JP2008530032A - 腫瘍治療のためのフラビウイルスレプリコン構築物 - Google Patents

Abstract

腫瘍治療を促進するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の送達および発現用の、フラビウイルスレプリコンを基にした発現構築物が提供される。特に、該レプリコン構築物は、本発明により送達された組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と共働する細胞内ＩＦＮのレベルを増強する、非構造タンパク質ＮＳ２Ａに１以上の突然変異を有するクンジンウイルスレプリコンをコードする。該構築物は、腫瘍またはがんを治療的および／または予防的に処置するために、動物に腫瘍内投与されても腫瘍周辺投与されてもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡとして、またはＶＬＰ内にパッケージされて投与されてもよい。腫瘍またはがんは例えば、黒色腫、肺癌、子宮頸癌、肺上皮性悪性腫瘍、前立腺がん、乳がん、腎臓癌、結腸がん、上皮性がんおよび中皮腫である。

Description

本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の送達および発現のための、フラビウイルスレプリコンを基にした発現構築物に関する。特に、本発明は、腫瘍治療のためのＧＭＣＳＦの送達および発現のための、クンジン（Ｋｕｎｊｉｎ）ウイルスのレプリコンを基にした発現構築物に関する。

ＧＭＣＳＦは、がんの治療に有用な可能性のあるサイトカインである。例えば、トランスフェクションにより組換えＧＭＣＳＦを発現するようになったＢ１６メラノーマ細胞を、放射線照射してナイーブなマウスに注射すると、全細胞の生ワクチンとして使用することが可能であった。そのようなワクチン接種を受けたマウスは、その後Ｂ１６による攻撃から保護された。これら初期のネズミでの予防的な実験は、同じ原理を使用したヒトのがん治療の治験に結びついた。

ＧＭＣＳＦを分泌するように組換え改変され、放射線照射されたメラノーマ細胞を用いたワクチン接種は、動員された樹状細胞およびマクロファージによる腫瘍抗原提示を向上させることにより、宿主の免疫反応を増強する。その結果、がんを攻撃するがん特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が誘導される（非特許文献１）。そのような全細胞ワクチン接種の手法は、トランスフェクションされた生きた腫瘍細胞株をワクチン剤として作製して患者に接種する必要があるため複雑である（非特許文献２）。ＧＭＣＳＦの特性を利用するワクチン療法についてかなりの数が調査されている（非特許文献３）。

これらのアプローチのうち、最も実用性の高い可能性のある分野は、がん細胞に感染するかまたは細胞を取り囲むかのうち少なくともいずれかが可能で、該細胞に組換えＧＭＣＳＦを産生させることが可能なウイルスベクターを、腫瘍内および腫瘍周辺のうち少なくともいずれか一方に直接注射することであった。そのようなアプローチは、生体外（ｅｘ
ｖｉｖｏ）での細胞の作製を必要とせず、多くの異なるがんの腫瘍治療においてある程度の見込みを示すものであった（非特許文献４〜７）。

見込みはあるものの、現行のシステムは確実に腫瘍を治療することが可能であるようには見えない。従って、本分野では多くの人が他の抗がん療法を用いた相乗作用を利用することにより腫瘍治療を改善しようと努力している。しかしながらこれらのアプローチは、予測の科学が未だ出現していないように、一般には「試行錯誤」方式で試みられてきた。
ドラノフ（Ｄｒａｎｏｆｆ）、２００３年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 第２２巻、ｐ．３１８８−９２ エレム（Ｅｌｌｅｍ）ら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．第４４巻、ｐ．１０−２０ チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、２００４年、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ 第９巻、ｐ．２０７−１５ トリオッツィ（Ｔｒｉｏｚｚｉ）ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００４年、ｐ．２８ ヤン（Ｙａｎｇ）ら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． 第６３巻、ｐ．６９５６−６１ パーキンソン（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ）ら、２００３年、Ｐｒｏｓｔａｔｅ 第５６巻、ｐ．６５−７３ パン（Ｐａｎ）ら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． 第５３巻、ｐ．１７−２５

したがって本発明は、ＧＭＣＳＦの送達を利用する腫瘍治療システムを改善することを目的とする。

本発明者らは、最近、フラビウイルスレプリコンの発現構築物、例えば限定するものではないがクンジンウイルスレプリコンの発現構築物、を使用したＧＭＣＳＦの送達は、ＧＭＣＳＦを介した腫瘍治療において特に効果的であることを発見した。とりわけ、クンジンウイルスレプリコンを含む構築物であって、レプリコンにコードされた非構造タンパク質、例えば限定するものではないがＮＳ２Ａに突然変異を有する構築物は特に効果的である。これは恐らく、組換えＧＭＣＳＦとの相乗作用で腫瘍治療を増強する、ＩＦＮα／βの分泌およびその他の炎症性サイトカインのレベルを増強する能力によるものである。

したがって、本発明は、概して、フラビウイルスレプリコンを含む構築物、例えば限定するものではないがクンジンウイルスレプリコン構築物を使用する、腫瘍またはがんの予防的または治療的処置を目的としたＧＭＣＳＦの送達に関する。

第１の態様では、本発明は、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンと；
（ｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）と
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるフラビウイルスレプリコン構築物を提供する。

該フラビウイルスレプリコン構築物の形態は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。
好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、前記レプリコンの非構造タンパク質に１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換を有するフラビウイルスレプリコンをコードする。

好ましくは、前記非構造タンパク質は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂから成る群から選択される。
好ましくは、フラビウイルスの非構造タンパク質中の前記１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換は、
（Ｉ）３０位のアラニンのプロリンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ；および
（ＩＩ）１０１位のアスパラギンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ
から成る群から選択される。

本発明はさらに、前記レプリコンのそれぞれの非構造タンパク質のうち１つ以上における、１つ以上のその他のアミノ酸突然変異、欠失または置換であって、動物細胞中において、野生型フラビウイルスのレプリコンにコードされた非構造タンパク質と比較してＩＦＮα／βまたはその他の炎症誘発性サイトカインまたはケモカインの誘導を増強するものについても意図している。

好ましい実施形態では、フラビウイルスレプリコン構築物はクンジンウイルスのレプリコンをコードする。
第２の態様では、本発明は、１つ以上の調節配列に作動可能なように連結された第１の態様のフラビウイルスレプリコン構築物を含む発現構築物を提供する。

発現構築物がＤＮＡである場合、１つ以上の調節配列はプロモータを含むことが好ましい。
発現構築物が、フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡをインビトロで転写するためのＤＮＡ構築物である実施形態では、プロモータはＳＰ６プロモータまたはＴ７プロモータでよいが、これらに限定されるものではない。

発現構築物が動物細胞での発現用のＤＮＡ構築物である実施形態では、プロモータは、フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡの前記動物細胞による発現を促進するために、前記動物細胞において適切に作動可能なものである。

第３の態様では、本発明は、
（ｉ）第２の態様によるＤＮＡまたはＲＮＡの発現構築物；および
（ｉｉ）パッケージング構築物であって、パッケージング細胞によって前記発現ベクターまたは構築物がフラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中にパッケージングされるのを促進する１つ以上のタンパク質を発現可能な構築物
を含む発現系を提供する。

好ましくは、（ｉ）の発現構築物はＲＮＡである。
パッケージング細胞によるＶＬＰの産生には、フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡがインビトロ転写されたものが用いられることが好ましいが、代替の実施形態では、ＶＬＰ産生用のパッケージング細胞をトランスフェクションするためのＤＮＡ発現構築物が企図される。この代替実施形態によれば、プロモータは、フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡのパッケージング細胞による発現を促進するために、パッケージング細胞中で適切に作動可能である。

この態様の好ましい形態では、（ｉｉ）のパッケージングシステムは、テトラサイクリン制御性プロモータなどの、制御可能なプロモータを含む。
特定の好ましい形態では、パッケージング構築物は、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を含むフラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された、制御可能なプロモータを含む。

第４の態様では、本発明は、ＲＮＡの形態の第１の態様のレプリコン構築物を含むフラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。
第５の態様では、本発明は、第３の態様の発現系を含むパッケージング細胞を提供する。

第６の態様では、本発明は、第１の態様のＲＮＡレプリコン構築物、第２の態様のＤＮＡ発現構築物、または第４の態様のフラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、医薬として許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤と合わせて含んでなる医薬組成物を提供する。

第７の態様では、本発明は、動物の腫瘍またはがんを予防的または治療的に処置する方法を提供し、該方法は、第１の態様のＲＮＡレプリコン構築物、第２の態様のＤＮＡ発現構築物、または第４の態様のフラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を動物に投与することにより、前記動物の腫瘍またはがんを縮小、停止、除去、その他処置する工程を含む。

好ましくは、前記方法は、医薬組成物を腫瘍内または腫瘍周辺に投与する工程を含む。
当然のことであるが、本発明の方法が少なくとも１つの他の腫瘍治療法またはがん治療
法との併用療法として使用されてもよい。前記他の治療法は例えば腫瘍またはがんの免疫療法またはがんのワクチンであるが、これらに限定はされない。

第８の態様では、本発明は、第７の態様によって処置された動物から得られる単離細胞を提供する。
好ましくは、単離細胞は、抗原提示細胞、リンパ細胞、骨髄細胞、あるいは動物の免疫系の構成要素であるその他の細胞のような、免疫細胞である。

ある特定の実施形態では、単離細胞は樹状細胞のような抗原提示細胞である。
別の特定の実施形態では、単離細胞は腫瘍特異的Ｔリンパ球のようなリンパ細胞である。

当然のことであるが、そのような細胞は腫瘍の養子免疫療法において特に有効な可能性がある。
前述の態様によれば、動物には、ヒト、家畜、コンパニオン・アニマル、家禽、および商業上重要なその他の動物が含まれる。

好ましくは、動物は哺乳動物である。
より好ましくは、動物はヒトである。
本発明によって処置されうる腫瘍またはがんの非限定的な例としては、黒色腫、肺癌、子宮頸癌、肺上皮性悪性腫瘍、前立腺がん、乳がん、腎臓癌、結腸がん、上皮性がんおよび中皮腫が挙げられるが、これらに限定はされない。

本明細書全体を通じて、別途記載のないかぎり、「含む、含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に使用され、その結果、指定された整数値または整数値群は１つ以上の他の指定されていない整数値または整数値群を含みうる。

本発明は、少なくとも部分的には、本発明者らが、自然免疫系と獲得免疫系との間を繋ぐものとしてのＩＦＮα／βの役割、ならびに細胞内ＩＦＮα／βまたは分泌ＩＦＮα／βのうち少なくともいずれか一方が組換えＧＭ−ＣＳＦとの相乗作用により樹状細胞の動員および活性化の両方を引き起こす能力を認識したことから始まっている。

より具体的には、ＧＭＣＳＦをコードし、かつＮＳ２Ａに突然変異を有するクンジンウイルスレプリコンを含む構築物を含んでなるクンジンウイルスＶＬＰは、該クンジンウイルスＶＬＰを８−１０日間腫瘍内注入されたマウスにおいて腫瘍の増殖を阻止した。対照の腫瘍はこの時間枠で急速に増殖し、動物を安楽死させる必要があった。

いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、このクンジンウイルスレプリコンを含むベクターによって誘導されたＩＦＮα／βが、組換えＧＭＣＳＦとの相乗作用により樹状細胞の動員および活性化の両方を引き起こし、その結果腫瘍の増殖阻止を促進すると考えている。

さらに別の要因は、他のサイトカインまたはケモカインの分泌、ならびに、よく言及されるようにクンジンウイルスレプリコンが永続的に非細胞変性性であること、加えてクンジンウイルスレプリコンがトランスフェクション細胞の複製後に生じるいずれの娘細胞へも遺伝物質を伝える能力でもありうる。後者の特徴は、ＧＭＣＳＦの持続的放出を促進しうる。

特に、ＮＳ２Ａのような非構造タンパク質に突然変異を有するクンジンウイルスレプリコンは、本発明によって送達された組換えＧＭＣＳＦと共働する高レベルの細胞内ＩＦＮα／βを誘導するようである。

フラビウイルスレプリコン構築物
本発明の１態様は、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することが可能でないフラビウイルスレプリコンと；
（ｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）と
をコードするヌクレオチド配列を含むフラビウイルスレプリコン構築物を提供する。

別の態様では、本発明は、作動可能なようにプロモータおよび１つ以上の他の調節配列に連結された前述のレプリコン構築物を含む発現構築物を提供する。
したがって、本発明は、腫瘍治療の目的などで、ＧＭＣＳＦタンパク質の発現を促進するために使用可能な核酸構築物を提供する。

本明細書中で使用されるように、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）を示す。
「タンパク質」は、アミノ酸重合体を意味する。アミノ酸には、当業者には良く知られているように、天然（つまり、遺伝的にコードされた）、非天然、Ｄ型およびＬ型のアミノ酸が含まれる。

「ペプチド」は５０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。
「ポリペプチド」は５０個以上のアミノ酸を有するタンパク質である。
ＧＭＣＳＦをコードするヌクレオチド配列は、動物、特にヒトにおいて腫瘍治療を支援、補強、増強、そうでなければ促進する任意の形態のＧＭＣＳＦをコードしうる。

したがって当然ながら、ヒトでの腫瘍治療については、前記ヌクレオチド配列はヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードすることが好ましい。
本発明はまた、生物学的に活性なＧＭＣＳＦタンパク質の断片またはＧＭ−ＣＳＦタンパク質のバリアントのうち少なくともいずれか一方をコードするヌクレオチド配列も企図する。

適切には、生物学的に活性なＧＭＣＳＦタンパク質の断片またはバリアントは、完全長または野生型ＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の活性を有する。

適切には、ＧＭ−ＣＳＦのバリアントは、野生型ＧＭ−ＣＳＦと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する。

配列同一性は、当技術分野で周知のＢＬＡＳＴＰおよびＣＬＵＳＴＡＬＷのようなプログラムによって便利に測定可能である。
本明細書で用いられるように、「フラビウイルス」および「フラビウイルスの」は、フラビウイルス科のフラビウイルス属のメンバーを指す。フラビウイルス属には６５以上の関連ウイルス種が含まれる。一般に、フラビウイルスは、単一の糖タンパク質Ｅを含むペプロマーを備えた小さなエンベロープ型ＲＮＡウイルス（直径約４５ｎｍ）である。他の構造タンパク質はＣ（コア）およびＭ（メンブレン状）と呼ばれる。一本鎖ＲＮＡは感染性であり、典型的には分子量約４×１０^６、５’末端にｍ７Ｇ「キャップ」を有し、３’末端にはポリ（Ａ）領域を持たず；唯一のメッセンジャーとして機能する。フラビウイル
スは広範囲の脊椎動物に感染する。また、多くはダニや蚊のような節足動物によって運ばれるが、フラビウイルスの個別のグループは未知のベクター（ＮＫＶ）を有することが示されている。

特に、フラビウイルスの非限定的な例は、ＮＹ９９株を含む西ナイルウイルス、クンジンウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、ウスツ（Ｕｓｕｔｕ）ウイルス、セントルイス脳炎ウイルスおよびフルマ（Ａｌｋｈｕｒｍａ）ウイルスである。

西ナイルウイルスのサブグループには、多少の論争はあるがサブタイプとしてクンジンウイルスが含まれる。しかしながら、本明細書では、クンジンウイルスおよび西ナイルウイルスは別個のフラビウイルスであるとみなされている。

本発明は主として、クンジンウイルスレプリコンを含む発現構築物を使用して例証されるが、本明細書に記述される発明の原理が他のフラビウイルスレプリコンを含む構築物に拡張可能であることが意図されている。

さらに、ある特定のフラビウイルスに由来するフラビウイルスレプリコン構築物が、別の特定のフラビウイルスのＶＬＰ中にパッケージされうることも意図されている。この点については、西ナイルウイルスレプリコン構築物を含有するクンジンウイルスＶＬＰを実証するデータを、本明細書中に後述する。

本発明によって意図されるクンジンウイルスレプリコンには、本明細書において以下に記述されるような、また例えば国際公開公報第９９／２８４８７号パンフレット、国際公開公報第０３／０４６１８９号パンフレットおよびファルナフスキー（Ｖａｒｎａｖｓｋｉ）ら、２０００年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７４巻、ｐ．４３９４−４４０３に記述されるようなクンジンウイルスＲＮＡから誘導可能な任意の自己複製要素が挙げられる。

本明細書において一般的に使用されるように、フラビウイルスレプリコンはフラビウイルスから誘導されるか、あるいはそうでなければフラビウイルスを起原とする。したがって、本明細書においては、「フラビウイルスレプリコンをコードするヌクレオチド配列」とは、フラビウイルスレプリコンまたは少なくともその一部分からの、複製するには十分であるが感染性ウイルスを産生することはできない配列情報を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ配列である。

例えば、当業者には理解されるように、本明細書で言及される本発明のＤＮＡ系構築物は、レプリコンＲＮＡのＤＮＡ複製物であって、前記レプリコンＲＮＡに相補的であるかまたは同ＲＮＡに由来するものを含む。

適切には、フラビウイルスレプリコンは、複製能力は有するが「感染性ウイルスを産生することができない」。このことは、該フラビウイルスレプリコンが、ウイルスのパッケージングに必要な１つ以上の構造タンパク質についてその全体または一部を発現することができないことを意味している。ウイルスのパッケージングを不能にするためにクンジンフラビウイルスレプリコンを改変する詳細については、国際公開公報第９９／２８４８７号パンフレットに記載されている。

好ましい実施形態では、フラビウイルスレプリコンはさらに
（ｉ）５’および３’非翻訳（ＵＴＲ）配列ならびにＣタンパク質の最初の２０アミノ酸（Ｃ２０）およびＥタンパク質の最後の２２アミノ酸（Ｅ２２）をそれぞれコードする配列；ならびに
（ｉｉ）非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５をコードするヌクレオチド配列
を含む。

さらに好ましい実施形態では、該レプリコンによってコードされる前記非構造タンパク質のうち１つ以上は、野生型のフラビウイルスレプリコンと比較して動物細胞中でのＩＦＮα／βの誘導を増強するアミノ酸配列突然変異、欠失または置換を含む。

好ましくは、前記非構造タンパク質は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂから成る群から選択される。
ある特定の実施形態では、クンジンウイルスのＮＳ２Ａタンパク質の３０位のアラニンがプロリンで置換される。

別の特定の実施形態では、クンジンウイルスのＮＳ２Ａタンパク質の１０１位のアスパラギンがアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換される。
当然のことであるが、上記の突然変異または置換の各々は、個々にあるいは組み合わせて本発明のフラビウイルスレプリコン中に存在しうる。

本発明はさらに、前記レプリコンの非構造タンパク質中の、野生型のフラビウイルスレプリコンと比較して動物細胞中でのＩＦＮα／βの誘導を増強する１つ以上の他のアミノ酸突然変異、欠失または置換をも意図している。

本発明によれば、「発現構築物」は、１つ以上の調節配列に作動可能なように連結された第１の態様のフラビウイルスレプリコンを含む。
本発明の１つの実施形態によれば、発現構築物は、哺乳動物細胞において、組換えＧＭＣＳＦタンパク質または生物学的に活性なその断片の発現を促進するＲＮＡ構築物である。

本発明の別の実施形態によれば、発現構築物はＤＮＡ構築物であって、哺乳動物細胞において該ＤＮＡ構築物からのフラビウイルスレプリコンＲＮＡの転写を促進することによって、該哺乳動物細胞における組換えＧＭＣＳＦタンパク質または生物学的に活性なその断片の発現を促進するＤＮＡ構築物である。

さらに別の実施形態において、発現構築物はＤＮＡ構築物であって、インビトロで該ＤＮＡ構築物からのフラビウイルスレプリコン構築物ＲＮＡの転写を促進するＤＮＡ構築物である。

さらになお別の実施形態では、発現構築物はＤＮＡ構築物であって、パッケージング細胞において該ＤＮＡ構築物からのフラビウイルスレプリコン構築物ＲＮＡの転写を促進することにより、該パッケージング細胞によるＶＬＰの産生を促進するＤＮＡ構築物である。

本発明によれば、発現構築物はさらに１つ以上の他の調節ヌクレオチド配列を含む。そのような調節配列としては、プロモータ、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、１以上の異種の核酸を挿入するための制限酵素切断部位、口蹄疫ウイルス２Ａオートプロテアーゼ部位、転写の終結および３’末端の正確な切断をそれぞれ確実にするポリアデニル化配列およびデルタ肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶｒ）の抗ゲノム配列のような他の配列が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明のＤＮＡ発現構築物は、フラビウイルスレプリコン構築物に作動可能なように連
結されたプロモータを適切に含む。
「作動可能なように連結された」または「作動可能なように接続された」とは、前記プロモータが、前記フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡ、ならびにＲＮＡプロセシングおよびタンパク質発現を促進する任意の他の存在する調節配列の、インビトロまたは細胞内での転写を、開始させ、調節し、あるいは、制御するように配置されていることを意味する。

好ましくは、プロモータはフラビウイルスレプリコンの５’側に配置される。
ＤＮＡ発現構築物からインビトロでＲＮＡを転写するための好ましいプロモータは、ＳＰ６プロモータである。

動物細胞（例えば、パッケージング細胞株あるいは動物への治療的投与後の細胞などの哺乳動物細胞）において、ＤＮＡ発現構築物からＲＮＡを細胞内転写するための好ましいプロモータは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータである。しかしながら、当然のことであるが哺乳動物細胞において活性を有する他の周知のプロモータ、例えば、限定するものではないが、ＳＶ４０プロモータ、ヒト伸長因子αプロモータおよびαクリスタリンプロモータなども意図されている。

ウイルスのパッケージングおよびＶＬＰ産生
本発明の上記第３の態様によれば、フラビウイルスの発現系であって、
（ｉ）パッケージング細胞において作動可能なプロモータを含む、第２の態様によるＤＮＡまたはＲＮＡの発現構築物と；
（ｉｉ）フラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中への前記発現ベクターまたは構築物のパッケージングを促進する１つ以上のタンパク質を発現可能なパッケージング構築物と
を含む発現系が提供される。

当然のことであるが、ある広い実施形態では、フラビウイルスのパッケージングは
（ａ）宿主細胞（本明細書において前述したような宿主細胞）を、ＧＭＣＳＦをコードするフラビウイルス発現構築物およびウイルスのパッケージングに必要な構造タンパク質を提供するパッケージング構築物を用いて、一過性トランスフェクションする工程；
（ｂ）宿主細胞を、ＧＭＣＳＦをコードするフラビウイルス発現構築物を用いて一過性トランスフェクションする工程であって、該宿主細胞が、ウイルスのパッケージングに必要な構造タンパク質を提供するパッケージング構築物により安定的にトランスフェクション済みであることを特徴とする工程
によって達成可能である。

（ａ）に関しては、発現構築物およびパッケージング構築物は同時トランスフェクションされてもよいし、あるいは最適なＶＬＰ産生を可能にする時間枠内で別々にトランスフェクションされてもよい。

上記に関して、「トランスフェクションされた」とは、宿主細胞内への外来遺伝物質の一時的（一過性）または安定的な導入を包含する一般的な用語として便宜的に使用されている。

パッケージング細胞のトランスフェクションは、当技術分野において周知の方法、例えばリン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）およびその他の脂肪親和性物質、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、微粒子銃およびマイクロインジェクションによって達成可能である。

好ましくは、特定するものではないが、（ｉ）のフラビウイルス発現構築物は、本発明のＤＮＡ発現構築物からインビトロで転写され、パッケージング細胞中にトランスフェクションされたＲＮＡである。

パッケージング細胞によるＶＬＰ産生には、インビトロで転写されたフラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡを利用することが好ましいが、代替実施形態では、ＶＬＰ産生用のパッケージング細胞をトランスフェクションするためのＤＮＡ発現構築物が意図されている。この代替実施形態によれば、プロモータは、パッケージング細胞によるフラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡの発現を促進するために、パッケージング細胞中で適切に作動可能である。

特に好ましい形態では、本発明は、ＧＭＣＳＦをコードするフラビウイルス発現構築物ＲＮＡを用いて、パッケージング細胞を一過性トランスフェクションすることを意図しており、この場合パッケージング細胞は、ウイルスのパッケージングに必要な構造タンパク質を提供するパッケージング構築物で安定的にトランスフェクション済みである。

好ましくは、パッケージング構築物のプロモータは、テトラサイクリン制御性プロモータのような制御性プロモータである。
特に好ましい形態では、パッケージング構築物は、フラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結された制御性プロモータを含み、前記翻訳産物はＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を含む。

安定的に形質転換されたパッケージング細胞を作製するために、パッケージング構築物はさらに選択可能な標識遺伝子を含む。選択可能な標識遺伝子は当技術分野において周知であり、ネオマイシントランスフェラーゼおよびピューロマイシンＮ‐アセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定はされない。

構造タンパク質を制御可能に発現するためのパッケージング構築物に関しては、国際公開公報第２００４／１０８９３６号パンフレットが参照される。同文献は、安定的にトランスフェクションされたパッケージング細胞によるクンジンウイルス構造タンパク質の産生および制御可能な発現の使用に関する詳細な開示を提供し、その全体は参照によって本願に組込まれる。

当然のことであるが、別例として、他のベクターがＶＬＰの産生においてフラビウイルス構造タンパク質の発現に使用されてもよい。例えば、前記パッケージング構築物が、アルファウイルス例えばセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）またはシンドビスウイルス（ＳＩＮ）、あるいはＤＮＡウイルス例えばアデノウイルス、鶏痘ウイルスまたは牛痘ウイルスに由来する場合も考えられる。

ＳＦＶ由来のパッケージング構築物の例は、国際公開公報第９９／２８４８７号パンフレットおよび国際公開公報第０３／０４６１８９号パンフレットに提供されている。
適切なパッケージング細胞は、タンパク質発現およびＶＬＰ産生に必要な、転写、翻訳および任意の転写後および／または翻訳後のプロセシングもしくは修飾を実施する能力のある任意の真核細胞株でよい。核酸のトランスフェクションおよびタンパク質発現に一般的に使用される哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＲＣ−５細胞およびＢ１６メラノーマ細胞であるが、これらに限定はされない。

パッケージング細胞はＢＨＫ２１細胞であることが好ましい。
医薬組成物ならびに腫瘍またはがん治療の方法
本発明の特定の態様は、腫瘍の治療的および／または予防的処置における、ＧＭＣＳＦをコードするフラビウイルスレプリコン構築物の使用に関する。

本発明による、ＧＭＣＳＦをコードするレプリコン構築物の送達用の医薬組成物は、
（ｉ）ＲＮＡを含有するＶＬＰ；
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ発現構築物からインビトロで転写された「裸の」ＲＮＡ；あるいは
（ｉｉｉ）インビボでＲＮＡを転写させることが可能な本発明のプラスミドＤＮＡ発現構築物
を含みうる。

好ましくは、しかし限定するものではないが、本発明の医薬組成物はＲＮＡを含有するＶＬＰを含む。
該医薬組成物は、医薬として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含みうる。

「医薬として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与において安全に使用可能な固体または液体の増量剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野において周知の様々な担体を使用可能である。これらの担体は、砂糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、多価アルコール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水、および塩類、例えば塩酸塩、臭化物および硫酸塩などの鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、およびマロン酸塩などの有機酸、ならびに発熱性物質を含まない水、からなる群から選択可能である。

医薬として許容可能な担体、希釈剤および賦形剤について記述する有用な参照文献は、レミングトンの薬剤学（Remington's Pharmaceutical Sciences ）（米国ニュージャージー州所在のマック出版社（Mack Publishing Co. ）、１９９１年）であり、同文献は参照によって本願に援用される。

本発明の組成物を患者に提供するために、任意の安全な投与経路を使用することができる。例えば、口腔内、直腸内、非経口、舌下、頬内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などが使用されうる。筋肉内注射および皮下注射は、例えば、免疫療法用組成物、タンパク質ワクチン剤および核酸ワクチン剤の投与に適切である。

剤形としては、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液、シロップ剤、トローチ、カプセル剤、坐剤、エアゾール剤、経皮パッチ剤などが挙げられる。これらの剤形はまた、制御放出用に特別設計された制御放出デバイス、あるいはこの様式でも作用するように修正された他の形態の移植物を、注入するかまたは埋め込むことも含みうる。治療薬の制御放出は、同治療薬を、例えば、アクリル樹脂、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなある種のセルロース誘導体などの、疎水性ポリマーで被覆することにより達成されうる。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアの使用により達成される場合がある。

経口投与または非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、各々が１以上の本発明の治療薬を所定量含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤のような個別の単位として、散剤または顆粒剤として、あるいは、水性液、非水性液、水中油型乳濁液または油中水型
乳濁液中の溶液または懸濁剤として提供されうる。そのような組成物は薬剤学の方法のうち任意の方法で調製可能であるが、いずれの方法も、１つ以上の上記治療薬を、１以上の必須成分を構成する担体と合わせる工程を含んでいる。一般に、組成物は、本発明の薬剤を、液体担体または微粉固体担体または両方とともに均一かつ十分に混合し、次いで、必要な場合は該生成物を所望の体裁へと成形することにより、調製される。

上記組成物を、剤型に適した方法で、かつ薬学的に有効であるような量で投与すればよい。患者に投与される用量は、本発明においては、適正な時間にわたり患者において有益な応答が達成されるのに十分でなければならない。投与される薬剤の量は、処置を受ける対象の年齢、性別、体重および健康状態など、また医師の判断に依存する要因に応じて変わりうる。

本発明の「裸の」ＤＮＡまたはＲＮＡ発現構築物のインビボ送達に関する実施形態において、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤は、ＲＮＡまたはＤＮＡの送達を特に促進する薬剤でもよい。

例として、脂肪親和性の薬剤、例えば限定するものではないがカチオン性リポソームは、核酸をインビボで送達するためにうまく使用されてきた。ごく最近のカチオン性リポソームは、この目的のための合成カチオン性カルジオリピンアナログ（ＣＣＬＡ）を基礎として開発されている。

好ましい形態では、本発明の医薬組成物は腫瘍内および／または腫瘍周辺に投与される。
本発明によって処置されうる腫瘍およびがんとしては、黒色腫、肺癌、子宮頸癌、肺上皮性悪性腫瘍、前立腺がん、乳がん、腎癌、結腸がん、上皮がんおよび中皮腫が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の治療方法および組成物は、単独で施用されてもよいし、あるいは他の処置、例えば化学療法、放射線療法、がんワクチン剤のような免疫療法あるいはサイトカイン治療などと併用して補助療法として施用されてもよい。

これに関しては例を本明細書中後述するが、その例では、オバルブミンのエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１；アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、上述）を含むネズミのポリトープ（ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔ）をコードするクンジンウイルスＶＬＰがＧＭＣＳＦをコードするクンジンウイルスＶＬＰとの相乗作用を示した。

さらにウェイ（Ｗｅｉ）ら、２００５年、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２巻、ｐ．３５１を参照すると、当業者向けのガイダンスとなりうるがん免疫治療の最新の総説が提供されている。

１つの特定の実施形態では、本発明は、自己由来の腫瘍細胞をインビトロでトランスフェクションして該腫瘍細胞が免疫学的活性を有するサイトカイン（典型的にはＧＭＣＳＦであるがこれに限定されるものではない）を発現するようにすることと、このトランスフェクションされた細胞を抗腫瘍ワクチン（例として、エレム（Ｅｌｌｅｍ）ら、１９９７年、上述の文献に記載のもの）として使用して本発明によるクンジンレプリコンＧＭＣＳＦ治療と併用することを企図している。

別の特定の実施形態では、本発明は、樹状細胞またはその骨髄前駆細胞の単離、腫瘍抗原による前記樹状細胞のトランスフェクション、およびトランスフェクションされた樹状細胞の前記動物への投与（例えばメサロム（Ｍｅｔｈａｒｏｍ）ら、２００５年、Ｃｅｌ
ｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２巻、ｐ．２８１に記載）を、本発明のクンジンレプリコンＧＭＣＳＦ治療と併用することを企図している。

さらに別の実施形態では、本発明は、クンジンレプリコンＧＭＣＳＦ治療を、自己由来のインビトロ生成された腫瘍特異的かつ／またはがん特異的Ｔ細胞の養子免疫細胞移入のような他の免疫療法や抗がん抗体（例えばハーセプチン）と組み合わせることを企図している。

上述に照らして、当然ながら、前述の態様によれば、動物にはヒト、家畜、コンパニオン・アニマル、家禽、および商業上重要なその他の動物が含まれるが、これらに限定されるものではない。

好ましくは、動物は哺乳動物である。
より好ましくは、動物はヒトである。
また当然のことであるが、本発明は、本発明に従って処置された前述の動物から得られる単離細胞を提供する。

いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明に従って処置された動物から単離された免疫細胞は、処置されていない動物から得られた細胞と比較して、免疫治療上の特性が改善されていると考えられる。

１つの特定の実施形態では、単離細胞は抗原提示細胞、例えば樹状細胞または樹状前駆細胞、例えばＣＤ１４＋単球であり、例えばカーティ（Ｃｕｒｔｉ）ら、２００４年、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ 第４５巻、ｐ．１４１９−１４２８および／またはババツ（Ｂａｂａｔｚ）ら、２００３年、Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第１２巻、ｐ．５１５−２３に記述されているようなものである。

さらにこの実施形態によって企図されるのは、本発明に従って処置された動物から樹状細胞またはその骨髄前駆細胞を単離すること、腫瘍抗原を用いて前記樹状細胞をトランスフェクションすること、およびトランスフェクションされた樹状細胞を前記動物に投与することによって、前記動物において腫瘍の縮小、停止、除去、その他の処置を行うことである。

別の特定の実施形態では、単離細胞は、ＣＤ８^＋もしくはＣＤ４^＋のＣＴＬおよび／またはヘルパーＴ細胞を含めた腫瘍特異的Ｔリンパ球であって、養子免疫療法に好適であり、例えばヤマグチ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、２００３年、Ｈｕｍ Ｃｅｌｌ 第１６巻、ｐ．１８３−９に総説がある。

本発明が容易に理解され、実践的効果をあげうるように、当業者に対し以下の非限定的な実施例を示す。

ネズミ科のＧＭＣＳＦを発現するＫＵＮレプリコンの構築およびレプリコンＶＬＰの産生
クンジンレプリコンＳｐ６ＫＵＮｒｅｐ４は、クンジンレプリコンｐＫＵＮｒｅｐ４（ファルナフスキー（Ｖａｒｎａｖｓｋｉ）ら、２０００年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ 第７４巻、ｐ．４３９４−４４０３）のＣＭＶプロモータをＳＰ６プロモータに置き換えることにより作製された。その結果、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡをインビトロで転写することが可能となった。Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４は、ピューロマイシン選択マーカー、Ｎ末端に挿入された異種起源のタンパク質を切り離すための口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）
２Ａオートプロテアーゼをコードし、かつ脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を含んでいる。前記ＩＲＥＳは、ＲＮＡ複製に必要なＫＵＮの非構造遺伝子の翻訳を開始させる。ＩＲＥＳはさらに、異種遺伝子の停止コドンを保持して、真正のＣ末端を備えた異種起源タンパク質が確実に産生されるようにする。

細胞における持続的なＲＮＡ複製をさらに増強するために、続いて、細胞株の適応的突然変異がＳｐ６ＫＵＮｒｅｐ４へ導入された。ＮＳ２Ａのアミノ酸３０位での特定の突然変異（Ａｌａ３０→Ｐｒｏ）は、ハムスター細胞株（ＢＨＫ２１）およびヒト細胞株（ＨＥＫ２９３およびＨＥｐ−２）においておよそ１５〜５０倍効率良く持続的複製を確立した（リウ（Ｌｉｕ）ら、２００４年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ 第７８巻、ｐ．１２２２５−３５）。さらに、３０位のアラニン（Ａｌａ３０）のプロリンへの突然変異は、ＩＦＮβプロモータで駆動される転写の誘導におけるＮＳ２Ａの阻害活性を、野生型（ｗｔ）ＮＳ２Ａタンパク質について観察される阻害活性と比較して低減させる。こうして得られた、ＮＳ２Ａ（Ａｌａ３０→Ｐｒｏ）突然変異を備えたＫＵＮレプリコンを、Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰと名付けた。

ネズミ科のＧＭＣＳＦの配列は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ／ＧＭＣＳＦ（グレン・ドラノフ（Ｇｌｅｎｎ Ｄｒａｎｏｆｆ）、米国ボストン所在のデイナ＝ファーバーがん研究所から入手）から、高品質（High-fidelity ）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、ＭｌｕＩ制限酵素切断部位（下線部）が組み込まれた順方向プライマー（５’−ＧＣＧＧＡＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＡＡＧ−３’；配列番号２）および逆方向プライマー（５’−ＧＣＧＡＣＧＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣ−Ｓ」；配列番号：３）を使用したＰＣＲによって増幅された。ＧＭ−ＣＳＦのＰＣＲ生成物（開始コドンはないが真正の停止コドンを有する）を、クンジンレプリコンＳｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰのＭｌｕＩ制限酵素切断部位にクローニングすることによって、Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰ−ＧＭＣＳＦが作製された。

Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰ−ＧＭＣＳＦレプリコンＲＮＡを含んでいるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、本質的に以前に報告されているようにして（ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）ら、２００４年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ 第７８巻、ｐ．５３１−５３８および国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００７５２号）、テトラサイクリンで誘導可能なパッケージング用のＢＨＫ細胞株（ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ）中で産生された。

簡潔に述べると、Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰ−ＧＭＣＳＦレプリコンＲＮＡは、直線化されたプラスミドＤＮＡから、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写され、エレクトロポレーションによってｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥパッケージング細胞へトランスフェクションされた。培地からドキシサイクリンが取り除かれると、ＫＵＮ構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥの発現が可能となり、続いてレプリコンＲＮＡがＶＬＰ中へパッケージされる。培養液は、１０日目まで繰り返し回収され、Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰ−ＧＭＣＳＦ ＶＬＰの力価を決定するためにＶＥＲＯ細胞でアッセイされた。

ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ腫瘍免疫療法 １
序論
ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ遺伝子療法の可能性を評価するために、Ｂ１６腫瘍が同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立され、腫瘍内／腫瘍周辺（ｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．）注射によって処置された。対照としては、ＶＬＰを調製し保存した培地、およびＰＰ突然変異を含まないかまたはいかなる異種遺伝子もコードしていない空のＶＬＰを含めた。

方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛刈りした背部に、１０^６個のＢ１６黒色腫細胞が与えられた（ｓ．ｃ．）。このＢ１６細胞はＴ２５フラスコ中で対数増殖期にあったものであり、トリプシン処理され、１回洗浄され、１０％のＦＣＳが補われたＲＰＭＩ１６４０ １００ｕｌに含めて注射された。４日後に、動物は無作為に４群に割り当てられた。すなわち；（１）５％のＦＣＳが補われたＲＰＭＩ１６４０を含む培地４０−５０ｕｌをｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射された対照群；
（２）空のＫＵＮ ＶＬＰ（Ｓｐ６ＫＵＮＲｅｐ６ＬＡＥｍｐｔｙ）１．７×１０^６ ＩＵ／腫瘍を４０−５０ｕｌ^＊としてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射された対照ＫＵＮ ＶＬＰ群；
（３）ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）１．７×１０^６ ＩＵ／腫瘍を４０−５０ｕｌ^＊としてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射されたＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群；
（４）未処置の対照群
である。

（^＊）数バッチのＶＬＰの力価にわずかな差異があるため、用量が同一に維持されるように容量が調節された。
腫瘍は文献に記述されているようにして（アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．第７６巻、ｐ．３７９１−９）モニターされた。処置は第０日（ｄ０）、第１日（ｄ１）、第２日（ｄ２）、第６日（ｄ６）、第７日（ｄ７）および第８日（ｄ８）に行われた。

結果
接種（処置の初日または処置開始後第０日を表わす）の４日後の平均腫瘍サイズは、第１群では１２．２±ＳＤ５．１、第２群では１０．５±１．６、第３群では１３．２±６、第４群は１２．６±３．８であった。腫瘍が１００ｍｍ^２に達したら動物は殺処分され、生き残っている動物をカプラン・マイアー曲線として示した（図１）。ＫＵＮ ＶＬＰ
ＧＭ−ＣＳＦ処置群は、Ｓｐ６ＫＵＮＲｅｐ６ＬＡＥｍｐｔｙ処置群（対数順位検定 ｐ＝０．００６１）および未処置の対照群（対数順位検定 ｐ＝０．００３７）と比較して、生存数を著しく増加させた。対照群はいずれも互いに著しい差異はなかった。

結論
ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭ−ＣＳＦによるｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．処置は、このＢ１６のモデルにおいて顕著な治療的抗がん活性を示している。

ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ腫瘍免疫療法 ２
序論
さらにＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ遺伝子療法の可能性を評価するために、Ｂ１６腫瘍が同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立され、第０日から第９日まで１０日間のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦの腫瘍内／腫瘍周辺（ｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．）注射によって処置された。対照としては、ＰＰ突然変異を含んでいるベクター中にβガラクトシダーゼをコードしているＫＵＮ ＶＬＰおよび非処置群を含めた。

方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛刈りした背部に、１０^６個のＢ１６黒色腫細胞が与えられた（ｓ．ｃ．）。このＢ１６細胞はＴ２５フラスコ中で対数増殖期にあったものであり、トリプシン処理され、１回洗浄され、１０％のＦＣＳが補われたＲＰＭＩ１６４０ １００ｕｌに含めて注射された。２日後に、動物は以下の群に割り当てられた。すなわち、
（１）ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）１．７×１０^６ ＩＵ／腫瘍／日を第０日から第９日まで全１０日間毎日、４０−５０ｕｌとしてｉ
．ｔ．／ｐ．ｔ．注射されたＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群（ｎ＝７）
（２）ＫＵＮ ＶＬＰ βｇａｌ（Ｓｐ６ＫＵＮＲｅｐ３ＰＰβｇａｌ）１．７×１０^６
ＩＵ／腫瘍／日を第０日から第９日まで４０−５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射された対照ＫＵＮ ＶＬＰ群（ｎ＝６）
（３）未処置群（ｎ＝８）
である。

腫瘍は文献に記述されているようにして（アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、上述）モニターされた。
結果
生存数のカプラン＝マイアー・プロットから、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによる１０日間毎日の処置により、未処置の動物（対数順位検定、ｐ＝０．０００２）またはＫＵＮ
ＶＬＰ対照で処置された動物（対数順位検定、ｐ＝０．００２１）と比較して、死亡するまでの時間が著しく短縮されたことが示されている（図３）。対照ＶＬＰによる処置はまた、未処置の対照と比較して、ある程度の保護を提供している（対数順位検定、ｐ＝０．００５）（図３）。

各群で最初の動物が殺処分されるまでに得られた増殖曲線からも、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦで処置された動物における腫瘍の増殖の著しい低減が示された（図４）。
恐らく、最も驚くべきことは、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦで処置された動物７匹のうちの４匹について、Ｂ１６腫瘍が第２７―２９日目で検出不能となり、現在のモニタリング期間の最後（第３５日目）まで検出不能のままだったことである。

結論
ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによる処置は、このＢ１６のモデルにおいて顕著な治療的抗がん活性を示している。１０日間毎日の注射が腫瘍の増殖を遅らせるだけでなく、動物の５７％ではさらに腫瘍が退縮し、処置停止の１８−２０日後に腫瘍が検出不能となった。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（シャルマ（Ｓｈａｒｍａ）ら、２００３年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．第２５巻、ｐ．１４９−５３；スフォンドリニ（Ｓｆｏｎｄｒｉｎｉ）ら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．第５３巻、ｐ．６９７−７０４）との同時投与は、この治癒率を改善しなかった（データは示さない）。

対照のＶＬＰもまた、おそらくはＩＦＮα／βの誘導に起因するある程度の保護を明らかに提供している。
ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ腫瘍免疫療法 ３
序論
さらにＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ遺伝子療法の可能性を評価するために、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍（安定的にオバルブミンを発現するＢ１６細胞；アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、上述）が、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立され、第０日から第９日まで１０日間ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦの腫瘍内／腫瘍周辺（ｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．）注射によって処置された。対照としては、ＰＰ突然変異を含んでいるベクター中にβガラクトシダーゼをコードしているＫＵＮ ＶＬＰ、および非処置群を含めた。ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ遺伝子療法が治療的ワクチン接種との相乗作用を示すかどうか判断するために、さらなる群を含めた。前記さらなる群は、オバルブミンエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、上述）を含むネズミのポリトープをコードするＫＵＮ ＶＬＰ（ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔ）でワクチン接種された群である。ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔは、予防的に使用された場合Ｂ１６−ＯＶＡの増殖を遅くすることが可能であり（アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、上述）、治療的に使用された場合はＢ１６−ＯＶＡの増殖を遅くしてかつ死亡を遅らせることが可能である（デー
タは示さない）。

方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛刈りした背部に、１０^６個のＢ１６黒色腫細胞が与えられた（ｓ．ｃ．）。このＢ１６細胞はＴ２５フラスコ中で対数増殖期にあったものであり、トリプシン処理され、１回洗浄され、１０％のＦＣＳが補われたＲＰＭＩ１６４０ １００ｕｌに含めて注射された。３日後に、動物は以下の群に割り当てられた。すなわち、
（１）ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）１．７×１０^６ ＩＵ／腫瘍／日を第０日から第９日まで全１０日間毎日、４０−５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射されたＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群（ｎ＝６）
（２）（１）と同様であるが、１０^７ｐｆｕのＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔも第０、５および９日にｉ．ｐ．投与された群
（３）ＫＵＮ ＶＬＰ βｇａｌ（Ｓｐ６ＫＵＮＲｅｐ３ＰＰβｇａｌ）１．７×１０^６
ＩＵ／腫瘍／日を第０日から第９日まで４０−５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射された対照ＫＵＮ ＶＬＰ群（ｎ＝６）
（４）未処置群（ｎ＝８）
である。

腫瘍は文献に記述されているようにして（アンラク（Ａｎｒａｋｕ）ら、２００２年、上述）モニターされた。
結果
生存数のカプラン＝マイアー・プロットから、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによる１０日間毎日の処置により、未処置の動物（対数順位検定、ｐ＝０．０００４）またはＫＵＮ
ＶＬＰ対照で処置された動物（対数順位検定、ｐ＝０．０００５）と比較して、死亡するまでの時間が著しく短縮されたことが示されている（図５）。対照のＶＬＰ処置はさらに、未処置の対照と比較して、保護（対数順位検定、ｐ＝０．００１）をも提供している（図５）。

ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ治療にＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔ処置を追加すると、６匹中６匹のマウスで腫瘍が退縮し、現在のモニタリング期間の最後（第３３日目）には腫瘍がなくなった。対照的に、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦのみで処置された群では、この時点で６匹中４匹の動物についてのみ腫瘍がなくなり、動物のうち１匹は第３０日目に処分された。

各群の最初の動物が死亡するまでに得られた増殖曲線も、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦで処置された動物では腫瘍の増殖が著しく低減されたことを示した（図６）。
結論
ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによる処置は、このＢ１６−ＯＶＡモデルにおいて顕著な治療的抗がん活性を提供する。毎日１０日間の注射が、腫瘍の増殖を遅らせるだけでなく、動物の６７％において腫瘍を退縮させた。データは、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによる処置を、ＫＵＮに基づいたがんワクチン（ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔ）と組み合わせることにより、第３３日目に６／６匹の動物について腫瘍がないという相乗的な抗がん活性が提供されることも強く示唆している。この相乗作用は、（ｉ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的なＣＤ８ Ｔ細胞に起因する、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗がん活性の増強、（ｉｉ）ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔワクチン接種によって増加したＫＵＮレプリコン特異的Ｔ細胞およびＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ感染細胞の標的化による腫瘍の炎症の増強、ならびに／または（ｉｉｉ）ＫＵＮ特異的Ｔ細胞による、腫瘍を排除する樹状細胞へのライセンス、による場合がありうる。我々は、ＫＵＮ ＶＬＰワクチン接種がレプリコンに特異的なＴ細胞の応答を引き起こす可能性があることを示した（データは示さない）。

対照のＶＬＰは、おそらくはＩＦＮα／βの誘導に起因するある程度の保護についても明らかに示している。
中皮腫のＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ免疫療法
序論
ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ治療が他の腫瘍細胞株についても奏功するかどうかを判断するために、中皮腫ＡＥ１７（ジャッカマン（Ｊａｃｋａｍａｎ）ら、２００３年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１７１巻、ｐ．５０５１−６３）について試験した。

方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、背部に１匹あたり１．４×１０^６個のＡＥ１７細胞を注入された（ｓｃ）。２日後、腫瘍を有したマウスは、ｎ＝６の２群に分割された。

第１群： ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ５ＰＰＧＭＣＳＦ）１．５×１０^６ ＩＵ／腫瘍を第０日から第７日まで毎日５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射され、次いで第８日および第９日に同量のＫＵＮ
ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）が注射された。

第２群：未処置。
結果
確立されたＡＥ１７腫瘍のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによるｉ．ｔ．／ｐ．ｔ処置は、これらの腫瘍の増殖を有意に（ｐ＜０．０１）低減させた（図７Ａ）。同じ実験のカプラン・マイアー曲線は図７Ｂに示されている。

結論
この実験は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ治療が中皮腫の治療に有効であろうことを示している。

結腸がんのＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ免疫療法
序論
ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ治療が他の腫瘍に奏功するかどうかを判断するため、結腸がん細胞株ＭＣ３８（ヒキノ（Ｈｉｋｉｎｏ）ら、２００４年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第２４巻、ｐ．１６０９−１５；チラプ（Ｔｉｒａｐｕ）ら、２００４年、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．第１１０巻、ｐ．５１−６０）を試験した。

方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、毛刈りした背部に１匹当たり４×１０^５個のＭＣ３８細胞を注入された（ｓｃ）。２日後、腫瘍を有するマウスは２群に分割された。

第１群（ｎ＝６）：ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ５ＰＰＧＭＣＳＦ）１．５×１０^６ ＩＵ／腫瘍を第０日から第７日まで毎日５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射され、次いで第８日および第９日に同量のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）が注射された。

第２群（ｎ＝５）：未処置。
結果
確立されたＭＣ３８腫瘍のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによるｉ．ｔ．／ｐ．ｔ処置は、これらの腫瘍の増殖を有意に（ｐ＜０．０１）低減させた（図８Ａ）。同じ実験のカプラン・マイアー曲線は図８Ｂに示されている。

結論
この実験は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ治療が結腸がんの治療に有効であろうことを示している。

乳腺癌のＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ免疫療法
序論
ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ治療が他の腫瘍に奏功するかどうかを判断するために、乳腺癌、ＴＵＢＯを試験した（バラダチャリ（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙ）ら、２００４年、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．第１１１巻、ｐ．３９８−４０３）。

方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、毛刈りした背部に１匹当たり１×１０^５個のＴＵＢＯ細胞を注入された（ｓｃ）。７日後、腫瘍を有するマウスは、２群に分割された。

第１群（ｎ＝４）：ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ５ＰＰＧＭＣＳＦ）１．５×１０^６ ＩＵ／腫瘍を第０日から第３日まで毎日５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射され、次いで第４〜８日に同量のＫＵＮ
ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）を注射された。

第２群（ｎ＝６）：未処置。
結果
確立されたＴＵＢＯ腫瘍のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによるｉ．ｔ．／ｐ．ｔ処置は、該腫瘍の５０％の増殖を有意に（ｐ＜０．０１）遅延させた（図９Ａ、第１群の白色の正方形および黄色の三角形）。同じ実験のカプラン・マイアー曲線は図９Ｃに示されている。

結論
この実験は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ治療が乳がんの治療に有効であろうことを示している。

乳がんのＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ免疫療法
序論
ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰ治療が他の腫瘍に奏功するかどうかを判断するために、乳がん細胞株４Ｔ１を試験した。

方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、毛刈りした背部に１匹当たり４×１０^５個の４Ｔ１細胞を注入された（ｓｃ）。２日後、腫瘍を有するマウスは、２群に分割された。

第１群（ｎ＝６）：ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ群は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ（Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ４ＰＰＧＭＣＳＦ）１．５×１０^６ ＩＵ／腫瘍を第０日から第４日まで毎日５０ｕｌとしてｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．注射され、次いで第７日および第８日に同量のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦを注射された。

第２群（ｎ＝５）：未処置。
結果
確立された４Ｔ１腫瘍のＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦによるｉ．ｔ．／ｐ．ｔ処置は、該腫瘍の増殖を有意に（ｐ＜０．０１）低減させた（図１０Ａ）。同じ実験のカプラン・マイアー曲線は図１０Ｂに示されている。

結論
この実験は、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ治療が乳がんの治療に有効であろうことを示している。

ＫＵＮレプリコンＲＮＡによるＧＭＣＳＦの産生
後でＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＶＬＰを製造するために使用されるＫＵＮ ＲＮＡにより、ＧＭＣＳＦが産生されることを確認するために、ＲＮＡは、既述（クロミク（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ）ら、１９９８年、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．第７２巻、ｐ．５９６７−７７）のようにしてエレクトロポレーション（２５ｕＦ、１５００Ｖ、１０秒間隔で２パルス）でＢＨＫ細胞に、あるいはエレクトロポレーション（９６０ｕＦ、２５０Ｖ、１パルス）でＢ１６細胞にトランスフェクションされた。これらの細胞は、２４ウェルプレートの１ウェル当たり細胞数１．２５×１０^５個で接種され、３日間標準培地中でインキュベートされた。ＩＦＡによる測定では、細胞のおよそ１０〜３０％がトランスフェクションされた。その後、上清が二連または三連としてネズミＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡアッセイキット（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して分析され、生物活性は、段階希釈された試料およびＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３応答性のＦＤＣＰ１−１細胞株（ナパーステク（Ｎａｐａｒｓｔｅｋ）ら、１９８６年、Ｂｌｏｏｄ 第６７巻、ｐ．１３９５−１４０３）を使用して分析された。

図１１に示されるように、いずれの分析からも、ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＲＮＡでトランスフェクションされたＢＨＫ細胞およびＢ１６細胞が３日間にわたり１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦを産生することが例証された。注目すべきことは、この間に細胞分裂が生じ、ＫＵＮでトランスフェクションされた細胞が分かれるときに両方の娘細胞がＫＵＮ
ＲＮＡを含み、ＧＭＣＳＦを産生することになることである（ファルナフスキー（Ｖａｒｎａｖｓｋｉ）ら、１９９９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第２５５巻、ｐ．３６６−７５）。

野生型ＫＵＮウイルスおよびＮＳ２ＡにＡｌａ３０→Ｐｒｏ変異を有するＫＵＮウイルスによるＩＦＮ−β ｍＲＮＡの転写およびＩＦＮα／βの分泌生産
ＩＦＮ−βの転写誘導における野生型（ｗｔ）およびＮＳ２Ａ変異型ＫＵＮウイルスの効率を比較するために、ＭＯＩが１の野生型ＫＵＮウイルスおよびＭＯＩが３のＮＳ２Ａ変異型ＫＵＮウイルスの各ウイルスで２４時間感染させたＡ５４９細胞からの全ＲＮＡは、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡ、ＫＵＮ ＲＮＡおよびβ−アクチン ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションで分析された。その結果から、ＮＳ２Ａ変異型ＫＵＮウイルスに感染した細胞のＩＦＮ−β ｍＲＮＡの量は、野生型ＫＵＮウイルスに感染した細胞で観察された量のおよそ６倍高いことが示された（図１１Ａを参照）。試験した時点でのＫＵＮ ＲＮＡの量は野生型および変異型ウイルスで同じであることに留意されたい（２４時間、図１２Ａ）。感染細胞の２４時間培養液をＩＦＮ−α／βの存在に関してバイオアッセイ（アンタリス（Ａｎｔａｌｉｓ）ら、１９９８年、Ｊ
Ｅｘｐ Ｍｅｄ．第１８７巻、ｐ．１７９９−８１１）で試験すると、ＮＳ２Ａ変異型ＫＵＮは野生型ＫＵＮよりはるかに高量のＩＦＮα／β産生を誘導することが示された（図１２Ｂ）。

上記アッセイの感度（〜７．８ＩＵ／ｍｌの参照用ＩＦＮ−αはＡ５４９細胞をＳＦＶチャレンジから５０％保護した）では、野生型ウイルスに感染したＡ５４９細胞の培養液中に生物学的に活性なＩＦＮ−α／βを検出することはできなかったが、ＮＳ２Ａ変異型ウイルスに感染した細胞では〜３７０ＩＵ／ｍｌの生物学的に活性なＩＦＮ−α／βが検出された。これらの結果は２つの主要かつ新たな発見を実証する。該発見は：（ｉ）ＩＦＮ−α／βの誘導および分泌は、野生型ＫＵＮウイルスによって阻害されること、（ｉｉ）ＮＳ２Ａタンパク質の３０位におけるアラニンのプロリンへの１アミノ酸置換により、ＩＦＮ−α／βの誘導および分泌が増大したこと、である。

ＫＵＮレプリコンＶＬＰによる腫瘍細胞の感染
β−ｇａｌをコードするＶＬＰが製造され、小量のアリコートに等分されて、１０％のＦＣＳおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補ったＲＰＭＩ１６４０中で−７０℃にて保存された。腫瘍細胞のパネルはカバーグラス上で一晩増殖され、Ｓｐ６ＫＵＮｒｅｐ３ＰＡβｇａｌまたはＳｐ６ＫＵＮｒｅｐ２ＬＡＥｍｐｔｙを使用して、ＭＯＩを１０として、２％のＦＣＳおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含んだＲＰＭＩ中に懸濁されたＫＵＮ ＶＬＰ３００ｕｌで感染された。２４ウェルプレートはインキュベータ内に置かれ、毎時振動が加えられた。３時間のインキュベーション後、ウェルは１ｍｌの培地で浸され、細胞はさらに６０時間培養された。６０時間後、細胞は短時間洗浄され、冷アセトン／メタノール（５０／５０）中で２分間固定された。その後カバーグラスは洗浄され、ブロッキングされ、そして抗ＫＵＮ ＮＳ３ポリクローナルウサギ抗血清（１／５００で使用）およびＦＩＴＣ標識された二次抗体により染色された。細胞は蛍光顕微鏡下で検査され、非感染細胞（可視相）および感染細胞（蛍光）の数が１０個の代表視野について２０×対物レンズを使用して計数され、百分比が算出された。

表１は、ＫＵＮレプリコンＶＬＰが異なる多数のがんに感染することが可能であることを示しており、よって本発明者らは、ＧＭＣＳＦのようなサイトカインをコードするＫＵＮレプリコンＶＬＰは種々様々な異なるがんの治療において有用であると判断しうるものと考えている。

本発明者らはまた、感染率は、（表１のように）ガラス上で増殖させた細胞と比較して、プラスチック上で増殖させた細胞において高い場合があるという、ある程度の証拠も有している。例えば、プラスチック上で増殖させ、上記のようにしてＭＯＩを１０として感染させたＢ１６細胞は、＞４０〜７０％の感染率を示す。

西ナイルウイルスのニューヨーク９９株のレプリコンＲＮＡを含有するクンジンＶＬＰによる腫瘍細胞の感染
構造領域の９２％超が欠失している西ナイルウイルスのレプリコン構築物は、Ｐ．−Ｙ．シ（Ｓｈｉ）（米国）によって、西ナイルウイルスのニューヨーク単離株の完全長クローンから既述のようにして作製された（シ（Ｓｈｉ）ら、２００２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
第２９６巻、ｐ．２１９−３３）。ＷＮレプリコンＲＮＡをパッケージ細胞株ｔｅｔＫＵＮＣｐｒＭＥ（ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）ら、２００４年、上述）中にエレクトロポレーションした後、ドキシサイクリンの除去により、ＫＵＮ構造遺伝子Ｃ、ｐｒＭおよびＥの発現を誘導すると、エレクトロポレーション後４日目までに７ｘ１０^７ ＩＵ／ｍｌの分泌ＶＬＰが産生された。したがって、このＶＬＰは、クンジン構造タンパク質Ｃ、ｐｒＭおよびＥによりパッケージされたＷＮレプリコンＲＮＡを含んでいる。並列実験で行なったＫＵＮレプリコンＲＮＡ、ＲＮＡｌｅｕのエレクトロポレーションの結果、ＶＬＰ（ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）ら、２００４年、上述）に匹敵する力価（１０^８ ＩＵ／ｍｌ）が産生された。

クンジンまたはＷＮのレプリコンＲＮＡを含んでいるＶＬＰは、感染多重度を１０としてルイス肺細胞およびＴＣ−１腫瘍細胞を感染させるために使用された。感染効率は、クンジンＮＳ３タンパク質と交差反応する抗体を用いた免疫蛍光分析法によって分析された。表２は、ＷＮレプリコンＲＮＡを含むＶＬＰによる感染効率が、クンジンレプリコンＲＮＡを含むＶＬＰに感染した細胞で観察された感染効率よりも高かったことを示している。

したがって、本発明者らは、ＧＭＣＳＦをコードする西ナイルウイルスレプリコンの構築によりいくつかの腫瘍細胞のインビトロにおける感染効率の向上が可能となると考えて
いる。ＫＵＮ ＶＬＰがインビトロで腫瘍細胞を感染させる能力と、ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ
ＶＬＰ治療がインビボで有効ながん治療を提供する能力との間には相関があるかもしれない。本発明者らはさらに、レプリコン構築物は腫瘍細胞内での複製に関して選択することも可能であり、そうすることにより、インビボで該レプリコン系が腫瘍細胞中でＧＭＣＳＦを産生する能力を高める可能性のある突然変異を提供しうると考えている。

本明細書全体にわたって、本発明を任意の１つの実施形態または特定の特徴の集合物に制限することなく、本発明の好ましい実施形態について記述することを目的としてきた。本明細書に記述および例証された実施形態に対し、本発明の広範な思想および範囲から逸脱することなく様々な変更および改良を行うことが可能である。

本明細書中で参照されたすべてのコンピュータ・プログラム、アルゴリズム、特許文献および学術文献は、参照によってその全体が本願に組み込まれる。

生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。Ｂ１６腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいて確立された（１群当たりｎ＝６、対照群はｎ＝８）。腫瘍は、第０日（ｄ０）、第１日（ｄ１）、第２日（ｄ２）、第６日（ｄ６）、第７日（ｄ７）および第８日（ｄ８）に、腫瘍内／腫瘍周辺（ｉ．ｔ．／ｐ．ｔ）投与により、無（対照）、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ（培地対照）、ＫＵＮ ＶＬＰ対照またはＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦで処置された。 図１に示したのと同じ実験の増殖曲線を示す図。 生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。 図３に示したのと同じ実験の増殖曲線を示す図。グラフ線は、腫瘍サイズが１０×１０に達したため群内で最初に動物が処分された日で終わっている。 生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。処置は第９日に中止された。 図５に示したのと同じ実験の増殖曲線を示す図。グラフ線は、腫瘍サイズが１０×１０に達したため群内で最初に動物が処分された日で終わっている。ただし、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ＋ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔ群は、第３３日以前に処分された動物がいないので例外である。目視できる腫瘍のない動物の数が、群内で最初に動物が処分された時点で各群について記載されている。ただし、ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦ＋ＫＵＮ ＶＬＰ ｍｐｔ群は、第３３日の時点で処分された動物がなく、腫瘍も見られなかったので例外である。 ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦでｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．処置された、または未処置のｓｃ ＡＥ１７腫瘍に関する、平均腫瘍サイズの増殖曲線を示す図。 生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。処置は第９日で中止された。 ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦでｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．処置された、または未処置のｓｃ ＭＣ３８腫瘍に関する、平均腫瘍サイズの増殖曲線を示す図。 生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。処置は第９日で中止された。 処置されたマウス（第１群のマウスＭ１−Ｍ４）に関する、各ｓｃ ＴＵＢＯ腫瘍の腫瘍サイズの個々の増殖曲線を示す図。 未処置のマウス（第２群のマウスＭ１−Ｍ５）に関する、各ｓｃ ＴＵＢＯ腫瘍の腫瘍サイズの個々の増殖曲線を示す図。 生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。ＴＵＢＯ腫瘍は、ｂａｌｂ／ｃマウスの群（試験群ｎ＝４、対照群ｎ＝５）において確立された。この腫瘍は、第０日〜第９日に、無（対照）またはＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦでｉ．ｔ／ｐ．ｔ処置された。 ＫＵＮ ＶＬＰ ＧＭＣＳＦでｉ．ｔ．／ｐ．ｔ．処置された、または未処置のｓｃ ４Ｔ１腫瘍に関する、平均腫瘍サイズの増殖曲線を示す図。 生存マウスのカプラン・マイアー・プロットを示す図。 ＫＵＮ ＧＭＣＳＦ ＲＮＡでトランスフェクションされたＢＨＫ細胞によるＧＭＣＳＦの産生を示す図。 野生型およびＮＳ２Ａ変異型ＫＵＮウイルスに感染したＡ５４９細胞における、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡおよび分泌されたＩＦＮの−α／βの検出について示す図。（Ａ）野生型ＮＳ２Ａ（ｗｔＮＳ２Ａ）をコードするＫＵＮウイルスをＭＯＩ＝１として、またはＡｌａ３０→Ｐｒｏ変異を有するＮＳ２Ａ（ＮＳ２Ａ／Ａ３０Ｐ）遺伝子をコードするＫＵＮウイルスをＭＯＩ＝３として２４時間感染させたＡ５４９細胞の、ノーザンブロット解析。プローブは、ＫＵＮ ＲＮＡ、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡおよびβ−アクチンｍＲＮＡに特異的なものとした。（Ｂ）同じ感染Ａ５４９細胞からの２４時間培養液のバイオアッセイ分析。新しいＡ５４９細胞を、回収された培養液とともに２４時間インキュベートし、次いで０．５ＭＯＩのセムリキ森林熱ウィルス（ＳＦＶ）に感染させた。ＩＦＮα／βの産生は、ＳＦＶ感染による細胞変性作用からの細胞の保護によって評価され、既知の生物活性を有する参照用ＩＦＮ２α（シグマ（Ｓｉｇｍａ））による保護との比較により計算した。

Claims (47)

1. （ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンと；
   （ｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）と
   をコードするヌクレオチド配列を含んでなるフラビウイルスレプリコン構築物。
2. ヌクレオチド配列は、前記レプリコンの非構造タンパク質に１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換を有するフラビウイルスレプリコンをコードし、前記１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換は、動物細胞中において、野生型フラビウイルスのレプリコンにコードされた非構造タンパク質と比較してＩＦＮα／βの誘導を増強することを特徴とする、請求項１に記載のフラビウイルスレプリコン構築物。
3. 前記非構造タンパク質は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂから成る群から選択される、請求項２に記載のフラビウイルスレプリコン構築物。
4. 前記フラビウイルスの非構造タンパク質中の前記１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換は、
   （Ｉ）ＮＳ２Ａにおける３０位のアラニンのプロリンへの変異；および
   （ＩＩ）ＮＳ２Ａにおける１０１位のアスパラギンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異
   から成る群から選択される、請求項２に記載のフラビウイルスレプリコン構築物。
5. クンジンウイルスのレプリコンをコードする、請求項１に記載のフラビウイルスレプリコン構築物。
6. １つ以上の調節配列に作動可能なように連結された請求項１に記載のフラビウイルスレプリコン構築物を含む発現構築物。
7. 前記ヌクレオチド配列は、前記レプリコンの非構造タンパク質に１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換を有するフラビウイルスレプリコンをコードし、前記１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換は、動物細胞中において、野生型フラビウイルスのレプリコンにコードされた非構造タンパク質と比較してＩＦＮα／βの誘導を増強することを特徴とする、請求項６に記載の発現構築物。
8. 前記非構造タンパク質は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂから成る群から選択される、請求項７に記載の発現構築物。
9. 前記フラビウイルスの非構造タンパク質中の前記１つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失または置換は、
   （Ｉ）ＮＳ２Ａにおける３０位のアラニンのプロリンへの変異；および
   （ＩＩ）ＮＳ２Ａにおける１０１位のアスパラギンのアスパラギン酸またはグルタミン酸への変異
   から成る群から選択される、請求項８に記載の発現構築物。
10. クンジンウイルスのレプリコンをコードする、請求項６に記載の発現構築物。
11. 該発現構築物はＤＮＡであり、１つ以上の調節配列はプロモータを含む、請求項６に記載の発現構築物。
12. フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡのインビトロでの転写を促進する、請求
    項１１に記載の発現構築物。
13. プロモータはＴ７プロモータまたはＳＰ６プロモータである、請求項１２に記載の発現構築物。
14. フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡの動物細胞での転写を促進する、請求項６に記載の発現構築物。
15. プロモータはＣＭＶプロモータである、請求項１０に記載の発現構築物。
16. プロモータは制御可能なプロモータである、請求項１０に記載の発現構築物。
17. 制御可能なプロモータはテトラサイクリン制御性プロモータである、請求項１６に記載の発現構築物。
18. （ｉ）請求項６に記載の発現構築物；および
    （ｉｉ）パッケージング構築物であって、パッケージング細胞によって前記発現ベクターまたは構築物がフラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中にパッケージングされるのを促進する１つ以上のタンパク質を発現可能な構築物
    を含む発現系。
19. 発現構築物はＲＮＡである、請求項１８に記載の発現系。
20. ＲＮＡはインビトロ転写されたものである、請求項１９に記載の発現系。
21. 発現構築物はＤＮＡである、請求項１８に記載の発現系。
22. 発現構築物が、フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡのパッケージング細胞による発現を促進するために、パッケージング細胞中で作動可能なプロモータをさらに含む、請求項１８に記載の発現系。
23. プロモータは制御可能なプロモータである、請求項２２に記載の発現系。
24. 制御可能なプロモータはテトラサイクリン制御性プロモータである、請求項２３に記載の発現系。
25. 制御可能なプロモータは、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質を含むフラビウイルス構造タンパク質翻訳産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結される、請求項２３に記載の発現系。
26. ＲＮＡの形態の請求項１に記載のレプリコン構築物を含む、フラビウイルス属ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
27. 請求項１８に記載の発現系を含むパッケージング細胞。
28. ＢＨＫ２１細胞である、請求項２７に記載のパッケージング細胞。
29. 請求項１に記載のレプリコン構築物を含むＶＬＰと、医薬として許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤とを合わせて含んでなる医薬組成物。
30. 請求項１４に記載の発現構築物と、医薬として許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤とを合わせて含んでなる医薬組成物。
31. 動物の腫瘍またはがんを予防的または治療的に処置する方法であって、前記方法は、請求項１に記載のフラビウイルスレプリコン構築物を動物に投与することにより、前記動物の腫瘍またはがんを縮小、停止、除去、その他処置する工程を含む、方法。
32. フラビウイルスレプリコン構築物はＲＮＡである、請求項３１に記載の方法。
33. フラビウイルスレプリコン構築物はＶＬＰ内にある、請求項３２に記載の方法。
34. フラビウイルスレプリコン構築物はクンジンウイルスのレプリコンをコードする、請求項３１に記載の方法。
35. 動物の腫瘍またはがんを予防的または治療的に処置する方法であって、前記方法は、請求項１４に記載のフラビウイルス発現構築物を動物に投与することにより、前記動物の腫瘍またはがんを縮小、停止、除去、その他処置する工程を含む、方法。
36. 少なくとも１つの他の免疫療法との併用療法として使用される、請求項３５に記載の方法。
37. フラビウイルス発現構築物はクンジンウイルスのレプリコンをコードする、請求項３５に記載の方法。
38. フラビウイルスレプリコン構築物またはフラビウイルス発現構築物を腫瘍内または腫瘍周辺に投与する工程を含む、請求項３１または請求項３５に記載の方法。
39. 動物は哺乳動物である、請求項３１または請求項３５に記載の方法。
40. 哺乳動物はヒトである、請求項３８に記載の方法。
41. 腫瘍またはがんは、黒色腫、肺癌、子宮頸癌、肺上皮性悪性腫瘍、前立腺がん、乳がん、腎臓癌、結腸がん、上皮性がんおよび中皮腫である、請求項３５に記載の方法。
42. 請求項３１または請求項３５に記載の方法によって処置された動物から得られる単離細胞。
43. 抗原提示細胞またはリンパ細胞である、請求項４２に記載の単離細胞。
44. 動物の腫瘍またはがんの養子免疫療法であって、前記方法は、請求項４３に記載の単離細胞を前記動物に投与することにより、前記動物の腫瘍またはがんを縮小、停止、除去、その他処置する工程を含む、方法。
45. 動物は哺乳動物である、請求項４４に記載の方法。
46. 哺乳動物はヒトである、請求項４５に記載の方法。
47. 腫瘍またはがんは、黒色腫、肺癌、子宮頸癌、肺上皮性悪性腫瘍、前立腺がん、乳がん、腎臓癌、結腸がん、上皮性がんおよび中皮腫である、請求項４４に記載の方法。

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