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CN101120086A - 用于肿瘤治疗的黄病毒复制子结构 - Google Patents

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CN101120086A
CN101120086A CNA2006800050678A CN200680005067A CN101120086A CN 101120086 A CN101120086 A CN 101120086A CN A2006800050678 A CNA2006800050678 A CN A2006800050678A CN 200680005067 A CN200680005067 A CN 200680005067A CN 101120086 A CN101120086 A CN 101120086A
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replicon
cancer
flavivirus
cell
animal
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CNA2006800050678A
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A·祖尔比尔
A·A·赫罗梅赫
Original Assignee
University of Queensland UQ
Queensland Institute of Medical Research QIMR
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Publication date
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Abstract

本申请提供用于运载好表达粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子以有利于肿瘤治疗的基于黄病毒复制子的结构。特别地，根据本发明，复制子结构编码含有在NS2A非结构蛋白中存在一个或多个突变的库京病毒复制子，其诱导增强细胞的IFN水平，其协同增强重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子运载。该结构以DNA、RNA或包装成VLP形式在动物的肿瘤内或肿瘤周围给药，用于治疗和/或预防治疗肿瘤或癌症，所述的肿瘤或癌症例如黑色素瘤、肺癌、子宫颈癌、肺上皮细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、上皮癌和间皮瘤。

Description

用于肿瘤治疗的黄病毒复制子结构
技术领域
本发明涉及一个基于黄病毒复制子的表达结构，其用于运载和表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。更特别的，本发明涉及用于运载和表达GMCSF以治疗肿瘤的基于库京(Kunjin)病毒复制子的表达结构。
背景技术
GMSCF是一个可以用于治疗癌症的有潜在价值的细胞因子。例如，当把转染后能表达重组GMCSF的B16黑色素瘤细胞用放射线辐射后注射给裸鼠可以作为活的全细胞疫苗。这些被免疫的小鼠可以得到保护，经受住随后B16肿瘤细胞的攻击。这些起初为预防疾病而进行的小鼠实验为人类癌症治疗的试验提供了相同的策略。
接种分泌GMCSF的辐射后黑色素瘤细胞疫苗可以通过募集树突状细胞和巨噬细胞来提高肿瘤抗原的提呈从而增强宿主的免疫反应。这导致癌症特异的CD8T细胞被诱导，而CD8T细胞可以攻击癌细胞(Dranoff，2003，Oncogene 22 3188-92)。这种全细胞免疫的策略是复杂的，它需要产生和接种活的转染后肿瘤细胞系作为疫苗给病人(Ellem等，1997，Cancer Immunol Immunother.44 10-20)。大量的疫苗形式已经被研究，揭示了GMCSF的特性(Chang等，2004，Hematology 9 207-15)。
在这些方法中，潜在的最大利用领域是直接的肿瘤内和/或近肿瘤注射病毒载体，其能够感染癌症细胞和/或周围的细胞并引起这些细胞产生重组GMCSF。这些方法不需要体外产生细胞并且已经显示了一些对许多不同癌症进行肿瘤治疗的前景。(Triozzi等，Int J Cancer.200428；Yang等，2003，Cancer Res.63 6956-61；Parkinson等，2003，Prostate 56 65-73；Pan等，2004，Cancer Immunol Immunother.5317-25).
虽然前景光明，但目前的系统在治疗肿瘤上并不能使人信赖。因此，这个领域的许多人正在通过寻求和其它抗癌形式的协同作用来达到改善肿瘤治疗的目的。然而，这些方法在反复试验的基础上被典型地采用，所以一个有预见性的科学就仍然需要出现。
发明内容
发明目的
本发明的目的是提供一个改良的肿瘤治疗体系，在该体系中利用了GMCSF的运载。
发明人最近已经发现利用黄病毒复制子表达结构进行GMCSF的运载在GMCSF介导的肿瘤治疗中是具有独特的效果，其中黄病毒复制子表达结构不只局限于库京病毒复制子病毒结构。更为特别的是，包括在非结构蛋白的复制子编码中含有突变的结构的库京病毒复制子疗效是尤其明显的，所述非结构蛋白的复制子编码例如，但不局限于NS2A，这很可能是通过诱导增加IFNα/β和/或其它炎症因子的分泌水平，并与重组的GMCSF协同作用来达到增强肿瘤治疗效果的目的。
因此，本发明广义的涉及(is broadly directed)GMCSF的运载，利用了诸如但不局限于库京病毒复制子结构的黄病毒复制子结构，用于预防或治疗肿瘤或癌症。
在第一方面，本发明提供了一个黄病毒复制子结构，包含一个核苷酸编码序列：
(i)一个不能产生感染病毒的黄病毒复制子；和
(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
黄病毒复制子的结构可以是RNA或DNA形式。
在一个首选的实施方案中，核苷酸序列编码一个在所述复制子的一个非结构蛋白中有一个或多个氨基酸突变、缺失或替代的黄病毒复制子。
优选的所述的非结构蛋白选自NS2A、NS2B、NS3、NS4A或NS4B。
优选的所述的在黄病毒非结构蛋白中一个或多个的氨基酸突变、缺失或替代是选自：
(I)非结构蛋白NS2A第30位丙氨酸突变为脯氨酸；和
(II)非结构蛋白NS2A第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸或谷氨酸。
本发明也涵盖在所述复制子的一个或多个各自的非结构蛋白中有一个或多个其它氨基酸突变、缺失或替代；与野生型黄病毒复制子编码的非结构蛋白相比，在动物细胞中，这些突变、缺失或替代增强诱导IFNα/β或其它致炎(炎症前)细胞因子或化学因子。
在一个优选的实施方案中，黄病毒复制子结构编码库京病毒复制子。
在第二个方面，本发明提供包括第一个方面的黄病毒复制子结构连接到一个或多个调节序列的表达结构。
优选的是，在一些情况下表达结构是DNA，一个或更多的调节序列包含启动子。
在实施方案中，尽管对其没有限制，表达结构是一个在体外转录黄病毒复制子编码RNA的DNA结构，启动子可以是SP6或T7启动子。
在实施方案中，表达结构是在动物细胞中表达的DNA结构，启动子在所述细胞中是适合操纵的以利于黄病毒复制子编码RNA在所述动物细胞中的表达。
在第三个方面，本发明提供一个表达系统包含：
(i)根据第二个方面提到的DNA或RNA表达结构；和
(ii)能够用所述包装细胞表达一个或多个蛋白，其有利于促进所述表达载体或结构包装成一个黄病毒样颗粒(VLPs)的包装结构。
在(i)中优选的表达结构是RNA。
虽然通过包装细胞产生的VLP优选利于黄病毒复制子编码RNA体外转录，但是可选实施方案涵盖DNA表达结构，这个结构是用来转染包装细胞以产生VLPs。依照这个可选的方案，在包装细胞中，启动子是适合操纵以利于包装细胞表达黄病毒复制子编码的RNA。
在这个方面优选的形式中，在(ii)中的包装体系包含一个可调节的启动子，例如一个四环素调节的启动子。
在一个特别优选的形式中，包装结构包含一个可调节的启动子，启动子连到一个编码黄病毒结构蛋白翻译产物的核苷酸序列，其包括C蛋白、prM蛋白和E蛋白。
在第四方面，本发明提供了一个黄病毒样颗粒(VLP)，包括第一方面的RNA形式的复制子结构。
在第五方面，本发明提供了包括第三方面的表达系统的包装细胞。
在第六方面，本发明提供了一个药物组合物，该组合物包含第一方面的RNA复制子结构，第二方面的DNA表达结构或第四方面的黄病毒样颗粒(VLP)，同时还有药学上可接受的载体、稀释液或赋形剂。
在第七方面，本发明提供了在动物中预防或治疗肿瘤或癌症的方法，所述的方法包括给动物服用第一方面的RNA复制子结构、第二方面的DNA表达结构或第四方面的黄病毒样颗粒(VLP)，以减小、阻滞、消除或治愈所述动物的肿瘤或癌症的步骤。
优选的所述的方法包括肿瘤内或肿瘤周围给予药物组合物的步骤。
可以理解，本发明的方法可以和至少一种其它的肿瘤或癌症治疗方法联合应用，其他方法例如但不局限于肿瘤或癌症的免疫治疗或癌症疫苗。
在第八方面，本发明提供了已经分离的细胞，它是从根据第七方面处理的动物中获得的。
优选的分离细胞是免疫细胞，比如抗原提呈细胞、淋巴细胞或髓细胞或其它动物免疫系统组分的细胞。
在一个特定的实施方案中，分离的细胞是抗原提呈细胞，比如树突状细胞。
在另一个特定的实施方案中，分离的细胞是淋巴细胞，比如肿瘤特异的T淋巴细胞。
可以理解，这些细胞可能在肿瘤的过继免疫治疗中有着独特的功效。
依照前述方面，动物包括人、家畜、伴侣动物、家禽和其它商业上重要的动物，没有额外限制。
优选的动物是哺乳动物。
更优选的动物是人。
根据本发明可以被治疗的肿瘤或癌症的非限定实施例包括黑色素瘤、肺癌、子宫颈癌、肺上皮细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、上皮癌和间皮瘤，没有额外限制。
贯穿整个说明书，除非另外说明，“包括”、“包含”和“含有”用于指包括而不是排除，所以一个指定的整数或整数群组可能包括一个或更多个其它未指定的整数或整数群组。
附图说明
图1.Kaplan Meier生存图。B16肿瘤建立在一组C57BL6小鼠(除了对照组n＝8，n＝6/组)。0天、1天、2天、6天、7天或8天，采用瘤内/瘤旁周注射(i.t./p.t)处理肿瘤。无处理(对照组)，RPMI 1640/10％FCS(培养基对照)，KUN VLP对照或KUN VLP GMCSF。
图2.和图1显示相同实验的生长曲线
图3.Kaplan Meier生存图
图4.图3显示的相同实验的生长曲线。曲线终止于组内第一只动物的肿瘤达到10×10从而被淘汰出来的那一天。
图5.Kaplan Meier生存图。处理终止在第9天。
图6.和图5显示相同实验的生长曲线。曲线终止于组内第一只动物的肿瘤达到10×10从而被淘汰出来的那一天，除外KUN VLP GMCSF+KUN VLP mpt组，这组没有动物被选出来，或者在33天前被选出来。在组内第一只动物被选出来的时候，要记录每组中无可见肿瘤动物的数量，除外KUN VLP GMCSF+KUN VLP mpt组，这组中没有动物被选出并且在33天时也无可见肿瘤。
图7.(A)有或无瘤内/周注射KUN VLP GMCSF处理的sc AE17肿瘤的平均体积的生长曲线。(B)在第9天停止处理时的Kaplan Meier生存图。
图8.(A)有或无瘤内/周注射KUN VLP GMCSF处理的sc MC38肿瘤的平均体积的生长曲线。(B)在第9天停止处理时的Kaplan Meier生存图。
图9.(A&B)处理(第一组小鼠M1-M4；A)和未处理(第二组小鼠M1-M5；B)的sc TUBO肿瘤的单个肿瘤体积的生长曲线。(C)KaplanMeier生存图。TUBO肿瘤建立在balb/c小鼠群组(实验组4只，对照组5只)。从0天到第9天，瘤内/周注射Kun VLP GMCSF或者不注射(对照)处理肿瘤。
图10.(A)有或无瘤内/周注射KUN VLP GMCSF处理sc 4T1肿瘤的平均体积的生长曲线。(B)Kaplan Meier生存图。
图11.通过用KUN GMCSF RNA转染BHK细胞生产GMCSF。
图12.在感染野生型和NS2A突变KUN病毒的A549细胞中检测IFN-βmRNA和分泌型IFN-α/β。(A)Northern blot杂交分析感染MOI＝1的编码野生型NS2A(wtNS2A)的KUN病毒或MOI＝3的编码第30丙氨酸突变为脯氨酸的NS2A(NS2A/A30P)的KUN病毒24小时的A549细胞。所用探针针对KUN RNA、IFN-βmRNA以及β-肌动蛋白mRNA是特异的。(B)生物学分析培养相同的感染24小时A549细胞的液体培养基。新的A549细胞在收集的液体培养基里培养24小时，然后用0.5MOI的塞姆利基森林病毒病毒(SFV)感染细胞。IFN-α/β产物用SFV感染细胞病理效应的保护程度来评估，并且通过参照已知生物学活性的IFN-2α(Sigma生产)产生的保护作用来计算。
具体实施方式
本发明源自，至少是部分源自本发明者对IFNα/β的认识，IFNα/β是先天免疫和过继免疫系统的纽带并且细胞的和/或分泌的IFNα/β与重组GM-CSF的协同作用可以引起树突状细胞的募集和激活。
更为特别的是，库京病毒的VLPs包括库京病毒复制子包含结构，这个结构编码GMCSF并且含有NS2A的突变，当在小鼠瘤内注射库京病毒VLPs8到10天可引起肿瘤生长阻滞。对照肿瘤在这个时间段内生长快速，需要对这些动物实行安乐死。
虽然不希望被任何特定的理论束缚，但是本发明家们相信库京病毒复制子包含载体诱导的IFNα/β可能与重组的GMCSF协同引起树突状细胞的募集和激活，这有利于阻滞肿瘤生长。
额外起作用的因素可能是分泌的其它细胞因子或化学因子，还有描述过的库京复制子的持久的非细胞病变特性，再加上它们能够通过已经被转染细胞的复制把遗传物质传给子细胞的能力。后者的特性可能促进GMCSF的持续释放。
更特别的是，在非结构蛋白如NS2A中有突变的库京复制子似乎可以诱导增强细胞内IFNα/β的水平，依照本发明IFNα/β与重组GMCSF的运载有协同作用。
黄病毒复制子构建
本发明一方面提供一个黄病毒的复制子结构，其包含的核苷酸序列编码：
(i)不能产生具有感染能力病毒的黄病毒复制子；和
(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
另一个方面，本发明提供了表达结构，其包含前述的复制子结构可操作连接启动子和一个或多个其它调控序列。
因此本发明提供核酸结构可以用来促进GMCSF蛋白的表达，比如为了肿瘤治疗的目的。
这里用的术语“核酸”指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA、DNA，包括cDNA和基因组DNA。
“蛋白质”指氨基酸的聚合体。氨基酸可包括本领域已知的天然(例如：遗传编码的)、非天然的、D型和L型氨基酸。
“肽”是少于50个氨基酸的蛋白。
“多肽”是含有50个或更多氨基酸的蛋白。
编码GMCSF的核苷酸序列可编码任何形式的GMCSF，可以帮助、增加、加强或促进动物的特别是人的肿瘤治疗。
对于人的肿瘤治疗，所述的核苷酸序列优选编码人的GM-CSF蛋白，这也能被理解。
本发明也涵盖具有生物学活性的GMCSF蛋白片断和/或GM-CSF蛋白的变体的核苷酸编码序列。
合适地，GM-CSF生物学活性的片段和/或变体有至少25％，优选至少50％，更优选至少有75％或者再优选至少80％、90％、95％或100％的全长或野生型GM-CSF的生物学活性。
合适地，GM-CSF的变体至少有75％，优选至少80％，更优选至少85％或者再优选至少90％、95％或98％的序列与野生型GM-CSF序列的同一性。
序列的同一性可以通过本领域已知的常用的BLASTP和CLUSTALW程序检测。
在这里用的“黄病毒属(flavivirus)”和“flaviviral”都指黄病毒科，属于黄病毒属的成员，包括65个或更多相关的病毒种。典型的黄病毒很小，是包膜RNA病毒(直径大约45nm)，具有包括单一糖蛋白E的包膜。其它结构蛋白有命名为C(核心蛋白)和M(膜样蛋白)的蛋白。单链RNA具有感染性，典型的特点是分子量大约4×106、5’端有m7G帽子，但3’端没有多聚腺苷酸尾；它的作用为单一的信使。黄病毒可感染许多脊椎动物，并且很多可以被节肢动物如扁虱和蚊子传播。有一个单独的黄病毒群被认为含有未知载体(NKV)。
特别地，黄病毒非限定的例子是西尼罗病毒，包含NY99株、库京病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、蒙大拿蝙蝠脑白质炎病毒、尤苏它病毒、圣路易斯脑炎病毒和Alkhurma病毒。
西尼罗病毒亚群将库京病毒作为它的一个亚型有些争议。不过，根据本说明库京病毒和西尼罗病毒被认为是不同的黄病毒。
虽然本发明首先使用库京病毒复制子表达结构作为例子，但是这里所描述的发明原则可以延伸到其它黄病毒复制子包含的结构，这是涵盖在本发明中的。
本发明也涵盖从一个特殊的黄病毒衍生的黄病毒复制子结构，其可被包装成另外特定的黄病毒的VLPs。在这方面，在下文中的数据证明VLPs包括一个西尼罗病毒复制子结构的库京病毒。
被本发明所涵盖的库京病毒复制子包括任何可衍生自库京病毒RNA的自我复制组分，就象在下文中所描述的，例如：国际出版物WO99/28487，国际出版物WO03/046189和Varnavski等，2000，J.Virol.744394-4403。
就象通常用在这里的一样，黄病毒复制子衍生自黄病毒或其它黄病毒来源。因此，在这个说明的正文中“编码黄病毒复制子的核苷酸序列”是DNA或RNA序列，包含来自黄病毒复制子的或至少其一部分的对复制有效的序列信息，但不能产生有传染性的病毒。
例如，就象本领域技术人员理解的那样，本发明所指的以DNA为基础的结构包含一个复制子RNA的DNA拷贝，它互补或衍生自所述的复制子RNA。
适合地，黄病毒复制子具有复制能力，但“不能产生具有传染性的病毒”。这就意味着不论是整体还是部分黄病毒复制子不能表达一个或更多的结构蛋白，它们是用于病毒包装的。一个详细的关于库京黄病毒复制子修饰后不能进行病毒包装的描述在国际公开WO99/28487中描述。
在一个优选的实施方案中，黄病毒复制子还包括：
(i)5’和3’非翻译区(UTR)序列和分别编码C蛋白前20个氨基酸(C20)和E蛋白最后22个氨基酸(E22)的序列；和
(ii)编码非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的核苷酸序列。
在一个更优选的实施方案中，与野生型黄病毒复制子相比较，被复制子编码的一个或多个所述的非结构蛋白包括的氨基酸序列突变、缺失或替代在哺乳动物细胞中可以增加IFNα/β的诱导。
所述的优选非结构蛋白选自NS2A、NS2B、NS3、NS4A或NS4B。
在一个特定的实施方案中，库京NS2A蛋白的第30位丙氨酸被脯氨酸代替。
在另一个特定的实施方案中，库京NS2A蛋白的第101位天冬酰胺被天冬氨酸或谷氨酸代替。
这也可以被理解为每一个上述突变或替换可以分别出现或联合出现在本发明的一个黄病毒复制子中。
本发明也涵盖在所述的复制子的一个非结构蛋白中一个或多个其它氨基酸突变、缺失或替代，这些突变、缺失或替代在动物细胞中比野生型黄病毒复制子，增强对IFNα/β的诱导。
根据本发明，“表达结构”包括可操纵的连接到一个或多个调节序列的第一方面的黄病毒复制子结构。
根据本发明的一个实施方案，表达结构是在哺乳动物细胞中的有利于重组GMCSF蛋白或其中有生物学活性片段表达的RNA结构。
根据本发明的另一个实施方案，表达结构是在哺乳动物细胞中的有利于黄病毒复制子RNA从DNA结构转录从而在哺乳动物细胞中促进重组GMCSF蛋白或其中的有生物学活性片段表达的DNA结构。
在另外一个实施方案中，表达结构是在体外促进黄病毒复制子结构RNA从DNA结构转录的DNA结构。
在另外一个实施方案中，表达结构是在包装细胞中促进黄病毒复制子结构RNA从DNA结构转录从而促进包装细胞VLPs生成的DNA结构。
根据本发明，表达结构还包括一个或多个其它调节核苷酸序列。这些调节序列包括但不只限于启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、用于插入一个或多个异源核酸的限制性内切酶位点、口蹄疫病毒2A自身蛋白酶位点、多聚腺嘌呤序列和其它序列，比如：丁型肝炎病毒核糖体(HDVr)的反基因组序列，其可以保证转录的终止和3’末端的精确切割。
本发明的一个DNA表达结构适宜包含一个可操纵的连接到黄病毒复制子结构的启动子。
“可操作地连接”指所述的启动子被安置以起始、调节或另外控制在体外或细胞内编码所述的黄病毒复制子和任何其它有利于RNA加工和蛋白表达的调节序列的RNA的转录。
优选的启动子在黄病毒复制子的5’端。
从DNA表达结构体外转录RNA的优选启动子是SP6启动子。
在动物细胞内(例如：哺乳动物细胞，如包装细胞系或随后的给动物治疗的细胞)从DNA表达结构的细胞内转录RNA的优选启动子是细胞巨化病毒(CMV)启动子。然而，其它在哺乳动物细胞中已知的有活性的启动子也涵盖在里面，包括SV40启动子、人延长因子α启动子和α晶状体球蛋白启动子，而没有额外限制。这也是可以理解的。
病毒包装和VLP产生
根据本发明第三个提到的方面，黄病毒表达体系包括：
(i)根据第二个方面，在包装细胞里包括一个可操纵启动子的DNA或RNA表达结构；和
(ii)能够表达一个或多个蛋白以利于包装所述的表达载体或结构进入黄病毒样颗粒(VLPs)的包装结构。
可以理解在某些广泛的实施方案中，黄病毒包装可以通过以下途径达到：
(a)用一个编码GMCSF的黄病毒表达结构和一个提供病毒包装所需要的结构蛋白的包装结构瞬时转染宿主细胞(就象上文中提到的)；
(b)用一个编码GMCSF的黄病毒病毒结构瞬时转染宿主细胞，而该宿主细胞已经被稳定转染了一个提供病毒包装所需要的结构蛋白的包装结构。
关于(a)，表达和包装结构可以被共转染或在一个时间段分别转染以达到最佳的VLP产生。
关于上述，“转染”方便地用作瞬时和稳定介导外源遗传物质进入宿主细胞的一般术语。
可以用本领域常用的方法转染包装细胞，比如磷酸钙沉淀，电转、脂质体(lipofectamine)、脂质体(lipofectin)和其它亲脂性试剂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖法、微粒子轰炸技术和显微注射法。
虽然不排除，但在(i)中优选的黄病毒表达结构是在体外从本发明的DNA表达结构转录并转染到包装细胞的RNA。
虽然包装细胞产生的VLP优选利用黄病毒复制子编码的在体外转录的RNA，但是可选的实施方案涵盖可以转染入包装细胞以产生VLPs的DNA表达结构。根据这个可选的实施方案，在包装细胞中启动子是可操纵的以促进包装细胞中黄病毒复制子编码RNA的表达。
在一个特定优选的形式中，本发明涵盖包装细胞瞬时转染一个编码GMCSF的黄病毒表达结构RNA，在这个包装细胞中已经稳定转染了一个可以提供病毒包装所需要的结构蛋白的包装结构。
包装结构的优选启动子是可调节启动子，比如：四环素调节启动子。
在一个特定优选的形式中，包装结构包含了一个可调节启动子，它可操纵地连接到一个编码黄病毒结构蛋白翻译产物(包括C蛋白、prM蛋白和E蛋白)的核苷酸序列。
为了产生稳定转化的包装细胞，包装结构还包括了一个选择性标记基因。本领域熟知的选择性标记基因包括新霉素转移酶和嘌呤霉素N-乙酰转移酶，而没有额外限制。
关于调节结构蛋白表达的包装结构可参考国际公开WO2004/108936，它提供了一个关于产物和利用稳定转染的包装细胞调节库京病毒结构蛋白表达的详细说明，这个文献通过参考而合并入本申请。
在产生VLPs时，可选择其它载体用于黄病毒结构蛋白的表达，这是可以被理解的。例如，所述的包装结构可以衍生自甲病毒，比如：塞姆利基森林病毒(SFV)或辛德比斯病毒(SIN)；或者衍生自DNA病毒，比如：腺病毒、禽痘病毒或牛痘病毒。
SFV衍生的包装结构实施例可见于国际公开WO99/28487和国际公开WO03/046189。
合适的包装细胞可以是任何的真核细胞系，这些细胞能够胜任蛋白表达和VLP产生所需要的转录、翻译和转录后和/翻译后加工或修饰。用于核酸转染和蛋白表达的典型的哺乳动物细胞实施例是COS、Vero、CV-1、BHK21、HEK293、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NIH3T3、Jurkat、WEHI 23、HeLa MRC-5或B16黑色素瘤细胞，而没有额外限制。
优选的包装细胞是BHK21细胞。
药物组合物和肿瘤或癌症治疗方法
本发明的一个特定方面是关于在治疗和/或预防性治疗肿瘤时使用编码GMCSF的黄病毒复制子结构。
根据本发明的用于运载GMCSF编码复制子结构的药物组合物包括：
(i)包含RNA的VLPs；
(ii)本发明的DNA表达结构体外转录的“裸”RNA；或
(iii)本发明的能够在体内直接转录RNA的质粒DNA表达结构。
根据本发明，优选的但不是排除的本发明的药物组合物是含有RNA的VLPs。
药物组合物可以进一步的含有药学上可接受的载体、稀释液或赋形剂。
“制药学上可接受的载体、稀释液或赋形剂”是指固体或液体的装填剂、稀释液或胶囊物质，它们可以被安全地用于系统给药。根据特定的给药途径，本领域常用的多种载体均可以被使用。这些载体是选自包括糖、淀粉、纤维素和它的衍生物、麦芽、白明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸缓冲液溶液、乳化剂、等渗生理盐水和盐，如矿物酸的盐包括氢氯化物、溴化物和硫酸盐、有机酸如醋酸、丙酸盐和丙二酸和无热原质的水。
Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)是一本描述了制药学可接受的载体、稀释液和赋形剂的参考书，通过参考被合并在这里。
任何安全的给药途径可能被用来将本发明的合成物应用给病人。例如，口服、直肠、注射、舌下、口腔、静脉、关节内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、侧脑室、透皮和类似可被应用的。肌肉和皮下注射可被理解，如，用于免疫治疗组分、蛋白质疫苗和核酸疫苗的给药。
剂型包括片剂、分散剂(disperions)、悬液、注射剂、溶液、糖浆、片剂、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴剂和类似的形式。这些剂型也可包括注射或植入控制释放装置，这些是特别为此或其它照这样额外做的修改的植入形式而设计的。治疗因子的控制释放可被包被所影响，例如：疏水聚合物包括丙烯酸树脂、腊状物、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。另外，控制释放可被其它聚合物基质、脂质体和/或微球体所影响。
本发明的药物组合物适合口服或肠胃外给药，可以以不连续的单位如每个包含本发明一个或多个治疗制剂的预先给定剂量的胶囊、小袋或片剂而出现，可以是粉状或粒状或溶液或悬在一个水溶液里、非水液体、水包油的乳状或油包水的液体乳。这些成分可以用任何药物学方法制备但所有的方法包括就如上面所描述的那样用由一个或更多必须成分组成的载体把一个或多个制剂联合在一起的步骤。一般地，成分是均一的和紧密的把本发明的制剂和液体载体或细微分割的固体载体或两者都有，混和在一起的，然后如果需要再把产物变成所想要得到的形状。
上述成分可以根据适合剂量配方的方式给药，并且剂量是药物学上有效的。在本发明的正文中，给病人的给药剂量应该是在一个合适的时间段内在一个病人体内足够产生有益的反应的。给药的剂量依赖于治疗对象的年龄、性别、体重和其中一般的健康状态，也依赖于施治者判断的一些因素。
在关于在体内运载本发明的“裸”DNA或RNA表达结构的实施方案中，药物学上可接受的载体、稀释液或赋形剂可以是促进RNA或DNA传递的因子。
通过实施例，脂质体制剂，例如，但不限于，阳离子脂质体已经被成功地用于在体内运载核酸。为了这个目的一个更新的基于合成的阳离子双磷脂酰甘油类似物(CCLA)的阳离子脂质体已经被发展出来。
在一个优选的形式中，本发明的药物组合物是通过肿瘤内和/或在肿瘤旁侧给药。
根据本发明可以治疗的肿瘤和癌症包括黑色素瘤、肺癌、子宫颈癌、肺上皮细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、上皮癌和间皮瘤，没有额外的限制。
本发明的治疗方法和成分可单独使用或作为一个附属的治疗与其它治疗联合，如化疗、放疗、免疫治疗如癌症疫苗或细胞因子治疗。
在这点上，下文提供了一个实施例，其中库京VLP编码一个包括卵清蛋白的抗原决定簇SIINFEKL(SEQ ID NO：1；Anraku等，2002，上述)的鼠类多面体(KUN VLP mpt)可以和编码GMCSF的库京病毒VLP有协同作用。
Wei等，2005，Cell.Mol.Immunol.2 351的参考文献提供了一篇关于目前癌症免疫原治疗的综述，可为本领域技术人员提供一个指导。
在一个特定的实施方案中，本发明涵盖了根据本发明在体外转染一个白体固有的肿瘤细胞使这个肿瘤细胞表达免疫活性细胞因子(典型地，但不唯一是GMCSF)并且根据本发明用转染的细胞作为一个抗肿瘤的疫苗(如Ellem等描述的那样，1997，上述)和库京复制子GMCSF治疗可有协同作用。
在另一个特定的实施方案中，本发明期望分离树突状细胞或者它们的骨髓前体的，转染带有肿瘤抗原的上述树突状细胞以及对所述的动物给药转染后的树突状细胞(例如：Metharom等，2005，Cell.Mol.Immunol.2281)并同时联合本发明中的库京复制子GMCSF治疗。
在另外又一个实施方案中，本发明预期用于库京复制子GMCSF治疗联合其它免疫为基础的治疗，比如：在体外产生的自体同源性肿瘤和/或癌症特异性T细胞采集回输，或者抗肿瘤抗体(例如：赫赛汀(herceptin))。
根据上述各方面，动物包括人，家畜，伴侣动物，家禽和任何其它又商业重要性的动物，没有额外限制。这是可以理解的。
优选动物是哺乳动物。
更优选动物是人类。
本发明提供分离的细胞，它来源于根据本发明处理的前述的动物，这也是可以理解的。
虽然并不希望被局限在任何特定的理论中，但是与未经处理动物来源的细胞比较，从根据本发明处理的动物中分离得到的免疫细胞预期可能已经改良了免疫治疗的特性。
在一个特定的实施方案中，分离的细胞是抗原提呈细胞，诸如：树突状细胞或者树突状细胞前体，比如，CD14+的单核细胞，例如Curti等，2004年在Leuk.Lymphoma 45，1419-1428中所描述的；和/或Babatz等2003年在J Hematother Stem Cell Res.12 515-23中所描述的。
根据这个实施方案，可以预期的是，树突状细胞或者它们的骨髓前体从依照本发明处理的动物中分离，上述带有肿瘤抗原的树突状细胞被转染和转染的树突状细胞给药于前述动物，从而导致减少，阻滞，消除或治愈所述动物的肿瘤。
在另一个特定的实施方案中，分离的细胞是肿瘤特异性T淋巴细胞，包括CD8+或CD4+CTL或/和辅助性T细胞，适合于过继免疫治疗，比如Yamaguchi等2003年在Hum Cell 16 183-9中所描述的。
本发明很容易被理解和付诸实施，所以本领域技术人员可直接进行如下非限制的实施例。
实施例
表达鼠源GMCSF的KUN复制子的构建和复制子VLPs的产生
库京复制子Sp6KUNrep4是用SP6启动子置换库京复制子pKUNrep4的CMV启动子而得到(Varnavski等，2000，J Virol 74，4394-4403)，因此RNA可以在体外依赖SP6RNA聚合酶而进行转录。Sp6KUNrep4编码嘌呤霉素选择性标记，口蹄疫病毒(FMDV)2A自身蛋白酶(autoprotease)，可以在N端切割插入的外源蛋白质，还包含脑炎心肌炎病毒(EMCV)内在核糖体插入位点(IRES)，其可以起始RNA复制必需的KUN非结构基因的翻译。内在核糖体插入位点(IRES)也顾及了外源基因终止密码子的存在，以确保外源蛋白质产物有一个确定的C末端。
为了进一步增强细胞中持久的RNA复制，在Sp6KUNrep4中引入细胞系可适应的突变。这个特定的突变是将NS2A蛋白的第30位丙氨酸改变为脯氨酸，这样的结果导致了仓鼠BHK21细胞系和人类HEK293及HEp-2细胞系中持久复制效率提高约15-50倍(Liu等，2004，J Virol78，12225-35)。另外，第30位丙氨酸突变为脯氨酸与野生型NS2A蛋白比较，降低了NS2A在IFN-β启动子驱动的转录诱导中的抑制活性。带有NS2A突变(第30位丙氨酸突变为脯氨酸)的KUN复制子被命名为Sp6KUNrep4PP。
鼠源GMCSF序列以质粒pEF-BOS/GMCSF(从美国波士顿Dana-Farber癌症研究所Glenn Dranoff处获得)为模板，用高保真Pfu DNA聚合酶PCR扩增得到。所用正向引物(5’-GCGGACGCGTATGCCCACGAGAGAAAGGCTAAG-3’；SEQ ID NO：2)，反向引物(5，-GCGACGCGTCATTTTTGGACTGGTTTTTTGC-3’；SEQ ID NO：3)，含有MluI限制性酶切位点(粗体)。GM-CSF的PCR产物(无起始密码子，有可信的终止密码子)被克隆到库京复制子Sp6KUNrep4PP的MluI限制性位点，从而产生Sp6KUNrep4PP-GMCSF。
包含Sp6KUNrep4PP-GMCSF复制子RNA的病毒样颗粒(VLPs)就像前边已经描述过的一样(Harvey等，2004，J Virol 78，531-538和国际申请PCT/AU2004/000752)，在四环素诱导的BHK包装细胞系(tetKUNCprME)中产生。
简言之，Sp6KUNrep4PP-GMCSF复制子RNA以线性化质粒DNA为模板，在SP6RNA聚合酶的催化下进行体外转录，可以通过电转的方法转染至tetKUNCprME包装细胞中。去除培养基中的强力霉素将诱导KUN结构蛋白C，prM和E的表达，这些蛋白可以将复制子RNA包装到VLPs中。反复收集培养液最多10天，并用VERO细胞检测Sp6KUNrep4PP-GMCSF VLP的滴度。
KUN GMCSF VLP肿瘤免疫疗法1
简介
为了评估KUN VLP GMCSF基因治疗的潜在价值，用同系基因型的C57BL/6小鼠建立B16肿瘤模型，采用瘤内/瘤周(i.t./p.t.)的方式注射。对照组包括用于制备和储存VLPs的培养基和不包含PP突变或者没有外源基因插入的空VLP。
方法
将106B16黑色素瘤细胞皮下移植到C57BL/6小鼠剃毛后的背部。在T25培养瓶中，将达到对数生长期的B16细胞用胰酶消化，洗涤一次，用100μl含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞并注射。4天后，将动物随机分成4组。
1.对照组中，i.t./p.t注射40-50μl含5％胎牛血清的RPMI1640培养基；
2.在KUN VLP对照组中，i.t./p.t 40-50μl*KUN VLP空载体(Sp6KUNRep6LAEmpty)，注射剂量：1.7×106IU/肿瘤；
3.在KUN VLP GMCSF组中，i.t./p.t 40-50μl*KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)，注射剂量：1.7×106IU/肿瘤；
4.无任何处理的对照组。
*由于不同批次的VLPs之间滴度具有轻微差异，调整体积使剂量保持一致。
按照Anraku等描述的方法监测肿瘤(Anraku等，2002，J Virol.76 3791-9)。分别在0、1、2、6、7和8天进行处理。
结果
接种(表示处理的第1天，或者处理开始后0天)后4天，第一组的肿瘤平均体积为12.2±SD5.1，第二组为10.5±1.6，第三组为13.2±6，第四组为12.6±3.8。将肿瘤生长到100平方毫米(mm2)时处死动物，并且动物存活显示在Kaplan Meier曲线(图1)。KUN VLPGM-CSF处理组和Sp6KUNRep6LAEmpty处理组(Log Rank统计p＝0.0061)以及未处理组(Log Rank统计p＝0.0037)相比较，动物的存活明显增加。各对照组之间没有明显差别。
结论
在B16模型中，KUN VLP GM-CSF i.t./p.t.处理具有明显的抗癌治疗活性。
KUN GMCSF VLP肿瘤免疫疗法2
简介
为了进一步评估KUN VLP GMCSF基因治疗的潜在价值，将KUN VLPGMCSF通过瘤内/瘤周(i.t./p.t.)注射于建立在同系基因型C57BL/6小鼠中的B16肿瘤，持续时间从0天至第9天，共10天。对照组包括含有PP突变并带有β-半乳糖苷酶标记的KUN VLP和未处理组。
方法
将106B16黑色素瘤细胞皮下移植到C57BL/6小鼠剃毛后的背部。在T25培养瓶中，将达到对数生长期的B16细胞用胰酶消化，洗涤一次，用100μl含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞并注射。2天后，将动物随机分成下列几组。
1.KUN VLP GMCSF组，i.t./p.t.注射40-50μl KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)，1.7×106IU/肿瘤/天，从0天至第9天，共10天，每天注射(n＝7)。
2.KUN VLP对照组，i.t./p.t.注射40-50μl KUN VLP β-半乳糖苷酶(Sp6KUNRep3PPβgal)，1.7×106IU/肿瘤/天，从0天至第9天(n＝6)。
3.未处理对照组(n＝8)
按照Anraku等描述的方法监测肿瘤(Anraku等，2002，上述)。
结果
Kaplan-Meier生存图显示每天用KUN VLP GMCSF处理，连续10天，与未处理组(log rank统计p＝0.0002)或者KUN VLP对照组(logrank统计p＝0.0021)相比可明显降低死亡时间(图3)。与未处理组比较，VLP处理对照组也有一些保护作用(log rank统计p＝0.005)(图3)。
截至每组中第一个动物被处死时为止，所绘制的生长曲线显示KUNVLP GMCSF处理组的肿瘤生长明显减慢(图4)。
最使人惊讶的可能是7只KUN VLP GMCSF处理的动物中有4只，在27-29天时，检测不到了B16肿瘤，并且直到最近的检测结束时(35天)仍然没有检测到。
结论
在B16模型中，KUN VLP GMCSF处理具有明显的抗癌治疗活性。连续10天的注射不仅引起肿瘤生长的延缓，而且在57％的动物中，肿瘤发生退化，在停止治疗18-20天后肿瘤检测不到。CpG寡核苷酸的联合给药(Sharma等，2003，Biotechnol Lett.25 149-53；Sfondrini等2004，Cancer Immunol Immunother.53 697-704)不能改善治愈率(数据未发表)。
对照VLP也可提供一些保护，可能是通过IFNα/β诱导所致。
KUN GMCSF VLP肿瘤免疫疗法3
简介
为了进一步评估KUN VLP GMCSF基因治疗的潜在价值，将KUN VLPGMCSF通过瘤内/周(i.t./p.t.)注射于建立在同系基因型C57BL/6小鼠中的B16-OVA肿瘤(B16细胞稳定表达卵清蛋白；Anraku等，2002，上述)，持续时间从0天至第9天，共10天。对照组包括含有PP突变并带有β-半乳糖苷酶标记的KUN VLP和一个未处理组。为了确定KUN VLPGMCSF基因治疗是否能与治疗性疫苗协同作用，用可编码鼠多面体(polytope)的KUN VLP(KUN VLP mpt)免疫另一个实验组，其具有卵清蛋白表位，SIINFEKL(Anraku等，2002，上述)。当预防性给药时，KUN VLP mpt能够延缓B16-OVA的生长(Anraku等，2002，上述)；当用作治疗时，其也能减慢B16-OVA的生长并延缓动物死亡(数据未发表)。
方法
将106B16黑色素瘤细胞皮下移植到C57BL/6小鼠剃毛的的背部。在T25培养瓶中，将达到对数生长期的B16细胞用胰酶消化，洗涤一次，用100μl含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞并注射。3天后，将动物随机分成下列几组。
1.KUN VLP GMCSF组，i.t./p.t.注射40-50μl KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)，1.7×106IU/肿瘤/天，从0天至第9天，共10天，每天注射(n＝6)。
2.与1相同，但是在0，5和9天时，腹腔注射(i.p.)107pfu KUN VLPmpt。
3.KUN VLP对照组，i.t./p.t.注射40-50μl KUN VLPβ-半乳糖苷酶(Sp6KUNRep3PPβgal)，1.7×106IU/肿瘤/天，从0天至第9天(n＝6)。
4.未处理对照组(n＝8)
按照Anraku等描述的方法监测肿瘤(Anraku等，2002，上述)。
结果
Kaplan-Meier生存图显示每天用KUN VLP GMCSF处理，连续10天，与未处理组(log rank统计p＝0.0004)或者KUN VLP对照组处理动物(log rank统计p＝0.0005)相比可明显降低死亡时间(图5)。与未处理组比较，VLP处理对照也有一些保护作用(log rank统计p＝0.001)(图5)。
对于KUN VLP GMCSF治疗组，额外给予KUN VLP mpt处理结果导致6/6动物的肿瘤退化并且在最近的检测(33天)中发现全部为无瘤状态。相反，KUN VLP GMCSF组只有4/6的动物在这个时间点处于无瘤状态，有一只在30天时淘汰的动物。
截至每组中第一个动物被处死时为止，所绘制的生长曲线也显示KUN VLP GMCSF处理组的肿瘤生长明显减慢(图6)。
结论
在B16-OVA模型中，KUN VLP GMCSF治疗具有明显的抗癌活性。连续10天的注射不仅引起肿瘤生长的延缓，而且在67％的动物中，肿瘤发生退化。该数据也强烈提示，KUN VLP GMCSF治疗与基于KUN的癌症疫苗(KUN VLP mpt)联合治疗可以得到协同的抗癌活性，6/6的动物在33天时处于无瘤状态。这种协同效应产生的原因：(i)来源于SIINFEKL特异的CD8T细胞的CD8T细胞抗癌活性的增强，(ii)肿瘤炎症的增强，这是由于KUN VLP mpt免疫和KUN VLP GMCSF靶向感染细胞引起KUN复制子特异T细胞的增加所致，和/或(iii)被KUN特异T细胞引起的肿瘤引流树突状细胞(tumour draining dendritic cells)产生。我们已经发现KUN VLP免疫能够诱导T细胞对这种复制子的特异响应(数据未报道)。
VLP对照也有明显的保护作用，可能是通过IFNα/β诱导所致。
间皮瘤的KUN GMCSF VLP免疫疗法
简介
为了确定KUN GMCSF VLP治疗在其它肿瘤细胞系中是否有效，应用一个间皮瘤细胞系AE17进行实验(Jackaman等，2003，J Immunol.171 5051-63)。
方法
将1.4×106AE17细胞/小鼠皮下注射到C57BL/6J小鼠剃毛的背部。2天后带瘤小鼠被分成两组，每组6只。
第一组，KUN VLP GMCSF组，从0天至第7天，按照每天1.5×106IU/肿瘤的剂量，i.t./p.t注射50μl KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep5PPGMCSF)；然后，在第8天和第9天注射相同剂量的KUNVLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)。
第二组，无处理组。
结果
将AE17肿瘤进行KUN VLP GMCSF的瘤内/周注射处理可以明显(p＜0.01)降低这些肿瘤的生长速度(图7A)。图7B显示相同实验的Kaplan Meier曲线。
结论
这个实验提示KUN VLP GMCSF治疗将是一个有效的治疗间皮瘤的方法。
结肠癌的KUN GMCSF VLP免疫疗法
简介
为了确定KUN GMCSF VLP治疗在其它肿瘤细胞系中是否有效，应用结肠癌细胞系MC38(Hikino等，2004，Anticancer Res.24 1609-15；Tirapu等，2004，Int J Cancer.110 51-60)进行实验。
方法
将4×105MC38细胞/小鼠皮下注射到C57BL/6J小鼠剃毛的背部。2天后带瘤小鼠被分成两组。
第一组(n＝6)，KUN VLP GMCSF组，从0天至第7天，按照每天1.5×106IU/肿瘤的剂量，i.t./p.t注射50μl KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep5PPGMCSF)；然后，在第8天和第9天注射相同剂量的KUNVLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)。
第二组(n＝5)，无处理组。
结果
将建立的MC38肿瘤进行KUN VLP GMCSF的i.t./p.t注射处理可以明显(p＜0.01)降低这些肿瘤的生长速度(图8A)。图8B显示相同实验的Kaplan Meier曲线。
结论
这个实验提示KUN VLP GMCSF治疗将有效的治疗结肠癌。乳腺腺癌(mammary adenocarcinoma)的KUN GMCSF VLP免疫疗法
简介
为了确定KUN GMCSF VLP治疗在其它肿瘤细胞系中是否有效，应用乳腺腺癌细胞系TUBO(Varadhachary等，2004，Int J Cancer.111398-403)进行实验。
方法
将1×105TUBO细胞/小鼠皮下注射到Balb/c小鼠剃毛的背部。7天后带瘤小鼠被分成两组。
第一组(n＝4)，KUN VLP GMCSF组，从0天至第3天，按照每天1.5×106IU/肿瘤的剂量，瘤内/周注射50μl KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep5PPGMCSF)；然后，从第4天至第8天注射相同剂量的KUNVLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)。
第二组(n＝6)，未处理组。
结果
将TUBO肿瘤进行KUN VLP GMCSF的瘤内/周注射处理可以明显(p＜0.01)延缓50％肿瘤的生长速度(图9A，第一组：白色正方形和黄色三角形)。图9C显示相同实验的Kaplan Meier曲线。
结论
这个实验提示KUN VLP GMCSF治疗将有效的治疗乳腺癌。
乳腺癌的KUN GMCSF VLP免疫疗法
简介
为了确定KUN GMCSF VLP治疗在其它肿瘤细胞系中是否有效，应用乳腺癌细胞系4T1进行实验。
方法
将4×105 4T1细胞/小鼠皮下注射到Balb/c小鼠剃毛的背部。2天后带瘤小鼠被分成两组。
第一组(n＝6)，KUN VLP GMCSF组，从0天至第4天，按照每天1.5×106IU/肿瘤的剂量，瘤内/周注射50μl KUN VLP GMCSF(Sp6KUNrep4PPGMCSF)；然后，在第7天至第8天注射相同剂量的KUNVLP GMCSF。
第二组(n＝5)，无处理组
结果
将4T1肿瘤进行KUN VLP GMCSF的瘤内/周注射处理可以明显(p＜0.01)降低这些肿瘤的生长(图10A)。图10B显示相同实验的Kaplan Meier曲线。
结论
这个实验提示KUN VLP GMCSF治疗能有效的治疗乳腺癌。
通过KUN复制子RNA产生GMCSF
为了确认通过KUN RNA产生GMCSF，其随后用于生成KUN GMCSFVLPs，采用电转的方法(25uF，1500V，2脉冲10秒间隔)转染RNA至BHK细胞中(参见：Khromykh等，1998，J Virol.725967-77)，或者转染(电转条件：960uF，250V，1脉冲)至B16细胞中。按照每孔1.25×105个细胞接种到24孔板中，在标准培养基中培养3天。应用IFA检测发现，大约10-30％的细胞被转染。然后，用鼠源的GMCSFELISA分析试剂盒(BD Biosciences)检测两孔或三孔平行的上清；生物学活性用连续稀释的样品和GMCSF/IL-3应答FDCP1-I细胞株来检测(Naparstek等，1986，Blood 67 1395-1403)。
在图11中，两个实验显示了转染KUN GMCSF RNA的BHK或B16细胞在3天产生了10-100ng/ml的GMCSF。值得注意的是，在这个过程中细胞发生了分裂，转染KUN的细胞分裂生成两个含有KUN RNA的子细胞，而这些子细胞也会产生GMCSF(Varnavski等，1999，Virology255 366-75)。
通过野生型KUN病毒和含有NS2A第30位丙氨酸突变为
脯氨酸的KUN病毒诱导IFN-βmRNA转录和产生分泌型IFN-a/β
为了比较野生型和突变型NS2A KUN病毒在诱导IFN-βmRNA转录中的效率，用MOI＝1的野生型KUN病毒和MOI＝3的NS2A突变型KUN病毒感染A549细胞24小时，从这些细胞中提取总RNA进行针对特异的IFN-βmRNA、KUN RNA和β-肌动蛋白mRNA探针的Northern blot杂交。结果发现在感染NS2A突变型KUN病毒的细胞中，IFN-βmRNA的量大约是感染野生型KUN病毒细胞的6倍(见：图11A)。注意：在检测时(24小时，图12A)，对于野生型和突变型病毒，KUN RNA的总量时相似的。通过生物测定方法检测IFN-α/β在感染细胞培养液中的存在(Antalis等，1998，J Exp Med.，187 1799-811)，结果显示NS2A突变型KUN比野生型KUN诱导更多的IFN-α/β产生(图12B)。
感染野生型病毒的A549细胞培养液中有生物学活性的a/β-干扰素的检测灵敏度(参考IFN-α保护50％感染SFV的A549细胞的检测灵敏度，～7.8IU/ml)是零，但是在感染NS2A突变型病毒的细胞培养液中有生物学活性的IFN-α/β的检测灵敏度是～370IU/ml。这些结果证明了两个主要的新发现：(i)IFN-α/β的诱导和分泌受野生型KUN病毒的抑制，和(ii)将NS2A蛋白第30位的丙氨酸单突变为脯氨酸可以增加IFN-α/β的诱导和分泌。
KUN复制子VLPs的肿瘤细胞感染
制备编码β-半乳糖苷酶的VLPs重悬在含有10％胎牛血清和10mMHEPES的RPMI 1640中，分装成小份，保存在-70℃。将一组肿瘤细胞在盖玻片上过夜培养，再用300μl重悬在含2％胎牛血清和10mM HEPES的RPMI中的KUN VLP，相当于MOI＝10的Sp6KUNrep3PAβgal或Sp6KUNrep2LAEmpty感染这些细胞。将培养上述细胞的24孔板放在培养箱中培养，每隔1小时摇动一次。3小时后加入1ml培养基继续培养60小时。60小时之后，将细胞简单洗涤一下，并在冷丙酮/甲醇(50/50)中固定2分钟。然后，将盖玻片洗涤、封闭，再用兔抗KUN NS3多克隆抗血清标记(1/500使用)，接着再与FITC标记的二抗反应。用荧光显微镜观察这些细胞，在20倍物镜下的10个有代表性的视野中，分别用相差计数未感染的细胞和用荧光计数感染的细胞，最后计算百分比。
表1显示KUN复制子VLPs能够感染多种不同的癌细胞，因此我们推测编码像GMCSF一样的细胞因子的KUN复制子VLPs将能够在治疗更广泛的不同种癌症中得到利用。
我们也有证据表明生长在塑料培养皿中比生长在玻璃培养皿中的细胞有更高的感染效率(见表1)。例如：生长在塑料培养皿中的B16细胞感染MOI＝10的上述病毒可以达到超过40-70％的感染效率。
用包含New York 99西尼罗病毒品系的
复制子RNA的库京VLPs感染肿瘤细胞
如在先Shi等在2002.Virology 296 219-33中描述的那样，P.-Y.Shi(USA)从西尼罗病毒中分离出一个全长的NewYork克隆中制备了一个结构区缺失超过92％的西尼罗复制子结构。电转WN复制子RNA到包装细胞系tetKUNCprME(Harvey等，2004，上述)，然后于电转后第四天去除强力霉素诱导KUN结构基因C、prM和E的表达，从而导致产生7×107IU/ml的分泌型VLPs。因此，包含WN复制子RNA的VLPs被库京结构蛋白C、prM和E包装。在平行实验中电转KUN复制子RNARNAleu导致产生可比较的VLPs的滴度(108IU/ml)(Harvey等，2004，上述)。
以多重性感染等于10的包含库京或WN复制子RNAs的VLPs感染Lewis肺癌和TC-1肿瘤细胞。用与库京NS3蛋白有交叉反应的抗体的免疫荧光分析感染效率。表2显示用包含MN复制子RNA的VLPs感染的效率高于含库京复制子RNA的VLPs在细胞中感染的效率。
因此，我们设想构建编码GMCSF的西尼罗复制子可能提高一些肿瘤细胞的体外感染效率。KUN VLPs在体外感染肿瘤细胞的能力和KUNGMCSF VLP在体内有效治疗癌症的能力之间可能有相关性。我们进一步设想肿瘤细胞中复制子结构能被筛选而用于复制，并且从而提供突变，这些突变可以改善复制子系统在体内肿瘤细胞中产生GMCSF的能力。
这个说明贯彻始终的目的是描述本发明优选的实施方案，而不把本发明限制于任何一个实施方案或特殊的特征集合中。不同的变化和修饰可用于在这里描述和说明的实施方案，而没有背离本发明广泛的精神和发明范围。
在本说明中涉及的所有计算机程序、运算法则、专利和科学著作通过参考以其全部合并在本申请。
表1
癌症细胞系                            感染细胞的百分率
Vero/BHK                              80-100％
B16黑色素瘤细胞系                     10.5-25％
Lewis肺癌细胞系                       2.9-9.1％
HeLa宫颈癌细胞系                                         32％
A549肺上皮细胞癌细胞系                                   16.1％
DU145前列腺癌细胞系                                      2.8％
MCF7乳腺癌细胞系                                         2.9％
ACHN人肾癌细胞系                                         66％
Colo205结肠癌细胞系                                      1.1％
TC-1上皮细胞系(E6，E7，c-Ha-ras)                         4.2-6.9％
AE17间皮瘤细胞系                                         11-17％
表2
肿瘤系                  被KUN复制子VLPs                  被WN复制子VLPs
                        感染的百分率                     感染的百分率
Lewis肺癌               3.1，9.1，2.9(三次实验).         48
TC-1                    4.2.6.9                          ＞30

Claims (47)

1.黄病毒复制子结构，其包含编码下述内容的核苷酸序列：
(i)不能产生有感染性病毒的黄病毒复制子；和
(ii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
2.权利要求1的黄病毒复制子结构，其中该核苷酸序列编码的黄病毒复制子含有所述的复制子的非结构蛋白的一个或多个氨基酸的突变，缺失或替代，与野生型黄病毒复制子编码的非结构蛋白相比其在动物细胞中增强IFNα/β的诱导。
3.权利要求2的黄病毒复制子结构，其中所述的非结构蛋白选自NS2A、NS2B、NS3、NS4A或NS4B。
4.权利要求2的黄病毒复制子结构，其中在所述黄病毒非结构蛋白中所述的一个或多个氨基酸的突变，缺失或替代选自：
(I)NS2A的第30位丙氨酸突变为脯氨酸；和
(II)NS2A的第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸或谷氨酸。
5.权利要求1的黄病毒复制子结构，其编码库京病毒复制子。
6.包含权利要求1的黄病毒复制子结构可操纵地连接一个或多个调节序列的表达结构。
7.权利要求6的表达结构，其中所述核苷酸序列编码黄病毒复制子，其具有在所述的复制子的非结构蛋白中的一个或多个氨基酸的突变，缺失或替代，与野生型黄病毒复制子编码的非结构蛋白相比其增强IFNα/β的诱导。
8.权利要求7的表达结构，其中所述非结构蛋白选自NS2A、NS2B、NS3、NS4A或NS4B。
9.权利要求8的表达结构，其中在所述黄病毒非结构蛋白中所述的一个或多个氨基酸突变，缺失或替代选自：
(I)NS2A的第30位丙氨酸突变为脯氨酸；和
(II)NS2A的第101位天冬酰胺突变为天冬氨酸或谷氨酸。
10.权利要求6的表达结构，其编码库京病毒的复制子。
11.权利要求6的表达结构，其为DNA形式，其中所述的一个或多个的调节序列包括启动子。
12.权利要求11的表达结构，其促进黄病毒复制子编码RNA的体外转录。
13.权利要求12的表达结构，其中该启动子是T7或SP6启动子。
14.权利要求6的表达结构，其促进黄病毒复制子编码RNA在动物细胞中的转录。
15.权利要求10的表达结构，其中该启动子是CMV启动子。
16.权利要求10的表达结构，其中该启动子是可调节的启动子。
17.权利要求16的表达系统，其中该可调节启动子是四环素调节的启动子。
18.一个表达系统，包括：
(i)根据权利要求6的表达结构；和
(ii)能够表达一个或多个蛋白的包装结构，该蛋白促进所述表达载体或结构被所述包装细胞包装成黄病毒样颗粒(VLPs)。
19.权利要求18的表达系统，其中该表达结构是RNA形式。
20.权利要求19的表达系统，其中该RNA已经在体外转录。
21.权利要求18的表达系统，其中该表达结构是DNA形式。
22.权利要求18的表达系统，其中该表达结构还包含在所述包装细胞内的可操纵的启动子，该启动子通过包装细胞促进黄病毒复制子编码RNA的表达。
23.权利要求22的表达系统，其中该启动子是可调节启动子。
24.权利要求23的表达系统，其中该可调节启动子是四环素调节启动子。
25.权利要求23的表达系统，其中该可调节启动子可操纵地连到编码黄病毒结构蛋白翻译产物的核苷酸序列上，其中该黄病毒结构蛋白翻译产物包括C蛋白、prM蛋白和E蛋白。
26.黄病毒样颗粒(VLP)，包括权利要求1的RNA形式的复制子结构。
27.一个包装细胞，包括权利要求18的表达系统。
28.权利要求27的包装细胞，其是BHK21细胞。
29.一个包含VLP的药物组合物，包括权利要求1的复制子结构和药学上可接受的载体、稀释液或赋形剂。
30.一个药物组合物，包含权利要求14的表达结构和药学上可接受的载体、稀释液或赋形剂。
31.一个预防或治疗处理动物的肿瘤或癌症的方法：所述方法包括把权利要求1的黄病毒复制子表达结构给药于动物，从而因此减小、阻滞、消除或治愈所述动物的肿瘤或癌症的步骤。
32.权利要求31的方法，其中该黄病毒复制子结构是RNA形式。
33.权利要求32的方法，其中该黄病毒复制子结构是在VLP中。
34.权利要求31的方法，其中该黄病毒复制子结构编码库京病毒复制子。
35.一个预防或治疗处理动物的肿瘤或癌症的方法：所述方法包括把权利要求14的黄病毒表达结构给药于动物，从而因此减小、阻滞、消除或治愈所述动物的肿瘤或癌症的步骤。
36.权利要求35的方法，与至少一个其它以免疫为基础的治疗方法联合使用。
37.权利要求35的方法，其中该黄病毒表达结构编码库京病毒复制子。
38.权利要求31或35的方法，其包括用黄病毒复制子结构或黄病毒表达结构在肿瘤内或在肿瘤周围给药的步骤。
39.权利要求31或35的方法，其中所述动物是哺乳动物。
40.权利要求38的方法，其中该哺乳动物是人。
41.权利要求35的方法，其中所述的肿瘤或癌症是黑色素瘤、肺癌、子宫颈癌、肺上皮细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、上皮癌和间皮瘤。
42.分离的细胞，其来自根据权利要求31或35处理的动物。
43.权利要求42的分离的细胞，其是抗原提呈细胞或淋巴细胞。
44.过继免疫治疗动物的肿瘤或癌症的方法，包括把权利要求43分离的细胞给药于所述动物，从而因此减小、阻滞、消除或治愈所述动物的肿瘤或癌症的步骤。
45.权利要求44的方法，其中所述的动物是哺乳动物。
46.权利要求45的方法，其中所述的哺乳动物是人。
47.权利要求44的方法，其中所述的肿瘤或癌症是黑色素瘤、肺癌、子宫颈癌、肺上皮细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、上皮癌和间皮瘤。
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