨酸脱氢酶   3   I，S
  12   甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)   10   I，S
  13   ″   ″   I，S
  延伸因子TU(EF-TS)   26   I，S
  14   不匹配   I，S
  15-16   甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)   10   I，S
  17   乙酰辅酶A C-乙酰转移酶   25   I
  18   胱硫醚γ-合酶   4   I
 19  铁色素结合脂蛋白   17   I，S
 寡肽通透酶   23   I，S
 20-23，25  铁色素结合脂蛋白   17   I，S
 24  果糖二磷酸醛缩酶   30   I，S
 26  ″  ″   I，S
  假设性蛋白   8   I，S
 假设性蛋白   7   I，S
 27，30-32  脂蛋白(SitC)   2   I，S
 28，33  氨基酸结合脂蛋白   22   I，S
 29  推定的己酮糖-6-磷酸合酶   5   I，S
 34  硫辛酸连接酶   13   I，S
 35  不匹配   I
 36  不匹配   I
 37  不匹配   I，S
 38  免疫优势抗原A   29   I，S
 推定的蛋白   1   I，S
 39  胞外基质结合蛋白(Embp)   32   I，S
 40  半胱氨酸合酶   14   S
 果糖二磷酸醛缩酶同源物   20   S
 硫氧还蛋白还原酶   27   S
 41  半胱氨酸合酶   14   S
 42  推定的转醛醇酶   6   I
 43  胞外基质结合蛋白(Embp)   32   S
 转酮醇酶   16   S
 假设性蛋白   24   S
 44  谷氨酰-tRNA Gln酰胺转移酶亚单元   15   S
a蛋白质的预测功能是通过与ATCC12228的完整基因组同源物比较确定。
b检测斑点的方法接着转移到硝酸纤维，来自受感染兔的反应性免疫血清I或结合血清组份S。
如上文所讨论，通过2D凝胶电泳分析在70％兔血清中生长的表皮葡萄球菌0-47的细胞壁相关蛋白的表达概况。确定血清中的总体表达概况显著不同于随后在TSB中发生的生长的概况。通过质谱法鉴别在血清中生长期间上调的多种蛋白质，并通过序列比较预测其功能。参看表5。预测养分获取所涉及的三种蛋白质305、1450和1703都显著增加。参看表4和5。所有三种蛋白质都形成横过凝胶的条纹。参看图4。在不受理论束缚的情况下，这可能是多种电荷异构体的结果或可能与其预测的脂蛋白组成有关。此外，所有三种蛋白质都与经表皮葡萄球菌0-47感染的兔的免疫血清具有高度反应性，表明感染期间宿主中也表达这些蛋白质。参看图2和表5。总起来说，这些蛋白质中有24种鉴别为与来自受感染兔的免疫血清具有反应性。这些蛋白质不仅在血清中生长期间表达，而且其还引起受感染动物的免疫反应。参看实例8。总的说来，这些数据表明在感染期间所有这些抗原都表达。受感染小鼠血流内这些ORF的转录本的表达是通过所有经鉴别蛋白质的RT-PCR确认(数据未图示)。
实例7
重组蛋白的克隆和表达
使用基于已表达的蛋白质的质谱所鉴别的蛋白质和表皮葡萄球菌0-47数据库设计的引物克隆基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增个别基因，并且用Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics)添加腺嘌呤悬突。遵循制造商的说明书，将反应产物克隆到pCRT7/NT-TOPO或pBAD/TOPOThio(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并将其转化到大肠杆菌Top10(Invitrogen)中。使用ReddyMix PCR mastermix(ABgene，Rochester，NY)通过集落PCR检测阳性克隆，并且进行测序以确保无假突变出现。纯化来自pCRT7克隆的质粒，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中以供使用T7聚合酶进行表达。37℃下，通过在振荡下(200rpm)使阳性克隆在补充有100μg/ml氨比西林的HySoy肉汤(1％HySoy(Quest Intl，Stockbridge，GA)、0.5％酵母提取物、100mM NaCl、50mM Na2HPO4-7H2O、40mMNaH2PO4-H2O)中生长直到OD600约为1.0来表达蛋白质。用1mM IPTG(pCRT7)或0.2％阿拉伯糖(pBAD)诱导蛋白质表达，并使培养物再生长3小时。接着，通过离心采集细胞，并通过全细胞溶解物的SDS-PAGE评定表达。
纯化重组蛋白质
使细胞小球再悬浮于100ml TBS(20mM Tris(pH 8.0)、150mM NaCl)中，并通过使其通过法氏压力室(French pressure cell)(SLM-Aminco，Rochester，NY)一次将其溶解。随后，通过在10,000×g下离心10分钟将样本分成可溶部分或不可溶小球。通过SDS-PAGE评定重组蛋白的位置。如果重组蛋白在可溶部分中，那么将蛋白质装载于负载有Ni2+的亚氨基二乙酸琼脂糖树脂上。参看表6。接着，用TBS中的30mM咪唑洗涤柱。用TBS中的300mM咪唑洗脱已结合的蛋白质。如果需要额外的纯化步骤，那么将蛋白质透析到含有50mM NaCl的20mM Tris(pH 8.0)和1mM EDTA中，并将其装载于填充有POROS-Q树脂(Applied Biosystems，Foster City，CA)的柱上。用20mM Tris(pH 8.0)中的50mM到500mM梯度NaCl和0.1mM EDTA洗脱已结合的蛋白质。通过SDS-PAGE测定含有所关注的蛋白质的部分，并在-20℃下冷冻。
如果发现重组蛋白在不可溶部分中，那么在4℃下用TBS中的100ml1％Triton X-100将不可溶部分处理4小时。参看表6。通过离心使不可溶蛋白质粒化并丢弃上清液。随后，在室温下，用100ml TBS中的8M尿素提取不可溶小球历时至少8小时。使不可溶碎片粒化，并如上所述纯化蛋白质，但所有缓冲液中都含有2M尿素。纯化后，加入TritonX-100直到0.1％的最终浓度。随后，将蛋白质透析到含有0.1％Triton的TBS中，并且在-20℃下储存。
所有的液相色谱都是使用AKTA探察器(Amersham-Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)进行。所有的SDS-PAGE都是使用4-20％梯度Tris-甘氨酸凝胶(Cambrex)进行。
表6
重组蛋白的溶解性
Figure A20058003601800521
Figure A20058003601800531
X表示蛋白质是在所述部分中发现。NT表示未测试。
实例8
使用重组表皮葡萄球菌蛋白的免疫原性组合物
在第0、3和6周时，通过皮下注射用与20μgSTIMULONTM QS-21一起调配的10μg重组蛋白使四周龄的雌性Balb/C小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)免疫。在第一次免疫前0周时和第8周时对所述小鼠抽血。最后一次抽血两天后，通过腹膜内注射在哥伦比亚盐琼脂(Columbia salt agar)(1×哥伦比亚琼脂、0.1％葡萄糖、1％酵母提取物、0.5％NaCl)上生长整夜的5×108cfu表皮葡萄球菌0-47激发小鼠。激发24小时后，处死小鼠并对脾和血液中的细菌计数。
用重组蛋白使小鼠主动免疫
从表皮葡萄球菌0-47克隆27个编码血清结合或免疫反应性蛋白的开放阅读框，并在具有六聚组氨酸标签的大肠杆菌中表达重组蛋白(His标签是为方便起见而使用；本发明的免疫原性组合物将含有在无His标签情况下表达的蛋白质)。参看表7。使用Ni2+螯合柱随后使用离子交换色谱纯化这些蛋白。克隆三个剩余的经克隆的开放阅读框(2006、2975和2907)，但不以足以纯化的水平表达。在第0、3和6周时，用个别重组蛋白使Balb/C小鼠免疫。在第0周和第8周对动物抽血，并在第8周用表皮葡萄球菌0-47激发(腹膜内)。激发24小时后，对动物施以安乐死，并计数血液和脾中存在的细菌数量。对5个动物的群组进行这一免疫原性组合物候选物的初始筛选以能够筛选多种蛋白质。所得数据在统计学上不显著，但其仍提供关于大量候选物的免疫原性组合物可能性的有价值信息。27种重组蛋白中有8种使从脾和/或血液回收的细菌数量降低1个对数或更多。参看表7(NT＝未测试)。
表7
免疫后细菌总数降低
NT表示未测试。
评估从经免疫小鼠获得的血清对细菌蛋白的抗体反应性。参看表8。如通过在兔血清中生长到对数生长中期的表皮葡萄球菌的全细胞溶解物的Western印迹法所测定，所测试的24份免疫血清中有23份与天然蛋白质反应。参看表8(NT＝未测试)。
表8
与葡萄球菌蛋白的抗体反应性
NT表示未测试。
如表8所示，许多经表皮葡萄球菌抗原免疫的动物也对金黄葡萄球菌显现出抗体反应。
因此，对抗表皮葡萄球菌抗原的免疫原性组合物可有效治疗或预防金黄葡萄球菌和表皮葡萄球菌。参看表8。
将用于上述免疫原性组合物中的一分组重组蛋白用于使较大的小鼠群组免疫。通过皮下注射生理盐水或10μg抗原和作为佐剂的20μgSTIMULONTM QS-21使10只雌性(4周龄)Balb/C小鼠的群组免疫。最后一次免疫2周后，通过腹膜内注射用约5×108cfu表皮葡萄球菌0-47激发小鼠。激发后24小时，对血液和脾中的细菌计数。参看表9。与生理盐水中的STIMULONTM QS-21对照相比较，测定log CFU的降低。通过Student′s-T检验分析数据，且得到*0.05或**0.01的p值。
表9
免疫原性组合物中所使用的蛋白质
Figure A20058003601800561
*p值＜0.05
**p值＜0.01
表9中所示的表皮葡萄球菌蛋白展示出当用于免疫原性组合物中时降低随后激发后细菌感染的严重程度的极高效用。
实例9
经表皮葡萄球菌蛋白免疫后防止金黄葡萄球菌激发
如实例8(表8)中的抗体结合数据所表明，对抗表皮葡萄球菌抗原的免疫原性组合物可对治疗或预防金黄葡萄球菌有效。因此，使用经表皮葡萄球菌抗原的免疫原性组合物免疫后的金黄葡萄球菌进行激发。
在第0、3和6周时，通过皮下注射以20μg STIMULONTM QS-21中的10μg重组蛋白使四周龄的雌性CD-1小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)免疫。在第一次免疫前0周时和第8周时对所述小鼠抽血。最后一次抽血两天后，通过腹膜内注射在哥伦比亚盐琼脂(1×哥伦比亚琼脂、0.1％葡萄糖、1％酵母提取物、0.5％NaCl)上生长整夜的3×108cfu金黄葡萄球菌Reynolds激发小鼠。激发24小时后，处死小鼠并对肾中的细菌计数。
表10
以金黄葡萄球菌激发
  蛋白   预期   CFU
  ORF  SEQ ID NO：   功能   降低
  2653  29   免疫优势Ag A   0.9log
  321  3   丙氨酸脱氢酶   0.7log
  1015  12   二氢硫辛酰胺脱氢酶   无
  608  7   未知   0.6log
  1069  13   硫辛酸连接酶   1.7log
  639  6   假设   无
如表10所示，某些表皮葡萄球菌抗原能够有效诱导识别金黄葡萄球菌并与其结合的抗体。此外，所诱导的抗体对于降低金黄葡萄球菌激发后所计数的细菌含量具有有益作用。
将SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32的表皮葡萄球菌多肽抗原的氨基酸序列的同一性百分数与其来自金黄葡萄球菌的同源物的氨基酸序列相比较。结果展示于表11中。
表11
表皮葡萄球菌与金黄葡萄球菌之间的同一性
  多肽   a与金黄葡萄球菌同源物的
  Orf  SEQ ID NO：   同一性％
  121  1   33％
  305  2   76％
  321  3   85％
  373  4   81％
  554  5   87％
  639  6   62％
  608  7   89％
  702  8   97％
  793  9   23％
  847  10   95％
  854  11   94％
  1015  12   96％
  1069  13   82％
  1238  14   94％
  1382  15   93％
  1405  16   82％
  1450  17   71％
  1522  18   96％
  1545  19   91％
  1653   20   95％
  1690   21   89％
  1703   22   82％
  2006   23   90％
  2180   24   87％
  2214   25   73％
  2482   26   91％
  2580   27   91％
  2649   28   78％
  2653   29   62％
  2736   30   92％
  2907   31
  2975   32   32％
测定多肽序列之间的同源性。
序列表
<110>惠氏公司
<120>表皮葡萄球菌多肽抗原的免疫原性组合物
<130>AM101548
<160>64
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>338
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>1
Leu Arg Lys Asp Val Ile Glu Val Val Asn Lys Val Glu Asp Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Phe Lys Ser Tyr Pro Ile Gln Tyr Asn Pro Ile Ile Glu Tyr Phe Asn
            20                  25                  30
Gln Ile Lys Asn Lys Lys Val Ile Val Ser Leu Lys Ile Tyr Lys Val
        35                  40                  45
Tyr Lys Lys Ile Val Glu Asn Ile His Asp Thr Glu Ser Gln Trp Ile
    50                  55                  60
Tyr Ser Pro Glu His Ala Leu His Pro Ile Glu Phe Ile Glu Ser Phe
65                  70                  75                  80
Cys Lys His Ile Lys Gly Lys Tyr Ala Gly Thr Pro Ile Glu Leu Glu
                85                  90                  95
Leu Trp Gln Lys Ala Gly Ile Ala Thr Ile Phe Gly Phe Ile Asn Lys
            100                 105                 110
Lys Thr Lys Glu Arg Lys Tyr Gln Glu Ile Phe Trp Val Val Ala Arg
        115                 120                 125
Lys Asn Gly Lys Ser Thr Ile Ser Ser Gly Ile Ala Leu Tyr Leu Leu
    130                 135                 140
Gly Ala Asp Gly Glu Gly Gly Pro Glu Val Tyr Thr Val Ala Thr Lys
145                 150                 155                 160
Lys Asp Gln Al a Lys Ile Val Trp Asn Asp Ala Lys Lys Met Val Asn
                 165                 170                 175
Lys Ser Pro Leu Leu Lys Leu Asp Phe Val Thr Lys Val Ala Glu Ile
            180                 185                 190
Leu Thr Pro Phe Asn Asp Gly Gln Leu Ile Pro Leu Gly Arg Asp Ser
        195                 200                 205
Asp Thr Thr Asp Gly Leu Asn Val His Gly Ala Ile Met Asp Glu Val
    210                 215                 220
His Ala Trp Lys Thr Met Gln Met Tyr Asp Val Val Phe Asp Gly Ile
225                 230                 235                 240
Ser Ala Arg Asp Asn Pro Leu Ile Leu Ala Ile Thr Thr Ala Gly Thr
                245                 250                 255
Ile Arg Asn Ser Val Tyr Asp Ile Lys Tyr Glu Glu Ser Glu Asn Ile
            260                 265                 270
Ile Asn Gly Leu Trp Glu Asp Glu Gly Tyr Lys Asn Glu Arg Phe Leu
        275                 280                 285
Pro Leu Ile Tyr Glu Leu Asp Ser Arg Glu Glu Trp Ile Asp Glu Ser
    290                 295                 300
Cys Trp Leu Lys Ala Asn Pro Gly Leu Gly Ser Ile Lys Lys Ile Asp
305                 310                 315                 320
Ala Ile Lys Thr Lys Val Asn Arg Ala Lys Lys Asn Ala Leu Phe Arg
                325                 330                 335
Ala Thr
<210>2
<211>309
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>2
Val Lys Lys Ile Leu Ala Leu Ala Ile Ala Phe Leu Ile Ile Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Cys Gly Asn His Ser Asn His Glu His His Ser His Glu Gly Lys
            20                  25                  30
Leu Lys Val Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Val Lys Arg
        35                  40                  45
Val Gly Gly Asn Lys Val Asp Val His Ser Ile Val Pro Val Gly Gln
    50                  55                  60
Asp Pro His Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Ala Leu Thr
65                  70                  75                  80
Asp Ala Asp Val Val Phe Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn
                85                  90                  95
Gly Trp Phe Glu Lys Ala Leu Asp Gln Ala Gly Lys Ser Thr Lys Asp
            100                 105                 110
Lys Asn Val Ile Ala Ala Ser Asn Asn Val Lys Pro Ile Tyr Leu Asn
        115                 120                 125
Gly Glu Glu Gly Asn Lys Asn Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu Ser
    130                 135                 140
Leu Glu Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Lys Ser Leu Glu
145                 150                 155                 160
His His Asp Lys Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Ala
                165                 170                 175
Tyr Ile Ser Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Asp Ser Lys Asn Lys Phe
            180                 185                 190
Asp Asp Ile Pro Lys Asn Gln Arg Ala Met Met Thr Ser Glu Gly Ala
        195                 200                 205
Phe Lys Tyr Phe Ala Gln Gln Phe Asp Val Lys Pro Gly Tyr Ile Trp
    210                 215                 220
Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Gly Gln Met Lys Gln Ala
225                 230                 235                 240
Ile Lys Phe Val Lys Asp Asn His Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr
                245                 250                 255
Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Gln Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys
            260                 265                 270
Asp Ile Tyr Gly Glu Val Phe Thr Asp Ser Ile Gly Lys Ala Gly Thr
        275                 280                 285
Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Asp Thr Ile
    290                 295                 300
His Gly Ser Met Lys
305
<210>3
<211>376
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>3
Leu Glu Val Asp Asn Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn
1               5                   10                  15
Asn Glu Asn Arg Val Gly Leu Ser Pro Ser Gly Val His Ala Leu Val
            20                  25                  30
Asp Gln Gly His Glu Val Leu Val Glu Thr Asn Ala Gly Leu Gly Ser
        35                  40                  45
Tyr Phe Glu Asp Gly Asp Tyr Gln Glu Ala Gly Ala Lys Ile Val Asp
    50                  55                  60
Glu Gln Ser Lys Ala Trp Asp Val Asp Met Val Ile Lys Val Lys Glu
65                  70                  75                  80
Pro Leu Glu Ser Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Glu Glu Leu Ile Leu Phe
                85                  90                  95
Thr Tyr Leu His Leu Ala Asn Glu Gln Lys Leu Thr Gln Ala Leu Val
            100                 105                 110
Asp Asn Lys Val Ile Ser Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Pro Asp
        115                 120                 125
Gly Ser Leu Pro Leu Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met
    130                 135                 140
Ser Thr Gln Val Gly Ala Glu Phe Leu Gln Arg Phe Asn Gly Gly Met
145                 150                 155                 160
Gly Ile Leu Leu Gly Gly Ile Pro Gly Val Pro Lys Gly Lys Val Thr
                165                 170                 175
Ile Ile Gly Gly Gly Gln Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Leu
            180                 185                 190
Gly Leu Gly Ala Glu Val Thr Ile Leu Asp Val Asn Pro Lys Arg Leu
        195                 200                 205
Glu Glu Leu Glu Asp Leu Phe Asp Gly Arg Val Arg Thr Ile Met Ser
    210                 215                 220
Asn Pro Leu Asn Ile Glu Met Tyr Val Lys Glu Ser Asp Leu Val Ile
225                 230                 235                 240
Gly Ala Val Leu Ile Pro Gly Ala Lys Ala Pro Asn Leu Val Thr Glu
                245                 250                 255
Asp Met Ile Lys Glu Met Lys Asp Gly Ser Val Ile Val Asp Ile Ala
            260                 265                 270
Ile Asp Gln Gly Gly Ile Phe Glu Thr Thr Asp Lys Ile Thr Thr His
        275                 280                 285
Asp Asn Pro Thr Tyr Thr Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala
    290                 295                 300
Asn Met Pro Gly Ala Val Pro Arg Thr Ser Thr Ile Gly Leu Asn Asn
305                 310                 315                 320
Ala Thr Leu Pro Tyr Ala Gln Leu Leu Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Glu
                325                 330                 335
Ala Phe Lys Val Asn His Pro Leu Ser Leu Gly Leu Asn Thr Phe Asn
            340                 345                 350
Gly His Val Thr Asn Lys Asn Val Ala Asp Thr Phe Asn Phe Glu Tyr
        355                 360                 365
Thr Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys
    370                 375
<210>4
<211>400
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>4
Met Glu Ala Ile Asp Thr Cys Pro Asn Lys Tyr Ser Thr Ile Arg Arg
1               5                   10                  15
Val Leu Ile Met Asn Lys Lys Thr Gln Met Ile His Gly Gly His Thr
            20                  25                  30
Thr Asp Asn Tyr Thr Gly Ala Val Thr Thr Pro Ile Tyr Gln Thr Ser
        35                  40                  45
Thr Tyr Leu Gln Asp Asp Ile Gly Asp Leu Arg Gln Gly Tyr Glu Tyr
    50                  55                  60
Ser Arg Thr Ala Asn Pro Thr Arg Ala Ser Leu Glu Ser Val Ile Ala
65                  70                  75                  80
Asn Leu Glu His Gly Lys His Gly Phe Ala Phe Gly Ser Gly Met Ala
                85                  90                  95
Ala Ile Ser Ala Val Ile Met Leu Leu Asp Lys Gly Asp His Leu Val
            100                 105                 110
Leu Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Ala Leu Thr Lys Val
        115                 120                 125
Phe Thr Arg Phe Gly Ile Asp Val Asp Phe Val Asp Thr Thr Lys Ile
    130                 135                 140
Glu Asn Ile Glu Gln Tyr Ile Lys Pro Glu Thr Lys Met Leu Tyr Val
145                 150                 155                 160
Glu Thr Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Thr Asp Ile Lys Ala Ser
                165                 170                 175
Ala Lys Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Leu Ile Ser Val Val Asp Asn Thr
            180                 185                 190
Phe Met Thr Pro Tyr Tyr Gln Asn Pro Leu Asp Phe Gly Ile Asp Ile
        195                 200                 205
Val Leu His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Gly Gly His Ser Asp Val Val
    210                 215                 220
Ala Gly Leu Val Ala Thr Ala Asp Asp Asp Leu Ala Glu Arg Leu Gly
225                 230                 235                 240
Phe Ile Ser Asn Ser Thr Gly Gly Val Leu Gly Pro Gln Asp Ser Tyr
                245                 250                 255
Leu Leu Ile Arg Gly Ile Lys Thr Leu Gly Leu Arg Met Glu Gln Ile
            260                 265                 270
Asn Arg Asn Val Glu Gly Ile Val Gln Met Leu Gln Lys His Pro Lys
        275                 280                 285
Val Gln Gln Val Phe His Pro Ser Ile Lys Glu His Met Asn Tyr Thr
    290                 295                 300
Ile His Gln Asn Gln Ala Thr Gly His Thr Gly Val Val Ser Phe Glu
305                 310                 315                 320
Val Lys Asp Thr Glu Ala Ala Lys Gln Val Ile His Ala Thr Asn Tyr
                325                 330                 335
Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Ala Val Glu Ser Leu Ile Ser Val
            340                 345                 350
Pro Ala Leu Met Thr His Ala Ser Ile Pro Ser Asp Val Arg Ala Lys
        355                 360                 365
Glu Gly Ile Thr Asp Gly Leu Ile Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Asp
    370                 375                 380
Thr Glu Asp Leu Val Asn Asp Leu Glu Gln Ala Leu Asn Thr Leu Arg
385                 390                 395                 400
<210>5
<211>210
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>5
Leu Glu Leu Gln Leu Ala Ile Asp Leu Leu Asn Lys Glu Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
Lys Leu Ala Gln Lys Val Glu Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu Ile Gly
            20                  25                  30
Thr Pro Ile Val Ile Asn Glu Gly Leu Pro Ala Val Gln His Leu Asn
        35                  40                  45
Glu Asn Ile Asn Asn Ala Lys Val Leu Ala Asp Leu Lys Ile Met Asp
    50                  55                  60
Ala Ala Asp Tyr Glu Val Ser Gln Ala Val Lys Tyr Gly Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Val Thr Ile Leu Gly Val Ala Glu Asp Ala Ser Ile Lys Ala Ala Val
                85                  90                  95
Glu Glu Ala His Lys His Gly Lys Ala Leu Leu Val Asp Met Ile Ala
            100                 105                 110
Val Gln Asn Leu Glu Gln Arg Ala Lys Glu Leu Asp Glu Met Gly Ala
        115                 120                 125
Asp Tyr Ile Ala Val His Thr Gly Tyr Asp Leu Gln Ala Glu Gly Lys
    130                 135                 140
Ser Pro Leu Asp Ser Leu Arg Thr Val Lys Ser Val Ile Lys Asn Ser
145                 150                 155                 160
Lys Val Ala Val Ala Gly Gly Ile Lys Pro Asp Thr Ile Lys Asp Ile
                165                 170                 175
Val Ala Glu Asp Pro Asp Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ala Asn
            180                 185                 190
Ala Asp Asp Pro Val Glu Ala Ala Lys Gln Cys Arg Ala Ala Ile Glu
        195                 200                 205
Gly Lys
    210
<210>6
<211>237
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>6
Met Thr Lys Leu Asn Val Lys Val Phe Ala Asp Gly Ala Asp Ile Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Lys Ser Ala Tyr Lys Asn Gln Leu Val Asp Gly Phe Thr Thr
            20                  25                  30
Asn Pro Ser Leu Met Ala Lys Ala Gly Val Thr Asp Tyr Lys Ala Phe
        35                  40                  45
Ala Glu Glu Val Val Ser Glu Ile Pro Asp Ala Ser Ile Ser Phe Glu
    50                  55                  60
Val Phe Ala Asp Asp Leu Pro Thr Met Glu Lys Glu Ala Glu Ile Leu
65                  70                  75                  80
Lys Gln Tyr Gly Asp Asn Val Phe Val Lys Ile Pro Ile Val Thr Thr
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ser Thr Leu Pro Leu Ile Lys Arg Leu Ser Ser Lys Gln
            100                 105                 110
Val Arg Leu Asn Val Thr Ala Val Tyr Thr Ile Glu Gln Val Lys Ala
        115                 120                 125
Ile Thr Asp Ala Val Thr Glu Gly Val Pro Thr Tyr Val Ser Val Phe
    130                 135                 140
Ala Gly Arg Ile Ala Asp Thr Gly Val Asp Pro Leu Pro Leu Met Lys
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Lys Val Thr His Ser Lys Glu Gly Val Gln Leu Leu Trp
                165                 170                 175
Ala Ser Cys Arg Glu Val Tyr Asn Val Ile Gln Ala Asp Glu Ile Gly
            180                 185                 190
Ala Asp Ile Ile Thr Cys Pro Ala Asp Val Val Lys Lys Val Asn Asn
        195                 200                 205
Asn Leu Gly Arg Asp Ile Gly Glu Leu Ser Val Asp Thr Val Lys Gly
    210                 215                 220
Phe Ala Lys Asp Ile Gln Ser Ser Gly Leu Ser Ile Leu
225                 230                 235
<210>7
<211>264
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>7
Val Asn Ile Leu Lys Ile Gln Ile Leu Gln Phe Asn Val Glu Arg Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Asp Lys Asn Met Gln Asn Ile Lys Thr Lys Phe Asn Gln Tyr
            20                  25                  30
Leu Asp Lys Asp Thr Ser Val Val Val Leu Pro Glu Met Trp Asn Asn
        35                  40                  45
Gly Tyr Ala Leu Glu Glu Leu Glu Gln Lys Ala Asp Lys Asn Leu Lys
    50                  55                  60
Asp Ser Ser Leu Phe Ile Lys Asp Leu Ala His Thr Phe Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Ile Ile Ala Gly Ser Val Ser Asn Ile Arg Glu Asn His Ile Tyr Asn
                85                  90                  95
Thr Ala Phe Ala Ile Asn Lys Asn Lys Glu Leu Ile Asn Glu Tyr Asp
            100                 105                 110
Lys Val His Leu Val Pro Met Leu Arg Glu Pro Asp Phe Leu Cys Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Val Val Pro Glu Pro Phe Tyr Leu Ser Asp Gln Thr Leu Val
    130                 135                 140
Thr Gln Ile Ile Cys Tyr Asp Leu Arg Phe Pro Glu Ile Leu Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Ala Arg Lys Gly Ala Lys Ile Ala Phe Tyr Val Ala Gln Trp Pro
                165                 170                 175
Ser Ser Arg Leu Asp His Trp Leu Ser Leu Leu Lys Ala Arg Ala Ile
            180                 185                 190
Glu Asn Asp Ile Phe Ile Val Ala Cys Asn Ser Cys Gly Asp Asp Gly
        195                 200                 205
His Thr Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Val Ile Asn Pro Asn Gly Glu
    210                 215                 220
Ile Leu Gly His Leu Asp Asp Lys Glu Gly Val Leu Thr Thr His Ile
225                 230                 235                 240
Asp Val Asp Leu Val Asp Gln Gln Arg Glu Tyr Ile Pro Val Phe Arg
                245                 250                 255
Asn Leu Lys Pro His Leu Tyr Lys
            260
<210>8
<211>295
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>8
Met Ser Lys Ile Val Gly Ser Asp Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu
1               5                   10                  15
Met Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Val Asn Ala Glu Gln Ala
            20                  25                  30
Lys Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg
        35                  40                  45
Val Pro Ser Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asn
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met
65                  70                  75                  80
Ala Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Thr Glu Ala Arg Val Leu Glu Ser
                85                  90                  95
Met Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp
            100                 105                 110
Glu Glu Tyr His Leu Arg Lys Asp Gln Phe Thr Val Pro Phe Val Cys
        115                 120                 125
Gly Cys Arg Asn Leu Gly Glu Ala Ala Arg Arg Ile Gly Glu Gly Ala
    130                 135                 140
Ala Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu
145                 150                 155                 160
Ala Val Arg His Met Arg Arg Val Asn Ser Glu Val Ser Arg Leu Thr
                165                 170                 175
Val Met Asn Asp Asp Glu Ile Met Thr Phe Ala Lys Asp Leu Gly Ala
            180                 185                 190
Pro Tyr Glu Val Leu Lys Gln Ile Lys Asp Asn Gly Arg Leu Pro Val
        195                 200                 205
Val Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Gln Asp Ala Ala Leu
    210                 215                 220
Met Met Glu Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe
225                 230                 235                 240
Lys Ser Glu Asp Pro Glu Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Gln Ala Thr
                245                 250                 255
Thr His Tyr Gln Asp Tyr Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ala Ser Glu Leu
            260                 265                 270
Gly Thr Ala Met Lys Gly Leu Asp Ile Asn Gln Ile Ser Leu Glu Glu
        275                 280                 285
Arg Met Gln Glu Arg Gly Trp
    290                 295
<210>9
<211>581
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>9
Met Glu Asp Ala Val Val Glu Met Asp Ala Val Lys Tyr Leu Asn Lys
1               5                   10                  15
Leu Asn Leu Asp Asn Ile Glu Leu Thr Lys Tyr Leu Phe Phe Thr Gly
            20                  25                  30
Lys Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Ile Ser Ser Phe Ile Ala Leu Asn
        35                  40                  45
Leu Ala Glu Asn Gly Lys Lys Val Ala Leu Val Ser Thr Asp Pro Ala
    50                  55                  60
Ser Asn Leu Gln Asp Val Phe Gln Met Glu Leu Ser Asn Lys Leu Thr
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Gln Pro Ile Pro Asn Leu Ser Ile Ala Asn Phe Asp Pro Ile
                85                  90                  95
Val Ala Ala Asp Asp Tyr Lys Ala Gln Ser Ile Glu Pro Tyr Glu Gly
            100                 105                 110
Ile Leu Pro Glu Asp Val Leu Ser Glu Met Lys Glu Gln Leu Ser Gly
        115                 120                 125
Ser Cys Thr Val Glu Val Ala Ala Phe Asn Glu Phe Thr Asn Phe Leu
    130                 135                 140
Ser Asp Lys Thr Leu Glu Gln Glu Phe Asp Phe Ile Ile Phe Asp Thr
145                 150                 155                 160
Ala Pro Thr Gly His Thr Leu Arg Met Leu Glu Leu Pro Ser Ala Trp
                165                 170                 175
Thr Asp Tyr Leu Asn Thr Thr Ser Asn Asp Ala Ser Cys Leu Gly Gln
            180                 185                 190
Leu Ser Gly Leu Asn Glu Asn Arg Val Lys Tyr Asn Ser Ala Leu Glu
        195                 200                 205
Lys Leu Arg Asn Gln Asp Asp Thr Thr Met Met Leu Val Ala Arg Pro
    210                 215                 220
Thr His Ser Ser Ile Tyr Glu Ile Gln Arg Ala Gln Gln Glu Leu Gln
225                 230                 235                 240
Gln Leu Ser Ile Ser Lys Phe Lys Val Ile Ile Asn Asn Tyr Ile Glu
                245                 250                 255
Glu Ser His Gly Leu Ile Ser Ser Gln Met Lys Ser Glu Gln Asp Lys
            260                 265                 270
Asn Ile Asn His Phe Thr Glu Trp Leu Asn Asn Asn His Ala Tyr Tyr
        275                 280                 285
Val Pro Tyr Lys Asn Gln Lys Glu Glu Gly Ile Glu Ser Leu Thr Asn
    290                 295                 300
Leu Leu Asn Asp Asp Asn Leu Ile Glu Asn Asp Asp Phe Ile Val Glu
305                 310                 315                 320
Asp His Pro Gln Phe Asn Lys Leu Ile Asp Glu Ile Glu Asn Ser Lys
                325                 330                 335
Val Gln Tyr Leu Phe Thr Met Gly Lys Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr
            340                 345                 350
Val Ala Thr Gln Leu Ala Thr Thr Leu Ser Asn Lys Gly Tyr Arg Val
        355                 360                 365
Leu Leu Ala Thr Thr Asp Pro Thr Lys Glu Ile Asn Val Glu Thr Thr
    370                 375                 380
Ser Asn Leu Asn Thr Ala Tyr Ile Asp Glu Glu Gln Ala Leu Glu Lys
385                 390                 395                 400
Tyr Lys Lys Glu Val Leu Ala Thr Val Asn Asp Asp Thr Pro Gln Asp
                405                 410                 415
Asp Ile Asp Tyr Ile Met Glu Asp Leu Lys Ser Pro Cys Thr Glu Glu
            420                 425                 430
Ile Ala Phe Phe Lys Ala Phe Ser Asp Ile Met Glu Asn Gln Asp Asp
        435                 440                 445
Met Asp Tyr Val Ile Val Asp Thr Ala Pro Thr Gly His Thr Leu Leu
    450                 455                 460
Leu Leu Asp Ser Ser Glu Asn His His Arg Glu Leu Lys Lys Lys Ser
465                 470                 475                 480
Thr Gln Thr Thr Ser Asn Val Glu Thr Leu Leu Pro Lys Ile Gln Asn
                485                 490                 495
Lys Asn Leu Thr Gln Met Ile Ile Val Thr Leu Ala Glu Lys Thr Pro
            500                 505                 510
Tyr Leu Glu Ser Lys Arg Leu Val Glu Asp Leu Asn Arg Ala Asn Ile
        515                 520                 525
Gly His Asn Trp Trp Val Val Asn Gln Ser Leu Val Thr Leu Asn Gln
    530                 535                 540
Arg Asp Asp Leu Phe Ser Asn Lys Lys Glu Asp Glu Ser Phe Trp Ile
545                 550                 555                 560
Asn Lys Ile Lys Asn Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Phe Val Ile Pro Tyr
                565                 570                 575
Arg Val Leu Glu Tyr
            580
<210>10
<211>336
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>10
Met Ala Ile Lys Val Ala Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu
1               5                   10                  15
Ala Phe Arg Arg Ile Gln Asp Val Glu Gly Leu Glu Val Val Ala Val
            20                  25                  30
Asn Asp Leu Thr Asp Asp Asp Met Leu Ala His Leu Leu Lys Tyr Asp
        35                  40                  45
Thr Met Gln Gly Arg Phe Thr Gly Glu Val Glu Val Ile Glu Gly Gly
    50                  55                  60
Phe Arg Val Asn Gly Lys Glu Ile Lys Ser Phe Asp Glu Pro Asp Ala
65                  70                  75                  80
Gly Lys Leu Pro Trp Gly Asp Leu Asp Ile Asp Val Val Leu Glu Cys
                85                  90                  95
Thr Gly Phe Tyr Thr Asp Lys Glu Lys Ala Gln Ala His Ile Asp Ala
            100                 105                 110
Gly Ala Lys Lys Val Leu Ile Ser Ala Pro Ala Lys Gly Asp Val Lys
        115                 120                 125
Thr Ile Val Phe Asn Thr Asn His Asp Thr Leu Asp Gly Ser Glu Thr
    130                 135                 140
Val Val Ser Gly Ala Ser Cys Thr Thr Asn Ser Leu Ala Pro Val Ala
145                 150                 155                 160
Lys Val Leu Ser Asp Glu Phe Gly Leu Val Glu Gly Phe Met Thr Thr
                165                 170                 175
Ile His Ala Tyr Thr Gly Asp Gln Asn Thr Gln Asp Ala Pro His Arg
            180                 185                 190
Lys Gly Asp Lys Arg Arg Ala Arg Ala Ala Ala Glu Asn Ile Ile Pro
        195                 200                 205
Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Ile Gly Lys Val Ile Pro Glu Ile
    210                 215                 220
Asp Gly Lys Leu Asp Gly Gly Ala Gln Arg Val Pro Val Ala Thr Gly
225                 230                 235                 240
Ser Leu Thr Glu Leu Thr Val Val Leu Asp Lys Gln Asp Val Thr Val
                245                 250                 255
Asp Gln Val Asn Ser Ala Met Lys Gln Ala Ser Asp Glu Ser Phe Gly
            260                 265                 270
Tyr Thr Glu Asp Glu Ile Val Ser Ser Asp Ile Val Gly Met Thr Tyr
        275                 280                 285
Gly Ser Leu Phe Asp Ala Thr Gln Thr Arg Val Met Thr Val Gly Asp
    290                 295                 300
Arg Gln Leu Val Lys Val Ala Ala Trp Tyr Asp Asn Glu Met Ser Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Ala Gln Leu Val Arg Thr Leu Ala His Leu Ala Glu Leu Ser Lys
                325                 330                 335
<210>11
<211>434
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>11
Met Pro Ile Ile Thr Asp Val Tyr Ala Arg Glu Val Leu Asp Ser Arg
1               5                   10                  15
Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Glu Val Leu Thr Glu Ser Gly Ala Phe
            20                  25                  30
Gly Arg Ala Leu Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu His Glu Ala
        35                  40                  45
Val Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val
    50                  55                  60
Thr Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Glu Met Ile Ala Pro Glu Ile Val
65                 70                 75                 80
Glu Gly Glu Phe Ser Val Leu Asp Gln Val Ser Ile Asp Lys Met Met
                85                 90                 95
Ile Gln Leu Asp Gly Thr His Asn Lys Gly Lys Leu Gly Ala Asn Ala
            100                 105                 110
Ile Leu Gly Val Ser Ile Ala Val Ala Arg Ala Ala Ala Asp Leu Leu
        115                 120                 125
Gly Gln Pro Leu Tyr Lys Tyr Leu Gly Gly Phe Asn Gly Lys Gln Leu
    130                 135                 140
Pro Val Pro Met Met Asn Ile Val Asn Gly Gly Ser His Ser Asp Ala
145                 150                 155                 160
Pro Ile Ala Phe Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Glu Ser
                165                 170                 175
Phe Lys Glu Ser Leu Arg Trp Gly Ala Glu Ile Phe His Asn Leu Lys
            180                 185                 190
Ser Ile Leu Ser Glu Arg Gly Leu Glu Thr Ala Val Gly Asp Glu Gly
        195                 200                 205
Gly Phe Ala Pro Arg Phe Glu Gly Thr Glu Asp Ala Val Glu Thr Ile
    210                 215                 220
Ile Lys Ala Ile Glu Lys Ala Gly Tyr Lys Pro Gly Glu Asp Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Gly Phe Asp Cys Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Gly Val Tyr
                245                 250                 255
Asp Tyr Thr Lys Phe Glu Gly Glu His Gly Ala Lys Arg Ser Ala Ala
            260                 265                 270
Glu Gln Val Asp Tyr Leu Glu Glu Leu Ile Gly Lys Tyr Pro Ile Ile
        275                 280                 285
Thr Ile Glu Asp Gly Met Asp Glu Asn Asp Trp Glu Gly Trp Lys Gln
    290                 295                 300
Leu Thr Asp Arg Ile Gly Asp Lys Val Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu
305                 310                 315                 320
Phe Val Thr Asn Thr Glu Ile Leu Ser Lys Gly IIle Glu Gln Gly Ile
                325                 330                 335
Gly Asn Ser Ile Leu Ile Lys Val Asn Gln Ile Gly Thr Leu Thr Glu
            340                 345                 350
Thr Phe Asp Ala Ile Glu Met Ala Gln Lys Ala Gly Tyr Thr Ala Val
        355                 360                 365
Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Thr Ile Ala Asp Ile
    370                 375                 380
Ala Val Ala Thr Asn Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Leu Ser Arg
385                 390                 395                 400
Thr Asp Arg Ile Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Asp Glu
                405                 410                 415
Leu Tyr Glu Thr Ala Lys Phe Glu Gly Ile Lys Ser Phe Tyr Asn Leu
            420                 425                 430
Asp Lys
<210>12
<211>468
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>12
Met Val Val Gly Asp Phe Pro Ile Glu Thr Asp Thr Ile Val Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ala Gln Leu Gly
            20                  25                  30
Gln Lys Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Asn Leu Gly Gly Val Cys Leu
        35                  40                  45
Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Ala Ser His Arg
    50                  55                  60
Phe Val Glu Ala Gln Asn Ser Glu Asn Leu Gly Val Ile Ala Glu Ser
65                  70                  75                  80
Val Ser Leu Asn Tyr Gln Lys Val Gln Glu Phe Lys Thr Ser Val Val
                85                  90                  95
Asn Lys Leu Thr Gly Gly Val Glu Gly Leu Leu Lys Gly Asn Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Val Arg Gly Glu Ala Tyr Phe Val Asp Asn Asn Ser Leu Arg
        115                 120                 125
Val Met Asp Glu Lys Ser Ala Gln Thr Tyr Asn Phe Lys His Ala Ile
    130                 135                 140
Ile Ala Thr Gly Ser Arg Pro Ile Glu Ile Pro Asn Phe Glu Phe Gly
145                 150                 155                 160
Lys Arg Val Ile Asp Ser Thr Gly Ala Leu Asn Leu Gln Glu Val Pro
                165                 170                 175
Asn Lys Leu Val Val Val Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Ser Glu Leu Gly
            180                 185                 190
Thr Ala Phe Ala Asn Phe Gly Ser Glu Val Thr Ile Leu Glu Gly Ala
        195                 200                 205
Lys Asp Ile Leu Gly Gly Phe Glu Lys Gln Met Thr Gln Pro Val Lys
    210                 215                 220
Lys Gly Met Lys Glu Lys Gly Ile Glu Ile Val Thr Glu Ala Met Ala
225                 230                 235                 240
Lys Ser Ala Glu Glu Thr Glu Asn Gly Val Lys Val Thr Tyr Glu Ala
                245                 250                 255
Lys Gly Glu Glu Gln Thr Ile Glu Ala Asp Tyr Val Leu Val Thr Val
            260                 265                 270
Gly Arg Arg Pro Asn Thr Asp Glu Leu Gly Leu Glu Glu Leu Gly Leu
        275                 280                 285
Lys Phe Ala Asp Arg Gly Leu Leu Glu Val Asp Lys Gln Ser Arg Thr
    290                 295                 300
Ser Ile Glu Asn Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Pro Gly Leu Pro
305                 310                 315                 320
Leu Ala His Lys Ala Ser Tyr Glu Gly Lys Val Ala Ala Glu Ala Ile
                325                 330                 335
Asp Gly Gln Ala Ala Glu Val Asp Tyr Ile Gly Met Pro Ala Val Cys
            340                 345                 350
Phe Thr Glu Pro Glu Leu Ala Gln Val Gly Tyr Thr Glu Ala Gln Ala
        355                 360                 365
Lys Glu Glu Gly Leu Ser Ile Lys Ala Ser Lys Phe Pro Tyr Ala Ala
    370                 375                 380
Asn Gly Arg Ala Leu Ser Leu Asp Asp Thr Asn Gly Phe Val Lys Leu
385                 390                 395                 400
Ile Thr Leu Lys Glu Asp Asp Thr Leu Ile Gly Ala Gln Val Val Gly
                405                 410                 415
Thr Gly Ala Ser Asp Ile Ile Ser Glu Leu Gly Leu Ala Ile Glu Ser
            420                 425                 430
Gly Met Asn Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Val His Ala His Pro Thr
        435                 440                 445
Leu Gly Glu Met Thr Met Glu Ala Ala Glu Lys Ala Ile Gly Tyr Pro
    450                 455                 460
Ile His Thr Met
465
<210>13
<211>279
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>13
Met Asp Leu Ala Thr Lys Tyr Phe Asn Gln Ile Asn Trp Arg Tyr Val
1               5                   10                  15
Asp His Ser Ser Gly Leu Glu Pro Met Gln Ser Phe Ala Phe Asp Asp
            20                  25                  30
Thr Phe Ser Glu Ser Val Gly Lys Asp Leu Ser Cys Asn Val Val Arg
        35                  40                  45
Thr Trp Ile His Gln His Thr Val Ile Leu Gly Ile His Asp Ser Arg
    50                  55                  60
Leu Pro Phe Leu Ser Asp Gly Ile Arg Phe Leu Thr Asp Glu Gln Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ala Ile Val Arg Asn Ser Gly Gly Leu Gly Val Val Leu Asp
                85                  90                  95
Gln Gly Ile Leu Asn Ile Ser Leu Ile Phe Lys Gly Gln Thr Glu Thr
             100                 105                 110
Thr Ile Asp Glu Ala Phe Thr Val Met Tyr Leu Leu Ile Asn Lys Met
        115                 120                 125
Phe Glu Asp Glu Asp Val Ser Ile Asp Thr Lys Glu Ile Glu Gln Ser
    130                 135                 140
Tyr Cys Pro Gly Lys Phe Asp Leu Ser Ile Asn Asp Lys Lys Phe Ala
145                 150                 155                 160
Gly Ile Ser Gln Arg Arg Val Arg Gly Gly Ile Ala Val Gln Ile Tyr
                165                 170                 175
Leu Cys Ile Glu Gly Ser Gly Ser Glu Arg Ala Leu Met Met Gln Gln
            180                 185                 190
Phe Tyr Gln Arg Ala Leu Lys Gly Glu Thr Thr Lys Phe His Tyr Pro
        195                 200                 205
Asp Ile Asp Pro Ser Cys Met Ala Ser Leu Glu Thr Leu Leu Asn Arg
    210                 215                 220
Glu Ile Lys Val Gln Asp Val Met Phe Leu Leu Leu Tyr Ala Leu Lys
225                 230                 235                 240
Asp Leu Gly Ala Asn Leu Asn Met Asp Pro Ile Thr Glu Asp Glu Trp
                245                 250                 255
Thr Arg Tyr Glu Gly Tyr Tyr Asp Lys Met Leu Glu Arg Asn Ala Lys
            260                 265                 270
Met Asn Glu Lys Leu Asp Phe
        275
<210>14
<211>310
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>14
Met Ala Gln Lys Pro Val Asp Tyr Val Thr Gln Ile Ile Gly Asn Thr
1               5                   10                  15
Pro Val Val Lys Leu Arg Asn Val Val Asp Asp Asp Ala Ala Asp Ile
            20                  25                  30
Tyr Val Lys Leu Glu Tyr Gln Asn Pro Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg
        35                  40                  45
Ile Ala Leu Ala Met Ile Glu Lys Ala Glu Arg Glu Gly Lys Ile Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Asp Thr Ile Val Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly
65                  70                  75                  80
Leu Ala Phe Val Cys Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Ala Val Phe Thr Met
                85                  90                  95
Pro Glu Thr Met Ser Gln Glu Arg Arg Asn Leu Leu Lys Ala Tyr Gly
            100                 105                 110
Ala Glu Leu Val Leu Thr Pro Gly Ser Glu Ala Met Lys Gly Ala Ile
        115                 120                 125
Lys Lys Ala Lys Glu Leu Lys Glu Glu His Gly Tyr Phe Glu Pro Gln
    130                 135                 140
Gln Phe Glu Asn Pro Ala Asn Pro Glu Ile His Glu Leu Thr Thr Gly
145                 150                 155                 160
Pro Glu Leu Val Glu Gln Phe Glu Gly Arg Gln Ile Asp Ala Phe Leu
                165                 170                 175
Ala Gly Val Gly Thr Gly Gly Thr Leu Ser Gly Val Gly Lys Val Leu
            180                 185                 190
Lys Lys Glu Tyr Pro Asn Val Glu Ile Val Ala Ile Glu Pro Glu Ala
        195                 200                 205
Ser Pro Val Leu Ser Gly Gly Glu Pro Gly Pro His Lys Leu Gln Gly
    210                 215                 220
Leu Gly Ala Gly Phe Val Pro Asp Thr Leu Asn Thr Glu Val Tyr Asp
225                 230                 235                 240
Ser Ile Ile Lys Val Gly Asn Asp Thr Ala Met Asp Met Ala Arg Arg
                245                 250                 255
Val Ala Arg Glu Glu Gly Ile Leu Ala Gly Ile Ser Ser Gly Ala Ala
            260                 265                 270
Ile Tyr Ala Ala Ile Gln Lys Ala Lys Glu Leu Gly Lys Gly Lys Thr
        275                 280                 285
Val Val Thr Val Leu Pro Ser Asn Gly Glu Arg Tyr Leu Ser Thr Pro
    290                 295                 300
Leu Tyr Ser Phe Asp Asn
305                 310
<210>15
<211>475
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>15
Met His Phe Glu Thr Val Ile Gly Leu Glu Val His Val Glu Leu Lys
1               5                   10                  15
Thr Asp Ser Lys Met Phe Ser Pro Ser Pro Ala His Phe Gly Ala Glu
            20                  25                  30
Pro Asn Ser Asn Thr Asn Val Ile Asp Leu Ala Tyr Pro Gly Val Leu
        35                  40                  45
Pro Val Val Asn Arg Arg Ala Val Asp Trp Ala Met Arg Ala Ser Met
    50                  55                  60
Ala Leu Asn Met Asp Ile Ala Thr Asn Ser Lys Phe Asp Arg Lys Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Phe Tyr Pro Asp Asn Pro Lys Ala Tyr Gln Ile Ser Gln Phe Asp
                85                  90                  95
Gln Pro Ile Gly Glu Asn Gly Tyr Ile Asp Ile Glu Val Asp Gly Glu
            100                 105                 110
Thr Lys Arg Ile Gly Ile Thr Arg Leu His Met Glu Glu Asp Ala Gly
        115                 120                 125
Lys Ser Thr His Lys Asp Gly Tyr Ser Leu Val Asp Leu Asn Arg Gln
    130                 135                 140
Gly Thr Pro Leu Ile Glu Ile Val Ser Glu Pro Asp Ile Arg Ser Pro
145                 150                 155                 160
Lys Glu Ala Tyr Ala Tyr Leu Glu Lys Leu Arg Ser Ile Ile Gln Tyr
                165                 170                 175
Thr Gly Val Ser Asp Cys Lys Met Glu Glu Gly Ser Leu Arg Cys Asp
            180                 185                 190
Ala Asn Ile Ser Leu Arg Pro Tyr Gly Gln Lys Glu Phe Gly Thr Lys
        195                 200                 205
Thr Glu Leu Lys Asn Leu Asn Ser Phe Asn Tyr Val Lys Lys Gly Leu
    210                 215                 220
Glu Tyr Glu Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Leu Leu Asn Gly Gly Glu
225                 230                 235                 240
Ile Gly Gln Glu Thr Arg Arg Phe Asp Glu Ser Thr Gly Lys Thr Ile
                245                 250                 255
Leu Met Arg Val Lys Glu Gly Ser Asp Asp Tyr Arg Tyr Phe Pro Glu
            260                 265                 270
Pro Asp Ile Val Pro Leu Tyr Val Asp Glu Asp Trp Lys Ala Arg Val
        275                 280                 285
Arg Glu Thr Ile Pro Glu Leu Pro Asp Glu Arg Lys Ala Lys Tyr Val
    290                 295                 300
Asn Asp Leu Gly Leu Pro Glu Tyr Asp Ala His Val Leu Thr Leu Thr
305                 310                 315                 320
Lys Glu Met Ser Asp Phe Phe Glu Gly Ala Ile Asp His Gly Ala Asp
                325                 330                 335
Val Lys Leu Thr Ser Asn Trp Leu Met Gly Gly Val Asn Glu Tyr Leu
            340                 345                 350
Asn Lys Asn Gln Val Glu Leu Lys Asp Thr Gln Leu Thr Pro Glu Asn
        355                 360                 365
Leu Ala Gly Met Ile Lys Leu Ile Glu Asp Gly Thr Met Ser Ser Lys
    370                 375                 380
Ile Ala Lys Lys Val Phe Pro Glu Leu Ala Glu Asn Gly Gly Asp Ala
385                 390                 395                 400
Lys Gln Ile Met Glu Asp Lys Gly Leu Val Gln Ile Ser Asp Glu Ala
                405                 410                 415
Thr Leu Leu Lys Phe Val Thr Asp Ala Leu Asp Asn Asn Pro Gln Ser
            420                 425                 430
Ile Glu Asp Tyr Lys Asn Gly Lys Gly Lys Ala Mer Gly Phe Leu Val
        435                 440                 445
Gly Gln Ile Met Lys Ala Ser Lys Gly Gln Ala Asn Pro Gln Lys Val
    450                 455                 460
Asn Ser Leu Leu Lys Gln Glu Leu Asp Asn Arg
465                 470                 475
<210>16
<211>364
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>16
Met Leu Lys Arg Ala Asn Glu Asn Glu Glu Ala Trp Asn Asn Met Leu
1               5                   10                  15
Lys Asn Tyr Ser Glu Ala Tyr Pro Glu Leu Ala Glu Glu Phe Lys Leu
            20                  25                  30
Ala Met Ser Gly Lys Leu Pro Asn Asn Tyr Ala Asp Ala Leu Pro Glu
        35                  40                  45
Tyr Asp Leu Asn His Ser Gly Ala Ser Arg Ala Asp Ser Gly Glu Ile
    50                  55                  60
Ile Gln Lys Leu Ser Glu Phe Val Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala
65                 70                 75                 80
Asp Leu Ala Gly Ser Asn Lys Ser Asn Val Lys Glu Ala Lys Asp Tyr
                85                 90                 95
Asn Lys Asp Thr Pro Glu Gly Lys Asn Val Trp Phe Gly Val Arg Glu
            100                 105                 110
Phe Ala Met Gly Ala Ala Ile Asn Gly Met Ala Ala His Gly Gly Leu
        115                 120                 125
His Pro Tyr Ala Ala Thr Phe Phe Val Phe Ser Asp Tyr Leu Lys Pro
    130                 135                 140
Ala Leu Arg Leu Ser Ser Ile Met Gly Leu Asn Ser Thr Phe Ile Phe
145                 150                 155                 160
Thr His Asp Ser Ile Ala Val Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Glu Pro
                165                 170                 175
Ile Glu Gln Leu Ala Gly Leu Arg Ala Ile Pro Asn Met Asn Val Ile
            180                 185                 190
Arg Pro Ala Asp Gly Asn Glu Thr Arg Val Ala Trp Glu Val Ala Leu
        195                 200                 205
Glu Ser Glu Gln Thr Pro Thr Ser Leu Val Leu Thr Arg Gln Asn Leu
    210                 215                 220
Pro Thr Leu Asp Val Asp Lys Gln Thr Val Glu Asn Gly Val Arg Lys
225                 230                 235                 240
Gly Ala Tyr Ile Val Phe Glu Thr Glu Gln Gln Leu Glu Tyr Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Ala Ser Gly Ser Glu Val Asn Leu Ala Val Glu Ala Ala Lys Glu
            260                 265                 270
Leu Glu Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Val Ile Ser Met Pro Asn Trp
        275                 280                 285
Tyr Ala Phe Glu Gln Gln Ser Ser Glu Tyr Lys Glu Ser Ile Leu Pro
    290                 295                 300
Ser Asp Val Thr Lys Arg Ile Ala Ile Glu Met Ala Ser Pro Leu Gly
305                 310                 315                 320
Trp His Lys Tyr Val Gly Ile Glu Gly Lys Val Ile Gly Ile Asn Ser
                325                 330                 335
Phe Gly Ala Ser Ala Pro Gly Asp Leu Val Val Glu Lys Tyr Gly Phe
            340                 345                 350
Thr Lys Glu Asn Ile Leu Lys Gln Val Arg Ser Leu
        355                 360
<210>17
<211>334
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>17
Val Glu Ser Val Arg Gly Leu Lys Ile Leu Ser Val Ile Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Phe Val Leu Ile Ala Thr Ala Ala Cys Gly Asn Asn Ser Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ser Ser Lys Glu Ser Ser Lys Asp Gly Val Glu Ile Lys His Glu Glu
        35                  40                  45
Gly Thr Thr Lys Val Pro Lys His Pro Lys Arg Val Val Val Leu Glu
    50                  55                  60
Tyr Ser Phe Val Asp Ala Leu Val Ala Leu Asp Val Lys Pro Val Gly
65                  70                  75                  80
Ile Ala Asp Asp Asn Lys Lys Asn Arg Ile Ile Lys Pro Leu Arg Asp
                85                  90                  95
Lys Ile Gly Lys Tyr Thr Ser Val Gly Thr Arg Lys Pro Pro Asn Leu
            100                 105                 110
Glu Glu Ile Ser Lys Leu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Ala Asp Asn Asn
        115                 120                 125
Arg His Lys Gly Ile Tyr Lys Asp Leu Asn Lys Ile Ala Pro Thr Ile
    130                 135                 140
Glu Leu Lys Ser Phe Asp Gly Asp Tyr Asn Glu Asn Ile Asp Ala Phe
145                 150                 155                 160
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Leu Gly Lys Glu Glu Glu Gly Lys Lys Arg
                165                 170                 175
Leu Glu Glu His Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Lys Lys Glu Ile Thr
            180                 185                 190
Met Asp Lys Asn Gln Lys Val Leu Pro Ala Val Ala Ala Lys Ser Gly
        195                 200                 205
Leu Leu Ala His Pro Ser Asn Ser Tyr Val Gly Gln Phe Leu Ser Gln
    210                 215                 220
Leu Gly Phe Lys Glu Ala Leu Ser Asp Asp Val Thr Lys Gly Leu Ser
225                 230                 235                 240
Lys Tyr Leu Lys Gly Pro Tyr Leu Gln Met Asn Thr Glu Thr Leu Ser
                245                 250                 255
Gln Val Asn Pro Glu Arg Met Phe Ile Met Thr Asn Lys Ala Ser Ser
            260                 265                 270
Asn Glu Pro Ser Leu Lys Glu Leu Glu Lys Asp Pro Val Trp Lys Lys
        275                 280                 285
Leu Asn Ala Val Lys Asn Gln Arg Val Asp Ile Leu Asp Arg Asp Leu
    290                 295                 300
Trp Ala Arg Ser Arg Gly Leu Ile Ser Ser Glu Glu Met Ala Lys Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Glu Leu Ser Lys Thr Asp Ser Lys Lys Asp Asn Lys
                325                 330
<210>18
<211>411
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>18
Met Arg Asp Lys Phe Glu Ile Thr Phe Ile Lys Asn Arg Arg Asp Leu
1               5                   10                  15
Ile Met Ala Lys Glu Lys Phe Asp Arg Ser Lys Glu His Ala Asn Ile
            20                  25                  30
Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala
        35                  40                  45
Ile Ala Thr Val Leu Ala Lys Asn Gly Asp Thr Val Ala Gln Ser Tyr
    50                  55                  60
Asp Met Ile Asp Asn Ala Pro Glu Glu Lys Glu Arg Gly Ile Thr Ile
65                  70                  75                  80
Asn Thr Ala His Ile Glu Tyr Gln Thr Asp Lys Arg His Tyr Ala His
                85                 90                 95
Val Asp Cys Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile Thr Gly
            100                 105                 110
Ala Ala Gln Met Asp Gly Gly Ile Leu Val Val Ser Ala Ala Asp Gly
        115                 120                 125
Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ser Arg Asn Val Gly
130                 135                 140
Val Pro Ala Leu Val Val Phe Leu Asn Lys Val Asp Met Val Asp Asp
145                 150                 155                 160
Glu Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Val Arg Asp Leu Leu Ser
                165                 170                 175
Glu Tyr Asp Phe Pro Gly Asp Asp Val Pro Val Ile Ala Gly Ser Ala
            180                 185                 190
Leu Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Glu Tyr Glu Gln Lys Ile Leu Asp
        195                 200                 205
Leu Met Gln Ala Val Asp Asp Tyr Ile Pro Thr Pro Glu Arg Asp Ser
    210                 215                 220
Asp Lys Pro Phe Met Met Pro Val Glu Asp Val Phe Ser Ile Thr Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gly Thr Val Ala Thr Gly Arg Val Glu Arg Gly Gln Ile Lys Val
                245                 250                 255
Gly Glu Glu Val Glu Ile Ile Gly Met His Glu Thr Ser Lys Thr Thr
            260                 265                 270
Val Thr Gly Val Glu Met Phe Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Ala Glu Ala
        275                 280                 285
Gly Asp Asn Ile Gly Ala Leu Leu Arg Gly Val Ala Arg Glu Asp Val
    290                 295                 300
Gln Arg Gly Gln Val Leu Ala Ala Pro Gly Ser Ile Thr Pro His Thr
305                 310                 315                 320
Lys Phe Lys Ala Glu Val Tyr Val Leu Ser Lys Asp Glu Gly Gly Arg
                325                 330                 335
His Thr Pro Phe Phe Thr Asn Tyr Arg Pro Gln Phe Tyr Phe Arg Thr
            340                 345                 350
Thr Asp Val Thr Gly Val Val Asn Leu Pro Glu Gly Thr Glu Met Val
        355                 360                 365
Met Pro Gly Asp Asn Val Glu Met Thr Val Glu Leu Ile Ala Pro Ile
    370                 375                 380
Ala Ile Glu Asp Gly Thr Arg Phe Ser Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr
385                 390                 395                 400
Val Gly Ser Gly Val Val Thr Glu Ile Phe Glu
                405                 410
<210>19
<211>428
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>19
Met Met Ser Phe Glu Lys Ser Ile Lys Ala Met Glu Gln Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Leu Met Pro Gly Gly Val Asn Ser Pro Val Arg Ala Phe Lys Ser Val
            20                  25                  30
Asp Thr Pro Ala Ile Phe Met Asp His Gly Glu Gly Ser Lys Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Ile Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Asp Tyr Val Leu Ser Trp Gly Pro
    50                  55                  60
Leu Ile Leu Gly His Lys Asn Gln Gln Val Ile Ser Lys Leu His Glu
65                  70                  75                  80
Ala Val Asp Lys Gly Thr Ser Phe Gly Ala Ser Thr Leu Gln Glu Asn
                85                  90                  95
Lys Leu Ala Glu Leu Val Ile Asp Arg Val Pro Ser Ile Glu Lys Val
            100                 105                 110
Arg Met Val Ser Ser Gly Thr Glu Ala Thr Leu Asp Thr Leu Arg Leu
        115                 120                 125
Ala Arg Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Lys Ile Ile Lys Phe Glu Gly Cys
    130                 135                 140
Tyr His Gly His Ser Asp Ser Leu Leu Ile Lys Ala Gly Ser Gly Val
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Glu Gly Ile Ala
                165                 170                 175
Lys Asn Thr Ile Thr Val Pro Tyr Asn Asp Leu Asp Ser Leu Lys Leu
            180                 185                 190
Ala Phe Glu Lys Tyr Gly Asp Asp Ile Ala Gly Val Ile Val Glu Pro
        195                 200                 205
Val Ala Gly Asn Met Gly Val Val Pro Pro Val Asn Gly Phe Leu Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Arg Asp Ile Thr Asn Glu Tyr Gly Ala Leu Leu Ile Phe Asp
225                 230                 235                 240
Glu Val Met Thr Gly Phe Arg Val Gly Tyr Asn Cys Ala Gln Gly Tyr
                245                 250                 255
Phe Gly Val Thr Pro Asp Leu Thr Cys Leu Gly Lys Val Ile Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Leu Pro Val Gly Ala Phe Gly Gly Lys Lys Glu Ile Met Asp Tyr
        275                 280                 285
Ile Ala Pro Val Gly Thr Ile Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser Gly Asn
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Met Thr Ser Gly Tyr Glu Thr Leu Ser Gln Leu Thr Pro
305                 310                 315                 320
Glu Ser Tyr Glu Tyr Phe Asn Ser Leu Gly Asp Ile Leu Glu Lys Gly
                325                 330                 335
Leu Lys Glu Val Phe Ala Lys Tyr Asn Val Pro Ile Thr Val Asn Arg
            340                 345                 350
Ala Gly Ser Met Ile Gly Tyr Phe Leu Asn Glu Gly Pro Val Thr Asn
        355                 360                 365
Phe Glu Glu Ala Asn Lys Ser Asp Leu Lys Leu Phe Ser Asn Met Tyr
    370                 375                 380
Arg Glu Met Ala Lys Glu Gly Val Tyr Ile Pro Pro Ser Gln Phe Glu
385                 390                 395                 400
Gly Thr Phe Leu Ser Thr Ala His Thr Lys Asp Asp Ile Glu Lys Thr
                405                 410                 415
Ile Gln Ala Phe Asp Asn Ala Leu Ser Arg Ile Val
            420                 425
<210>20
<211>286
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>20
Met Pro Leu Val Ser Met Lys Glu Met Leu Ile Asp Ala Lys Glu Asn
1               5                   10                  15
Gly Tyr Ala Val Gly Gln Tyr Asn Leu Asn Asn Leu Glu Phe Thr Gln
            20                  25                  30
Ala Ile Leu Glu Ala Ser Gln Glu Glu Asn Ala Pro Val Ile Leu Gly
        35                  40                  45
Val Ser Glu Gly Ala Ala Arg Tyr Met Ser Gly Phe Tyr Thr Val Val
    50                  55                  60
Lys Met Val Glu Gly Leu Met His Asp Leu Asn Ile Thr Ile Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ile His Leu Asp His Gly Ser Ser Phe Glu Lys Cys Lys Glu Ala
                85                  90                  95
Ile Asp Ala Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Ala Ser His Ser Pro
            100                 105                 110
Phe Glu Glu Asn Val Glu Ile Thr Ser Lys Val Val Glu Tyr Ala His
        115                 120                 125
Asp Arg Gly Val Ser Val Glu Ala Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly Gln
    130                 135                 140
Glu Asp Asp Val Val Ala Asp Gly Val Ile Tyr Ala Asp Pro Lys Glu
145                 150                 155                 160
Cys Gln Glu Leu Val Glu Lys Thr Gly Ile Asp Thr Leu Ala Pro Ala
                165                 170                 175
Leu Gly Ser Val His Gly Pro Tyr Lys Gly Glu Pro Lys Leu Gly Phe
            180                 185                 190
Lys Glu Met Glu Glu Ile Gly Ala Ser Thr Gly Leu Pro Leu Val Leu
        195                 200                 205
His Gly Gly Thr Gly Ile Pro Thr Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ile Pro
    210                 215                 220
Tyr Gly Thr Ala Lys Ile Asn Val Asn Thr Glu Asn Gln Ile Ala Ser
225                 230                 235                 240
Ala Lys Ala Val Arg Glu Val Leu Asn Asn Asp Lys Asp Val Tyr Asp
                245                 250                 255
Pro Arg Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Arg Glu Ala Ile Lys Glu Thr Val
            260                 265                 270
Lys Gly Lys Ile Arg Glu Phe Gly Thr Ser Asn Arg Ala Lys
        275                 280                 285
<210>21
<211>468
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>21
Met Thr Gln Gln Ile Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Leu Ala Trp Asn Ile Glu Ser Arg Gly Tyr Ser Val Ser Val Tyr Asn
            20                  25                  30
Arg Ser Arg Gln Lys Thr Asp Glu Met Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg
        35                  40                  45
Glu Ile Tyr Pro Thr Tyr Ser Leu Glu Glu Phe Val Glu Ser Leu Glu
    50                  55                  60
Lys Pro Arg Lys Ile Leu Leu Met Val Lys Ala Gly Pro Ala Thr Asp
65                  70                  75                  80
Ala Thr Ile Asp Gly Leu Leu Pro Leu Leu Asp Asp Asp Asp Ile Leu
                85                  90                  95
Ile Asp Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Arg Arg Asn Lys
            100                 105                 110
Ala Leu Ala Glu Ser Ser Ile Asn Phe Ile Gly Met Gly Val Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Glu Ile Gly Ala Leu Thr Gly Pro Ser Leu Met Pro Gly Gly Gln
    130                 135                 140
Lys Asp Ala Tyr Asn Lys Val Ser Asp Ile Leu Asp Ala Ile Ala Ala
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gln Asp Gly Ala Ser Cys Val Thr Tyr Ile Gly Pro Asn Gly
                165                 170                 175
Ala Gly His Tyr Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Ala Asp
            180                 185                 190
Met Gln Leu Ile Ala Glu Ser Tyr Ala Met Met Lys Asp Leu Leu Gly
        195                 200                 205
Met Ser His Lys Glu Ile Ser Gln Thr Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly
    210                 215                 220
Glu Leu Glu Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Gly Asp Ile Phe Asn Lys
225                 230                 235                 240
Leu Asp Asp Asp Asn Glu Ala Leu Val Glu Lys Ile Leu Asp Thr Ala
                245                 250                 255
Gly Gln Lys Gly Thr Gly Lys Trp Thr Ser Ile Asn Ala Leu Glu Leu
            260                 265                 270
Gly Val Pro Leu Thr Ile Ile Thr Glu Ser Val Phe Ala Arg Phe Ile
        275                 280                 285
Ser Ser Ile Lys Glu Glu Arg Val Thr Ala Ser Lys Ser Leu Lys Gly
    290                 295                 300
Pro Lys Ala His Phe Glu Gly Asp Lys Lys Thr Phe Leu Glu Lys Ile
305                 310                 315                 320
Arg Lys Ala Leu Tyr Met Ser Lys Ile Cys Ser Tyr Ala Gln Gly Phe
                325                 330                 335
Ala Gln Met Arg Lys Ala Ser Glu Asp Asn Glu Trp Asn Leu Lys Leu
            340                 345                 350
Gly Glu Leu Ala Met Ile Trp Arg Glu Gly Cys Ile Ile Arg Ala Gln
        355                 360                 365
Phe Leu Gln Lys Ile Lys Asp Ala Tyr Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln
    370                 375                 380
Asn Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Asn Ile Val Met Glu Tyr Gln
385                 390                 395                 400
Asp Ala Leu Arg Glu Val Val Ala Thr Ser Val Tyr Asn Gly Val Pro
                405                 410                 415
Thr Pro Gly Phe Ser Ala Ser Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Tyr Arg Ser
            420                 425                 430
Glu Asp Leu Pro Ala Asn Leu Ile Gln Ala Gln Arg Asp Tyr Phe Gly
        435                 440                 445
Ala His Thr Tyr Glu Arg Lys Asp Arg Glu Gly Ile Phe His Thr Gln
    450                 455                 460
Trp Val Glu Glu
465
<210>22
<211>262
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>22
Met Lys Arg Leu Leu Leu Cys Ile Val Ala Leu Val Phe Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Cys Gly Asn Asn Ser Ser Asn Asn Lys Asp Asn Gln Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Lys Asp Lys Asp Thr Leu Arg Val Gly Thr Glu Gly Thr Tyr Ala Pro
        35                  40                  45
Phe Thr Tyr His Asn Lys Lys Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Asp Ile Asp
    50                  55                  60
Val Ile Lys Ala Val Ala Lys Glu Glu Asn Leu Lys Leu Lys Phe Asn
65                  70                  75                  80
Glu Thr Ser Trp Asp Ser Met Phe Ala Gly Leu Asp Ala Gly Arg Phe
                85                  90                  95
Asp Val Ile Ala Asn Gln Val Gly Val Asn Lys Asp Arg Glu Lys Lys
            100                 105                 110
Tyr Lys Phe Ser Glu Pro Tyr Thr Tyr Ser Ser Ala Val Leu Val Val
        115                 120                 125
Arg Glu Asn Glu Lys Asp Ile Thr Ser Phe Asn Asp Val Lys Gly Lys
    130                 135                 140
Lys Leu Ala Gln Thr Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Gln Leu Ala Lys Asp
145                 150                 155                 160
Lys Gly Ala Asp Ile Thr Lys Val Asp Gly Phe Asn Gln Ser Met Asp
                165                 170                 175
Leu Leu Leu Ser Lys Arg Val Asp Gly Thr Phe Asn Asp Ser Leu Ser
            180                 185                 190
Tyr Leu Asp Tyr Arg Lys Gln Lys Pro Asn Ala Lys Ile Lys Ala Ile
        195                 200                 205
Lys Gly His Ala Glu Gln Asn Lys Ser Ala Phe Ala Phe Ser Lys Lys
    210                 215                 220
Val Asp Glu Lys Thr Ile GluLys Phe Asn Lys Gly Leu Glu Lys Ile
225                 230                 235                 240
Arg Asp Asn Gly Glu Leu Ala Lys Ile Gly Lys Lys Trp Phe Gly Gln
                245                 250                 255
Asp Val Ser Lys Pro Glu
            260
<210>23
<211>310
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>23
Val Tyr Met Thr Lys Tyr Val Leu Lys Arg Leu Cys Tyr Met Phe Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Phe Ile Val Ile Thr Ile Thr Phe Phe Leu Met Lys Leu Met
            20                  25                  30
Pro Gly Ser Pro Phe Asn Asp Thr Lys Leu Asn Ala Gln Gln Lys Glu
        35                  40                  45
Ile Leu Asn Glu Lys Tyr Gly Leu Asn Asp Pro Val Ala Leu Gln Tyr
    50                  55                  60
Val Asn Tyr Leu Lys Asn Val Val Thr Gly Asp Phe Gly Asn Ser Phe
65                  70                  75                  80
Gln Tyr His Asn Met Pro Val Trp Asp Leu Val Lys Pro Arg Leu Ile
                85                  90                  95
Pro Ser Met Glu Met Gly Ile Thr Ala Met Val Ile Gly Val Val Leu
            100                 105                 110
Gly Leu Val Leu Gly Val Ala Ala Ala Thr Lys Gln Asn Thr Trp Val
        115                 120                 125
Asp Tyr Thr Thr Thr Ile Ile Ser Val Ile Ala Val Ser Val Pro Ser
    130                 135                 140
Phe Val Leu Ala Val Leu Leu Gln Tyr Val Phe Ala Val Lys Leu Glu
145                 150                 155                 160
Trp Phe Pro Val Ala Gly Trp Glu Gly Phe Ser Thr Ala Ile Leu Pro
                165                 170                 175
Ser Leu Ala Leu Ser Ala Thr Val Leu Ala Thr Val Ala Arg Tyr Ile
            180                 185                 190
Arg Ala Glu Met Ile Glu Val Leu Ser Ser Asp Tyr Ile Leu Leu Ala
        195                 200                 205
Arg Ala Lys Gly Asn Ser Thr Leu Lys Val Leu Phe Gly His Ala Leu
    210                 215                 220
Arg Asn Ala Leu Ile Pro Ile Ile Thr Ile Ile Val Pro Met Leu Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ile Leu Thr Gly Thr Leu Thr Ile Glu Asn Ile Phe Gly Val Pro
                245                 250                 255
Gly Leu Gly Asp Gln Phe Val Arg Ser Ile Thr Thr Asn Asp Phe Ser
            260                 265                 270
Val Ile Met Ala Thr Thr Ile Leu Phe Ser Thr Leu Phe Ile Val Ser
        275                 280                 285
Ile Phe Ile Val Asp Ile Leu Tyr Gly Val Ile Asp Pro Arg Ile Arg
    290                 295                 300
Val Gln Gly Gly Lys Lys
305                 310
<210>24
<211>514
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>24
Val Asn Glu Glu Gln Arg Lys Ala Gly Thr Ile Asn Ile Leu Ala Glu
1               5                   10                  15
Arg Asp Arg Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Ser Lys Tyr Phe Glu Gln Val
            20                  25                  30
Tyr Gln Pro Pro Ser Leu Lys Glu Ala Lys Lys Arg Gly Lys Gln Glu
        35                  40                  45
Val Gln Tyr Asn Arg Asp Phe His Ile Asp Glu Lys Tyr Lys Gly Met
    50                  55                  60
Gly Lys Gly Arg Thr Phe Leu Ile Lys Thr Tyr Gly Cys Gln Met Asn
65                  70                  75                  80
Ala His Asp Thr Glu Val Met Ala Gly Ile Leu Asn Ala Leu Gly Tyr
                85                  90                  95
Ser Ala Thr Ser Asp Ile Asn Glu Ala Asp Val Ile Leu Ile Asn Thr
            100                 105                 110
Cys Ala Ile Arg Glu Asn Ala Glu Asn Lys Val Phe Ser Glu Ile Gly
        115                 120                 125
Asn Leu Lys His Leu Lys Lys Glu Arg Pro Asp Cys Leu Ile Gly Val
    130                 135                 140
Cys Gly Cys Met Ser Gln Glu Glu Ser Val Val Asn Lys Ile Leu Lys
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Gln Asn Val Asp Met Val Phe Gly Thr His Asn Ile His His
                165                 170                 175
Leu Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ala Tyr Leu Ser Lys Ala Met Val Val
            180                 185                 190
Glu Val Trp Ser Lys Glu Gly Asp Ile Ile Glu Asn Leu Pro Lys Val
        195                 200                 205
Arg Asp Gly His Ile Lys Ala Trp Val Asn Ile Met Tyr Gly Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Phe Cys Thr Tyr Cys Ile Val Pro Phe Thr Arg Gly Lys Glu Arg
225                 230                 235                 240
Ser Arg Arg Pro Glu Asp Ile Ile Asp Glu Val Arg Glu Leu Ala Arg
                245                 250                 255
Glu Gly Tyr Gln Glu Ile Thr Leu Leu Gly Gln Asn Val Asn Ser Tyr
            260                 265                 270
Gly Lys Asp Ile Glu Gly Leu Asp Tyr Glu Leu Gly Asp Leu Leu Glu
        275                 280                 285
Asp Ile Ser Lys Ile Asp Ile Pro Arg Val Arg Phe Thr Thr Ser His
    290                 295                 300
Pro Trp Asp Phe Thr Asp Arg Met Ile Glu Val Ile Ala Lys Gly Gly
305                 310                 315                 320
Asn Ile Val Pro His Ile His Leu Pro Val Gln Ser Gly Asn Asn Gln
                325                 330                 335
Val Leu Lys Ile Met Gly Arg Lys Tyr Thr Arg Glu Ser Tyr Leu Asp
            340                 345                 350
Leu Val Ser Arg Ile Lys Glu Ala Ile Pro Asn Val Ala Leu Thr Thr
        355                 360                 365
Asp Ile Ile Val Gly Tyr Pro Asn Glu Thr Val Glu Gln Phe Glu Glu
    370                 375                 380
Thr Leu Ser Leu Tyr Asp Asp Val Gln Phe Glu His Ala Tyr Thr Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Ser Gln Arg Asp Gly Thr Pro Ala Ala Lys Met Lys Asp Asn
                405                 410                 415
Val Pro Leu Glu Val Lys Lys Glu Arg Leu Gln Arg Leu Asn Lys Lys
            420                 425                 430
Val Gly Ile Tyr Ser Gln Gln Ala Met Ser Gln Tyr Glu Gly Lys Ile
        435                 440                 445
Val Thr Val Leu Cys Glu Gly Ser Ser Lys Lys Asp GluAsn Val Leu
    450                 455                 460
Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Asn Lys Leu Val Asn Phe Lys Gly Pro Arg
465                 470                 475                 480
Glu Ser Ile Gly Lys Leu Val Asp Val Lys Ile Asp Glu Ala Lys Gln
                485                 490                 495
Tyr Ser Leu Asn Gly Thr Phe Ile Gln Glu His Gln Arg Ser Met Val
            500                 505                 510
Thr Gln
<210>25
<211>394
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>25
Met Ser Arg Ile Val Leu Ala Glu Ala Tyr Arg Thr Pro Ile Gly Val
1               5                   10                  15
Phe Gly Gly Val Phe Lys Asp Ile Pro Ala Tyr Glu Leu Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Val Ile Arg Gln Ile Leu Glu His 5er Gln Ile Asp Pro Asn Glu Ile
        35                  40                  45
Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Gln Gly Gln Asn
    50                  55                  60
Pro Ala Arg Ile Ala Ala Ile His Gly Gly Val Pro Glu Ala Val Pro
65                  70                  75                  80
Ser Phe Thr Val Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ala Ile Gln
                85                  90                  95
Leu Ala Tyr Gln Ser Ile Val Ala Gly Asp Asn Glu Ile Val Ile Ala
            100                 105                 110
Gly Gly Met Glu Ser Met Ser Gln Ser Pro Met Leu Leu Lys Asn Ser
        115                 120                 125
Arg Phe Gly Phe Lys Met Gly Asn Gln Thr Leu Glu Asp Ser Met Ile
    130                 135                 140
Ala Asp Gly Leu Thr Asp Lys Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr
145                 150                 155                 160
Ala Glu Asn Leu Val Glu Gln Tyr Gln Ile Ser Arg Lys Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Gln Phe Ala Phe Asp Ser Gln Gln Lys Ala Ser Arg Ala Gln Gln Ala
            180                 185                 190
Gly Val Phe Asp Ala Glu Ile Val Pro Val Glu Val Pro Gln Arg Lys
        195                 200                 205
Gly Asp Pro Leu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Gly Ile Arg Pro Gln Thr
    210                 215                 220
Thr Ile Asp Lys Leu Ala Gln Leu Arg Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly
225                 230                 235                 240
Ser Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Ile Asn Asp Gly Ala Ala Ala
                245                 250                 255
Met Leu Val Met Thr Glu Asp Lys Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gln Pro
            260                 265                 270
Ile Ala Val Leu Asp Ser Phe Gly Ala Ser Gly Val Ala Pro Ser Ile
        275                 280                 285
Met Gly Ile Gly Pro Val Glu Ala Ile His Lys Ala Leu Lys Arg Ser
    290                 295                 300
Asn Lys Val Ile Asn Asp Val Asp Ile Phe Glu Leu Asn Glu Ala Phe
305                 310                 315                 320
Ala Ala Gln Ser Ile Ala Val Asn Arg Glu Leu Gln Leu Pro Gln Asp
                 325                 330                 335
Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly
            340                 345                 350
Ala Ser Gly Ala Arg Thr Leu Val Ser Leu Leu His Gln Leu Ser Asp
        355                 360                 365
Ala Lys Pro Thr Gly Val Ala Ser Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly
    370                 375                 380
Ile Ala Thr Val Val Ser Lys Tyr Glu Val
385                 390
<210>26
<211>292
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>26
Met Ala Ile Ser Ala Lys Leu Val Lys Glu Leu Arg Glu Lys Thr Gly
1               5                   10                  15
Ala Gly Met Met Asp Cys Lys Lys Ala Leu Thr Glu Thr Asp Gly Asp
            20                  25                  30
Ile Asp Lys Ala Ile Asp Tyr Leu Arg Glu Lys Gly Ile Ala Lys Ala
        35                  40                  45
Ala Lys Lys Ala Asp Arg Ile Ala Ala Glu Gly Leu Val His Val Glu
    50                  55                  60
Val Lys Asp Asn Glu Ala Ala Ile Val Glu Ile Asn Ser Glu Thr Asp
65                  70                  75                  80
Phe Val Ala Arg Asn Glu Gly Phe Gln Glu Leu Val Lys Glu Ile Ala
                85                  90                  95
Asn His Ile Leu Asp Ser Lys Val Glu Thr Val Asp Ala Leu Met Glu
            100                 105                 110
Ser Lys Leu Ser Ser Gly Lys Thr Val Asp Glu Arg Met Lys Glu Ala
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Ile Gly Glu Lys Leu ser Ile Arg Arg Phe ser Ile Arg
    130                 135                 140
Thr Lys Thr Asp Asn Asp Ala Phe Gly Ala Tyr Leu His Met Gly Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ile Gly Val Leu Thr Val Val Glu Gly Thr Thr Asp Glu Glu Ala
                165                 170                 175
Ala Lys Asp Val Ala Met His Ile Ala Ala Ile Asn Pro Lys Tyr Val
            180                 185                 190
Ser Ser Glu Gln Val 5er Glu Glu Glu Ile Asn His Glu Arg Glu Val
        195                 200                 205
Leu Lys Gln Gln Ala Leu Asn Glu Gly Lys Pro Glu Lys Ile Val Glu
    210                 215                 220
Lys Met Val Glu Gly Arg Leu Arg Lys Tyr Leu Gln Glu Ile Cys Ala
225                 230                 235                 240
Val Asp Gln Asn Phe Val Lys Asn Pro Asp Glu Thr Val Glu Ala Phe
                245                 250                 255
Leu Lys Ala Lys Gly Gly Lys Leu Thr Asp Phe Val Arg Tyr Glu Val
            260                 265                 270
Gly Glu Gly Met Glu Lys Arg Glu Glu Asn Phe Ala Glu Glu Val Lys
        275                 280                 285
Gly Gln Met Lys
    290
<210>27
<211>310
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>27
Met Thr Glu Val Asp Phe Asp Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala
1               5                   10                  15
Gly Met Thr Ala Ala Val Tyr Ala Ser Arg Ala Asn Leu Lys Thr Val
            20                  25                  30
Met Ile Glu Arg Gly Met Pro Gly Gly Gln Met Ala Asn Thr Glu Glu
        35                  40                  45
Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Glu Met Ile Thr Gly Pro Asp Leu Ser
    50                  55                  60
Thr Lys Met Phe Glu His Ala Lys Lys Phe Gly Ala Glu Tyr Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Asp Ile Lys Ser Val Glu Asp Lys Gly Asp Tyr Lys Val Ile Asn
                85                  90                  95
Leu Gly Asn Lys Glu Ile Thr Ala His Ala Val Ile Ile Ser Thr Gly
            100                 105                 110
Ala Glu Tyr Lys Lys Ile Gly Val Pro Gly Glu Gln Glu Leu Gly Gly
        115                 120                 125
Arg Gly Val Ser Tyr Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Phe Phe Lys Asn
    130                 135                 140
Lys Arg Leu Phe Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Val Glu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Thr Phe Leu Thr Lys Phe Ala Asp Lys Val Thr Ile Val His Arg Arg
                165                 170                 175
Asp Glu Leu Arg Ala Gln Asn Ile Leu Gln Glu Arg Ala Phe Lys Asn
            180                 185                 190
Asp Lys Val Asp Phe Ile Trp Ser His Thr Leu Lys Thr Ile Asn Glu
        195                 200                 205
Lys Asp Gly Lys Val Gly Ser Val Thr Leu Glu Ser Thr Lys Asp Gly
    210                 215                 220
Ala Glu Gln Thr Tyr Asp Ala Asp Gly Val Phe Ile Tyr Ile Gly Met
225                 230                 235                 240
Lys Pro Leu Thr Ala Pro Phe Lys Asn Leu Gly Ile Thr Asn Asp Ala
                245                 250                 255
Gly Tyr Ile Val Thr Gln Asp Asp Met Ser Thr Lys Val Arg Gly Ile
            260                 265                 270
Phe Ala Ala Gly Asp Val Arg Asp Lys Gly Leu Arg Gln Ile Val Thr
        275                 280                 285
Ala Thr Gly Asp Gly Ser Ile Ala Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Ile
    290                 295                 300
Thr Glu Leu Lys Asp Asn
305                 310
<210>28
<211>465
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>28
Met Thr Gln Lys Tyr Arg Tyr Pro Thr Phe Leu Glu Ser Ile Ser Thr
1               5                   10                  15
Ile Leu Val Met Val Val Val Val Val Ile Gly Phe Val Phe Phe Asn
            20                  25                  30
Val Pro Ile Gln Ile Leu Leu Leu Ile Ser Ser Ala Tyr Ala Ala Leu
        35                  40                  45
Ile Ala His Arg Val Gly Leu Lys Trp Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile
    50                  55                  60
Thr His Arg Leu Ser Thr Ala Met Pro Ala Ile Phe Ile Ile Leu Ala
65                  70                  75                  80
Val Gly Ile Ile Val Gly Ser Trp Met Tyr Ser Gly Thr Val Pro Ala
                85                  90                  95
Leu Ile Tyr Tyr Gly Leu Lys Phe Leu Asn Pro Ser Tyr Leu Leu Val
            100                 105                 110
Ser Ala Phe Ile Ile Ser Ala Met Thr Ser Ile Ala Thr Gly Thr Ala
        115                 120                 125
Trp Gly Ser Ala Ser Thr Ala Gly Ile Ala Leu Ile Ser Ile Ala Asn
    130                 135                 140
Gln Leu Gly Val Pro Ala Gly Met Ala Ala Gly Ala Ile Ile Ala Gly
145                 150                 155                 160
Ala Val Phe Gly Asp Lys Met Ser Pro Leu Ser Asp Thr Thr Asn Leu
                165                 170                 175
Ala Ala Leu Val Thr Lys Val Asn Ile Phe Ala His Ile Lys Ser Met
            180                 185                 190
Met Trp Thr Thr Ile Pro Ala Ser Ile Ile Gly Leu Ala Ile Trp Phe
        195                 200                 205
Ile Val Gly Leu Gln Tyr Lys Gly Asp Ala Asn Thr Gln Gln Ile Gln
    210                 215                 220
Asn Leu Leu Lys Glu Leu Thr Thr Ile Tyr Asn Leu Asn Phe Trp Val
225                 230                 235                 240
Trp Ile Pro Leu Ile Ile Ile Val Leu Cys Leu Ile Phe Arg Ile Ser
                245                 250                 255
Thr Val Pro Ser Met Leu Ile Ser Ser Ile Ser Ala Leu Val Ile Gly
             260                265                 270
Thr Phe Asp His Gln Phe Asn Met Lys Asp Gly Phe Lys Ala Ser Phe
        275                 280                 285
Asp Gly Phe Asn His Thr Met Leu His Gln Ser His Ile Ser Asp Asn
    290                 295                 300
Ala Lys Thr Leu Ile Glu Gln Gly Gly Met Met Ser Met Thr Gln Ile
305                 310                 315                 320
Ile Val Thr Ile Phe Cys Gly Tyr Ala Phe Ala Gly Ile Val Glu Lys
                325                 330                 335
Ala Gly Cys Leu Asp Val Ile Leu Glu Thr Ile Ala Lys Gly Val Lys
            340                 345                 350
Ser Val Gly Thr Leu Ile Leu Ile Thr Val Val Cys Ser Ile Met Leu
        355                 360                 365
Val Phe Ala Ala Gly Val Ala Ser Ile Val Ile Ile Met Val Gly Val
    370                 375                 380
Leu Met Lys Asp Met Phe Glu Lys Met Asn Val Ser Lys Ser Val Leu
385                 390                 395                 400
Ser Arg Thr Leu Glu Asp Ser Ser Thr Met Val Leu Pro Leu Ile Pro
                405                 410                 415
Trp Gly Thr Ser Gly Ile Tyr Tyr Ala His Gln Leu Asn Val Ser Val
            420                 425                 430
Asp Gln Phe Phe Ile Trp Ala Ile Pro Cys Tyr Leu Cys Ala Phe Ile
        435                 440                 445
Ala Ile Ile Tyr Gly Phe Thr Gly Ile Gly Ile Lys Lys Ile Ser Arg
    450                 455                 460
Lys
465
<210>29
<211>235
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>29
Met Lys Lys Thr Val Ile Ala Ser Thr Leu Ala Val SerLeu Gly Ile
1               5                   10                  15
Ala Gly Tyr Gly Leu Ser Gly His Glu Ala His Ala Ser Glu Thr Thr
            20                  25                  30
Asn Val Asp Lys Ala His Leu Val Asp Leu Ala Gln His Asn Pro Glu
        35                  40                  45
Glu Leu Asn Ala Lys Pro Val Gln Ala Gly Ala Tyr Asp Ile His Phe
    50                  55                  60
Val Asp Asn Gly Tyr Gln Tyr Asn Phe Thr Ser Asn Gly Ser Glu Trp
65                  70                  75                  80
Ser Trp Ser Tyr Ala Val Ala Gly Ser Asp Ala Asp Tyr Thr Glu Ser
                85                  90                  95
Ser Ser Asn Gln Glu Val Ser Ala Asn Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn
            100                 105                 110
Val Gln Ala Val Ser Ala Pro Thr Ser Ser Glu Ser Arg Ser Tyr Ser
        115                 120                 125
Thr Ser Thr Thr Ser Tyr Ser Ala Pro Ser His Asn Tyr Ser Ser His
    130                 135                 140
Ser Ser Ser Val Arg Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ala Gly Ser Val Gly
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Met Ala Ala Arg Thr Gly Val Ser Ala Ser
                165                 170                 175
Thr Trp Glu His Ile Ile Ala Arg Glu Ser Asn Gly Gln Leu His Ala
            180                 185                 190
Arg Asn Ala Ser Gly Ala Ala Gly Leu Phe Gln Thr Met Pro Gly Trp
        195                 200                 205
Gly Ser Thr Gly Ser Val Asn Asp Gln Ile Asn Ala Ala Tyr Lys Ala
    210                 215                 220
Tyr Lys Ala Gln Gly Leu Ser Ala Trp Gly Met
225                 230                 235
<210>30
<211>296
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>30
Met Asn Lys Glu Gln Leu Glu Lys Met Thr His Gly Lys Gly Phe Ile
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Asp Gln Ser Gly Gly Ser Thr Pro Lys Ala Leu Lys Glu
            20                  25                  30
Tyr Gly Val Asn Glu Asp Gln Tyr Ser Asn Glu Asp Glu Met Phe Gln
        35                  40                  45
Leu Val His Asp Met Arg Thr Arg Val Val Thr Ser Pro Ser Phe Ser
    50                  55                  60
Pro Asp Lys Ile Leu Gly Ala Ile Leu Phe Glu Gln Thr Met Asp Arg
65                  70                  75                  80
Glu Val Glu Gly Lys Tyr Thr Gly Asp Tyr Leu Ala Asp Lys Gly Val
                85                  90                  95
Val Pro Phe Leu Lys Val Asp Lys Gly Leu Ala Glu Glu Lys Asn Gly
            100                 105                 110
Val Gln Leu Met Lys Pro Ile Asp Asp Leu Asp Glu Thr Leu Asp Arg
        115                 120                 125
Ala Asn Glu Arg His Ile Phe Gly Thr Lys Met Arg Ser Asn Ile Leu
    130                 135                 140
Glu Leu Asn Glu Gln Gly Ile Lys Asp Val Val Glu Gln Gln Phe Glu
145                 150                 155                 160
Phe Ala Lys Lys Ile Ile Ala Lys Gly Leu Val Pro Ile Ile Glu Pro
                165                 170                 175
Glu Val Asn Ile Asn Ala Lys Asp Lys Ser Glu Ile Glu Lys Val Leu
            180                 185                 190
Lys Ala Glu Ile Lys Lys Gly Leu Asp Ser Leu Asn Asp Asp Gln Leu
        195                 200                 205
Val Met Leu Lys Leu Thr Ile Pro Thr Glu Ala Asn Leu Tyr Lys Asp
    210                 215                 220
Leu Ala Asp His Pro Asn Val Val Arg Val Val Val Leu Ser Gly Gly
225                 230                 235                 240
Tyr Ser Arg Asp Glu Ala Asn Lys Leu Leu Lys Asp Asn Asp Glu Leu
                245                 250                 255
Ile Ala Ser Phe Ser Arg Ala Leu Ala Ser Asp Leu Arg Ala Ser Gln
            260                 265                 270
Ser Gln Glu Glu Phe Asp Lys Ala Leu Gly Asp Ala Val Asp Ser Ile
        275                 280                 285
Tyr Asp Ala Ser Val Asn Lys Asn
    290                 295
<210>31
<211>263
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>31
Leu Lys Glu Arg Phe Ile Lys Lys Thr His Tyr Leu Asp Tyr Gln Phe
1               5                   10                  15
Asp Glu Pro Thr Asp Ile Lys Leu Gly Phe Thr Thr Arg Glu Asn Gly
            20                  25                  30
Leu Ser Pro Tyr Pro Asn His Ser Phe Asn Met Ala Arg Tyr Ile Ser
        35                  40                  45
Asp Ser Ala His His Ile Thr His His Gln Asp Ile Leu Ala Asn Leu
    50                  55                  60
Ile Gly Tyr Pro Arg Asp Glu Trp Val Phe Pro Ile Gln Thr His Asp
65                  70                  75                  80
Ser Arg Ile Val Glu Val Thr Ser Glu His Lys Gly Thr Asn Ile Asp
                85                 90                 95
Glu Leu Thr Asp Asp Leu His Gly Ile Asp Gly Met Tyr Thr Phe Asp
            100                 105                 110
Ser His Ile Leu Leu Thr Met Cys Tyr Ala Asp Cys Val Pro Val Tyr
        115                 120                 125
Phe Tyr Ser Glu Pro His Gly Tyr Ile Gly Leu Ala His Ala Gly Trp
    130                 135                 140
Arg Gly Thr Tyr Gly Gln Ile Val Lys Asp Met Leu Lys Lys Val Asp
145                 150                 155                 160
Phe Asp Tyr Glu Asp Leu Lys Ile Val Ile Gly Pro Ala Thr Ser Asn
                165                 170                 175
Ser Tyr Glu Ile Asn Asp Asp Ile Lys Asn Lys Phe Glu Glu Leu Thr
            180                 185                 190
Ile Asp Ser Thr Leu Tyr Ile Glu Thr Arg Gly Lys Asn Gln His Gly
        195                 200                 205
Ile Asp Leu Lys Asn Ala Asn Ala Leu Leu Leu Glu Glu Ala Gly Val
    210                 215                 220
Pro Ser Lys Asn Ile Tyr Val Thr Glu Tyr Ala Ihr Ser Glu Asn Leu
225                 230                 235                 240
Asp Leu Phe Phe Ser Tyr Arg Val Glu Lys Gly Gln Thr Gly Arg Met
                245                 250                 255
Leu Ala Phe Ile Gly Arg Lys
            260
<210>32
<211>10203
<212>PRT
<213>表皮葡萄球菌
<400>32
Met Lys Ser Lys Pro Lys Leu Asn Gly Arg Asn Ile Cys Ser Phe Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Lys Cys Met Ser Tyr Ser Leu Ser Lys Leu Ser Thr Leu Lys
            20                  25                  30
Thr Tyr Asn Phe Gln Ile Thr Ser Asn Asn Lys Glu Lys Thr Ser Arg
        35                  40                  45
Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Asn Asn Arg Asp Lys Leu Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Ser Ile Arg Lys Tyr Ala Ile Gly Thr Phe Ser Thr Val Ile Ala Thr
65                  70                  75                  80
Leu Val Phe Met Gly Ile Asn Thr Asn His Ala Ser Ala Asp Glu Leu
                85                  90                  95
Asn Gln Asn Gln Lys Leu Ile Lys Gln Leu Asn Gln Thr Asp Asp Asp
            100                 105                 110
Asp Ser Asn Thr His Ser Gln Glu Ile Glu Asn Asn Lys Gln Asn Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Gln Thr Glu Ser Leu Arg Ser Ser Thr Ser Gln Asn Gln Ala
    130                 135                 140
Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Glu Thr Ser Gln
145                 150                 155                 160
Gln Leu Pro Thr Asn Val Ser Asp Asp Ser Ile Asn Gln Ser His Ser
                165                 170                 175
Glu Ala Asn Met Asn Asn Glu Pro Leu Lys Val Asp Asn Ser Thr Met
            180                 185                 190
Gln Ala His Ser Lys Ile Val Ser Asp Ser Asp Gly Asn Ala Ser Glu
        195                 200                 205
Asn Lys His His Lys Leu Thr Glu Asn Val Leu Ala Glu Ser Arg Ala
    210                 215                 220
Ser Lys Asn Asp Lys Glu Lys Glu Asn Leu Gln Glu Lys Asp Lys Ser
225                 230                 235                 240
Gln Gln Val His Pro Pro Leu Asp Lys Asn Ala Leu Gln Ala Phe Phe
                245                 250                 255
Asp Ala Ser Tyr His Asn Tyr Arg Met Ile Asp Arg Asp Arg Ala Asp
            260                 265                 270
Ala Thr Glu Tyr Gln Lys Val Lys Ser Thr Phe Asp Tyr Val Asn Asp
        275                 280                 285
Leu Leu Gly Asn Asn Gln Asn Ile Pro Ser Glu Gln Leu Val Ser Ala
    290                 295                 300
Tyr Gln Gln Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Ala Arg Thr Leu Ser Gln
305                 310                 315                 320
Arg Ser Thr Thr Glu Lys Arg Gly Arg Arg Ser Thr Arg Ser Val Val
                325                 330                 335
Glu Asn Arg Ser Ser Arg Ser Asp Tyr Leu Asp Ala Arg Thr Glu Tyr
            340                 345                 350
Tyr Val Ser Lys Asp Asp Asp Asp Ser Gly Phe Pro Pro Gly Thr Phe
        355                 360                 365
Phe His Ala Ser Asn Arg Arg Trp Pro Tyr Asn Leu Pro Arg Ser Arg
    370                 375                 380
Asn Ile Leu Arg Ala 5er Asp Val Gln Gly Asn Ala Tyr Ile Thr Thr
385                 390                 395                 400
Lys Arg Leu Lys Asp Gly Tyr Gln Trp Asp Ile Leu Phe Asn Ser Asn
                405                 410                 415
His Lys Gly His Glu Tyr Met Tyr Tyr Trp Phe Gly Leu Pro Ser Asp
            420                 425                 430
Gln Thr Pro Thr Gly Pro Val Thr Phe Thr Ile Ile Asn Arg Asp Gly
        435                 440                 445
Ser Ser Thr Ser Thr Gly Gly val Gly Phe Gly Ser Gly Ala Pro Leu
    450                 455                 460
Pro Gln Phe Trp Arg Ser Ala Gly Ala Ile Asn Ser Ser Val Ala Asn
465                 470                 475                 480
Asp Phe Lys His Gly Ser Ala Thr Asn Tyr Ala Phe Tyr Asp Gly Val
                485                 490                 495
Asn Asn Phe Ser Asp Phe Ala Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Phe Asp Arg
            500                 505                 510
Glu Gly Ala Thr Gln Thr Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Glu Asn Phe Ala
        515                 520                 525
Leu Leu Asn Ser Glu Lys Pro Asp Gln Ile Arg Gly Leu Asp Thr Ile
    530                 535                 540
Tyr Ser Phe Lys Gly Ser Gly Asp Val Ser Tyr Arg Ile Ser Phe Lys
545                 550                 555                 560
Thr Gln Gly Ala Pro Thr Ala Arg Leu Tyr Tyr Ala Ala Gly Ala Arg
                565                 570                 575
Ser Gly Glu Tyr Arg Gln Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Leu Tyr Val Glu
            580                 585                 590
Pro Tyr Lys Asn Tyr Arg Asn Arg Val Gln Ser Asn Val Gl nVal Lys
        595                 600                 605
Asn Arg Thr Leu His Leu Lys Arg Thr Ile Arg Gln Phe Asp Pro Thr
    610                 615                 620
Leu Gln Arg Thr Thr Asp Val Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly
625                 630                 635                 640
Ser Ile Asp Ser Val Tyr Asp Pro Leu Ser Tyr Val Lys Asn Val Thr
                645                 650                 655
Gly Thr Val Leu Gly Ile Tyr Pro Ser Tyr Leu Pro Tyr Asn Gln Glu
            660                 665                 670
Arg Trp Gln Gly Ala Asn Ala Met Asn Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu
        675                 680                 685
Phe Ser Gln Glu Asn Leu Gln Asn Ala Ala Arg Ser Gly Arg Pro Ile
    690                 695                 700
Gln Phe Leu Val Gly Phe Asp Val Glu Asp Ser His His Asn Pro Glu
705                 710                 715                 720
Thr Leu Leu Pro Val Asn Leu Tyr Val Lys Pro Glu Leu Lys His Thr
                725                 730                 735
Ile Glu Leu Tyr His Asp Asn Glu Lys Gln Asn Arg Lys Glu Phe Ser
            740                 745                 750
Val Ser Lys Arg Ala Gly His Gly Val Phe Gln Ile Met Ser Gly Thr
        755                 760                 765
Leu His Asn Thr Val Gly Ser Gly Ile Leu Pro Tyr Gln Gln Glu Ile
    770                 775                 780
Arg Ile Lys Leu Thr Ser Asn Glu Pro Ile Lys Asp Ser Glu Trp Ser
785                 790                 795                 800
Ile Thr Gly Tyr Pro Asn Thr Leu Thr Leu Gln Asn Ala Val Gly Arg
                805                 810                 815
Thr Asn Asn Ala Thr Glu Lys Asn Leu Ala Leu Val Gly His Ile Asp
            820                 825                 830
Pro Gly Asn Tyr Phe Ile Thr Val Lys Phe Gly Asp Lys Val Glu Gln
        835                 840                 845
Phe Glu Ile Arg Ser Lys Pro Thr Pro Pro Arg Ile Ile Thr Thr Ala
    850                 855                 860
Asn Glu Leu Arg Gly Asn Pro Asn His Lys Pro Glu Ile Arg Val Thr
865                 870                 875                 880
Asp Ile Pro Asn Asp Thr Thr Ala Lys Ile Lys Leu Val Met Gly Gly
                885                 890                 895
Thr Asp Gly Asp His Asp Pro Glu Ile Asn Pro Tyr Thr Val Pro Glu
            900                 905                 910
Asn Tyr Thr Val Val Ala Glu Ala Tyr His Asp Asn Asp Pro Ser Lys
        915                 920                 925
Asn Gly Val Leu Thr Phe Arg Ser Ser Asp Tyr Leu Lys Asp Leu Pro
    930                 935                 940
Leu Ser Gly Glu Leu Lys Ala Ile Val Tyr Tyr Asn Gln Tyr Val Gln
945                 950                 955                 960
Ser Asn Phe Ser Asn Ser Val Pro Phe Ser Ser Asp Thr Thr Pro Pro
                965                 970                 975
Thr Ile Asn Glu Pro Ala Gly Leu Val His Lys Tyr Tyr Arg Gly Asp
            980                 985                 990
His Val Glu Ile Thr Leu Pro Val  Thr Asp Asn Thr Gly  Gly Ser Gly
        995                 1000                 1005
Leu Arg  Asp Val Asn Val Asn  Leu Pro Gln Gly Trp  Thr Lys Thr
    1010                 1015                 1020
Phe Thr  Ile Asn Pro Asn Asn  Asn Thr Glu Gly Thr  Leu Lys Leu
    1025                 1030                 1035
Ile Gly  Asn Ile Pro Ser Asn  Glu Ala Tyr Asn Thr  Thr Tyr His
    1040                 1045                 1050
Phe Asn  Ile Thr Ala Thr Asp  Asn Ser Gly Asn Thr  Thr Asn Pro
    1055                 1060                 1065
Ala Lys  Thr Phe Ile Leu Asn  Val Gly Lys Leu Ala  Asp Asp Leu
    1070                 1075                 1080
Asn Pro  Val Gly Leu Ser Arg  Asp Gln Leu Gln Leu  Val Thr Asp
    1085                 1090                 1095
Pro Ser  Ser Leu Ser Asn Ser  Glu Arg Glu Glu Val  Lys Arg Lys
    1100                 1105                 1110
Ile Ser  Glu Ala Asn Ala Asn  Ile Arg Ser Tyr Leu  Leu Gln Asn
    1115                 1120                 1125
Asn Pro  Ile Leu Ala Gly Val  Asn Gly Asp Val Thr  Phe Tyr Tyr
    1130                 1135                 1140
Arg Asp  Gly Ser Val Asp Val  Ile Asp Ala Glu Asn  Val Ile Thr
    1145                 1150                 1155
Tyr Glu  Pro Glu Arg Lys Ser  Ile Phe Ser Glu Asn  Gly Asn Thr
    1160                 1165                 1170
Asn Lys  Lys Glu Ala Val Ile  Thr Ile Ala Arg Gly  Gln Asn Tyr
    1175                 1180                 1185
Thr Ile  Gly Pro Asn Leu Arg  Lys Tyr Phe Ser Leu  Ser Asn Gly
    1190                 1195                 1200
Ser Asp  Leu Pro Asn Arg Asp  Phe Thr Ser Ile Ser  Ala Ile Gly
    1205                 1210                 1215
Ser Leu  Pro Ser Ser Ser Glu  Ile Ser Arg Leu Asn  Val Gly Asn
    1220                 1225                 1230
Tyr Asn  Tyr Arg Val Asn Ala  Lys Asn Ala Tyr His  Lys Thr Gln
    1235                 1240                 1245
Gln Glu  Leu Asn Leu Lys Leu  Lys Ile Val Glu Val  Asn Ala Pro
    1250                 1255                 1260
Thr Gly  Asn Asn Arg Val Tyr  Arg Val Ser Thr Tyr  Asn Leu Thr
    1265                 1270                 1275
Asn Asp  Glu Ile Asn Lys Ile  Lys Gln Ala Phe Lys  Ala Ala Asn
    1280                 1285                 1290
Ser Gly  Leu Asn Leu Asn Asp  Asn Asp Ile Thr Val  Ser Asn Asn
    1295                 1300                 1305
Phe Asp  His Arg Asn Val Ser  Ser Val Thr Val Thr  Ile Arg Lys
    1310                 1315                 1320
Gly Asp  Leu Ile Lys Glu Phe  Ser Ser Asn Leu Asn  Asn Met Asn
    1325                 1330                 1335
Phe Leu  Arg Trp Val Asn Ile  Arg Asp Asp Tyr Thr  Ile Ser Trp
    1340                 1345                 1350
Thr Ser  Ser Lys Ile Gln Gly  Arg Asn Thr Asp Gly  Gly Leu Glu
    1355                 1360                 1365
Trp Ser  Pro Asp His Lys Ser  Leu Ile Tyr Lys Tyr  Asp Ala Thr
    1370                 1375                 1380
Leu Gly  Arg Gln Ile Asn Thr  Asn Asp Val Leu Thr  Leu Leu Gln
    1385                 1390                 1395
Ala Thr  Ala Lys Asn Ser Asn  Leu Arg Ser Asn Ile  Asn Ser Asn
    1400                 1405                 1410
Glu Lys  Gln Leu Ala Glu Arg  Gly Ser Asn Gly Tyr  Ser Lys Ser
    1415                 1420                 1425
Ile Ile  Arg Asp Asp Gly Glu  Lys Ser Tyr Leu Leu  Asn Ser Asn
    1430                 1435                 1440
Pro Ile  Gln Val Leu Asp Leu  Val Glu Pro Asp Asn  Gly Tyr Gly
    1445                 1450                 1455
Gly Arg  Gln Val Ser His Ser  Asn Val Ile Tyr Asn  Glu Lys Asn
    1460                 1465                 1470
Ser Ser  Ile Val Asn Gly Gln  Val Pro Glu Ala Asn  Gly Ala Ser
    1475                 1480                 1485
Ala Phe  Asn Ile Asp Lys Val  Val Lys Ala Asn Ala  Ala Asn Asn
    1490                 1495                 1500
Gly Ile  Met Gly Val Ile Tyr  Lys Ala Gln Leu Tyr  Leu Ala Pro
    1505                 1510                 1515
Tyr Ser  Pro L ys Gly Tyr Ile  Glu Lys Leu Gly Gln  Asn Leu Ser
    1520                 1525                 1530
Asn Thr  Asn Asn Val Ile Asn  Val Tyr Phe Val Pro  Ser Asp Lys
    1535                 1540                 1545
Val Asn  Pro Ser Ile Thr Val  Gly Asn Tyr Asp His  His Thr Val
    1550                 1555                 1560
Tyr Ser  Gly Glu Thr Phe Lys  Asn Thr Ile Asn Val  Asn Asp Asn
    1565                 1570                 1575
Tyr Gly  Leu Asn Thr Val Ala  Ser Thr Ser Asp Ser  Ala Ile Thr
    1580                 1585                 1590
Met Thr  Arg Asn Asn Asn Glu  Leu Val Gly Gln Ala  Pro Asn Val
    1595                 1600                 1605
Thr Asn  Ser Thr Asn Lys Ile  Val Lys Val Lys Ala  Thr Asp Lys
    1610                 1615                 1620
Ser Gly  Asn Glu Ser Ile Val  Ser Phe Thr Val Asn  Ile Lys Pro
    1625                 1630                 1635
Leu Asn  Glu Lys Tyr Arg Ile  Thr Thr Ser Ser Ser  Asn Gln Thr
    1640                 1645                 1650
Pro Val  Arg Ile Ser Asn Ile  Gln Asn Asn Ala Asn  Leu Ser Ile
    1655                 1660                 1665
Glu Asp  Gln Asn Arg Val Lys  Ser Ser Leu Ser Met  Thr Lys Ile
    1670                 1675                 1680
Leu Gly  Thr Arg Asn Tyr Val  Asn Glu Ser Asn Asn  Asp Val Arg
    1685                 1690                 1695
Ser Gln  Val Val Ser Lys Val  Asn Arg Ser Gly Asn  Asn Ala Thr
    1700                 1705                 1710
Val Asn  Val Thr Thr Thr Phe  Ser Asp Gly Thr Thr  Asn Thr Ile
    1715                 1720                 1725
Thr Val  Pro Val Lys His Val  Leu Leu Glu Val Val  Pro Thr Thr
    1730                 1735                 1740
Arg Thr  Thr Val Arg Gly Gln  Gln Phe Pro Thr Gly  Lys Gly Thr
    1745                 1750                 1755
Ser Pro  Asn Asp Phe Phe Ser  Leu Arg Thr Gly Gly  Pro Val Asp
    1760                 1765                 1770
Al a Arg  Il e Val Trp Val Asn  Asn Gl n Gl y Pro Asp  Il e Asn Ser
    1775                 1780                 1785
Asn Gln  Ile Gly Arg Asp Leu  Thr Leu His Ala Glu  Ile Phe Phe
    1790                 1795                 1800
    Asp Gly  Glu Thr Thr Pro Ile  Arg Lys Asp Thr Thr  Tyr Lys Leu
    1805                 1810                 1815
Ser Gln  Ser Ile Pro Lys Gln  Ile Tyr Glu Thr Thr  Ile Asn Gly
    1820                 1825                 1830
Arg Phe  Asn Ser Ser Gly Asp  Ala Tyr Pro Gly Asn  Phe Val Gln
    1835                 1840                 1845
Ala Val  Asn Gln Tyr Trp Pro  Glu His Met Asp Phe  Arg Trp Ala
    1850                 1855                 1860
G1n Gly  Ser Gly Thr Pro Ser  Ser Arg Asn Ala Gly  Ser Phe Thr
    1865                 1870                 1875
    Lys Thr  Val Thr Val Val Tyr  Gln Asn Gly Gln Thr  Glu Asn Val
    1880                 1885                 1890
Asn Val  Leu Phe Lys Val Lys  Pro Asn Lys Pro Val  Ile Asp Ser
    1895                 1900                 1905
Asn Ser  Val Ile Ser Lys Gly  Gln Leu Asn Gly Gln  Gln Ile Leu
    1910                 1915                 1920
Val Arg  Asn Val Pro Gln Asn  Ala Gln Val Thr Leu  Tyr Gln Ser
    1925                 1930                 1935
Asn Gly  Thr Val Ile Pro Asn  Thr Asn Thr Thr Ile  Asp Ser Asn
    1940                 1945                 1950
Gly Ile  Ala Thr Val Thr Ile  Gln Gly Thr Leu Pro  Thr Gly Asn
    1955                 1960                 1965
Ile Thr  Ala Lys Thr Ser Met  Thr Asn Asn Val Thr  Tyr Thr Lys
    1970                 1975                 1980
Gln Asn  Ser Ser Gly Ile Ala  Ser Asn Thr Thr Glu  Asp Ile Ser
    1985                 1990                 1995
Val Phe  Ser Glu Asn Ser Asp  Gln Val Asn Val Thr  Ala Gly Met
    2000                 2005                 2010
Gln Ala  Lys Asn Asp Gly Ile  Lys Ile Ile Lys Gly  Thr Asn Tyr
    2015                 2020                 2025
Asn Phe  Asn Asp Phe Asn Ser  Phe Ile Ser Asn Ile  Pro Ala His
    2030                 2035                 2040
Ser Thr  Leu Thr Trp Asn Glu  Glu Pro Asn Ser Trp  Lys Asn Asn
    2045                 20502055
Ile Gly  Thr Thr Thr Lys Thr  Val Thr Val Thr Leu  Pro Asn His
    2060                 2065                 2070
Gln Gly  Thr Arg Thr Val Asp  Ile Pro Ile Thr Ile  Tyr Pro Thr
    2075                 2080                 2085
Val Thr  Ala Lys Asn Pro Val  Arg Asp Gln Lys Gly  Arg Asn Leu
    2090                 2095                 2100
Thr Asn  Gly Thr Asp Val Tyr  Asn Tyr Ile Ile Phe  Glu Asn Asn
    2105                 2110                 2115
Asn Arg  Leu Gly Gly Thr Ala  Ser Trp Lys Asp Asn  Arg Gln Pro
    2120                 2125                 2130
Asp Lys  Asn Ile Ala Gly Val  Gln Asn Leu Ile Ala  Leu Val Asn
    2135                 2140                 2145
Tyr Pro  Gly Ile Ser Thr Pro  Leu Glu Val Pro Val  Lys Val Trp
    2150                 2155                 2160
Val Tyr  Asn Phe Asp Phe Thr  Gln Pro Ile Tyr Lys  Ile Gln Val
    2165                 2170                 2175
Gly Asp  Thr Phe Pro Lys Gly  Thr Trp Ala Gly Tyr  Tyr Lys His
    2180                 2185                 2190
Leu Glu  Asn Gly Glu Gly Leu  Pro Ile Asp Gly Trp  Lys Phe Tyr
    2195                 2200                 2205
Trp Asn  Gln Gln Ser Thr Gly  Thr Thr Ser Asp Gln  Trp Gln Ser
    2210                 2215                 2220
Leu Ala  Tyr Thr Arg Thr Pro  Phe Val Lys Thr Gly  Thr Tyr Asp
    2225                 2230                 2235
Val Val  Asn Pro Ser Asn Trp  Gly Val Trp Gln Thr  Ser Gln Ser
    2240                 2245                 2250
Ala Lys  Phe Ile Val Thr Asn  Ala Lys Pro Asn Gln  Pro Thr Ile
    2255                 2260                 2265
Thr Gln  Ser Lys Thr Gly Asp  Val Thr Val Thr Pro  Gly Ala Val
    2270                 2275                 2280
Arg Asn  Ile Leu Ile Ser Gly  Thr Asn Asp Tyr Ile  Gln Ala Ser
    2285                 2290                 2295
Ala Asp  Lys Ile Val Ile Asn  Lys Asn Gly Asn Lys  Leu Thr Thr
    2300                2305                  2310
Phe Val  Lys Asn Asn Asp Gly  Arg Trp Thr Val Glu  Thr Gly Ser
    2315                 2320                 2325
Pro Asp  Ile Asn Gly Ile Gly  Pro Thr Asn Asn Gly  Thr Ala Ile
    2330                 2335                 2340
Ser Leu  Ser Arg Leu Ala Val  Arg Pro Gly Asp Ser  Ile Glu Ala
    2345                 2350                 2355
Ile Ala  Thr Glu Gly Ser Gly  Glu Thr Ile Ser Thr  Ser Ala Thr
    2360                 2365                 2370
Ser Glu  Ile Tyr Ile Val Lys  Ala Pro Gln Pro Glu  Gln Val Ala
    2375                 2380                 2385
Thr His  Thr Tyr Asp Asn Gly  Thr Phe Asp Ile Leu  Pro Asp Asn
    2390                 2395                 2400
Ser Arg  Asn Ser Leu Asn Pro  Thr Glu Arg Val Glu  Ile Asn Tyr
    2405                 2410                 2415
Thr Glu  Lys Leu Asn Gly Asn  Glu Thr Gln Lys Ser  Phe Thr Ile
    2420                 2425                 2430
Thr Lys  Asn Asn Asn Gly Lys  Trp Thr Ile Asn Asn  Lys Pro Asn
    2435                 2440                 2445
Tyr Val  Glu Phe Asn Gln Asp  Asn Gly Lys Val Val  Phe Ser Ala
    2450                 2455                 2460
Asn Thr  Ile Lys Pro Asn Ser  Gln Ile Thr Ile Thr  Pro Lys Ala
    2465                 2470                 2475
Gly Gln  Gly Asn Thr Glu Asn  Thr Asn Pro Thr Val  Ile Gln Ala
    2480                 2485                 2490
Pro Ala  Gln His Thr Leu Thr  Ile Asn Glu Ile Val  Lys Glu Gln
    2495                 2500                 2505
Gly Gln  Asn Val Thr Asn Asp  Asp Ile Asn Asn Ala  Val Gln Val
    2510                 2515                 2520
Pro Asn  Lys Asn Arg Val Ala  Ile Lys Gln Gly Asn  Ala Leu Pro
    2525                 2530                 2535
Thr Asn  Leu Ala Gly Gly Ser  Thr Ser His Ile Pro  Val Val Ile
    2540                 2545                 2550
Tyr Tyr  Ser Asp Gly Ser Ser  Glu Glu Ala Thr Glu  Thr Val Arg
    2555                 2560                 2565
Thr Lys  Val Asn Lys Thr Glu  Leu Ile Asn Ala Arg  Arg Arg Leu
    2570                 2575                 2580
Asp Glu  Glu Ile Ser Lys Glu  Asn Lys Thr Pro Ser  Ser Ile Arg
    2585                 2590                 2595
Asn Phe  Asp Gln Ala Met Asn  Arg Ala Gln Ser Gln  Ile Asn Thr
    2600                 2605                 2610
Ala Lys  Ser Asp Ala Asp Gln  Val Ile Gly Thr Glu  Phe Ala Thr
    2615                 2620                 2625
Pro Gln  Gln Val Asn Ser Ala  Leu Ser Lys Val Gln  Ala Ala Gln
    2630                 2635                 2640
Asn Lys  Ile Asn Glu Ala Lys  Ala Leu Leu Gln Asn  Lys Ala Asp
    2645                 2650                 2655
Asn Ser  Gln Leu Val Arg Ala  Lys Glu Gln Leu Gln  Gln Ser Ile
    2660                 2665                 2670
Gln Pro  Ala Ala Ser Thr Asp  Gly Met Thr Gln Asp  Ser Thr Arg
    2675                 2680                 2685
Asn Tyr  Lys Asn Lys Arg Gln  Ala Ala Glu Gln Ala  Ile Gln His
    2690                 2695                 2700
Ala Asn  Ser Val Ile Asn Asn  Gly Asp Ala Thr Ser  Gln Gln Ile
    2705                 2710                 2715
Asn Asp  Ala Lys Asn Thr Val  Glu Gln Ala Gln Arg  Asp Tyr Val
    2720                 2725                 2730
Glu Ala  Lys Ser Asn Leu Arg  Ala Asp Lys Ser Gln  Leu Gln Ser
    2735                 2740                 2745
Ala Tyr  Asp Thr Leu Asn Arg  Asp Val Leu Thr Asn  Asp Lys Lys
    2750                 2725                 2760
Pro Ala  Ser Val Arg Arg Tyr  Asn Glu Ala Ile Ser  Asn Ile Arg
    2765                 2770                 2775
Lys Glu  Leu Asp Thr Ala Lys  Ala Asp Ala Ser Ser  Thr Leu Arg
    2780                 2785                 2790
Asn Thr  Asn Pro Ser Val Glu  Gln Val Arg Asp Ala  Leu Asn Lys
    2795                 2800                 2805
Ile Asn  Thr Val Gln Pro Lys  Val Asn Gln Ala Ile  Ala Leu Leu
    2810                 2815                 2820
Gln Pro  Lys Glu Asn Asn Ser  Glu Leu Val Gln Ala  Lys Lys Arg
    2825                 2830                 2835
Leu Gln  Asp Ala Val Asn Asp  Ile Pro Gln Thr Gln  Gly Met Thr
    2840                 2845                 2850
Gln Gln  Thr Ile Asn Asn Tyr  Asn Asp Lys Gln Arg  Glu Ala Glu
    2855                 2860                 2865
Arg Ala  Leu Thr Ser Ala Gln  Arg Val Ile Asp Asn  Gly Asp Ala
    2870                 2875                 2880
Thr Thr  Gln Glu Ile Thr Ser  Glu Lys Ser Lys Val  Glu Gln Ala
    2885                 2890                 2895
Met Gln  Ala Leu Thr Asn Ala  Lys Ser Asn Leu Arg  Ala Asp Lys
    2900                 2905                 2910
Asn Glu  Leu Gln Thr Ala Tyr  Asn Lys Leu Ile Glu  Asn Val Ser
    2915                 2920                 2925
Thr Asn  Gly Lys Lys Pro Ala  Ser Ile Arg Gln Tyr  Glu Thr Ala
    2930                 2935                 2940
Lys Ala  Arg Ile Gln Asn Gln  Ile Asn Asp Ala Lys  Asn Glu Ala
    2945                 2950                 2955
Glu Arg  Ile Leu Gly Asn Asp  Asn Pro Gln Val Ser  Gln Val Thr
    2960                 2965                 2970
Gln Ala  Leu Asn Lys Ile Lys  Ala Ile Gln Pro Lys  Leu Thr Glu
    2975                 2980                 2985
Ala Ile  Asn Met Leu Gln Asn  Lys Glu Asn Asn Thr  Glu Leu Val
    2990                 2995                 3000
Asn Ala  Lys Asn Arg Leu Glu  Asn Ala Val Asn Asp  Thr Asp Pro
    3005                 3010                 3015
Thr His Gly Met Thr Gln Glu  Thr Ile Asn Asn Tyr  Asn Ala Lys
    3020                 3025                 3030
Lys Arg  Glu Ala Gln Asn Glu  Ile Gln Lys Ala Asn  Met Ile Ile
    3035                 3040                 3045
Asn Asn  Gly Asp Ala Thr Ala  Gln Asp Ile Ser Ser  Glu Lys Ser
    3050                 3055                 3060
Lys Val  Glu Gln Val Leu Gln  Ala Leu Gln Asn Ala  Lys Asn Asp
    3065                 3070                 3075
Leu Arg  Ala Asp Lys Arg Glu  Leu Gln Thr Ala Tyr  Asn Lys Leu
    3080                 3085                 3090
Ile Gln  Asn Val Asn Thr Asn  Gly Lys Lys Pro Ser  Ser Ile Gln
    3095                 3100                 3105
Asn Tyr  Lys Ser Ala Arg Arg  Asn Ile Glu Asn Gln  Tyr Asn Thr
    3110                 3115                 3120
Ala Lys  Asn Glu Ala His Asn  Val Leu Glu Asn Thr  Asn Pro Thr
    3125                 3130                 3135
Val Asn  Ala Val Glu Asp Ala  Leu Arg Lys Ile Asn  Ala Ile Gln
    3140                 3145                 3150
Pro Glu  Val Thr Lys Ala Ile  Asn Ile Leu Gln Asp  Lys Glu Asp
    3155                 3160                 3165
Asn Ser  Glu Leu Val Arg Ala  Lys Glu Lys Leu Asp  Gln Ala Ile
    3170                 3175                 3180
Asn Ser  Gln Pro Ser Leu Asn  Gly Met Thr Gln Glu  Ser Ile Asn
    3185                 3190                 3195
Asn Tyr  Thr Thr Lys Arg Arg  Glu Ala Gln Asn Ile  Ala Ser Ser
    3200                 3205                 3210
Ala Asp  Thr Ile Ile Asn Asn  Gly Asp Ala Ser Ile  Glu Gln Ile
    3215                 3220                 3225
Thr Glu  Asn Lys Ile Arg Val  Glu Glu Ala Thr Asn  Ala Leu Asn
    3230                 3235                 3240
Glu Ala  Lys Gln His Leu Thr  Ala Asp Thr Thr Ser  Leu Lys Thr
    3245                 3250                 3255
Glu Val  Arg Lys Leu Ser Arg  Arg Gly Asp Thr Asn  Asn Lys Lys
    3260                 3265                 3270
Pro Ser  Ser Val Ser Ala Tyr  Asn Asn Thr Ile His  Ser Leu Gln
    3275                 3280                 3285
Ser Glu  Ile Thr Gln Thr Glu  Asn Arg Ala Asn Thr  Ile Ile Asn
    3290                 3295                 3300
Lys Pro  Ile Arg Ser Val Glu  Glu Val Asn Asn Ala  Leu His Glu
    3305                 3310                 3315
Val Asn  Gln Leu Asn Gln Arg  Leu Thr Asp Thr Ile  Asn Leu Leu
    3320                 3325                 3330
Gln Pro  Leu Ala Asn Lys Glu  Ser Leu Lys Glu Ala  Arg Asn Arg
    3335                 3340                 3345
Leu Glu  Ser Lys Ile Asn Glu  Thr Val Gln Thr Asp  Gly Met Thr
    3350                 3355                 3360
Gln Gln  Ser Val Glu Asn Tyr  Lys Gln Ala Lys Ile  Lys Ala Gln
    3365                 3370                 3375
Asn Glu  Ser Ser Ile Ala Gln  Thr Leu Ile Asn Asn  Gly Asp Ala
    3380                 3385                 3390
Ser Asp  Gln Glu Val Ser Thr  Glu Ile Glu Lys Leu  Asn Gln Lys
    3395                 3400                 3405
Leu Ser  Glu Leu Thr Asn Ser  Ile Asn His Leu Thr  Val Asn Lys
    3410                 3415                 3420
Glu Pro  Leu Glu Thr Ala Lys  Asn Gln Leu Gln Ala  Asn Ile Asp
    3425                 3430                 3435
Gln Lys  Pro Ser Thr Asp Gly  Met Thr Gln Gln Ser  Val Gln Ser
    3440                 3445                 3450
Tyr Glu  Arg Lys Leu Gln Glu  Ala Lys Asp Lys Ile  Asn Ser Ile
    3455                 3460                 3465
Asn Asn  Val Leu Ala Asn Asn  Pro Asp Val Asn Ala  Ile Arg Thr
    3470                 3475                 3480
Asn Lys  Val Glu Thr Glu Gln  Ile Asn Asn Glu Leu  Thr Gln Ala
    3485                 3490                 3495
Lys Gln  Gly Leu Thr Val Asp  Lys Gln Pro Leu Ile  Asn Ala Lys
    3500                 3505                 3510
Thr Ala  Leu Gln Gln Ser Leu  Asp Asn Gln Pro Ser  Thr Thr Gly
    3515                 3520                 3525
Met Thr  Glu Ala Thr Ile Gln  Asn Tyr Asn Ala Lys  Arg Gln Lys
    3530                 3535                 3540
Ala Glu  Gln Val Ile Gln Asn  Ala Asn Lys Ile Ile  Glu Asn Ala
    3545                 3550                 3555
Gln Pro  Ser Val Gln Gln Val  Ser Asp Glu Lys Ser  Lys Val Glu
    3560                 3565                 3570
Gln Ala  Leu Ser Glu Leu Asn  Asn Ala Lys Ser Ala  Leu Arg Ala
    3575                 3580                 3585
Asp Lys  Gln Glu Leu Gln Gln  Ala Tyr Asn Gln Leu  Ile Gln Pro
    3590                 3595                 3600
Thr Asp  Leu Asn Asn Lys Lys  Pro Ala Ser Ile Thr  Ala Tyr Asn
    3605                 3610                 3615
Gln Arg  Tyr Gln Gln Phe Ser  Asn Glu Leu Asn Ser  Thr Lys Thr
    3620                 3625                 3630
Asn Thr  Asp Arg Ile Leu Lys  Glu Gln Asn Pro Ser  Val Ala Asp
    3635                 3640                 3645
Val Asn  Asn Ala Leu Asn Lys  Val Arg Glu Val Gln  Gln Lys Leu
    3650                 3655                 3660
Asn Glu  Ala Arg Ala Leu Leu  Gln Asn Lys Glu Asp  Asn Ser Ala
    3665                 3670                 3675
Leu Val  Arg Ala Lys Glu Gln  Leu Gln Gln Ala Val  Asp Gln Val
    3680                 3685                 3690
Pro Ser  Thr Glu Gly Met Thr  Gln Gln Thr Lys Asp  Asp Tyr Asn
    3695                 3700                 3705
Ser Lys  Gln Gln Ala Ala Gln  Gln Glu Ile Ser Lys  Ala Gln Gln
    3710                 3715                 3720
Val Ile  Asp Asn Gly Asp Ala  Thr Thr Gln Gln Ile  Ser Asn Ala
    3725                 3730                 3735
Lys Thr  Asn Val Glu Arg Ala  Leu Glu Ala Leu Asn  Asn Ala Lys
    3740                 3745                 3750
Thr Gly  Leu Arg Ala Asp Lys  Glu Glu Leu Gln Asn  Ala Tyr Asn
    3755                 3760                 3765
Gln Leu  Thr Gln Asn Ile Asp  Thr Ser Gly Lys Thr  Pro Ala Ser
    3770                 3775                 3780
Ile Arg  Lys Tyr Asn Glu Ala  Lys Ser Arg Ile Gln  Thr Gln Ile
    3785                 3790                 3795
Asp Ser  Ala Lys Asn Glu Ala  Asn Ser Ile Leu Thr  Asn Asp Asn
    3800                 3805                 3810
Pro Gln  Val Ser Gln Val Thr  Ala Ala Leu Asn Lys  Ile Lys Ala
    3815                 3820                 3825
Val Gln  Pro Glu Leu Asp Lys  Ala Ile Ala Met Leu  Lys Asn Lys
    3830                 3835                 3840
Glu Asn  Asn Asn Ala Leu Val  Gln Ala Lys Gln Gln  Leu Gln Gln
    3845                 3850                 3855
Ile Val  Asn Glu Val Asp Pro  Thr Gln Gly Met Thr  Thr Asp Thr
    3860                 3865                 3870
Ala Asn  Asn Tyr Lys Ser Lys  Lys Arg Glu Ala Glu  Asp Glu Ile
    3875                 3880                 3885
Gln Lys  Ala Gln Gln Ile Ile  Asn Asn Gly Asp Ala  Thr Glu Gln
    3890                 3895                 3900
Gln Ile  Thr Asn Glu Thr Asn  Arg Val Asn Gln Ala  Ile Asn Ala
    3905                 3910                 3915
Ile Asn  Lys Ala Lys Asn Asp  Leu Arg Ala Asp Lys  Ser Gln Leu
    3920                 3925                 3930
Glu Asn  Ala Tyr Asn Gln Leu  Ile Gln Asn Val Asp  Thr Asn Gly
    3935                 3940                 3945
Lys Lys  Pro Ala Ser Ile Gln  Gln Tyr Gln Ala Ala  Arg Gln Ala
    3950                 3955                 3960
Ile Glu  Thr Gln Tyr Asn Asn  Ala Lys Ser Glu Ala  His Gln Ile
    3965                 3970                 3975
Leu Glu  Asn Ser Asn Pro Ser  Val Asn Glu Val Ala  Gln Ala Leu
    3980                 3985                 3990
Gln Lys  Val Glu Ala Val Gln  Leu Lys Val Asn Asp  Ala Ile His
    3995                 4000                 4005
Ile Leu  Gln Asn Lys Asp Asn  Asn Ser Ala Leu Val  Thr Ala Lys
    4010                 4015                 4020
Asn Gln  Leu Gln Gln Ser Val  Asn Asp Gln Pro Leu  Thr Thr Gly
    4025                 4030                 4035
Met Thr  Gln Asp Ser Ile Asn  Asn Tyr Glu Ala Lys  Arg Asn Glu
    4040                 4045                 4050
Ala Gln  Ser Ala Ile Arg Asn  Ala Glu Ala Val Ile  Asn Asn Gly
    4055                 4060                 4065
Asp Ala  Thr Ala Lys Gln Ile  Ser Asp Glu Lys Ser  Lys Val Glu
    4070                 4075                 4080
Gln Ala  Leu Ala His Leu Asn  Asp Ala Lys Gln Gln  Leu Thr Ala
    4085                 4090                 4095
Asp Thr  Thr Glu Leu Gln Thr  Ala Val Gln Gln Leu  Asn Arg Arg
    4100                 4105                 4110
Gly Asp  Thr Asn Asn Lys Lys  Pro Arg Ser Ile Asn  Ala Tyr Asn
    4115                 4120                 4125
Lys Ala  Ile Gln Ser Leu Glu  Thr Gln Ile Thr Ser  Ala Lys Asp
    4130                 4135                 4140
Asn Ala  Asn Ala Val Ile Gln  Lys Pro Ile Arg Thr  Val Gln Glu
    4145                 4150                 4155
Val Asn  Asn Ala Leu Gln Gln  Val Asn Gln Leu Asn  Gln Gln Leu
    4160                 4165                 4170
Thr Glu  Ala Ile Asn Gln Leu  Gln Pro Leu Ser Asn  Asn Asp Ala
    4175                 4180                 4185
Leu Lys  Ala Ala Lys Leu Asn  Leu Glu Asn Lys Ile  Asn Gln Thr
    4190                 4195                 4200
Val Gln  Thr Asp Gly Met Thr  Gln Gln Ser Ile Glu  Ala Tyr Gln
    4205                 4210                 4215
Asn Ala  Lys Arg Val Ala Gln  Asn Glu Ser Asn Thr  Ala Leu Ala
    4220                 4225                 4230
Leu Ile  Asn Asn Gly Asp Ala  Asp Glu Gln Gln Ile  Thr Thr Glu
    4235                 4240                 4245
Thr Asp  Arg Val Asn Gln Gln  Thr Thr Asn Leu Thr  Gln Ala Ile
    4250                 4255                 4260
Asn Gly  Leu Thr Val Asn Lys  Glu Pro Leu Glu Thr  Ala Lys Thr
    4265                 4270                 4275
Ala Leu  Gln Asn Asn Ile Asp  Gln Val Pro Ser Thr  Asp Gly Met
    4280                 4285                 4290
Thr Gln  Gln Ser Val Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Leu  Gln Ile Ala
    4295                 4300                 4305
Lys Asn  Glu Ile Asn Thr Ile  Asn Asn Val Leu Ala  Asn Asn Pro
    4310                 4315                 4320
Asp Val  Asn Ala Ile Lys Thr  Asn Lys Ala Glu Ala  Glu Arg Ile
    4325                 4330                 4335
Ser Asn  Asp Leu Thr Gln Ala  Lys Asn Asn Leu Gln  Val Asp Thr
    4340                 4345                 4350
Gln Pro  Leu Glu Lys Ile Lys  Arg Gln Leu Gln Asp  Glu Ile Asp
    4355                 4360                 4365
Gln Gly  Thr Asn Thr Asp Gly  Met Thr Gln Asp Ser  Val Asp Asn
    4370                 4375                 4380
Tyr Asn  Asp Ser Leu Ser Ala  Ala Ile Ile Glu Lys  Gly Lys Val
    4385                 4390                 4395
Asn Lys  Leu Leu Lys Arg Asn  Pro Thr Val Glu Gln  Val Lys Glu
    4400                 4405                 4410
Ser Val  Ala Asn Ala Gln Gln  Val Ile Gln Asp Leu  Gln Asn Ala
    4415                 4420                 4425
Arg Thr  Ser Leu Val Pro Asp  Lys Thr Gln Leu Gln  Glu Ala Lys
    4430                 4435                 4440
Asn Arg  Leu Glu Asn Ser Ile  Asn Gln Gln Thr Asp  Thr Asp Gly
    4445                 4450                 4455
Met Thr  Gln Asp Ser Leu Asn  Asn Tyr Asn Asp Lys  Leu Ala Lys
    4460                 4465                 4470
Ala Arg  Gln Asn Leu Glu Lys  Ile Ser Lys Val Leu  Gly Gly Gln
    4475                 4480                 4485
Pro Thr  Val Ala Glu Ile Arg  Gln Asn Thr Asp Glu  Ala Asn Ala
    4490                 4495                 4500
His Lys  Gln Ala Leu Asp Thr  Ala Arg Ser Gln Leu  Thr Leu Asn
    4505                 4510                 4515
Arg Glu  Pro Tyr Ile Asn His  Ile Asn Asn Glu Ser  His Leu Asn
    4520                 4525                 4530
Asn Ala  Gln Lys Asp Asn Phe  Lys Ala Gln Val Asn  Ser Ala Pro
    4535                 4540                 4545
Asn His  Asn Thr Leu Glu Thr  Ile Lys Asn Lys Ala  Asp Thr Leu
    4550                 4555                 4560
Asn Gln  Ser Met Thr Ala Leu  Ser Glu Ser Ile Ala  Asp Tyr Glu
    4565                 4570                 4575
Asn Gln  Lys Gln Gln Glu Asn  Tyr Leu Asp Ala Ser  Asn Asn Lys
    4580                 4585                 4590
Arg Gln  Asp Tyr Asp Asn Ala  Val Asn Ala Ala Lys  Gly Ile Leu
    4595                 4600                 4605
Asn Gln  Thr Gln Ser Pro Thr  Met Ser Ala Asp Val  Ile Asp Gln
    4610                 4615                 4620
Lys Ala  Glu Asp Val Lys Arg  Thr Lys Thr Ala Leu  Asp Gly Asn
    4625                 4630                 4635
Gln Arg  Leu Glu Val Ala Lys  Gln Gln Ala Leu Asn  His Leu Asn
    4640                 4645                 4650
Thr Leu  Asn Asp Leu Asn Asp  Ala Gln Arg Gln Thr  Leu Thr Asp
    4655                 4660                 4665
Thr Ile  Asn His Ser Pro Asn  Ile Asn Ser Val Asn  Gln Ala Lys
    4670                 4675                 4680
Glu Lys  Ala Asn Thr Val Asn  Thr Ala Met Thr Gln  Leu Lys Gln
    4685                 4690                 4695
Thr Ile  Ala Asn Tyr Asp Asp  Glu Leu His Asp Gly  Asn Tyr Ile
    4700                 4705                 4710
Asn Ala  Asp Lys Asp Lys Lys  Asp Ala Tyr Asn Asn  Ala Val Asn
    4715                 4720                 4725
Asn Ala  Lys Gln Leu Ile Asn  Gln Ser Asp Ala Asn  Gln Ala Gln
    4730                 4735                 4740
Leu Asp  Pro Ala Glu Ile Asn  Lys Val Thr Gln Arg  Val Asn Thr
    4745                 4750                 4755
Thr Lys  Asn Asp Leu Asn Gly  Asn Asp Lys Leu Ala  Glu Ala Lys
    4760                 4765                 4770
Arg Asp  Ala Asn Thr Thr Ile  Asp Gly Leu Thr Tyr  Leu Asn Glu
    4775                 4780                 4785
Ala Gln  Arg Asn Lys Ala Lys  Glu Asn Val Gly Lys  Ala Ser Thr
    4790                 4795                 4800
Lys Thr  Asn Ile Thr Ser Gln  Leu Gln Asp Tyr Asn  Gln Leu Asn
    4805                 4810                 4815
Ile Ala  Met Gln Ala Leu Arg  Asn Ser Val Asn Asp  Val Asn Asn
    4820                 4825                 4830
Val Lys  Ala Asn Ser Asn Tyr  Ile Asn Glu Asp Asn  Gly Pro Lys
    4835                 4840                 4845
Glu Ala  Tyr Asn Gln Ala Val  Thr His Ala Gln Thr  Leu Ile Asn
    4850                 4855                 4860
Ala Gln  Ser Asn Pro Glu Met  Ser Arg Asp Val Val  Asn Gln Lys
    4865                 4870                 4875
Thr Gln  Ala Val Asn Thr Ala  His Gln Asn Leu His  Gly Gln Gln
    4880                 4885                 4890
Lys Leu  Glu Gln Ala Gln Ser  Ser Ala Asn Thr Glu  Ile Gly Asn
    4895                 4900                 4905
Leu Pro  Asn Leu Thr Asn Thr  Gln Lys Ala Lys Glu  Lys Glu Leu
    4910                 4915                 4920
Val Asn  Ser Lys Gln Thr Arg  Thr Glu Val Gln Glu  Gln Leu Asn
    4925                 4930                 4935
Gln Ala  Lys Ser Leu Asp Ser  Ser Met Gly Thr Leu  Lys Ser Leu
    4940                 4945                 4950
Val Ala  Lys Gln Pro Thr Val  Gln Lys Thr Ser Val  Tyr Ile Asn
    4955                 4960                 4965
Glu Asp  Gln Pro Glu Gln Ser  Ala Tyr Asn Asp Ser  Ile Thr Met
    4970                 4975                 4980
Gly Gln  Thr Ile Ile Asn Lys  Thr Ala Asp Pro Val  Leu Asp Lys
    4985                 4990                 4995
Thr Leu  Val Asp Asn Ala Ile  Ser Ash Ile SerThr  Lys Glu Asn
    5000                 5005                 5010
Ala Leu  His Gly Glu Gln Lys  Leu Thr Thr Ala Lys  Thr Glu Ala
    5015                 5020                 5025
Ile Asn  Ala Leu Asn Thr Leu  Ala Asp Leu Asn Thr  Pro Gln Lys
    5030                 5035                 5040
Glu Ala  Ile Lys Thr Ala Ile  Asn Thr Ala His Thr  Arg Thr Asp
    5045                 5050                 5055
Val Thr  Ala Glu Gln Ser Lys  Ala Asn Gln Ile Asn  Ser Ala Met
    5060                 5065                 5070
His Thr  Leu Arg Gln Asn Ile  Ser Asp Asn Glu Ser  Val Thr Asn
    5075                 5080                 5085
Glu Ser  Asn Tyr Ile Asn Ala  Glu Pro Glu Lys Gln  His Ala Phe
    5090                 5095                 5100
Thr Glu  Ala Leu Asn Asn Ala  Lys Glu Ile Val Asn  Glu Gln Gln
    5105                 5110                 5115
Ala Thr  Leu Asp Ala Asn Ser  Ile Asn Gln Lys Ala  Gln Ala Ile
    5120                 5125                 5130
Leu Thr  Thr Lys Asn Ala Leu  Asp Gly Glu Glu Gln  Leu Arg Arg
    5135                 5140                 5145
Ala Lys  Glu Asn Ala Asp Gln  Glu Ile Asn Thr Leu  Asn Gln Leu
    5150                 5155                 5160
Thr Asp  Ala Gln Arg Asn Ser  Glu Lys Gly Leu Val  Asn Ser Ser
    5165                 5170                 5175
Gln Thr  Arg Thr Glu Val Ala  Ser Gln Leu Ala Lys  Ala Lys Glu
    5180                 5185                 5190
Leu Asn  Lys Val Met Glu Gln  Leu Asn His Leu Ile  Asn Gly Lys
    5195                 5200                 5205
Asn Gln  Met Ile Asn Ser Ser  Lys Phe Ile Asn Glu  Asp Ala Asn
    5210                 5215                 5220
Gln Gln  Gln Ala Tyr Ser Asn  Ala Ile Ala Ser Ala  Glu Ala Leu
    5225                 5230                 5235
Lys Asn  Lys Ser Gln Asn Pro  Glu Leu Asp Lys Val  Thr Ile Glu
    5240                 5245                 5250
Gln Ala  Ile Asn Asn Ile Asn  Ser Ala Ile Asn Asn  Leu Asn Gly
    5255                 5260                 5265
Glu Ala  Lys Leu Thr Lys Ala  Lys Glu Asp Ala Val  Ala Ser Ile
    5270                 5275                 5280
Asn Asn  Leu Ser Gly Leu Thr  Asn Glu Gln Lys Thr  Lys Glu Asn
    5285                 5290                 5295
Gln Ala  Val Asn Gly Ala Gln  Thr Arg Asp Gln Val  Ala Asn Lys
    5300                 5305                 5310
Leu Arg  Asp Ala Glu Ala Leu  Asp Gln Ser Met Gln  Thr Leu Arg
    5315                 5320                 5325
Asp Leu  Val Asn Asn Gln Asn  Ala Ile His Ser Thr  Ser Asn Tyr
    5330                 5335                 5340
Phe Asn  Glu Asp Ser Thr Gln  Lys Asn Thr Tyr Asp  Asn Ala Ile
    5345                 5350                 5355
Asp Asn  Gly Ser Thr Tyr Ile  Thr Gly Gln His Asn  Pro Glu Leu
    5360                 5365                 5370
Asn Lys  Ser Thr Ile Asp Gln  Thr Ile Ser Arg Ile  Asn Thr Ala
    5375                 5380                 5385
Lys Asn  Asp Leu His Gly Val  Glu Lys Leu Gln Arg  Asp Lys Gly
    5390                 5395                 5400
Thr Ala  Asn Gln Glu Ile Gly  Gln Leu Gly Tyr Leu  Asn Asp Pro
    5405                 5410                 5415
Gln Lys  Ser Gly Glu Glu Ser  Leu Val Asn Gly Ser  Asn Thr Arg
    5420                 5425                 5430
Ser Glu  Val Glu Glu His Leu  Asn Glu Ala Lys Ser  Leu Asn Asn
    5435                 5440                 5445
Ala Met  Lys Gln Leu Arg Asp  Lys Val Ala Glu Lys  Thr Asn Val
    5450                 5455                 5460
Lys Gln  5er Ser Asp Tyr Ile  Asn Asp Ser Thr Glu  His Gln Arg
    5465                 5470                 5475
Gly Tyr  Asp Gln Ala Leu Gln  Glu Ala Glu Asn Ile  Ile Asn Glu
    5480                 5485                 5490
Ile Gly  Asn Pro Thr Leu Asn  Lys Ser Glu Ile Glu  Gln Lys Leu
    5495                 5500                 5505
Gln Gln  Leu Thr Asp Ala Gln  Asn Ala Leu Gln Gly  Ser His Leu
    5510                 5515                 5520
Leu Glu  Glu Ala Lys Asn Asn  Ala Ile Thr Gly Ile  Asn Lys Leu
    5525                 5530                 5535
Thr Ala  Leu Asn Asp Ala Gln  Arg Gln Lys Ala Ile  Glu Asn Val
    5540                 5545                 5550
Gln Ala  Gln Gln Thr Ile Pro  Ala Val Asn Gln Gln  Leu Thr Leu
    5555                 5560                 5565
Asp Arg  Glu Ile Asn Thr Ala  Met Gln Ala Leu Arg  Asp Lys Val
    5570                 5575                 5580
Gly Gln  Gln Asn Asn Val His  Gln Gln Ser Asn Tyr  Phe Asn Glu
    5585                 5590                 5595
Asp Glu  Gln Pro Lys His Asn  Tyr Asp Asn Ser Val  Gln Ala Gly
    5600                 5605                 5610
Gln Thr  Ile Ile Asp Lys Leu  Gln Asp Pro Ile Met  Asn Lys Asn
    5615                 5620                 5625
Glu Ile  Glu Gln Ala Ile Asn  Gln Ile Asn Thr Thr  Gln Thr Ala
    5630                 5635                 5640
Leu Ser  Gly Glu Asn Lys Leu  His Thr Asp Gln Glu  Ser Thr Asn
    5645                 5650                 5655
Arg Gln  Ile Glu Gly Leu Ser  Ser Leu Asn Thr Ala  Gln Ile Asn
    5660                 5665                 5670
Ala Glu  Lys Asp Leu Val Asn  Gln Ala Lys Thr Arg  Thr Asp Val
    5675                 5680                 5685
Ala Gln  Lys Leu Ala Ala Ala  Lys Glu Ile Asn Ser  Ala Met Ser
    5690                 5695                 5700
Asn Leu  Arg Asp Gly Ile Gln  Asn Lys Glu Asp Ile  Lys Arg Ser
    5705                 5710                 5715
Ser Ala  Tyr Ile Asn Ala Asp  Pro Thr Lys Val Thr  Ala Tyr Asp
    5720                 5725                 5730
Gln Ala  Leu Gln Asn Ala Glu  Asn Ile Ile Asn Ala  Thr Pro Asn
    5735                 5740                 5745
Val Glu  Leu Asn Lys Ala Thr  Ile Glu Gln Ala Leu  Ser Arg Val
    5750                 5755                 5760
Gln Gln  Ala Gln Gln Asp Leu  Asp Gly Val Gln Gln  Leu Ala Asn
    5765                 5770                 5775
Ala Lys  Gln Gln Ala Thr Gln  Thr Val Asn Gly Leu  Asn Ser Leu
    5780                 5785                 5790
Asn Asp  Gly Gln Lys Arg Glu  Leu Asn Leu Leu Ile  Asn Ser Ala
    5795                 5800                 5805
Asn Thr  Arg Thr Lys Val Gln  Glu Glu Leu Asn Lys  Ala Thr Glu
    5810                 5815                 5820
Leu Asn  His Ala Met Glu Ala  Leu Arg Asn Ser Val  Gln Asn Val
    5825                 5830                 5835
Asp Gln  Val Lys Gln Ser Ser  Asn Tyr Val Asn Glu  Asp Gln Pro
    5840                 5845                 5850
Glu Gln  His Asn Tyr Asp Asn  Ala Val Asn Glu Ala  Gln Ala Thr
    5855                 5860                 5865
Ile Asn  Asn Asn Ala Gln Pro  Val Leu Asp Lys Leu  Ala Ile Glu
    5870                 5875                 5880
Arg Leu  Thr Gln Thr Val Asn  Thr Thr Lys Asp Ala  Leu His Gly
    5885                 5890                 5895
Ala Gln  Lys Leu Thr Gln Asp  Gln Gln Ala Ala Glu  Thr ely Ile
    5900                 5905                 5910
Arg Gly  Leu Thr Ser Leu Asn  Glu Pro Gln Lys Asn  Ala Glu Val
    5915                 5920                 5925
Ala Lys  Val Thr Ala Ala Thr  Thr Arg Asp Glu Val  Arg Asn Ile
    5930                 5935                 5940
Arg Gln  Glu Ala Thr Thr Leu  Asp Thr Ala Met Leu  Gly Leu Arg
    5945                 5950                 5955
Lys Ser  Ile Lys Asp Lys Asn  Asp Thr Lys Asn Ser  Ser Lys Tyr
    5960                 5965                 5970
Ile Asn  Glu Asp His Asp Gln  Gln Gln Ala Tyr Asp  Asn Ala Val
    5975                 5980                 5985
Asn Asn  Ala Gln Gln Val Ile  Asp Glu Thr Gln Ala  Thr Leu Ser
    5990                 5995                 6000
Ser Asp  Thr Ile Asn Gln Leu  Ala Asn Ala Val Thr  Gln Ala Lys
    6005                 6010                 6015
Ser Asn  Leu His Gly Asp Thr  Lys Leu Gln His Asp  Lys Asp Ser
    6020                 6025                 6030
Ala Lys  Gln Thr Ile Ala Gln  Leu Gln Asn Leu Asn  Ser Ala Gln
    6035                 6040                 6045
Lys His  Met Glu Asp Ser Leu  Ile Asp Asn Glu Ser  Thr Arg Thr
    6050                 6055                 6060
Gln Val  Gln His Asp Leu Thr  Glu Ala Gln Ala Leu  Asp Gly Leu
    6065                 6070                 6075
Met Gly  Ala Leu Lys Glu Ser  Ile Lys Asp Tyr Thr  Asn Ile Val
    6080                 6085                 6090
Ser Asn  Gly Asn Tyr Ile Asn  Ala Glu Pro Ser Lys  Lys Gln Ala
    6095                 6100                 6105
Tyr Asp  Ala Ala Val Gln Asn  Ala Gln Asn Ile Ile  Asn Gly Thr
    6110                 6115                 6120
Asn Gln  Pro Thr Ile Asn Lys  Gly Asn Val Thr Thr  Ala Thr Gln
    6125                 6130                 6135
Thr Val  Lys Asn Thr Lys Asp  Ala Leu Asp Gly Asp  His Arg Leu
    6140                 6145                 6150
Glu Glu  Ala Lys Asn Asn Ala  Asn Gln Thr Ile Arg  Asn Leu Ser
    6155                 6160                 6165
Asn Leu  Asn Asn Ala Gln Lys  Asp Ala Glu Lys Asn  Leu Val Asn
    6170                 6175                 6180
Ser Ala  Ser Thr Leu Glu Gln  Val Gln Gln Asn Leu  Gln Thr Ala
    6185                 6190                 6195
Gln Gln  Leu Asp Asn Ala Met  Gly Glu Leu Arg Gln  Ser Ile Ala
    6200                 6205                 6210
Lys Lys  Asp Gln Val Lys Ala  Asp Ser Lys Tyr Leu  Asn Glu Asp
    6215                 6220                 6225
Pro Gln  Ile Lys Gln Asn Tyr  Asp Asp Ala Val Gln  Arg Val Glu
    6230                 6235                 6240
Thr Ile  Ile Asn Glu Thr Gln  Asn Pro Glu Leu Leu  Lys Ala Asn
    6245                 6250                 6255
Ile Asp  Gln Ala Thr Gln Ser  Val Gln Asn Ala Glu  Gln Ala Leu
    6260                 6265                 6270
His Gly  Ala Glu Lys Leu Asn  Gln Asp Lys Gln Thr  Ser Ser Thr
    6275                 6280                 6285
Glu Leu  Asp Gly Leu Thr Asp  Leu Thr Asp Ala Gln  Arg Glu Lys
    6290                 6295                 6300
Leu Arg  Glu Gln Ile Asn Thr  Ser Asn Ser Arg Asp  Asp Ile Lys
    6305                 6310                 6315
Gln Lys  Ile Glu Gln Ala Lys  Ala Leu Asn Asp Ala  Met Lys Lys
    6320                 6325                 6330
Leu Lys  Glu Gln Val Ala Gln  Lys Asp Gly Val His  Ala Asn Ser
    6335                 6340                 6345
Asp Tyr  Thr Asn Glu Asp Ser  Ala Gln Lys Asp Ala  Tyr Asn Asn
    6350                 6355                 6360
Ala Leu  Lys Gln Ala Glu Asp  Ile Ile Asn Asn Ser  Ser Asn Pro
    6365                 6370                 6375
Asn Leu  Asn Ala Gln Asp Ile  Thr Asn Ala Leu Asn  Asn Ile Lys
    6380                 6385                 6390
Gln Ala  Gln Asp Asn Leu His  Gly Ala Gln Lys Leu  Gln Gln Asp
    6395                 6400                 6405
Lys Asn  Thr Thr Asn Gln Ala  Ile Gly Asn Leu Asn  His Leu Asn
    6410                 6415                 6420
Gln Pro  Gln Lys Asp Ala Leu  Ile Gln Ala Ile Asn  Gly Ala Thr
    6425                 6430                 6435
Ser Arg  Asp Gln Val Ala Glu  Lys Leu Lys Glu Ala  Glu Ala Leu
    6440                 6445                 6450
Asp Glu  Ala Met Lys Gln Leu  Glu Asp Gln Val Asn  Gln Asp Asp
    6455                 6460                 6465
Gln Ile  Ser Asn Ser Ser Pro  Phe Ile Asn Glu Asp  Ser Asp Lys
    6470                 6475                 6480
Gln Lys  Thr Tyr Asn Asp Lys  Ile Gln Ala Ala Lys  Glu Ile Ile
    6485                 6490                 6495
Asn Gln  Thr Ser Asn Pro Thr  Leu Asp Lys Gln Lys  Ile Ala Asp
    6500                 6505                 6510
Thr Leu  Gln Asn Ile Lys Asp  Ala Val Asn Asn Leu  His Gly Asp
    6515                 6520                 6525
Gln Lys  Leu Ala Gln Ser Lys  Gln Asp Ala Asn Asn  Gln Leu Asn
    6530                 6535                 6540
His Leu  Asp Asp Leu Thr Glu  Glu Gln Lys Asn His  Phe Lys Pro
    6545                 6550                 6555
Leu Ile  Asn Asn Ala Asp Thr  Arg Asp Glu Val Asn  Lys Gln Leu
    6560                 6565                 6570
Glu Ile  Ala Lys Gln Leu Asn  Gly Asp Met Ser Thr  Leu His Lys
    6575                 6580                 6585
Val Ile  Asn Asp Lys Asp Gln  Ile Gln His Leu Ser  Asn Tyr Ile
    6590                 6595                 6600
Asn Ala  Asp Asn Asp Lys Lys  Gln Asn Tyr Asp Asn  Ala Ile Lys
    6605                 6610                 6615
Glu Ala  Glu Asp Leu Ile His  Asn His Pro Asp Thr  Leu Asp His
    6620                 6625                 6630
Lys Ala  Leu Gln Asp Leu Leu  Asn Lys Ile Asp Gln  Ala His Asn
    6635                 6640                 6645
Glu Leu  Asn Gly Glu Ser Arg  Phe Lys Gln Ala Leu  Asp Asn Ala
    6650                 6655                 6660
Leu Asn  Asp Ile Asp Ser Leu  Asn Ser Leu Asn Val  Pro Gln Arg
    6665                 6670                 6675
Gln Thr  Val Lys Asp Asn Ile  Asn His Val Thr Thr  Leu Glu Ser
    6680                 6685                 6690
Leu Ala  Gln Glu Leu Gln Lys  Ala Lys Glu Leu Asn  Asp Ala Met
    6695                 6700                 6705
Lys Ala  Met Arg Asp Ser Ile  Met Asn Gln Glu Gln  Ile Arg Lys
    6710                 6715                 6720
Asn Ser  Asn Tyr Thr Asn Glu  Asp Leu Ala Gln Gln  Asn Ala Tyr
    6725                 6730                 6735
Asn His  Ala Val Asp Lys Ile  Asn Asn Ile Ile Gly  Glu Asp Asn
    6740                 6745                 6750
Ala Thr  Met Asp Pro Gln Ile  Ile Lys Gln Ala Thr  Gln Asp Ile
    6755                 6760                 6765
Asn Thr  Ala Ile Asn Gly Leu  Asn Gly Asp Gln Lys  Leu Gln Asp
    6770                 6775                 6780
Ala Lys  Thr Asp Ala Lys Gln  Gln Ile Thr Asn Phe  Thr Gly Leu
    6785                 6790                 6795
Thr Glu  Pro Gln Lys Gln Ala  Leu Glu Asn Ile Ile  Asn Gln Gln
    6800                 6805                 6810
Thr Ser  Arg Ala Asn Val Ala  Lys Gln Leu Ser His  Ala Lys Phe
    6815                 6820                 6825
Leu Asn  Gly Lys Met Glu Glu  Leu Lys Val Ala Val  Ala Lys Ala
    6830                 6835                 6840
Ser Leu  Val Arg Gln Asn Ser  Asn Tyr Ile Asn Glu  Asp Val Ser
    6845                 6850                 6855
Glu Lys  Glu Ala Tyr Glu Gln  Ala Ile Ala Lys Gly  Gln Glu Ile
    6860                 6865                 6870
Ile Asn  Ser Glu Asn Asn Pro  Thr Ile Ser Ser Thr  Asp Ile Asn
    6875                 6880                 6885
Arg Thr  Ile Gln Glu Ile Asn  Asp Ala Glu Gln Asn  Leu His Gly
    6890                 6895                 6900
Asp Asn  Lys Leu Arg Gln Ala  Gln Glu Ile Ala Lys  Asn Glu Ile
    6905                 6910                 6915
Gln Asn  Leu Asp Gly Leu Asn  Ser Ala Gln Ile Thr  Lys Leu Ile
    6920                 6925                 6930
Gln Asp  Ile Gly Arg Thr Thr  Thr Lys Pro Ala Val  Thr Gln Lys
    6935                 6940                 6945
Leu Glu  Glu Ala Lys Ala Ile  Asn Gln Ala Met Gln  Gln Leu Lys
    6950                 6955                 6960
Gln Ser  Ile Ala Asp Lys Asp  Ala Thr Leu Asn Ser  Ser Asn Tyr
    6965                 6970                 6975
Leu Asn  Glu Asp Ser Glu Lys  Lys Leu Ala Tyr Asp  Asn Ala Val
    6980                 6985                 6990
Ser Gln  Ala Glu Gln Leu Ile  Asn Gln Leu Asn Asp  Pro Thr Met
    6995                 7000                 7005
Asp Ile  Ser Asn Ile Gln Ala  Ile Thr Gln Lys Val  Ile Gln Ala
    7010                 7015                 7020
Lys Asp  Ser Leu His Gly Ala  Asn Lys Leu Ala Gln  Asn Gln Ala
    7025                 7030                 7035
Asp Ser  Asn Leu Ile Ile Asn  Gln Ser Thr Asn Leu  Asn Asp Lys
    7040                 7045                 7050
Gln Lys  Gln Ala Leu Asn Asp  Leu Ile Asn His Ala  Gln Thr Lys
    7055                 7060                 7065
Gln Gln  Val Ala Glu Ile Ile  Ala Gln Ala Asn Lys  Leu Asn Asn
    7070                 7075                 7080
Glu Met  Gly Thr Leu Lys Thr  Leu Val Glu Glu Gln  Ser Asn Val
    7085                 7090                 7095
His Gln  Gln Ser Lys Tyr Ile  Asn Glu Asp Pro Gln  Val Gln Asn
    7100                 7105                 7110
Ile Tyr  Asn Asp Ser Ile Gln  Lys Gly Arg Glu Ile  Leu Asn Gly
    7115                 7120                 7125
Thr Thr  Asp Asp Val Leu Asn  Asn Asn Lys Ile Ala  Asp Ala Ile
    7130                 7135                 7140
Gln Asn  Ile His Leu Thr Lys  Asn Asp Leu His Gly  Asp Gln Lys
    7145                 7150                 7155
Leu Gln  Lys Ala Gln Gln Asp  Ala Thr Asn Glu Leu  Asn Tyr Leu
    7160                 7165                 7170
Thr Asn  Leu Asn Asn Ser Gln  Arg Gln Ser Glu His  Asp Glu Ile
    7175                 7180                 7185
Asn Ser  Ala Pro Ser Arg Thr  Glu Val Ser Asn Asp  Leu Asn His
    7190                 7195                 7200
Ala Lys  Ala Leu Asn Glu Ala  Met Arg Gln Leu Glu  Asn Glu Val
    7205                 7210                 7215
Ala Leu  Glu Asn Ser Val Lys  Lys Leu Ser Asp Phe  Ile Asn Glu
    7220                 7225                 7230
Asp Glu  Ala Ala Gln Asn Glu  Tyr Ser Asn Ala Leu  Gln Lys Ala
    7235                 7240                 7245
Lys Asp  Ile Ile Asn Gly Val  Pro Ser Ser Thr Leu  Asp Lys Ala
    7250                 7255                 7260
Thr Ile  Glu Asp Ala Leu Leu  Glu Leu Gln Asn Ala  Arg Glu Ser
    7265                 7270                 7275
Leu His  Gly Glu Gln Lys Leu  Gln Glu Ala Lys Asn  Gln Ala Val
    7280                 7285                 7290
Ala Glu  Ile Asp Asn Leu Gln  Ala Leu Asn Pro Gly  Gln Val Leu
    7295                 7300                 7305
Ala Glu  Lys Thr Leu Val Asn  Gln Ala Ser Thr Lys  Pro Glu Val
    7310                 7315                 7320
Gln Glu  Ala Leu Gln Lys Ala  Lys Glu Leu Asn Glu  Ala Met Lys
    7325                 7330                 7335
Ala Leu  Lys Thr Glu Ile Asn  Lys Lys Glu Gln Ile  Lys Ala Asp
    7340                 7345                 7350
Ser Arg  Tyr Val Asn Ala Asp  Ser Gly Leu Gln Ala  Asn Tyr Asn
    7355                 7360                 7365
Ser Ala  Leu Asn Tyr Gly Ser  Gln Ile Ile Ala Thr  Thr Gln Pro
    7370                 7375                 7380
Pro Glu  Leu Asn Lys Asp Val  Ile Asn Arg Ala Thr  Gln Thr Ile
    7385                 7390                 7395
Lys Thr  Ala Glu Asn Asn Leu  Asn Gly Gln Ser Lys  Leu Ala Glu
    7400                 7405                 7410
Ala Lys  Ser Asp Gly Asn Gln  Ser Ile Glu His Leu  Gln Gly Leu
    7415                 7420                 7425
Thr Gln  Ser Gln Lys Asp Lys  Gln His Asp Leu Ile  Asn Gln Ala
    7430                 7435                 7440
Gln Thr  Lys Gln Gln Val Asp  Asp Ile Val Asn Asn  Ser Lys Gln
    7445                 7450                 7455
Leu Asp  Asn Ser Met Asn Gln  Leu Gln Gln Ile Val  Asn Asn Asp
    7460                 7465                 7470
Asn Thr  Val Lys Gln Asn Ser  Asp Phe Ile Asn Glu  Asp Ser Ser
    7475                 7480                 7485
Gln Gln  Asp Ala Tyr Asn His  Ala Ile Gln Ala Ala  Lys Asp Leu
    7490                 7495                 7500
Ile Thr  Ala His Pro Thr Ile  Met Asp Lys Asn Gln  Ile Asp Gln
    7505                 7510                 7515
Ala Ile  Glu Asn Ile Lys Gln  Ala Leu Asn Asp Leu  His Gly Ser
    7520                 7525                 7530
Asn Lys  Leu Ser Glu Asp Lys  Lys Glu Ala Ser Glu  Gln Leu Gln
    7535                 7540                 7545
Asn Leu  Asn Ser Leu Thr Asn  Gly Gln Lys Asp Thr  Ile Leu Asn
    7550                 7555                 7560
His Ile  Phe Ser Ala Pro Thr  Arg Ser Gln Val Gly  Glu Lys Ile
    7565                 7570                 7575
Ala Ser  Ala Lys Gln Leu Asn  Asn Thr Met Lys Ala  Leu Arg Asp
    7580                 7585                 7590
Ser Ile  Ala Asp Asn Asn Glu  Ile Leu Gln Ser Ser  Lys Tyr Phe
    7595                 7600                 7605
Asn Glu  Asp Ser Glu Gln Gln  Asn Ala Tyr Asn Gln  Ala Val Asn
    7610                 7615                 7620
Lys Ala  Lys Asn Ile Ile Asn  Asp Gln Pro Thr Pro  Val Met Ala
    7625                 7630                 7635
Asn Asp  Glu Ile Gln Ser Val  Leu Asn Glu Val Lys  Gln Thr Lys
    7640                 7645                 7650
Asp Asn  Leu His Gly Asp Gln  Lys Leu Ala Asn Asp  Lys Thr Asp
    7655                 7660                 7665
Ala Gln  Ala Thr Leu Asn Ala  Leu Asn Tyr Leu Asn  Gln Ala Gln
    7670                 7675                 7680
Arg Gly  Asn Leu Glu Thr Lys  Val Gln Asn Ser Asn  Ser Arg Pro
    7685                 7690                 7695
Glu Val  Gln Lys Val Val Gln  Leu Ala Asn Gln Leu  Asn Asp Ala
    7700                 7705                 7710
Met Lys  Lys Leu Asp Asp Ala  Leu Thr Gly Asn Asp  Ala Ile Lys
    7715                 7720                 7725
Gln Thr  Ser Asn Tyr Ile Asn  Glu Asp Thr Ser Gln  Gln Val Asn
    7730                 7735                 7740
Phe Asp  Glu Tyr Thr Asp Arg  Gly Lys Asn Ile Val  Ala Glu Gln
    7745                 7750                 7755
Thr Asn  Pro Asn Met Ser Pro  Thr Asn Ile Asn Thr  Ile Ala Asp
    7760                 7765                 7770
Lys Ile  Thr Glu Ala Lys Asn  Asp Leu His Gly Val  Gln Lys Leu
    7775                 7780                 7785
Glu Gln  Ala Gln Gln Gln Ser  Ile Asn Thr Ile Asn  Gln Met Thr
    7790                 7795                 7800
Gly Leu  Asn Gln Ala Gln Lys  Glu Gln Leu Asn Gln  Glu Ile Gln
    7805                 7810                 7815
Gln Thr  Gln Thr Arg Ser Glu  Val His Gln Val Ile  Lys Lys Ala
    7820                 7825                 7830
Gln Ala  Leu Asn Asp Ser Met  AsnThr Leu Arg Gln  Ser Ile Thr
    7835                 7840                 7845
Asp Glu  Asn Glu Val Lys Gln  Thr Ser Asn Tyr Ile  Asn Glu Thr
    7850                 7855                 7860
Val Gly  Asn Gln Thr Ala Tyr  Asn Asn Ala Val Asp  Arg Val Lys
    7865                 7870                 7875
Gln Ile  Ile Asn Gln Thr Ser  Asn Pro Thr Met Asn  Pro Leu Glu
    7880                 7885                 7890
Val Glu  Arg Ala Thr Ser Asn  Val Lys Thr Ser Lys  Asp Ala Leu
    7895                 7900                 7905
His Gly  Glu Arg Glu Leu Asn  Asp Asn Lys Asn Ser  Lys Thr Phe
    7910                 7915                 7920
Ala Val  Asn His Leu Asp Asn  Leu Asn Gln Ala Gln  Lys Glu Ala
    7925                 7930                 7935
Leu Thr  His Glu Ile Glu Gln  Ala Thr Ile Val Ser  Gln Val Asn
    7940                 7945                 7950
Asn Ile  Tyr Asn Lys Ala Lys  Ala Leu Asn Asn Asp  Met Lys Lys
    7955                 7960                 7965
Leu Lys  Asp Ile Val Ala Gln  Gln Asp Asn Val Arg  Gln Ser Asn
    7970                 7975                 7980
Asn Tyr  Ile Asn Glu Asp Ser  Thr Pro Gln Asn Met  Tyr Asn Asp
    7985                 7990                 7995
Thr Ile  Asn His Ala Gln Ser  Ile Ile Asp Gln Val  Ala Asn Pro
    8000                 8005                 8010
Thr Met  Ser His Asp Glu Ile  Glu Asn AlaIleAsn  Asn Ile Lys
    8015                 8020                 8025
His Ala  Ile Asn Ala Leu Asp  Gly Glu His Lys Leu  Gln Gln Ala
    8030                 8035                 8040
Lys Glu  Asn Ala Asn Leu Leu  Ile Asn Ser Leu Asn  Asp Leu Asn
    8045                 8050                 8055
Ala Pro  Gln Arg Asp Ala Ile  Asn Arg Leu Val Asn  Glu Ala Gln
    8060                 8065                 8070
Thr Arg  Glu Lys Val Ala Glu  Gln Leu Gln Ser Ala  Gln Ala Leu
    8075                 8080                 8085
Asn Asp  Ala Met Lys His Leu  Arg Asn Ser Ile Gln  Asn Gln Ser
    8090                 8095                 8100
Ser Val  Arg Gln Glu Ser Lys  Tyr Ile Asn Ala Ser  Asp Ala Lys
    8105                 8110                 8115
Lys Glu  Gln Tyr Asn His Ala  Val Arg Glu Val Glu  Asn Ile Ile
    8120                 8125                 8130
Asn Glu  Gln His Pro Thr Leu  Asp Lys Glu Ile Ile  Lys Gln Leu
    8135                 8140                 8145
Thr Asp  Ala Val Asn Gln Ala  Asn Asn Asp Leu Asn  Gly Val Glu
    8150                 8155                 8160
Leu Leu  Asp Ala Asp Lys Gln  Asn Ala His Gln Ser  Ile Pro Thr
    8165                 8170                 8175
Leu Met  His Leu Asn Gln Ala  Gln Gln Asn Ala Leu  Asn Glu Lys
    8180                 8185                 8190
Ile Asn  Asn Ala Val Thr Arg  Ala Glu Val Ala Ala  Ile Ile Gly
    8195                 8200                 8205
Gln Ala  Lys Ile Leu Asp His  Ala Met Glu Asn Leu  Glu Glu Ser
    8210                 8215                 8220
Ile Lys  Asp Lys Glu Gln Val  Lys Gln Ser Ser Asn  Tyr Ile Asn
    8225                 8230                 8235
Glu Asp  Pro Asp Val Gln Glu  Thr Tyr Asn Asn Ala  Val Asp His
    8240                 8245                 8250
Val Thr  Glu Ile Leu Asn Gln  Thr Val Asn Pro Thr  Leu Ser Ile
    8255                 8260                 8265
Glu Asp  Ile Glu His Ala Ile  Asn Glu Val Asn Gln  Ala Lys Lys
    8270                 8275                 8280
Gln Leu  Arg Gly Lys Gln Lys  Leu Tyr Gln Thr Ile  Asp Leu Ala
    8285                 8290                 8295
Asp Lys  Glu Leu Ser Lys Leu  Asp Asp Leu Thr Ser  Gln Gln Ser
    8300                 8305                 8310
Ser Ser  Ile Ser Asn Gln Ile  Tyr Thr Ala Lys Thr  Arg Thr Glu
    8315                 8320                 8325
Val Ala  Gln Ala Ile Glu Lys  Ala Lys Ser Leu Asn  His Ala Met
    8330                 8335                 8340
Lys Ala Leu Asn Lys Val Tyr  Lys Asn Thr Asp Lys  Val Leu Asp
    8345                 8350                 8355
Ser Ser  Arg Phe Ile Asn Glu  Asp Gln Pro Glu Lys  Glu Ala Tyr
    8360                 8365                 8370
Gln Gln  Ala Ile Asn His Val  Asp Ser Ile Ile His  Arg Gln Thr
    8375                 8380                 8385
Asn Pro  Glu Met Asp Pro Thr  Val Ile Asn Ser Ile  Thr His Glu
    8390                 8395                 8400
Leu Glu  Thr Ala Gln Asn Asn  Leu His Gly Asp Gln  Lys Leu Ala
    8405                 8410                 8415
His Ala  Gln Gln Asp Ala Ala  Asn Val Ile Asn Gly  Leu Ile His
    8420                 8425                 8430
Leu Asn  Val Ala Gln Arg Glu  Val Met Ile Asn Ala  Asn Thr Asn
    8435                 8440                 8445
Ala Thr  Thr Arg Glu Lys Val  Ala Lys Asn Leu Asp  Asn Ala Gln
    8450                 8455                 8460
Ala Leu  Asp Lys Ala Met Glu  Thr Leu Gln Gln Val  Val Ala His
    8465                 8470                 8475
Lys Asn  Asn Ile Leu Asn Asp  Ser Lys Tyr Leu Asn  Glu Asp Ser
    8480                 8485                 8490
Lys Tyr  Gln Gln Gln Tyr Asp  Arg Val Val Ala Asp  Ala Glu Gln
    8495                 8500                 8505
Leu Leu  Asn Gln Thr Thr Asn  Pro Thr Leu Glu Pro  Tyr Lys Ile
    8510                 8515                 8520
Asp Ile  Val Lys Asp Asn Val  Leu Ala Asn Glu  Lys  Ile Leu Phe
    8525                 8530                 8535
Gly Ala  Glu Lys Leu Ser Tyr  Asp Lys Ser Asn Ala  Asn Asp Glu
    8540                 8545                 8550
Ile Lys  His Met Asn Tyr Leu  Asn Asn Ala Gln Lys  Gln Ser Ile
    8555                 8560                 8565
Lys Asp  Met Ile Ser His Ala  Ala Leu Arg Thr Glu  Val Lys Gln
    8570                 8575                 8580
Leu Leu  Gln Gln Ala Lys Thr  Leu Asp Glu Ala Met  Lys Ser Leu
    8585                 8590                 8595
Glu Asp  Lys Thr Gln Val Val  Ile Thr Asp Thr Thr  Leu Ser Asn
    8600                 8605                 8610
Tyr Thr  Glu Ala Ser Glu Asp  Lys Lys Glu Lys Val  Asp Gln Thr
    8615                 8620                 8625
Val Ser  His Ala Gln Ala Ile  Ile Asp Lys Ile Asn  Gly Ser Asn
    8630                 8635                 8640
Val Ser  Leu Asp Gln Val Arg  Gln Ala Leu Glu Gln  Leu Thr Gln
    8645                 8650                 8655
Ala Ser  Glu Asn Leu Asp Gly  Asp Gln Arg Val Glu  Glu Ala Lys
    8660                 8665                 8670
Val His  Ala Asn Gln Thr Ile  Asp Gln Leu Thr His  Leu Asn Ser
    8675                 8680                 8685
Leu Gln  Gln Gln Thr Ala Lys  Glu Ser Val Lys Asn  Ala Thr Lys
    8690                 8695                 8700
Leu Glu  Glu Ile Ala Thr Ala  Ser Asn Asp Ala Leu  Ala Leu Asn
    8705                 8710                 8715
Lys Val  Met Gly Lys Leu Glu  Gln Phe Ile Asn His  Ala Asp Ser
    8720                 8725                 8730
Val Glu  Asn Ser Asp Asn Tyr  Arg Gln Ala Asp Asp  Asp Lys Ile
    8735                 8740                 8745
Ile Ala  Tyr Asp Asp Ala Leu  Glu His Gly Gln Asp  Ile Gln Lys
    8750                 8755                 8760
Ser Asn  Ala Thr Gln Asn Glu  Ala Lys Gln Ala Leu  Gln Gln Leu
    8765                 8770                 8775
Ile Asn  Ala Glu Thr Ser Leu  Asn Gly Phe Glu Arg  Leu Asn His
    8780                 8785                 8790
Ala Arg  Pro Arg Ala Leu Glu  Tyr Ile Lys Ser Leu  Glu Lys Ile
    8795                 8800                 8805
Asn Asn  Ala Gln Lys Ser Ala  Leu Glu Asp Lys Val  Thr Gln Ser
    8810                 8815                 8820
His Asp  Leu Leu Glu Leu Glu  His Leu Val Asn Glu  Gly Thr Asn
    8825                 8830                 8835
Leu Asn  Asp Ile Met Gly Glu  Leu Ala Asn Ala Ile  Val Asn Asn
    8840                 8845                 8850
Tyr Ala  Pro Thr Lys Ala Ser  Ile Asn Tyr Ile Asn  Ala Asp Asn
    8855                 8860                 8865
Leu Arg  Lys Asp Asn Phe Thr  Gln Ala Ile Asn Asn  Ala Arg Asp
    8870                 8875                 8880
Ala Leu  Asn Lys Thr Gln Gly  Gln Asn Leu Asp Phe  Asn Ala Ile
    8885                 8890                 8895
Asp Thr  Phe Lys Asp Asp Ile  Phe Lys Thr Lys Asp  Ala Leu Asn
    8900                 8905                 8910
Gly Ile  Glu Arg Leu Thr Ala  Ala Lys Ser Lys Ala  Glu Lys Leu
    8915                 8920                 8925
Ile Asp  Ser Leu Lys Phe Ile  Asn Lys Ala Gln Phe  Thr His Ala
    8930                 8935                 8940
Asn Asp  Glu Ile Met Asn Thr  Asn Ser Ile Ala Gln  Leu Ser Arg
    8945                 8950                 8955
Ile Val  Asn Gln Ala Phe Asp  Leu Asn Asp Ala Met  Lys Ser Leu
    8960                 8965                 8970
Arg Asp  Glu Leu Asn Asn Lys  Ala Phe Pro Val Gln  Ala Ser Ser
    8975                 8980                 8985
Asn Tyr  Ile Asn Ser Asp Glu  Asp Leu Lys Gln Gln  Phe Asp His
    8990                 8995                 9000
Ala Leu  Ser Asn Ala Arg Lys  Val Leu Ala Lys Glu  Asn Gly Lys
    9005                 9010                 9015
Asn Leu  Asp Glu Ile Gln Ile  Glu Gly Leu Lys Gln  Val Ile Glu
    9020                 9025                 9030
Asp Thr  Lys Asp Ala Leu Asn  Gly Ile Gln Arg Leu  Ser Lys Ala
    9035                 9040                 9045
Lys Ala  Lys Ala Ile Gln Tyr  Val Gln Ser Leu Ser Tyr Ile Asn
    9050                 9055                 9060
Asp Ala  Gln Arg His Ile Ala  Glu Asn Asn Ile His  Asn Ser Asp
    9065                 9070                 9075
Asp Leu  Ser Ser Leu Ala Asn  Thr Leu Ser Lys Ala  Ser Asp Leu
    9080                 9085                 9090
Asp Asn  Ala Met Lys Asp Leu  Arg Asp Thr Leu Glu  Ser Asn Ser
    9095                 9100                 9105
Thr Ser  Val Pro Asn Ser Val  Asn Tyr Ile Asn Ala  Asp Lys Asn
    9110                 9115                 9120
Phe Gln  Ile Glu Phe Asp Glu  Ala Leu Gln Gln Ala  Ser Ala Thr
    9125                 9130                 9135
Ser Ser  Lys Thr Ser Glu Asn  Pro Ala Thr Ile Glu  Glu Val Leu
    9140                 9145                 9150
Gly Leu  Ser Gln Ala Ile Tyr  Asp Thr Lys Asn Ala  Leu Asn Gly
    9155                 9160                 9165
Glu Gln  Arg Leu Ala Thr Glu  Lys Ser Lys Asp Leu  Lys Leu Ile
    9170                 9175                 9180
Lys Gly  Leu Lys Asp Leu Asn  Lys Ala Gln Leu Glu  Asp Val Thr
    9185                 9190                 9195
Asn Lys  Val Asn Ser Ala Asn  Thr Leu Thr Glu Leu  Ser Gln Leu
    9200                 9205                 9210
Thr Gln  Ser Thr Leu Lys Leu  Asn Asp Lys Met Lys  Leu Leu Arg
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Asp Lys  Leu Lys Thr Leu Val  Asn Pro Val Lys Ala  Ser Leu Asn
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Tyr Arg  Asn Ala Asp Tyr Asn  Leu Lys Arg Gln Phe  Asn Lys Ala
    9245                 9250                 9255
Leu Lys  Glu Ala Lys Gly Ile  Leu Asn Lys Asn Ser  Gly Pro Asn
    9260                 9265                 9270
Val Asn  Ile Asn Asp Ile Gln  His Leu Leu Thr Gln  Ile Asp Asn
    9275                 9280                 9285
Ala Lys  Asp Gln Leu Asn Gly  Glu Arg Arg Leu Lys  Glu His Gln
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Gln Lys  Ser Glu Val Phe Ile  Ile Lys Glu Leu Asp  Ile Leu Asn
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Asn Ala  Gln Lys Ala Ala Ile  Ile Asn Gln Ile Arg  Ala Ser Lys
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Asp Ile  Lys Ile Ile Asn Gln  Ile Val Asp Asn Ala  Ile Glu Leu
    9335                 9340                 9345
Asn Asp  Ala Met Gln Gly Leu  Lys Glu His Val Ala  Gln Leu Thr
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Leu Lys  Leu Gln Tyr Asp Tyr  Ala Ile Asn Leu Ala  Asn Asn Val
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Leu Asp  Lys Glu Asn Gly Thr  Asn Lys Asp Ala Asn  Ile Ile Ile
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Gly Met  Ile Gln Asn Met Asp  Asp Ala Arg Ala Leu  Leu Asn Gly
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Ala Ile  Asn Lys Gln Gln Ile  Glu Asn Ala Thr Thr  Lys Leu Asp
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Ile Asn  Asn Asn Thr Asp Leu  Thr Pro Ser Gln Lys  Ala His Ala
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Gly Leu  Thr Ser Asn Glu Lys  Thr Gln Phe Asp Lys  Gln Leu Thr
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Gln Ser   Thr Lys Lys Val Val   Lys Thr Lys Lys Arg   Ser Lys Lys
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<210>33
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<212>DNA
<213>表皮葡萄球菌
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tgtaaacata taaagggaaa gtatgctgga acaccaattg aattagaatt atggcaaaaa    300
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<210>34
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<213>表皮葡萄球菌
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<213>表皮葡萄球菌
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gttgtcgttg tagtaattgg ttttgttttc tttaatgtcc cgatacaaat attattatta    120
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atcgttgata atgcaataga attaaatgat gctatgcaag gtttaaaaga acatgtagct    28080
caattaacag caactacaaa agacaacatt gaatatttaa atgctgatga agaccttaaa    28140
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catgcagatg aattacctaa agcgaaacta gatgctaatc aaatgattga ccaaaaagtt    28560
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tctaaaaagt  aa                                                       30612

Claims (48)

1.一种免疫原性组合物，其包含具有选自一或多个SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32、其生物等效物或其片段的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述多肽可与受表皮葡萄球菌(Staphylococus epidermidis)感染的兔的血清中的抗体免疫反应。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述多肽与一或多种兔血清蛋白结合。
4.根据权利要求1至3中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其另外包含医药学上可接受的载剂。
5.根据权利要求1至4中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其另外包含一或多种佐剂。
6.根据权利要求1至5中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽是从表皮葡萄球菌获得。
7.根据权利要求1至6中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽另外包含异源氨基酸。
8.根据权利要求1至7中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽为融合多肽。
9.根据权利要求1至8中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽为重组多肽。
10.根据权利要求1至9中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽是从表皮葡萄球菌分离。
11.根据权利要求1至10中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽包含表皮葡萄球菌的中和表位。
12.根据权利要求1至11中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽为脂蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，所述组合物另外包含表皮葡萄球菌多糖抗原。
14.根据权利要求1至13中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，所述组合物另外包含金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)多糖或多肽抗原。
15.根据权利要求1至14中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽包含选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：30、其生物等效物或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌多肽序列。
16.根据权利要求1至15中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述多肽是由聚核苷酸编码，所述聚核苷酸包含与选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64中一者或其简并变异体或其片段的核苷酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸是得自表皮葡萄球菌。
18.根据权利要求1至17中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述表皮葡萄球菌聚核苷酸序列是选自由SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：62或其简并变异体或其片段组成的群组。
19.根据权利要求1至18中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸另外包含异源核苷酸。
20.一种免疫原性组合物，其包含具有选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64中一者、其简并变异体或其片段的核苷酸序列的聚核苷酸，且所述聚核苷酸是包含于表达载体中。
21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中所述表皮葡萄球菌聚核苷酸序列是选自由SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：62或其简并变异体或其片段组成的群组。
22.根据权利要求20或21所述的免疫原性组合物，其中所述载体为质粒DNA。
23.根据权利要求20至22中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸为重组聚核苷酸。
24.根据权利要求20至23中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸是从表皮葡萄球菌获得。
25.根据权利要求24所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸包含异源核苷酸。
26.根据权利要求20至23中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸操作地连接到一个或多个基因表达调控元件。
27.根据权利要求24所述的免疫原性组合物，其中所述聚核苷酸引导表皮葡萄球菌的中和表位的表达。
28.根据权利要求20至23中任一或多项权利要求所述的免疫原性组合物，其另外包含转染促进剂。
29.根据权利要求28所述的免疫原性组合物，其中所述转染促进剂为布比卡因(bupivicaine)。
30.一种诱导对抗表皮葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：具有选自一或多个SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32或其生物等效物或其片段的氨基酸序列的多肽，和医药学上可接受的载剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述多肽另外包含异源氨基酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述多肽为融合多肽。
33.根据权利要求30所述的方法，其另外包含佐剂。
34.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述多肽为重组多肽。
35.一种诱导对抗表皮葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：具有选自一或多个SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64、其简并变异体或其片段的核苷酸序列的聚核苷酸，和医药学上可接受的载剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其另外包含载体。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述载体为质粒DNA。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述聚核苷酸为重组聚核苷酸。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述聚核苷酸另外包含异源核苷酸。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述聚核苷酸操作地连接到一个或多个基因表达调控元件。
41.根据权利要求35所述的方法，其另外包含佐剂。
42.根据权利要求35所述的方法，其中所述组合物另外包含转染促进剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述转染促进剂为布比卡因。
44.一种诱导对抗金黄葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：30、其生物等效物或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌多肽序列。
45.一种诱导对抗金黄葡萄球菌的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与免疫原性量的组合物，所述组合物包含：选自由SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：62或其简并变异体或其片段组成的群组的表皮葡萄球菌聚核苷酸序列。
46.一种用于检测和/或鉴别生物样本中的表皮葡萄球菌的方法，其包含：
(a)在允许杂交的条件下，使所述样本与聚核苷酸的寡核苷酸探针接触，所述聚核苷酸包含选自SEQ ID NO：33到SEQ ID NO：64中一者或其简并变异体或其片段的核苷酸序列；和
(b)检测所述样本中杂交复合物的存在，其中杂交复合物表明所述样本中存在表皮葡萄球菌。
47.一种用于检测和/或鉴别生物样本中抗表皮葡萄球菌的抗体的方法，其包含：
(a)在允许免疫复合物形成的条件下，使所述样本与多肽接触，所述多肽包含选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：32中一者或其生物等效物或其片段的氨基酸序列；和
(b)检测所述样本中免疫复合物的存在，其中免疫复合物表明所述样本中存在表皮葡萄球菌。
48.一种根据权利要求1至29中任一或多项权利要求所述的组合物，其是用于诱导对抗表皮葡萄球菌的免疫反应的方法中。
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