CN101139387B - 一种重组可溶性人fgfr2胞外段及其生产方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用。本发明在通过大肠杆菌高效表达FGFR2的基础上，对影响其复性效率的各种因素进行了定性定量研究，确定了重组人可溶性人FGF受体胞外段体外变复性的较为合适的方法，使其复性效率达到10％～20％，且成本低、周期短、适合大规模生产。本发明利用游离的FGFRs的胞外段与血液及肿瘤组织中的FGFs结合，降低了游离FGFs的水平，从而竞争性抑制了FGFs的信号，有效抑制了肿瘤的增殖、转移以及血管形成，并以S252W+P253R双突变型FGFR2胞外段的效果最佳。

Description

一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用

技术领域

本发明涉及人FGF受体技术领域，具体地说，涉及一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors FGFs)是一组同源的肝素结合多肽，其家族包含23个成员。FGFs有广泛的生物学活性，例如在胚胎发育中调控细胞增殖、迁移和分化，在成体中诱导创伤修复，肿瘤生长和分化，诱导新血管生成。FGFs对于多种细胞类型来说都是有效的促有丝分裂剂。FGFs的多样的生物学活性是通过细胞表面的高亲和性受体FGFRs来实现的。

FGF以及FGFR都是重要的原癌基因，它们在肿瘤的增殖、血管生成、转移以及凋亡等的生理活动中起着非常重要的作用。因此FGFs及FGFRs已经成为一个新的抗肿瘤研究靶点。

成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors，FGFRs)属于酪氨酸激酶受体家族，它们在特定的时间和空间表达，是FGF信号通路上重要的调控点之一，FGFR正常功能的紊乱可导致人类疾病的发生。例如FGFR的基因突变可导致FGFR对FGFs的亲和力发生改变从而引发骨发育畸形，如软骨发育不全(achondroplasia)，肢端发育畸形如并指症(syndactyly)，颅缝早闭(craniosynostosis)等；另外FGFR的过表达或mRNA的选择性剪切的错误调控可导致细胞转型和癌化。

Apert综合征(AS)表现为颅缝早闭，严重的并指(趾)，常伴有严重的中枢神经系统畸形、智力迟钝等，几乎所有的AS都发现有FGFR2的两种突变：S252W和P253R，这两个位点在高度保守的免疫球蛋白样功能区D2-D3的连接部分，通过对FGF2和FGFR 2突变体两者复合体晶体结构的分析，发现两种突变都引起FGF2/FGFR2亲和力的增加，将两种点突变引入我们构建的FGFR2胞外段，由于增强了对FGFs的亲和力，从而大大加强对肿瘤的生长及血管形成的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低，复性效率高，活性好的重组可溶性人FGFR2胞外段的生产方法。

本发明的另一个目的是提供上述生产方法所得到的重组可溶性人FGFR2胞外段。

本发明的进一步目的是提供上述重组可溶性人FGFR2胞外段在制备抗肿瘤药物中的应用。

Apert Syndrome(AS)颅缝骨早闭综合症由FGFR2的两种突变导致：S252W或P253R。原因在于FGFR2的这两种突变都引起FGFR2与配体的亲和力分别增加3-10倍，我们构建野生型及双突变型的的FGFR2胞外段，在大肠杆菌表达并纯化，因为突变型与FGF-2具有高亲合力，因此细胞培养液中的绝大部分FGF-2将与突变型的FGFR2结合，从而竞争性地抑制了肿瘤细胞膜上FGFR2与配体的结合，能够强烈地抑制FGF的信号，显著抑制肿瘤细胞的增殖、转移以及血管形成。同时，由于FGF对各种肿瘤都有作用，因此突变型FGFR胞外段可广谱抑制如乳腺癌、前列腺癌、肺小细胞癌等各种肿瘤。

本发明的重组可溶性人FGFR2胞外段的生产方法，包括如下步骤：

(1)目的基因FGFR2的全基因合成；

根据截短型FGF受体野生型胞外段氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则设计四对引物，四对引物序列分别如序列表NO：1～NO：4所示，由内而外分别进行四轮重叠延伸扩增，首先是F1、R1互为模版扩增，然后以第一轮产物作为模版，F1、R1作为引物进行下一轮的扩增，如此进行4轮扩增；

(2)FGFR2双突变型的构建；

针对S252W和P253R双突变的引物称为M252+253_F和M252+253_R，序列如序列表NO：5所示；

(3)双酶切FGFR2基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建FGFR2基因工程菌；

(4)培养FGFR2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；

(5)纯化包涵体；

(6)复性；

(7)超滤、冻干得到重组可溶性人FGFR2胞外段。

在上述的生产方法中，步骤(1)所述扩增的条件是94℃，4min后，94℃，30s，64℃，30s，72℃，60s，32个循环，72℃，10min。

在上述的生产方法中，步骤(3)所述载体为pET3c，双酶切所用的酶为Nde I和BamH I，所述宿主菌为大肠杆菌。

在上述的生产方法中，步骤(4)所述培养FGFR2基因工程菌的培养基为LB培养基，培养温度为37℃。步骤(4)所述分离、清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎，离心收集沉淀，用溶液1清洗，用溶液2溶解；所述溶液1为10-500mmol/L PB，1-20mmol/L EDTA，1-10％Triton X-100，pH 6-8.5；所述溶液2为20-500mmol/L Tirs-HCl，1-20mmol/L EDTA，3-6mol/L Guandine Hydrochloride，1-50mmol/LDTT，pH 6-8.5。

在上述的生产方法中，步骤(5)所述纯化包涵体是采用离子交换或凝胶层析纯化，所需平衡溶液为20-500mmol/L Tirs-HCl，1-20mmol/L EDTA，8mol/L urea，1-50mmol/L DTT，pH 6-8.5；纯化方法为取5g包涵体用5ml溶液2溶解，离心去沉淀后上样，将纯化后产物对水透析，将产生的沉淀离心收获。

在上述的生产方法中，步骤(6)所述复性是采用凝胶层析法、稀释法或透析法复性，复性液为：10-100mmol/LHEPES+0.5-10mmol/LEDTA+10-1000mmol/LNaCl+10-50mmol/L L-Cysteine，pH6-8.5。

在上述的生产方法中，步骤(7)所述超滤是采用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤。

利用上述生产方法得到的可溶性人FGFR2胞外段能用于制备抗肿瘤药物。包括可溶性人FGFR2胞外段的S252W和P253R的单突变型，还包括全长的FGFFR2、S252W和P253R的单突变型和S252W+P253R的双突变型。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

大肠杆菌表达的FGFR2以包涵体形式存在，成熟的有活性的FGFR2结构比较复杂，对其进行体外变复性比较困难，本发明在通过大肠杆菌高效表达FGFR2的基础上，对影响其复性效率的各种因素进行了定性定量研究，确定了重组人可溶性人FGF受体胞外段体外变复性的较为合适的方法，使其复性效率达到10％～20％。可溶性人FGF受体胞外段的生产率先使用凝胶层析复性法复性，其优点是得率高，成本低，周期短，适合大规模生产。

本发明的生产工艺简便，成本低，产量高，活性好，适于大规模生产。本发明利用游离的FGFRs的胞外段与血液及肿瘤组织中的FGFs结合，降低了游离FGF的水平，从而竞争性抑制了FGF的信号，有效抑制了肿瘤的增殖、转移以及血管形成。

附图说明

图1为全基因合成示意图；

图2为重叠延伸PCR法进行点突变示意图；

图3为pET/FGFR2表达质粒的构建图；

图4为质粒pET3C-FGFR2的酶切鉴定电泳图；

图5为诱导前后菌体蛋白电泳结果对比；

图6为MTT法检测rhFGFR2对FGF2促有丝分裂活性的抑制作用；

图7为rhFGFR2胞外段对裸鼠模型人MCF-7乳腺癌的抑制作用；

图8为rhFGFR2胞外段对鸡胚尿囊膜血管抑制试验。

其中，图2中，*表示突变位点。图4中，M：100bp DNA laddermarker；1，4转化子被Nde I和BamH I双酶切后呈阳性，2，3转化子被Nde I和BamH I双酶切后呈阴性。图5中，M：protein marker；；1：未诱导菌体；2：诱导后菌体。

具体实施方式

实施例1

FGFR2胞外段双突变型的构建：

1.FGFR2野生型胞外段的构建：

根据截短型FGF受体野生型胞外段氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则设计四对引物，分别标记为：上游引物F1、F2、F3、F4；下游引物R1、R2、R3、R4，如下所示，并在引物F4与R4的5’端分别引入Nde I和BamH I限制性内切酶位点，以便于基因的定向克隆。每条105～106bp不等，合成全长707bp，除去酶切位点及其保护碱基后阅读框内含684bp的FGFR2IIIC胞外段的截短型，由150aa开始到365aa，相邻的每条引物之间有20bp的重叠区。共分四轮合成，第一轮由最内部的引物F1和R1，进行重叠延伸，得到第一轮产物192Bp，第二轮产物364bp，第三轮产物536，第四轮产物707bp。如图1所示。

F4：5′＞GGAATTC

AAACGTGCGCCGTATTGGACCAATACCGAAAAAATGGAAAAACGTCTGCATGCAGTTCCGGCAGCAAATACCGTGAAATTTCGTTGTCCGGCGGGT＜3′

F3：5′＞AATTTCGTTGTCCGGCGGGTGGTAATCCGATGCCGACCATGCGTTGGCTGAAAAATGGTAAAGAATTTAAACAGGAACATCGTATTGGTGGTTATAAAGTTCGTAA＜3′

F2：5′＞GGTGGTTATAAAGTTCGTAATCAGCATTGGAGCCTGATTATGGAAAGCGTTGTTCCGTCTGATAAAGGTAATTATACCTGTGTGGTGGAAAATGAATATGGTTCTA＜3′

F1：5′＞GGAAAATGAATATGGTTCTATTAATCATACCTATCATCTGGATGTTGTGGAACGTTCGCCTCATCGTCCGATTCTGCAGGCAGGTCTGCCGGCAAATGCGTCTACC＜3′

R1：5′＞TTTTTTTCAACATGTTTAATCCACTGAATATGCGGCTGCGCATCGCTATAAACTTTACAAACAAATTCAACATCACCACCAACAACGGTAGACGCATTTGCCGGCA＜3′

R2：5′＞CTTCAATTTCTTTATCGGTGGTATTAACACCCGCCGCTTTCAGAACTTTCAGATACGGCAGACCATCCGGACCATATTTGCTACCATTTTTTTCAACATGTTTAAT＜3′

R3：5′＞AGAATGAAAAGAAATACCAATAGAATTACCCGCCAGACAGGTATATTCACCCGCATCTTCAAAGGTAACATTACGAATATACAGAACTTCAATTTCTTTATCGGTG＜3′

R4：5′＞CG

CGTCATTATTCCAGATAATCCGGAGACGCGGTAATTTCTTTTTCACGACCAGGTGCCGGCAGAACGGTCAGCCACGCAGAATGAAAAGAAATACCAA＜3′

(1)第一轮PCR反应：

(2)PCR反应体系如下：

LATaq Buffer       10

dNTP               10

LA Taq酶           1.5

F1                 10

R1                 10

ddH2O              58.5

Total              100μl

(3)PCR反应条件如下：

94℃               4min

72℃               10min

将第一轮合成的产物分进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，用ddH₂O稀释100倍后作为下一轮反应的模板。

第二轮PCR反应：

PCR反应体系如下：

LATaq Buffer    10

dNTP            10

LA Taq酶        1.5

第一轮产物      1

F2              10

R2          10

ddH2O       58.5

Total       100μl

PCR反应条件如下：

94℃        4min

72℃        10mm

将第二轮合成的产物分进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，用ddH₂O稀释100倍后作为下一轮反应的模板。

(4)第三、四轮PCR反应：

体系与第二轮一样，程序设定：第三轮退火温度为65℃，延伸时间为60s；第四轮退火温度为64℃，延伸时间为70s。

(5)基因的克隆：

将质粒载体和目的基因片段用Nde I和BamH I双酶切，质粒载体酶切反应体系如下：

10×M buffer    10

Nde I           3

BamH I          3

pET3C           50

H₂O             34

Total          100μl

目的片段酶切反应体系如下：

10×M buffer   10

Nde I          3

BamH I         3

PCR纯化产物    50

H₂O            34

Total          100μl

酶切4小时后，用OMEGA cycle-pure纯化试剂盒纯化酶切产物，分别用40μl ddH₂O溶解回收片段。

用LigationHigh DNA连接酶催化连接反应，反应体系如下：

pET3C/Nde I+BamH I          2

βFGFR2IIIc/Nde I+BamH I    8

LigationHigh                10

Total                       20μl

16℃反应2小时。

连接产物转化到DH5α感受态细胞

重组子鉴定：

挑取阳性转化子克隆到5ml LB试管扩大培养，提取质粒后，用Nde I和BamH I进行双酶切，37℃反应2小时，同时用F4和R4作为引物进行PCR鉴定。1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切和PCR产物。酶切与PCR鉴定结果如图4所示。结果显示，重组成功的质粒酶切反应切出一条长约707bp的片段，与重组目的基因片段的长度吻合；而没有重组成功的菌株没有能酶切分离出目的基因片段条带。

(6)测序：

测序结果证实基因克隆成功。

2.FGFR2双突变体的构建：

根据文献报道，在野生型FGFR2的基础上，用重叠延伸法来进行

定点突变，双突变(S252W和P253R)所设计的引物如下：

M252+253_F：5’TGGAACGTTGGCGTCATCGTCCGA 3’

M252+253_R：5’TCGGACGATGACGCCAACGTTCCA 3’

构建步骤如图2所示：

第一步反应体系如下：

         体系1                         体系2

Pyrobest Buffer    10         Pyrobest Buffer    10

dNTP               10         dNTP               10

Pyrobest酶         0.5        Pyrobest酶         0.5

野生型阳性质粒     0.5        野生型阳性质粒     0.5

F4                 10         包含突变的正向引物 10

包含突变的反向引物 10         R4                 10

ddH2O              59         ddH2O              59

       Total                        100μl         Total

100μl

PCR反应条件如下

94℃             4min

72℃             10min

取部分第一轮反应两个体系产物进行电泳，其余以等体积混合，用ddH2O稀释50倍作为第二轮反应的模板。

第二步反应体系如下：

Pyrobest Buffer    10

dNTP               10

Pyrobes酶          0.5

第一步产物混合物   2

Q4E_F             10

Q4E_R             10

ddH2O             58.5

Total             100μl

PCR反应条件如下

94℃              4min

72℃              10min

将第二轮合成的产物分进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，再进行酶切、连接、转化、鉴定和测序，得到FGFR2的双突变体。

3.培养FGFR2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；

(1)将构建好的双突变重组子转化进入BL21(+)表达菌种中，进行大肠杆菌表达；

(2)双突变重组子的表达：

①取50ml灭菌LB培养基，加入50μl 1000X AMP，接入50μl要表达的FGFR2菌株的菌液，

②37℃，200rpm培养10h，后接入500ml含0.1％AMP的灭菌LB培养基中扩大培养2h，

③加入550μl 1000X IPTG诱导表达5h后收菌。

④诱导表达后，取未诱导及诱导后的菌液进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示。诱导前后菌体蛋白电泳有较大差别，诱导后菌体在24KD处有大量包涵体存在；重组蛋白表达约占菌体总蛋白量50％。

(3)菌体破碎和包涵体清洗

①取诱导培养后的大肠杆菌，4℃离心，6,000rpm×30min；

②去培养基上清，称菌体重量；

③按菌体∶裂解缓冲液＝1∶10(g∶ml)的比例加入裂解缓冲液，振荡重悬，冰浴15min；

④冰浴中超声破碎菌体(900W，工作4s，间歇6s，循环100×3)；

⑤4℃离心，6,000rpm×30min，分别从上清，沉淀取样分析双突变FGFR2表达；

⑥按照包涵体∶包涵体清洗缓冲液＝1∶15(g∶ml)的比例加入包涵体清洗缓冲液，4℃振荡40min，6,000rpm×30min；重复一次；

⑦按照包涵体∶裂解缓冲液＝1∶10(g∶ml)的比例加入裂解缓冲液，振荡重悬，6,000rpm×30min，收集包涵体，-20℃冰箱保存备用。

4.纯化包涵体；

取0.5g(湿重)双突变FGFR2IIIC包涵体沉淀，溶解于5ml包涵体溶解液II，室温下搅拌，溶解样品1h，4℃19000rpm离心50min，取上清，以包涵体溶解液I预先平衡好的凝胶层析柱，上样及平衡速度均为1ml/min，收集目标蛋白峰。

5.复性：

复性方法为：取纯化后样品，对溶液2透析，离心取上清上样已经用复性液平衡的HiLoad 16/60Superdex 75预装柱，流速为0.1-1.0ml/min，用复性液冲洗，分步接收。取目标峰部分。

用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤、冻干得到可溶性人FGF受体2胞外段。

6.MTT法活性测定

将复性后的各种FGFR2与FGF2混合对NIH3T3细胞的增殖进行MTT试验，以不含细胞的空白维持培养基的吸光值为零，绘制相关曲线，确定各组各种FGFR2血清的FGF-2生物学活性。其中，双突变的FGFR2对3T3细胞的增殖抑制最强(图6)。

7.以裸鼠为模型检测FGFR2对乳腺癌的抑制作用

将4-6周雌性BALB裸鼠分为对照组与处理组，每组7只，体重16-20g，饲养于SPF级环境，将密度1×10⁷MCF-7乳腺癌肿瘤细胞悬液接种到裸鼠乳垫，每只鼠接种0.1ml，一周后成瘤。成瘤后每天给药剂量为0.2ug，连续给药14天，停药后第三天处死，解剖，称瘤重，处理组瘤重较对照组低(图7)。双突变的FGFR2对MCF-7肿瘤的增殖抑制最强。

8.鸡胚尿囊膜血管模型

选购受精种蛋，分组，用0.1％的新洁尔灭水溶液消毒，置于37℃恒温箱中孵化培养。取7日龄鸡胚，用砂轮在气室处开启约1cm×1cm的窗口，暴露出鸡胚尿囊膜，用无菌透明胶带封口，继续孵化。在鸡胚发育第8天时，将复合了FGFR样品的滤膜放在鸡胚尿囊膜上，每只蛋加样量为20μg。继续孵育3天，由观察窗加入数滴甲醇∶丙酮＝1∶1的固定液固定15min，剪下鸡胚尿囊膜，将其平铺在平板上，用数码相机拍照，观察滤膜范围内血管数目和长度，分析血管生成情况。见图8。

一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用序列表.txtSEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用

<130>

<160>1

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工引物

<400>1

F1：5’＞GGAAAATGAATATGGTTCTATTAATCATACCTATCATCTGGATGTTGTGGAACGTTCGCCTCATCGTCCGATTCTGCAGGCAGGTCTGCCGGCAAATGCGTCTACC＜3’

R1：5’＞TTTTTTTCAACATGTTTAATCCACTGAATATGCGGCTGCGCATCGCTATAAACTTTACAAACAAATTCAACATCACCACCAACAACGGTAGACGCATTTGCCGGCA＜3’

<210>2

<211>

<212>DNA

<213>人工引物

<400>2

F2：5’＞GGTGGTTATAAAGTTCGTAATCAGCATTGGAGCCTGATTATGGAAAGCGTTGTTCCGTCTGATAAAGGTAATTATACCTGTGTGGTGGAAAATGAATATGGTTCTA＜3’

R2：5’＞CTTCAATTTCTTTATCGGTGGTATTAACACCCGCCGCTTTCAGAACTTTCAGATACGGCAGACCATCCGGACCATATTTGCTACCATTTTTTTCAACATGTTTAAT＜3’

<210>3

<211>

<212>DNA

<213>人工引物

<400>3

F3：5’＞AATTTCGTTGTCCGGCGGGTGGTAATCCGATGCCGACCATGCGTTGGCTGAAAAATGGTAAAGAATTTAAACAGGAACATCGTATTGGTGGTTATAAAGTTCGTAA＜3’R3：5’＞AGAATGAAAAGAAATACCAATAGAATTACCCGCCAGACAGGTATATTCACCCGCATCTTCAAAGGTAACATTACGAATATACAGAACTTCAATTTCTTTATCGGTG＜3’

<210>4

<211>

<212>DNA

<213>人工引物

<400>4

F4：5’＞GGAATTCCATATGAAACGTGCGCCGTATTGGACCAATACCGAAAAAATGGAAAAACGTCTGCATGCAGTTCCGGCAGCAAATACCGTGAAATTTCGTTGTCCGGCGGGT＜3’

R4：5’＞CGGGATCCCGTCATTATTCCAGATAATCCGGAGACGCGGTAATTTCTTTTTCACGACCAGGTGCCGGCAGAACGGTCAGCCACGCAGAATGAAAAGAAATACCAA＜3’

<210>5

<211>

<212>DNA

<213>人工引物

<400>5

M252+253_F：5’TGGAACGTTGGCGTCATCGTCCGA 3’

M252+253_R：5’TCGGACGATGACGCCAACGTTCCA 3’

一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用序列表.txt

Claims (6)

1.制备重组可溶性人FGFR2胞外段的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)目的基因FGFR2IIIc的重叠延伸法全基因合成；

(2)FGFR2IIIc点突变型的构建；

(3)用Nde I和BamH I双酶切FGFR2IIIc基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建FGFR2IIIc基因工程菌；

(4)培养FGFR2IIIc基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；

(5)纯化包涵体；

(6)复性；

(7)超滤、冻干后得到可溶性人FGF受体胞外段；

其中步骤(1)所述目的基因FGFR2IIIc的重叠延伸法全基因合成为根据FGF受体野生型胞外段截短型氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则设计四对分别为序列表NO：1～NO：4所示序列的引物，首先以引物F1、R1互为模板扩增，然后以第一轮扩增的产物作为模板，F2、R2作为引物进行第二轮扩增，以第二轮扩增产物为模板，F3、R3作为引物进行第三轮扩增，以第三轮扩增产物为模板，F4、R4作为引物进行第四轮扩增；

步骤(6)中所述复性为采用凝胶层析法，其中所使用的复性液组成为：10-100mmol/L HEPES+0.5-10mmol/L EDTA+10-1000mmol/L NaCl+10-50mmol/L L-胱氨酸，pH6-8.5。

2.如权利要求1所述的制备重组可溶性人FGFR2胞外段及其突变衍生物的方法，其特征在于步骤(4)中所述清洗、溶解包括用溶液1清洗并用溶液2溶解；所述溶液1的组成为10-500mmol/L PB，1-20mmol/L EDTA，1-10％Triton X-100，pH 6-8.5；所述溶液2的组成为20-500mmol/L Tirs-HCl，1-20mmol/L EDTA，3-6mol/L盐酸胍，1-50mmol/L DTT，pH 6-8.5。

3.如权利要求1所述的制备重组可溶性人FGFR2胞外段及其突变衍生物的方法，其特征在于步骤(5)中所述纯化包涵体是采用离子交换或凝胶层析纯化，所需平衡溶液的组成为20-500mmol/LTirs-HCl，1-20mmol/L EDTA，8mol/L尿素，1-50mmol/L DTT，pH6-8.5。

4.如权利要求1所述的制备重组可溶性人FGFR2胞外段及其突变衍生物的方法，其特征在于步骤(7)中所述超滤为采用分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤。

5.利用权利要求1所述制备重组可溶性人FGFR2胞外段的方法得到的重组可溶性人FGFR2胞外段。

6.权利要求5所述重组可溶性人FGFR2胞外段在制备抗肿瘤药物中的应用。

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