CN101173228B - 新的乳酸杆菌菌株、药物组合物及其用途、以及制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406，其在37℃存活30-60天。本发明还提供了一种包含所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406的药物组合物。本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023能长期保存，且能有效地治疗抗生素和化疗药物引起的腹泻和相关症状。
Description
技术领域
本发明涉及新的乳酸杆菌(L.rhamnosus)菌株、其制备方法以及在治疗抗生素和化疗引起的腹泻及其相关病症的新用途。
背景技术
正常情况下，肠道菌群、宿主和外部环境建立起一个动态的生态平衡，该生态平衡对人体的健康起着重要作用。但是，目前由于多种原因(如抗生素的不合理使用、长期慢性病患者、创伤或手术、免疫抑制剂、激素、化疗药、放疗等医疗措施以及环境因素)破坏了这种生态平衡，从而造成菌群紊乱并导致腹泻等症状。
在上述原因中，抗生素和化疗药的使用目前日益突出。随着抗生素的广泛应用，抗生素相关性腹泻(AAD)日益受到关注。抗生素在抑制或杀死致病菌的同时，也会同时损伤正常菌群，而肠道球菌或真菌则会过度生长。几乎所有的抗生素(包括万与霉素和甲硝唑)均可诱发AAD，且以广谱青霉素最为常见，其次是克林霉素、头孢菌素、氨基糖甙类等。另外抗肿瘤的化疗药物也会造成肠道菌群紊乱，从而导致腹泻。
研究表明，临床长期应用广谱抗生素和化疗药物会导致肠道菌群失调、肠道黏膜形态学改变以及肠道屏障功能损害，从而使肠腔中的大量细菌及其内毒素由肠系膜淋巴结进入内脏器官及体循环，引起菌血症、脓毒血症等重症感染。这种肠源性感染依靠常规的抗生素治疗不但难以治愈，而且会导致病情的恶化和蔓延。一旦真菌感染引起腹泻，由于水和电解质紊乱，病死率高。
近年来微生态学的兴起和微生态疗法的应用为抗生素和化疗引起的腹泻和相关症状的防治提供了新思路。微生态调节剂益生菌是一群通过提高肠道菌群平衡性而对宿主起益生作用的细菌，主要有乳酸杆菌、乳酸链球菌、双岐杆菌等。这些细菌是健康人肠道的正常菌群。乳酸杆菌在肠道菌群中的重要性已在许多不同研究中得到证实。经发现，鼠李糖乳酸杆菌大量口服给于哺乳动物有助于维持和增进该动物的健康。摄入后，鼠李糖乳杆菌会暂时定植在肠黏膜上，并抑制致病菌和轮状病毒等生长，抑制过敏反应，从而减轻腹泻症状。
另外关于鼠李糖乳杆菌的安全性评价已经有许多报道，例如Safetyassessment of potential probiotic lactic acid bacterial strains Lactobacillusrhamnosus HN001，Lb.acidophilus HN017，和Bifidobacterium lactis HN019 inBALB/c mice，International Journal of Microbiology 56：87-96。
但是，目前报道的微生态制剂的稳定性并不能令人满意。因此，目前需要一种能长期保存的微生态制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的鼠李糖乳酸杆菌菌株，它能长期保存且能有效治疗抗生素和化疗药物引起的腹泻和相关症状。
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株被命名为SLR0406，已经于2006年3月17日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC-M206023。
本发明提供了一种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406，其在37℃存活30-60天，且糖发酵特征如下：
阿纤果半葡乳麦甘松密棉鼠核海七拉维糖乳萄糖芽露三二子李糖藻叶伯糖糖糖糖醇糖糖糖糖糖灵糖
- + + + + + ± + + - - + + + +
在本发明的一个优选实例中，所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406是活的菌株或灭活菌株。
本发明还提供了一种药物组合物，它包含本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406、保护剂和药物上可接受的载体。
在本发明的一个优选实例中，所述药物组合物的剂型选自口服液、片剂、胶囊和其它口服固体制剂、以及冻干粉制剂。
在本发明的一个优选实例中，所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量为0.1-99.9重量份，优选为10-80重量份，更优选为20-70重量份、最优选为40-60重量份；所述保护剂的用量为0.1-99.9重量份，优选为20-90重量份，更优选为30-80重量份，最优选为40-60重量份。
在本发明的一个优选实例中，所述保护剂包含脱脂奶粉10～20重量份，海藻酸钠10～20重量份，异乳糖10～20重量份，淀粉6～20重量份，谷氨酸钠0.01～2重量份，维生素C-钠0.01～0.2重量份，优选地，所述保护剂含脱脂奶粉12～18重量份，异乳糖12～18重量份，淀粉10～16重量份，谷氨酸钠0.05～1.5重量份，维生素C-钠0.05～0.15重量份，更优选地，所述含脱脂奶粉14～16重量份，异乳糖14～16重量份，淀粉12～14重量份，谷氨酸钠0.5～1.0重量份，维生素C-钠0.1～0.12重量份。
本发明还提供了一种制备本发明所述的冻干粉制剂的方法，所述方法包括：
(a)配制培养基并消毒；
(b)将步骤(a)所得培养基置于发酵罐中接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206030，并发酵；
(c)发酵所得产物进行离心得到菌泥；
(d)在所得菌泥中加入保护剂，并进行冷冻干燥得冻干粉；
(e)在步骤(d)所得冻干粉中加入赋形剂，过筛得到冻干粉制剂。
本发明还提供了所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023在治疗抗生素和化疗引起的腹泻及其相关病症特别是肠道菌群紊乱、肝病辅助治疗和降低血氨浓度中中的用途。
在本发明的一个优选实例中，所述相关病症包括急性腹泻、慢性腹泻、肠易激综合症和便秘。
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023能长期保存，且能有效地治疗抗生素和化疗药物引起的腹泻和相关症状，特别是肠道菌群紊乱。
具体实施方式
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023是通过如下方法获得的：
(a)将市售多株鼠李糖乳杆菌菌株(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)在37℃、pH为4.0～7.0的条件下有氧发酵12-36小时，后置于三角瓶内，并在0℃-50℃保存；
(b)将三角瓶内的菌株每天涂平板测菌落数，并进行镜检观察，同时进行无菌试验，待菌落数降低至20个菌落以下时将全部菌落挑至庖肉管复苏，进行生理生化鉴定，鉴定结果符合其生理生化特性(即下述的糖发酵指标)后扩增复壮；
(c)将步骤(b)中所得菌株重复进行步骤(a)-(b)，直到得到在37℃存活30-60天的菌株，即鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023。
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023的培养特征和菌体形态如下：
兼性厌氧菌，最适生长温度为37℃～40℃，最适pH值为5.5～7.0，在MRS培养基上培养48小时长出乳白色菌落，菌落圆形隆起光滑，革兰氏染色阳性，无芽孢、无夹膜、无鞭毛，菌体呈两端圆的短杆、球杆状，单个或双排列。
本发明的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406能在37℃存活至少30天，例如30-60天，30-50天，30-40天。
使用API 50CHL试剂盒(购自BioMerieux，Lyon，France)按试剂盒说明书对本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023以及市售鼠李糖乳酸杆菌(购自北京普通微生物中心)进行发酵方式测定，结果如下：
| 阿拉伯糖 | 纤维糖 | 果糖 | 半乳糖 | 葡萄糖 | 乳糖 | 麦芽糖 | 甘露醇 | 松三糖 | 密二糖 | 棉子糖 | 鼠李糖 | 核糖 | 海藻糖 | 七叶灵 | |
| 市售菌株 | - | - | + | + | + | + | (d) | + | + | - | - | + | + | + | + |
| SLR0406CCTCC-M206030 | - | + | + | + | + | + | ± | + | + | - | - | + | + | + | + |
糖发酵实验结果表明驯化前后仅纤维糖发酵结果有差异，因此鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023符合鼠李糖乳杆菌特征。
遗传学鉴定：由北京微生物研究所进行SLR0406的16SrDNA序列分析，所得序列如SEQ ID NO：1所示。结果显示SLR0406 CCTCC-M206023与其它鼠李糖乳杆菌高度同源，相似性超过99％。
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023可以本领域中常规剂型进行给药。例如，上述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023可以制成口服液、片剂、胶囊和其它口服固体制剂、以及冻干粉制剂等。在本发明的一个优选实例中，所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023可以制成冻干粉制剂。
本发明还提供了一种冻干粉制剂，它包含鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023冷冻干燥菌粉和保护剂。
在上述制剂中，所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023的含量是常规的，只要能起到预期效果即可。在本发明的一个优选实例中，所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023的用量为0.1-99.9重量份，优选为10-80重量份，更优选为20-70重量份、最优选为40-60重量份。
在上述制剂中，所述保护剂是本领域中的常规保护剂。在本发明的一个优选实例中，所述保护剂包含脱脂奶粉10～20重量份，海藻酸钠10～20重量份、异乳糖10～20重量份，淀粉6～20重量份，谷氨酸钠0.01～2重量份，维生素C-钠0.01～0.2重量份。在本发明的另一个优选实例中，所述保护剂含脱脂奶粉12～18重量份，异乳糖12～18重量份，淀粉10～16重量份，谷氨酸钠0.05～1.5重量份，维生素C-钠0.05～0.15重量份。在本发明的还有一个优选实例中，所述含脱脂奶粉14～16重量份，异乳糖14～16重量份，淀粉12～14重量份，谷氨酸钠0.5～1.0重量份，维生素C-钠0.1～0.12重量份。
在上述制剂中，所述保护剂的用量是常规的。在本发明的一个优选实例中，所述保护剂的用量为0.1-99.9重量份，优选为20-90重量份，更优选为30-80重量份，最优选为40-60重量份。
在上述冻干粉制剂中，还可包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体在本领域中是常规的，它可以是例如药学可接受的填料、赋形剂、调味剂等。
本发明还提供了上述冻干粉制剂的制备方法，该方法包含下列步骤：
(a)配制培养基并消毒；
(b)将步骤(a)所得培养基置于发酵罐中接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023，并发酵；
(c)发酵所得产物进行离心得到菌泥；
(d)在所得菌泥中加入保护剂，并进行冷冻干燥得冻干粉；
(e)在步骤(d)所得冻干粉中加入赋形剂，过筛得到冻干粉制剂。
在上述方法中，所述培养基在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员在阅读本发明的基础上结合其专业知识可以直接得到哪些培养基可用于本发明的。在本发明的一个优选实例中，所述培养基包括氮源、碳源和特殊成分。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐、牛肉膏、和/或植物胴；所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖和/或麦芽糖；所述特殊成分选自酵母粉、西红柿汁、泡菜汁、半胱氨酸和/或土温80。
在上述方法，所述配制培养基并进行消毒的步骤在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员在阅读本发明的基础上结合其专业知识可以直接得到怎样配制培养基并进行消毒。在本发明的一个优选实例中，所述配制培养基并进行消毒的步骤包括将脱脂奶粉、葡萄糖以及酵母膏充分溶解在水中，并将pH值调节到6.5-7.5，并所得水溶液置于高压锅内于100-200℃灭菌5-60分钟，随后冷却至37～38℃。
在上述方法中，所述接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023并进行发酵的步骤在本领域中是常规的，只不过使用本发明的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023代替其它常规菌株而已，因此本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合其专业知识可以直接得到怎样进行接种和发酵。在本发明的一个优选实例中，所述接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023并进行发酵的步骤包括：将步骤(a)所得产物置于发酵罐内并在无菌条件下接种5-30体积％(以步骤(a)中所得产物的体积计)的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023，然后在37～38℃、罐内压为0.3～0.6公斤/平方厘米的条件下通入无菌空气发酵12小时～24小时。
在上述方法中，所述冷冻干燥得到冻干粉的步骤在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合其专业知识可以直接得知怎样进行冷冻干燥。在本发明的一个优选实例中，所述冷冻干燥得到冻干粉的步骤包括：以所得菌泥的重量计，在菌泥中加入5-30重量％的保护剂，并进行冷冻干燥，得冻干粉。
在上述配制培养基并进行消毒的步骤中，对于脱脂奶粉、葡萄糖以及酵母膏的用量并没有具体的限制，只要形成能形成接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023的培养基即可。在本发明的一个实例中，所述脱脂奶粉的用量为5-15千克，优选为6-10千克，更优选为7-9千克。在本发明的一个实例中，所述葡萄糖的用量为0.5-5千克，优选为1-3千克，更优选为1.2-2千克，最优选为1.3-1.8千克。在本发明的一个实例中，所述酵母膏的用量为0.5-5千克，优选为0.6-3千克，更优选为0.7-2千克，最优选为0.8-1.5千克。
在上述配制培养基并进行消毒的步骤中，所述灭菌温度优选为110-150℃，更优选为120-130℃。
在上述配制培养基并进行消毒的步骤中，所述灭菌时间优选为6-40分钟，更优选为7-20分钟，最优选为8-15分钟。
在上述接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023并进行发酵中，鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206030的用量优选为6-20体积％，更优选为7-15体积％，最优选为8-12体积％。
在上述接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023并进行发酵中，发酵罐内压优选为0.4-0.5公斤/平方厘米。
在上述冷冻干燥得到冻干粉的步骤中，所述保护剂的用量优选为6-20重量％，更优选为7-15重量％，最优选为8-12重量％。
在上述冷冻干燥得到冻干粉的步骤中，所述冷冻干燥优选在-50℃到30℃进行，更优选在-40℃到10℃进行。在上述步骤(e)中，所述赋形剂优选为淀粉或预胶化淀粉。
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023使用简单，例如可通过口服进行给药。
本发明所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023能长期保存，且能有效地治疗抗生素和化疗药物引起的腹泻和相关症状。
下面结合实施例细说明本发明，这些实施例只是用于举例说明的目的，并没有限制本发明的范围。
实施例1：制备鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023
如下制备鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023：
(a)将市售多株鼠李糖乳杆菌菌株(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)在37℃的条件下有氧发酵24小时，后置于三角瓶内，并在37℃保存，发酵起始pH为7.0，结束时pH为3.8～4.2；
(b)将三角瓶内的菌液每天涂平板测菌落数，并进行镜检观察，同时进行无菌试验，待菌落数降低至20个菌落以下时将全部菌落挑至庖肉管复苏，进行生理生化鉴定，鉴定结果符合其生理生化特性(本文所述的糖发酵指标)后扩增复壮；
(c)将步骤(b)中所得菌株重复进行步骤(a)-(b)，直到得到在37℃能存活30-60天的菌株，即鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406 CCTCC-M206023。
实施例2-5
如实施例1相同的方法制备鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023，不同的是步骤(a)的保存温度分别是4℃、25℃、40℃和45℃。
实施例6：制备冻干粉胶囊
在500L发酵罐中分别加入脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖厂)1.5千克，酵母粉(英国OXOID.LTD)1千克，充分溶于350L水中，用40％氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。所得水溶液于121℃在高压锅中灭菌10分钟，得到无菌产物。
在上述无菌产物中按10体积％(以上述无菌产物的体积计)的接种量接种实施例1所得鼠李糖乳杆菌SLR0406 CCTCC-M206023，并在有氧、37℃条件下培养20小时后冷却，离心得菌泥3千克。
在上述菌泥中加入3千克保护剂混匀，在-40℃冷冻干燥，得菌粉2千克。
在上述菌粉中加入预胶化淀粉8千克，过40目筛，直接灌装胶囊。
保护剂配方：脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)2千克，异乳糖2.5千克，谷氨酸钠(广州味精食品厂)0.4千克，维生素C-钠(江苏靖江制药厂)0.05千克，上述组分溶于12千克水中，并于121℃灭菌15分钟。
实施例7：制备冻干粉胶囊
在500L发酵罐中分别加入脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖厂)1.5千克，酵母粉(英国OXOID.LTD)1千克，充分溶于350L水中，用40％氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。所得水溶液于121℃在高压锅中灭菌10分钟，得到无菌产物。
在上述无菌产物中按10体积％(以上述无菌产物的体积计)的接种量接种实施例2所得鼠李糖乳杆菌SLR0406 CCTCC-M206023，并在有氧、37℃条件下培养20小时后冷却，离心得菌泥3千克。
在上述菌泥中加入3千克保护剂混匀，在-40℃冷冻干燥，得菌粉2千克。
在上述菌粉中加入预胶化淀粉8千克，过40目筛，直接灌装胶囊。
保护剂配方：脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)2千克，异乳糖2.5千克，谷氨酸钠(广州味精食品厂)0.4千克，维生素C-钠(江苏靖江制药厂)0.05千克，上述组分溶于12千克水中，并于121℃灭菌15分钟。
实施例8：制备冻干粉胶囊
在500L发酵罐中分别加入脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖厂)1.5千克，酵母粉(英国OXOID.LTD)1千克，充分溶于350L水中，用40％氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。所得水溶液于121℃在高压锅中灭菌10分钟，得到无菌产物。
在上述无菌产物中按10体积％(以上述无菌产物的体积计)的接种量接种实施例3所得鼠李糖乳杆菌SLR0406 CCTCC-M206023，并在有氧、37℃条件下培养20小时后冷却，离心得菌泥3千克。
在上述菌泥中加入3千克保护剂混匀，在-40℃冷冻干燥，得菌粉2千克。
在上述菌粉中加入预胶化淀粉8千克，过40目筛，直接灌装胶囊。
保护剂配方：脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)2千克，异乳糖2.5千克，谷氨酸钠(广州味精食品厂)0.4千克，维生素C-钠(江苏靖江制药厂)0.05千克，上述组分溶于12千克水中，并于121℃灭菌15分钟。
实施例9：制备冻干粉胶囊
在500L发酵罐中分别加入脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖厂)1.5千克，酵母粉(英国OXOID.LTD)1千克，充分溶于350L水中，用40％氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。所得水溶液于121℃在高压锅中灭菌10分钟，得到无菌产物。
在上述无菌产物中按10体积％(以上述无菌产物的体积计)的接种量接种实施例4所得鼠李糖乳杆菌SLR0406 CCTCC-M206023，并在有氧、37℃条件下培养20小时后冷却，离心得菌泥3千克。
在上述菌泥中加入3千克保护剂混匀，在-40℃冷冻干燥，得菌粉2千克。
在上述菌粉中加入预胶化淀粉8千克，过40目筛，直接灌装胶囊。
保护剂配方：脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)2千克，异乳糖2.5千克，谷氨酸钠(广州味精食品厂)0.4千克，维生素C-钠(江苏靖江制药厂)0.05千克，上述组分溶于12千克水中，并于121℃灭菌15分钟。
实施例10：制备冻干粉胶囊
在500L发酵罐中分别加入脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖厂)1.5千克，酵母粉(英国OXOID.LTD)1千克，充分溶于350L水中，用40％氢氧化钠溶液将pH调节到7.0。所得水溶液于121℃在高压锅中灭菌10分钟，得到无菌产物。
在上述无菌产物中按10体积％(以上述无菌产物的体积计)的接种量接种实施例5所得鼠李糖乳杆菌SLR0406 CCTCC-M206023，并在有氧、37℃条件下培养20小时后冷却，离心得菌泥3千克。
在上述菌泥中加入3千克保护剂混匀，在-40℃冷冻干燥，得菌粉2千克。
在上述菌粉中加入预胶化淀粉8千克，过40目筛，直接装胶囊。
保护剂配方：脱脂奶粉(新西兰进口脱脂奶粉)2千克，异乳糖2.5千克，谷氨酸钠(广州味精食品厂)0.4千克，维生素C-钠(江苏靖江制药厂)0.05千克，上述组分溶于12千克水中，并于121℃灭菌15分钟。
实施例11-15：制备活菌片剂
如实施例6-10得到2千克菌粉，并在其中分别加入β-环糊精0.5千克，粉碎得到粉末。在所得粉末加入8千克预胶化淀粉和1千克乳糖，充分混合后过24目筛，并用压片机(上海远东制药机械厂)压片得到片剂。
实施例16：急性毒性实验
选择Wistar大鼠和beagle犬作为研究对象，研究实施例11-15中所得活菌片剂的毒性。挑选Wistar大鼠60只(雌雄各半)，beagle犬10只(雌雄各半)。将Wistar大鼠10只(雌雄各半)加beagle犬2只(雌雄各半)分成1组(实验组1-5)，将单独Wistar大鼠10只(雌雄各半)分成一组(对照组)
将实施例11-15制得的500mg片剂分散在12.5ml无菌生理盐水稀释成悬浮液，以2克片剂/千克体重的标准分别一次性服实验组1-5。观察动物出现的反应，连续观察14天。实验组和对照组动物的一般指标(动物外观、行为、排泄物等)均正常，体重无明显差异，未发生中毒现象和死亡现象。
实施例17：急性毒性实验
选择昆明小白鼠60只，将其分成10只一组(实验组1-5以及对照组)。
将实施例11-15所得的500mg片剂分散在12.5ml无菌生理盐水稀释成悬浮液，将所得悬浮液腹腔注射到实验组1-5的动物中，每只0.5毫升。对照组腹腔注射生理盐水0.5毫升。观察动物出现的反应，连续观察14天。实验组和对照组动物的一般指标(动物外观、行为、排泄物等)均正常，体重无明显差异，未发生中毒现象和死亡现象。
实施例18：长期毒性实验
如实施例17进行实验，不同的是连续给药时间为3个月，给药期间动物自由摄食、饮水。给药期间观察动物。根据观察，给药组和对照组行为正常，体重增长正常且无明显差异，各项生化和病理指标均未出现异常改变。
实施例16-18的结果表明由本发明所述鼠李糖乳杆菌SLR0406CCTCC-M206023制成的制剂对Wistar大鼠、昆明小白鼠和beagle犬无急性毒性和蓄积毒性，可以安全服用。
实施例19
选择雌性SPF级的BALB/c小鼠(18g±2g)30只，并将其分成2组，模型组为20只，对照组为10只。用抗生素氨苄西林钠作为造模药物，采用饮水+胃的方式对模型组进行造模。氨苄西林钠胃剂量300毫克/天。氨苄西林钠处理时间为3天，观察粪便变化并记录。
以出现稀便(滤纸上有无污迹为标准)判定有无腹泻。
①腹泻率＝组中排稀便的动物数/该组动物总数
②腹泻指数＝稀便率*稀便级，其中稀便率＝每只动物的稀便数/总便数；稀便级表示稀便的程度，以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小定级。分为4级，标准如下：
级数 1 2 3 4
污迹直径(cm) ＜1 1-1.9 2-3 ＞3
氨苄西林钠300mg/天对模型组进行给药，导致小鼠出现水样便，均腹泻，即腹泻率为100％，腹泻指数为0.93±0.12，而对照组正常进食，所得2项指标均为0。
对照组与模型组小鼠肠道菌群均值比较(log值)
将用抗生素氨苄西林钠如上述处理过的60只小鼠平均分成6组(实验组1-5和对照组)。将实施例11-15所得片剂以每天108CFU的剂量分别口服胃给实验组1-5，自然恢复组服无活菌的对照品生理盐水。连续服7天，第八天处死小鼠，并在无菌条件下进行解剖，各小鼠的肠道取样物培养后进行活菌计数。
各组实验小鼠处理1周后肠道菌群定量分析结果(log值)
注：实验组的数值取平均值
结果显示连续服抗生素后引起小鼠腹泻，此后连续服本发明的产品，和自然恢复组相比试验组腹泻症状明显改善，肠道益生菌数量迅速恢复到正常水平。
实施例20：储存稳定性
将实施例1-5中所得鼠李糖乳杆菌(即SLR0406 CCTCC-M206023)和原始菌株(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)发酵液于37℃条件下储存，比较其稳定性。由下表可以看出在相同保存条件下驯化菌株的活菌数比原始菌株高一个数量级，因此经驯化的菌株更为稳定。
注：SLR0406 CCTCC-M206023的实验结果取平均值
实施例21
将实施例1中所得鼠李糖乳杆菌(即SLR0406 CCTCC-M206023)，发酵液于37℃条件下储存，分别与第5天、第10天、第30天和第40天测量活菌数，结果如下：
| 储存天数(d) | 0 | 5 | 10 | 30 | 40 |
| 活菌数 | 2.90×108 | 2.13×108 | 1.16×108 | 8.54×104 | 4.03×102 |
由上表可知，本发明所得鼠李糖乳杆菌在37℃至少能够稳定地保存30天。而且，将实施例1中所得鼠李糖乳杆菌保存到第60天，其存活的活菌数也能达到约100。
序列表
Claims (14)
1.一种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406，其能在37℃存活30-60天，且糖发酵特征如下：
阿 纤 果 半 葡 乳 麦 甘 松 密 棉 鼠 核 海 七
拉 维 糖 乳 萄 糖 芽 露 三 二 子 李 糖 藻 叶
伯 糖 糖 糖 糖 醇 糖 糖 糖 糖 糖 灵
糖
- + + + + + ± + + - - + + + +
其中，所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406的保藏号为CCTCC-M206023。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406，其特征在于它是活的菌株或灭活菌株。
3.一种用于治疗抗生素引起的腹泻的药物组合物，它包含权利要求1所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406、保护剂和药物上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型选自口服液以及冻干粉制剂。
5.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊和其它口服固体制剂。
6.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量为0.1-99.9重量份；所述保护剂的用量为0.1-99.9重量份。
7.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量为10-80重量份；所述保护剂的用量为20-90重量份。
8.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量为20-70重量份；所述保护剂的用量为30-80重量份。
9.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量为40-60重量份；所述保护剂的用量为40-60重量份。
10.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述保护剂包含脱脂奶粉10～20重量份，海藻酸钠10～20重量份，异乳糖10～20重量份，淀粉6～20重量份，谷氨酸钠0.01～2重量份，维生素C-钠0.01～0.2重量份。
11.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述保护剂含脱脂奶粉12～18重量份，异乳糖12～18重量份，淀粉10～16重量份，谷氨酸钠0.05～1.5重量份，维生素C-钠0.05～0.15重量份。
12.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述保护剂含脱脂奶粉14～16重量份，异乳糖14～16重量份，淀粉12～14重量份，谷氨酸钠0.5～1.0重量份，维生素C-钠0.1～0.12重量份。
13.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)配制培养基并消毒；
(b)将步骤(a)所得培养基置于发酵罐中接种鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023，并发酵；
(c)发酵所得产物进行离心得到菌泥；
(d)在所得菌泥中加入保护剂，并进行冷冻干燥得冻干粉；
(e)在步骤(d)所得冻干粉中加入赋形剂，过筛得到冻干粉制剂，
所述药物组合物的剂型是冻干粉制剂，
所述药物组合物包含权利要求1所述的鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406、保护剂和药物上可接受的载体。
14.鼠李糖乳酸杆菌菌株SLR0406CCTCC-M206023在制备治疗抗生素引起的腹泻的药物中的用途。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李海军 等.鼠李糖乳杆菌_Lactobacillusrhamnosus_L_乳酸发酵工艺研究.《中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集》.2005,88-90. * |
| 王坚镪 等.益生菌对大鼠肠道菌群紊乱和细菌易位的影响.《上海交通大学学报( 医学版)》.2006,第26卷(第2期),163-165. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101173228A (zh) | 2008-05-07 |
| WO2008052468A1 (fr) | 2008-05-08 |
| WO2008052468A8 (fr) | 2009-07-09 |
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