KR20070068455A

KR20070068455A - 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 항원의 면역원성조성물

Info

Publication number: KR20070068455A
Application number: KR1020077011032A
Authority: KR
Inventors: 브렛 리차드 셀먼; 스티븐 모리스 베이커
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2007-06-29
Also published as: IL182546A0; WO2007001423A2; ZA200703274B; JP2008517918A; AR051826A1; CN101175508A; US8445000B2; EP2340848A3; EP1802335A2; BRPI0516974A; EP2340848A2; JP2013121981A; AU2005333603A1; EP2298341A3; CA2583121A1; EP2213298A2; EP2298341A2; TW200619228A; WO2007001423A3; US20150196629A1

Abstract

본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로부터 분리된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 면역원성 조성물 중에서의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 면역원성 조성물을 사용하여 스타필로코커스 에피더미디스 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 면역 반응을 포유동물 내에서 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 시료 중에서 스타필로코커스 에피더미디스를 검출하는 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 항원의 면역원성 조성물{IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS POLYPEPTIDE ANTIGENS}

본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로부터 분리된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이의 면역원성 조성물 중에서의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 면역원성 조성물을 사용하여 스타필로코커스 에피더미디스 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 면역 반응을 포유동물 내에서 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 시료 중에서 스타필로코커스 에피더미디스를 검출하는 방법에 관한 것이기도 하다.

스타필로코커스 에피더미디스는 보통 사람의 피부와 점막에 존재하는 미생물 군(microbial flora) 중 가장 흔한 구성원으로서, 한때에는 감염된 환자 시료로부터 배양되는 오염균으로서만 치부되었다. 문헌[Heilmann, C. and G.Peters, Biology and pathogenicity of Staphylococcus epidermidis, in Gram-positive pathogens, V.A. Fischetti, Editor. 2000, American Society for Microbiology: Washington, D.C. p. 442-449; von Eiff, C외 다수, Lancet Infect Dis, 2(11): p. 677-85 (2002)]을 참조하시오. 그러나, 현재는 기회 감염균(opportunistic pathogen)으로서 주목받고 있으며, 또한 병원 혈류 감염(nosocomial bloodstream infection)의 주요 원인인 것으로서 여겨지고 있다. 문헌[Am J Infect Control, 27: p. 520-32 (1999); Diekema, D.J.외 다수, Int J Antimicrob Agents, 20(6): p.412-8 (2002); Edmond, M.B.외 다수, Clin Infect Dis, 29(2): p. 239-44 (1999)]을 참조하시오. 이러한 감염은 주로 내재하고 있으며, 중합체로 이루어진 외래 기구 예를 들어, 정맥 카테터, 인공 관절 또는 인공 판막과의 접촉과 관련되어 있다. 문헌[Heilmann, C. and G. Peters, Biology and pathogenicity of Staphylococcus epidermidis, in Gram-positive pathogens, V.A. Fischetti, Editor. 2000, American Society for Microbiology: Washington, D.C. p. 442-449; von Eiff, C외 다수, Lancet Infect Dis, 2(11): p. 677-85 (2002)]을 참조하시오. 감염은 인공 장치를 환자의 몸에 삽입할 때에 환자의 피부에 있던 스타필로코커스 에피더미디스가 함께 도입되는 것에 기인하는 것으로 생각된다. 군체 형성 및 이후의 균막(biofilm) 형성은 혈행을 통하여 체내 다른 부위로 퍼져나갈 수 있는 균혈증(bacteremia)을 유발시킬 수 있다. 생물 막 내에 존재하던 박테리아가 항생제를 처리하였음에도 불구하고 일부 생존함으로 인하여 유발되는 감염은 치료가 어려울 뿐만 아니라, 감염의 원인이 되는 임상 분리 주는 항생제 내성이 증가하게 된다. 문헌[Diekema, D.J.외 다수, lnt J Antimicrob Agents, 20(6): p. 412-8 (2002); Edmond, M.B.외 다수, Clin Infect Dis, 29(2): p. 239-44 (1999); Lewis, K., Antimicrob Agents Chemother, 45(4): p. 999-1007 (2001); Raad, I. et al., Clin Infect Dis, 26(5): p. 1182-7 (1998)]을 참조하시오. 반코마이신(vancomycin)에 대한 감수성이 떨어지는 스타필로코커스 에피더미디스에 관하여 보고된 바 있다. 문헌[Sanyal, D. and D. Greenwood, J Med Microbiol,. 39(3): p. 204-10 (1993); Sanyal, D.외 다수, Lancet, 337(8732): p. 54 (1991)]을 참조하시오. 이와 같이 감염의 치료에 따른 어려움으로 인하여, 감염을 막기 위한 수단으로서 면역화시키는 것이 필요하게 되었다.

균막 형성은 스타필로코커스 에피더미디스 감염에 있어서 주요 독성(virulence) 결정 인자이다. 결과적으로, 스타필로코커스 에피더미디스 표면 단백질에 관한 연구는 이러한 균막 형성에 관련된 단백질에 초점이 맞추어졌다. 이러한 단백질은 균막 형성 과정에 있어서 2가지 주요 단계에 대한 연관성을 기초로 하여 몇몇 그룹으로 세분화되었다: 1) 1차적 부착 과정 관련 단백질로서, 스타필로코커스 표면 단백질-1(SSP-1), 자기 소화 효소(autolysin)(AtIE), Fbe(SdrG) 및 GehD 와, 2) 박테리아 세포 축적 관련 단백질로서, Bap 동종 단백질(homologous protein)(Bhp), 축적 관련 단백질(AAP) 및 자기 소화 효소(AtIE). 문헌[von Eiff, C외 다수, Lancet Infect Dis, 2002. 2(11): p. 677-85; Vuong, C외 다수, J Infect Dis, 188(5): p. 706-18 (2003); Veenstra, G.J.외 다수, J Bacteriol., 178(2): p. 537-41 (1996); Rupp, M.E.외 다수, J Infect Dis, 183(7): p. 1038-42 (2001); Hussain, M.외 다수, Infect Immun, 65(2): p. 519-24 (1997); Nilsson, M.외 다수, Infect Immun, 66(6): p. 2666-73 (1998); Davis, S.L.외 다수, J Biol Chem, 276(30): p. 27799-805 (2001); 및 Bowden, M.G.외 다수, J Biol Chem, 277(45): p. 43017-43023 (2002)]을 참조하시오. 숙주 내에서 일어나는 환경 자극에 노출됨에 따라서 발현되는 표면 단백질 또는 숙주-기생체 상호 작용에 관련된 표면 단백질을 동정하는데에는 그다지 어렵지는 않았다.

스타필로코커스 에피더미디스는 공생체에서 병원체로 변이되어 숙주 내 미세 환경에 적응을 하여야 한다. 공생체에서 병원체로 변이되는 경우, 스타필로코커스 에피더미디스는 숙주 조직에 침투할 수 있는 통로를 확보하여, 숙주의 환경 변화를 감지하고, 유전자 발현을 변형시켜 숙주의 방어 기작을 무너뜨리고, 숙주 인자에 붙어 부착하여야 하며, 상이한 영양분 및 숙주 방어 기작에 따라서 성장 및 분열을 하여야 한다. 박테리아 표면에 존재하는 단백질은 숙주 내 새로운 환경과 처음으로 접촉하게 된다. 이러한 단백질의 다수의 기능으로서는, 환경을 감지하는 기능, 영양분을 찾아내어 이동시키는 기능, 숙주 면역계에 대하여 방어하는 기능 그리고 숙주 단백질에 결합하는 기능을 포함한다. 표면에 노출된 단백질은 또한 숙주 면역계에 의해 접촉 또는 인지되는 지점으로서의 역할을 할 수 있으며, 박테리아에 대한 체액성 면역 반응의 표적이 될 수 있다[Josefsson, E.외 다수, J Infect Dis, 184(12): p. 1572-80 (2001); Swiatlo, E.외 다수, Infect Immun, 71(12): p. 7149-53 (2003); Grifantini, R.외 다수, Nat Biotechnol, 20(9): p. 914-21 (2002)]. 그러므로, 스타필로코커스 에피더미디스의 혈청형을 유도하는 질병에 대한 면역 반응을 유발시키는 면역원성 조성물에 사용될 단백질로서 스타필로코커스 에피더미디스 단백질 중 유력한 후보 단백질을 동정할 필요성이 대두되고 있다.

발명의 개요

본 발명은 서열 번호 1∼서열 번호 32중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 스타필로코커스 에피더미디스로 감염된 토끼의 혈청 중 항체와는 면역 반응성이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 토끼 혈청 단백질과 결합한다.

임의의 구체예에서, 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 또한 하나 이상의 애쥬반트(adjuvant)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물은 추가로 스타필로코커스 에피더미디스 다당류 항원을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물은 추가로 스타필로코커스 아우레우스 다당류 또는 폴리펩티드 항원을 포함한다.

본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스로부터 분리된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명은 폴리펩티드가 추가로 이종 아미노산을 포함하는, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스의 중화 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 임의의 구체예에서, 폴리펩티드는 리포단백질이다.

본 발명은 추가로 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는데, 여기서 이 폴리펩티드는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편에 의해 암호화되는 것이다. 특정 구체예에서, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 62 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드가 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래된 면역원성 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 추가로 이종 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터이다. 또 다른 구체예에서, 발현 벡터는 플라스미드 DNA이다. 임의의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스의 중화 에피토프의 발현을 유도한다.

본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 스타필로코커스 에피더 미디스 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는데, 이 면역원성 조성물은 형질 감염 촉진제(transfection facilitating agent)를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 형질 감염 촉진제는 부피비카인이다.

본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스에 대하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나 이상으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 면역 유발량(immunogenic amount)으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 스타필로코커스 에피더미디스에 대하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 서열 번호 33∼서열 번호 64중 하나 이상으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 면역 유발량으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 또한 이 조성물은 발현 벡터 중에 포함되어 있다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 이종 뉴클레오티드를 포함한다.

임의의 구체예에서, 본 발명은 생물학적 시료 중에서 스타필로코커스 에피더 미디스를 검출 및/또는 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 혼성화가 가능한 조건 하에서, 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편의 올리고뉴클레오티드 프로브를 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 시료 중 혼성화 복합체가 존재하는지 여부를 검출하는 단계로서, 이 혼성화 복합체는 시료 중 스타필로코커스 에피더미디스가 존재함을 나타내는 지표인 것인 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 생물학적 시료 중 스타필로코커스 에피더미디스에 대한 항체를 검출 및/또는 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 면역 복합체 형성이 가능한 조건 하에서, 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 시료 중 면역 복합체가 존재하는지 여부를 검출하는 단계로서, 이 면역 복합체는 시료 중 스트렙토코커스 뉴모니아애(streptococcus pneumoniae)가 존재함을 나타내는 지표인 것인 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 면역원성 조성물은 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역원성 조성물은 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51 , 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 포유동물에 면역 유발량으로 투여하는 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 포유동물에 면역 유발량으로 투여하는 단계를 포함한다.

도 1은 TSB 중에서 생육시킨 에스.에피더미디스 0-47(A 및 C) 또는 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 에스.에피더미디스 0-47(B 및 D)로부터 유래하는 세포벽 분획의 단백질 발현 프로필을 2D 겔 전기 영동에 의하여 비교한 결과를 나타내는 것 이다. 단백질을 pH4∼7의 IPG 스트립 상에서 1차원적으로, 그리고 SDS-PAGE에 의해서 2차원적으로 분리시킨 다음, 이를 니트로셀룰로즈에 옮기고 형광 염색(A 및 C)으로 검출하였다. 면역 반응성 단백질을 에스.에피더미디스 0-47에 감염된 토끼로부터 유래하는 면역 혈청을 이용하여 시각화하였다(B 및 D). 분자량 마커는 좌측에 표시하였다.

도 2는 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 에스.에피더미디스 0-47로부터 유래하는 세포 표면 분획을 pH4∼7의 IPG 스트립 상에서 1차원적으로, 그리고 SDS-PAGE에 의해서 2차원적으로 분리시킨 다음, 이를 형광 염색 블럿팅(A) 및 면역 블럿팅(B)시킨 결과를 나타내는 것이다. 스팟에 존재하는 단백질은 질량 분광 분석법에 의해 동정되었다.

도 3은 NaCl 또는 4.0 M 우레아의 농도를 증가시키면서, TSB 또는 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 에스.에피더미디스 0-47의 표면으로부터 용리된 단백질의 분석 결과를 나타내는 것이다. *는 혈청이 존재하는 조건 하에서 생육 시킨 에스. 에피의 표면으로부터 용리된 단백질이 다량 존재함을 나타내는 것이다. 박테리아를 3×TBS로 세척하고, 그 다음 0.5M NaCl → 1.0M NaCl → 4.0M 우레아로 세척하였다. 단백질 농도는 각 시료에 대해 측정하였으며, 이 시료 중 0.75 ㎍을 4∼20% 구배의 겔 상에서 전개시켰다. TSB 생육 박테리아(래인 2∼5)의 표면으로부터 용리된 시료를 단백질 검정한 결과, 단백질은 발견되지 않았으므로, 시료 중 25㎕를 겔에 다시 로딩하였다. 래인 1 = 토끼 혈청; 래인 2 및 6 = 0.15M NaCl 용리액; 래인 3 및 7 = 0.5M NaCl; 래인 4 및 8 = 1.0M NaCl; 래인 5 및 9 = 4.0M 우레아.

도 4는 에스.에피더미디스로부터 유래된 세포 표면 단백질을 2차원적으로 이동시킨 결과를 나타내는 것으로서, 여기서 이 단백질은 형광 염색하였으며(A) 또한, 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 에스.에피더미디스로부터 용리된 바이오틴화 혈청 단백질로 프로빙하였다(4B). 스팟을 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트로 시각화하였다. 스팟에 존재하는 단백질은 질량 분광 분석법으로 동정하였다.

숙주의 혈류에 노출됨에 따라서, 침투한 박테리아는 새로운 환경에 특이적인 환경 자극을 만나게 된다. 이러한 자극은 박테리아에 의해 감지되고, 또한 세포벽 정제 단백질 중에서 검출될 수 있는 단백질의 발현에 있어서 순응성인 변화를 암시한다. 종종 박테리아 세포 벽에 있는 단백질과 탄수화물은 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물에 포함될 후보 물질이 된다. 상승 조절된 단백질이 숙주와 상호 작용을 하는지 또는 영양 획득에 어떤 역할을 하고 있는지 여부는 박테리아에게 중요한 것으로서, 박테리아의 생존과 발병과정에 한몫을 담당하고 있다. 체액(즉, 혈청, 복강 내 투석액 및 소변) 중에서의 박테리아 생장은 박테리아가 숙주 내에서 맞닥뜨리게 되는 신호 중 일부를 모의하는 모델 시스템으로서 사용되고 있다. 문헌[Wiltshire, M.D. and S.J. Foster, Infect Immun, 69(8): p. 5198-202 (2001); Shepard, B.D. and M.S. Gilmore, Infect Immun, 70(8): p. 4344-52 (2002); Smith, D.G.외 다수, Infect Immun, 59(2): p. 617-24 (1991); McDermid, K.P.외 다수, Infect Immun, 61(5): p. 1743-9 (1993)]을 참조하시오. 이러한 배양 조건 중 하나 이상은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스.아우레우스(S.aureus) 및 스타필로코커스 에피더미디스의 유전자 발현을 변형시키고, 변형된 배양 조건 하에서 발현량이 증가하는 것으로 확인된 단백질들은 다양한 기능을 보유하는 단백질의 상이한 부류에 속하는 것으로 파악되었다. 문헌[Wiltshire, M.D. and S.J. Foster, Infect Immun, 69(8): p. 5198-202 (2001); Shepard, B.D. and M.S. Gilmore, Infect Immun, 70(8): p.4344-52 (2002)]을 참조하시오.

스타필로코커스 에피더미디스 감염에 있어서 가장 일반적인 소인 요인은 인공 장치의 이식에 의한 것이다. 이식된 인공 장치는 혈장과 기질 단백질 예를 들어, 피브리노겐, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자 및 피브로넥틴으로 피복된다. 문헌[von Eiff, C외 다수,. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 18(12): p. 843-6 (1999)]을 참조하시오. 이러한 단백질은 종종 스타필로코커스 에피더미디스 표면 단백질에 대한 리간드로서 작용을 하여, 박테리아가 인공 장치에 결합하여 이것에 균체를 형성하게 만든다. 스타필로코커스 에피더미디스는 피브리노겐, 비트로넥틴 및 피브로넥틴에 결합하는 단백질을 발현하는 것으로 공지되어 있다. 문헌[Nilsson, M.외 다수, A fibrinogen-binding protein of Staphylococcus epidermidis. Infect Immun, 66(6), p. 2666-73 (1998); Davis, S.L.외 다수, J Biol Chem, 276(30), p. 27799-805 (2001); Williams, R.J.외 다수, Infect Immun,. 70(12), p. 6805-10 (2002); Heilmann, C외 다수, Mol. Microbiol, 24(5), p. 1013-24 (1997)]을 참조하시오. 스타필로코커스 에피더미디스는 이를 공생체에서 병원체로 변이시키는 부가적 혈청 단백질에 결합할 것이다.

본원에 기술된 발명은 스타필로코커스 에피더미디스의 혈청형에 의해 유발되는 질병의 대부분 또는 모두를 효과적으로 예방 또는 치료하는 스타필로코커스 에피더미디스 면역원성 조성물에 대한 요구에 부응하는 것이다. 본 발명은 추가로 스타필로코커스 에피더미디스 감염을 진단하는 방법에 대한 요구에도 부응하는 것이다. 본 발명은 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 스타필로코커스 에피더미디스의 개방 해독틀(이하 "ORF"라 칭함)을 동정하였다. 더욱 구체적으로, 상기 스타필로코커스 에피더미디스의 ORF는 면역원성 조성물 중 유효한 항원성 폴리펩티드로서 사용되는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 본 발명은 표면에 국소화된 형태, 노출형, 분비형 또는 막 결합형 폴리펩티드 항원을 암호화하는 스타필로코커스 에피더미디스의 폴리뉴클레오티드 ORF를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 ORF 서열을 포함하는 벡터와, 이 벡터로 형질 전환, 형질 감염 또는 감염된 숙주 세포 또는 동물을 포함한다. 본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스의 ORF 예를 들어, mRNA, 안티 센스 RNA, 안티 센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임 분자의 전사 유전자 산물을 포함하며, 이 전자 유전자 산물은 미생물의 생육을 억제 또는 제어하는데에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하는 방법과, 스타필로코커스 에피더미디스 감염을 진단하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 박테리아 감염, 구체적으로 스타필로코커스 에피더미디스에 의해 유발 또는 악화되는 감염을 예방 및/또는 치료하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 면역원성 조성물은 스타필로코커스 에피더미디스에 의하여 유발 또는 악화되는 전신성 질병의 치료 또는 예방에 사용된다. 다른 구체예에서, 면역원성 조성물은 스타필로코커스 에피더미디스에 의해 유발 또는 악화되는 비-전신성 질병의 치료 또는 예방에 사용된다.

A. 스타필로코커스 에피더미디스 ORF 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드

분리 및 정제된 스타필로코커스 에피더미디스 ORF 폴리뉴클레오티드는 면역원성 조성물에 포함될 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 생산에 사용되는 것으로서 확인된다. 더욱 구체적으로, 임의의 구체예에서, ORF는 스타필로코커스 에피더미디스의 표면 국소화 형태, 노출형, 막 결합형 또는 분비형 폴리펩티드, 구체적으로 항원성 폴리펩티드를 암호화한다. 그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 면역원성 조성물에 포함될 스타필로코커스 에피더미디스의 표면 국소화 형태, 노출형, 막 결합형 또는 분비형 폴리펩티드를 암호화하는 분리 및 정제된 폴리뉴클레오티드(ORF)를 동정한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자로서, 이 DNA는 게놈형 DNA, 염색체 DNA, 플라스미드 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 이는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화한다. 다른 구체예에서, 분리 및 정제된 ORF 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 33∼서열 번호 64의 ORF 뉴클레오티드 서열 중 하나와 95% 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열, 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 상보체를 포함한다. 하나의 구체예에서, 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나의 ORF 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터에 포함되며, 이는 또한 원핵 숙주 세포 중에서 발현된다.

이하에 사용될 "폴리뉴클레오티드"란 용어는, 포스포디에스테르 결합에 의하여 연결된 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 이하, 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 제시한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 약 10개∼약 수십만 개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 약 10개∼약 3000개의 염기쌍을 포함한다. 특정 폴리뉴클레오티드의 예시적 길이는 이하에 제시하였다.

본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA) 분자, 리보핵산(RNA) 분자, 또는 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체일 수 있다. 핵산 분자는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있으나, 이중 사슬 DNA가 바람직하다. 폴리뉴클레오티드가 DNA 분자인 경우, 그 분자는 유전자, cDNA 분자 또는 게놈형 DNA 분자일 수 있다. 뉴클레오티드 염기는 이하에 단일 문자 암호로 제시되어 있다: 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 이노신(I) 및 우라실(U).

"분리된"이란, 천연의 상태에서 "인간의 기술에 의해" 변형되었음을 의미한다. 만일 조성물 또는 물질이 "분리된" 것으로서 간주 되도록 천연의 상태로 존재하면, 그것은 본래의 상태와는 다르게 변화된 것이거나 또는 이로부터 분리된 것, 또는 둘 다일 것이다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이 아니지만, 천연 상태에서 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이하에 사용된 용어와 같이 "분리된" 것이다.

본원에 사용된 "분리된" 폴리뉴클레오티드는, 천연 상태에서는 핵산이 유래된 유기체의 게놈형 DNA 내에 존재하는 핵산(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)에 측접하는 유리 서열을 말한다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 분리된 스타필로코커스 에피더미디스 핵산 분자는, 천연의 상태에서는 핵산이 유래된 세포의 게놈형 DNA 중에 존재하는 핵산 분자에 측접하는, 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0. 1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 그러나, 스타필로코커스 에피더미디스 핵산 분자는 다른 단백질 암호화 서열 또는 조절 서열에 융합될 수 있으며, 또한 분리된 것으로서 간주 될 수 있다.

본원에 개시된 ORF 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 표준적인 클로닝 및 스크리닝 기술을 이용하여 mRNA로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 천연 공급원 예를 들어, 게놈형 DNA 라이브러리(예를 들어, 스타필로코커스 에피더미디스 라이브러리)로부터 얻을 수도 있으며, 또는 널리 공지되어 있고 산업상 이용 가능한 기술을 사용하여 합성될 수도 있다.

유전 암호의 축퇴성으로 인하여, 서열 번호 33∼서열 번호 64에 나타낸 뉴클레오티드 서열(및 이의 단편)과 상이하지만, 서열 번호 33∼서열 번호 64에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 동일한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자도 본원에 포함된다.

스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드의 상동 분자종(orthologue) 및 대립 형질 변이체는 당 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 용이하게 동정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 대립 형질 변이체 및 상동 분자종은 서열 번호 33∼서열 번호 64에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 이 뉴클레오티드 서열의 단편과 통상적으로 약 70∼75% 이상, 더욱 통상적으로 약 80∼85% 이상, 및 가장 통상적으로 약 90∼95% 이상 또는 그 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 이러한 핵산 분자는 엄중한 조건 하에서, 서열 번호 33∼서열 번호 64에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 이 뉴클레오티드 서열의 단편에 혼성화될 수 있는 것으로 용이하게 확인될 수 있다.

더욱이, 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 암호화 부위의 단편 예를 들어, 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나의 단편만을 포함할 수 있다. 임의의 구체예에서, 이러한 단편은 면역원성 단편을 암호화한다.

본 발명의 스타필로코커스 에피더미디스 ORF 폴리뉴클레오티드는 면역원성 조성물에 포함될 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하는 데에 사용되며, 이 폴리뉴클레오티드는 성숙한 폴리펩티드 자체에 대한 암호화 서열, 또는 다른 암호화 서열 예를 들어, 리더 또는 분비 서열, 전구 단백질 또는 보조 단백질(proprotein) 또는 프리프로 단백질(preproprotein) 서열 또는 기타 융합 펩티드 부분을 암호화하는 서열을 가지는 해독 틀 내에 존재하는 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 마커 서열은 암호화 서열에 결합될 수 있다[Gentz외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824, 1989; 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]. 그러므로, 본원은 발현 생산물의 His-태그 정제를 가능하게 하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 이 폴리뉴클레오티드는 또한 비-암호화 5' 및 3' 서열 예를 들어, 전사 서열, 비 전사 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널을 포함할 수도 있다.

그러므로, 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 스타필로코커스 에피더미디스 이외의 균종 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래되는 상동체 및 상동 분자종은, 엄중한 혼성화 조건 하에서 적당한 라이브러리를 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나의 서열을 가지는 표지화된 프로브, 또는 이의 단편으로 스크리닝하는 단계; 및 이 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 전장 cDNA 및 게놈형 클론을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 이러한 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 당업자는, 다수의 경우에 있어서 분리된 cDNA 서열은 이의 폴리펩티드를 암호화하는 부위가 cDNA의 5' 말단에서 절단되어 있기 때문에 불완전할 것이라는 사실을 이해할 것이다. 이는 역전사 효소가 본질적으로 "진행성(processivity)"[중합 반응시 효소가 주형에 결합한 채로 유지되는 능력의 척도]이 떨어져서, 첫 번째 cDNA 사슬 합성시 mRNA 주형의 DNA를 복사하는데에 실패하였기 때문이다.

그러므로, 임의의 구체예에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 정보를 통하여 이하에 개시된 선택 폴리뉴클레오티드의 유전자 서열에 특이적으로 혼성화되는 능력을 보유하는 비교적 짧은 DNA(또는 RNA) 올리고뉴클레오티드 서열을 제조할 수 있다. 본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"란 용어는, 2개 이상, 일반적으로 3개 이상, 및 통상적으로는 10개 이상 및 100개 이하 또는 그 이상(20∼30개가 바람직함)의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 분자로서 정의된다. 정확한 크기는 다수의 인자에 따라 달라질 것인 바, 예를 들어, 궁극적인 기능 또는 올리고뉴클레오티드의 사용 여부에 따라서 달라질 수 있다. 그러므로, 특정 구체예에서, 정확한 길이를 갖는 핵산 프로브는 선택된 뉴클레오티드 서열 예를 들어, 서열 번호 33∼서열 번호 64에 나타낸 서열을 고려하여 제조된다. 이러한 핵산 프로브가 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 능력은, 이 핵산 프로브가 다수의 구체예에서 특히 유용하도록 만들어 준다. 이때 가장 중요한 점은, 이 프로브가 소정의 시료 중에 상보성 서열이 존재하는지 여부를 검출하는 다수의 검정법에 사용될 수 있다는 점이다.

임의의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 것이 유리하다. 이러한 프라이머는 임의의 방식 예를 들어, 화학적 합성법, DNA 복제법, 역전사법 또는 이들의 조합법으로 생산될 수 있다. 이러한 프라이머의 서열은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 이용하여 원핵 세포에서 유래된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 ORF 폴리뉴클레오티드의 한정된 절편을 검출, 증폭 또는 돌연 변이시키는데에 사용된다고 기술된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 디자인된다.

임의의 구체예에서, 혼성체 형성 여부를 검출하는데에 적당한 표지와 함께 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리하다. 검출 가능한 신호를 방출할 수 있는 다수의 적당한 표지 예를 들어, 방사성 표지, 효소 표지 또는 기타 리간드 예를 들어, 아비딘/바이오틴에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다.

서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나 또는 이의 단편에 포함된 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 충분히 동일한 폴리뉴클레오티드는 cDNA 및 게놈형 DNA에 대한 혼성화 프로브로서, 또는 핵산 증폭(PCR) 반응용 프라이머로서 사용되어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 게놈형 클론 및 전장 cDNA와, 서열 번호 33∼서열 번호 64에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과의 서열 유사성이 큰 기타 유전자(예를 들어, 스타필로코커스 에피더미디스 이외의 균 종으로부터 유래된 상동체 및 상동 분자종을 암호화하는 유전자)의 게놈형 클론 및 cDNA를 분리해 낼 수 있다. 통상적으로, 이러한 뉴클레오티드 서열은 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70%∼약 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 프로브 또는 프라이머는 일반적으로 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 것이며, 50개 이상의 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 특히 바람직한 프로브는 30∼50개의 뉴클레오티드를 보유할 것이다.

전장 cDNA를 얻거나, 또는 짧은 cDNA를 연장시키기 위한 몇몇 방법 예를 들어, cDNA 말단의 급속 증폭법(RACE)을 바탕으로 하는 방법이 당 업자에 의해 수행 가능하며 또한 널리 공지되어 있다. 문헌[Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988]을 참조하시오. 이러한 기술에 있어서 최근의 변법 예를 들어, 마라톤™ 기술(Clontech Laboratories Inc.)은 보다 긴 cDNA를 찾아내기 위한, 상당히 간단한 기술이다. 마라톤™ 기술에 있어서, cDNA는 선택된 조직으로부터 추출된 mRNA로써 제조되고, "어댑터(adaptor)" 서열은 각각의 말단부에 결찰된다. 이후 핵산 증폭(PCR) 과정이 수행되며, 이때 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 어댑터 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 조합 사용함으로써 cDNA의 "흠결된" 5' 말단부가 증폭된다. 이후 PCR 반응은 "내재(nested)" 프라이머 즉, 증폭된 생산물 내에서 어닐링되도록 디자인된 프라이머[통상적으로, 어댑터 서열 내 3' 말단에 추가로 어닐링되는 어댑터 특이적 프라이머 및 공지의 유전자 서열 내 5' 말단에 추가로 어닐링되는 유전자 특이적 프라이머]를 사용하여 반복 수행된다. 이 반응의 생산물은 이후 DNA 서열 결정에 의해 분석될 수 있으며, 또한 생산물을 현존하는 cDNA에 직접 결합시켜 완전한 서열을 형성하거나, 또는 5' 프라이머 디자인에 관한 새로운 서열 정보를 이용하여 개별 전장 PCR을 수행함으로써 구성된 전장 cDNA를 통하여 분석될 수 있다.

본 발명에 따른 임의의 이점을 제공하기 위하여, 혼성화 연구 또는 검정법에 사용된 바람직한 핵산 서열로서는, 길이 약 10∼약 70 뉴클레오티드 이상인 폴리뉴클레오티드에 상보성인 프로브 분자를 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 것으로서, 그 예로서는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나가 있다. 길이가 10 뉴클레오티드 이상이라는 사실을 통해서, 단편은 안정하고 선택적인 이중체 분자를 형성하기에 충분한 길이를 가질 것이라는 사실을 보증할 수 있다. 일반적으로, 혼성체의 안정성과 선택성을 증가시켜 얻어진 특이 혼성체 분자의 특성과 특이성 정도를 개선시키기 위해서는, 길이가 10 염기 이상인 구역에 상보성인 서열을 가지는 분자가 바람직하다. 일반적으로 당업자는 25∼40 뉴클레오티드, 55∼70 뉴클레오티드, 또는 원할 경우 그 이상의 유전자-상보성 구역을 보유하는 핵산 분자를 디자인하는 것을 선호할 것이다. 이러한 단편은 예를 들어, 화학적 방법, 핵산 증폭 기술 예를 들어, PCR 기술(미국 특허 제4,683,202호; 본원에 참고용으로 인용됨)에 의하여 직접 합성되거나, 또는 적당한 삽입부와 적당한 제한 효소 위치를 함유하는 재조합 플라스미드로부터 선택한 DNA 단편을 절개함으로써 얻어진, 단편을 직접 합성함으로써 용이하게 생산될 수 있다.

다른 구체예에서, 분리 및 정제된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나의 절편(10개 이상의 염기로 이루어진 절편)과 동일하거나 또는 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 간주되며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화된다. 바람직하게, 분리 및 정제된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나의 연속 염기 절편(25개 이상∼약 70개의 연속 염기 절편)과 동일하거나 또는 이에 상보성인 염기 서열을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 개시된 뉴클레오티드 서열의 40개 또는 55개의 연속 염기와 동일하거나 또는 이에 상보성인 염기 절편을 포함할 수 있다.

따라서, 폴리뉴클레오티드 프로브 분자는 유전자의 상보성 구역의 이중체 분자를 선택적으로 형성할 수 있는 능력으로 인하여 사용될 수 있다. 구체화된 예에 따라서, 당업자는 표적 서열에 대한 프로브(이하 표 1a ∼ 1b 참조)의 선택성을 다양화시킬 수 있는 다양한 혼성화 조건을 이용하기를 원할 것이다. 고도의 선택성이 필요한 경우, 당업자는 통상적으로 혼성체를 형성하는데에 비교적 엄중한 조건을 이용하기를 원할 것이다. 일부의 경우 예를 들어, 근원 주형에 혼성화된 돌연 변이 프라이머 사슬을 사용하여 돌연 변이체를 생산하고자 하는 경우, 또는 기타 세포로부터 스타필로코커스 에피더미디스 상동성 폴리펩티드 암호화 서열을 분리하고자 하는 경우, 기능상 균등 범위에 속하되, 엄중도가 떨어지는 혼성화 조건은 통상적으로 이형 이중체(heteroduplex)를 형성할 수 있어야 한다(표 1a ∼ 1b 참조). 이로써 교차 혼성화(cross-hybridizing) 종은 대조구 혼성화에 관하여 양의 혼성화 시그널로서 용이하게 확인될 수 있다. 그러므로, 혼성화 조건은 쉽게 조작할 수 있으므로, 일반적으로 목적으로 하는 결과에 따라서 선택할 수 있는 방법일 것이다.

일부의 경우 예를 들어, 근원 주형에 혼성화된 돌연 변이 프라이머 사슬을 사용하여 돌연 변이체를 생산하고자 하는 경우, 또는 기타 세포로부터 상동성 폴리펩티드 암호화 서열을 분리하고자 하는 경우, 기능상 균등 범위에 속하되, 엄중도가 떨어지는 혼성화 조건은 통상적으로 이형 이중체를 형성할 수 있어야 한다. 이로써 교차 혼성화 종은 대조구 혼성화에 관하여 양의 혼성화 시그널로서 용이하게 확인될 수 있다. 임의의 경우, 조건은 포름아미드(온도가 상승할 때와 마찬가지로 혼성 이중체를 탈 안정화시킴)의 양을 증가시킨다든지 함으로써, 보다 엄중하게 만들어질 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로, 혼성화 조건은 용이하게 조작할 수 있으므로, 일반적으로 목적으로 하는 결과에 따라서 선택할 수 있는 방법일 것이다.

본 발명은 또한 엄중도가 떨어지는 조건 더욱 바람직하게는 엄중한 조건 및 가장 바람작하게는 고도로 엄중한 조건 하에서, 이하에 기술된 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관하여도 기술되어 있다. 엄중도 조건에 관하여는 이하 표 1a ∼ 1b에 나타내었다: 고도로 엄중한 조건은 최소한 예를 들어, 조건 A∼F 정도로 엄중한 조건이고; 엄중한 조건은 최소한 예를 들어, 조건 G∼L 정도로 엄중한 조건이며; 엄중도가 떨어지는 조건은 최소한 예를 들어, 조건 M∼R 정도로 엄중한 조건을 의미한다.

상기 표 1a∼1b에 있어서:

(bp)¹은, 혼성화 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 부위(들)에 대해 예측되는 혼성체의 길이를 의미한다. 폴리뉴클레오티드가 미지의 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 때, 혼성체 길이는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 길이인 것으로 추정된다. 공지 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화될 때, 혼성체 길이는 폴리뉴클레오티드 서열을 정렬하고 최적 서열 상보성을 갖는 부위(들)를 동정함으로써 측정될 수 있다.

완충액^H에 있어서, SSPE(1xSSPE = 0.15M NaCl, 1OmM NaH₂PO₄, 및 1.25mM EDTA, pH 7.4)는 혼성화 및 세척 완충액 중 SSC(1xSSC = 0.15M NaCl 및 15mM 구연산나트륨)로 대체될 수 있으며; 세척은 혼성화가 완결된 이후에 15분 동안 수행된다.

T_B∼T_R은, 길이가 50 염기쌍 미만인 것으로 예측되는 혼성체의 혼성화 온도로서, 혼성체의 용융 온도(T_m) 미만인 5∼10℃이며, T_m은 다음과 같은 등식에 의해 결정된다. 즉, 길이가 18 염기쌍 미만인 혼성체에 있어서, T_m(℃) = 2(A + T 염기의 수) + 4(G + C 염기의 수)이다. 길이가 18∼49 염기쌍인 혼성체에 있어서, T_m(℃) = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41(% G+C) - (600/N)[식 중, N은 혼성체 중 염기의 수이고, [Na⁺]는 혼성화 완충액 중 나트륨 이온의 농도임(1 x SSC에 있어서 [Na⁺] = 0.165 M)]이다.

폴리뉴클레오티드 혼성화에 대한 엄중도 조건의 부가적 예에 관하여는 문헌[Sambrook외 다수, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11, 및 Ausubel외 다수, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4; 이하 참고용으로서 인용됨]에 제공되어 있다.

B. 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드

특정 구체예에서, 본 발명은 면역원성 조성물에 사용할 분리 및 정제된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 면역원성 조성물에 사용되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 임의의 구체예에서, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물에 사용되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 1) 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나에 나타낸 아미노산 서열; 2) 서열 번호 1∼ 서열 번호 32의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 기능성 및 비-기능성 천연 생성 변이체 또는 생물학적 균등체; 3) 서열 번호 1∼서열 번호 32의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 재조합 생산된 변이체 또는 생물학적 균등체; 및 4) 스타필로코커스 에피더미디스 이외의 유기체로부터 분리된 폴리펩티드(스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 상동 분자종을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

이러한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 생물학적 균등체 또는 변이체는 1) 스타필로코커스 에피더미디스로부터 분리된 폴리펩티드; 및 2) 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 폴리펩티드를 포함한다.

스타필로코커스 에피더미디스의 생물학적 균등체 또는 변이체로서는 기능성 및 비-기능성 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 모두를 포함한다. 기능성 균등체 또는 변이체는 개체 내에서 면역 반응 또는 항원 반응을 유도하는 능력을 보존하는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 천연 생성된 아미노산 서열 변이체이다. 기능성 변이체는 통상적으로 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나의 아미노산이 하나 이상 보존적으로 치환되었거나, 또는 폴리펩티드의 중요하지 않은 부위(예를 들어, 항원 결정기 또는 보호 에피토프를 함유하는 부위가 아닌 부위) 내에 존재하는 중요하지 않은 잔기가 치환, 결실 또는 삽입되었을 것이다.

본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 비-스타필로코커스 에피더미디스 상동 분자종을 제공한다. 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 상동 분자종은 비-스타필로코커스 에피더미디스 유기체로부터 분리되는 폴리펩티드로서, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 항원 능력(antigenic capability)을 보유한다. 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 상동 분자종은 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 것으로서 용이하게 확인될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 구조에 변형 및 변화가 발생할 수 있으며, 또한 이로써 스타필로코커스 에피더미디스 항원성을 보유하는 분자를 얻을 수 있다. 예를 들어, 임의의 아미노산은 항원성을 인지할 수 있을 만큼 상실하지 않고서도 서열 내 기타 아미노산으로 치환될 수 있다. 폴리펩티드의 생물학적 기능 활성을 한정하는 것은 폴리펩티드의 상호 작용 능력과 특성이므로, 임의의 아미노산 서열 치환은 폴리펩티드 서열(또는 이의 근원 DNA 암호화 서열) 내에서 발생할 수 있으나, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 보유하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

이러한 변화를 일으키는데에 있어서, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 폴리펩티드에 상호 작용성 생물 기능을 부여하는데에 있어서 아미노산의 수치요법 지수의 중요성에 관하여는 일반적으로 당 업계에 알려져 있다[Kyte and Doolittle, J Mol. Biol, 157: p. 105-132, 1982]. 임의의 아미노산은 유사한 수치요법 지수 또는 스코어를 보유하는 기타 아미노산으로 치환될 수 있으며, 그 결과 유사한 생물 활성을 보유하는 폴리펩티드가 생성된다. 각각의 아미노산에는 소수성과 하전 특성을 바탕으로 하여 수치요법 지수가 할당되었다. 이러한 지수는 다음과 같다: 이소루신(+4.5); 발린(+4.2); 루신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

아미노산 잔기의 상대적 수치요법 특성(hydropathic character)은 결과로 생성되는 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 결정지으며, 이로써 폴리펩티드와 기타 분자들 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, 항체 및 항원 등의 상호 작용을 한정하는 것으로 생각된다. 아미노산은 치료요법 지수가 유사한 다른 아미노산으로 치환되어 기능상 균등한 폴리펩티드를 얻을 수 있다는 사실은 당 업계에 알려져 있다. 이러한 변화에 있어서, 치료요법 지수가 +/- 2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 상기 치료요법 지수가 +/- 1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, 상기 치료요법 지수가 +/- 0.5 이내인 아미노산의 치환이 가장 바람직하다.

유사한 아미노산의 치환은 또한 친수성을 바탕으로 하여 이루어질 수 있는데, 특히 이러한 치환을 통하여 생성된, 생물 기능이 균등한 폴리펩티드 또는 펩티드는 면역학적 구체예로서 사용되도록 하고 있다. 본원에 참고용으로서 인용된 미국 특허 제4,554,101호에는, 인접 아미노산의 친수성에 의해 영향받는 폴리펩티드의 최대 국소 평균 친수성(the greatest local average hydrophilicity)은 면역원성 및 항원성 즉, 폴리펩티드의 생물학적 특성과 상관되어 있다고 기술되어 있다.

미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 다음과 같은 친수성 수치(hydrophilicity value)가 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5±1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루신(-1.8); 이소루신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 친수성 수치가 유사한 다른 아미노산으로 치환되어 생물학적으로 균등한, 특히 면역학적으로 균등한 폴리펩티드가 될 수 있다는 사실을 알 수 있다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 수치가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 친수성 수치가 ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, 친수성 수치가 ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 가장 바람직하다.

개략적으로 전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성 예를 들어, 이 치환기의 소수성, 친수성, 하전 및 크기 등을 바탕으로 하는 것이다. 전술한 특징 중 다수를 고려한 대표적인 치환에 관하여는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 다음과 같은 경우를 포함한다: 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 루신 및 이소루신(이하 표 2 참조). 그러므로 본 발명은 상기 나열한 바와 같은 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 기능적 또는 생물학적 균등체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

폴리펩티드의 생물학적 또는 기능적 균등물은 또한 위치-특이적 돌연 변이 유발법을 이용하여 제조될 수도 있다. 위치-특이적 돌연 변이 유발법은, 암호화 DNA의 특이적 돌연 변이 유발법을 통하여 폴리펩티드 또는 펩티드의 서열로부터 유래된, 제2 세대 폴리펩티드 즉, 생물학적으로 기능성인 균등 폴리펩티드 또는 펩티드의 제조에 유용한 기술이다. 전술한 바와 같이, 이러한 변화는 아미노산 치환이 바람직할 경우에 바람직할 수 있다. 이 기술은 또한 DNA를 이루고 있는 뉴클레오티드 서열에 1회 이상 변화를 줌으로써 예를 들어, 상기 고려 사항 중 하나 이상이 적용된 서열 변이체를 용이하게 제조 및 시험할 수 있는 역량을 제공한다. 위치-특이적 돌연 변이 유발법을 통해서, 의도로 하는 돌연 변이가 발생한 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열과 충분한 수의 인접 뉴클레오티드를 사용하여 돌연 변이체를 생산함으로써, 선회하는 결실 이음부의 양 측면에 안정한 이중체를 형성하기에 충분한 크기와 서열 복잡도(sequence complexity)를 갖는 프라이머 서열을 제공할 수 있다. 통상적으로, 길이 약 17∼25 뉴클레오티드인 프라이머가 바람직하며, 서열의 이음부 양 측면에 약 5∼10개의 잔기가 변형되어 있다.

일반적으로, 위치-특이적 돌연 변이 유발 기술은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 앞으로 알 수 있는 바와 같이, 이 기술은 통상적으로 단일 사슬 형태 및 이중 사슬 형태 모두로서 존재할 수 있는 파지 벡터를 사용한다. 통상적으로, 본원에 따른 위치-배향성 돌연 변이 유발법은 우선 단일 사슬 벡터 즉, 선택된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열의 전부 또는 일부를 암호화하는 DNA 서열이 이 벡터 서열 내에 포함되어 있는 단일 사슬 벡터를 생성함으로써 수행된다. 목적으로 하는 돌연 변이 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 (예를 들어, 합성에 의하여) 제조된다. 그 다음, 상기 프라이머는 단일 사슬 벡터에 어닐링되어, 효소 예를 들어, 이.콜라이 중합 효소 I Klenow 단편에 의해 연장되고, 그 결과 돌연 변이-보유 사슬의 합성이 종결된다. 이로써, 사슬 하나는 원래의 비-돌연 변이 서열을 암호화하고 또 다른 사슬 하나는 목적 돌연 변이를 보유하는 사슬인 이형 이중체가 형성된다. 이러한 이형 이중체 벡터는 적당한 세포 예를 들어, 이.콜라이 세포를 형질 전환하는데에 사용되며, 그 결과 돌연 변이를 보유하는 재조합 벡터를 포함하는 클론이 선택되는 것이다. 시판중인 키트는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제외하고 필요한 모든 시약을 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물에 사용되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 항원은, 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드와 실질적으로 서열이 유사하며, 구조 및/또는 기능이 유사한 임의의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드인 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 이러한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 항원은 특정 공급원에 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명을 통하여, 다양한 공급원으로부터 유래된 폴리펩티드를 전체적으로 검출하고 분리할 수 있다.

스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드가 추가의 구조 또는 기능 분석에 사용되거나, 또는 시약 예를 들어, 스타필로코커스 에피더미디스-관련 폴리펩티드 및 스타필로코커스 에피더미디스-특이 항체의 제조에 사용될 단편에 삽입되는 것이 유리할 수도 있다는 것도 본 발명에 고려된다. 이는 정제 또는 미정제 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 펩티다제 예를 들어, 엔도프로티나제인 glu-C(인디애나주 인디애나폴리스 소재, Boehringer)로 처리함으로써 수행 가능하다. 천연 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드로부터 펩티드 단편을 생산할 수 있는, CNBr로 처리하는 방법도 또 다른 방법이 될 수 있다. 재조합 기술은 또한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 특이 단편을 생산하는데에 사용될 수 있다.

스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 단편은 또한 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된다. 단편은 아미노산 서열과 전체적으로 동일하지 않되 부분적으로는 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다. 단편은 예를 들어, 7개 이상(예를 들어, 8개, 10개, 12개, 14개, 16개, 18개, 20개 이상)의 연속 아미노산(서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나의 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 단편은 "독립적으로 존재하는(freestanding)" 것이거나, 또는 보다 큰 폴리펩티드 내에 포함되어 일부 또는 일정 부위, 가장 바람직하게는 단일의 연속 부위를 형성할 수 있다. 하나의 구체예에서, 단편은 성숙한 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 에피토프를 포함한다.

"융합 단백질"이란, 2개의 (종종 관련되지 않은 것들의) 융합 유전자 또는 이의 단편에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 면역 글로불린 분자 불변부의 다양한 부분들과 기타 인간 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩티드가 기술되어 있다. 다수의 경우, 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 일부로서 면역 글로불린 Fc 부위를 사용하는 것이, 예를 들어, 약물 동력학적 특성이 개선된 치료법 및 진단법에 유리하다[예를 들어, 국제 특허 출원 EP-A 0232 2621 참조]. 다른 한편, 일부의 경우에 있어서는 융합 단백질 또는 폴리펩티드가 발현되어 검출 및 정제된 이후, Fc 부분을 결실시킬 수 있는 것이 바람직하다.

스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 스타필로코커스 에피더미디스로부터 분리될 수 있거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 재조합적 방법으로 생산될 수도 있다.

C. 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 변이체

이하에 사용될 "변이체"란 용어는 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이하되 근본적인 특성은 유지하고 있는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 통상적인 변이체는 참조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 서로 상이하다. 변이체의 뉴클레오티드 서열의 변화는 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시킬 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다. 뉴클레오티드에 변화가 생기면, 이하에 기술한 바와 같이, 참조 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산이 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단될 수 있다. 통상의 폴리펩티드 변이체는 참조 서열과 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 그 차이는 한정적이어서, 참조 폴리펩티드와 변이체 서열은 전체적으로 매우 유사하고, 다수의 부위는 동일하다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 치환, 부가 및 결실이 임의의 조합적 방식으로 발생되어 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 암호에 의해 암호화된 것일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 천연 생성되는 것 예를 들어, 대립 형질 변이체일 수 있거나, 또는 천연 생성되는 것으로 공지되어 있지 않은 변이체일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비-천연 생성 변이체는 돌연 변이 유발 기술 또는 직접 합성법에 의해 제조될 수 있다.

당 업계에 공지되어 있는 "동일성"이란, 서열을 비교함으로써 파악되는 2 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 관계를 의미하는 것이다. 뿐만 아니라, 당 업계에서 "동일성"이란, 서열들을 일렬로 매치시킴으로써 결정될 수 있는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 서열 관련 정도를 의미한다. "동일성"과 "유사성"은 공지의 방법 예를 들어, 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기술된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다. 동일성을 측정하는 방법은 시험될 서열들을 가장 많이 매치시키도록 디자인된다. 동일성과 유사성을 측정하는 방법은 공중이 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 암호화되어 있다. 2개의 서열들 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 컴퓨터 프로그램 방법으로서는 예를 들어, GCG 프로그램 패키지(Devereux 외 다수, Nucleic Acids Research 12(1):387, 1984), BLASTP, BLASTN, TBLASTN 및FASTA(Altschul외 다수, J. Molec. Biol. 215:403-410, 1990)를 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 기타 공급원으로부터 공중이 이용가능하다(BLAST Manual, Altschul, S.외 다수, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul외 다수, J. Molec. Biol. 215:403-410, 1990). 널리 공지된 스미스-워터맨 알고리즘도 또한 동일성을 측정하는데에 사용될 수 있다.

예를 들어, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나의 참조 서열과 동일, 다시 말해서 동일성이 100%일 수 있거나, 또는 참조 서열에 비해서 뉴클레오티드가 임의의 정수 이하의 수만큼 변형되어 있을 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환 예를 들어, 전이(transition) 및 반전(transversion), 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 이러한 변형은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 또는 이 말단 위치 사이의 임의의 부위에서 일어날 수 있거나, 아니면 참조 서열 내 하나 이상의 연속 그룹 또는 참조 서열 내 뉴클레오티드 사이에 산재할 수 있다. 뉴클레오티드 변형 횟수는, 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나에 존재하는 총 뉴클레오티드 수와 각 동일성 %를 수로 표시한 백분율(100으로 나눔)을 곱하고, 상기 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나에 존재하는 뉴클레오티드의 총수에서 상기 곱한 값을 공제함으로써 결정된다.

예를 들어, 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나의 핵산 서열과 70% 이상의 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편을 포함하며, 분리된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나의 핵산 서열의 전체 폴리뉴클레오티드 부위에 걸쳐서 n _n 개 이하의 핵산 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 n_n은 최대 변형 횟수를 나타내는 것으로서 다음과 같은 식에 의해 계산된다:

n_n ≤ X_n - (X_n ㆍ y)

[상기 식 중, X_n은 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나의 핵산 서열의 총 수이고, y는 0.70이며, X_n과 y의 곱한 값(정수가 아닌 임의의 값)은 정수에 가장 가까운 값으로 깎인 후, 이 곱한 값은 X_n으로부터 공제됨].

물론, y는 80%일 경우에는 0.80으로, 85%일 경우에는 0.85로, 90%일 경우에는 0.90으로, 그리고 95%일 경우에는 0.95로 나타낼 수 있다. 서열 번호 1∼서열 번호 32의 폴리펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시켜, 암호화 서열에 넌 센스, 미스 센스 또는 틀 이동 돌연 변이를 유발할 수 있으며, 이로써 그러한 변형에 따라 생성된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변형시킬 수 있다.

이와 유사하게, 본원에 기술된 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1∼서열 번호 32의 참조 서열과 동일(즉, 동일성이 100%)할 수 있거나, 또는 참조 서열과 비교하였을 때 아미노산 변형을 임의의 정수 이하만큼 포함하여 동일성 %가 100% 미만일 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 아미노산 결실, 치환 예를 들어, 보존적 및 비보존적 치환 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 이러한 변형은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노 말단 또는 카복시 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 또는 이 말단 위치 사이의 임의의 부위에서 일어날 수 있거나, 아니면 참조 서열 내 하나 이상의 연속 그룹 또는 참조 서열 내 아미노산 사이에 산재할 수 있다. 소정의 동일성 %에 대한 아미노산 변형 횟수는, 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나에 존재하는 총 아미노산 수와 각 동일성 %를 수로 표시한 백분율(100으로 나눔)을 곱하고, 상기 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나에 존재하는 아미노산의 총수에서 상기 곱한 값을 공제함으로써 결정되거나, 또는 다음과 같은 식에 의해 결정된다:

n_a ≤ X_a - (X_a ㆍ y)

[상기 식 중, n_a는 아미노산 변형 횟수이고, X_a는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나에 존재하는 아미노산의 총 수이며, y는 예를 들어, 70%일 경우에는 0.70, 80%일 경우에는 0.80, 85%일 경우에는 0.85이고, X_a와 y의 곱한 값(정수가 아닌 임의의 값)은 정수에 가장 가까운 값으로 깎인 후, 이 곱한 값은 X_a로부터 공제됨].

D. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드

하나의 구체예에서, 본 발명은 면역원성 조성물에 사용할 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 ORF 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 스타필로코커스 에피더미디스 발현 벡터는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 ORF 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대안적으로, 발현 벡터는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나의 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는 폴라뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터는 인핸서-프로모터에 작동 가능하도록 결합된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 발현 벡터는 원핵 생물 프로모터에 작동 가능하도록 결합된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대안적으로, 발현 벡터는 진핵 생물 프로모터인 인핸서-프로모터에 작동 가능하도록 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 발현 벡터는 추가로 카복시-말단 아미노산의 3' 말단과 암호화된 폴리펩티드의 전사 단위 내에 위치하는 폴리아데닐화 시그널을 포함한다.

원핵 생물 중 단백질의 발현은 대부분 융합 단백질 또는 비 융합 단백질을 발현시키는 유도성 프로모터 또는 구성 프로모터를 함유하는 벡터를 이용하여 이.콜라이 내에서 수행된다. 융합 벡터는 다수의 아미노산을 이 아미노산이 암호화하는 단백질, 일반적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단부에 부가한다. 이러한 융합 벡터는 통상적으로 다음과 같이 3가지 목적으로 사용된다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가; 2) 재조합 단백질의 용해도 증가; 및 3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제 보조. 융합 발현 벡터에 있어서, 단백 분해 절단 위치는 종종, 재조합 단백질을 융합 부로부터 분리시켜 융합 단백질을 정제할 수 있도록 만드는, 융합 부와 재조합 단백질의 이음부에 도입된다. 이러한 효소와 이 효소의 동일 기원 인지 서열은 Xa 인자, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.

통상적인 융합 발현 벡터로서는 각각 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토즈 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시키는, pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, Gene 67:31-40, 1988), pMAL(New England Biolabs, 매사츄세츠주 비버리 소재) 및 pRIT5(Pharmacia, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다.

하나의 구체예에서, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열은 pGEX 발현 벡터에 클로닝되어, GST-트롬빈 절단 위치-스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 N-말단→C-말단 배향으로 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 벡터를 형성한다. 글루타치온-아가로즈 수지를 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 융합 단백질이 정제될 수 있다. GST에 융합되지 않은 재조합 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 트롬빈으로 융합 단백질을 절단함으로써 회수할 수 있다.

적당한 비-융합 이.콜라이 발현 벡터의 예로서는 pTrc(Amann외 다수, Gene 69:301-315, 1988), pET IId(Studier외 다수, "Gene Expression Technology" Methods in Enzymology 185, 60-89, 1990), pBAD 및 pCRT7을 포함한다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자를 발현시키는 것은 혼성 trp-lac 융합 프로모터로 인한 숙주 RNA 중합 효소 전사에 좌우된다. pET IId 벡터로부터 표적 유전자를 발현시키는 것은 공동 발현된 바이러스 RNA 중합 효소 J7 gnl에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로 인한 전사에 좌우된다. 이 바이러스 중합 효소는 숙주인 변종 BL21(DE3) 또는 HMSI74(DE3)에 의하여, lacUV5 프로모터의 전사 제어 하에 있는 T7 gnl 유전자를 포함하는 내재 프로파지로부터 공급된다.

이.콜라이 내에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키는 한 가지 방법은 재조합 단백질을 단백 분해하여 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아 내에서 단백질을 발현시키는 것이다. 다른 방법은 발현 벡터에 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변형시켜, 각 아미노산에 대한 개별 코돈을 바람직하게는 이.콜라이 내에서 활용하는 것이다. 본 발명의 핵산 서열의 이러한 변형은 표준적인 DNA 돌연 변이 유발법 또는 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.

다른 구체예에서, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모인 에스.세레비지애(S.cerevisiae) 내에서 발현되는 벡터의 예로서는 pYepSec I(Baldari외 다수, Embo J, 6: p. 229-234,1987), pMFa(Kurjan and Herskowitz, Cell, p. 933-943, 1982), pJRY88(Schultz외 다수, Gene, 54: p. 113-123, 1987) 및 pYES2(Invitrogen Corporation, 캘리모니아주 샌 디에고 소재)를 포함한다.

대안적으로, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포 내에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 내에서 단백질을 발현시킬 수 있는 바큘로바이러스 벡터로서는 pAc 시리즈(Smith외 다수, Mol. Cell Biol, 3: p. 2156-2165, 1983) 및 pVL 시리즈(Lucklow and Summers, Virology, 170: p. 31-39, 1989)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 포유동물 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포 내에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예로서는 pCDM8(Seed, Nature, 329: p. 840, 1987) 및 pMT2PC(Kaufman외 다수, EMBO J, 6: p. 187-195, 1987)를 포함한다. 포유동물 세포에 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다.

이하에 사용될 프로모터란, 전사가 시작되는 지점(즉, 전사 개시 위치)의 앞 부분(이 지점의 상류의 앞 부분)에 있는 약 100개의 뉴클레오티드 쌍 이내에 통상적으로 존재하는 DNA 분자의 일부분을 의미한다. 이 부분은 통상적으로 상이한 유전자에도 존재하는 유사한 상대적 위치에 위치하고 있는 몇 가지 유형의 DNA 서열 요소를 함유한다. 이하에 사용될 "프로모터"란 용어는 당 업계에서 상류 프로모터 부위, 프로모터 부위 또는 일반화된 진핵 생물 RNA 중합 효소 II 전사 단위의 프로모터라 칭하여지는 것들을 포함한다.

개별 전사 조절 서열 요소의 다른 유형으로서는 인핸서가 있다. 인핸서는 특정 암호화 부위(예를 들어, 유전자)의 전사 시기, 전사 위치 및 발현 수준을 특이적으로 조절한다. 인핸서의 주요 기능은 인핸서에 결합하는 하나 이상의 전사 인자를 함유하는 세포 내에서 암호화 서열의 전사 수준을 상승시키는 것이다. 프로모터와는 달리 인핸서는 이 프로모터가 존재하는 한, 전사 개시 위치로부터 다양한 거리만큼 떨어져서 위치할 때에 작용을 할 수 있다.

이하에 사용될 "인핸서-프로모터"라는 어구는 인핸서와 프로모터 요소를 둘 다 포함하는 복합 단위를 의미한다. 인핸서-프로모터는 하나 이상의 유전자 산물을 암호화하는 암호화 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 이하에 사용될 "작동 가능하도록 결합된"이란 어구는, 암호화 서열의 전사가 인핸서-프로모터에 의해 제어 및 조절되도록 이 인핸서-프로모터가 암호화 서열에 연결되어 있음을 의미한다. 인핸서-프로모터를 암호화 서열에 작동 가능하도록 결합시키는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 당 업계에 널리 공지되어 있듯이, 전사가 제어되는 암호화 서열의 정확한 방향 및 위치는 인핸서-프로모터의 특이 성질에 따라 달라진다. 그러므로, TATA 박스 최소 프로모터는 통상적으로 전사 개시 위치의 약 25∼약 30 염기쌍 상류에 위치하며, 이 상류 프로모터 요소는 통상적으로 전사 개시 위치의 약 100∼약 200 염기쌍 상류에 위치한다. 이와는 반대로, 인핸서는 개시 위치의 하류에 위치할 수 있으며, 이 위치로부터 상당한 거리만큼 떨어져 존재할 수 있다.

본원에 개시된 벡터 구조물에 사용된 인핸서-프로모터는 세포 내에 형질 감염된 유전자를 발현시키는 임의의 인핸서-프로모터일 수 있다. 널리 공지된 특성을 갖는 인핸서-프로모터를 사용함으로써, 유전자 산물의 발현 수준 및 패턴을 최적화할 수 있다.

예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스 2(Adenovirus 2), 싸이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 및 원숭이 바이러스 40(Simian Virus 40)으로부터 유래된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 적당한 기타 발현 계에 관하여는 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed, 제16장 및 제17장, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 이하 참고용으로 인용됨]을 참조하시오.

다른 구체예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형 내에서 핵산을 선호적으로 발현시킬 수 있다[예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현시키는데에 사용됨]. 조직-특이적 조절 요소는 당 업계에 공지되어 있다. 적당한 조직-특이적 프로모터의 비 제한적 예로서는 알부민 프로모터(간-특이적; Pinkert외 다수, Genes Dev, 1: p. 268-277, 1987), 림프-특이적 프로모터(Calame and Eaton, Adv Immunol, 43: p. 235-275, 1988) 구체적으로, T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Baltimore, EMBO J, 8: p. 729-733, 1989) 및 면역글로불린의 프로모터(Banerji et al., Cell, 33: p. 729-740, 1983), (Queen and Baltimore, Cell, 33: p. 741-748, 1983), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 신경 미세 섬유 프로모터; Byrne and Ruddle, PNAS, 86: p. 5473-5477, 1989), 췌장-특이적 프로모터(Edlund et al., Science, 230: p. 912-916, 1985) 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 유장 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 국제 특허 출원 EP 264,166)를 포함한다. 발달 조절 프로모터 예를 들어, 쥣과 동물 혹스 프로모터(Kessel and Gruss, Science, 249: p. 374-379, 1990) 및 α-태아 단백질 프로모터(Campes and Tilghman, Genes Dev, 3: p. 537-546, 1989)도 포함된다.

본원에서는 또한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자가 안티 센스 배향으로 발현 벡터 내에 클로닝된 재조합 발현 벡터도 제공된다. 즉, DNA 분자는 스타필로코커스 에피더미디스 mRNA에 안티 센스인 RNA 분자를 발현(DNA 분자의 전사에 의한 발현)시킬 수 있는 방식으로 조절 서열과 작동 가능하도록 연결되어 있다. 안티 센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하도록 결합된 조절 서열은 다양한 세포 유형에서 안티 센스 RNA 분자를 연속적으로 발현시키는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서 또는 조절 서열은 안티센스 RNA를 구성적, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적으로 발현시키는 것으로 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는, 안티센스 핵산이 고효율의 조절 부위의 제어하에 생산되고, 활성이 벡터가 도입된 세포 유형에 따라서 결정될 수 있는, 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독성 바이러스의 형태일 수 있다.

본원에 개시된 재조합 발현 벡터는 임의의 적당한 숙주 세포 내에 삽입될 수 있다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"란 용어는 이하에서 호환적으로 사용된다. 이러한 용어들은 특정한 개체 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 포함하는 의미임을 이해하여야 한다. 돌연 변이 또는 환경적 영향으로 인하여 이어지는 세대에도 변형이 발생할 수 있기 때문에, 자손은 실제로 부모 세포와 동일할 수는 없지만, 이하에 사용된 용어의 범위 내에는 포함된다. 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 박테리아 세포 예를 들어, 이.콜라이, 곤충 세포(예를 들어, Sf9, Sf21), 효모 또는 포유동물 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), VERO, 닭의 배아 섬유아세포, BHK 세포 또는 COS 세포) 내에서 발현될 수 있다. 기타 적당한 숙주 세포에 관하여도 당 업자에게 공지되어 있다.

벡터 DNA는 통상의 형질 전환, 감염 또는 형질 감염 기술을 통해 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입된다. 이하에 사용될 "형질 전환" 및 "형질 감염"이란 용어는 외래 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포에 도입시키기 위한 업계 굴지의 다양한 기술을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동 침전법, DEAE-덱스트린-매개 형질 감염법, 리포팩션, 초음파법 또는 전기 천공법을 포함한다. 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질 감염시키는 데에 적당한 방법에 관하여는 문헌[Sambrook외 다수, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 및 기타 실험 매뉴얼에 기술되어 있다.

본원에 기술된 숙주 세포 예를 들어, 배양액 중에 존재하는 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포가 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 생산(즉, 발현)하는데에 사용된다. 그러므로, 이러한 숙주 세포를 이용하여 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관하여도 본원에 기술되어 있다. 하나의 구체예에서, 이 방법은 숙주 세포[스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포]를 적당한 배지 중에서 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드가 생산될 때까지 배양하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 이 방법은 또한 배지 또는 숙주 세포로부터 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다.

발현 벡터의 암호화 서열은 전사 종결 부위에 작동 가능하도록 결합되어 있다. RNA 중합 효소는 폴리아데닐화가 일어나는 위치를 통과하여 암호화 DNA 서열을 전사시킨다. 통상적으로 DNA 서열은 전사를 종결시키는 폴리아데닐화 위치의 하류 수백 염기쌍에 위치한다. 이러한 DNA 서열을 이하 전사-종결 부위라 칭한다. 이러한 부위는 전사된 메신저 RNA(mRNA)를 효율적으로 폴리아데닐화시키는데에 필요하다. 전사-종결 부위에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 전사-종결 부위의 예로서는 SV40 및 프로타민 유전자의 폴리아데닐화 시그널이 있다.

발현 벡터는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 길이의 측면에서 비-스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 절편과 충분히 구별되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는 의미이다. 이러한 폴리펩티드는 또한 변이 아미노산 서열[예를 들어, 교환될 아미노산의 상대적 수치요법 스코어와 같은 사항을 기초로 하여 선택된 변화가 발생한 변이 아미노산 서열]을 가지는, 생물학적으로 기능성인 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화할 수도 있다. 이러한 변이 서열은 돌연 변이 유발법 예를 들어, 위치-배향 돌연 변이 유발법을 이용하여 천연 공급원으로부터 분리된 것이거나, 또는 이하에 개시된 서열 내에 유도될 수 있다.

임의의 구체예에서, 본원에 기술된 발현 벡터는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 발현 벡터는, 전술한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 중 임의의 것의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 암호화 부위를 포함할 수 있거나, 또는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 기본적 암호화 부위에 선택된 변화 또는 변형이 일어난 암호화 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이러한 벡터 또는 단편은 기본적 암호화 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 보다 큰 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 임의의 경우, 코돈의 축퇴성과 생물학적 기능의 균등성으로 인하여, 상기와 같은 측면은 전술한 폴리펩티드 서열에 상응하는 특정 DNA 분자에 국한되지 않는다는 사실을 이해하여야 할 것이다.

대표적인 벡터로서는 포유동물 발현 벡터인 pCMV 군 예를 들어, pCMV6b 및 pCMV6c(Chiron Corp., 캘리포니아 에머리빌 소재)을 포함한다. 임의의 경우에 있어서, 특히 각각의 포유동물 발현 벡터의 경우에 있어서, 결과로 생성되는 구조물은 선별 가능한 마커를 함유하는 벡터 예를 들어, pSV2neo와 함께 공동 형질 감염될 필요가 있을 수도 있다. 디하이드로폴레이트 리덕타제-결핍 중국 햄스터 난소 세포주 예를 들어, DG44에의 공동 형질 감염을 통하여, 발현 벡터에 통합된 DNA에 의해 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 발현하는 클론이 검출될 수 있다.

DNA 분자는 당 업계에 널리 공지된 다수의 기술에 의해 벡터로 통합될 수 있다. 예를 들어, 벡터 pUC18은 유전자를 클로닝 및 발현시키는데에 특히 유용한 것으로 알려져 있다. 이와 유사하게, 관련 벡터인 M13mp18 및 M13mp19는 본 발명의 임의의 구체예 특히, 디데옥시 서열 결정 수행시 사용될 수 있다.

본원에 기술된 발현 벡터는 다량의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드-암호화 DNA 자체를 제조하는 수단으로서, 그리고 암호화된 폴리펩티드 및 펩티드를 제조하는 수단으로서 유용하다. 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드가 재조합적 방법에 의해 생산되는 경우에는 셔틀 시스템으로서 원핵 생물 또는 진핵 생물 발현 벡터를 사용할 수 있다.

다른 측면에서, 재조합 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 바람직하게, 본 발명의 재조합 숙주 세포는 박테리아 세포 즉, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 DH5α 변종이다. 일반적으로, 원핵 생물은 DNA 서열을 처음에 클로닝하여 본 발명에 유용한 벡터를 구성하는데에 바람직하다. 예를 들어, 이.콜라이 K12 변종이 특히 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 기타 미생물 변종으로서는 이.콜라이 B 및 이,콜라이 _X1976(ATCC 31537)을 포함한다. 이러한 예들은 물론 본 발명을 한정하는 것이 아니라, 예시하는 것이다.

전술한 변종들과 이.콜라이 W3110(ATCC 273325), 이.콜라이 BL21(DE3), 이.콜라이 Top10, 바실러스(bacilli) 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 기타 장내 세균(enterobacteriaceae) 예를 들어, 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella typhimurium) (또는 미국 특허 제4,837,151호에 기술된 기타 약독성 살모넬라 변종들) 또는 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans), 그리고 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 사용될 수 있다.

일반적으로, 숙주 세포와 혼화 가능한 종으로부터 유래된 레플리콘(replicon)과 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이러한 숙주들과 함께 사용된다. 벡터는 일반적으로 레플리콘 위치와, 형질 전환 세포 내에서 표현형에 따라 선택할 수 있도록 만드는 마킹 서열을 운반한다. 예를 들어, 이.콜라이는 이.콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322(Bolivar외 다수 1977)를 이용하여 형질 전환될 수 있다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하므로, 형질 전환된 세포를 용이하게 확인할 수 있는 수단을 제공한다. pBR 플라스미드 또는 기타 미생물 플라스미드 또는 파지는 또한 미생물이 미생물 자신의 폴리펩티드를 발현시키는데에 사용할 수 있는 프로모터를 함유하여야 하거나, 또는 이를 함유하도록 변형되어야 한다.

대부분 재조합 DNA 구조물에 사용되는 프로모터로서는 β-락타마제(페니실리나제) 및 락토즈 프로모터 시스템(Chang외 다수 1978; Itakura.외 다수 1977, Goeddel외 다수 1979; Goeddel외 다수 1980)과, 프립토판(TRP) 프로모터 시스템(EP 0036776; Siebwenlist외 다수, 1980)을 포함한다. 이러한 프로모터들이 가장 일반적으로 사용되고 있는 반면에, 기타 미생물 프로모터들이 발견되어 이용되고 있고, 또한 이 프로모터 뉴클레오티드 서열에 관한 세부 사항은 공개되어 있어서, 당업자들이 플라스미드 벡터에 기능성 프로모터를 도입시킬 수 있도록 만든다[Siebwenlist외 다수 1980].

원핵 생물에 더하여, 진핵 미생물 예를 들어 효모도 사용될 수 있다. 기타 다수의 변종들도 일반적으로 사용할 수 있지만, 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomycetes cerevisiae) 또는 일반적인 제빵용 효모가 진핵 미생물 중 가장 일반적으로 사용된다. 사카로마이세스에서 발현함에 있어서는 예를 들어, 플라스미드 YRp7이 일반적으로 사용된다[Stinchcomb외 다수, 1979; Kingsman외 다수, 1979; Tschemper외 다수, 1980]. 이와 같은 플라스미드는 이미 트립토판 중에서 생장할 수 없는 효모의 돌연 변이 변종에 선별 마커를 제공하는 trpI 유전자를 함유하며, 그 예로서는 ATCC 44076 또는 PEP4-1이 있다(Jones, 1977). 효모 숙주 세포 게놈의 특징을 이루는 trpI 병변이 존재함으로써 트립토판 부재하에 생육시켜 형질 전환 여부를 확인할 수 있게 된다.

효모 벡터 내에 존재하는 적당한 프로모터 서열로서는, 3-포스포글리서레이트 키나제(Hitzeman.외 다수 1980) 또는 기타 해당 효소(Hess외 다수 1968; Holland외 다수 1978) 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산 효소, 인산과당분해효소, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리서레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오즈포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터들을 포함한다. 적당한 발현 플라스미드를 구성함에 있어서, 이러한 유전자들과 결합된 종결 서열도 발현 벡터 내 발현될 서열로부터 하류인 위치에 도입되어 mRNA를 폴리아데닐화시켜 발현을 종결시킬 수 있다. 생장 조건에 의해 제어되는 전사의 부가적인 이점을 보유하는 기타 프로모터로서는, 알콜 탈수소 효소 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사 관련 분해 효소 및 전술한 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소, 그리고 말토즈 및 갈락토즈의 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 부위가 있다. 효모-혼화성 프로모터, 기원 또는 복제 및 종결 서열을 포함하는 임의의 플라스미드 벡터가 적당하다.

미생물 이외에, 다세포 유기체로부터 유래된 세포 배양액도 숙주로서 사용될 수 있다. 원칙적으로, 임의의 세포 배양액은 척추 동물 배양액으로부터 얻어졌는지 또는 무척추 동물 배양액으로부터 얻어졌는지 여부에 따라서 조정 가능하다. 그러나, 척추 동물 세포의 경우가 훨씬 유리하며, 근래에 와서는 배양액(조직 배양액) 내에서 척추 동물 세포를 증식시키는 것은 보통 행하여지는 단계가 되었다. 이와 같이 유용한 숙주 세포주의 예로서는 AtT-20, VERO, HeLa, NSO, PER C6, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 그리고 W138, BHK, COSM6, COS-7, 293 및 MDCK 세포주가 있다. 이러한 세포에 대한 발현 벡터는 (필요한 경우) 임의의 필요한 리보좀 결합 위치, RNA 스플라이싱 위치, 폴리아데닐화 위치 및 전사 종결 서열과 함께, 복제 기원, 발현될 유전자의 상류에 위치하는 프로모터를 포함한다.

재조합 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 발현을 목적으로 하고, 진핵 생물 숙주가 고려되는 경우, 벡터 예를 들어, 진핵 생물의 복제 기원을 포함하는 플라스미드를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 뿐만 아니라, 진핵 생물 시스템 내에서 발현시키기 위해서는, 유용한 진핵 생물 프로모터 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포와 함께 사용되는 프로모터에 인접하여 이의 제어하에 있는 스타필로코커스 에피더미디스 암호화 서열을 배치하는 것이 바람직하다. 암호화 서열을 프로모터의 제어 하에 두기 위해서는, 그 프로모터가 진핵 생물의 것이든 원핵 생물의 것이든, 폴리펩티드의 적당한 번역 해독 틀의 번역 개시 부위의 5' 말단은 선택한 프로모터 3' 말단 쪽 약 1∼약 50 뉴클레오티드 사이에 배치하거나 또는 이 프로모터의 하류에 배치하여야 한다. 뿐만 아니라, 진핵 생물의 발현을 기대하는 경우에는, 통상적으로 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 전사 단위에 도입하는 것이 바람직할 것이다.

외인성 폴리뉴클레오티드 예를 들어, DNA 분자로 세포를 형질 전환 또는 형질 감염시키는 수단에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 인산칼슘 형질 감염법 또는 DEAE-덱스트란-매개성 형질 감염법, 원형질체 융합법, 전기 천공법, 리포좀 매개 형질 감염법, 직접 미세 주입법 및 아데노바이러스 감염법을 포함한다[예를 들어, Sambrook, Fritsch and Maniatis(1989) 참조].

가장 널리 사용되는 방법은 인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란에 의해 매개되는 형질 감염법이다. 비록 그 기작에 관하여는 아직 명확히 규명되어 있지는 않지만, 형질 감염된 DNA는 엔도시토시스에 의해 세포의 세포질에 도입되어 핵으로 운반되는 것으로 생각된다. 세포 유형에 따라서, 배양된 세포 군집의 90% 이하는 임의의 어느 시점에 형질 감염될 수 있다. 방법의 고 효율성으로 인하여, 인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란에 의해 매개되는 형질 감염법은 다수의 세포에서 외래 DNA를 일시적으로 발현시킬 필요가 있는 실험에 채택되고 있다. 인산칼슘-매개 형질 감염법은 또한 외래 DNA의 복사체를 통합하는 세포주를 확립하는데에도 사용되며, 이 외래 DNA 복사체는 일반적으로 숙주 세포 게놈에 헤드-대-테일(Head-to-Tail) 직렬 배열되어 정렬된다.

원형질체 융합법에 있어서, 목적 플라스미드 복사체를 다수 함유하는 박테리아로부터 유래된 원형질체는 배양된 포유 동물 세포와 직접 혼합된다. (일반적으로 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) 세포막을 융합한 후, 박테리아 내용물은 포유동물 세포의 세포질로 운반되고, 플라스미드 DNA는 핵 내에 운반된다. 원형질체 융합법은 일시적 발현 검정법에 일반적으로 사용되는 다수의 세포주를 형질 감염시키는데에는 그다지 효율적이지 못하지만, DNA의 엔도시토시스가 비효율적으로 일어나는 세포주에는 유용하다. 원형질체 융합법은 종종 숙주 염색제에 직렬로 통합된 플라스미드 DNA 복사체를 다수 생산한다.

다양한 포유동물 세포와 식물 세포에 고전압 전기 충격을 간단히 가하여주면, 원형질막에 나노미터 크기의 구멍이 형성된다. DNA는 이 구멍을 통하여 세포질에 직접 도입되거나 또는 이 구멍을 밀폐시키는 막 성분을 재배치함으로써 세포질에 도입된다. 전기 천공법은 매우 효율적일 수 있으며, 클로닝된 유전자를 일시적으로 발현시키고 또한 목적 유전자 복사체가 통합된 세포주를 확립하는데에 사용될 수 있다. 인산칼슘-매개 형질 감염법 및 원형질체 융합법과는 달리, 전기 천공법은 종종 외래 DNA 복사체 중 하나를 보유하거나 또는 소수의 DNA 복사체가 통합되어 있는 세포주를 생산한다.

리포좀 형질 감염법은 리포좀 내에 DNA 및 RNA를 봉입시킨 후, 리포좀과 세포막을 융합시키는 단계를 포함한다. DNA가 세포에 전달되는 기작에 관하여는 명확히 규명되어 있지는 않지만, 형질 감염 효율은 90% 정도로 높을 수 있다.

DNA 분자를 핵에 직접 미세 주입하는 방법은 DNA가 세포 구획 예를 들어, 저pH 엔도좀(low pH endosome)에 노출되지 않는다는 이점을 갖는다. 그러므로 미세 주입법은 주로 목적 DNA의 복사체가 통합되어 있는 세포주를 확립하는 방법으로서 사용된다.

세포 형질 감염용 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 다양한 세포에 관한 아데노바이러스 벡터-매개성 세포 형질 감염법은 다양한 세포에 관하여는 보고된바 있다[Stratford-Perricaudet외 다수, 1992].

형질 감염된 세포는 원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 생산하고자 하는 경우에는, 배양된 원핵 숙주 세포가 특히 바람직하다.

본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 제조하는 절차 또는 방법도 제공하는데, 이 방법은 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질 전환, 형질 감염 또는 감염시켜 형질 전환된 숙주 세포를 생산하는 단계; 및 폴리펩티드를 발현시키는데에 충분한 생물학적 조건 하에 상기와 같이 형질 전환된 숙주 세포를 유지시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 형질 전환된 숙주 세포는 원핵 생물 세포이다. 대안적으로, 숙주 세포는 진핵 생물 세포이다. 더욱 구체적으로, 원핵 생물 세포는 에스케리챠 콜라이 DH5-α 변종의 박테리아 세포이다. 대안적으로, 형질 전환된 세포에 형질 감염된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나의 핵산 서열을 포함한다. 부가적으로, 형질 감염은 상기 기술된 발현 벡터를 이용하여 수행된다. 본 방법에 사용된 숙주 세포는 기능성의 재조합 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 발현할 수 있다.

형질 감염 이후, 세포는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드가 발현되는데에 충분한 시간 동안 배양 조건하에 유지된다. 배양 조건은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이에는 이온 조성 및 농도, 온도, pH 등을 포함한다. 통상적으로, 형질 감염된 세포는 배양 배지 중에서 배양된다. 다양한 유형의 세포에 적당한 배지에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 구체예에서, 배양 온도는 약 20∼약 50℃이고, 더욱 바람직하게는 약 30∼약 40℃이며, 가장 바람직하게는 약 37℃이다.

pH 값은 약 6.0∼약 8.0인 것이 바람직하며, 약 6.8∼약 7.8인 것이 더욱 바람직하고, 약 7.4인 것이 가장 바람직하다. 중량 몰 삼투압 농도(osmolality)는 1리터 당 약 200 밀리오스몰(mosm/L) ∼ 약 400 mosm/L인 것이 바람직하며, 약 290∼약 310 mosm/L인 것이 더욱 바람직하다. 암호화된 단백질의 형질 감염 및 발현에 필요한 기타 생물학적 조건에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다.

형질 감염된 세포는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드의 발현에 충분한 시간 동안 유지된다. 발현에 적당한 시간은 사용된 세포의 유형에 따라서 달라지며, 이는 당 업자에 의하여 용이하게 결정된다. 통상적으로, 유지 시간은 약 2∼약 14일이다.

재조합 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드는 형질 감염된 세포 또는 이 세포가 배양된 배지로부터 회수 또는 수집된다. 회수 방법은 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 폴리펩티드의 분리 및 정제 기술은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 침전법, 여과법, 크로마토그래피, 전기 영동법 등을 포함한다.

E. 면역원성 조성물

본 발명은 이하 실시예에 기술된 바와 같이 하나 이상의 선택된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드와 생리적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 임의의 구체예에서, 면역원성 조성물은 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나 이상의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 하나 이상의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 생리적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물은 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 포함한다. 대안적으로, 면역원성 조성물은 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드의 시험관 내 면역원성을 평가하기 위하여 다양한 시험이 행하여 진다. 예를 들어, 시험관 내 옵소닌 검정법은 스타필로코커스 에피더미디스 세포, 미지의 폴리펩티드에 대한 특이 항체를 함유하는 열 불활성화 인간 혈청, 그리고 외인성 보체 공급원의 혼합물을 함께 항온 처리함으로써 실시된다. 옵소닌 식세포 작용(opsonophagocytosis)는 새로이 분리된 인간 다형핵 세포(PMN)와 항체/보체/스타필로코커스 세포 혼합물을 항온 처리할 때 진행된다. 항체와 보체로 피복된 박테리아 세포는 옵소닌 식세포 작용 진행시 사멸된다. 옵소닌 식세포 작용으로부터 살아남은 생존 박테리아의 집락 형성 단위(CFU)는 검정 혼합물을 도말함으로써 측정된다. 역가는 50% 이상의 박테리아를 사멸시키는 최고 희석률의 역수로서 나타낸다(검정용 대조구와 비교함으로써 측정). 혈청의 최저 시험 희석률(1:8) 일 때 50% 미만 사멸되는 표본의 OPA 역가는 4로 표시한다. 최고 시험 희석률은 1:2560이다. 더욱 높은 초기 희석률을 시작으로 하여, 최고 희석률에서 50% 이상 사멸되는 시료에 대해 OPA 역가 측정을 반복 수행한다. 전술한 방법은 그레이법(Gray, Conjugate Vaccines Supplement, p. 694-697, 1990)의 변법이다.

시험 혈청과 박테리아 세포, 그리고 열 불활성화 보체를 함유하는 시험 혈청 대조구가 각각의 혈청에 포함된다. 이 대조구는 항생제 또는 기타 혈청 성분이 존재함으로 인하여(즉, 보체 또는 PMN의 부재하에) 박테리아 균종을 직접 사멸시킬 수 있는지 여부를 평가하는데에 사용된다. 공지의 옵소닌 역가를 보유하는 인간 혈청은 양성 인간 혈청 대조구로서 사용된다. 각 미지의 혈청에 대한 옵소닌 항체 역가는 혈청이 존재하지 않는 대조구에 비하여 CFU가 50% 감소된 혈청 초기 희석률의 역수로서 계산된다.

전 세포 ELISA 검정법은 또한 폴리펩티드 항원의 시험관 내 면역원성과 표면 노출율을 평가하는데에도 사용되며, 여기서 목적 박테리아 균종(스타필로코커스 에피더미디스)은 평판 예를 들어, 96 웰 평판 상에 피복되고, 면역화된 동물로부터 유래된 시험 혈청은 박테리아 세포와 반응하게 된다. 임의의 항체 즉, 시험 폴리펩티드 항원에 특이적인 항체가 폴리펩티드 항원의 표면 노출 에피토프와 반응성이면, 그 항체는 당 업자에게 공지된 표준 방법에 따라서 검출될 수 있다.

이후, 목적으로 하는 시험관 내 활성을 나타내는 임의의 폴리펩티드는 생체 내 동물 공격 모델 내에서 검정된다. 임의의 구체예에서, 면역원성 조성물은 당 업자에게 공지된 방법 및 면역화 경로(예를 들어, 비강 내, 비경구, 경구, 직장, 질내, 경피, 복강 내, 정맥 내, 피하 등)에 의해 동물(예를 들어, 마우스)을 면역화시키는데에 사용된다. 동물을 특정 스타필로코커스 에피더미디스 면역원성 조성물로 면역화시킨 이후, 동물을 스타필로코커스 에피더미디스로 공격하여 이 동물이 스타필로코커스 에피더미디스 감염에 저항할 수 있는지에 관해 검정한다.

스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 개체 예를 들어, 인간에 투여되는데에 적당한 면역원성 조성물에 통합된다. 이러한 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 핵산 분자 또는 단백질을 포함한다. 이하에 사용될 "약학적으로 허용 가능한"이란 어구는 약물 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등의 것들 중 임의의 것 또는 이들 모두를 포함하는 의미이다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 이와 같은 매질 및 제제의 사용에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 활성 화합물과 비 혼화성인, 이제까지의 여타 매질 또는 제제를 제외한 매질이본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 보조적 활성 화합물도 또한 본 조성물에 통합될 수도 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 그것의 의도로 한 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예로서는, 비 경구 투여 경로(예를 들어, 정맥 내, 피내, 피하, 복강 내 투여), 경 점막 투여 경로(예를 들어, 경구, 직장, 비강 내, 질내, 호흡기 투여) 및 경피 투여 경로(국소 투여)를 포함한다. 비 경구, 피내 또는 피하 투여시 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음과 같은 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예를 들어, 주사용 물, 염수 용액, 불휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예를 들어, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액 예를 들어, 아세트산염, 구연산염 또는 인산염; 및 강장 조절제 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로즈. pH는 산이나 염기 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨으로 조절할 수 있다. 비 경구 투여용 제제는 유리나 플라스틱으로 만들어진 앰플, 1회용 시린지 또는 복수 투여용 바이알에 담겨질 수 있다.

주사용으로 적당한 약학 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉석에서 제조하는데에 사용되는, 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥 내 투여의 경우, 적당한 담체로서는 생리 식염수, 정균수, 크레모포(Cremophor) EL™(BASF, 뉴저지주 파시퍼니 소재) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이하게 주사 가능한 정도로 유동성이어야 한다. 또한 상기 조성물은 제조 및 보관 상태 하에서 안정하여야 하며, 미생물 예를 들어, 박테리아 및 진균의 오염 활동에 대해 보존적이어야 한다. 상기 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적당한 혼합물을 포함하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 예를 들어, 피복물 예를 들어, 레시틴을 사용한다든지, 분산에 필요한 입도를 유지시킨다든지, 그리고 계면 활성제를 사용한다든지 하여 유동성은 적당히 유지될 수 있다. 미생물 활동은 다양한 항균제 및 항진균제 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 아스코르브산 등을 사용하여 막을 수 있다. 다수의 경우, 조성물 중 등장제로서는 예를 들어, 수크로즈, 폴리알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함한다. 주사용 조성물의 흡수 시간은 이 조성물에 흡수를 지연시키는 제제 예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 포함시킴으로써 연장될 수 있다.

멸균 주사 용액은, 활성 화합물(예를 들어, 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 또는 항-스타필로코커스 에피더미디스 항체)을 필요량만큼 적당한 용매 중에 상기 나열한 성분들 중 어느 하나와 통합시키거나 또는 이 성분들을 조합하여 함께 통합시킨 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 상기 나열한 성분들 중 필요한 성분들과 기본 분산 매질을 함유하는 멸균 비이클에 통합시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용인 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는 미리 멸균 여과한 성분의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 부가적인 목적 성분으로 이루어진 분말을 생산하는, 진공 건조법과 동결 건조법이 있다.

경구용 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 또는 정제로 압착된다. 치료제의 경구 투여를 위하여, 활성 화합물은 부형제와 함께 통합되어 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 투여용 조성물은 또한 구강 세척용 유동 담체를 사용하여 제조될 수도 있는데, 이때 이 유동 담체 중에 존재하는 화합물은 경구 투여되어, 가글 한 후 뱉거나 또는 삼킨다. 약학적으로 혼화성인 결합제 및/또는 애쥬반트 물질이 본 조성물의 한 성분으로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐 및 트로키 등은 다음의 성분들 또는 이들과 성질이 유사한 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제 예를 들어, 미세 결정질 셀룰로즈, 검 트래거칸트 또는 젤라틴; 부형제 예를 들어, 전분 또는 락토즈, 붕해제 예를 들어, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제 예를 들어, 스테아르산마그네슘 또는 스테로트(Sterote); 활제 예를 들어, 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예를 들어, 수크로즈 또는 사카린; 또는 풍미제 예를 들어, 페퍼민트, 살리실산메틸 또는 오렌지 향.

흡입에 의한 투여에 있어서, 화합물은 적당한 추진제 예를 들어, 가스 예를 들어, 이산화탄소를 함유하는 가압 용기나 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 전신 투여는 또한 경 점막 또는 경피적 수단에 의할 수도 있다. 경 점막 또는 경피 투여에 있어서, 투과될 장벽으로서 적당한 추진제가 본 제형에 사용된다. 이러한 추진제는 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경 점막 투여용 추진제로서는 세제, 담즙산 염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 경 점막 투여는 비강 내 스프레이 또는 좌제를 사용하여 수행될 수 있다. 경피 투여에 있어서, 활성 화합물은 당 업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.

화합물은 또한 직장 투여용 좌제(예를 들어, 통상의 좌제 베이스 예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세리드 함유) 또는 정체형 관장제의 형태로 제조될 수도 있다.

하나의 구체예에서, 활성 화합물은 화합물이 체 내에서 급속히 소멸되는 것을 막아주는 담체와 함께 예를 들어, 조절 방출형 제형 예를 들어, 임플란트 및 미소 캡슐화 전달 시스템의 형태로 제조된다.

생분해성이고 생체 적합성인 중합체 예를 들어, 아세트산 에틸렌 비닐, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 당 업자에게 알려져 있다. 이 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation)과 노바 파마슈티컬스, 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 시판되고 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포좀 포함)도 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 상기 제형들은 당 업자에게 널리 공지된 방법 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호(이하 참고용으로 인용됨)에 기술된 방법에 의하여 제조될 수 있다.

투여를 용이하고 균일하게 만들기 위해서는 경구 및 비 경구 투여 조성물을 단위 투여 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 이하에 사용될 단위 투여형이란, 치료될 개체에 단위 투여하기에 적당한, 물리적으로 분리된 단위를 의미하는 것으로서; 소정 량의 활성 화합물을 함유하는 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 함께 원하는 치료 효과를 나타내도록 결정된다. 본 발명의 단위 투여형에 관한 명세는 활성 화합물의 독특한 특징과 달성될 특정 치료 효과, 그리고 개체 치료용 활성 화합물의 화합 분야에 내재하는 한계 사항들에 따라서 직접 지정된다.

복합적 면역원성 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 중 2 이상을 포함시키고, 본 발명의 폴리펩티드 중 하나 이상과, 하나 이상의 공지된 비-스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 폴리펩티드를 배합함으로써 제공된다.

다음과 같은 12개의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열들 즉, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 30은 스타필로코커스 아우레우스의 폴리펩티드 서열 상동체와 90% 이상의 동일성을 보인다. 그러므로, 상기 12개의 폴리펩티드들은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 면역원성 조성물 중에 사용될 수도 있다. 뿐만 아니라, 다음과 같은 12개의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 서열 즉, 스타필로코커스 아우레우스의 폴리펩티드 서열 상동체와 90% 이상 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열도 본 면역원성 조성물 중에 사용될 수도 있다: 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 62, 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편.

다른 구체예에서, 복합 면역원성 조성물(combination immunogenic composition)은 본 발명의 폴리펩티드 중 하나 이상과 공지의 에스.에피더미디스 다당류 또는 다당류-단백질 컨쥬게이트를 배합함으로써 제공된다. 그 예로서는 스타필로코커스 에피더미디스 및 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 다당류 부착소, PNSG, 폴리-N-숙시닐 베타-1-6 N-아세틸 글루코사민(PIA, PS/A, PNAG로도 공지됨)가 있다. 문헌[Mckenney, D.외 다수, Infect. Immun. 66:4711(1998) and Mckenney, D.외 다수, Science 284:1523 (1998); 이 문헌의 개시 사항은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]을 참조하시오.

다른 구체예에서, 복합 면역원성 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 중 하나 이상과 하나 이상의 공지 에스.아우레우스 다당류 또는 에스.아우레우스 다당류-단백질 컨쥬게이트를 배합함으로써 제공된다. 예를 들어, 에스.아우레우스의 12개 공지 캡슐 혈청형에 있어서, 혈청형 5(CP5)와 혈청형 8(CP8)은 전체 임상 분리주의 약 85∼90%를 차지한다. 대부분의 메티실린-내성 에스.아우레우스 분리주는 CP5를 발현한다. CP5 및 CP8에 대한 항체는 시험관 내 인간 다형핵 호중구에 의한 유형-특이적 옵소닌 식균 작용 멸균능을 유도하여 동물의 체내에서 보호 능을 부여한다[Karakawa, W. W., Sutton, A.외 다수, Infect Immun 56(5) :1090-1095 (1988); Fattom, A. I., Sarwar, J.외 다수, Infection & Immunity 64(5): 1659-1665 (1996)]. 일부 실험실에서는 CP5 및 CP8이 단백질에 공유 결합되어 있는 면역원성 컨쥬게이트를 합성하였다. 이러한 컨쥬게이트는 마우스와 사람에 있어서 면역원성이 강하며, 식균 작용에 대해 미세 캡슐화되어 있는 에스.아우레우스를 옵소닌화시키는 항체를 유도한다[Fattom, A., Schneerson, R외 다수, Infect lmmun 61(3): 1023-1032 (1993); Gilbert, F. B., Poutrel, B.외 다수, Vaccine 12(4):369-374 (1994); Reynaud-Rondier, L., Voiland, A.외 다수, FEMS Microbiol Immunol 3(4):193-199 (1991)]. 슈도모나스 애어루기노사( Pseudomonas aeruginosa) 재조합 외독소 A에 컨쥬게이트화된 CP5를 함유하는 1가 면역원성 조성물은 건강한 성인뿐만 아니라, 말기 신장 질환 환자에 있어서 면역원성이며 저항성이 양호하다[Welch, P. G., Fattom, A., Moore, J. Jr.외 다수, J. Am. Soc. Nephrol. 7:247-253 [Abstract] (1996)]. 혈액 투석을 받은 말기 신장 질환 환자가 참여하는 이중 맹검 실험에서, CP5와 CP8이 슈도모나스 애어루기노사 재조합 외독소 A에 컨쥬게이트화된 2가 컨쥬게이트 백신은 약 40주 동안 즉, 항체 수치가 떨어짐에 따라서 보호 효능도 감소하는 기간 동안, 에스.아우레우스 균혈증에 대하여 부분적으로 면역성을 부여하였다[Shinefield, H., Black, S.외 다수, N Engl J Med 346(7):491-496 (2002)]. 이 실험의 결과를 통하여, 보다 광범위하고 보다 완벽한 보호가 가능한 개선된 면역원성 조성물이 필요함을 알 수 있다.

전술한 바와 같이, 임의의 구체예에서, 복합 면역원성 조성물은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 공지 에스.아우레우스 다당류-단백질 컨쥬게이트를 배합함으로써 제공된다. 탄수화물-단백질 컨쥬게이트 중 "단백질 성분"은 담체 단백질이라 공지되어 있다. 포괄적으로 "담체 단백질"이란 용어는 바람직하게는 비 독성이고 비 반응성이며 충분한 양과 순도로 얻어질 수 있는 단백질이다. 담체 단백질은 표준적인 컨쥬게이트화 과정에 순응할 수 있어야 한다. 본 발명의 특정 구체예에서, CRM₁₉₇은 담체 단백질로서 사용된다. CRM₁₉₇(노스캐롤라이나 샌포드 소재, Wyeth)은 카사미노산과 효모 추출물계 배지에서 생장한 코린박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7(β197)의 배양액으로부터 분리된 디프테리아 독소의 비 독성의 변이체(즉, 순화 독소(toxoid))이다. CRM₁₉₇은 한외 여과법, 황산암모늄 침전법 및 이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제된다. 기타 디프테리아 순화 독소는 또한 담체 단백질로서도 적당하다. 면역원성 조성물은 또한 애쥬반트 예를 들어, 알루미늄계 애쥬반트 예를 들어, 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 수산화알루미늄을 포함할 수 있다.

기타 적당한 담체 단백질로서는 불활성화 박테리아 독소 예를 들어, 파상풍 독소, 백일해 독소, 콜레라 독소(예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2004/083251[38]), 이.콜라이 LT, 이.콜라이 ST 및 슈도모나스 애어루기노사로부터 유래된 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질 예를 들어, 외막 복합체 C(OMPC), 포린(porin), 트랜스페린 결합 단백질, 폐 박리, 폐렴 구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴 구균 부착 단백질(PsaA) 또는 해모필러스 인플루엔자애(Haemophilus influenzae) 단백질 D도 사용될 수 있다. 기타 단백질 예를 들어, 오발부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 투베르쿨린의 정제 단백질 유도체(PPD)도 담체 단백질로서 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물은 다양한 벡터 및 발현 시스템으로써 수용체에 전달된다. 이러한 시스템으로서는 염색체, 에피좀 및 바이러스 유래 시스템 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 약독화 박테리아 예를 들어, 살모넬라(미국 특허 제4,837,151호), 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피좀, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스 예를 들어, 백시니아 바이러스 및 기타 수두 바이러스, 아데노 바이러스, 바큘로 바이러스, 파포바 바이러스 예를 들어, SV40, 계두 바이러스, 가성 광견병 바이러스(pseudorabies virus) 및 레트로바이러스, 알파 바이러스 예를 들어, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(미국 특허 제5,643,576호), 신드비스 바이러스 및 세밀리키 포레스트 바이러스(semiliki forest virus), 비 절편형 네가티브 사슬 RNA 바이러스 예를 들어, 구내염 바이러스(미국 특허 제6,168,943호)로부터 유래된 벡터와, 이들을 조합하여 생성된 벡터 예를 들어, 플라스미드와 박테리오파지 유전자 요소로부터 유래된 벡터 예를 들어, 코스미드 및 파지미드를 포함한다. 발현 시스템은 발현을 조절하고 유도하는 제어 부위 예를 들어, 프로모터와 기타 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 시그널)를 포함하여야 한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지하고, 증식 또는 발현시켜 숙주 내에서 폴리펩티드를 생산하는데에 적당한 임의의 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다. 적당한 뉴클레오티드 서열은 임의의 널리 공지된 통상의 기술들 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 개시된 기술을 이용하여 발현 시스템 내에 삽입될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 비이클은, 부작용을 일으키지 않고, 예를 들어, 활성 화합물의 투여를 촉진하고, 체 내 수명 및/또는 효능을 증가시키며, 용액 중에서의 용해도를 증가시키거나, 또는 보존성을 강화할 수 있는, 약학 조성물 또는 면역원성 조성물에 도입되는 화합물 또는 그러한 화합물의 조합을 특정하는 것으로 생각된다. 이와 같이 약학적으로 허용 가능한 비이클은 널리 공지되어 있으며, 선택된 활성 화합물의 투여 방식과 성질에 따라서 당 업자에 의해 채택될 것이다.

이하 정의될 "애쥬반트"란, "항원"의 면역원성 또는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 면역원성을 강화하는 물질을 의미한다. 그러므로, 애쥬반트는 종종 면역 반응을 증가 또는 조절하기 위해 투여되며, 이에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에서 고려되는 애쥬반트의 예로서는 알루미늄 염(알룸) 예를 들어, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄, 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 박테리아 리포다당류, 인산아미노알킬 글루코사민 화합물(AGP), 또는 이의 유도체 또는 유사체[코릭사(Corixa, Hamilton, MT)에서 시판되고 있으며, 미국 특허 제6,113,918호에 개시되어 있음]; 상기와 같은 AGP의 하나인 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노시드(529로도 알려져 있는 것으로서(예전에는 RC529라 칭함), 수성 형태 또는 안정한 유액의 형태로 제형화됨), MPL™ (3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A)(Corixa)(미국 특허 제4,912,094호에 개시됨), 합성 폴리뉴클레오티드 예를 들어, CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드(미국 특허 제6,207,646호), 폴리펩티드, 사포닌 예를 들어, Quil A 또는 스티뮬론(STIMULON)™ QS-21(Antigenics, 메사츄세츠주 프래밍엄 소재; 미국 특허 제5,057,540호에 개시됨), 백일해 독소(PT) 또는 이.콜라이 열 불활성 독소(LT), 구체적으로 LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129[예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 93/13302 및 WO 92/19265 참조], 콜레라 독소(야생형 또는 돌연 변이형(29번 아미노산 위치의 글루탐산이 다른 아미노산 바람직하게는 히스티딘으로 치환됨); 국제 특허 출원 WO 00/18434에 의함)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유사한 콜레라 독소 돌연 변이체에 관하여는 국제 특허 출원 공보 WO 02/098368에 기술되어 있으며, 이 돌연 변이체는 16번 아미노산 위치의 이소루신이 다른 아미노산으로 단독 치환되었거나 또는 68번 아미노산 위치의 세린이 다른 아미노산으로 치환될 때 함께 치환되었으며/치환되었거나; 72번 아미노산 위치의 발린은 다른 아미노산으로 치환되어 있다. 기타 콜레라 독소 돌연 변이체에 관하여는 국제 특허 출원 공보 WO 02/098369에 기술되어 있으며, 이 돌연 변이체는 25번 아미노산 위치의 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환되었고/치환되었거나; 49번 아미노산 위치에 임의의 아미노산이 삽입되었으며/삽입되었거나; 2개의 아미노산이 35번과 36번 아미노산 위치에 삽입되어 있다.

다양한 사이토카인 및 림포카인이 애쥬반트로서 사용하기에 적당하다. 이러한 애쥬반트로서는 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(미국 특허 제5,078,996호에 개시된 뉴클레오티드 서열 보유)가 있다. GM-CSF cDNA를 함유하는 플라스미드는 이.콜라이 내에 형질 전환되며, 이 플라스미드는 미국 버지니아주 20110-2209, 매너사, 1081 유니버시티 불레바드에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)에 수탁 번호 39900으로 기탁되어 있다. 사이토카인인 인터루킨-12(IL-12)는 미국 특허 제5,723,127호에 개시되어 있는 또 다른 애쥬반트이다. 기타 사이토카인 또는 림포카인은 면역 조절 활성을 보유하며 그 예로서는, 인터루킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론-α, β 및 γ, 과립구 골로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 α 및 β가 있고(이에 한정되는 것은 아님), 이들은 애쥬반트로서 사용하기에 적당한 것으로 파악된다.

본 발명의 조성물은 통상적으로 표준적이고, 널리 공지되어 있는 비 독성의 생리적으로 허용 가능한 담체, 애쥬반트 및 비이클을 함유하는 단위 투여 제형으로서 비 경구 투여된다.

주사용 제제 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적당한 분산제 또는 습윤제와 현탁제를 사용하여 당 업계에 공지된 바에 따라서 제형화된다. 주사용 멸균 제제는 또한 비 독성이며 비 경구적으로 사용 가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액일 수도 있다.

사용 가능한 비이클 및 용매로서는 물, 링거 용액, 그리고 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 뿐만 아니라, 멸균의 비활성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위하여, 임의의 비 자극성 불휘발성 오일 예를 들어, 합성 모노-글리세리드 또는 디-글리세리드가 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 지방산 예를 들어, 올레산도 주사용 제제에 사용될 수 있다.

바람직한 담체로서는 인산염, 락트산염 및 트리스(Tris) 등으로 완충된 중성 염수 용액을 포함한다. 물론, 바이러스 벡터를 투여할 때에는, 바람직하지 않은 오염 물질 예를 들어, 결함 방해 아데노바이러스 입자 또는 내독소 및 기타 발열원이 본질적으로 존재하지 않도록 만들기에 충분하도록 벡터를 정제하여야 벡터 구조물이 투여된 개체의 체내에서 의도로 하지 않은 임의의 반응을 일으키지 않게 된다. 벡터를 정제하는 바람직한 방법은 부력 밀도 구배(buoyant density gradient)를 이용하는 방법 예를 들어, 염화세슘 구배 원심 분리법을 포함한다.

담체는 리포좀일 수도 있다. 리포좀을 전달 비이클로 사용하는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Gabizon외 다수, 1990; Ferruti외 다수, 1986; 및 Ranade, 1989 참조].

본 발명의 면역원성 조성물은 또한 유전자 발현을 제어하는 조절 서열과 작동 가능하도록 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 목적 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 예를 들어, 플라스미드(DNA의 발현을 촉진할 조절 요소 즉, 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 제어하에 존재하는 플라스미드) 내에 조작되어 들어간다. 바람직한 구체예에서, 인간의 싸이토메갈로바이러스 최초 프로모터/인핸서(cytomegalovirus immediate-early promoter/enhancer)가 사용된다(미국 특허 제5,168,062호). 프로모터는 세포-특이적인 것으로서, 정해진 세포 내에서만 폴리뉴클레오티드의 전사를 실질적으로 허용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 내에 "나출형" DNA(미국 특허 제5,580,859호)로서, 또는 촉진제 예를 들어, 부피바카인 및 기타 국소 마취제(미국 특허 제5,593,972호) 및 양이온 폴리아민(미국 특허 제6,127,170호)를 포함하는 조성물로서 제형화되어 직접 도입된다(상기 문헌들은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨).

이와 같은 폴리뉴클레오티드 면역화 방법에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 일시적으로 생체 내에서 발현되며; 유전 물질은 숙주의 염색체 내에 삽입 또는 통합되지 않는다. 이러한 방법은 유전자 치료법과는 구별되는 것으로서, 목적 유전 물질을 염색체에 삽입 또는 통합화하는 것을 목적으로 할 때 적용된다. 검정법을 통하여, 면역화에 의해 투여되는 폴리뉴클레오티드가 숙주 내에서 형질 전환된 표현형을 발현하지 않는다는 사실을 확인하였다(미국 특허 제6,168,918호).

H. 본 발명의 용도 및 방법

본원에 기술된 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 폴리펩티드 상동체가 면역화 방법에 사용된다. 분리된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드를 발현시킨다[예를 들어, 숙주 세포 또는 폴리뉴클레오티드 면역화 방법에서 재조합 발현 벡터를 이용함].

본원의 실시예에 상세히 기술한 바와 같이, 스타필로코커스 에피더미디스는 박테리아의 전신 감염에 있어서 중요한 역할을 하는 박테리아 세포벽에서의 단백질 및 탄수화물의 발현을 촉진하는 혈청의 존재 하에 생육 되었다. 결과적으로, 스타필로코커스 에피더미디스가 70%의 혈청 중에서 생육 될 때 스타필로코커스 에피더미디스에 의해 발현되는 32개의 폴리펩티드 그리고 이외 상응하는 폴리뉴클레오티드를 동정하였다. 뿐만 아니라, 상기 단백질들 중 24개는 스타필로코커스 에피더미디스가 감염된 토끼로부터 유래된 면역 혈청과 반응성인 것으로 파악되었다.

스타필로코커스 에피더미디스가 혈청 중에서 생육될 때 발현되는 단백질에 상응하는 유전자를 클로닝하여 단백질을 재조합적 방식으로 발현시키는데에 사용하였다. 이 재조합 단백질을 마우스를 면역화하는데에 사용하였으며, 26개의 단백질 중 25개는 스타필로코커스 에피더미디스의 전 세포 용해물과 반응성인 항체를 유도하였다. 뿐만 아니라, 이 혈청 중 18개는 또한 스타필로코커스 아우레우스의 전 세포 용해물과 반응하였다. 마지막으로, 면역화된 마우스에 스타필로코커스 에피더미디스를 접종하였을 때, 이들 단백질 중 11개의 단백질이 접종 이후 비장에서 관찰되는 박테리아를 검출 가능한 양만큼 감소시키는 항체를 유도하였음을 알 수 있었다.

본 발명은 또한 상기와 같이, 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 면역원성 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 임의의 구체에에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 애쥬반트를 포함할 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 벡터 내에 포함되어 있다. 상기 벡터는 플라스미드 DNA인 것이 바람직하다. 상기 폴리뉴클레오티드는 추가로 이종 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있고, 또한 하나 이상의 애쥬반트를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 면역원성 폴리뉴클레오티드 조성물은 스타필로코커스 에피더미디스의 하나 이상의 중화 에피토프의 발현을 유도한다.

본 발명은 또한 스타필로코커스 에피더미디스 감염에 대하여 숙주를 면역화시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 상기 숙주는 인간이다. 그러므로, 숙주 또는 개체에는 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물이 면역성 유발량만큼 투여된다. 면역성 유발량의 면역원성 조성물은 투여량 반응 연구[즉, 개체에 면역원성 조성물의 양을 점진적으로 증량하여 투여하고, 그때의 면역 반응을 분석하여 최적 투여량을 결정하는 연구]를 수행함으로써 평가된다. 이 연구의 개시 시점은 동물 모델에서 얻어진 면역화 데이터로부터 추정된다. 투여량은 개체의 특정 상태에 따라서 다양할 수 있다. 상기 양은 당 업자에게 공지된 수단을 이용하는 통상의 검정법을 통하여 결정된다.

면역학적으로 유효량의 면역원성 조성물이 개체에 적당한 투여 횟수로 투여되면 면역 반응이 유도된다. 본원에 있어서 면역학적으로 유효량이란, 그 양만큼 포유동물 숙주(바람직하게는 인간)에 단일 투여 방식으로 또는 연속 투여 방식의 한 단계로서 투여하였을 경우 치료받을 개체의 면역계가 최소한의 반응(즉, 박테리아 감염시 임상학적 영향이 감소된 반응)을 일으키는데에 충분한 양을 의미한다. 치료받은 개체는 스타필로코커스 에피더미디스 또는 스타필로코커스 아우레우스 감염에 따른 임상 징후를 거의 나타내지 않는 것이 이상적일 것이다. 투여량은 개체의 특이 조건 예를 들어, 연령 및 체중에 따라서 달라질 수 있다. 이 양은 당 업자에게 공지된 수단에 의해 통상의 실험에서 결정될 수 있다.

본원에 인용된 모든 특허 및 공보는 참고용으로 인용한 것이다.

이하 실시예는, 별도로 상세히 설명한 사항을 제외하고, 당 업자에게 널리 공지되어 있으며 통상적인 표준적 기술을 이용하여 실시하였다. 모든 화학 물질은 달리 언급이 없는 한 모두 시그마(Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 입수하였다. 이하 실시예들은 예시의 목적으로 제공된 것이지, 어떠한 경우든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석해서는 안 될 것이다.

실시예 1

70% 혈청 중 박테리아 생장

본 실시예는 임상 분리 균주인 스타필로코커스 에피더미디스 O-47을 사용하여 수행하였다. 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 인사이트 코포레이션(Incyte Corporation)으로부터 입수한 분리 균주의 게놈 서열에는 주석을 달지 않았다. 문헌[Heilmann, C외 다수, Infect Immun, 64(1): p. 277-82 (1996)]을 참조하시오. 임상학적으로 병원성과 관련될 수 있는 단백질들의 발현을 촉진하기 위해, 박테리아 배양액을 100% 트립신 처리 대두 발효액(TBS) 또는 토끼 혈청과 TBS를 70:30으 로 혼합한 혼합물 중에서 밤새도록 진탕(200rpm) 생육시켰다(37℃). 토끼 혈청은 메릴랜즈 록빌에 소재하는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 입수하였다. 밤새 생육시킨 박테리아를 OD₆₀₀이 약 0.1이 될 때까지 희석시키고, 중간 대수기에 이를 때까지 4시간 동안 생육시켰다. 중간 대수기에 이르렀을 때, 원심 분리로 세포를 수집하고, 계속해서 이하 실시예에 기술된 바와 같이 처리하였다.

실시예 2

2-D 겔 전기 영동 용 세포 벽 분획의 제조

실시예 1에 기술된 바와 같이 생육시킨 스타필로코커스 에피더미디스 O-47의 세포 벽을 분리한 후, 이를 2차원 겔 전기 영동 용으로 제조하였다. OD₆₀₀이 약 20이 될 때까지 박테리아 펠렛을 재현탁한 후 트리스 완충 염수(TBS, 20 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl)를 사용하여 4℃에서 15분 동안 2회 진동 세척하였다. 1M NaCl을 함유하는 20 mM 트리스(pH8.0)를 사용하여 4℃에서 15분 동안 세척함으로써 박테리아 표면에 결합한 혈청 단백질을 제거하였다. TSB에서 생육한 박테리아를 혈청 내에서 박테리아를 생육시키는 경우와 동일하게 처리하였다. 박테리아를 원심 분리로 다시 펠렛화하였다. 원형질체를 WPWH하기 위하여, 박테리아를 OD₆₀₀이 약 40이 될 때까지 TBS[30% 수크로즈, 100 ㎍/㎖ 리소스타핀, 10㎍/㎖ DNase, 1 ㎍/㎖ 페파블록(Pefablock)(인디애나주 인디애나폴리스 소재, Boehringer Mannheim), 10 ㎍/㎖ 리소자임 및 100 유닛/㎖ 뮤타놀리신 함유] 중에 재현탁하고, 이를 37℃에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 결과로 생성된 원형질체를 5000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛화시키고, 세포 벽 물질을 함유하는 상청액을 분리하였다. 분리된 상청액(세포 벽 분획 함유)을 완전 최소 프로테아제 억제제 정제(Roche Diagnostics, 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로 보충하고, 10,000 kDa MWCO 투석막(일리노이주 록포드 소재, Pierce Biotechnology, Inc)을 사용하여 4℃에서 밤새도록 물에 대해 투석하였다. 투석 후, 세포 벽 분획을 -20℃에서 동결시켰다.

분리 후, 세포 벽 분획 시료를 다음과 같이 2-D 겔 전기 영동 용으로서 준비하였다: 동결 세포 벽 추출물을 해동시키고 4 시간 동안 얼음 상에서 70% 아세톤으로 침전시켰다. 이 단백질 침전물을 펠렛화하고, 스피드백(SpeedVac)(Thermo Savant, 뉴욕주 홀브룩 소재)에서 건조시킨 다음, 레디프렙(ReadyPrep; BioRad) 연속 추출 시약 3(SEQUENTIAL EXTRACTION REAGENT 3; 5 M 우레아, 2 M 티오우레아, 2%(w/v) CHAPS, 2%(w/v) SB 3-10, 40 mM 트리스 및 0.2% Bio-Lyte 3/10 함유)로 용해하였다.

준비된 세포 벽 분획 시료를 11 ㎝ 고정 pH 구배(IPG) 스트립(pH4∼7)(BioRad) 상에 로딩한 후, 실온에서 밤새도록 항온 처리하여 각 시료가 겔 스트립을 재 수화할 수 있도록 하였다. 시료의 양은 총 부피 200 ㎕ 중 250 ㎍이 되도록 하였다. 밤새도록 항온 처리할 때 스트립에 광유(BioRad)를 발라주어 시료가 증발되는 것을 막았다. 스트립을 재 수화한 후, 물로 포화된 블럿팅 페이퍼에 있는 과량의 광유를 제거하고, 이 수화된 스트립을 페이저 등전초법(IEF)용 장치(Genomic Solutions Inc., 미시건 주 앤 아버 소재)에 로딩하였다. 상기 스트립을 한류 50 mA/스트립 및 전압 250 V → 5,000 V으로 하여 예비 포커 싱(prefocusing)하였다. 이후 전압은 총 50 kVh(약 16 시간)에 대해 5,000 V로 일정하게 유지시켰다. 12.5% 기준 예비 성형 겔(BioRad)을 사용하여 2차원 SDS-PAGE를 수행하였다. 질량 분광 분석법에 있어서, 겔은 제조자의 지침에 따라서, 사이프로 루비(Sypro Ruby) 단백질 겔 염색(BioRad)에 의해 염색하였다.

TBS 또는 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래한 단백질과 결합한 세포 벽의 2 차원(2D) 겔 프로필을 비교하였다. 도 1을 참조하시오. 70% 토끼 혈청 중에서 생육하였을 경우에는 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래한 단백질과 결합한 세포 벽의 단백질 발현 프로필이 변하였으며, 이러한 변화는 2D 겔의 형광 염색 스팟의 이동을 통하여 쉽게 관찰 가능하였다(도 1의 A 및 B 참조).

TBS 중에서 또는 토끼 혈청의 존재 하에서 생육한 스타필로코커스 에피더미디스들의 단백질 8개는 상호 차등적으로 형광 염색되는 것으로 관찰되었다. 표 3a∼3b와 도 1을 참조하시오. 가장 주목할 점은, 70% 혈청 중에서 생육한 세포들 가운데 25∼37 kDa에 해당하는 3개의 단백질 밴드의 형광 염색이 진하였다는 점이다(도 1의 B의 e, g 및 h 스팟).

상기 표 3a∼3b에 있어서, ^a는 면역 혈청과의 반응성 또는 혈청 성분과의 결합에 의해 2D 블럿 상에서 검출되는 스팟의 목록을 나타내는 것이고;

^b는 하나 이상의 단백질을 함유하는 스팟들을 나타내는 것이며;

^c는 니트로셀룰로즈로 이동시킨 후 스팟을 검출하는 방법이고, I는 감염된 토끼로부터 유래한 반응성 면역 혈청, S는 결합 혈청 성분을 나타내는 것이고;

^dNGID는 데이터베이스에 없는 유전자를 나타내는 것이다.

실시예 3

세포 벽 단백질과 면역 혈청 및 바이오틴화된 혈청 단백질의 결합

1차원 및 2차원 전기 영동을 종결한 후, 겔 내 단백질 내용물을 결합 검정용 니트로셀룰로즈에 옮겼다. 특히, 반건조 블럿팅 장치(Owl Separations Systems, 뉴햄프셔주 포츠마우스 소재)를 사용하여 12 V에서 1 시간 동안 겔 내 단백질 내용물을 니트로셀룰로즈 막(BioRad)에 전기 블럿팅시켰다. 그 다음, 단백질 함유 니트로셀룰로즈 막(블럿)을 제조자의 지침에 따라서 사이프로 루비 단백질 블럿 염색제(BioRad)로 염색한 다음, 플루어 S 이미져(FluorS Imager; BioRad)에서 시각화하였다. 각 블럿을 블로킹 완충액(0.05% Tween 20 및 5% 분유 함유 PBS) 중에서 10분 동안 실온으로 항온 처리한 후, 면역 혈청을 1:2000으로 희석한 희석액(웨스턴 블럿) 또는 40 ㎍/㎖의 바이오틴화된 혈청 단백질과 함께 밤새도록 항온 처리하였다(이하 참조). 밤새도록 항온 처리한 후, 블럿을 세척 완충액(0.5% Tween 20 함유 PBS)으로 3회 세척한 다음, 블로킹 완충액 중 실온에서 2 시간 동안, 염소 항-토끼 IgG 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트(Biosource International, 캘리포니아주 카마릴로 소재) 또는 스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트(Biosource)와 함께 항온 처리하였다. 블럿을 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 후 이를 BCIP/NBT 막 포스파타제 기질 시스템(KPL, Inc., 미들랜드주 게이터스버그 소재)으로 시각화하였다. 플루어 S로 사진을 찍었다. 2D 겔에 대한 모든 분석은 멜라니(Melanie) 3.0 소프트웨어를 이용하여 실행하였다.

단백질 농도는 바이오래드 단백질 검정 키트(BioRad)를 사용하여 분석하였다.

세포 벽 결합 단백질의 단백질 발현 프로필의 변화는 2D 겔로부터 옮겨진 단백질을 함유하는 니트로셀룰로즈 막의 웨스턴 블럿 결과를 통하여 더욱 분명히 알 수 있다. 웨스턴 블럿에 있어서, 니트로셀룰로즈 막은 토끼(스타필로코커스 에피더미디스 O-47로 반복하여 감염시킨 토끼)로부터 풀링한 면역 혈청으로 항온 처리하였다. 도 1의 C 및 D를 참조하시오. 상승 조절된 단백질은 또한 면역 반응성이 강한데, 이는 곧 토끼가 감염되었을 때에 단백질이 발현됨을 시사하는 것이다. 혈청-생육 세포로부터 얻어진 5개의 기타 면역 반응성 밴드 또는 스팟을 TBS 생육 세포 중에서 보다 낮은 수준 또는 검출이 불가능한 수준으로 발현시켰다. 도 1의 스팟 a, b, c, d 및 f를 참조하시오.

실시예 4

스타필로코커스 에피더미디스 세포 벽 결합 단백질과 상호 작용하는 혈청 단백질의 분석

스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래된 혈청 단백질의 용리

스타필로코커스 에피더미디스 O-47을 37℃의 70% 토끼 혈청 중에서 OD₆₀₀이 약 0.8이 될 때까지 생육시키고, 세포를 펠렛화하였다. OD₆₀₀이 약 20이 되었을 때 세포를 다시 현탁시키고, 4℃에서 진동시키면서 TBS로 3회 세척하였다. 결합한 혈청 단백질을 4℃에서 1 시간 동안 진동시키면서 20 mM 트리스(pH 8.0)(0.5 M NaCl, 1.0 M NaCl 또는 4.0 M 우레아 함유)와 함께 연속적으로 용리하였다. 이후 박테리아를 원심 분리로 제거하고, 상청액을 수집하였다. 혈청 단백질을 함유하는 상청액을 박테리아 표면으로부터 용리하였다. 상이한 조건 하에서 용리된 단백질을 4∼20% 구배 트리스-글리신 겔(Cambrex Biosciences Rockland, Inc., 메사추세츠주 록랜드 소재)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

혈청 단백질의 바이오틴화

용리된 혈청 단백질을 4℃에서 밤새도록 PBS에 대해 투석하였다. 4℃에서 단백질 G 세파로즈(뉴저지주 피스카타웨이 소재, Amersham-Pharmacia)로 밤새도록 항온 처리하여 IgG를 제거하였다. 용리된 분획 중 평균 단백질 질량이 50 kDa이라고 가정하였을 때, 단백질을 4℃에서 1.5 시간 동안 15 몰 과량의 EZ-Link® NHS-바이오틴(Pierce Biotechnology)으로 표지화하였다. 과량의 글리신을 첨가하여 반응을 급랭시킨 후, PBS에 대해 밤새도록 투석하였다(10,0000 MWCO, Pierce).

스타필로코커스 에피더미디스의 표면에 결합한 혈청 단백질의 동정

상기 조건 하에 있던 박테리아로부터 용리한 혈청 단백질을, 정상의 토끼 혈청, 그리고 TSB 중에서 생육한 스타필로코커스 에피더미디스의 표면으로부터 용리한 박테리아 단백질과 SDS-PAGE로 비교하였다. 도 3을 참조하시오. 0.5M NaCl, 1M NaCl 그리고 4M 우레아를 함유하는 각각의 완충액을 사용하여 박테리아 세포로부터 유래한 결합형 혈청 단백질을 용리하였다. 이와 같이 용리된 혈청 단백질은 혈청 단백질에 대하여 증폭된 박테리아 표면으로부터 용리된 단백질 풀을 나타낸다. 일부 박테리아 단백질은 이 풀에 존재하는 것으로 추측되지만, 단백질 검정법에 의하여 검출 가능한 박테리아 단백질은 TSB에서 생육한 박테리아로부터는 용리되지 않았다. 비록 TSB 생육 박테리아로부터 용리된 흐릿한 단백질 밴드 중 몇몇은 은 염색에 의해 검출 가능하였지만, 이 밴드는 혈청 중에서 생육한 박테리아의 표면으로부터 용리된, 염색 강도가 보다 진한 단백질에 해당하지는 않았다. 대부분의 단백질을 용리시킨, 가장 약한 변성 조건은 1M NaCl로 용리시키는 것이었으며, 이 조건은 다음 실시예에 사용할 단백질을 용리하는 데에 사용하였다.

혈청 성분을 결합시키는데에 관여하는 세포 벽 결합 단백질을 동정하기 위하여, 바이오틴 표지화 혈청 단백질을 사용하였으며, 이로써 표지화된 단백질 용액과 니트로셀룰로즈 결합 세포 벽 단백질(2D 겔로 이동한 단백질)을 항온 처리함으로써 2D 이동 단백질을 프로빙할 수 있었다. 스타필로코커스 에피더미디스에 결합한 혈청 단백질을 분리하기 위하여, 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 박테리아를 1M NaCl로 세척하였다. 용리된 혈청 단백질을 수집하여 PBS에 대해 투석시켰다. 그 다음, 용리된 혈청 단백질 중에 존재할 수 있는 천연 생성 면역 IgG와 단백질 G 세파로즈를 함께 항온 처리하여 이 천연 생성 면역 IgG를 제거하였다. IgG을 제거하면 숙주 항체와 반응성인 단백질을 동정할 가능성을 줄일 수 있다. 이후 용리된 혈청 단백질을 전술한 바와 같이 바이오틴으로 표지화하여 스타필로코커스 에피더미디스 세포 표면 단백질의 2D 블럿을 프로빙하는데에 사용하였다. 도 4의 A 및 B를 참조하시오. 이와 같은 방법으로 34개의 스팟과 해당 부위를 시각화하였으며, 이러한 스팟 및 부위들은 스타필로코커스 에피더미디스와 숙주 혈청 단백질의 상호 작용에 관여하는 것으로 파악된다. 일괄적으로 혈청 성분 모두와 상호 작용을 하는 것으로 파악되는 34개의 스팟 중 4개는 감염된 토끼로부터 유래된 면역 혈청과 반응을 하는 것으로 파악되었다. 도 2와 표 3a∼3b를 참조하시오.

혈청 중에서 생육시킨 스타필로코커스 에피더미디스의 혈청 단백질은 0.5M 및 1M의 NaCl로 용리된 박테리아 표면 단백질에 결합하였다. 동일한 조건 하에서 소수의 스타필로코커스 단백질은 TSB 중에서 생육한 박테리아로부터 용리되었으나, 혈청 중에서만 발현된 스타필로코커스 단백질은 고농도 염 처리에 의해 용리될 수 있다.

실시예 5

혈청 상승 조절 단백질의 질량 분광 분석 결과

70% 혈청 중에서 생육한 박테리아를, 혈청 중에서 생육하는 동안 관찰되는 변화는 숙주 세포 내에서 나타나는 환경 자극에 반응하여 박테리아에 의해 진행되는 유전자 발현의 변화를 더욱 정확하게 반영할 수 있다는 가정하에서 수행하는, 후속 단백질체학적 실험 및 분석법에 사용하였다. 다음과 같은 질량 분광 분석학적 연구에 있어서, 2D 겔 전기 영동 분리시 나타나는 스팟으로부터 분리한 단백질을 우선 비행 시간형 질량 분광 분석(time-of-flight mass spectroscopy)하였다. 양성의 동정 결과 즉, 명백한 동정 결과가 얻어졌을 경우, 더 이상 질량 분광 분석은 수행하지 않았다. 표 4를 참조하시오. 비행 시간형 질량 분광 분석 이후 조금이라도 애매한 부분이 남을 경우 예를 들어, 2D 겔 상에 동일한 스팟으로 해석되는 단백질이 여러개 나타날 경우, 이 불명확한 부분을 해석하기 위해 전자 분무 질량 분광 분석법을 수행하였다. 표 4를 참조하시오.

시료 제조

질량 분광 분석법을 수행하기 이전에, 표적 단백질 스팟을 겔 내에서 트립신 처리하여 분해하였다. 단백질 스팟을 겔에서 분리하여 약 1㎜의 조각으로 잘랐다. 이 겔 조각들을 10 mM 중탄산암모늄 중 50%(v/v) 아세토니트릴(Burdick & Jackson, 미시간 주 머스케곤 소재) 0.2㎖로 15분 동안 가끔 와류시켜 주면서(vortexing) 3회 세척하였다. 이후 겔 조각을 아세토니트릴로 5분 동안 탈수시키고, 동결 건조한 다음, -20℃에 저온 보관하였다. 그 다음, 겔 내 단백질을 37℃에서 밤새도록 12 ng/㎖의 서열 결정급 개질 트립신(위스콘신주 매디슨 소재, Promega Corporation) 50 ㎕로 분해하였다. 이후, 트립신 용액을 제거하고 겔을 다시 50 ㎕의 아세토니트릴 중에서 탈수시켰다. 그 다음, 펩티드-함유 아세토니트릴을 제거하고, 겔 조각을 50 ㎕의 5% 포름산(독일 실츠 소재, Riedel-de Haen)을 사용하여 실온에서 15분 동안 초음파 세척기(캔터키주 셸톤 소재, Branson Cleaning Equipment Co.) 내에서 세척하였다. 펩티드-함유 상청액을 분리하여 이를 초기 아세토니트릴 세척액과 혼합하였다. 겔을 다시 아세토니트릴과 상청액(이전의 추출 단계를 2회 거쳐 혼합된 상청액) 중에서 세척하고, 스피드백(Thermo Savant)에서 약 10㎕가 될 때까지 건조시킨 다음, 0.1%(v/v) 수성 포름산 100 ㎕로 희석시켰다. 이후, 시료를 Zip-Tip_C18 P10 컬럼 (Waters Corporation, 메사츄세츠주 밀포드 소재) 상에 로딩하고 50% 아세토니트릴/0.1% 포름산 50 ㎕로 용리하였다. 시료를 92 ×2 웰 테플론 피복 스테인레스 스틸 평판(PerSeptive Biosystems, 메사츄세츠주 프래밍엄 소재)으로 옮기고, 이온 포집 질량 분광계의 오리피스로부터 도포되도록 장착된, MALDI-ToF 기구(PerSeptive Biosystems) 유리 나노스프레이 팁(New Objective Inc., 메사츄세츠주 워번 소재) 상에서 질량 핑거프린팅 분석(mass fingerprinting analysis)을 수행하였다.

ToF 질량 분광계를 이용한 펩티드 질량 핑거프린팅

각 시료를, α-시아노-4-히드록시신남산 박층이 도포된 테플론 피복 스테인레스 스틸 92 ×2 웰 평판에 도말하였다. 시료를 실온에서 건조시켰다. 지연 추출 기술이 도입된 반사기가 장착되어 있는 보이저 DE-STR MALDI-ToF 질량 분광계(PerSeptive Biosystems)를 통하여 질량 분광 분석 데이터를 얻었다. 질량 분광계에 337 ㎚ 질소 레이저(레이저 주파수 = 3 ㎐)를 장착하였다. 가속 전압은 20 kV로, 작동 방식은 반사기, 추출 방식은 지연형, 극성은 양성, 그리드 전압은 65%, 거울상 전압 비(mirror voltage ratio)는 1.12, 추출 지연 시간은 200 nsec, 질량 범위는 800∼3500 Da, 그리고 스펙트럼 당 레이저 샷은 200으로 설정하였다.

고정 나노스프레이 이온 포집 -질량 분광계

나노 전자 분무 계면이 장착된 서모피니건(ThermoFinnigan) LCQ DECA 사중 극자 이온 포집 질량 분광계(ThermoFinnigan, 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 질량 스펙트럼 데이터를 얻었다. 이 나노-전자 분무 계면은 길이 약 27 ㎜이고 OD/ID가 120/69 ㎛이며, 오리피스 지름이 2 ㎛인 실리카 분무 바늘(New Objective Inc.)로 이루어져 있다. 유리 팁에는 x,y,z 축 홀더(ThermoFinnigan)가 탑재되어 있었으며, 이는 기본적으로 질량 분광계 검출기 정면에 위치하고 있었다. 유리 팁의 표준 피복물에 전류를 인가하여, 이를 고정 나노스프레이 프로브(ThermoFinnigan) 상에 존재하는 금속 연결부를 통해 전기 분무 계면과 전기적으로 연결시켰다. 나노스프레이는 분당 20∼80 nl의 유속으로 내용물을 분사하였다.

질량 분광계의 오리피스로 내용물을 직접 분사하는 나노스프레이 유리 팁을 사용하여 트립신 분해물 2∼5 ㎕를 분석하였다. LCQ-DECA 이온 포집 질량 분광계(ThermoFinnigan)[가변 분무 전압 약 1 ㎸에서 작동하고, 가열 모관 온도(capillary temperature)가 200℃] 상에서 펩티드 분석을 수행하였다. 기구에내장된 데이터 수득 소프트웨어를 사용하는 자동화 MS/MS 방식으로 데이터 세트를 얻었다. 수득 방법은 1 MS 주사(400∼1800 m/z) → MS 주사 중 가장 많은 이온 3개의 MS/MS 주사로 수행되었다. 분석된 펩티드 이온의 수를 증가시키기 위해서 동적 배타 함수(dynamic exclusion function)를 적용하였다[설정: 3 amu = 배타 폭, 0.5 분 = 배타 기간]. 본 실험은 시료군에 대해서 수동적 방식으로 실시되었다.

Incyte PathoSeq(c) 스타필로코커스 에피더미디스 0-47 데이터베이스를 이용하는 MSFIT(Protein Prospector) 및 MASCOT(Matrix Science) 소프트웨어 데이터베이스 검색 엔진을 사용하여 질량 핑거프린팅 데이터의 자동화 분석을 실시하였다. 결과로 얻어진 스펙트럼을 기준 보정 값, 잡음 제거 및 피크 탈 동위 원소 처리(de-isotoping) 후, 검색 엔진을 사용하여 처리하였다. 데이터베이스 검색 매개 변수를 다음과 같은 수준으로 설정하였다: MW(1000 ∼ 150 kDa), pI(3 ∼ 10), 분해(트립신), 최대 분해 오류 수(2), 분해 오류 p인자(0.4), 정적 변형(아크릴아미드에 의해 변형된 시스테인), N 말단(수소), C 말단(유리 산), 가변수(메티오닌 산화, N-말단 아세틸화, 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화), 질량(단일 동위 원소성), 질량 톨러런스(mass tolerance)가 300 ppm인, 매칭 시 필요한 최소 펩티드 수(4), 및 질량 톨러런스 15 ppm인 반복적 캘리브레이션(Intelcast) 적용. 단백질 동정은 각각 MS-FIT 및 MASCOT를 사용하여 MOWSE 스코어와 95% 신뢰도 스코어에 따라서 실시하였다.

피니건 바이오웍스(Finnigan Bioworks) 데이터 분석 팩키지(ThermoFinnigan)에 통합된 SEQUEST를 사용하여 MS/MS 데이터를 자동으로 분석하였다. 문헌[Eng, J. K.외 다수, J Amer Soc Mass Spec, 5(11): p. 976-89 (1994)]을 참조하시오. 소프트웨어에는 다음과 같이 다양한 변화를 주었다: 시스테인 아크릴아미드 변형 및 메티오닌의 산화. 검색 매개 변수는 다음과 같이 지정하였다: 질량 범위(400 ∼ 3500 Da), 저밀도 MS 시그널(1e⁺⁵), 펩티드 톨러런스(2.0 Da), 단편 이온의 최소 수(15), 그룹 당 최소 주사 횟수(1), 그리고 분해 오류의 최대 횟수(2). 모든 단백질 동정 결과는 정확성을 위해 수동 방식으로 확인하였다.

질량 분광계에 의한 단백질의 동정

70% 혈청 중에서 생육시킨 스타필로코커스 에피더미디스로부터 얻은 형광 및 면역 염색 이동 물질에 해당하는 스팟을 검출하여, 이를 질량 분광 분석법에 의한 동정을 위해 배치 및 표지화하였다. 도 2의 A와 B를 참조하시오. 총 40개의 면역 반응성 스팟을 잘라내고, 이를 질량 분광 분석법으로 동정하였다. 표 4를 참조하시오. 완전한 단백질 서열을 서열 목록(서열 번호 1∼32)에 나타내었다. 겔로부터 단백질 함유 겔 스팟을 잘라내고, 이를 MALDI-TOF를 이용하여 질량 핑거프린트 분석법으로 동정한 다음, Incyte PathSeq(c) 스타필로코커스 에피더미디스 O-47 데이터베이스를 상응하는 암호화 부위에 대해 검색하였다. 표 4를 참조하시오. 다수의 단백질 히트(hit) 또는 미지의 시그널을 갖는 스팟을 고정 나노 분무법으로 추가로 분석하였다. 총 32개의 단백질이 동정되었으며, 이 중 일부 스팟은 하나 이상의 단백질을 포함하였다. 표 3a∼3b 및 4를 참조하시오. 동정된 단백질 중 24개는 면역 반응성이었으며, 이 단백질 중 26개는 혈청 성분과 결합하였고, 또한 이 단백질 중 20개는 면역 반응성일 뿐만 아니라 혈청과도 결합하였다. 혈청 인자와 결합하는데에 관여하는 스타필로코커스 에피더미디스의 표면상에 존재하는 대부분의 단백질은 면역 반응을 유도할 것이므로, 단백질은 이와 같이 많이 중첩될 것으로 예측되었다.

6개의 단백질은 면역 염색된 블럿에 존재하였으나, 이에 상응하는 스팟들은 형광 염색된 이동 물질 상에서 관찰되지 않았다. 도 2의 B에 있어서 백색 원과 화살표를 참조하시오. 이와 같이 단백질이 감염시 발현되어 면역 반응을 유발함에도 불구하고, 단백질은 이 실험에서 사용된 조건 하에서 형광 단백질 염색에 의해 검출될 수 있을 정도로 발현되지는 않는다.

실시예 6

단백질 기능의 추정

ATCC 12228로부터 유래하는 완전한 게놈 상동체와 비교함으로써 단백질의 기능을 추정하였다. 문헌[Zhang, Y.Q.외 다수, Mol Microbiol, 49(6), p. 1577-93 (2003)]을 참조하시오. 표 5a∼5b에 나타낸 예측 기능은, 특정 단백질이 관여하는 이전의 문헌과 다른 유기체 내에서 생성되는 이미 특성 규명된 단백질에 대한 상동성에 따른 각각의 ORF에 기인한 것이다.

스타필로코커스 에피더미디스 단백질의 예측 기능
스팟 번호	^a예측 기능	단백질 서열 번호	^b검출 방법
1,2	디하이드로리포아미드 탈수소효소	12	I, S
3	〃	12	I, S
	글루타메이트-1-세미알데히드 2,1- 아미노뮤타제	19	I, S
4	에놀라제	11	I, S
	연장 인자 TU(EF-TU)	18	I, S
5∼7, 9	에놀라제	11	I, S
8	포스포글루코네이트 탈수소효소	21	I
10	에놀라제	11	I, S
	연장 인자 TU(EF-TU)	18	I, S
	Na+/H+ 안티포터(antiporter)	28	I, S
11	알라닌 탈수소효소	3	I, S
12	글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH)	10	I, S
13	〃	〃	I, S
	연장 인자(EF-TS)	26	I, S
14	해당 사항 없음		I, S
15∼16	글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH)	10	I, S
17	아세틸-CoA C-아세틸트랜스퍼라제	25	I
18	시스타티온 감마-신타제	4	I

19	페리크롬 결합 리포단백질	17	I, S
	올리고펩티드 퍼미아제	23	I, S
20∼23, 25	페리크롬 결합 리포단백질	17	I, S
24	프록토즈-비스포스페이트 알돌라제	30	I, S
26	〃	〃	I, S
	가설 단백질(hypothetical protein)	8	I, S
	가설 단백질	7	I, S
27, 30∼32	리포단백질(SitC)	2	I, S
28, 33	아미노산-결합 리포단백질	22	I, S
29	추정 헥술로즈-6-포스페이트 신타제	5	I, S
34	리포에이트 리가제	13	I, S
35	해당 사항 없음		I
36	해당 사항 없음		I
37	해당 사항 없음		I, S
38	면역 우성 항원 A	29	I, S
	추정 단백질	1	I, S
39	세포 외 기질 결합 단백질(Embp)	32	I, S
40	시스테인 신타제	14	S
	프록토즈-비스포스페이트 알돌라제 상동체	20	S
	티오리독신 리덕타제	27	S
41	시스테인 신타제	14	S
42	추정 트랜스알돌라제	6	I
43	세포 외 기질 결합 단백질 (Embp)	32	S
	트랜스케톨라제	16	S
	가설 단백질	24	S
44	글루타밀-tRNAGln 아미도트랜스퍼라제 서브유닛	15	S
^a단백질의 예측 기능은 ATCC12228로부터 얻은 완전 게놈 상동체와 비교하여 측정함. ^b는 스팟을 니트로셀룰로즈에 옮긴 후 이 스팟을 검출하는 방법이고, I는 감염된 토끼로부터 유래된 반응성 면역 혈청을 나타내는 것이며, S는 결합 혈청 성분을 나타냄.

전술한 바와 같이, 70% 토끼 혈청 중에서 생육시킨 스타필로코커스 에피더미디스 O-47로부터 유래한 세포 벽 결합 단백질의 발현 프로필은 2D 겔 전기 영동법에 의해 분석되었다. 혈청 중에서의 전체적인 발현 프로필은 TSB에서 생육시켰을 경우의 발현 프로필과는 상당한 차이를 보였다. 혈청 중에서 생육할 동안 상승 조절된 다수의 단백질은 질량 분광 분석법과, 서열 비교에 의해 예측된 이 단백질의 기능에 의해 확인되었다. 표 5a∼5b를 참조하시오. 영양소 획득에 관여하는 것으로 예측되는 3개의 단백질 즉, 305, 1450 및 1703은 모두 상당히 증가하였다. 표 4 및 5를 참조하시오. 상기 3개의 단백질들은 모두 겔 상에 흔적을 남겼다. 도 4를 참조하시오. 어떠한 이론에 국한되지 않고, 이러한 결과는 다수의 하전 이성체 또는 이의 예측 리포단백질 조성에 의하여 얻어진 것이다. 뿐만 아니라, 이들 3개의 단백질 모두는 스타필로코커스 에피더미디스 O-47로 감염된 토끼로부터 유래한 면역 혈청과의 반응성이 매우 강한데, 이는 상기 단백질들이 감염시에도 숙주 내에서 발현됨을 시사하는 것이다. 도 2 및 표 5a∼5b를 참조하시오. 전체적으로, 이러한 단백질들 중 24개는 감염된 토끼로부터 유래한 면역 혈청과 반응성인 것으로 확인되었다. 이 단백질들은 혈청 중에서 생육할 때에 발현되었을 뿐만 아니라, 감염된 동물 내에서도 면역 반응을 나타내었다. 실시예 8을 참조하시오. 이러한 데이터를 종합하였을 때, 이 항원들은 모두 감염 시 발현된다는 것을 알 수 있다. 동정된 단백질 모두에 대한 RT-PCR을 통하여, 감염된 마우스의 혈류 내에서 상기 ORF로부터 전사체가 발현되는 것을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 7

재조합 단백질의 클로닝 및 발현

발현된 단백질을 질량 분광 분석하여 동정된 단백질과 스타필로코커스 에피더미디스 O-47 데이터베이스를 바탕으로 하여 디자인된 프라이머를 사용하여 유전자를 클로닝하였다. Pfu Turbo DNA 중합 효소(Stratagene, 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)으로 각각의 유전자를 증폭시키고, Taq DNA 중합 효소(Roche Diagnostics)를 이용하여 아데닌 돌출부(adenine overhang)를 부가하였다. 제조자의 지침에 따라서 반응 생산물을 pCRT7/NT-TOPO 또는 pBAD/TOPOThio (Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 클로닝한 후, 이를 이.콜라이 Top10(Invitrogen)에 형질 전환시켰다. ReddyMix PCR 마스터믹스(ABgene, 뉴욕 로체스터 소재)를 이용하는 콜로니 PCR로 양성 클론을 검출하고, 이를 서열 결정하여 의사 돌연 변이가 발생하지 않았음을 확인하였다. pCRT7 클론으로부터 유래한 플라스미드를 정제하고, 이를 이.콜라이 BL21(DE3)(Invitrogen)에 형질 전환시킨 다음, T7 중합 효소를 이용하여 발현시켰다. 상기 양성 클론을 100 ㎍/㎖ 암피실린이 보충된 HySoy 발효액[1% HySoy(Quest Intl, Stockbridge, GA), 0.5% 효모 추출물, 100 mM NaCl, 50 mM Na₂HPO₄-7H₂O, 40 mM NaH₂PO₄-H₂O 함유] 중 37℃에서 진탕(200 rpm)하면서 OD_60O이 약 1.0이 될 때까지 생육시켜 단백질을 발현시켰다. 단백질을 1 mM IPTG(pCRT7) 또는 0.2 % 아라비노즈(pBAD)가 함유된 배양액에서 발현시키고, 이 배양액을 다시 3시간 더 배양하였다. 이후 세포를 원심 분리로 수집하고, 전 세포 용해물을 SDS-PAGE하여 단백질이 발현되었는지 여부를 확인하였다.

재조합 단백질의 정제

세포 펠렛을 100 ㎖ TBS(20 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl)에 재현탁하고, 프렌치 가압 셀(French pressure cell; SLM-Aminco, 뉴욕주 로체스터 소재)에 1회 통과시켜 분쇄하였다. 이후 시료를 원심 분리(10,000 x g, 10분)로 가용성 분획 또는 불용성 펠렛으로 분리하였다. 재조합 단백질의 위치는 SDS-PAGE로 확인하였다. 만일 재조합 단백질이 가용성 분획 중에 존재한다면, 단백질은 Ni²⁺로 하전된 이미노디아세트산 아가로즈 수지상에 로딩하였다. 표 6을 참조하시오. 그 다음, 컬럼을 TBS 중 30 mM 이미다졸로 세척하였다. 결합된 단백질을 TBS 중 300 mM 이미다졸로 용리하였다. 만일 추가의 정제 단계가 필요하다면, 단백질을 50 mM NaCl 및 1 mM EDTA를 함유하는 20 mM 트리스(pH 8.0)로 투석시키고, POROS-Q 수지(Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터 시티 소재)가 팩킹된 컬럼에 로딩하였다. 결합된 단백질을 20 mM 트리스(pH 8.0) 및 1 mM EDTA 중에서 50 mM → 500 mM NaCl 구배를 걸어주어 용리하였다. 목적 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE로 확인하고 이를 -20℃에 보관하였다.

만일 재조합 단백질이 불용성 분획에서 발견되었다면, 이 불용성 분획을 TBS 중 1% Triton X-100 100 ㎖로 4℃에서 4 시간 동안 처리하였다. 표 6을 참조하시오. 불용성 단백질을 원심 분리에 의해 펠렛화하고 상청액은 폐기하였다. 이후, 불용성 펠렛을 실온에서 최소 8 시간 동안 TBS 중 8 M 우레아 100 ㎖로 추출하였다. 불용성 파편을 펠렛화하고 단백질은 전술한 바와 같이 정제하였다[단, 모든 완충액은 2M 우레아를 함유함]. 정제 후, Triton X-100을 첨가하여 최종 농도가 0.1%로 되도록 만들었다. 그 다음, 단백질을 0.1% Triton을 함유하는 TBS로 투석시켜 이를 -20℃에 보관하였다.

AKTA 엑스플로러(Amersham-Pharmacia Biotech, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 모든 액체 크로마토그래피를 수행하였다. 모든 SDS-PAGE는 4∼20% 구배 트리스-글리신 겔(Cambrex)을 이용하여 수행하였다.

실시예 8

재조합 스타필로코커스 에피더미디스 단백질을 사용한 면역원성 조성물

4주령 된 암컷 Balb/C 마우스(Charles River Laboratories, 메사츄세츠주 윌밍턴 소재)에 10 ㎍ 재조합 단백질과 20 ㎍ STIMULON™ QS-21을 함께 조제한 것을 0주, 3주 및 6주 경과시 피하 주사하여 상기 마우스를 면역화하였다. 처음 면역화하기 이전인 0주째 되는 날과 8주 경과시 이 마우스로부터 채혈하였다. 마지막 채혈 후 2일 경과시, 마우스에 콜럼비아 염 아가(Columbia salt agar; 1x 콜럼비아 아가, 0.1% 글루코즈, 1% 효모 추출액, 0.5% NaCl)에서 밤새도록 생육시킨 5 x 10⁸ cfu의 스타필로코커스 에피더미디스 0-47를 복강 내 주입하여 이 마우스를 공격하였다. 공격 후 24 시간 경과시, 마우스를 죽이고 비장 및 혈액 내에 존재하는 박테리아의 수를 계측하였다.

재조합 단백질을 이용한 마우스의 능동 면역화

혈청-결합 단백질 또는 면역 반응성 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 27개의 orf를 스타필로코커스 에피더미디스 O-47로부터 클로닝하고, 재조합 단백질을 헥사히스티딘 태그 보유 이.콜라이 내에서 발현시켰다[여기서, 상기 His-태그는 편의를 위해 사용하는 것으로서, 본 발명의 면역원성 조성물은 His-태그를 포함하지 않고 발현된 단백질을 함유할 것이다]. 표 7을 참조하시오. 이 단백질은 Ni²⁺ 킬레이트 컬럼 → 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 나머지 3개의 orf 클론(2006, 2975 및 2907)을 클로닝하되, 정제하는데에 충분한 수준으로 발현시키지는 않았다. 0주, 3주 및 6주 경과시 Balb/C 마우스를 각각의 재조합 단백질로 면역화하였다. 0주 및 8주 경과시 동물로부터 채혈한 다음, 8주 경과시에는 스타필로코커스 에피더미디스 O-47로 공격(복강 내)하였다. 공격 후 24시간 경과시, 동물을 마취한 후, 이 동물의 혈액 및 비장에 존재하는 박테리아의 수를 계측하였다. 이와 같이 5마리의 동물로 이루어진 그룹에 대해 후보 면역원성 조성물의 초기 스크리닝을 수행한 결과, 다수의 단백질을 스크리닝할 수 있었다. 결과로 얻어진 데이터는 통계학적으로 중요하지는 않았지만, 다수의 후보 면역원성 조성물의 효능에 관한 중요 정보를 제공하였다. 27개의 재조합 단백질 중 8개는 비장 및/또는 혈액으로부터 회수한 박테리아의 수가 1 로그 이상 감소하였다. 표 7(NT = 시험하지 않음)을 참조하시오.

면역화된 마우스로부터 얻은 혈청을 박테리아 단백질에 대한 항체 활성에 관하여 평가하였다. 표 8을 참조하시오. 토끼 혈청 중에서 중간 대수기까지 생육한 스타필로코커스 에피더미디스의 전 세포 용해물을 웨스턴 블럿하여 확인한 바에 따르면, 시험된 24개의 면역 혈청 중 23개는 원래의 단백질과 반응하였다. 표 8(NT = 시험하지 않음)을 참조하시오.

표 8에 따르면, 스타필로코커스 에피더미디스 항원으로 면역화된 다수의 동물들은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항체 반응도 나타냄을 알 수 있었다. 그러므로, 스타필로코커스 에피더미디스 항원에 대한 면역원성 조성물은 스타필로코커스 에피더미디스 뿐만 아니라 스타필로코커스 아우레우스로 인한 질병의 치료 또는 예방에도 효과가 있음을 알 수 있었다. 표 8을 참조하시오.

상기 면역원성 조성물에 사용되는 재조합 단백질의 하위세트를 사용하여 보다 큰 무리의 마우스를 면역화할 수도 있었다. 10마리의 암컷(4주령) Balb/C 마우스로 이루어진 그룹의 경우, 마우스에 염수 또는 10 ㎍의 항원과 20 ㎍의 STIMULON™ QS-21(애쥬반트)를 피하 주입하여 면역화하였다. 마지막 면역화 이후 2주 경과시, 마우스를 약 5 × 10⁸ cfu의 에스.에피더미디스 0-47로 공격(복강 내 주사)하였다. 공격 후 24 시간 경과시, 혈액 및 비장 중에 존재하는 박테리아를 계수하였다. 표 9를 참조하시오. 염수 내 STIMULON™ QS-21 대조구에 비하여 로그 CFU가 감소하였음을 관찰할 수 있었다. 데이터를 스튜던트 T 검정법(p값 = ^*0.05 또는 ^**0.01)으로 분석하였다.

표 9에 나타낸 스타필로코커스 에피더미디스 단백질은 후속 공격에 의해 박테리아 감염의 심각성이 감소된 면역원성 조성물에 사용될 경우에 가장 효과적이었음을 알 수 있었다.

실시예 9

스타필로코커스 에피더미디스 단백질로 면역화한 이후 스타필로코커스 에피더미디스 공격에 대한 보호

실시예 8의 항체 결합 데이터(표 8)에 의해 제시된 바와 같이, 스타필로코커스 에피더미디스 항원에 대한 면역원성 조성물은 스타필로코커스 아우레우스로 인한 질병의 치료 또는 예방에 있어서 효과적일 수 있었다. 그러므로, 공격은 스타필로코커스 에피더미디스 항원을 함유하는 면역원성 조성물로 면역화한 이후에 스타필로코커스 아우레우스를 사용하여 행해졌다.

4주령 된 암컷 CD-1 마우스(Charles River Laboratories, 메사츄세츠주 윌밍턴 소재)에 10 ㎍ 재조합 단백질과 20 ㎍ STIMULON™ QS-21을 함께 조제한 것을 0주, 3주 및 6주 경과시 피하 주사하여 상기 마우스를 면역화하였다. 처음 면역화하기 이전인 0주째 되는 날과 8주 경과시 이 마우스로부터 채혈하였다. 마지막 채혈 후 2일 경과시, 마우스에 콜럼비아 염 아가(1 x 콜럼비아 아가, 0.1% 글루코즈, 1% 효모 추출액, 0.5% NaCl)에서 밤새도록 생육시킨 3 x 10⁸ cfu의 에스.아우레우스 레이놀즈(Reynolds)를 복강 내 주입하여 이 마우스를 공격하였다. 공격 후 24 시간 경과시, 마우스를 죽이고 신장 내에 존재하는 박테리아를 계수하였다.

스타필로코커스 아우레우스를 이용한 공격
ORF	단백질 서열 번호	예측 기능	CFU 감소율
2653	29	면역 우성 AgA	0.9 로그
321	3	알라닌 탈수소효소	0.7 로그
1015	12	디하이드로리포아미드 탈수소효소	감소하지 않음
608	7	예측 불가	0.6 로그
1069	13	리포에이트 리가제	1.7 로그
639	6	가설	감소하지 않음

표 10에 나타낸 바와 같이, 임의의 스타필로코커스 에피더미디스 항원은 스타필로코커스 아우레우스를 인지하고 이와 결합하는 항체를 유도하는데에 효과적이었다. 뿐만 아니라, 유도된 항체는 스타필로코커스 아우레우스 공격 이후 계수된 박테리아의 수치를 감소하는 유리한 효능을 보유하였다.

서열 번호 1∼서열 번호 32의 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 항원의 아미노산 서열의 % 동일성은 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래된 상동체의 아미노산 서열과 비교하여 측정하였다. 그 결과를 이하 표 11에 제시하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Wyeth Sellman, Bret R. Baker, Steven M. <120> Immunogenic Compositions of Staphylococcus Epidermidis Polypeptide Antigens <130> AM101548 <160> 64 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 338 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 1 Leu Arg Lys Asp Val Ile Glu Val Val Asn Lys Val Glu Asp Tyr Tyr 1 5 10 15 Phe Lys Ser Tyr Pro Ile Gln Tyr Asn Pro Ile Ile Glu Tyr Phe Asn 20 25 30 Gln Ile Lys Asn Lys Lys Val Ile Val Ser Leu Lys Ile Tyr Lys Val 35 40 45 Tyr Lys Lys Ile Val Glu Asn Ile His Asp Thr Glu Ser Gln Trp Ile 50 55 60 Tyr Ser Pro Glu His Ala Leu His Pro Ile Glu Phe Ile Glu Ser Phe 65 70 75 80 Cys Lys His Ile Lys Gly Lys Tyr Ala Gly Thr Pro Ile Glu Leu Glu 85 90 95 Leu Trp Gln Lys Ala Gly Ile Ala Thr Ile Phe Gly Phe Ile Asn Lys 100 105 110 Lys Thr Lys Glu Arg Lys Tyr Gln Glu Ile Phe Trp Val Val Ala Arg 115 120 125 Lys Asn Gly Lys Ser Thr Ile Ser Ser Gly Ile Ala Leu Tyr Leu Leu 130 135 140 Gly Ala Asp Gly Glu Gly Gly Pro Glu Val Tyr Thr Val Ala Thr Lys 145 150 155 160 Lys Asp Gln Ala Lys Ile Val Trp Asn Asp Ala Lys Lys Met Val Asn 165 170 175 Lys Ser Pro Leu Leu Lys Leu Asp Phe Val Thr Lys Val Ala Glu Ile 180 185 190 Leu Thr Pro Phe Asn Asp Gly Gln Leu Ile Pro Leu Gly Arg Asp Ser 195 200 205 Asp Thr Thr Asp Gly Leu Asn Val His Gly Ala Ile Met Asp Glu Val 210 215 220 His Ala Trp Lys Thr Met Gln Met Tyr Asp Val Val Phe Asp Gly Ile 225 230 235 240 Ser Ala Arg Asp Asn Pro Leu Ile Leu Ala Ile Thr Thr Ala Gly Thr 245 250 255 Ile Arg Asn Ser Val Tyr Asp Ile Lys Tyr Glu Glu Ser Glu Asn Ile 260 265 270 Ile Asn Gly Leu Trp Glu Asp Glu Gly Tyr Lys Asn Glu Arg Phe Leu 275 280 285 Pro Leu Ile Tyr Glu Leu Asp Ser Arg Glu Glu Trp Ile Asp Glu Ser 290 295 300 Cys Trp Leu Lys Ala Asn Pro Gly Leu Gly Ser Ile Lys Lys Ile Asp 305 310 315 320 Ala Ile Lys Thr Lys Val Asn Arg Ala Lys Lys Asn Ala Leu Phe Arg 325 330 335 Ala Thr <210> 2 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 2 Val Lys Lys Ile Leu Ala Leu Ala Ile Ala Phe Leu Ile Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Cys Gly Asn His Ser Asn His Glu His His Ser His Glu Gly Lys 20 25 30 Leu Lys Val Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Val Lys Arg 35 40 45 Val Gly Gly Asn Lys Val Asp Val His Ser Ile Val Pro Val Gly Gln 50 55 60 Asp Pro His Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Ala Leu Thr 65 70 75 80 Asp Ala Asp Val Val Phe Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn 85 90 95 Gly Trp Phe Glu Lys Ala Leu Asp Gln Ala Gly Lys Ser Thr Lys Asp 100 105 110 Lys Asn Val Ile Ala Ala Ser Asn Asn Val Lys Pro Ile Tyr Leu Asn 115 120 125 Gly Glu Glu Gly Asn Lys Asn Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu Ser 130 135 140 Leu Glu Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Lys Ser Leu Glu 145 150 155 160 His His Asp Lys Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Ala 165 170 175 Tyr Ile Ser Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Asp Ser Lys Asn Lys Phe 180 185 190 Asp Asp Ile Pro Lys Asn Gln Arg Ala Met Met Thr Ser Glu Gly Ala 195 200 205 Phe Lys Tyr Phe Ala Gln Gln Phe Asp Val Lys Pro Gly Tyr Ile Trp 210 215 220 Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Gly Gln Met Lys Gln Ala 225 230 235 240 Ile Lys Phe Val Lys Asp Asn His Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr 245 250 255 Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Gln Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys 260 265 270 Asp Ile Tyr Gly Glu Val Phe Thr Asp Ser Ile Gly Lys Ala Gly Thr 275 280 285 Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Asp Thr Ile 290 295 300 His Gly Ser Met Lys 305 <210> 3 <211> 376 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 3 Leu Glu Val Asp Asn Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn 1 5 10 15 Asn Glu Asn Arg Val Gly Leu Ser Pro Ser Gly Val His Ala Leu Val 20 25 30 Asp Gln Gly His Glu Val Leu Val Glu Thr Asn Ala Gly Leu Gly Ser 35 40 45 Tyr Phe Glu Asp Gly Asp Tyr Gln Glu Ala Gly Ala Lys Ile Val Asp 50 55 60 Glu Gln Ser Lys Ala Trp Asp Val Asp Met Val Ile Lys Val Lys Glu 65 70 75 80 Pro Leu Glu Ser Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Glu Glu Leu Ile Leu Phe 85 90 95 Thr Tyr Leu His Leu Ala Asn Glu Gln Lys Leu Thr Gln Ala Leu Val 100 105 110 Asp Asn Lys Val Ile Ser Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Pro Asp 115 120 125 Gly Ser Leu Pro Leu Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met 130 135 140 Ser Thr Gln Val Gly Ala Glu Phe Leu Gln Arg Phe Asn Gly Gly Met 145 150 155 160 Gly Ile Leu Leu Gly Gly Ile Pro Gly Val Pro Lys Gly Lys Val Thr 165 170 175 Ile Ile Gly Gly Gly Gln Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Leu 180 185 190 Gly Leu Gly Ala Glu Val Thr Ile Leu Asp Val Asn Pro Lys Arg Leu 195 200 205 Glu Glu Leu Glu Asp Leu Phe Asp Gly Arg Val Arg Thr Ile Met Ser 210 215 220 Asn Pro Leu Asn Ile Glu Met Tyr Val Lys Glu Ser Asp Leu Val Ile 225 230 235 240 Gly Ala Val Leu Ile Pro Gly Ala Lys Ala Pro Asn Leu Val Thr Glu 245 250 255 Asp Met Ile Lys Glu Met Lys Asp Gly Ser Val Ile Val Asp Ile Ala 260 265 270 Ile Asp Gln Gly Gly Ile Phe Glu Thr Thr Asp Lys Ile Thr Thr His 275 280 285 Asp Asn Pro Thr Tyr Thr Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala 290 295 300 Asn Met Pro Gly Ala Val Pro Arg Thr Ser Thr Ile Gly Leu Asn Asn 305 310 315 320 Ala Thr Leu Pro Tyr Ala Gln Leu Leu Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Glu 325 330 335 Ala Phe Lys Val Asn His Pro Leu Ser Leu Gly Leu Asn Thr Phe Asn 340 345 350 Gly His Val Thr Asn Lys Asn Val Ala Asp Thr Phe Asn Phe Glu Tyr 355 360 365 Thr Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys 370 375 <210> 4 <211> 400 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 4 Met Glu Ala Ile Asp Thr Cys Pro Asn Lys Tyr Ser Thr Ile Arg Arg 1 5 10 15 Val Leu Ile Met Asn Lys Lys Thr Gln Met Ile His Gly Gly His Thr 20 25 30 Thr Asp Asn Tyr Thr Gly Ala Val Thr Thr Pro Ile Tyr Gln Thr Ser 35 40 45 Thr Tyr Leu Gln Asp Asp Ile Gly Asp Leu Arg Gln Gly Tyr Glu Tyr 50 55 60 Ser Arg Thr Ala Asn Pro Thr Arg Ala Ser Leu Glu Ser Val Ile Ala 65 70 75 80 Asn Leu Glu His Gly Lys His Gly Phe Ala Phe Gly Ser Gly Met Ala 85 90 95 Ala Ile Ser Ala Val Ile Met Leu Leu Asp Lys Gly Asp His Leu Val 100 105 110 Leu Asn Ser Asp Val Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Ala Leu Thr Lys Val 115 120 125 Phe Thr Arg Phe Gly Ile Asp Val Asp Phe Val Asp Thr Thr Lys Ile 130 135 140 Glu Asn Ile Glu Gln Tyr Ile Lys Pro Glu Thr Lys Met Leu Tyr Val 145 150 155 160 Glu Thr Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Thr Asp Ile Lys Ala Ser 165 170 175 Ala Lys Ile Ala Lys Lys Tyr Asp Leu Ile Ser Val Val Asp Asn Thr 180 185 190 Phe Met Thr Pro Tyr Tyr Gln Asn Pro Leu Asp Phe Gly Ile Asp Ile 195 200 205 Val Leu His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Gly Gly His Ser Asp Val Val 210 215 220 Ala Gly Leu Val Ala Thr Ala Asp Asp Asp Leu Ala Glu Arg Leu Gly 225 230 235 240 Phe Ile Ser Asn Ser Thr Gly Gly Val Leu Gly Pro Gln Asp Ser Tyr 245 250 255 Leu Leu Ile Arg Gly Ile Lys Thr Leu Gly Leu Arg Met Glu Gln Ile 260 265 270 Asn Arg Asn Val Glu Gly Ile Val Gln Met Leu Gln Lys His Pro Lys 275 280 285 Val Gln Gln Val Phe His Pro Ser Ile Lys Glu His Met Asn Tyr Thr 290 295 300 Ile His Gln Asn Gln Ala Thr Gly His Thr Gly Val Val Ser Phe Glu 305 310 315 320 Val Lys Asp Thr Glu Ala Ala Lys Gln Val Ile His Ala Thr Asn Tyr 325 330 335 Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Ala Val Glu Ser Leu Ile Ser Val 340 345 350 Pro Ala Leu Met Thr His Ala Ser Ile Pro Ser Asp Val Arg Ala Lys 355 360 365 Glu Gly Ile Thr Asp Gly Leu Ile Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Asp 370 375 380 Thr Glu Asp Leu Val Asn Asp Leu Glu Gln Ala Leu Asn Thr Leu Arg 385 390 395 400 <210> 5 <211> 210 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 5 Leu Glu Leu Gln Leu Ala Ile Asp Leu Leu Asn Lys Glu Glu Ala Ala 1 5 10 15 Lys Leu Ala Gln Lys Val Glu Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu Ile Gly 20 25 30 Thr Pro Ile Val Ile Asn Glu Gly Leu Pro Ala Val Gln His Leu Asn 35 40 45 Glu Asn Ile Asn Asn Ala Lys Val Leu Ala Asp Leu Lys Ile Met Asp 50 55 60 Ala Ala Asp Tyr Glu Val Ser Gln Ala Val Lys Tyr Gly Ala Asp Ile 65 70 75 80 Val Thr Ile Leu Gly Val Ala Glu Asp Ala Ser Ile Lys Ala Ala Val 85 90 95 Glu Glu Ala His Lys His Gly Lys Ala Leu Leu Val Asp Met Ile Ala 100 105 110 Val Gln Asn Leu Glu Gln Arg Ala Lys Glu Leu Asp Glu Met Gly Ala 115 120 125 Asp Tyr Ile Ala Val His Thr Gly Tyr Asp Leu Gln Ala Glu Gly Lys 130 135 140 Ser Pro Leu Asp Ser Leu Arg Thr Val Lys Ser Val Ile Lys Asn Ser 145 150 155 160 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epidermidis <400> 31 Leu Lys Glu Arg Phe Ile Lys Lys Thr His Tyr Leu Asp Tyr Gln Phe 1 5 10 15 Asp Glu Pro Thr Asp Ile Lys Leu Gly Phe Thr Thr Arg Glu Asn Gly 20 25 30 Leu Ser Pro Tyr Pro Asn His Ser Phe Asn Met Ala Arg Tyr Ile Ser 35 40 45 Asp Ser Ala His His Ile Thr His His Gln Asp Ile Leu Ala Asn Leu 50 55 60 Ile Gly Tyr Pro Arg Asp Glu Trp Val Phe Pro Ile Gln Thr His Asp 65 70 75 80 Ser Arg Ile Val Glu Val Thr Ser Glu His Lys Gly Thr Asn Ile Asp 85 90 95 Glu Leu Thr Asp Asp Leu His Gly Ile Asp Gly Met Tyr Thr Phe Asp 100 105 110 Ser His Ile Leu Leu Thr Met Cys Tyr Ala Asp Cys Val Pro Val Tyr 115 120 125 Phe Tyr Ser Glu Pro His Gly Tyr Ile Gly Leu Ala His Ala Gly Trp 130 135 140 Arg Gly Thr Tyr Gly Gln Ile Val Lys Asp Met Leu Lys Lys Val Asp 145 150 155 160 Phe Asp Tyr Glu Asp Leu Lys Ile Val Ile Gly Pro Ala Thr Ser Asn 165 170 175 Ser Tyr Glu Ile Asn Asp Asp Ile Lys Asn Lys Phe Glu Glu Leu Thr 180 185 190 Ile Asp Ser Thr Leu Tyr Ile Glu Thr Arg Gly Lys Asn Gln His Gly 195 200 205 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taaatgtaca tggtgctatt 660 atggatgaag tgcatgcttg gaaaacaatg caaatgtacg atgtggtttt tgacggaata 720 tctgcacgtg ataatccttt aattctagca ataactactg cgggaacaat aagaaactct 780 gtgtatgata taaaatatga agaatcagaa aatataatca atgggttatg ggaagatgaa 840 ggatataaaa atgaacgatt tttacctttg atatatgaat tagattcacg agaagaatgg 900 atagatgaaa gttgttggct aaaagccaat ccaggattag gttcaataaa gaaaatagat 960 gctatcaaaa ctaaagtaaa tagagctaag aagaatgctt tatttagagc aacc 1014 <210> 34 <211> 930 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 34 gtgaaaaaaa ttctcgcttt agcaatagca tttttaatta tccttgccgc atgtgggaat 60 cacagtaacc atgaacatca ctcacatgaa ggaaaattaa aagttgtaac tacaaactct 120 attctctatg acatggttaa acgtgtcggt ggaaataagg tcgatgttca tagcatcgtt 180 ccagtaggac aagatccaca tgaatatgag gttaaaccta aagatattaa agcattaaca 240 gatgctgacg ttgtatttta taatggttta aacctagaaa ctggaaatgg ttggtttgaa 300 aaagcacttg accaagcagg aaaatcaaca aaagataaaa atgtgatagc agcatcaaat 360 aatgttaaac caatatactt aaatggtgag gaaggtaaca aaaacaaaca agatccacat 420 gcatggttaa gtttagagaa tggaattaaa tacgtaaaaa caatacaaaa atcactagaa 480 catcatgata aaaaagataa gtctacatat gaaaaacaag ggaatgcata tatatcaaaa 540 ttagaagaac ttaataaaga tagtaaaaat aaatttgatg acatacccaa aaatcaacgt 600 gccatgatga caagtgaagg tgcatttaaa tattttgctc aacaattcga tgttaaacca 660 ggttatattt gggagataaa cacagaaaaa caaggtacac ctggtcaaat gaaacaagcc 720 attaaatttg ttaaagataa tcatttaaaa catttattag tcgaaacaag cgtagataaa 780 aaagctatgc aaagtttatc agaagaaact aagaaagata tttatggtga agtatttacc 840 gactctatag gtaaggcagg tactaaaggt gactcatact ataaaatgat gaaatctaat 900 attgatacaa tacatggtag tatgaaataa 930 <210> 35 <211> 1131 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 35 ttggaggtag ataatatgaa aattgggatt cctaaagaaa taaagaataa tgagaatcga 60 gtggggttat ccccaagtgg tgtacatgca cttgtagacc aaggacatga agttttagta 120 gaaacaaatg ctggtctagg atcttacttt gaagatggtg attatcaaga agccggtgcc 180 aaaattgttg atgagcagtc aaaagcttgg gatgttgata tggtcatcaa agttaaagaa 240 ccacttgaat cggaatacaa attctttaaa gaagagttaa 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atgagatggg tgcagactat atcgcagttc atacaggtta cgacttacaa 420 gctgaaggaa aatctccatt agacagcttg cgtacagtta aatctgttat caaaaactct 480 aaggttgcag tagcaggtgg tattaaacca gatactatca aagatattgt tgctgaagat 540 ccagatttag ttattgttgg tggcggtatt gcgaatgctg acgatcctgt agaagcagca 600 aaacaatgta gagcagctat tgaaggtaaa taa 633 <210> 38 <211> 714 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 38 atgacaaaat taaatgttaa agtgtttgcg gatggtgcag atattgaaga aatgaaatca 60 gcatataaga atcaactcgt tgatggtttt acaacgaatc caagcttgat ggctaaagcg 120 ggtgtaactg attataaagc ttttgcagag gaagtggtta gtgaaatacc agacgcttca 180 atttcttttg aggtgtttgc tgacgattta cctactatgg aaaaagaagc tgagatttta 240 aaacaatatg gtgataatgt atttgtaaaa attcctattg ttacaacaac tggtgagtct 300 acactaccat taattaaacg tttatcatcg aaacaggtaa ggttgaatgt cacggctgtc 360 tatactatag agcaagtaaa agcaattact gacgctgtaa ctgaaggtgt gccaacatat 420 gtgtcagtat ttgcaggacg cattgcagat actggggttg atccacttcc tttgatgaaa 480 gaatcagtta aggtaactca tagtaaagaa ggcgttcaat tattatgggc 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Claims

서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나 이상으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로 감염된 토끼 혈청 중의 항체와 면역 반응성인 것인 면역원성 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 토끼 혈청 단백질과 결합하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 애쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 스타필로 코커스 에피더미디스로부터 유래하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이종 아미노산을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 스타필로코커스 에피더미디스로부터 분리되는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 스타필로코커스 에피더미디스의 중화 에피토프(neutralizing epitope)를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 리포단백질인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 스타필로코커스 에피더미디스 다당류 항원을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 다당류 또는 폴리펩티드 항원을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편에 의해 암호화되는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래하는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 62, 또는 이의 축퇴성 변이체, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이종 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 이의 축퇴성 변이체, 또는 이의 단편을 포함하며, 이 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것인 면역원성 조성물.
제20항에 있어서, 상기 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 62, 또는 이의 축퇴성 변이체, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 DNA인 면역원성 조성물.
제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드인 면역원성 조성물.
제20항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스로부터 유래하는 것인 면역원성 조성물.
제24항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이종 뉴클레오티드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
제20항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 것인 면역원성 조성물.
제24항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 스타필로코커스 에피더미디스의 중화 에피토프의 발현을 유도하는 것인 면역원성 조성물.
제20항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형질 감염 촉진제(transfection facilitating agent)를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제28항에 있어서, 상기 형질 감염 촉진제는 부피비카인인 면역원성 조성물.
서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나 이상으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 면역 유발량(immunogenic amount)으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 스타필로코커스 에피더미디스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이종 아미노산을 추가로 포함하는 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드인 방법.
제30항에 있어서, 상기 조성물은 애쥬반트를 추가로 포함하는 것인 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드인 방법.
서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나 이상으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 면역 유발량으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 스타필로코커스 에피더미디스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 조성물은 벡터를 추가로 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 DNA인 방법.
제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드인 방법.
제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이종 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 유전자 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 결합되어 있는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 조성물은 애쥬반트를 추가로 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 조성물은 형질 감염 촉진제를 추가로 포함하는 것인 방법.
제42항에 있어서, 상기 형질 감염 촉진제는 부피비카인인 방법.
서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리펩티드 서열, 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 면역 유발량으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타필로코커스 에피더미디스 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 축퇴성 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 면역 유발량으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
(a) 혼성화가 가능한 조건 하에서, 서열 번호 33∼서열 번호 64 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 축퇴성 변이체, 또는 이의 단편의 올리고뉴클레오티드 프로브를 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 시료 중 혼성화 복합체가 존재하는지 여부를 검출하는 단계로서, 이 혼성화 복합체는 시료 중 스타필로코커스 에피더미디스가 존재함을 나타내는 지표인 단계

를 포함하는, 생물학적 시료 중에서 스타필로코커스 에피더미디스를 검출 및/또는 동정하는 방법.
(a) 면역 복합체 형성이 가능한 조건 하에서, 서열 번호 1∼서열 번호 32 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 균등체 또는 이의 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 시료 중 면역 복합체가 존재하는지 여부를 검출하는 단계로서, 이 면역 복합체는 시료 중 스타필로코커스 에피더미디스가 존재함을 나타내는 지표인 단계

를 포함하는, 생물학적 시료 중에서 스타필로코커스 에피더미디스에 대한 항체를 검출 및/또는 동정하는 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스타필로코커스 에피더미디 스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 것인 조성물.