CN103261409B - 甘露聚糖酶、其编码基因及其生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的甘露聚糖酶及其编码基因、含有该基因的重组载体和宿主细胞，以及利用重组载体在大肠杆菌中表达该甘露聚糖酶的方法和利用重组载体在酵母细胞中生产该甘露聚糖酶的方法。本发明还涉及一种新发现的野生型巨大芽孢杆菌菌株FB101。

Description

甘露聚糖酶、其编码基因及其生产

技术领域

本发明涉及一种新的甘露聚糖酶及其编码基因、含有该基因的重组载体和宿主细胞，以及利用重组载体在大肠杆菌中表达该酶和利用重组载体在酵母细胞中生产该酶。本发明还涉及一种新发现的野生型巨大芽孢杆菌，具体是巨大芽孢杆菌FB101，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年9月13日，保藏号为CGMCC No.4162。

背景技术

植物半纤维素是继纤维素之后自然界最丰富的多糖类化合物，甘露聚糖及其衍生物是构成半纤维素的第二大组分，广泛存在于植物细胞壁、种子的胚乳、植物胶(角豆胶、槐豆胶、瓜儿胶)中，它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如玉米、小麦、菜籽粕和麸皮等。甘露聚糖作为半纤维素一种组分，主要以葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的形式存在。

我国甘露聚糖资源十分丰富，在许多植物如魔芋、椰子及多种植物胶(槐豆胶、田警胶、瓜儿胶)中都有高含量的甘露聚糖，但人和大部分家畜家禽均不分泌降解甘露聚糖的酶类，因此仅有小部分甘露聚糖作为食品凝胶使用，大部分尚未被有效地开发利用。

β-甘露聚糖酶(又称为β-1,4-甘露聚糖甘露糖水解酶(β-1,4-mannanmannohydrolase))，简称为β-甘露聚糖酶或β-1,4-D-甘露聚糖酶，EC3.2.1.78)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的内切水解酶。

近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。

在食品行业，β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖酶生成甘露低聚糖，具有保肝、抗肿瘤、增强免疫力等生理特性，还可作为甜味剂；在造纸业中，使用β-甘露聚糖酶一方面可以得到比单纯用氯漂白、碱提取更好的纸浆特性，还可减少氯和碱的用量，降低环境污染；在石油开采方面，β-甘露聚糖酶是油井石油压裂液的优质生物破胶剂，具有高效、价廉、适用范围广、对低层伤害小等特点。

甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水后，增加了消化道内容物的黏度，抵抗胃肠蠕动，直接影响动物对营养物质的消化吸收。β-甘露聚糖酶不仅具有一般非淀粉多糖(NSP)酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且具有促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌、促进蛋白质的合成、提高瘦肉率的作用。因此，β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂，可将甘露聚糖降解为易被动物吸收的低聚糖，有助动物对营养物质的消化和吸收，大大提高了饲料的利用率。

β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类，是具有纤维素酶活性的广谱诱导型多功能酶，广泛存在于动植物和微生物中。由于微生物较动植物有易培养、产量高等优势，商业化生产的β-甘露聚糖酶大多都来源于微生物。目前β-甘露聚糖酶的研究主要集中在产酶菌种的筛选以及酶的分离纯化等方面，新的β-甘露聚糖酶的克隆和高活性的β-甘露聚糖酶的分离成为寻找新的β-甘露聚糖酶的热点。

国内外对β-甘露聚糖酶的研究近年来取得了较大的进展，但在我国对β-甘露聚糖酶的研究和应用主要局限于实验室小试阶段。因此，不断提高菌种产酶水平、研究β-甘露聚糖酶合成的调控机理、酶基因的克隆和高表达、进行工业化推广应用等，是今后主要的努力方向。

由于β-甘露聚糖酶应用的不断拓宽，实践中对各种具有特殊性质的β-甘露聚糖酶的要求越来越高，虽然已有报道从多种微生物中获得β-甘露聚糖酶，但在工业应用上仍缺少高质量的酶源，特别是在饲料业中，不仅需要高活力的酶，还需要酶在酸性环境和高温条件下保持酶学特性。因此，研究和开发具有优良特性、更适合实际应用需要的高效β-甘露聚糖酶意义重大。

发明内容

为此，本发明提供了以下技术方案，并获得了良好的技术效果。

本发明提供一种分离的多肽，其具有β-1,4-甘露聚糖酶活性。在另一个实施方式中，该多肽具有β-1,4-甘露聚糖酶活性和如下特性：

a)理论分子量为39kDa；

b)理论pI值为5.29；

c)最适pH为5.0-8.0，优选6.0-7.0，最优选6.5；

d)最适反应温度为35-60℃，优选45-55℃，最优选55℃；

e)比活力>11000U/mg，优选>15000U/mg，最优选为16718.2U/mg；且

f)抗蛋白酶水解性，优选对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抗性。

在另一实施方式中，本发明提供一种多肽，该多肽的氨基酸序列为SEQID NO：2。在另一个实施方式中，本发明提供一种多肽，其包含与SEQ IDNO：2的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明多肽由在严谨条件下与SEQ ID NO.1所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码。在一个实施方式中，本发明多肽由SEQ ID NO.1所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码。在一个实施方式中，本发明多肽包含由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的氨基酸序列序列。在一个优选实施方式中，所述氨基酸序列不包含来源微生物的内源性信号肽序列。在优选实施方式中，所述氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：2位置153的氨基酸残基与SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸残基相同。

在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码本发明所述的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码氨基酸序列为SEQ IDNO：2的多肽。在一个实施方式中，本发明提供一种核酸，其编码包含SEQID NO：2的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的氨基酸序列的核酸。在优选实施方式中，所述氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：2位置153的氨基酸残基与SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸残基相同。在另一优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1。在另一优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其具有核苷酸序列SEQ ID NO：1中1-1008位的核苷酸。在另一优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含与SEQ ID NO：1的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。在优选实施方式中，所述核苷酸序列中对应于SEQ ID NO：1位置458的核苷酸残基与SEQ ID NO：1中相应位置的核苷酸残基相同。在另一优选实施方式中，本发明提供一种核酸，其包含与SEQ ID NO：1中1-1008位的核苷酸序列的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。在优选实施方式中，所述核苷酸序列中对应于SEQ ID NO：1位置458的核苷酸残基与SEQ ID NO：1中相应位置的核苷酸残基相同。在一个优选实施方式中，所述核苷酸序列不包含来源微生物的内源性信号肽序列。

在一个实施方式中，本发明提供一种重组载体，其包含本发明的核酸。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在原核细胞中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在真核细胞中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在大肠杆菌中表达的载体。在一个实施方式中，本发明提供的重组载体可以包含适合在酵母或毕氏酵母中表达的载体。具体说，本发明提供的重组载体可以包含pMD18-T载体或pPIC9载体。

在一个实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的重组载体，所述重组载体可以整合到所述宿主细胞的基因组内。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是原核细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是真核细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是大肠杆菌的细胞。在一个实施方式中，本发明提供的宿主细胞可以是酵母或毕氏酵母的细胞。具体的说，本发明提供的宿主细胞可以是毕氏酵母GS115。

另一方面，本发明还提供一种生产β-甘露聚糖酶的方法，其依次包括以下步骤：

i)培养本发明的宿主细胞，

ii)诱导其表达，

iii)收获表达产物，和

iv)任选地，纯化表达产物。

另一方面，本发明还提供一种野生型巨大芽孢杆菌菌株FB101，其产生包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的β-1,4-甘露聚糖酶，和/或包含含有核苷酸序列SEQ ID NO：1的核酸。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期为2010年9月13日，保藏号为CGMCC No.4162。

另一方面，本发明还提供一种组合物，其含有有效量的本发明多肽以及食品学上或工业上可接受的运载体或赋形剂。优选的，本发明中所述的组合物由一种或多种添加的酶组成，所述酶可选自下组：蛋白酶、纤维素酶、β-木聚糖酶、β-糊精酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、或它们的混合物。更优选的，所述组合物可被用于饲料、食品、脱墨和造纸工业。

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌β-甘露聚糖酶的重组生产株，实现了β-甘露聚糖酶的大规模生产，并获得了优质的β-甘露聚糖酶产品。本发明通过酶学性质检验对酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力等理化性质进行分析，证明本发明的β-1,4-甘露聚糖酶具有很好的pH稳定性、良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。

附图说明

图1来自巨大芽孢杆菌FB101的β-甘露聚糖酶基因BM-Man的核苷酸序列SEQ ID NO：1和氨基酸序列SEQ ID NO：2。

图2BM-Man甘露聚糖酶基因在酵母质粒pPIC9上的重组子结构图。

图3毕赤酵母表达的巨大芽孢杆菌FB101甘露聚糖酶的最适反应pH，及其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WL-7甘露聚糖酶和枯草芽孢杆菌MA139甘露聚糖酶最适反应pH的比较。

图4毕氏酵母表达的巨大芽孢杆菌FB101甘露聚糖酶的最适反应温度，及其与枯草芽孢杆菌WL-7甘露聚糖酶和枯草芽孢杆菌MA139甘露聚糖酶最适反应温度的比较。

图5毕氏酵母表达的巨大芽孢杆菌FB101甘露聚糖酶的pH稳定性，及其与枯草芽孢杆菌WL-7甘露聚糖酶和枯草芽孢杆菌MA139甘露聚糖酶pH稳定性的比较。

图6毕氏酵母表达的巨大芽孢杆菌FB101甘露聚糖酶的热稳定性，及其与枯草芽孢杆菌WL-7甘露聚糖酶和枯草芽孢杆菌MA139甘露聚糖酶热稳定性的比较。

图7毕氏酵母表达BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶的发酵过程中不同时间的酶活力和菌湿重。

图8在毕氏酵母表达BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶的发酵过程中不同时间的发酵样品的SDS-PAGE电泳图。

图9经纯化的本发明β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE电泳图，分子量约为39kDa。

图10毕氏酵母表达的BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

图11本发明重组β-甘露聚糖酶固体制剂的耐热性。

图12本发明重组β-甘露聚糖酶固体制剂的贮存稳定性。

具体实施方式

I.定义

以下所使用的术语贯穿于整个说明书，并且代表本领域技术人员所熟知的含义，除非另有规定。

如本文所要，“包含”表示存在如权利要求中所提及的规定的特征、整体、步骤或成分，但并不排除存在或增加一个或多个特征、整体、步骤、成分或组分。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的β-甘露聚糖酶”是指β-甘露聚糖酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化β-甘露聚糖酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。β-甘露聚糖酶的纯度能用于氨基酸序列分析。

本发明的“β-甘露聚糖酶”又称作“β-1,4-甘露聚糖酶”，可以是重组蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的β-甘露聚糖酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的β-甘露聚糖酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的β-甘露聚糖酶还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本文所用术语“β-甘露聚糖酶活性”是指一种能够随机切断甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)糖链上的β-1,4-D-甘露糖苷键的能力。该酶具有4个底物结合位点，分别为W72、W172、W298和W302；金属离子的结合位点为H1-H23-E336；催化中心由6个结合位点结构环组成，分别为环1(F37-M47)、环2(S103-A134)、环3(F162-N185)、环4(Y215-I236)、环5(P269-Y278)和环6(W298-G309)。

本发明还包括β-甘露聚糖酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明天然β-甘露聚糖酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的β-甘露聚糖酶片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还提供β-甘露聚糖酶及其变异形式。在本发明中，术语“β-甘露聚糖酶”指具有β-甘露聚糖酶活性的多肽或蛋白质，可以是包含或具有SEQID NO：2序列的蛋白。该术语还包括具有与β-甘露聚糖酶相同功能的、SEQID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：在SEQ ID NO.2序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸，以及在其C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸获得的序列。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些变异形式还可包含与SEQ ID NO.2的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的氨基酸序列；优选的是，该变异序列中对应于SEQ ID NO：2位置153的氨基酸残基与SEQ ID NO：2中相应位置的氨基酸残基相同。

该β-甘露聚糖酶的变异形式还包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与β-甘露聚糖酶的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗β-甘露聚糖酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含β-甘露聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白外，本发明还包括了β-甘露聚糖酶的可溶性片段。通常，该片段具有β-甘露聚糖酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供β-甘露聚糖酶的类似物。这些类似物与天然β-甘露聚糖酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。

这种类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的β-甘露聚糖酶并不限于上述列举的代表性蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

本发明也提供了一种包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的分离多肽或蛋白。优选的，所述多肽或蛋白是由SEQ ID NO.1所示的多核苷酸或其简并序列所编码。在本发明中，“β-甘露聚糖酶保守性变异蛋白(多肽)”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个、较佳地至多8个、更佳地至多5个、最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换、缺失和/或插入而获得，并仍然具有β-甘露聚糖酶活性的蛋白。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在β-甘露聚糖酶蛋白中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其甘露聚糖酶活性。此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ IDNO.1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO.2的蛋白质，但与SEQ IDNO.1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.2的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

又在一个实施例中，本发明的具有β-甘露聚糖酶活性的蛋白包括由如在严谨条件下与序列表中的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。如此处所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述典型的相互间至少60%同源的核苷酸序列仍可相互杂交的杂交和清洗条件。优选的，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间有至少65%、更优的至少70%、且甚至更优选的至少80%或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术人员所公知。严谨条件的一个优选，非限制性实例为：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，0℃；或(2)杂交时加有变性剂，50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：2所示的成熟蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码β-甘露聚糖酶的多聚核苷酸。

本发明核酸可具有核苷酸序列SEQ ID NO：1，也可具有核苷酸序列SEQ ID NO：1中1-1008位的核苷酸。本发明核酸可包含与SEQ ID NO：1的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，该核苷酸序列中对应于SEQ ID NO：1位置458的核苷酸残基与SEQ ID NO：1中相应位置的核苷酸残基相同。本发明核酸也可包含与SEQ ID NO：1中1-1008位的核苷酸序列的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，该核苷酸序列中对应于SEQ ID NO：1位置458的核苷酸残基与SEQID NO：1中相应位置的核苷酸残基相同。

本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供，更优选地被纯化至均质。

本发明的β-甘露聚糖酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science1985;230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法，ElizabethScotto–Lavino等，NATURE PROTOCOLS2006，第1卷第6期：2555-2562.和Elizabeth Scotto–Lavino等，NATURE PROTOCOLS2006，第1卷第6期：2742-2745)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

在一个实施方式中，本发明人提取巨大芽孢杆菌FB101的基因组DNA，根据芽孢杆菌(如巨大芽孢杆菌)来源β-甘露聚糖酶的保守序列设计简并引物，通过PCR获取编码β-甘露聚糖酶的全长序列。结果获得如SEQID NO.1所示的核酸序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的重组载体，以及用本发明的重组载体或β-甘露聚糖酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的β-甘露聚糖酶。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码β-甘露聚糖酶的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

又在一个方面，本发明涉及含有所述β-甘露聚糖酶基因的载体、已导入所述载体或所述基因的重组宿主细胞、以及在宿主细胞中表达所述β-甘露聚糖酶的方法。本文所用的术语“重组表达载体”和“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定，这些重组载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件，在本发明中适用的重组载体包括但不限于：酵母质粒。本发明的重组表达载体包含以适于核酸在宿主细胞中表达形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个基于用于表达的宿主细胞而选择的条件序列，其与表达的核酸可操作的连接。在重组表达载体中，“可操作的连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含β-甘露聚糖酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本领域普通技术人员将理解重组表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。

此外，重组表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

在一种实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明β-甘露聚糖酶编码序列经XhoI和NotI双酶切后与XhoI和NotI双酶切的pPIC9载体连接，得到酵母重组表达载体PIC9-BMMan。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的重组载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞，是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达β-甘露聚糖酶蛋白。从而，本发明涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞、优选毕赤酵母。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母，植物细胞，果蝇S2或Sf9的昆虫细胞，CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等，其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的一个实施方式中，选用毕赤酵母GS115构建表达β-甘露聚糖酶的宿主细胞。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。如此处所用，术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的β-甘露聚糖酶。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在一个实施方式中，通过包含本发明β-甘露聚糖酶编码序列的酵母(例毕赤酵母GS115)发酵生产β-甘露聚糖酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明的β-甘露聚糖酶的用途包括(但不限于)：用于水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖或葡甘露聚糖等。本发明的β-甘露聚糖酶具有优异的水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖或葡甘露聚糖等的效果，且具有良好的热稳定性以及pH稳定性，应用前景良好。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的β-甘露聚糖酶以及食品学上或工业上可接受的运载体或赋形剂。这类运载体包括(但并不限于)：缓冲液、水等。其可被制成溶液或粉剂等。所述的“有效量”是指可发挥β-甘露聚糖酶的功能或活性的且可被接受的量。在使用时，本领域能够根据所述β-甘露聚糖酶的酶活性方便地确定所述的有效量。

本发明利用基因工程手段制备了能够表达β-甘露聚糖酶的重组生产株，并获得了优质的β-甘露聚糖酶。本发明通过酶学性质鉴定对酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力等理化性质进行分析，证明本发明的β-甘露聚糖酶具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)(科学出版社，2008)；朱检等，生物化学实验[M](上海科学技术出版社，1995)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，百分比和份数均按重量计算。

I.实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌DH5α及T载体pMD18-T购自诺华基(Novagen)公司(澳大利亚北来得(NORTH RYDE NSW，AUSTRALIA))；

-T轻便载体系统(-T Easy Vector systems)购自普洛麦格(Promega)公司(美国威斯康辛州麦迪逊市WH路2800号(2800WoodsHollow Road,Madison,WI53711USA))；

毕氏酵母GS115及表达载体pPIC9均购自英杰(Invitrogen)公司(美国加州卡尔斯巴德市(Carlsbad，CA，USA))。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA标记物、蛋白质标记物均购自加拿大安大略省伯灵顿市哈灵顿路830号的富酶泰斯公司(MBI)(Fermentas(MBI)，830Harrington Court，Burlington，Ontario，Canada)；

β-甘露聚糖酶活力测定底物刺槐豆胶购自西格玛(Sigma)公司(美国密苏里州圣路易斯市(St.Louis,MO,USA))；

其他常规试剂购自中国上海生物工程有限公司或进口。

3.培养基：

LB培养基、YPD、YPAD培养基均参照英杰公司毕氏酵母操作手册制备。

4.方法

4.1β-甘露聚糖酶活力测定方法

本发明各实施例中所述的酶活、酶活力、酶活性均是指β-甘露聚糖酶活力，可用刺槐豆胶作为底物进行检测。其中，酶活力定量测定采用国际通用的DNS(3,5-二硝基水杨酸)法(参见Miller G.L.,Apal.Chem.,1959,31:426)。

具体说，准确移取0.5ml0.5%(m/v)的β-甘露聚糖底物溶液(用0.5%NaOH溶液溶解刺槐豆胶，加热使其完全溶解后，用冰乙酸调节pH至6.5获得的溶液)至5ml刻度试管中，放入50℃水浴中预热5min。用50mM pH6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将酶液样品做10倍梯度稀释，选择显色效果令人满意的稀释度(吸光度在0.2～0.4之间)。将按照选定稀释度(N)稀释好的酶液放入50℃水浴中预热5min，然后取0.5ml加入到含有底物溶液的试管中，震荡混合均匀后，于50℃下精确保温10min。再加入1.0ml DNS试剂(DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶于800mL蒸馏水中，加热(不超过50℃)，于热溶液中依次加入3,5—二硝基水杨酸6.3g,NaOH20.96g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌(加热)至完全溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，如果溶液不澄清，用沃特曼(Whatman)l号滤纸过滤，室温保存于棕色瓶中，在室温下放置7天后使用。)，震荡混合均匀后，沸水加热10min，然后迅速冷却至室温，以终止反应并显色。用分光光度计于540nm处测定反应液(如出现浑浊，需将反应液4000rpm离心10min，取上清液)的吸光度值A。

空白对照为先将0.5ml同样稀释度的酶溶液(已于50℃水浴中预热5min)加入到5ml刻度试管中，加入1.0ml DNS试剂，震荡混合均匀后，再加入0.5ml底物溶液(已于50℃水浴中预热5min)，50℃下精确保温10min，沸水加热10min，然后迅速冷却至室温，于540nm处测定反应液(如出现浑浊，需将反应液4000rpm离心10min，取上清液)的吸光度值A₀。

如下绘制酶水解产物(甘露糖)的显色标准曲线：将1.6umol/ml的甘露糖标准液用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50mM，pH6.5)稀释成1.60、1.28、0.96、0.64、0.32umol/ml的溶液，按上述样品测定的操作步骤一起反应。以甘露糖浓度(C，umol/ml)为纵坐标，以吸光度值(A)为横坐标，绘制标准曲线，列出线性回归方程(C=KA+b)。

β-甘露聚糖酶活性单位定义：单位量的β-甘露聚糖酶每分钟分解甘露聚糖(刺槐豆胶)产生1μmol甘露糖为1个活力单位(U)。

样品的β-甘露聚糖酶活力U按照下面的公式计算：

$U=\frac{K\×(A-A_0)+b}{t\×V}\×V_0\×N$

式中：

U——样品β-甘露聚糖酶活力，U/mL；

K——标准曲线的斜率；

A——样品溶液的吸光值；

A₀——空白对照的吸光值；

b——标准曲线的截距；

t——反应时间，min；

V——反应体系中酶液的加入量，ml；

V₀——反应体系的总体积，ml；

N——试样稀释倍数；

每次测定均取两个平行试验结果的算术平均值，保留整数。

β-甘露聚糖酶的比活力按下面的公式计算：

Ｕ_ｃ＝Ｕ/ｃ

其中：Ｕ_ｃ——样品β-甘露聚糖酶比活性，U/mg；

Ｕ——样品β-甘露聚糖酶活力，U/ml；

ｃ——样品溶液中的蛋白质含量，mg/ml。

纯化倍数X按照下面的公式计算：

X＝U_C/U_C0

其中：X——纯化倍数；

U_C——纯化后β-甘露聚糖酶样品的比活力，U/mg；

U_C0——纯化前β-甘露聚糖酶样品的比活力，U/mg。

4.2蛋白质和核酸电泳方法

蛋白质电泳与核酸电泳均为常规的实验技术，可参见常用的生物化学参考书，如赵永芳等，《生物化学技术原理及其应用》(第二版)(科学出版社，2008)和分子生物学参考书，如Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，1989)。

如果没有特别说明，本专利中所提及的蛋白质电泳均是指SDS-PAGE，实验参数为：12%分离胶，5%浓缩胶；120V恒压电泳30分钟，然后再150V恒压电泳60分钟；电泳胶用考马斯亮蓝染色。

本专利中所提及的核酸电泳、DNA电泳等均是指琼脂糖凝胶电泳，实验参数为：1%琼脂糖，120V恒压电泳40分钟，采用胶内EB(溴化乙锭)染色。

II.实施例

实施例1β-甘露聚糖酶来源菌的分离

β-甘露聚糖酶来源菌株分离自中国厦门中山公园的土壤样品。

具体的，为了分离β-甘露聚糖酶来源菌株，采集了厦门中山公园的土壤样品，将其悬浮在无菌水中，并稀释，然后，将不同样品的悬浮液接种于无琼脂的LB培养基中，接着分别在15℃、20℃、25℃和30℃下培养1-2天。接着利用DNS法(具体如4.1“β-甘露聚糖酶活力测定方法”中所述)测定不同温度下、在不同样品的培养液和细胞破碎液中的β-甘露聚糖活性。在培养液中可检测到β-甘露聚糖酶活性，说明这些菌株具有分泌型的β-甘露聚糖酶。

首先挑选到具有β-甘露聚糖酶活性的样品，并且判定其适当的培养温度为30℃，将其稀释后涂覆于含有1.5%琼脂的LB平板上，置于培养箱中30℃培养1天。挑选具有各种形态的不同菌落，接种于5ml LB培养基中过夜培养。测定各菌落细胞培养液的β-甘露聚糖酶活性，最后在所选菌落中挑选显示最高β-甘露聚糖酶活性的菌株，该菌株的编号为FB101。

实施例2β-甘露聚糖酶来源菌株FB101的特征分析

通过革兰氏染色法，将实施例1中分离的巨大芽孢杆菌FB101菌株确定为革兰氏阳性菌。此菌是典型的杆菌，在显微镜下具有与巨大芽孢杆菌相似的大小。进一步研究了其部分生理生化特性。

结果表明，该菌株为革兰氏阳性好氧菌，杆状、末端圆、单个或呈短链排列，直径为1.2～1.5×2.0～4.0微米，能运动。芽胞为1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生。其最佳生长温度为30℃，好氧，在光学显微镜下可被观察。对该菌的16s rRNA进行了测定(上海生工)，并通过使用BLAST和多序列比对程序CLUSTAL W比对该菌的16s rRNA序列和在GenBank中的参考序列。结果显示，其16s rRNA的碱基序列与巨大芽孢杆菌B188、CNR9和UFV-E26等之间具有99%的一致性。基于所选菌株的形态、生理生化特性和16s rRNA的研究结果，确定该菌株为巨大芽孢杆菌的一个新的亚种。

根据以上结果和研究过程中使用的记录号，此菌株被命名为“巨大芽孢杆菌FB101”(Bacillus megaterium FB101)，并在2010年9月13日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏号为CGMCC No.4162。

实施例3巨大芽孢杆菌β-1,4-甘露聚糖酶编码基因的克隆和获得

基因组DNA的提取：用营养肉汤培养基(蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.4)在30℃培养实施例1中分离的巨大芽孢杆菌FB101菌株3～4天，至菌体浓度OD_600nm为0.5～0.8。取该培养菌液50ml，10000rpm离心10min，取50mg菌体加500μl无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重新悬浮于500μl1mg/ml的溶菌酶溶液中，于37℃温浴30min后，再补加100μl1mg/ml的溶菌酶液于40-50℃继续保温30min，至菌液透明后，加10%SDS至终浓度2%(m/v)，搅拌约5min至菌液粘度显著下降，15000rpm离心10min去除碎片。上清依次用等体积的酚、酚:氯仿(1:1)、氯仿抽提。取氯仿抽提所得上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。16000rpm离心15min。沉淀用70%(v/v)乙醇清洗，低速离心，将沉淀晾干后用30μl无菌水溶解，备用。

β-甘露聚糖酶编码基因的克隆：综合比对NCBI(National Center forBiotechnology Information)数据库中芽孢杆菌来源β-甘露聚糖酶编码基因的DNA序列，并由此设计简并引物FI：5’-TGAAGCGCATACTGTGKCKCCTGTRAATCCTAATGCC-3’(SEQ ID NO:3)和RI：5’-TCAYTCAACGATTGGCGTTAAAGAATCRCCRYTCC-3’(SEQ ID NO:4)。

以巨大芽孢杆菌FB101菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃保温10min。得到β-甘露聚糖酶的全长基因片段，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并用凝胶回收试剂盒(欧米茄(OMEGA)公司(美国佐治亚州海狸背环路1850-E(1850-E Beaver RidgeCircle,Norcross,GA,USA))的E.Z.N.A.凝胶提取试剂盒)回收1000bp的目的DNA片段。

取4ul回收得到的DNA片段与质粒pMD18-T连接，具体如下：

反应条件：于16℃下连接2hr（水浴或金属浴）。

将连接好的质粒pMD18-T-BM Man转入DH5α中，涂平板(LB-琼脂平板，含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃正置1h后，倒置培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入2ml LB培养基中(含100ug/ml氨苄青霉素，10ml试管)，37℃、200rpm培养4-6h，收集培养液，10000rpm室温离心10min收集菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒(欧米茄公司的E.Z.N.A.质粒小抽试剂盒I)，并用BcaBEST^TM测序引物和M13引物(塔卡拉(TaKaRa)公司(日本大津市(Otsu,Shiga,520-2193,Japan))生产的pMD18-T载体)对克隆后的PCR产物进行DNA序列测定(上海英杰公司)，由此所得到的β-甘露聚糖酶的编码序列共有1011bp。其中第1009-1011位为终止密码子TGA，第1-1008位为β-甘露聚糖酶的编码序列(图1，SEQ ID NO:1)，编码不含信号肽的成熟蛋白质，该成熟蛋白质含有336个氨基酸(图1，SEQ ID NO:2)。

所用的测序方法具体是：采用4种荧光染料分别标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后，反应产物3′端（标记终止物法）或5′端（标记引物法）带有不同的荧光标记。通过电泳将各个荧光标记片段分开，同时激光检测器同步扫描，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD(charge-coupled device)摄影机上同步成像，从而得到荧光吸收峰图或碱基排列顺序。

实施例4酵母重组表达载体的构建

根据实施例3中所得到的不含信号肽的β-甘露聚糖酶成熟蛋白质的编码序列设计引物：

ManF：5’-CCGCTCGAGCCATACTGTGTCGCCTGTGAATC-3’(SEQID NO:5)和

ManR：5’-AAGCGGCCGCTTATCACTCAACGATTGGCGTTAA-3’(SEQ ID NO:6)，其中插入酶切位点XhoI和NotI(划线部分所示)。

以实施例2中酶切回收所得的DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增得到β-甘露聚糖酶的编码基因。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，32个循环；72℃10min。PCR产物用XhoI和NotI进行双酶切后，连接到同样进行双酶切的载体pPIC9上，获得含有β-甘露聚糖酶编码基因的重组质粒pPIC9-BM Man(如图2所示)。

以重组质粒为模板，以原始基因BM-Man的特异性引物(BMF:5’-CTGTTCAGGCCGCTGCATGAAATGAACGGTG-3’(SEQ ID NO:7)和BMR:5’-TCACTCAACGATTGGCGTTAAAGAATCG-3’(SEQ ID NO:8))，和包含插入片段在内的原始质粒的特异性引物(a-因子引物:5-’TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’(SEQ ID NO:9)和3′AOX1引物:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO:10))做PCR扩增。将PCR产物进行琼脂糖电泳(1%琼脂糖，120v恒压，电泳40min)鉴定，用胶回收试剂盒分别回收1000bp和1200bp的DNA片段，然后进行DNA序列测定(上海英杰公司)。两个DNA片段序列中，目的插入DNA的长度均为1011bp，与出发菌株巨大芽孢杆菌原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。

实施例5毕氏酵母发酵生产重组β-甘露聚糖酶

将实施例4制备的重组质粒pPIC9-BMMan经StuI或者BglII酶切，得到线性化质粒pPIC9-BMMan1。

取构建好的线性重组质粒DNA50ug，直接加入到仍在零度以下的感受态细胞中(毕氏酵母GS115)；加入1.0ml含5ug/ml的鲑鱼精DNA(西格玛公司)的溶液II(40%(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5ul1mg/ml的鲑鱼精DNA并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1h以上，每隔15min轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0ml的溶液III(0.15MNaCl，10mM N,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g离心5min，移去800ul上清，用剩余的200ul上清重新悬浮菌体；将200ul菌液涂YPD平板(YP(5%(w/v)酵母粉和10%(w/v)蛋白胨)和20%(w/v)D(葡萄糖)单独灭菌，倒平板之前按1:9向YP中加入20%D；筛选抗性为80ug/ml氨苄青霉素)，30℃倒置培养3-4天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组质粒pPIC9-BMMan1转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150ml YPD培养液中，30℃250rpm振荡培养至OD600nm＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，40g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1(30mM硫酸铜、0.54mM碘化钠、17.6mM硫酸锰、0.80mM钼酸钠、0.32mM硼酸、2.4mM氯化钴、0.18mM氯化锌、0.24mM硫酸亚铁、1.6mM生物素、0.19M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25ml/hr的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到该阶段的末期，菌湿重可达到160g/L。

在诱导阶段，以10-15ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量搅拌转速，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔8-16hr取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定β-甘露聚糖酶活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图7和图8所示。发酵达139hr时，菌湿重可达到340g/L，β-甘露聚糖酶的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到21458U/ml，这说明巨大芽孢杆菌来源的β-甘露聚糖酶基因均在毕氏酵母中得到了表达和积累。

实施例6重组β-甘露聚糖酶的纯化

将实施例5所制备的发酵培养液10000rpm离心10min以去除菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至80％，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液(磷酸氢二钠-柠檬酸，pH6.5，50mM)重新溶解。

将以上溶解后的沉淀进行透析，以除去残余的硫酸铵，具体条件为：选用截留分子量为12-14kDa的透析袋(袋宽5cm)，透析外液为磷酸氢二钠-柠檬酸(pH6.5，10mM)缓冲液，透析外液与透析内液(即以上所得到的溶解后的沉淀样品)的体积比大于15，于4℃透析24hr，过程中每8hr更换一次透析外液。结束后，收集透析内液，冷冻干燥后，贮藏于-80℃下待用。

取适量以上所制备的冻干样品，用PBS(pH7.0，20mM)缓冲液溶解后(浓度为5-10mg/ml)，取1-2ml上Sephacryl^TM S200常压凝胶过滤柱(Φ1.6×200cm)(瑞典乌普萨拉SE-75184的GE健康护理公司(GE Healthcare,SE-75184Uppsala,Sweden))，先用pH7.020mM PBS缓冲液洗脱平衡柱子，然后上样，用pH7.020mM PBS缓冲液洗脱1.5个柱体积，流速为1.0ml/min，用部分收集器收集，每管6ml，然后对收集的样品测定β-甘露聚糖酶活力及进行蛋白质电泳分析。

收集凝胶过滤分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH6.550mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解(浓度为5-10mg/ml)，上Mono Q^TM5/50GL高效阴离子交换柱(瑞典乌普萨拉SE-75184的GE健康护理公司)。先用pH8.0，0.05mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后取150ul溶解的样品上样，再用相同缓冲液配置的0-1.0mol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，按峰收集，然后对收集的样品测定甘露聚糖酶活力并进行蛋白质电泳分析。

纯化完成后，BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶比活性从粗酶液的3427.8U/mg提高到纯酶的16718.2U/mg，纯化倍数为4.88。结果(图9)表明，BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶纯化后在SDS-PAGE凝胶中仅显示单一的条带，分子量约为39kDa。

实施例7重组β-甘露聚糖酶的酶学性质分析

将实施例6所制备的β-甘露聚糖酶纯酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液的pH范围为3.0-10.0(pH3.0-8.0范围内采用50mM Na₂HPO₄-C₆H₈O₇缓冲液，pH8.0-10.0采用50mM Gly-NaOH缓冲液)。用β-甘露聚糖酶在不同的pH的缓冲液中、50℃下测定pH适性结果，结果表明BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶的最适pH为5.0-8.0(见图3)。将β-甘露聚糖酶溶液在不同pH值的缓冲液中于室温下处理60min，再测定残余酶活性以研究β-甘露聚糖酶的pH稳定性。结果表明，在pH3.0-4.0范围内处理60min，BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶有70%以上的残余酶活力；在pH4.5-10.0的范围内处理60min，BM-Manβ-甘露聚糖酶能保持90%以上的残余酶活力(见图5)。这说明BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶有很广泛的pH适用范围和很好的pH稳定性。

在磷酸氢二钠-柠檬酸(pH6.5，50mM)缓冲体系及不同温度下(20℃-80℃)进行酶促反应，以测定最适反应温度。结果表明，BM-Manβ-甘露聚糖酶的最适反应温度为45-55℃(图4)。

在不同温度下处理酶60min后测定酶活性，以进行热稳定性研究。结果表明，在20℃-55℃范围内处理60min，β-甘露聚糖酶的残余酶活力维持在90%以上；在60℃和65℃下保温60min，β-甘露聚糖酶的残余酶活力分别为88%和78%；在70℃下保温60min，β-甘露聚糖酶的残余酶活力为45%(图6)。说明BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶有很好的热稳定性。

在BM-Man基因来源β-甘露聚糖酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0PBS缓冲液配置)或胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL缓冲液配置)，于37℃处理120min，稀释后再测定β-甘露聚糖酶活性。经胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理120min后，β-甘露聚糖酶残余酶活力均在95%以上(图10)，说明BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶具有较好的抗蛋白酶水解能力。

实施例8重组β-甘露聚糖酶与其它芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的比较

将本发明的β-甘露聚糖酶的比活力(参见实施例6)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WL-7来源的甘露聚糖酶的比活力(参见KWEUN，MIN A，MI-SUNGLEE和JOON HO CHOI.2004.枯草芽孢杆菌WL-7甘露聚糖酶基因的克隆和基因产物的鉴定(Cloning of a Bacillus subtilis WL-7MannanaseGene and Characterization of the Gene Product).J.Microbiol.Biotechnol.14(6):1295-1302)进行比较，可以看出本发明的β-甘露聚糖酶的比活力(16718.2U/mg)显著高于枯草芽孢杆菌WL-7来源的甘露聚糖酶的比活力(10080U/mg)。

还将本发明的重组β-甘露聚糖酶与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WL-7甘露聚糖酶(KWEUN，MIN A，MI-SUNGLEE和JOON HO CHOI.2004.枯草芽孢杆菌WL-7甘露聚糖酶基因的克隆和基因产物的鉴定(Cloning of aBacillus subtilis WL-7Mannanase Gene and Characterization of the GeneProduct).J.Microbiol.Biotechnol.14(6):1295-1302.)和枯草芽孢杆菌MA139甘露聚糖酶(Jiayun Qiao,Zhenghua Rao,Bing Dong,and Yunhe Cao.2010.在巴斯德毕赤酵母中表达枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶和酶鉴定(Expression of Bacillus subtilis MA139β-mannanase in pichia pastoris and theEnzyme Characterization).Appl Biochem Biotechnol.160:1362-1370和王春林，曹云鹤，一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用，中国专利(申请号200910084472.9)2009)的纯酶的最适反应pH、最适反应温度、pH稳定性和热稳定性等理化性质进行比较，结果如图3至图6所示。可以看出，三种重组β-甘露聚糖酶有相似的pH稳定性和热稳定性，但本发明的甘露聚糖酶较其它两种甘露聚糖酶有更广泛的pH适用范围和温度适用范围。

实施例9重组β-甘露聚糖酶干燥制剂的稳定性

将实施例6所制备的重组β-甘露聚糖酶纯酶进行制剂加工。具体是，在酶液中加入25%(w/v)淀粉、5%(w/v)硫酸钠、10%(w/v)糊精、2.5%(w/v)氯化钠、1.5%(w/v)山梨酸钾和1%(w/v)硫酸钙，混合均匀后进行喷雾干燥。然后将所得到的固体重组β-甘露聚糖酶制剂置于不同的温度下(50-100℃)孵育60min，在按照以上所述的方法测定残余β-甘露聚糖酶活性，考察重组β-甘露聚糖酶固体制剂的耐热性。在50℃-90℃下处理60min，重组β-甘露聚糖酶固体制剂的残余酶活力均在90%以上；在100℃下处理60min，仍能保持78%的残余酶活力(图11)。说明本发明的重组β-甘露聚糖酶固体制剂有很好的耐热性，能够很好的应用于颗粒饲料加工等行业。

将以上所制备的重组β-甘露聚糖酶固体制剂置于恒温恒湿箱中(25℃，相对湿度50%)贮存15个月，其中每隔一个月取样一次测定固定制剂的残余酶活力，考察重组β-甘露聚糖酶固体制剂的贮存稳定性。贮存15个月后，仍保持有94%的残余酶活力(图12)，说明本发明的β-甘露聚糖酶有很好的贮存稳定性。

通过上述实验结果可以看出，利用本发明所述的菌株和方法所制备的BM-Man基因来源的β-甘露聚糖酶具有广泛的工业应用前景，可广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域。

Claims (15)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有β-1,4-甘露聚糖酶活性，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

2.一种编码权利要求1所述多肽的核酸。

3.如权利要求2所述的核酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

4.一种重组载体，其包含权利要求2或3所述的核酸。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的重组载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是真核细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是酵母细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是毕氏酵母细胞。

9.如权利要求5-8中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组载体整合入所述宿主细胞的基因组内。

10.一种生产β-甘露聚糖酶的方法，其依次包括以下步骤：

i)培养权利要求5-9中任一项所述的宿主细胞，

ii)诱导其表达，

iii)收获表达产物。

11.如权利要求10所述的方法，还包括以下步骤：

iv)纯化表达产物。

12.一种组合物，其含有有效量的如权利要求1所述的多肽以及食品学上或工业上可接受的运载体或赋形剂。

13.一种组合物，其含有有效量的如权利要求1所述的多肽以及一种或多种选自下组的酶：蛋白酶、纤维素酶、β-木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶；或它们的混合物。

14.一种如权利要求12或13所述的组合物，其用于饲料和食品添加剂，用于废纸脱墨和纸浆漂白。

15.一种野生型巨大芽孢杆菌菌株FB101，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年9月13日，保藏号为CGMCC No.4162。