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CN112500472B - 一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN112500472B CN202011408856.4A CN202011408856A CN112500472B CN 112500472 B CN112500472 B CN 112500472B CN 202011408856 A CN202011408856 A CN 202011408856A CN 112500472 B CN112500472 B CN 112500472B
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Abstract

本发明属于干扰素基因工程的技术领域，具体涉及一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用。所述突变体包括成熟肽猫ω干扰素突变体；所述成熟肽猫ω干扰素突变体为将成熟肽猫ω干扰素进行定点突变得到，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；对猫ω干扰素进行氨基酸位点的突变形成具有糖基化位点的突变体，对毕赤酵母密码子优化修饰后的猫ω干扰素及猫ω干扰素突变体进行表达，适度的糖基化修饰提高了猫干扰素突变体的生物活性及延长了半衰期，解决现有表达系统及相关生物技术制备的猫干扰素含量低、生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题。

Description

一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于干扰素基因工程的技术领域，具体涉及一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用。
背景技术
1985年，干扰素ω首次从仙台病毒诱导的Namalwa细胞中克隆得到。1992年，Nakamura首次分离得到猫干扰素基因，在相关研究基础上的重组干扰素药物研制成功并在日本上市，主要用于治疗猫杯状病毒及犬细小病毒病。自IFN-ω被发现以来，因其种属特异性及更高效的抗病毒活性，一直是国内外研究的热点。IFN-ω存在于人类、猫科动物、猪、马、兔子和蝙蝠等动物体中，犬和小鼠体内并未发现。
猫ω干扰素是应用最早的猫干扰素制剂，同时是抗病毒活性最强的猫干扰素。猫ω干扰素具有广谱性抗病毒作用，其与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，从而音质病毒在细胞内的复制，对RNA和DNA病毒都有效，FeIFN-α与FeIFN-ω的同源性为94％，虽然两者之间的同源性很高，但它们之间的抗病毒、抗增殖以及免疫调节的活性存在着巨大差异。有学者还针对FeIFN-α与FeIFN-ω的抗病毒活性进行比较研究，就H9N2亚型禽流感病毒(AIV)和犬瘟热病毒(CDV)两种病毒而言，FeIFN-ω的抗病毒活性比FeIFN-α高160倍和4倍。
猫ω干扰素具有加速和强化疫苗的免疫作用，和疫苗联合使用，可缩短产生抗体的时间，提高机体的抗体水平，其有着出色的抗肿瘤活性，具有可以成为猫乳腺癌首选治疗药物的潜质，但是FeIFN-ω的药代动力学较差，半衰期较短，半衰期小于2h，半衰期较短限制了FeIFN-ω在临床中的应用。
现有技术中猫干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。猫干扰素的外源表达主要在大肠杆菌、毕赤酵母、动物细胞三种表达系统中的表达，在大肠杆菌表达系统缺少将蛋白质有效的释放分泌机制，面临产量小、包涵体表达的问题，存在变复性、去除内毒素及热源等繁琐的蛋白纯化工艺；利用动物细胞表达则存在着工业复杂、成本较高、大规模产业化生产较为困难的情况。
改善IFN-ω的药学性质，研制安全、高稳定性、长效的IFN-ω对IFN-ω的应用具有广阔的应用前景。在长效性修饰的研究中，PEG修饰、血清白蛋白修饰、FC蛋白等技术均有利用来提高干扰素的半衰期，PEG修饰及FC蛋白融合表达技术延长了其半衰期，但是抗病毒活性均低于天然IFN-ω。血清白蛋白修饰融合表达时易出现断裂、酶降解及影响猫干扰素活性等问题，在不同表达系统中融合蛋白的选择是一个技术性难题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用。对FeIFN-ω进行氨基酸位点的突变形成具有糖基化位点的FeIFN-ω-Mut，提高了猫干扰素突变体的生物活性及延长了半衰期，解决现有表达系统及相关生物技术制备的猫干扰素含量低、生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种猫ω干扰素突变体，所述突变体包括成熟肽猫ω干扰素突变体；
所述成熟肽猫ω干扰素突变体(mFeIFN-ω)为将成熟肽猫ω干扰素进行定点突变得到，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；
所述成熟肽猫ω干扰素(mFeIFN-ω)为通过对猫进行诱导刺激之后，采用RT-PCR及PCR的方法得到的蛋白，所述成熟肽猫ω干扰素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；
所述定点突变的氨基酸位点包括成熟肽猫ω干扰素的第22～24位，第69位，第110位，第165、167位，第169～171位以及第181～184位，所述对成熟肽猫ω干扰素的氨基酸位点的突变有助于形成具有糖基化位点的突变体，有助于提高生物学活性、提高稳定性以及缩短干扰素半衰期；
所述第22～24位精氨酸(R)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)分别突变为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN22，其氨基酸序列如序列表SEQID NO.1所示；
所述第69位氨基酸亮氨酸(L)突变为苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN67，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
所述第110位的精氨酸(R)突变为天冬酰胺(N)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN110，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
所述第165、167位氨基酸苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)突变为天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN165，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
所述第169～171位氨基酸丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)突变为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN169，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
所述第181～184位氨基酸引入天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN181，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种猫ω干扰素突变体的制备方法，包括如下步骤：
1)获取成熟肽猫ω干扰素序列：对猫进行诱导刺激之后，采用RT-PCR及PCR的方法得到成熟肽猫ω干扰素(mFeIFN-ω)序列；
2)成熟肽猫ω干扰素重组质粒：将成熟肽猫ω干扰素以及蛋白标签新进行密码子优化，之后合成于质粒载体上，经双酶切后克隆至毕赤酵母表达载体，连接转化得到重组质粒mFeIFN-ω-质粒载体；
3)氨基酸突变：根据mFeIFN-ω序列进行三级结构的分析，避开IFNAR1及IFNAR2受体结合位点，将得到的成熟肽猫ω干扰素进行氨基酸的定点突变，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-mut；
3)突变体重组蛋白构建：以mFeIFN-ω-pPICZαA为模板，设计相应的互补引物，采用环PCR扩增获得产物纯化后进行DpnI酶消化，纯化后的消化产物进行无缝克隆试剂盒处理后转化DH5α，菌液PCR鉴定阳性菌株并提取质粒经测序鉴定，阳性质粒经酶切线性化、导入表达宿主菌得到重组酵母菌，之后经诱导表达、层析纯化得到目的蛋白即猫ω干扰素突变体重组蛋白。
步骤1)所述成熟肽猫ω干扰素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；
所述蛋白标签His-tag融合于突变体的C端，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，所述His-Tag蛋白标签便于目的蛋白的纯化；
所述成熟肽猫ω干扰素、猫ω干扰素突变体与His-tag融合之前先进行毕赤酵母密码子优化，优化之后的核酸序列分别如序列表SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.15所示；
所述成熟肽猫ω干扰素、猫ω干扰素突变体与His-tag融合之后的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.22所示；
步骤3)所述毕赤酵母表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P的一种，毕赤酵母具有原核生物生长快、易操作的特点，同时具有真核细胞表达系统的修饰功能，其表达的蛋白质翻译后加工与修饰方式与高等真核生物类似，毕赤酵母分泌表达系统为高产量表达系统；
步骤3)所述宿主菌包括毕赤酵母宿主菌X33、GS115、KM71以及SMD1168的一种，更有利于二硫键的形成；
步骤4)所述引物的核酸序列如序列表SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.34所示。
本发明还提供了一种猫ω干扰素突变体用于制备抗病毒药物。
本发明的有益效果如下：
本发明的猫ω干扰素突变体，通过对成熟肽猫ω干扰素进行氨基酸位点的突变形成具有糖基化位点的突变体，利用高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达系统，对毕赤酵母密码子优化修饰后的成熟肽猫ω干扰素及其猫ω干扰素突变体进行表达，适度的糖基化修饰提高了猫干扰素突变体的生物活性及延长了半衰期，解决现有表达系统及相关生物技术制备的猫干扰素含量低、生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题。将成熟肽猫ω干扰素及其突变体整合于毕赤酵母染色体上，具有蛋白表达含量高、糖基化适度、二硫键易于形成、表达产物生物学活性好、背景蛋白质少、操作简便及易于工业化生产等优势。
附图说明
图1为成熟肽猫ω干扰素重组蛋白的构建示意图；
图2为mFeIFN-ω-pPICZαA-DH5α的PCR鉴定结果；
图3为mFeIFN-ω-mut突变体的环PCR扩增结果；
图4为mFeIFN-ω-mut突变体转化后的PCR鉴定结果；
图5为mFeIFN-ω和mFeIFN-ω-mut突变体组电转化后的重组酵母菌液的PCR鉴定结果图；
图6为重组酵母诱导表达上清的SDS-PAGE结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
一种猫ω干扰素突变体-重组蛋白的制备：
1.全基因片段的合成及重组质粒的构建
将猫干扰素FeIFN-ω通过干扰素诱生剂聚肌胞(polyI:C)及有丝分裂原植物血凝素(PHA)刺激刺激家猫后，提取猫脾脏组织的RNA利用RT-PCR及PCR的方法获得猫干扰素FeIFN-ω序列，对该序列进行TA克隆，测序后对序列进行信号肽分析，去掉信号肽获得成熟肽mFeIFN-ω序列；
根据mFeIFN-ω的序列以及表达载体pPICZαA图谱，在目的基因的C端引入组氨酸标签及终止密码子TAA，上游引入EcoRI酶切位点，下游引入XbaI；
相关序列进行毕赤酵母密码子优化后全基因合成至pUC57的质粒上得到mFeIFN-ω-pUC57；
将mFeIFN-ω-pUC57经EcoRI、XbaI酶切后获得的目的片段克隆至经相同双酶切的pPICZαA上，并进行T4连接酶连接及转化感受态DH5α得到mFeIFN-ω-pPICZαA-DH5α；
重组质粒的构建示意图如图1所示。
对mFeIFN-ω-pPICZαA-DH5α进行菌液PCR鉴定，挑取PCR鉴定为阳性菌进行质粒抽提并测序鉴定，所述PCR的鉴定体系如表1所示，鉴定程序如表2所示。
表1 PCR鉴定体系
试剂名称 用量(μL)
2×Rapid Taq Master PCR Mix 12.5
α-factor(25μmol/L) 0.5
3’Aox1(25μmol/L) 0.5
菌液 2.0
ddH<sub>2</sub>O 9.5
表2 PCR鉴定程序
Figure BDA0002817256800000081
如图2所示，为PCR鉴定结果为阳性，表明重组质粒构建正确。
2.mFeIFN--Mut的糖基化位点的定点突变
根据mFeIFN-ω序列进行三级结构的分析，避开IFNAR1及IFNAR2受体结合位点，对mFeIFN-ω进行氨基酸的定点突变为具有糖基化位点的mFeIFN-ω-Mut，以mFeIFN-ω-pPICZαA为模板，设计相应的互补引物(引物序列如表3所示)，采用环PCR扩增获得产物纯化后进行DpnI酶消化，纯化后的消化产物进行无缝克隆试剂盒处理后转化DH5α。
所述mFeIFN-ω氨基酸的定点突变的位点包括：
将第22～24位精氨酸(R)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)分别突变为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN22；
将第69位氨基酸亮氨酸(L)突变为苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN67；
将第110位的精氨酸(R)突变为天冬酰胺(N)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN110；
将第165、167位氨基酸苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)突变为天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN165；
将第169～171位氨基酸丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)突变为天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN169；
将第181～184位氨基酸引入天冬酰胺(N)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)，形成具有糖基化位点的mFeIFN-ω-MutN181。
表3环PCR扩增引物
Figure BDA0002817256800000101
环PCR结果如图3所示，各组的环PCR扩增均为阳性，表明各突变体质粒成功扩增。
3.重组阳性转化子的PCR鉴定
鉴定引物分别为α-factor和3’Aox1(广州金唯智生物科技有限公司合成)，PCR鉴定体系及程序通表1、表2所示，PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。
挑取PCR鉴定为阳性菌进行质粒抽提并测序鉴定，鉴定结果如图4所示：各组菌液均为阳性，质粒测序结果显示各组测序正确。
4.重组质粒的酶切线性化及纯化回收
参考TAKARA公司酶切试验手册，用Sac I单酶切各重组质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检测线性化完全；
对线性化产物进行纯化回收，纯化回收方法参考试剂盒使用说明书。
5.毕赤酵母感受态细胞的制备
1)接种酵母受体菌(包括X33、GS115、KM71以及SMD1168，本实施例采用X33)单菌落于YPD平板，30℃培养2天；
2)挑取平板上的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
3)过夜培养后按1％左右的接种量接种到100mLYPD培养基中震荡培养至OD值1.2～1.5；
4)4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
5)4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
6)再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
7)20mL、1mol/L山梨醇洗涤1次；
8)将菌体溶于1mL，1M预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化。
6.线性化表达质粒电转化毕赤酵母感受态细胞
1)准备好80μL的酵母感受态(本实施例采用X33，其它宿主菌的使用方式相同)与线性化的质粒1～5g(冰上预冷15min)混合，迅速放入0.2cm的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌)，电击；电转参数为Voltage：1500V；Capacitance：25μF；Resistance：200Ω；Cuvette(mm)：2mm；
2)电击结束，迅速加入1mL山梨醇(1M)，冰上静置15min，随后30℃温箱中静置培养1h。再加入1mLYPD液体培养基，30℃，200r/min振荡培养1小时，常温4000r/min离心收集菌体，涂至含有100μg/μL的YPDS平板中30℃静置培养3d。
7.重组酵母菌的鉴定及高拷贝的筛选
用灭菌枪头细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，接种于2mL的YPD液体培养基中(含150μg/mLZeocin)，30℃，200r/min振荡培养过夜；
采用菌液PCR分析P.pastoris转化子，PCR鉴定体系同表1，PCR鉴定程序如表4所示：
表4重组酵母菌液PCR鉴定程序
Figure BDA0002817256800000121
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定引物能扩增出目的条带的克隆定为阳性转化子。高拷贝的筛选需结合PCR鉴定中的条带亮度及高抗性YPD平板(200μg/mLZeocin)试验结果。
如图5所示，重组酵母菌液PCR鉴定结果显示：各组鉴定菌株均为阳性重组酵母菌株，表明电转化X33成功。
可选取相应菌株进行YPD(含100μg/mLZeocin)平板划线，用于后续诱导表达。
8.高拷贝重组酵母菌的诱导表达
(1)用灭菌枪头细挑YPD平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于20mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD600＝2～6，此时细胞处于对数生长期；
(2)3000r/min室温离心5min收集沉淀，重悬于1mL的BMMY中，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在250mL的三角锥瓶中振荡培养；
(3)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养；
(4)培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE或置于-80℃保存。
9.重组酵母菌诱导表达上清的SDS-PAGE
重组酵母菌诱导表达4d的上清进行SDS-PAGE蛋白电泳，设置相应的空质粒pPICZαA-X33对照组，同时与mFeIFN-ω组进行比较，观察该表达系统对目的蛋白糖基化修饰的情况。
蛋白上样缓冲液为5×Loading Buffer，上样量为12L；
如图6所示，除了N67组无明显条带外，mFeIFN-ω及相应的糖基化位点修饰突变体mFeIFN-ω-MutN22、mFeIFN-ω-MutN110、mFeIFN-ω-MutN165、mFeIFN-ω-MutN169、mFeIFN-ω-MutN181均在酵母表达系统中高效表达，由于mFeIFN-ω无糖基化位点，条带大小与预期的21kDa相符。去糖基化处理组比较可知，未去糖基化处理组蛋白略大于去糖基化处理组，表明该酵母表达系统对mFeIFN-ω-MutN22、mFeIFN-ω-MutN110、mFeIFN-ω-MutN165、mFeIFN-ω-MutN169、mFeIFN-ω-MutN181进行了适度的糖基化修饰。mFeIFN-ω-MutN67组无明显条带，表达量较低，纯化后可观察到条带，结果未给出。
10.表达产物的纯化回收纯化回收，
为研究毕赤酵母糖基化修饰对猫ω干扰素活性的影响，设置去糖基化处理组(终浓度1％去糖基化试剂，37℃孵育3h)及未去糖基化处理组，对两组表达上清的纯化结合HisTag进行镍柱亲和层析方法进行蛋白的吸附、洗脱纯化，利用透析法进行咪唑的去除后测定浓度。各组样品纯化后浓度见下表5，将各组样品进行冻干保存备用。
表5纯化后样品浓度
Figure BDA0002817256800000141
Figure BDA0002817256800000151
重组蛋白的生物学活性以及半衰期的检测：
1.生物学活性的测定-微量病变抑制法
采用CRFK-VSV微量病变抑制法检测目的蛋白的活性，将消化后的CRFK细胞铺96孔细胞培养板，待细胞完全贴壁后每孔加入100μL 4倍比稀释的纯化后的猫ω干扰(去糖基化处理组和未去糖基化处理组)，37℃孵育24h后每孔用100TCID50VSV攻毒，同时设置正常细胞对照组和只加病毒的病毒对照组；
48h后观察细胞病变的抑制结果，以抑制50％细胞病变CPE50的最高干扰素稀释度为1个活性单位。
表6纯化样品的活性
组别 去糖基化处理组 未去糖基化处理组
mFeIFN-ω组 - 1.21×10<sup>7</sup>U/mg
mFeIFN-ω-MutN22组 1.24×10<sup>7</sup>U/mg 2.35×10<sup>7</sup>U/mg
mFeIFN-ω-MutN67组 1.18×10<sup>7</sup>U/mg 1.54×10<sup>7</sup>U/mg
mFeIFN-ω-MutN110组 1.26×10<sup>7</sup>U/mg 2.78×10<sup>7</sup>U/mg
mFeIFN-ω-MutN165组 1.22×10<sup>7</sup>U/mg 3.74×10<sup>7</sup>U/mg
mFeIFN-ω-MutN169组 1.19×10<sup>7</sup>U/mg 4.07×10<sup>7</sup>U/mg
mFeIFN-ω-MutN181组 1.25×10<sup>7</sup>U/mg 3.98×10<sup>7</sup>U/mg
由表6可见，去糖基化处理组及未去糖基化处理组中的mFeIFN-ω-MutN22、mFeIFN-ω-MutN110、mFeIFN-ω-MutN165、mFeIFN-ω-MutN169、mFeIFN-ω-MutN181均有较高的活性，未去糖基化处理组的活性高于去糖基化处理组，表明适度的糖基化能够有效提高猫ω干扰素的活性。mFeIFN-ω组与突变体的活性比较可知，各组活性mFeIFN-ω-MutN169＞mFeIFN-ω-MutN181＞mFeIFN-ω-MutN165＞mFeIFN-ω-MutN110＞mFeIFN-ω-MutN22＞mFeIFN-ω-MutN67＞mFeIFN-ω，尤其是mFeIFN-ω-MutN169的活性较天然mFeIFN-ω提高了3.36倍，表明适当的氨基酸位点的突变有利于猫ω干扰素活性的提升。
2.猫ω干扰素半衰期的测定
选择mFeIFN-ω-Mut的去糖基化处理组和未去糖基化处理组来进行猫ω干扰素半衰期的测定，测定方法采用细胞病变抑制法测定猫ω干扰素的血药浓度与时间的关系。
取6只体重接近4kg的成年家猫，雌雄各半。
按1mg/mL/只剂量颈部皮下注射冻干的mFeIFN-ω及mFeIFN-ω-Mut。分别在注射后1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h静脉采血。血样4℃低温凝固后，3000r/min低温离心5min，获取上层血清。采用细胞病变抑制法测定不同时间点血清中猫ω干扰素的浓度，利用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算相关参数。
表7纯化样品的活性
Figure BDA0002817256800000161
Figure BDA0002817256800000171
经测定各组的mFeIFN-ω-Mut的去糖基化处理组的半衰期为1.4h左右，与天然mFeIFN-ω组的半衰期相当，mFeIFN-ω-MutN22、mFeIFN-ω-MutN110、mFeIFN-ω-MutN165、mFeIFN-ω-MutN169、mFeIFN-ω-MutN181的未去糖基化处理组半衰期较去糖基化处理组均有明显的提升，mFeIFN-ω-MutN169组的半衰期较mFeIFN-ω组提高了2.8倍。
利用酵母表达系统中对成熟肽猫ω干扰素糖基化修饰突变体能够显著延长半衰期，简化了猫ω干扰素的长效性修饰工艺，具有广阔的应用前景。
序列表
<110> 广州源博医药科技有限公司
<120> 一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Pro Val Leu Arg Glu Leu Leu Gln Gln
50 55 60
Thr Phe Asn Leu Leu His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Ser Pro
65 70 75 80
Ala Pro Leu His Gly Leu Arg Ser Gly Leu His Arg Gln Leu Glu Ala
85 90 95
Leu Asp Ala Cys Leu Leu Gln Ala Thr Arg Glu Gly Glu Arg Ala Thr
100 105 110
Gly Glu Gly Glu Arg Ala Pro Gly Met His Gly Pro Val Leu Ala Ile
115 120 125
Lys Arg Tyr Phe Gln Asp Ile Arg Val Tyr Leu Glu Asp Glu Gly Tyr
130 135 140
Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ala Leu
145 150 155 160
Phe Ser Ser Ala Asn Leu Thr Asp Ser Phe Ala Ile Lys Asp Gly Asp
165 170 175
Leu Ala Ser Ser His His His His His His
180 185
<210> 21
<211> 186
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 21
Cys Ala Leu Pro Gly Ser Asp Ala Gln Val Ser Arg Asp Asn Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Phe Leu Cys Leu Arg Ala
20 25 30
Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Arg Glu Met Leu Glu Arg Gly Gln Leu
35 40 45
Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Pro Val Leu Arg Glu Leu Leu Gln Gln
50 55 60
Thr Phe Asn Leu Leu His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Ser Pro
65 70 75 80
Ala Pro Leu His Gly Leu Arg Ser Gly Leu His Arg Gln Leu Glu Ala
85 90 95
Leu Asp Ala Cys Leu Leu Gln Ala Thr Arg Glu Gly Glu Arg Ala Thr
100 105 110
Gly Glu Gly Glu Arg Ala Pro Gly Met His Gly Pro Val Leu Ala Ile
115 120 125
Lys Arg Tyr Phe Gln Asp Ile Arg Val Tyr Leu Glu Asp Glu Gly Tyr
130 135 140
Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ala Leu
145 150 155 160
Phe Ser Ser Ala Thr Leu Gln Asp Asn Leu Thr Ile Lys Asp Gly Asp
165 170 175
Leu Ala Ser Ser His His His His His His
180 185
<210> 22
<211> 190
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 22
Cys Ala Leu Pro Gly Ser Asp Ala Gln Val Ser Arg Asp Asn Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Phe Leu Cys Leu Arg Ala
20 25 30
Arg Lys Asp Phe Arg Phe Pro Arg Glu Met Leu Glu Arg Gly Gln Leu
35 40 45
Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Pro Val Leu Arg Glu Leu Leu Gln Gln
50 55 60
Thr Phe Asn Leu Leu His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Ser Pro
65 70 75 80
Ala Pro Leu His Gly Leu Arg Ser Gly Leu His Arg Gln Leu Glu Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Glu Gly Glu Arg Ala Pro Gly Met His Gly Pro Val Leu Ala Ile
115 120 125
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130 135 140
Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ala Leu
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Ala Ser Ser Asn Leu Thr Ser His His His His His His
180 185 190
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
atgaatttga cttctccatt tttgtgtttg agagctag 38
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
atggagaagt caaattcatt tgtcccaaca aaaccaaatt atc 43
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
acttttaatt tgactcatac tgaaagatct tctgctgctt g 41
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gtatgagtca aattaaaagt ttgttgcaac aattctctc 39
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gcgaaaatgc gacgggagaa ggtgaaaggg c 31
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
tctcccgtcg cattttcgcc ttccctagta gcttgcaac 39
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ctgctaattt gactgattct tttgctatta aagatggaga t 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaatcagtca aattagcaga agaaaacaaa gctctcataa t 41
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aagataattt gactattaaa gatggagatt tggcttcttc 40
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ctttaatagt caaattatct tgcaaagtag cagaagaaaa c 41
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tctaatttga ctagtcatca tcatcatcat cattaatcta gaac 44
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
atgatgacta gtcaaattag aagaagccaa atctccatct tt 42

Claims (9)

1.一种猫ω干扰素突变体，其特征在于，所述突变体为将成熟肽猫ω干扰素进行定点突变得到，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6所示。
2.由权利要求1所述的猫ω干扰素突变体，其特征在于，所述定点突变的氨基酸位点为成熟肽猫ω干扰素的第22~24位，第69位，第110位，第165、167位或者第169~171位，或者第181~184位引入新的氨基酸。
3.由权利要求2所述的猫ω干扰素突变体，其特征在于，所述第22~24位的精氨酸、精氨酸、亮氨酸分别突变为天冬酰胺、亮氨酸、苏氨酸；
所述第69位的亮氨酸突变为苏氨酸；
所述第110位的精氨酸突变为天冬酰胺；
所述第165、167位的苏氨酸、谷氨酰胺突变为天冬酰胺、苏氨酸；
所述第169~171位的丝氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸突变为天冬酰胺、亮氨酸、苏氨酸；
所述第181~184位为引入天冬酰胺、亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸。
4.一种权利要求1所述的猫ω干扰素突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）成熟肽猫ω干扰素重组质粒：将成熟肽猫ω干扰素以及蛋白标签新进行密码子优化，之后合成于质粒载体上，经双酶切后克隆至毕赤酵母表达载体，连接转化得到重组质粒mFeIFN-ω-质粒载体；
所述成熟肽猫ω干扰素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；
2）氨基酸突变：将得到的成熟肽猫ω干扰素进行氨基酸的定点突变，形成具有糖基化位点的成熟肽猫ω干扰素突变体mFeIFN-ω-mut；
3）突变体表达：以mFeIFN-ω-质粒载体为模板，设计相应的互补引物，采用环PCR扩增获得产物纯化后进行DpnI酶消化，纯化后的消化产物进行无缝克隆试剂盒处理后转化DH5α，菌液PCR鉴定阳性菌株并提取质粒经测序鉴定，阳性质粒经酶切线性化、导入表达宿主菌得到重组酵母菌，之后经诱导表达、层析纯化得到目的蛋白即猫ω干扰素突变体重组蛋白。
5.由权利要求4所述的猫ω干扰素突变体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述成熟肽猫ω干扰素的核酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示。
6.由权利要求4所述的猫ω干扰素突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2）所述毕赤酵母表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P的一种。
7.由权利要求4所述的猫ω干扰素突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2）所述宿主菌包括毕赤酵母宿主菌X33、GS115、KM71以及SMD1168的一种。
8.由权利要求4所述的猫ω干扰素突变体重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3）所述引物的核酸序列如序列表SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.34所示。
9.一种权利要求1所述的猫ω干扰素突变体用于制备抗病毒药物。
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