CN104371988B

CN104371988B - 一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN104371988B
Application number: CN201310357541.5A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 王钱福; 钱昌丽; 刘宁; 严兴; 魏维; 王倩; 谢磊; 黄勇平
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2013-08-15
Filing date: 2013-08-15
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2033-08-15
Also published as: US20160201045A1; WO2015021930A1; CN104371988A

Abstract

本发明涉及一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及利用所述木聚糖酶形成简单糖的方法。本发明还涉及提高所述木聚糖酶热稳定性的突变体和提高该木聚糖酶热稳定性的方法。本发明的木聚糖酶的酶活性高，具有宽的pH适用范围和良好的温度稳定性，可良好地应用于工业生产。

Description

一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的内切木聚糖酶，其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖简介。木聚糖，由木糖分子(D Xylose)以β-1,4-糖苷键连结成主链；阿拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙酰基等连结成支链。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要成份，半纤维素是植物多糖中仅次于纤维素的重要成份，是自然界中除纤维素为含量最为丰富的可再生植物多糖。

木聚糖的来源。富含木聚糖的原料来源广泛，包括硬木、软木、秸秆、稻草、麸皮等农、林、工业废弃物及城市固体垃圾等。且不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的15～30％，软材中一般占干重的7～12％。而在一些一年生植物如小麦、甘煎、棉子壳中，木聚糖含量则高达30％以上。

木聚糖酶简介。木聚糖酶是一系列能特异降解木聚糖的糖基水解酶的总称。由于组成木聚糖单糖单元的差异、键的类型不同、以及木聚糖中存在许多不同取代基的支链，木聚糖的彻底降解需要多种酶参与，包括：内切-1，4-β-木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase，EC3.2.1.8)，β-木糖苷酶(β-xylosidase，EC 3.2.1.37)，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，E.C.3.2.1.39)、β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase，EC3.2.1.39)、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterases，E.C.3.1.1.72)以及降解阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯键酚酸酯酶(ferulic or p-coumaric acidesterase，E.C.3.2.1.73)等。其中，内切-1，4-β-木聚糖酶是降解木聚糖最主要的酶。该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为低聚木糖和少量木糖，从而起始多聚糖的逐步降解(Bernier R,Driguez H,Desrochers M Gene 26:59–65,1983)

木聚糖酶在传统产业中的应用。木聚糖酶被广泛应用于包括食品、饲料、造纸、纺织等各种工业部门中，并在其中扮演重要的角色。第一，在食品工业中，木聚糖酶被用于水果、蔬菜和植物加工，以促进浸渍过程，使汁液澄清，提高产量和过滤效率；被用于葡萄酒制造和酿造以促进葡萄皮浸渍和降低成品的混浊度；被用于培烤、磨粉、糕点、糖果的加工中以提高面团的弹性和强度，改善面包质地；被用于咖啡加工中，以降低咖啡提取物的粘度并改善了干燥/冻干过程。第二，在造纸工业中，木聚糖酶被用于促进制浆处理和代替机械制浆，不仅能有效降低能量消耗还可提高纸浆的原纤维形成和透水性进而提高加工效率和纸张强度。第三，在纺织工业中，木聚糖酶被用于纺织品(亚麻，黄麻，兰麻，大麻等)的酶解中，以减少或替代化学混麻方法。第四，在农牧业中，木聚糖酶被广泛应用于单胃动物(如猪和家禽)以及反刍动物的饲料中。辅助动物有效降解木聚糖，降低饲料中非淀粉多糖的含量，以提高饲料的可消化性和营养价值同时减少环境污染。

木聚糖酶在生物能源领域的作用。尤为重要的是，在全球化石资源日益枯竭，开发新型生物能源迫在眉睫的背景下，木聚糖酶可与其他纤维素酶、半纤维素酶共同应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇的工业生产中。一方面，木聚糖酶通过降解木质纤维素中与木质素及纤维素骨架链紧密交联的半纤维素链，大大提高纤维素酶接触并作用于纤维素链的频率和效率，从而间接提高纤维素的降解效率；另一方面，随着近年来五碳糖发酵途径及菌株的研究、开发，利用细菌、酵母及丝状真菌发酵木聚糖水解产物木糖生产燃料乙醇的工艺日趋成熟。两方面共同作用使木质纤维素的转化效率大大提高，从而有效降低燃料乙醇的生产成本。

木聚糖酶的研究历史。由于木聚糖酶有着广泛的用途，对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，且己经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。研究得较为清楚的有Trichoderma reesei(里氏木霉)、Aspergillus niger(黑曲霉)、Streptomyces lividans(变铅青链霉菌)、Cellulomonas fimi(粪肥杆菌)、Clostridiumthermocellum(热纤梭菌)、Penicillium simplicissimum(简青霉)等所产生的木聚糖酶。需要指出的是，这些木聚糖酶基因大部分都是从纯培养的微生物中分离出来的，而自然界中可培养微生物的种类尚不足1％，获得的木聚糖酶在理化特性、催化效率、产量等方面也远远不能满足现代工业生产的需求。

鉴于现有技术中大部分木聚糖酶的活力较低，在理化特性、催化效率、产量等方面也远远不能满足现代工业生产的需求，有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出新的、酶活性高的木聚糖酶，以用于工业生产，提高生产效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用。

本发明的目的在于提供包括内切木聚糖酶基因的表达载体和宿主细胞，基因的表达和蛋白纯化方法，以及重组蛋白的酶学特性和功能特征。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)由SEQ ID NO:2的第19－272位氨基酸残基组成的多肽片段；

(c)由SEQ ID NO:2的第19－267位氨基酸残基组成的多肽片段；

(d)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中第19-267位氨基酸的多肽；

(e)由(a)、(b)、(c)或(d)中所述的多肽经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有多肽(a)功能的多肽；

(f)在(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个优选例中，所述的多肽来源于高等食木非培菌黄球白蚁肠道系统的元基因组。

在一个具体实施例中，所述(a)多肽的功能包括但不限于作为内切木聚糖酶的功能。

在一优选实施例中，(e)所述多肽除保留内切木聚糖酶功能外，还相对于野生型序列而言还具有提高的热稳定性。

在一个具体实施例中，所述多肽选自：

(i)SEQ ID NO:2；和

(ii)SEQ ID NO:2的至少含有其第19-267位氨基酸的片段。

在一个具体实施例中，所述片段为由SEQ ID NO:2的第19－272位氨基酸残基组成的片段。

在一个具体实施例中，(e)所述多肽选自在SEQ ID NO:2的至少一个下述位点存在氨基酸取代的多肽：K32、N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228和A386。

在一个具体实施例中，(e)所述多肽至少在SEQ ID NO:2的K32和K223中存在取代。在某些具体实施例中，所述取代突变为K32T与选自K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、K223G和K223L中的任一种突变的组合。

在一个具体实施例中，(e)所述多肽至少在223位上存在选自以下的取代突变：K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、K223G和K223L。

在一个具体实施例中，(e)所述多肽的突变为取代突变，所述取代突变选自以下突变中的一个或多个：K32T、N37D、S42N、M80I、K205E、E219D、A221T、M222L、K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、K223G、K223L、T228S、和A386S。

在一个具体实施例中，(e)所述多肽选自：(1)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：N37D；(2)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：S42N；(3)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：M80I；(4)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：E219D；(5)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述示取代的多肽：A221T；(6)在对应于SEQ IDNO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：M222L；(7)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223M；(8)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：T228S；(9)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E、K223T和A386S；(10)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T和K223T；(11)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E和K223T；(12)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223E、K223T、K223C、K223S、K223G或K223L；(13)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K21T和K223C；和(14)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T和K223S。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(a)培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种利用所述的多肽将木聚糖或含有木聚糖的物质中的木聚糖降解为低聚木糖或木寡糖或单糖的方法。

在另一优选例中，所述的低聚木糖或木寡糖是：木二糖、木三糖或木四糖。

在另一优选例中，所述的多肽以内切形式水解底物，所述的底物是：木聚糖，或含木聚糖的物质(如半纤维素)。

在另一优选例中，所述的木聚糖是：桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物还含有调节酶活性的添加物。

在另一优选例中，所述的调节酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；较佳地选自：K⁺，Mn²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺，Mn²⁺的物质；或

所述的调节酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物；较佳地选自：Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和EDTA；或在添加至底物后可水解形成Ni²⁺、Zn²⁺或Fe³⁺的物质。

在一个优选例中，所述的木聚糖是：桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

在另一优选例中，在pH3-12(例如3.5-9.5、5-10、pH4-9.5、pH5.5-9.5；优选是pH6.0-9.5；更优选是pH6.0-8.0；最佳地是pH7.0)条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，在温度15-90℃(例如，25-80℃，较佳地是30-60℃；更佳地是45-55℃，更进一步地，50-55℃)条件下，用所述的多肽处理待水解的底物。

在另一优选例中，用所述的多肽处理的同时，还加入调节酶活性的添加物。

本发明还提供一种提高木聚糖酶的热稳定性方法，所述方法包括：

将木聚糖酶多肽中对应于SEQ ID NO:2第32位和/或第223位的氨基酸进行突变，从而得到热稳定性提高的木聚糖酶。

在一具体实施例中，所述木聚糖酶多肽是本领域已知的木聚糖酶多肽。

在其它实施例中，所述木聚糖酶多肽是本发明的SEQ ID NO:2或其活性片段。

在其它实施例中，所述突变还包括在该木聚糖酶的其它位置上进行的突变。在优选实施例中，所述其它位置包括下述位置中的一个或多个：37、42、80、205、219、221、222、228和386，所述位置编号对应于SEQ ID NO:2的编号。

本发明还提供一种筛选热稳定性提高的木聚糖酶的方法，所述方法包括：

(1)构建含有SEQ ID NO:2或其活性片段的突变体的文库；和

(2)对所述文库中的突变体进行热稳定性测试；

其中，在相同的测试条件下，若突变体测试后活力下降的程度低于对照的下降程度至少5％(优选低于至少10％、至少20％、至少30％或更低)，则筛选该该突变体为热稳定性提高的木聚糖酶。

所述方法中，对照可以是构建该突变体文库的出发多肽，例如SEQ ID NO:2或其含有第19到267或272位氨基酸的片段，也可以是某些已确定具有SEQ ID NO:2的内切木聚糖酶活性且其热稳定性与SEQ ID NO:2或其含有第19到267或272位氨基酸的片段相同或提高的突变体。

在一具体实施例中，构建的突变体至少包括以下一个或几个位置中的取代突变：K32、N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228和A386，所述氨基酸编号以SEQ IDNO:2的编号计。

在一具体实施例中，构建的突变体至少包括K32和/或K223位上的突变。在其它实施例中，构建的突变体还可包括以下一个或几个位置中的突变，优选为取代突变：N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、T228和A386。上述氨基酸编号对应于SEQ ID NO:2的编号。

在一具体实施例中，所述热稳定性测试包括在pH为3-12，优选5.5-10，更优选约7.0；温度为15-90℃，优选为30-60℃，更优选为50-55℃的条件下测试突变体及对照的酶活，测试的底物选自桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-xyl7菌落PCR后的电泳图。图中泳道M为DNA marker的电泳结果(片段由上到下依次是23.1kb、9.4kb、6.6kb、4.4kb、2.3kb、2.0kb、564bp)，1-5为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-xyl7 5个单克隆菌落PCR后的电泳图。

图2为内切-1,4-β-木聚糖酶基因xyl7的表达和表达产物的纯化SDS-PAGE图。其中左图泳道1为细胞裂解液上清中的蛋白，泳道2为20mM咪唑洗脱液，泳道3为40mM咪唑洗脱液，泳道4为60mM咪唑洗脱液，泳道5为100mM咪唑洗脱液，泳道6为200mM咪唑洗脱液，泳道7为500mM咪唑洗脱液，泳道M为蛋白Marker(分子量由上到下依次为200、116、97.2、66.4、44.3、29、20.1、14.3kDa)。

图3为Xyl7在不同pH条件下的酶活力曲线。其中，◆表示NaAc缓冲液中的酶活力，■表示NaH₂PO₄缓冲液中的酶活力，▲表示Tris-HCl缓冲液中的酶活力。

图4为Xyl7pH耐受性测定。其中，◆表示Ph6.5的NaH₂PO₄缓冲液中的酶活力，▲表示pH7.0的NaH₂PO₄缓冲液中的酶活力，*表示pH7.0的NaH₂PO₄缓冲液中加入70mM巯基乙醇的酶活力，×表示pH7.5的NaH₂PO₄缓冲液中的酶活力。

图5为Xyl7在不同温度条件下的酶活力曲线。

图6为Xyl7对不同温度的耐受性检测结果。其中，◆表示45℃下的酶活力，■表示50℃下的酶活力，▲表示55℃下的酶活力，×表示50℃下NaH₂PO₄缓冲液中加入70mM巯基乙醇的酶活力。

图7为Xyl7对桦木木聚糖在不同作用条件下的水解底物的TLC分析。其中，1：标准品：X1为木糖，X2为木二糖，X3为木三糖；2：对照组(未与酶作用的1％桦木木聚糖)；3：当作用时间为10分钟时的水解产物；4：当作用时间为1小时时的水解产物；5：当作用时间为4小时时的水解产物；6：当作用时间为12小时时将其最终水解为木寡糖，主要包括：木二糖、木三糖、木四糖。

图8为Xyl7在pH8和pH9条件下，在55℃、60℃和70℃分别放置两小时后测得的剩余酶活。

图9为Xyl7在pH4和pH5下37℃温浴15、30、45和60分钟后的相对剩余酶活。

图10为Xyl7定向进化第一轮随机突变文库筛选结果。

图11为定向进化第一轮筛选到突变子的热稳定性测定结果。

图12为第二轮随机突变文库筛选结果和第223位点的饱和突变筛选结果。

图13为第223位点组合突变子分别在55度(上)和60度(下)热稳定性测定结果。

图14为Xy17第19-272位氨基酸片段的表达和表达产物的纯化SDS-PAGE图。其中泳道1为细胞裂解后的总蛋白，泳道2为细胞裂解液沉淀，泳道3为细胞裂解液上清，泳道4为60mM咪唑洗脱液，泳道5为100mM咪唑洗脱液，泳道6为200mM咪唑洗脱液，泳道7为500mM咪唑洗脱液，泳道M为蛋白Marker(分子量由上到下依次为200、116、97.2、66.4、44.3、29、20.1、14.3kDa)。

图15为Xy17第19-272位氨基酸片段中第223位点突变子分别在55度(上)和60度(下)的热稳定性测定结果。

图16为Xy17第19-267位的蛋白表达结果，命名为Xy17R2。泳道1为细胞裂解后的总蛋白，泳道2为细胞裂解液沉淀，泳道3为细胞裂解液上清，泳道4为60mM咪唑洗脱液，泳道5为100mM咪唑洗脱液，泳道6为200mM咪唑洗脱液，泳道7为500mM咪唑洗脱液，泳道M为蛋白Marker。

具体实施方式

本发明人经过大规模的筛选，首次从白蚁肠道的元基因组中分离得到一种新的木聚糖酶(较佳地为内切-1，4-β-木聚糖酶)，其酶活性高，对温度和pH具有较宽的作用范围，可良好地应用于工业生产。所述的木聚糖酶的氨基酸序列与已知氨基酸序列的相似性最高的为69％，证明其是一种新的蛋白。本发明的木聚糖酶具有很高的酶活性，在pH7.0，50℃下的比活力高于6340U/mg。

针对传统微生物学中基因筛选方面的缺陷，元基因组学(Metagenomics)技术异军突起。通过直接从环境中抽提微生物核酸并构建元基因组文库(BAC，fosmid或者质粒文库)，可以有效克服由于微生物分离培养技术造成的缺陷，获得群落中所有种群的遗传信息，这些遗传信息就包括了群落中所欲参与生物转化的基因，这些基因编码的酶在克隆宿主中的表达可以用于各种与生物转化相关的酶的筛选，从而有可能获得大量新的基因。

众所周知，针对不同用途需要使用不同性质的木聚糖酶，而不同性质的木聚糖酶极有可能蕴藏于自然界不同生态环境下的微生物基因组中。白蚁作为自然生态系统中木质纤维素的重要降解者，其肠道共生微生物群落在纤维素物质转化过程中起到了关键作用。鉴于白蚁肠道生态系统的高效性、独特性和复杂性，本发明以白蚁作为木聚糖酶筛选的体系，利用元基因组学技术进行筛选，对其基因和酶进行挖掘，最终找到了本发明的木聚糖酶。

本发明的木聚糖酶可作用于木聚糖长链分子的内部，以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为简单糖(如木寡糖)。

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”、“本发明的木聚糖酶”、“Xyl7蛋白”、“Xyl7多肽”或“木聚糖酶Xyl7”可互换使用，都指具有木聚糖酶Xyl7氨基酸序列(SEQID NO:2、其片段或变异形式或衍生物)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的木聚糖酶Xyl7。

如本文所用，术语“本发明的基因”、“xyl7基因”、“xyl7”指具有木聚糖酶编码基因序列(SEQ ID NO:1或其变异形式或衍生物)的多核苷酸。

如本文所用，所述的“简单糖”广义地指木聚糖链被切割后形成的一类糖的总称，其链长度低于被切割前。例如，所述的简单糖含有1-50个木糖，较佳的，含有1-30个木糖；更佳的，含有1-15个木糖；更佳地含有1-10个木糖，如2，3，4，5，6，7，8，9个木糖。所述的简单糖包括：木寡糖、木二糖、木三糖、木四糖等。本发明中，所述的简单糖又指：低聚木糖、少量木糖。

如本文所用，所述的“木糖”指一种含有五个碳原子的单糖。分子式C₄H₉O₄CHO。所述的“木聚糖”是“木糖”的聚合体。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的Xyl7蛋白或多肽”是指Xyl7多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Xyl7蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。Xyl7多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括Xyl7蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Xyl7蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“Xyl7多肽”指具有Xyl7蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的多肽或活性片段和活性衍生物。在一优选实施例中，所述活性片段可以是含有SEQ ID NO:2的保守功能域(第32-256位氨基酸)的片段。例如，所述片段可以是含有SEQ ID NO:2的第19-267位氨基酸残基的片段。在其它实施例中，所述活性片段可以是含有SEQ ID NO:2的第19-272位氨基酸残基的片段。例如，所述片段可以为SEQ ID NO:2的第19-450位氨基酸序列、第19-300位氨基酸序列不等，优选SEQ ID NO:2的第19-267位氨基酸序列以及SEQ ID NO:2的第19-272位氨基酸序列。又例如，变异可以发生在SEQ ID NO:2的保守功能域(第32-256位氨基酸)之外；在一优选实施例中，变异发生在例如SEQ ID NO:2的第19-267或272位氨基酸序列之外。变异可以是1-20个、例如1-10个、优选1－5或1－3个氨基酸缺失、取代和插入。该术语还包括具有与Xyl7蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列或SEQ ID NO:2的第19-272位氨基酸序列或第19-267位氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能；又比如，仅表达该蛋白的催化结构域，而不表达碳水化合物结合结构域也能获得和完整蛋白同样的催化功能。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与xyl7DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Xyl7多肽的抗体获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Xyl7多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Xyl7多肽的可溶性片段。通常，该片段具有Xyl7多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明SEQ ID NO:2序列或SEQ ID NO:2的第19-272位氨基酸序列或SEQ ID NO:2的第19-267位氨基酸序列的变异形式包括但不限于发生在SEQ ID NO:2序列或相对于该序列相同位点的第32位、第37位、第42位、第80位、第205位、第219位、第221位、第222位、第223位、第228位、第386位中的一个或多个位置上的取代突变。用来取代的氨基酸并无特别限制。在某些实施例中，本发明的变异序列可包含以下取代中的一个或多个：K32T、N37D、S42N、M80I、K205E、E219D、A221T、M222L、K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、K223G、K223L、T228S、和A386S。

在一些实施方式中，本发明的变异形式的多肽包括但不限于SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27和29中所示的序列。本发明也包括这些变异多肽的编码序列，其编码序列的例子包括SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26和28所示的序列。

发明还提供Xyl7蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Xyl7多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“Xyl7蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的第19-267或272位的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的Xyl7蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表2列出了其中的一些标签及其序列。

表2

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述Xyl7的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的第19-267位氨基酸序列所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Xyl7蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的xyl7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Xyl7蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Xyl7多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码Xyl7多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，xyl7多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Xyl7编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的Xyl7的用途包括(但不限于)：水解木聚糖，将木聚糖长链切割为短链，或形成简单糖。大部分已知木聚糖酶的活力都低于本发明的Xyl7的酶活力，预期通过蛋白分子改造等手段可以进一步提高Xyl7的酶活力、或扩大Xyl7适用的PH值范围、温度范围及热稳定性，因此其应用前景良好。一些蛋白的分子改造技术是本领域人员熟知的，因此采用这些技术改造Xyl7后生成的木聚糖酶也包含在本发明中。

用表达的重组Xyl7蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Xyl7蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对Xyl7DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Xyl7基因产物或片段。较佳地，指那些能与Xyl7基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Xyl7蛋白的分子，也包括那些并不影响Xyl7蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Xyl7基因产物结合的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Xyl7基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Xyl7蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。抗Xyl7蛋白的抗体可用于检测样本中的Xyl7蛋白。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Xyl7蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的Xyl7多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中Xyl7多肽的有效量。

所述的组合物中还可添加调节本发明的Xyl7酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，所述的提高本发明的Xyl7酶活性的物质选自：K⁺，Mn²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺，Mn²⁺的物质，如氯化钾、硫酸锰。此外，一些物质可以降低酶活性，选自：Ni²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和EDTA；或在添加至底物后可水解形成Ni²⁺、Zn²⁺或Fe³⁺的物质。

在获得了本发明的Xyl7酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解底物(特别是木聚糖)的作用。作为本发明的优选方式，还提供了一种形成简单糖的方法，该方法包含：用本发明所述的Xyl7酶处理待水解的底物，所述的底物包括桦木木聚糖和山毛榉木聚糖等。通常，在pH3.5-10条件下，用所述的Xyl7酶处理待水解的底物。通常，在温度30-80℃条件下，用所述的Xyl7酶处理待水解的底物。较佳地，用所述的Xyl7酶处理的同时，还加入K⁺，Mn²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺，Mn²⁺的物质。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从白蚁肠道系统构建的Fosmid文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1518个碱基，编码全长为505个氨基酸的Xyl7蛋白(SEQ ID NO:2)。所述的Xyl7蛋白(SEQ ID NO:2)序列中，自氨基端的第32-256位氨基酸为糖基水解酶第11家族(Glycosyl Hydrolase Family 11)保守功能域。所述的Xyl7蛋白与已知氨基酸序列的相似性为69％，证明是一种新的内切-1,4-β-木聚糖酶。

实验证明本发明的内切-1,4-β-木聚糖酶具有很高的木聚糖酶活性、很广的pH适用范围及较广的温度适用范围，因而具有巨大的应用前景。

本发明同时提供一种热稳定性提高的多肽，该多肽衍生自原始多肽，具有木聚糖酶活力的同时其热稳定性大幅提高。原始多肽优选为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其含有第19-267或272位氨基酸残基的片段。该热稳定性提高的多肽优选至少具有相对于SEQ ID NO:2序列中第32位或第223位氨基酸的取代突变。优选的突变氨基酸为：K32T，K223E，K223C，K223S，或其组合，更佳的优选为K32T与K223C的组合，或K32T与K223S的组合。

本发明同时还提供一种提高多肽热稳定性的方法，包括将木聚糖酶多肽中对应于SEQ ID NO:2第32位和/或第223位的氨基酸进行突变，从而得到热稳定性提高的木聚糖酶。所述木聚糖酶可以是当前已知的其它木聚糖酶。在某些实施例中，所述木聚糖酶为本申请所公开的木聚糖酶。具体而言，所述方法包括将SEQ ID NO:2序列或其活性片段中第32位或第223位氨基酸的位点进行突变。

本文中，热稳定性的提高指的是在一定温度下，例如15-90℃，优选为30-60℃，更优选为50-55℃，例如50℃或55℃，经过一段时间后，相对于在该温度处理之前，其活力下降的程度与野生型(出发多肽)经过同样处理后的下降程度相比较低，即处理后保留的活力较高。热稳定性处理时使用的底物可以是该木聚糖酶的特异性底物。在本发明中，底物可以是例如桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。处理时的pH值通常在3-12的范围内，优选5.5-10，更优选约7.0。

此外应理解，上述的热稳定性提高的多肽和提高多肽热稳定性的方法，本领域人员可在一定范围内进行改动，在除相对于SEQ ID NO:2序列中第32位或第223位氨基酸之外进行氨基酸的增加，减少或缺失，或添加信号肽，这些改动均不影响本发明的权利要求。如果改动涉及到相对于SEQ ID NO:2序列中第32位或第223位氨基酸的位点，则落在本发明的说明书和权利要求之内。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、内切-1,4-β-木聚糖酶及其编码基因的分离

利用元基因组技术，通过常规方法从白蚁肠道元基因组系统中筛选到木聚糖酶阳性克隆，提取该克隆的质粒DNA进行454高通量测序，序列拼接后可以获得完整的Fosmid序列。用DNAStar软件寻找ORF，用NCBI的BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜寻GenBank数据库，得到一个新的内切-1,4-β-木聚糖酶的编码基因，该基因具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，命名为Xyl7。自SEQ ID NO:1的5’端第1-1518位核苷酸为Xyl7的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO:1的5’端的第1-3位核苷酸为Xyl7基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:1的5’端的第1516-1518位核苷酸为Xyl7基因的终止密码子TAA。

内切-1,4-β-木聚糖酶基因Xyl7编码一个含有505个氨基酸的蛋白质Xyl7，具有SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为51.9kDa，等电点pI为8.87。自SEQ ID NO:2的氨基端的第32-256位氨基酸为糖基水解酶第11家族(Glycosyl Hydrolase Family 11)保守功能域。

经鉴定，Xyl7能够高效地以内切方式作用于桦木木聚糖或山毛榉木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键，当作用时间较短(10分钟)时，将大分子多聚木糖初步水解为低聚木聚糖；当作用时间较长(12小时)时，将其最终水解为木寡糖，主要包括：木二糖、木三糖、木四糖。

经比对，Xyl7同已知序列的内切木聚糖酶的同源性最高为69％，表明该内切-1,4-β-木聚糖酶为新酶。

实施例2、Xyl7在大肠杆菌中的表达

1.重组表达载体的构建

通过PCR从上述筛选到的木聚糖酶阳性克隆中扩增预测到的内切-1,4-β-木聚糖酶ORF编码基因，所用正向引物为：5'GAGACTCCATATGCAAGGTCCCAC ATGGACT 3'(SEQ ID NO:3)，其5’端添加Nde I识别位点：CATATG；反向引物为:5'CGGAATTCTTACCTCACCATAACCCT 3'(SEQ ID NO:4)，其5’端添加EcoR I识别位点：GAATTC。

将PCR产物纯化后用Nde I和EcoR I酶切，应用Axgen PCR产物柱回收试剂盒回收酶切的DNA片段，将该DNA片段和经同样双酶切的回收的载体pET-28a(Novagen公司)用T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，得到重组表达载体pET 28a-Xyl7。表达产物的N末端有一个由表达载体提供的His标签(6×His-Tag)，便于后续纯化。

2.Xyl7基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达及表达产物纯化

(1)Xyl7的表达

将上述构建好的质粒pET 28a-Xyl7转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，将得到的BL21(DE3)/pET28a-Xyl7转化子随机挑取5个单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养液中，摇床上经过短期培养后，以菌液直接作为模板，通过载体上的T7启动子引物(cat.no.69348-3)和T7终止子引物(cat.no.69337-3)PCR鉴定阳性克隆。结果如图1所示，5个单克隆中均有目的片段扩出。

接种E.coli BL21(DE3)/pET28a-Xyl7于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃200rpm培养过夜。取1ml培养液到100ml LB培养液中，37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。冷却后加入80μM IPTG，于24℃200rpm继续培养16个小时，离心收集菌体。用裂解液(1ysis buffer：NaH₂PO₄ 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，pH7.4)悬浮收集的菌体，超声波破碎细胞后离心收集上清液即为粗酶液。

用购自Qiagen公司的Ni柱(Ni-NTA Column)纯化粗酶液，纯化时所用洗涤液(washbufer)：NaH₂PO₄ 50mmol/L，NaCI 300mmol/L，pH7.0；不同咪唑浓度(20、40、60、100、200、500)的洗脱液(elution bufer)：NaH₂PO₄ 50mmol/L，NaCl 300mmol/L，inidazole 20-500mmol/L，pH 7.0。用5μl洗脱液进行蛋白SDS-PAGE电泳检测，如图2所示。其中泳道1为细胞裂解上清液，泳道2为20mM咪唑洗脱液，泳道3为40mM咪唑洗脱液，泳道4为60mM咪唑洗脱液，泳道5为100mM咪唑洗脱液，泳道6为200mM咪唑洗脱液，泳道7为500mM咪唑洗脱液。从图中可见，200mM咪唑洗脱时目的蛋白大量洗脱，电泳后可以看到单条带，说明此时已经得到高纯度的目的蛋白，将所有含有目的蛋白的洗脱液合并，用GE公司10Kd截留的vivaspin6超滤管浓缩透析，同时用20mM pH7.4NaH₂PO₄的置换缓冲液，以去除咪唑。

实施例3.重组Xyl7蛋白酶学性质的分析

内切-1,4-β-木聚糖酶的酶活测定采用DNS法，具体操作如下：

(1)DNS配制

称取10克NaOH，溶解于大约400ml ddH₂O中，再称取10g二硝基水杨酸、2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠、200g四水酒石酸钾钠，将其溶解于大约300ml ddH₂O中，两种溶液混合，定容到1升，避光保存。

(2)标准曲线制备

取9支薄壁离心管，按表3中所述的木糖母液体积和纯水体积配制木糖标样，木糖母液浓度为10mg/ml。

表3

标样编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										木糖含量(μg)	0	10	20	30	40	70	80	120	150
木糖母液体积(μl)	0	1	2	3	4	7	8	12	15
										补充纯水体积(μl)	100	99	98	97	96	93	92	88	85

上表每份标样加DNS 100μl，沸水浴5min显色，酶标仪测540nm光吸收，标样1为空白对照。各样品吸光值减空白对照吸光值后制备标准曲线。

(3)标准酶活测定

在100μl反应体系中，加入终浓度为1％(w/w)的桦木木聚糖，终浓度为100mM的pH7.0Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，然后加入用该缓冲液稀释至一定稀释度的适量酶液50℃反应10分钟，再加入100μl DNS终止反应，对照为在上述反应体系中先加入100μl DNS后再加酶液。沸水浴中反应5分钟显色，用酶标仪测540nm光吸收值，样品测定值减去对照后利用标准曲线计算酶活单位(U)。

酶活单位(U)定义：1U为每分钟催化水解木聚糖产生1μmol木糖所需的酶量。

比活力单位的定义：每毫克蛋白质所含的酶活力(U/mg)。

结果表明Xyl7对山毛榉木聚糖在pH7.0，50℃下的比活力为6340U/mg。

(4)Xyl7最适pH测定

pH范围为3.5-10，每0.5个单位为一个梯度，不同pH值的缓冲液配制为：pH 3.5～6.0用终浓度为100mM的NaAc；pH 6.0～8.0用终浓度为100mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄；pH 8.0～pH10用终浓度为100mM Tris-HCl。将酶液加入各pH缓冲液的体系中，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活。在50℃反应条件下，Xyl7在pH7.0的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中的比活力最高，以此为参照值，其相对活力定义为100％，各pH值下酶的相对活力为各pH下酶的比活力与参照值的比值。

结果如图3所示，Xyl7最适pH为7.0，且在pH 5.5～10之间均具有50％以上的相对活力，说明Xyl7的反应pH范围较宽，能够适应的酸碱范围较广。

(5)Xyl7pH耐受性测定

将酶液在不同pH(6.5、7.0、7.5)的缓冲液或在PH7.0时加入70mM巯基乙醇中，于50℃下分别保持不同时间(15min、30min、45min、60min、75min)后，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活(在pH7.0，50℃下，反应10min,测定酶活力)。以Xyl7在pH7.0，50℃中保存0min，在50℃反应10min的比活力为参照值，其相对活力定义为100％，Xyl7在各pH值缓冲液中保存不同时间后的相对活力为各种处理后的酶的比活力与参照值的比值。

结果如图4所示，Xyl7具有较广的pH耐受性：在pH6.5、7.0、7.5的缓冲液中保持45min后，均能够保持最高活力的50％以上。

(6)Xyl7最适温度测定

在pH7.0条件下，在温度范围为25-80℃之间，按如前所述标准酶活测定方法步骤测定酶活。结果如图5所示，Xyl7的最适温度为50～55℃，50℃活力略高于55℃，故以此温度下的酶的比活力为参照值，其相对活力定义为100％，各个温度下的酶的相对活力为各个温度下酶的比活力与参照值的比值。Xyl7在30-60℃的温度范围内可保持最高活力50％以上的活力，说明Xyl7的反应温度范围较宽。

(7)Xyl7温度耐受性测定

将Xyl7酶液保存于最适pH7.0缓冲液中，在不同温度(55℃、50℃、45℃)或在50℃时加入70mM巯基乙醇下保持不同时间(15min、30min、45min、60min、75min)后，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活(在pH7.0，50℃，下，反应10min，测定酶活力)。其对照是未热处理的酶液在pH7.0，50℃下所测定的比活力，以此为参照值，其相对活力定义为100％；处理组的相对活力为在不同温度下保温不同时间(处理条件)后测得的相对活力与参照值的比值。结果如图6所示，Xyl7在55℃下保存15min时，活力迅速下降到最大活力的50％以下；在50℃、45℃下保持时酶活力下降较慢，保持45min时酶活力才下降到最大酶活力的50％以下；当加入70mM巯基乙醇后，酶活力的下降速度进一步减慢。

(8)不同化学试剂及金属离子对Xyl7酶活的影响

在反应体系中加入各种化合物(终浓度为l0mmol/L)，然后按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活，以未加任何化学试剂及金属离子的酶的比活力为参照值，其相对活力定义为100％。不同化学试剂或金属离子对Xyl7酶活的影响用相对活力表示，相对活力为各种化学试剂或金属离子环境下的酶的比活力与参照值的比值。结果如表4所示，K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺和Co²⁺对Xyl7有激活作用，其中K⁺和Mn²⁺可使酶活力提高近20％；Ni²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺和EDTA对Xyl7有显著的抑制作用，均可使酶丧失70％以上活力；Mg²⁺对Xyl7没有显著作用。

表4

(9)Xyl7对不同底物的水解情况

将各种底物(终浓度为2％(w/w))与适量酶在pH7.0及50℃下作用10min，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活力。结果如表5所示：Xyl7的底物特异性较强，仅对桦木木聚糖及山毛榉木聚糖具有显著酶活，对于其他测定底物则没有检测到酶活，这与GH11家族木聚糖酶的高底物特异性能较好吻合。

表5

(10)Xyl7对桦木木聚糖水解底物的TLC分析

将1％(w/w)桦木木聚糖与15U Xyl7在pH7.0、50℃下分别作用10min、1h、4h、12h获得水解产物。将5μl上述两种产物用TLC进行鉴定，其中标准样品为木糖、木二糖和木三糖；展开剂为：乙酸乙酯：乙酸：水2:1:1(V/V/V)；显色剂为1mL苯胺、1g二苯胺、5mL 85％磷酸溶于50mL丙酮中。

结果如图7所示，当作用时间较短时，Xyl7将大分子多聚木糖初步水解为低聚木聚糖；当作用时间较长时，将其水解为木寡糖，主要包括：木二糖、木三糖、木四糖；在酶过量的情况下最终的水解产物是木糖。证明Xyl7是以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4-木糖苷键。

(11)Xyl7在纸浆漂白中的应用

纸浆漂白需要木聚糖酶没有纤维素酶活性，而且可以在中高温(如50-70度)、碱性环境(如pH8-9)下，在1-2小时内保持酶活性。因此，将Xyl7在pH8和pH9条件下，在55℃、60℃和70℃分别放置两小时后，按如前所述标准酶活测定步骤测定酶活(在pH7.0，50℃下，反应10min，测定酶比活力)，其对照是未处理的酶液在pH7.0，50℃下所测定的比活力，以此为参照值，其相对活力定义为100％，并计算剩余酶活，剩余酶活为各处理后的酶的比活力与参照值的比值。

结果如图8所示，可见Xyl7即使在50-70度的高温、pH8-9的碱性环境中，仍能在1-2小时内保持足够高的酶活性，因此可用于纸浆漂白。

(12)Xyl7作为饲料添加剂的应用

作为饲料添加剂，由于猪等畜类胃内酸性环境，需要木聚糖酶在PH4左右的环境下保持酶活性，对于鸡消化道内的弱酸环境，需要木聚糖酶在PH6左右的环境下保持酶活性。因此，将Xyl7在pH4和pH5下于37℃温浴15、30、45和60分钟后测定并计算剩余酶活，剩余酶活为各处理后的酶的比活力与没有处理的酶的比活力的比值。

结果如图9所示，可见Xyl7即使在pH4-5的酸性环境中仍能保持足够高的酶活性，因此可用作饲料调节剂。

实施例4.Xyl7第19-272位氨基酸片段特性研究

使用正向引物：5'TGAGACTCCATATGCAAGGTCCCACATGGACT 3'(SEQ ID NO:10)(其5’端添加Nde I识别位点：CATATG)以及反向引物:5'GCGGAATTCTTATGGCGTAGGCGTGGTGCC 3'(SEQ ID NO:11)(其5’端添加EcoR I识别位点：GAATTC)，通过与实施例2同样的方法，扩增内切-1,4-β-木聚糖酶ORF编码基因中的58～801碱基片段(对应于内切-1,4-β-木聚糖酶的第19-272位氨基酸)，将其克隆到重组表达载体pET 28a，在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达并纯化表达产物(以下将该表达产物称为Xyl7R3)，通过与实施例3同样的方法评价Xyl7R3的酶活性。

如图14所示Xyl7第19-272位氨基酸片段(Xyl7R3)的表达量明显高于Xyl7的表达量，且能获得高纯度的目的蛋白。另外，采用实施例3标准酶活测定步骤测定Xyl7R3的酶活性，结果比活性为8775U/mg，说明其仍然具有与全长蛋白相当的活性，且Xyl7R3与Xyl7的最适温度和温度耐受性几乎完全一致。

实施例5.Xyl7的定向进化

1.xyl7随机突变文库的构建

利用易错PCR(error-prone PCR)技术构建随机突变文库，易错PCR采用试剂盒GeneMorph II Random Mutagenesis Kit，并按照试剂盒中提供的方法进行。并依照试剂盒中的方法在易错PCR时加入模版DNA500ng，调整突变率至1个突变位点/kb。采用两轮易错PCR构建突变文库，每次库容量大概为4万。每次对筛选到的突变子都进行复筛，并对得到的部分突变位点进行点饱和突变。

2.Xyl7热稳定性提高突变子的筛选和热稳定性测定

用无菌牙签挑取转化子到含有抗生素和终浓度1mM IPTG的LB液体培养基的96孔培养板中，37℃，200rpm，培养过夜后，离心收集菌体，加入最适反应pH缓冲液100ul重悬菌体，各孔对应的克隆分对照组和处理组各50ul，对照组置4℃保存，处理组于适宜温度水浴锅处理2小时，后每孔加入2％木聚糖(xylan)后于37℃反应1小时，DNS法检测酶活，处理后野生型处理组约保留对照组的酶活的10％～20％左右，此时可对其它克隆进行筛选，得到热稳定性相对野生型有增加的突变子。随后按照实施例3中的方法对最终筛选到的突变子进行热稳定性测定。剩余酶活的计算是指将过夜菌体重悬后分为两组，一为对照组，另一部分为处理组，前者置4℃冰箱后者在特定温度条件下各处理2h后，检测后者的酶活，与对照组相比其酶活力占对照组酶活力的百分比记为处理组的剩余酶活。

在对野生型进行热稳定性实验后，发现野生型样品在52.5℃水浴处理2h后，处理组酶活约保留对照组酶活的10％～20％，符合筛选要求，在此条件下对文库中的约10000个克隆进行筛选后，得到了17个经热处理后处理组酶活仍可保留约为对照组酶活80％以上的转化子。为进一步验证这些阳性转化子对温度的稳定性能力，对这些克隆又做了两次复筛实验：一是，在保持热处理温度保持52.5℃不变条件下，将处理时间从2小时延长至8小时；二是，热处理时间2小时不变，将处理温度从52.5℃提高到55℃。处理后结果如图10所示，从初步筛选得到的17个阳性克隆中，进一步得到两个编号为1-6D7和1-8B10的克隆，复筛条件下，这两个克隆相对野生型和其他阳性克隆，在温度稳定性上有明显优势。突变子1-6D7在氨基酸序列223位发生了突变K223M；突变子1-8B10在氨基酸序列上3个位置发生了突变，分别为K205E、K223T和A386S。

研究这几个突变位点各自对该酶温度稳定性的影响，分别构建了各位点的单突变共4个克隆，表达并纯化蛋白后，对各突变子做热稳定性检测，如图11所示,木聚糖酶基因xyl7突变子1-6D7(K223M)、1-8B10和单突变K223T克隆在55℃保温条件下热稳定性相对野生型及另外两个单突变克隆有明显增强，在60℃保温条件下有同样的趋势(结果未显示)，观察稳定性增强的3个突变子，发现均在氨基酸序列223位有突变，并以突变子K223T稳定性增强最明显，说明氨基酸序列223位与木聚糖酶xyl7的酶活稳定性有重要关系，对223位点做了饱和突变，同时以单突变克隆K223T为母本做第二轮易错PCR，构建随机突变文库。对构建的木聚糖酶基因xyl7的第二轮随机突变文库和223K位点饱和突变子建立筛选条件，以58℃热处理2小时为基础，随机突变文库筛选了10000多克隆，得到了约20个经58℃热处理后相对出发菌株(K223T)稳定性明显增强的突变子，这些突变子温度处理后处理组酶活仍可保持在未经温度处理的对照组的80％以上。对xyl7基因氨基酸序列223K饱和突变克隆进行筛选，与223K野生型相比，亦得到几个热稳定性增强的突变子，同第一轮筛选复筛类似，对这些突变子进行复筛，分别为58℃处理8小时和60℃处理2小时，结果可见随机突变文库中筛选到2个热稳定性相对出发菌株xyl7-K223T有明显增强的突变子，标记为2-8F12和2-6B2；xyl7-223K饱和突变文库筛选到突变子xyl7-K223C和xyl7-K223S热稳定性相对xyl7-K223T有明显增强(图12)。以上数据中计算突变子高温处理后的剩余相对活力是用处理组经温度处理后保留的相对于未经温度处理的突变子的相对活力；饱和突变筛选突变子时则是以构建突变子库的出发菌株为对照，经过同样条件的处理，若突变子处理后保留的相对活力明显高于同样处理的出发菌株(野生型)，则认为该突变子相对野生型酶活或热稳定性有明显提高。

对突变子2-8F12和2-6B2测序后发现其除均含有出发亲本的K223T突变外，前者在氨基酸序列32位有一个K32T突变，后者在氨基酸序列219位有一个E219D突变。对得到突变子的各阳性位点K32T、E219D、K223C和K223S进行组合，构建双突变和三突变的突变子克隆，并对各克隆蛋白诱导表达和纯化，测定木聚糖酶xyl7野生型及各突变蛋白在55℃和60℃的热稳定性，得到两个稳定性相对野生型及其它突变克隆有明显增强的突变子xyl7-K32T/K223C和xyl7-K32T/K223S，从数据可以看出这两个突变子的木聚糖酶蛋白在55℃的半衰期由野生型的约15分钟左右，大幅提高到42小时以上，约提高了250倍，而在60℃的半衰期也由10分钟不到提高到了150分钟以上(图13)。

此外，在Xyl7R3的氨基酸序列上构建了野生型Xyl7定向进化筛选到的对酶的稳定性有明显增强作用的几个定点突变，突变子分别命名为R3-TC(K32T/K223C)和R3-TS(K32T/K223S)，如图15所示这两个突变子在55℃的半衰期由野生型的约10分钟左右，大幅提高到约60小时，约提高了360倍，而在60℃的半衰期也由10分钟不到提高到了120分钟。

在Xyl7第19-272位氨基酸片段基础上，将相对于SEQ ID NO:2序列上第37位、第42位、第80位、第205位、第219位、第221位、第222位、第223位、第228位、第386位氨基酸的位点进行取代突变，相应的突变位点对应于SEQ ID NO:2序列的以上突变位点编号。突变位点包含以下取代中的一个或多个：N37D、S42N、M80I、K205E、E219D、A221T、M222L、K223M或K223T、T228S以及A386S。结果显示，这些突变仍然保留有该酶活性。

在Xyl7第19-272位氨基酸片段基础上，将相对于SEQ ID NO:2序列上第32位或第223位氨基酸的位点进行取代突变，包括单位点突变的K32T、K223E、K223C、K223S、K223T，以及双位点突变的K32T+K223C、K32T+K223S。结果显示，同SEQ ID NO:2序列类似，Xyl7第19-272位氨基酸片段在进行这些突变后同样显示出了热稳定性增强的特性。

实施例6.Xyl7截短氨基酸片段特性研究

在Xyl7氨基酸序列SEQ ID NO:2基础上，设计了相对于SEQ ID NO:2的第19-272氨基酸更短的序列进行表达，表达序列为SEQ ID NO:2的第19-267氨基酸，命名为Xy17R2。按照实施例3的“(3)标准酶活测定”方法测得Xy17R2的酶活为8560U/mg。结果表明，R2能检测到活性，且蛋白表达量很高(图16)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)SEQ ID NO:2的多肽片段，该多肽片段至少含SEQ ID NO:2第19-267位氨基酸残基；

(c)(a)或(b)所述的多肽在选自K32、N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228和A386位点中的1个、2个或3个位点上发生了氨基酸取代且仍具有多肽(a)功能的多肽，其中，所述氨基酸取代选自：K32T、N37D、S42N、M80I、K205E、E219D、A221T、M222L、K223M、K223T、K223C、K223S、K223G、K223L、T228S和A386S，所述功能包括作为内切木聚糖酶的功能和任选的相对于野生型序列而言提高的热稳定性；和

(d)在(a)、(b)或(c)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，(c)项所述的多肽为在选自K32、K205、K223和A386的位点中的1个、2个或3个位点上发生了氨基酸取代且仍具有多肽(a)功能的多肽，其中，所述氨基酸取代选自：K32T、K205E、K223M、K223T、K223C、K223S、K223G、K223L和A386S。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，(c)项所述多肽为至少在K223位发生了选自以下的氨基酸取代的多肽：K223M、K223T、K223C、K223S、K223G和K223L。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，(c)项所述多肽为在K32和K223中发生了氨基酸取代的多肽，其中，所述氨基酸取代为K32T与选自K223M、K223T、K223C、K223S、K223G和K223L中的任一种突变的组合。

5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自：

(1)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T；

(2)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：N37D；

(3)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：S42N；

(4)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：M80I；

(5)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E；

(6)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：E219D；

(7)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：A221T；

(8)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：M222L；

(9)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223M；

(10)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223T；

(11)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223C；

(12)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223S；

(13)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223G；

(14)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223L；

(15)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：T228S；

(16)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：A386S；

(17)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E、K223T和A386S；

(18)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T和K223T；

(19)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T和K223C；

(20)在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T和K223S；

(21)由SEQ ID NO:2的第19－272位氨基酸残基组成的多肽片段；和

(22)由SEQ ID NO:2的第19－267位氨基酸残基组成的多肽片段。

6.一种分离的多核苷酸，选自下组：

(1)编码权利要求1－5中任一项所述多肽的多核苷酸；和

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体，或其基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。

9.一种制备如权利要求1－5中任一项所述多肽的方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适于权利要求8所述的宿主细胞表达权利要求1－5中任一项所述多肽的条件下培养所述宿主细胞；和

(b)从培养物中分离出权利要求1－5中任一项所述的多肽。

10.权利要求1－5中任一项所述多肽的用途，其特征在于，所述的多肽用于将木聚糖或含有木聚糖的物质中的木聚糖降解成低聚木聚糖或木寡糖或单糖。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的木聚糖选自桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

12.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述含有木聚糖的物质选自：纸浆、饲料和秸秆。

13.一种降解木聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1－5中任一项所述的多肽与木聚糖或含有木聚糖的物质混合，在适合的反应条件下将所述的木聚糖或含有木聚糖的物质中的木聚糖降解成低聚木聚糖或木寡糖或木糖。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的木聚糖选自桦木木聚糖和山毛榉木聚糖。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述含有木聚糖的物质选自：纸浆、饲料和秸秆。

16.如权利要求13－15中任一项所述的方法，其特征在于，所述的适合的反应条件为：pH为3-12；温度为15-90℃。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述pH 5.5-10。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述pH7.0。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述温度为30-60℃。

20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述温度为50-55℃。

21.如权利要求13－15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在所述多肽与木聚糖或含有木聚糖的物质混合物中还加入调节所述多肽的酶活性的添加物，所述添加物选自K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺的物质。

22.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，在所述多肽与木聚糖或含有木聚糖的物质混合物中还加入调节所述多肽的酶活性的添加物，所述添加物选自K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺或在添加至底物后可水解形成K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺或Co²⁺的物质。

23.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1－5中任一项所述的多肽以及食品学或工业上可接受的载体。