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CN108148121B - 丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗 - Google Patents

丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗 Download PDF

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CN108148121B CN201810183121.2A CN201810183121A CN108148121B CN 108148121 B CN108148121 B CN 108148121B CN 201810183121 A CN201810183121 A CN 201810183121A CN 108148121 B CN108148121 B CN 108148121B
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗。本发明提供了丙型肝炎病毒抗原多肽组合物，包括至少三条丙型肝炎病毒抗原多肽，其中，所述丙型肝炎病毒抗原多肽为具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽、SEQ ID NO：2所示序列的多肽、SEQ ID NO：3所示序列的多肽、SEQ ID NO：4所示序列的多肽和SEQ ID NO：5所示序列的多肽。本发明还提供了丙型肝炎病毒疫苗及其应用。该发明有效解决目前HCV疫苗存在的性状不稳定，免疫原性弱，特异性不强的技术缺陷。

Description

丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗。
背景技术
丙型病毒性肝炎，简称为丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。既往研究中，HCV感染与原发性肝癌的相关性最强，包括肝细胞癌和肝内胆管癌。2005～2015年期间，HCV相关的HCC死亡率增加了21.1％。
HCV对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。但迄今为止，尚缺乏理想的抗病毒治疗措施，干扰素治疗也不令人满意。由于HCV病毒变异率高，以保护性抗体为主的预防性HCV疫苗的研究步履维艰。
现有技术中，常见的HCV疫苗的制备方法为将抗原肽直接溶于医学蒸馏水制成疫苗溶液。但由于HCV病毒变异率高，使其制备的疫苗，特异性不强，同时，这种HCV疫苗由于是多肽溶于水溶液制备而成的，往往性状不够稳定，免疫原性较弱，特异性不强，不能很好引起机体的免疫反应以杀伤HCV病毒；另外，由于缺乏一些免疫辅助因子的表达，不能够很好的调节HCV病毒的机体免疫机制，不能改善HCV病毒引起的肝脏免疫耐受的现象。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗，能有效解决目前HCV疫苗存在的性状不稳定，免疫原性弱，特异性不强的技术缺陷。
本发明提供了丙型肝炎病毒抗原多肽组合物，包括至少三条丙型肝炎病毒抗原多肽，其中，所述丙型肝炎病毒抗原多肽为具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽、SEQ ID NO：2所示序列的多肽、SEQ ID NO：3所示序列的多肽、SEQ ID NO：4所示序列的多肽和SEQ IDNO：5所示序列的多肽。
更为优选，所述丙型肝炎病毒抗原多肽组合物包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽、SEQ ID NO：2所示序列的多肽、SEQ ID NO：3所示序列的多肽、SEQ ID NO：4所示序列的多肽和SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
本发明还提供丙型肝炎病毒抗原多肽组合物，包括至少三条丙型肝炎病毒抗原多肽，其中，所述丙型肝炎病毒抗原多肽为具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
更为优选，所述丙型肝炎病毒抗原多肽组合物包括具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
更为优选，SEQ ID NO：1所示序列的多肽的浓度范围为5μg/ml-15μg/ml、SEQ IDNO：2所示序列的多肽的浓度范围为5μg/ml-15μg/ml、SEQ ID NO：3所示序列的多肽的浓度范围为5μg/ml-15μg/ml、SEQ ID NO：4所示序列的多肽的浓度范围为5μg/ml-15μg/ml和SEQID NO：5所示序列的浓度范围为5μg/ml-15μg/ml。
本发明还公开所述的丙型肝炎病毒抗原组合物在制备诱导DC细胞成熟的产品中的应用。
本发明还公开所述的丙型肝炎病毒抗原组合物在制备提高平DC细胞免疫能力的产品中的应用。
本发明还公开丙型肝炎病毒疫苗，包括所述的丙型肝炎病毒抗原组合物及药学上可接受的辅料
丙型肝炎病毒疫苗，包括：所述的丙型肝炎病毒抗原组合物及药学上可接受的辅料，从实施例可知，丙型肝炎病毒抗原组合物负载到DC细胞后能激活DC细胞成熟，提高DC细胞免疫能力，DC细胞成熟后，释放一种具有抗原提呈能力的囊泡小体，该小体内含有大量MHCI、II类分子和共刺激分子，能显著刺激抗原特异性CD8+T淋巴细胞增殖，并诱导抗原特异性T淋巴细胞反应，由此可知，丙型肝炎病毒抗原组合物起到免疫作用。
本发明还公开丙型肝炎病毒疫苗，包括负载所述的丙型肝炎病毒抗原组合物的DC细胞。
本发明还公开所述的丙型肝炎病毒疫苗在制备激活T淋巴细胞的产品中的应用。
本发明还公开所述的丙型肝炎病毒疫苗在制备促进T淋巴细胞分泌细胞因子的产品中的应用。
本发明还提供丙型肝炎病毒疫苗，其特征在于，包括负载所述的丙型肝炎病毒抗原组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养的培养物。
本发明还提供所述的丙型肝炎病毒疫苗在制备抑制肝癌细胞的产品中的应用。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽和如SEQ ID NO：2所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽、如SEQ ID NO：2所示序列的多肽和如SEQ ID NO：3所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽、如SEQ ID NO：2所示序列的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列的多肽和如SEQ ID NO：4所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列的多肽、如SEQ ID NO：2所示序列的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列的多肽、如SEQ ID NO：4所示序列的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：1所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列的多肽和如SEQ ID NO：3所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列的多肽和如SEQ ID NO：4所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列的多肽、如SEQ ID NO：4所示序列的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：2所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：3所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：3所示序列的多肽和如SEQ ID NO：4所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：3所示序列的多肽、如SEQ ID NO：4所示序列的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：3所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽、如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：4所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：4所示序列的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：4所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽和如SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
在一些实施例中，丙型肝炎病毒抗原多肽，包括具有如SEQ ID NO：5所示序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基得到的多肽。
针对HCV疫苗现有技术的不足，本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物，包括：SEQID NO：1所示序列的多肽、SEQ ID NO：2所示序列的多肽、SEQ ID NO：3所示序列的多肽、SEQID NO：4所示序列的多肽和SEQ ID NO：5所示序列的多肽，其中，SEQ ID NO：1来源于HCV的E1区第56-第65的多肽序列；SEQ ID NO：2来源于HCV的E2区第86-第99的多肽序列；SEQ IDNO：3来源于HCV的NS2区第179-第190的多肽序列；SEQ ID NO：4来源于HCV的NS3区第603-第612的多肽序列；SEQ ID NO：5来源于HCV的NS4B区第213-第228的多肽序列。HCV是一种有包膜呈球形的正单链RNA病毒。其基因组为单股正链RNA，全长约9500个碱基。基因组两侧分别为5’和3’非编码区，中间为开放读码框(ORF)，分为结构区和非结构区。结构区包括核心蛋白区(C)和两个包膜蛋白区(E1、E2)，分别编码核心蛋白和包膜蛋白。非结构蛋白区包括NS2、NS3、NS4和NS5区，编码功能蛋白，如蛋白酶(NS2、NS3和NS4A区)，螺旋酶(NS3)以及依赖RNA的RNA多聚酶(NS5B区)。虽然非结构蛋白不是病毒颗粒的组成部分，但在病毒复制中起到非常重要的作用。本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物针对HCV E1、E2、NS2、NS3和NS4B区，从结果可知丙型肝炎病毒抗原多肽组合物能有效诱导DC细胞成熟，从而提高DC细胞呈递抗原的能力。
树突状细胞(dendriticcells，DC)是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞，能摄取、加工、处理抗原并将抗原信息提呈给T淋巴细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T淋巴细胞免疫应答中起到关键作用。未成熟DC有较强的抗原内吞和加工处理能力，而激发混合淋巴细胞反应能力较弱。本发明发现将本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物负载DC细胞的疫苗，DC细胞可被本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物有效地激活、诱导成熟，被激活的成熟的DC细胞释放一种具有抗原提呈能力的囊泡小体，该小体内含有大量MHCI、II类分子和共刺激分子，能显著刺激抗原特异性CD8+T淋巴细胞增殖，并诱导抗原特异性T淋巴细胞反应，与T淋巴细胞共培养后可激活特异性的抗病毒T淋巴细胞，从而具有更强的杀瘤能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示第5天未成熟时DC细胞显微结构；
图2示第8天成熟时DC细胞显微结构；
图3示负载抗原多肽后DC表型变化；
图4示本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物负载的DC细胞促使T淋巴细胞分泌TNF-α结果；
图5示本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物负载的DC细胞促使T淋巴细胞分泌IFN-γ结果；
图6示负载本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物的DC-CTL对Huh7的杀瘤效率；
图7示皮下注射Huh7肝癌细胞的裸鼠进行负载本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物的DC-CTL治疗结果；
其中，附图标记，SEQ ID NO：1标记为HCV E1、SEQ ID NO：2标记为HCV E2、SEQ IDNO：3标记为HCV NS2、SEQ ID NO：4标记为HCV NS3和SEQ ID NO：5标记为HCV NS4B。
具体实施方式
本发明提供了丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗，用于解决现有技术中的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，以下实施例的原料为市售或自制；SEQ ID NO：1标记为HCV E1、SEQ ID NO：2标记为HCV E2、SEQ ID NO：3标记为HCV NS2、SEQ ID NO：4标记为HCV NS3和SEQ ID NO：5标记为HCV NS4B，DC CTL为未负载抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物组，SEQID NO：1至SEQ ID NO：5的五条抗原多肽的序列信息来源为丙型肝炎病毒(HCV)的遗传信息。
实施例1
本实施例为体外合成抗原肽，具体步骤如下：
委托南京金斯瑞公司通过人工合成SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：5这5条抗原多肽，多肽序列如下。
SEQ ID NO：1为ATRDGKLPTT；
SEQ ID NO：2为WGPISYANGSGLDE；
SEQ ID NO：3为ADTAACGDIING；
SEQ ID NO：4为AVQNEVTLT；
SEQ ID NO：5为SRGNHVSPTHYVPESD；
将这5条抗原多肽用二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司产品)溶解至浓度为10mg/ml，0.22μM滤膜过滤除菌后，分装保存于-80℃。
实施例2
本实施例为DC细胞的分离培养，具体步骤如下：
1)采集肿瘤患者80ml外周血，经密度梯度离心获得单个核细胞。
2)计数后用RPMI1640培养基(Gibco公司产品)稀释到3-5×106个/ml，加入T75培养瓶中培养。
3)在37℃、5％CO2培养箱中孵育90min后，洗涤收集未贴壁细胞，为T淋巴细胞。
4)贴壁细胞加入完全RPMI1640培养基，其中含有5％自体血清，1000IU/ml重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和1000IU/ml IL-4(Sigma公司产品)。
5)第五天收集未成熟DC细胞，成熟DC细胞采用完全RPMI1640培养基培养至第八天收集得到。
如图1所示，第5天未成熟时DC呈圆形，如图2所示，到第8天成熟时，DC成树突状。
实施例3
本实施例为丙型肝炎病毒抗原多肽组合物负载DC细胞及表型鉴定，具体步骤如下：
收集3×106个实施例2培养至第五天的未成熟DC细胞，用实施例1中5条抗原多肽在37℃、5％CO2培养箱中负载2h，每种抗原多肽的终浓度均为40μg/ml。共分为9组：
①负载本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物(HCV E1、HCV E2、HCV NS2、HCVNS3和HCV NS4B抗原组合物)的DC细胞；
②负载HCV E1、E2、NS2和NS3抗原多肽组合物的DC细胞；
③负载HCV E2、NS3和NS4B抗原多肽组合物的DC细胞；
④负载HCV E1抗原多肽的DC细胞；
⑤负载HCV E2抗原多肽的DC细胞；
⑥负载HCV NS2抗原多肽的DC细胞；
⑦负载HCV NS3抗原多肽的DC细胞；
⑧负载HCV NS4B抗原多肽的DC细胞；
⑨未负载抗原多肽的DC细胞。
完全培养基继续培养至第八天，收集成熟的抗原多肽负载DC，流式细胞术检测负载抗原多肽后DC细胞表型变化。
如图3所示，以上9组的DC细胞通过CD86-PE、CD80-PE、CD40-FITC、CD83-PE、CD11c-FITC和HLA-DR-PerCP(BD公司)染色，流式细胞仪检测负载后DC表型变化结果显示，所制备的DC表型符合DC细胞特异表型。且①组(本发明的丙型肝炎病毒抗原组合物)负载DC细胞的效果要明显优于②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧和⑨负载DC细胞的效果，同时①组的效果最为明显，说明本发明的丙型肝炎病毒抗原组合物负载能够更加有效地诱导DC细胞的成熟，提高DC呈递抗原的能力。
实施例4
本实施例为检测细胞因子分泌情况，具体步骤如下：
将实施例2中第3)步骤的T淋巴细胞，调整细胞密度为1×107个/ml，将T淋巴细胞与实施例3中9组的负载抗原多肽的DC细胞进行混合培养48h，方法采用文献Brossart P,etal.Induction of cytotoxicT-1ymphocyte responses in
vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells,Blood.2000
Nov1；96(9):3102-8中所述。T淋巴细胞与DC细胞的数量比例为10:1，共分为9组，分别是：
①负载了本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物(HCV E1、HCV E2、HCV NS2、HCVNS3和HCV NS4B抗原组合物)的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
②负载了HCV E1、E2、NS2和NS3抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
③负载了HCV E2、NS3和NS4B抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
④负载了HCV E1抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
⑤负载了HCV E2抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
⑥负载了HCV NS2抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
⑦负载了HCV NS3抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
⑧负载了HCV NS4B抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养；
⑨未负载抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养。
本实施例的T淋巴细胞具体为CTL细胞。
在第三天、第六天和第十天时收集上清液，用ELISA试剂盒(RD公司产品)检测IFN-γ和TNF-α的分泌情况。
结果如图4和图5，结果显示本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物(①组)负载的DC细胞能够更加有效地促使T淋巴细胞分泌TNF-α和IFN-γ，且分别在第三天和第六天达到峰值，①组结果明显优于②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧和⑨组结果。
实施例5
本实施例为体外杀瘤实验检测，具体步骤如下：
分别取实施例1的抗原多肽负载到实施例2的DC细胞和T淋巴细胞进行共培养，收集以下9组的共培养物：
①负载了本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物(HCV E1、HCV E2、HCV NS2、HCVNS3和HCV NS4B抗原组合物)的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
②负载了HCV E1、E2、NS2和NS3抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
③负载了HCV E2、NS3和NS4B抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
④负载了HCV E1抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑤负载了HCV E2抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑥负载了HCV NS2抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑦负载了HCV NS3抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑧负载了HCV NS4B抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑨未负载抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物。
以9组的负载抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞为效应细胞，肝癌细胞系Huh7为靶细胞，MTT法检测杀瘤效率，具体步骤如下：
1)收集Huh7肿瘤细胞，用RPMI1640培养基(含5％FBS)重悬细胞，调整细胞浓度为5×104个/ml，加入96孔板中，每孔加入100μl，细胞为5000个/孔。37℃，5％CO2培养箱中贴壁过夜。
2)收集各组DC细胞与T淋巴细胞共培养物，重悬于RPMI1640培养基(含5％FBS)中，调整细胞浓度为106个/ml，按照效靶比20:1，10:1，5:1加入效应细胞，用RPMI1640培养基(含5％FBS)补足体积。
3)置于37℃，5％CO2培养箱中培养4h。
4)每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，在培养箱中继续培养4小时。
5)2000rpm，10min，离心后小心地将上清尽量吸出，注意不要将板底的结晶紫吸出。然后加入150μl的DMSO，避光，震荡10min，使结晶紫全部溶解。
6)酶标仪检测，在波长492nm下检测每孔的吸光度值。
7)计算杀瘤效率。杀瘤效率(％)＝[1-(实验组OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞OD值]×100％。
图6的结果显示，负载本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养物在效靶比为20:1的条件下，对Huh7的杀瘤效率可达85.3％，高于负载了混合3种、4种抗原多肽组和单独抗原肽组。
实施例6
本实施例为体内杀瘤实验检测，具体步骤如下：
1)取六周龄裸鼠60只，分为10组，每组6只。
分别取实施例1的抗原多肽负载到实施例2的DC细胞和T淋巴细胞进行共培养，收集以下9组的共培养物：
①负载了本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物(HCV E1、HCV E2、HCV NS2、HCVNS3和HCV NS4B抗原组合物)的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
②负载了HCV E1、E2、NS2和NS3抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
③负载了HCV E2、NS3和NS4B抗原多肽组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
④负载了HCV E1抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑤负载了HCV E2抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑥负载了HCV NS2抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑦负载了HCV NS3抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑧负载了HCV NS4B抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑨未负载抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养的共培养物；
⑩生理盐水。
2)收集Huh7肝癌细胞，重悬于生理盐水中，调整细胞浓度为1.5×107个/ml，
①-⑩组裸鼠，每只在腋窝皮下注射200μl，即3×106个。
3)7天后，裸鼠皮下肿瘤直径约为5mm大小，将各组细胞进行局部注射。每只裸鼠注射的细胞量为107个。隔一周后进行再次注射，共进行两次注射治疗。每隔三天测量一次肿瘤体积。
结果如图7所示。在皮下注射Huh7肝癌细胞的裸鼠进行负载抗原多肽的DC细胞与T淋巴细胞共培养物治疗后，多抗原多肽负载的DC细胞与T淋巴细胞共培养物治疗组的肿瘤体积增长变缓本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物同时负载组较其它几组的肿瘤增殖明显变慢。说明本发明的丙型肝炎病毒抗原多肽组合物负载的DC细胞与T淋巴细胞共培养物可有效抑制肿瘤在模型动物体内的生长，可以起到抗肿瘤的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 李陶、刘佳、吴春风
<120> 丙型肝炎病毒抗原多肽组合物以及丙型肝炎病毒疫苗
<130> MP1729887
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp
1 5 10 15

Claims (9)

1.丙型肝炎病毒抗原多肽组合物，其特征在于，包括至少三条丙型肝炎病毒抗原多肽，其中，所述丙型肝炎病毒抗原多肽为SEQ ID NO：1所示序列的多肽、SEQ ID NO：2所示序列的多肽、SEQ ID NO：3所示序列的多肽、SEQ ID NO：4所示序列的多肽和SEQ ID NO：5所示序列的多肽。
2.权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原组合物在制备提高DC细胞免疫能力的产品中的应用。
3.权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原组合物在制备诱导DC细胞成熟的产品中的应用。
4.丙型肝炎病毒疫苗，其特征在于，包括：权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原组合物及药学上可接受的辅料。
5.丙型肝炎病毒疫苗，其特征在于，包括负载权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原组合物的DC细胞。
6.权利要求4或5所述的丙型肝炎病毒疫苗在制备激活T淋巴细胞的产品中的应用。
7.权利要求6所述的丙型肝炎病毒疫苗在制备促进T淋巴细胞分泌细胞因子的产品中的应用。
8.丙型肝炎病毒疫苗，其特征在于，包括负载权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原组合物的DC细胞与T淋巴细胞共培养的培养物。
9.权利要求8所述的丙型肝炎病毒疫苗在制备抑制肝癌细胞增殖的产品中的应用。
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