CN101115994A - 通过免疫色谱法定量测定液体样品中分析物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过免疫色谱法定量测量液体样品中至少一种分析物的方法，所述方法包括与对照相比分析物数量的权重测量。所述方法特别适合于止血领域的医学诊断，例如为了排除静脉血栓栓塞的诊断风险。

Description

通过免疫色谱法定量测定液体样品中分析物的方法

本发明涉及通过免疫色谱法定量测定液体样品中至少一种目标分析物的方法，以及为此目的而开发的装置。

看起来到二十世纪八十年代末期，免疫色谱法这项技术已有极大进展。它目前具有广泛应用，从传统的医学或兽医诊断学领域到环境领域或食品领域。

免疫色谱法属于基于特异结合的成对成员之间的亲和性结合反应的诊断方法类，并统称为通用术语免疫测定。

通常，根据使用的方法将免疫测定分成两大类：一类涉及所研究分析物与标记的分析物之间对特异性配体的竞争；另一类称为“夹心”技术，其中，分析物与第一特异性配体的结合被固定在所述分析物上的标记的第二特异性配体所显示。

免疫测定已稳步发展成为越来越容易使用的装置，并使快速和价格适中的常规诊断方法得到发展。

随着“治疗点”或“在家测试”诊断学的出现，这种发展在医学领域已变得特别重要，在“治疗点”或“在家测试”诊断中，在患者床边或住处进行诊断而无需自动化实验室分析。

免疫色谱法属于用于上述类型的快速诊断的技术。

免疫色谱法是使用干式化学处理和在惰性膜上横向迁移的固相诊断方法。这种方法使用条状的多孔载体，其中整合有干形式的进行检测所需的试剂。处理所述膜使得特异结合配偶体(通常为抗原/抗体)之间的识别反应发生在预定区带中并且在该位置能够被显示。示意性地，当待分析样品被沉积到载体上时，其通过毛细管作用沿着膜迁移。固定在膜的预定区带上的特异性配体捕获所研究的分析物，并且使用夹心方法通过标记的第二特异性配体显示该反应。

还可以在免疫色谱法中使用竞争类型的反应。在该情况下，使用与所研究分析物竞争的标记的分析物结合固定的配体。对该类型的检测，还可以使用标记的配体：在该情况下，所研究的分析物与固定的分析物竞争。

最后，当通过免疫色谱法研究抗体时还可以使用血清型反应。在这种情况下，测定是可能的。将对疾病特异的抗原固定在载体上。它能够捕获样品中存在的对该抗原和该疾病特异的人抗体。加入针对人免疫球蛋白的第二抗体后显示人抗体的存在。对这种血清学检测，甚至可能测定抗体类型以确定检测到的人抗体类型(IgM、IgG或IgA)(图1显示了免疫色谱法检测条的原理)。

一些现有技术文献描述了免疫色谱检测和装置以及针对某些应用的特殊改装。下文非穷举地列出了可以引用的文献：美国文献US-A-5591 645、US-A-5 120 643和欧洲专利EP-A-0 299 428或EP-A-0 250137，它们描述了免疫色谱检测的基本原理，包括允许液体通过毛细管作用迁移和通过固定在检测条上预定区带中的特异性试剂捕获所研究分析物的检测条；EP-A-0 291 184，它描述了由包含反应载体的中空容器组成的特定分析装置；EP-A-0 383 619，它涉及特定的膜载体；以及EP-A-0 267 006，它描述了用于同时检测样品中存在的几种分析物的定性免疫色谱方法。

然而，现有技术中描述的涉及免疫色谱法的大多数快速单一检测是基于肉眼读取的定性的有/无类型检验。然而，以该方式读取的主观性是变化和混淆的来源。此外，这种检测不能用在存在决定取舍点的某些应用中，例如在止血领域中存在某些血栓形成的排除标记物，例如D-二聚物。

因此，亟需能够尽可能简单地量化所得结果的方法。

最早的通用方法之一是使用称为过程控制区带(PCZ)的特定内部参照物的方法(参见，例如EP-A-0 542 627；国际专利申请WO-A-96/0179、WO-A-94/07163或AN，C D，YOSHIKI T，LEE G andOKADAY，Cancer Letters 2001，162：135-139；CHAN，C P Y，SUM K W，CHEUNG K Y，GLATZ J F C，SANDERSON J E，HEMPEL A，LEHMANN M，RENNEBERG I and RENNEBERG R，J ImmunolMethods，2003，279：91-100)。

示意性地，在该系统中，使待分析样品在沉积到免疫色谱检测条的过程中与针对所研究分析物的特定偶联物接触。

所述偶联物结合所研究分析物且形成的复合物沿膜向分析物的特异性检测捕获区带迁移。此区带处显示的颜色与所研究分析物的浓度成比例。在检测条上检测捕获区带下游的PCZ区带处捕获没有结合分析物的过量偶联物。该PCZ区带包括对使用的偶联物特异的固定的试剂。实际上，使用该方法，偶联物通常为动物源的单克隆抗体，并且固定在该PCZ区带上的试剂为针对该动物物种的偶联物的抗物种抗体。

尽管该系统在原理上相对简单，但该系统有某些缺点：同样的偶联物试剂用来显示检测和对照。由于这个原因，PCZ信号极大地依赖于分析物的浓度。对高浓度，在极端情况下信号能够被极大地减弱或者甚至缺失。

而且，在这种对照系统中，没有对与样品和膜相关的变化作加权。

在其它方法中，EP-A-0 088 636描述了基于使用迁移载体上隔开的、对相同分析物特异的多个连续反应区带的定量分析方法。

WO-A-91/12528描述了也使用多区带检测条的定量免疫色谱方法，其中，示意性地，所研究的分析物被夹在两个特异性试剂之间，这两个特异性试剂中的一个与标记物偶联，另一个与生物素偶联。从所述相互作用中得到的产物沿检测条迁移，并在检测区带被捕获试剂捕获，捕获试剂由固定在胶乳颗粒上的抗生物素蛋白组成，它们均被固定在检测条上。

WO-A-97/09620涉及定量或半定量检测样品中分析物的方法，包括使用校准试剂并基于多个区带的存在，其中至少一个区带用于校准，一个用于测量且最后一个区带用于证明该检测正常运行。

WO-A-00/43786描述了用于量化免疫色谱法所得结果的方法，其显示与颜色相关的结果，其中，对信号颜色或颜色强度应用数值或数值的范围，并将结果的颜色与内部校准参照物的颜色进行比较。该参考文献中采用的方法实际上是半定量检测方法，定义了与所研究分析物的参照浓度相对应的参照颜色强度。该方法没有使用测量仪器和预先校准，而它们是保证定量检测的结果可靠的仅有方法。

WO-A-97/37222和WO-A-02/077646涉及使用RAMP^TM(快速抗原测量平台)装置进行的定量免疫色谱方法。那些方法在应用方面相对复杂。它们涉及区分应用样品的区带和使样品与对所研究分析物特异的试剂相接触的区带。而且，它们使用能够特异结合期望分析物的颗粒群作为检测试剂，该群与期望分析物一起向检测区带迁移。

本发明旨在提供简单通用的定量免疫色谱方法，尽管由于诸如样品(粘性、成分等)或膜(结构的微观不均一性)等因素引起的某些波动，该方法还是保证可靠的结果，该方法使用特定的加权系统。

特别地，本发明提出使得能够收集与寻找的分析物的存在有关的信号以及对照信号的方法，后者的选择独立于涉及分析物的主要反应，因此保证对照信号的稳定性且因此保证检测结果的客观性。

因此，本发明提供这种类型的方法和装置，其中，将生物样品沉积在多孔材料条带的一端，样品通过毛细管作用向条带的另一端迁移，样品在开始迁移时与检测产品(捕获试剂)相接触，检测产品能够与待分析物质(分析物)以及对照产品(对照试剂)形成特异结合复合物。所述物质与检测产品形成的复合物在样品向包含检测区带的条带的另一端迁移期间转移，在检测区带内沉积有针对该复合物的捕获试剂。对照产品也通过样品向包含对照区带的条带另一端迁移而被转移，其中针对对照产品的捕获试剂已沉积在对照区带中，检测区带靠近对照区带。

检测试剂和对照产品包含任何类型的检测或标识标记，这些标记可通过光学的、磁学的、电磁学的或其它方法检测。

在一特定方面，本发明提供通过免疫色谱法定量测量液体样品中至少一种目标分析物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包括条状的固体载体的免疫色谱装置，所述载体包括样品应用区带、迁移区带、每个所研究分析物的特异性捕获区带和比值计量测量对照区带(RMC)，所述特异性捕获区带或每个特异性捕获区带包含固定在所述载体上的捕获试剂，所述捕获试剂与所研究分析物之一形成特异结合对，所述RMC区带包含固定在载体上的对照捕获试剂，所述试剂与带有可检测标签的对照试剂形成特异结合对；

b)使样品与带有可检测标签的对照试剂和偶联物或偶联物的混合物相接触，每个偶联物由与所研究分析物之一形成特异结合配偶体且带有可检测标签的试剂组成，所述可检测标签与对照试剂的标签在相同波长处吸收；

c)将已经与对照试剂和偶联物或偶联物的混合物相接触的样品沉积到载体的样品应用区带上；

d)将所述装置保持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个特异性偶联物形成结合对，以及使一个或多个所研究的分析物和对照试剂通过毛细管作用沿着固体载体迁移到每一个针对一个或多个所研究分析物的特异性捕获区带和RMC区带；

e)将所述装置保持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个捕获试剂在一个或多个捕获区带中进一步结合，以及使对照试剂与对照捕获试剂在RMC区带结合；

f)测量由每个捕获区带中与所研究分析物结合的偶联物产生的检测信号的强度和由RMC区带中对照试剂产生的RMC对照信号的强度；

由此，样品中每个目标分析物的量(或比值)与每个检测信号和RMC对照信号的比值直接成比例。

本发明还涉及使用本发明方法定量分析样品中一个或多个分析物的免疫色谱装置，包括条状的固体载体，所述载体包括样品应用区带、迁移区带、用于每个所研究分析物的特异性捕获区带和比值计量测量对照区带(RMC)，其中所述RMC区带包含固定在所述载体上的对照捕获试剂，所述试剂能够与带有可检测标签的对照试剂通过特异结合形成对。

根据本发明，沿着免疫色谱膜迁移且随后被固定在RMC区带中的对照捕获试剂所捕获的对照试剂与所研究的分析物没有交叉反应。因此提供了其强度独立于样品中所研究分析物的浓度的信号。同样，可以选择对照捕获试剂使得其不干扰所述剂量的其它试剂，所述干扰在抗体的情况下特别是任何交叉反应，所述其它试剂特别是用于捕获分析物的试剂。

因此在此区带中形成的信号通过加权某些实验条件的影响证实观察到的结果，所述实验条件例如样品的粘度和成分、膜的物理化学性质的不同等等。

使用能够提供数字结果和消除任何主观性的信号读取装置可有利地测量使用本发明方法得到的信号。

在本发明方法中，可以在向载体的应用区带沉积之前向样品中加入对一个或多个所研究分析物特异的偶联物或偶联物的混合物以及RMC对照试剂。在这种应用中，随后将样品/偶联物/RMC试剂混合物依照上述方法中的步骤b)和c)沉积到应用区带上。

在本发明的第二优选方面中，使用干形式的偶联物或偶联物的混合物和RMC对照试剂。它们随后被包含在样品应用区带的储器中，并且液体样品与偶联物或偶联物的混合物和RMC对照试剂的接触发生在将样品沉积在载体的加样区域上时。样品的沉积引起偶联物和RMC对照试剂溶解，引起一个或多个偶联物结合它们的特异性分析物，并且引起每一分析物及其特异性偶联物之间形成的复合物、RMC试剂以及可能存在的没有与分析物反应的过量偶联物通过毛细管作用沿着载体迁移。

在本发明的一个特定应用中，将样品沉积在已浸透的储器中(例如在使用PBS-1％Regilait-5％蔗糖浸透溶液的饱和浴中(以0.5ml/检测至1ml/检测的量))。

在这种特定的变化中，本发明提供：通过免疫色谱法定量测量液体样品中至少一种目标分析物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包括条状的固体载体的免疫色谱装置，所述载体包括样品应用区带、迁移区带、用于每个所研究分析物的特异性捕获区带和比值计量测量对照区带(RMC)，所述应用区带包括含有带可检测标签的对照试剂和偶联物或偶联混合物的储器，每个偶联物由能够与所研究分析物之一形成特异结合配偶体并带有可检测标签的试剂组成，该可检测标签与对照试剂的标签在相同波长处吸收，所述RMC区带包含固定在载体上的对照捕获试剂，所述试剂与带有可检测标签的对照试剂形成特异结合对；

b)将样品沉积到载体的应用区带；

c)将所述装置保持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个特异性偶联物形成结合对，并且使一个或多个所研究分析物和对照试剂通过毛细管作用沿着固体载体迁移到每一个针对一个或多个所研究分析物的特异性捕获区带中和RMC区带中；

d)将所述装置保持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个捕获试剂在一个或多个捕获区带处进一步结合，并且使对照试剂与对照捕获试剂在RMC区带处结合；

e)测量由每个捕获区带中固定在所研究分析物上的偶联物产生的检测信号的强度和由RMC区带处对照试剂产生的RMC对照信号的强度；

由此，样品中每个目标分析物的量(或比值)与每个检测信号和RMC对照信号的比值直接成比例。

根据本发明的第一个实施方案，如下进行测定：操作人员将待分析的样品沉积在检测条的一端，任选地与迁移缓冲液一起沉积，然后启动记时器。随后将检测条置于能够读取结果的装置中，当从启动记时器的时间起经过预定的时间后操作人员启动该装置。通过检测条的检测和对照区带中的标记所产生的信号来读取结果，之后产生记录信号的比值并使用校准曲线或表从所述比值确定液体样品中存在的物质的量。在检测和对照区带中检测到的信号的比值抵消了由于样品的某些特性(其性质、粘度、蛋白质或离子含量等等)和条带的某些特性(特别是其结构和组成的微小变化)造成的变化。在检测和对照区带中检测到的信号的比值基本上是样品中待测定物质的浓度的函数，并且至少据初算，其独立于样品和条带的所述特性。

然而，已证实如此产生的测定的准确性很大程度上依赖于操作人员，为了保证结果的质量和可靠性，在每次测定中操作人员必须遵循相同的步骤，实践中这并不总是可能的。尤其是，如果操作人员在向条带上沉积样品和任选的迁移缓冲液后启动记时器时过快或过慢，测定结果可能会有相对较大的不同。

操作人员还可能会犯错误，例如忘记启动记时器或没有添加迁移缓冲液，这意味着当发现错误时必须重复测定，通常由于缺失结果才发现错误，由此浪费了很多时间。

由于这些原因，根据另一实施方案，本发明描述了提高测定结果的准确性和可靠性的定量测定方法和装置。

根据这个实施方案，本发明涉及上述类型的定量测定方法和装置，它能够避免操作人员的错误并保证了良好的可重复性和测定可靠性。

为此，本发明提供通过免疫色谱法定量测定液体样品中存在的物质的方法，遵照本申请的说明书且其特征在于其还包括在样品迁移开始时自动检测标记向检测条上给定区带中的推移、自动开始对检测标记的所述推移的预定时间段的记时、以及在所述时间段结束时自动开始获取检测条的检测区带和对照区带中标记产生的信号。

特别是，涉及的定量测定方法包括使液体样品与能够与待测定物质反应形成复合物的偶联物接触，并使所述液体样品与对照产品接触，所述偶联物和对照产品包含检测标记；样品在毛细管作用下与偶联物和对照产品在多孔材料条带中迁移，其中多孔材料条带包括含有能够与复合物反应的试剂的检验区带和含有能够与对照产品反应的试剂的对照区带；检测由检测区带和对照区带中的标记产生的信号；得出所述信号的比值并且由所述比值推断出样品中存在的物质的量；所述方法的特征还在于该方法还包括在样品迁移开始时自动检测标记向检测条上给定区带的推移、自动开始对检测标记的所述推移的预定时间段的记时、以及在所述时间段结束时自动开始获取检测条的检测区带和对照区带中标记产生的信号。

可以根据定量测定分析物方法或实施该方法的装置的特征的不同变量进行包括自动检测步骤的所述方法。

根据包括自动信号检测的这个实施方案，本发明方法因此规定当样品已在条带中迁移了一定距离时开始倒记时，即，在其间可能发生与测定反应相关的干扰的初始阶段之后，所述干扰可能发生在样品或迁移缓冲液向检测条上沉积时或偶联物溶解时或复合物形成时。在此初始阶段之后开始倒计时保证了在获得结果之前所有样品在检测条中的恒定迁移时间，如果在沉积样品或迁移缓冲液开始或结束时或在溶解偶联物期间或在复合物形成期间开始倒计时将不会是这种情况。

因此，显著提高了结果的质量和测定的可靠性。

在优选实施方案中，结果的获得包括测量由检测和对照区带中的标记所产生的信号面积、得出这些面积的比值以及从这个比值和校准曲线或表中推断样品中存在的物质的量。

根据本发明的其它特征，所述标记在给定波长处具有光吸收峰，并且所述方法包括在此波长处照射条带、使用至少一种光电探测器在该波长处测量由所述标记反射或漫射的光强度以及处理由所述光电探测器发出的信号以获得由所述标记产生的信号面积。

有利地，所述光电探测器与用于扫描检测条的装置相连以捕获由标记产生的信号并将所述信号面积确定为扫描距离的函数。

本发明还涉及用于进行上述方法的免疫色谱装置，所述装置包括条状的固体载体，所述载体包括样品应用区带、迁移区带、针对每个所研究分析物的特异性捕获区带和比值计量测量对照区带(RMC)，其中所述应用区带包括含有干形式的、带有可检测标签的对照试剂以及偶联物或偶联物混合物的储器，每个偶联物由与所研究分析物之一形成特异结合配偶体并带有与对照试剂的标签在相同波长处吸收的可检测标签的试剂组成，RMC区带包含固定在载体上的对照捕获试剂，所述试剂与带有可检测标签的对照试剂形成特异结合对。图2示意性地显示了所述装置。

根据本发明装置的应用，检测条的膜由多孔惰性材料制成以使得所包含的毛细管的流量在50秒/4cm至150秒/4cm之间，特别是低于100秒/4cm，例如从90秒/4cm。形成检测条的载体的孔大小可以是10μm。

在本发明的特定应用中，能够与分析物特异反应形成结合物的偶联物为抗体，例如针对分析物的第一抗原性位点的单克隆抗体。与偶联物结合的分析物捕获试剂也可能是抗体，例如针对分析物第二位点的单克隆抗体。

在本发明的特定应用中，RMC对照捕获试剂(或化合物)也是抗体，例如多克隆抗体。

可以通过蒸发检测条来沉积形成与分析物结合的偶联物的试剂和对照捕获试剂。

上文描述的本发明方法中，PCZ的使用是任选的。这种情况下该类型对照的作用限于证实所研究分析物的特异性偶联物是否已经复合或反应后是否还有过量的未使用的偶联物。

在储器中提供偶联物一方面能够保证储存，另一方面能够保证偶联物和样品向迁移膜的一致迁移。向包含偶联物储器的检测装置中加入样品后，示踪剂溶解。示踪剂从储器中“释放”或“浸出”到迁移膜上。通常在最佳条件下进行导致检测和/或测定的其余反应。

用来作为偶联物储器的材料为无纺材料。可以使用下述材料：玻璃纤维(GF)，它是最常用的；其次为纤维素过滤器和亲水聚酯。

通常预处理偶联物储器，该处理为用浸透试剂，即蛋白质和/或表面活性剂，先行浸透。在所述浸透之后，接着在37℃的温度下(通常)快速干燥，通过浸没或印刷沉积偶联物。

使用储器使得能够控制释放的偶联物的量、所述释放的速度以及偶联物在膜上的迁移。

RMC区带在载体上放置的方式与实施本发明方法无关，条件为它与每一捕获区带都分开。RMC区带和捕获区带之间的间隔可以在3至10mm之间，有利地约为5±0.5mm。为了简化，RMC区带优选位于其它检测捕获区带的下游。

可以有利地进行本发明的方法以同时定量多个分析物，然后在特定捕获区带停止每个分析物在载体上的迁移，并通过特异性偶联物显示。

使用单一RMC有利地进行每个分析物浓度的定量。在这种情况下其足以计算每个检测信号对RMC信号的比值。

如上所述，在RMC区带中捕获的对照试剂与所研究的分析物没有交叉反应，这保证了独立于所研究分析物的浓度和性质的RMC信号强度。

例如，在对人源样品进行测定的情况下，RMC选自与所研究分析物没有交叉反应的动物源分子。

因此，对照试剂可以选自某些动物源的免疫球蛋白，例如鸡免疫球蛋白。

这种情况下的捕获试剂是针对该动物物种的所述对照试剂的抗体，即鸡抗免疫球蛋白抗体。

由RMC对照试剂及其特异性捕获试剂形成的结合对优选抗原/抗体类型。

然而，结合对可由其它亲和性配偶体组成，例如胶乳或脂质体类型，或如下对：抗生物素蛋白(链霉抗生物素蛋白)/生物素、蛋白A/免疫球蛋白(Ig)、蛋白G/Ig、外源凝集素/伴刀豆球蛋白A(Con A)、抗-结合珠蛋白/血红蛋白。

用于偶联物和RMC试剂的标签通常有两种类型：

·直接的，例如特定的标签(金、胶乳、碳、聚碳酸酯的颗粒)和着色剂、着色的葡聚糖、荧光示踪剂等等。这些标签本身无需附加的反应就可检测出。

·间接的，例如需要显示反应的酶标签，该显示反应的产物被检测和/或测量。

优选地，偶联物或偶联物混合物上的标签与用于RMC对照试剂上的标签相同。尽管如此，可以使用不同的标签，条件是它们在相同的波长处吸收，使得在测量期间总是可以建立相关性。

优选地，使用的标签为颗粒类型，这种情况下为诸如胶体金的金颗粒。

如上所述，使用能够以诸如反射率或透射率的任意单位测量检测信号和RMC信号的检测条读取装置有利地进行所研究分析物浓度的定量测定。

所称的最终测量为检测信号/RMC比值。因此，测量的比值对应每一个进行的检验。

首先，通过测定多个浓度的参照分析物建立标准曲线。对给定的分析物，这个标准曲线作为确定样品中分析物数量的参考，它对应测量的检测信号/RMC信号比值。标准曲线的值还对应由给定浓度的参照分析物得到的信号与唯一的RMC信号的比值。技术人员选择RMC信号以建立标准曲线，并且与曲线的平台部分的值相反，RMC信号对应RMC捕获试剂-RMC之间形成的复合物的值，该复合物产生位于信号/复合物曲线上升部分的信号(RMC信号)。

其次，将所进行测定的测量的比值转换为这种标准曲线。然后就可能将测量的比值转化为所研究分析物的浓度。

因此通过参考标准曲线进行样品的所有测定，该标准曲线被读取装置以适合的表达形式(图表、条形码等)跟踪或存储。

以如下方式有利地实现所述装置：将检测条构成的固体载体装在外壳中。该外壳通过防止液体渗漏影响样品在储器和膜水平上的流动。还可以使其适合于读取系统。

通常用在免疫色谱检测中的检测试剂为胶体金，它在535nm处有吸收峰。这种情况下，对于检测，读取装置可以装配有两个在530nm处发射的LED(发光二极管)源。

对于这种应用，两种类型的光(透射的和反射的)具有不同的特征：

·反射率或多或少独立于环境，并且所使用的装置对检测条本身没有影响；

·透射率高度依赖于装置，尤其是在其中嵌入有反应条的材料。

这意味着根据所使用材料的性质和厚度，测量透射率可能较容易或较困难。

反射和透射光的测量值与被偶联到胶体金颗粒上的特异性试剂(偶联物)所捕获的分析物的浓度成比例。

本发明的示例中，优选使用反射率。

本发明还涉及制造所述测量装置的方法和由该方法获得的装置，所述方法包括如下步骤：

-在膜上包被(或固定)，使得液体能够通过毛细管作用流动，一方面通过样品中测定分析物的剂量试剂的方式，另一方面通过捕获对照试剂的方式；

-干燥预先包被的膜，例如在35℃和40℃之间的温度下，尤其是在37℃下，例如持续30分钟，例如在通风的恒温箱中。

在本发明的实施方案中，制造测量装置的方法不包括任何浸透步骤，也不包括包被之后对膜的任何清洗步骤。

在本发明的实施方案中，通过包被试剂的方式实施制造测量装置的方法，该包被试剂是捕获抗体，例如单克隆抗体。必须以获得良好限定的包被道的方式确定沉积试剂的量。

包被后干燥温度的确定取决于组成分析物捕获试剂和捕获对照试剂的分子。

使用分析物检测和对照的捕获试剂的标记(或示踪剂)时无需将它们连接到基质上(例如胶乳颗粒)。换句话说，在偶联过程结束时捕获试剂被标记，例如通过吸收捕获试剂上的标记以提供偶联物，其随后能够被纯化，例如通过离心。

本发明特别提出了进行所述方法的装置，包括由带有至少一个用于沉积样品的开口和用于读取检测条上检测区带与对照区带中结果的窗口形成的条带支持物，对应本申请所述的特征，所述装置还包括捕获检测区带和对照带区中的标记所产生信号的装置，所述装置的特征在于它包括在样品迁移开始时检测标记向检测条上给定区带中推移的装置、测量时间的装置和控制测量从检测标记向检测条上给定区带中推移时算起的时间的所述装置的装置，以及用于在推移预定时间后捕获信号的控制装置。

这种装置也可以由包括本申请描述的变量特征构成。

有利地，检测标记在检测条的所述区带中推移的装置由用于捕获检测和对照区带中的标记所产生信号的装置构成。

所述检测和捕获装置包括在给定波长处照射检测条的装置以及至少一个与扫描检测条的被照射区带的装置相连的光电探测器。

所述装置还包括确定检测和对照区带中的标记所产生信号的面积的装置和计算所述面积比值的装置以及从已存储在存储器中的标准表或曲线确定样品中期望物质的量的装置。

检测条的支持物包括在其中放置和固定有条带的具有顶面的外壳，该顶面包括至少一个开口用于在样品迁移开始时检测标记的推移和捕获标记在检测与对照区带中产生的信号。

所述开口在样品迁移方向上延伸，其一端包括迁移开始时标记通过的所述区带，而其另一端包括检测和对照区带。

如将在实例中更详细说明的，本发明方法对紧急情况下进行医学诊断排除某些疾病提供了帮助，限制对某些侵入性研究或昂贵分析的依赖。

这种情况，例如在止血领域中，包括深静脉血栓形成的静脉血栓栓塞和肺栓塞的诊断。

据估计，在法国仅肺栓塞每年可影响近100 000名患者，造成10000至20000人死亡。因此，它是可能涉及所有类型患者的严重疾病，无论是住院的还是能走动的。因为不能通过临床检查简单地诊断，诊断涉及诸如血管扫描仪、血管造影术或闪烁扫描术的昂贵成像(有时是侵入性的)的互补检查，通常与下肢的Doppler扫描相连。因此，诊断需要昂贵的仪器和专业人员，这在健康机构并不总是可以获得的。此外，可能需要若干检查以确定地排除肺栓塞的诊断，或与此相反，以确定是该病，因此证明使用有效的抗凝剂治疗是正当的。然而，应注意的是，在归入急诊的能走动的患者中仅有不到三分之一通过探察被证实肺栓塞的诊断，因此关注开发非侵入性生物学检测，它能够确认或排除肺栓塞的诊断，更广泛的，静脉血栓栓塞的诊断。大多数检测涉及凝结活化标签，特别是纤维蛋白溶解，尤其是D-二聚物——纤维蛋白的特异降解产物。已清楚地确定了测定D-二聚物以排除肺栓塞诊断的重要性。

D-二聚物作为纤维蛋白凝块在血纤维蛋白溶酶作用下的降解产物出现。凝结活化期间产生的凝血酶切割纤维蛋白原分子，造成在释放两个小肽(FPA和FPB)后产生纤维蛋白单体，该单体随后聚合(可溶凝块)。凝块(不溶凝块)的稳定性取决于因子XIII，它的活化形式是谷氨酰胺转移酶，该酶可通过纤维蛋白分子的D结构域交联涉及的纤维蛋白分子。纤维蛋白溶解系统的活化随后通过产生血纤维蛋白溶酶引起由此形成的血栓的溶解。血纤维蛋白溶酶对纤维蛋白的蛋白酶作用导致释放不同大小的可能的切割片断，包括D-二聚物，与最初的血栓形成过程相比它出现的相对晚一些。在生化水平上仅有异种降解产物的组装。应注意在纤维蛋白溶解系统的病理性活化过程中血纤维蛋白溶酶也能够切割纤维蛋白原和其他凝结因子。来自纤维蛋白原或纤维蛋白降解的产物被总称为FDP纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物。因此，D-二聚物反映了受到因子XIII作用的聚合纤维蛋白分子被血纤维蛋白溶酶溶解。

血浆D-二聚物的含量被认为是纤维蛋白凝块形成及其溶解的良好指示。它在一些临床病例中增高：深静脉血栓、肺栓塞、弥漫性血管内凝血(DIVC)、外科手术、癌症和硬化等等。D-二聚物的含量因此成为很有价值的工具，用于帮助诊断排除静脉血栓栓塞(VTED)，无论是深静脉血栓(DVT)还是肺栓塞(PE)。

由于此原因，开发用于定量测定的独立于用户试验和环境条件的足够可靠的快速检测特别有利于限制对诸如肺血管造影术、静脉造影术或肺闪烁造影术等检查的依赖。

以下实例说明了使用本发明方法测定血液样品中的D-二聚物。

在本发明的有利的实施方案中，如实例所说明的，剂量方法提供结果，其特征在于测量的变化系数(CV)具有阀值为约500ng/ml的D-二聚物，如果信号读取线再远离1毫米，该变化系数达到10％，如果不是从6％至8％的话。

依照本发明定量测定的血液样品例如为血浆样品。可以将约30μl量的血浆沉积在检测条上以进行检测。读取检测得到D-二聚物的含量，从检验分析物的信号测量值和RMC对照的信号测量值之间的比值得到该结果。

本发明还涉及通过免疫色谱法进行测量液体样品中至少一种目标分析物的定量方法的试剂盒，包括：

·惰性载体，在其上的不同区带中固定有称为捕获化合物的不同类型的化合物，使得(i)对于分析物的每一捕获化合物，当所述分析物与由带有可检测标签的试剂构成的偶联物形成特异结合配偶体时，通过所述捕获化合物和包含在样品中的分析物之间的特异性结合反应捕获检测样品中预先确定的分析物，以及(ii)对于对照试剂的捕获化合物，捕获带有可检测标签的对照试剂；

·偶联物或不同偶联物的混合物，每个偶联物由能够与生物样品中所研究的预先确定的分析物特异结合的试剂构成，所述偶联物还带有可检测标签，所述偶联物被包含在浸透的偶联物储器中；

·在与偶联物标签相同的波长处吸收且带有可检测标签的对照试剂(RMC：比值计量测量对照)；

·对于每个分析物，对所述分析物特异的标准曲线，通过测定多个浓度的与偶联物缔合的参照分析物以及通过在相同条件下测定给定浓度的对照试剂(RMC)建立标准曲线，曲线上的每个点对应由与分析物缔合的且被分析物捕获化合物所捕获的偶联物产生的信号和由被对照试剂的捕获化合物所捕获的对照试剂所产生的信号之间的比值；

·一个或多个支持物(基础)，以包含用于进行检测的惰性载体；

·如果适合，包含所述惰性载体及其附件的容器以组成放置在信号读取器中的盒子；

·如果适合，使用所述试剂盒测量一种或多种分析物的数量的说明书。

特别地，将捕获化合物固定(包被)在条状的惰性膜上，例如硝酸纤维膜。

在实例和图4中说明了包括检测条的装置的不同部分。

在本发明方法或试剂盒的特定应用中，捕获化合物为捕获抗体，特别是用于捕获分析物的单克隆抗体和用于RMC捕获的多克隆抗体。

将分析物捕获抗体以1.5-4mg/ml的浓度固定在惰性载体上，例如约2±0.1mg/ml。

将对照试剂捕获抗体以0.5-2mg/ml的浓度固定在惰性载体上，例如约1±0.05mg/ml。

参考附图阅读下述作为实例的描述会更好地理解本发明，其中：

图1非常示意性地描述了用于免疫色谱法的检测条；

图2说明依照本发明剂量的一般原理；

图3示意性地说明了结果读取装置的使用；

图4示意性地描述了免疫色谱法检测条的组装方式；

图5描述了校准的标准曲线；

图6描述了用于依照本发明剂量的装置的主要组件；

图7是被光电探测装置所捕获的光信号的强度作为时间的函数而变化的曲线图；

图8是说明获得由检测条的检测和对照区带中的标记所产生信号的曲线图。

图1为检测条免疫色谱法原理的概要。

这种检测条分别包括：

·将样品沉积于其上的沉积区带1；该沉积区带与含有干形式偶联物的储器一起显示；

·捕获区带2，其包含对所研究分析物特异的固定的捕获抗体；

·PCZ区带3，其包含对偶联物特异的固定的捕获抗体。没有与样品中分析物反应的过量偶联物沿着膜向PCZ区带迁移，捕获抗体使其停止在PCZ区带；

·吸收剂4，它作为样品中分析物沿反应检测条推移所引发的免疫学反应的泵和堆存处。它增加了整个装置的吸收容量以最终“清扫”迁移膜，在该膜上发生导致测定的免疫学反应。

图2显示本发明装置的一般原理。在此图中，假定只研究一个分析物。膜5分别包括：

·将样品沉积于其上的沉积区带1。在这个实例中，偶联物和RMC对照试剂以干形式位于沉积区带区域的储器6中；

·捕获区带2，其包含对所研究分析物特异的固定的捕获抗体；

·RMC区带7，其包含对标记的对照试剂特异的固定的捕获抗

·体。通过将样品沉积在沉积区带上使这种对照试剂溶解，这种对照试剂通过毛细管作用沿着膜向RMC区带迁移，在RMC区带上被对照捕获试剂特异捕获。然后，在此RMC区带上形成完全独立于待分析物浓度的信号；

·吸收剂4，它作为样品中分析物沿反应检测条推移所引发的免疫学反应的泵和堆存处。它增加了整个装置的吸收容量以最终“清扫”迁移膜，在该膜上发生导致测定的免疫学反应。没有与样品中分析物或RMC捕获试剂反应的过量偶联物沿着膜迁移，随后由吸收剂吸出。

图3总结了结果读取装置的作用原理。

在此图中，读取器8测量由免疫色谱法检测条5反射的光9和透射的光10。

使用两种不同的光源11和11’照射检测条5。

图4为显示免疫色谱法检测条组装的剖视图。

形成检测条(尺寸为7cm±5mm)组成部分的载体的实际尺寸为：

12＝基础(粘性支持物)(70mm)；

13＝包被的硝酸纤维膜(40mm)；

14＝偶联物的储器(7mm)；

15＝过滤器(16mm)；

16＝吸收剂(18mm)。

包被的位置：

吸收剂/硝酸纤维膜        ＝AB＝4mm

偶联物储器/硝酸纤维膜    ＝CD＝1mm

过滤器/偶联物储器        ＝DE＝6mm

图5说明用于校准的标准曲线的实例，作为检测/RMC比值的函数给出D-二聚物浓度。

图6的装置主要包括由塑性材料形成的外壳20，其中放置和维持有多孔材料的检测条22，用虚线表示检测条22的轮廓，外壳20的顶面包括用于在检测条22的一端沉积液体样品和任选的迁移缓冲液的开口24和具有长条形状的读取窗口26，该读取窗口例如可延伸到检测条22的约一半的长度，以接近该检测条与液体样品的沉积位置相对的末端。

从基于硝酸纤维的材料生产检测条22，例如，通过开口24沉积的液体样品可以在检测条22中通过毛细管作用迁移。

如上所述，在开口24和窗口26的一端28之间，检测条22可以包括区带30，在该区带上首先已沉积了旨在与液体样品中待测定物质形成复合物的偶联物以及其次，迁移对照产品。

窗口26中呈现的检测条部分在接近其另一端32处包括检测区带34和对照区带36，以检测条上的横线表示，检测捕获试剂和对照捕获试剂已分别沉积在所述区带上。

检测区带或线34的试剂旨在捕获由偶联物和待分析物质形成的复合物。对照线试剂36旨在捕获沉积在条带的所述区带30中的对照产品。

作为例子，在测定D-二聚物的情况下，以干形式沉积在区带30中的偶联物为来自Diagnostica Stago(France)的LiatestD-DI试剂盒中称为9C3或8D2抗体的F(ab)’₂抗-D-二聚物/F(ab)’₂9C3片断，也以干形式沉积的对照产品为抗生物素抗体或鸡IgG抗体；检测区带34的捕获试剂为抗-D-二聚物/2.1.16抗体，对照区带36的捕获试剂为γ生物素或鸡的抗体-IgG，对照产品和该产品的捕获试剂与待分析物质没有任何交叉反应。

沉积在区带30中的偶联物和对照产品包括检测或标识标记，它们可以是任何类型的，例如颗粒标记(金、胶乳、碳、聚碳酸酯颗粒等)或着色剂、荧光示踪剂或酶标记。

在本发明一个优选的应用中，用于偶联物和对照产品的标记为胶体金颗粒，它在530nm波长处具有光吸收峰值使得可通过如下方法检测所述标记：用在530nm波长处或在与该值非常接近的波长处发射的光源38照射条带并且在对所述波长敏感的光电探测器或一组光电探测器40中形成被照射区带的图像。

优选地，光源38和光电探测器40位于检测条的同一侧，在外壳20的窗口28之上，通过反射测量光强度。在变体中，光源38和光电探测器40可分别位于检测条的两侧，随后通过透射进行测量。

数据处理装置42控制光电探测器或一组光电探测器40，该装置还控制光源48的操作以及接受来自检测装置40的输出信号。当使用单一光电检测器或排列在检测区带34或对照区带36之上的一组光电探测器时，所述光电检测装置与扫描装置相连，该扫描装置使得它们在当液体样品迁移时连续瞄准被液体样品覆盖的检测条中的不同区带。作为例子，所述扫描装置可以包括用于将外壳20沿与检测装置40有关的箭头44所示方向移动的装置。也可能使用光学扫描装置或光电探测器阵列，使得扫描装置的使用成为冗余。

在测定血浆样品中D-二聚物的情况下，本发明的测定方法如下：

将固定体积的血浆沉积在支持物20的开口14中，随后将固定体积的迁移缓冲液沉积在所述开口中。沉积在开口20中的液体在毛细管作用下在检测条22中向其相对末端方向移动，并且最初经过包含用作检测和对照产品的偶联物的区带30。偶联物被样品和迁移缓冲液溶解并与D-二聚物反应形成复合物。所述复合物在检测条22中与对照产品一起通过毛细管作用迁移，因此向窗口26的一端28移动。

在此期间，将外壳20置于提供有光源38、检测装置40、数据处理装置42和与检测装置40相连的光学扫描装置的读取器中。

在这个读取器中，窗口26的一端28被光源38照射并通过检测装置40观察。当检测条22中的迁移开始时，复合物和对照产品到达窗口26的一端28，由检测装置40检测它们的标记。

图7图解显示了检测装置40的输出信号，其对应标记的检测，该图显示检测装置40捕获的光强度作为时间的函数的变化。标记在窗口26的一端28一出现，检测装置40捕获的光强度I就减少，经过最小值随后逐渐增加到平台区，在平台区期间在检测区带34和对照区带36进行测量。

标记出现在窗口的一端28的那一刻该信号的前边缘非常陡峭，可以用来借助数据处理装置42启动记时器，该数据处理装置42以常规方式装配了产生时间信号的记时器。

图8图解显示了由观察检测区带34或对照区带36的检测装置40产生的测量信号，其中曲线C对应光强度作为扫描距离(d)的函数的变化。所述信号被传输到数据处理装置42，它计算信号面积A，由图8中的阴影部分表示。

由检测区带34中测量的信号面积与对照区带36中测量的信号面积的比值R以及建立的校准表或曲线确定样品中存在的D-二聚物的量，该校准表或曲线根据比值R直接提供D-二聚物的浓度(图5)。

在窗口26的一端28检测标记具有一些优点：

·在窗口26的一端28检测到标记出现的一定时间后(例如10分钟)，在检测区带34和对照区带36进行测量，所述时间间隔对所有样品都是相同的，并且不依赖于在条带的区带30处溶解偶联物的条件和所述偶联物与待测定物质之间形成复合物的条件；

·在测量中能够很快检测到诸如忘记将迁移缓冲液沉积在外壳20的开口24中或使用了已使用过的条带22等操作人员的错误，因为图7的信号I不会具有标记出现时的前边缘特征。

实施例1

在硝酸纤维膜上包被或固定的方法

装置

待固定的抗-D-二聚物捕获抗体：单克隆2.1.16(Stago，France)，浓度为2mg/ml。

待固定的RMC捕获抗体：山羊抗-鸡Ig抗体(Sigma，France)，浓度为1mg/ml。

包被膜：硝酸纤维SHF0900405(Millipore，USA)。

包被缓冲液：0.15M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

抗体溶液分配装置：Linomat IV(Camag，Switzerland)或Bio JetQuanti 3000(Bio dot，USA)。

方法

使用如下简要概述的方法将捕获抗体和蛋白质包被(固定)在惰性载体上。使用Linomat或Bio Jet Quanti装置(通过蒸发)将1μg/检测的检测2.1.16捕获抗体和0.25μg/检测的山羊抗-鸡RMC捕获抗体分配到硝酸纤维膜上，预切割成适于试验的形式。

在抗体沉积在膜上并由其导致抗体被吸收到膜上后，立即在37℃的通风恒温箱中干燥30分钟。将包被了抗体的膜在室温(22℃-25℃)下保存在密封的铝袋中。

实施例2

偶联抗体与胶体金颗粒的方法

装置

抗-D-二聚体单克隆抗体：F(ab)’₂ 9C3片断(Stago，France)。

RMC显示抗体：鸡IgG(Sigma，France)。

四氯金酸(Sigma，France)。

柠檬酸三钠(Prolabo，France)。

PEG₂₀₀₀₀(Prolabo，France)。

硼酸盐缓冲液2mM。

K₂CO₃溶液0.2M。

偶联物储器：PT-R5(MDI，India)。

方法

制备胶体金颗粒

使用稍微修改的Frens-Tinglu方法制备大小为50nm的胶体金颗粒。简要概述该方法。

将2ml 1％的四氯金酸加入到干净烧瓶中的198ml超纯水中。

向烧瓶中放入磁力搅拌子并加热至沸点。

加入275μl10％的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌。继续加热。

出现紫色后，再加热10分钟。

冷却至室温(22-25℃)。

在4℃下在烟色玻璃瓶中避光保存胶体金颗粒。

表征制备的颗粒：测量最大波长和该波长处的OD值，测量pH。

制备试验抗-D-二聚物-胶体金颗粒偶联物。

该制备包括几个步骤：

a)制备用于偶联的抗体

使用下述实验方案将抗-D-二聚物9C3(片断F(ab)’₂，Stago)抗体偶联到金颗粒上。

在pH 6.5的2 mM硼酸盐中稀释抗体获得1mg/ml的终浓度，随后将其在室温(22-25℃)下、在该缓冲液中透析3小时。

将抗体溶液在4℃、5000rpm下离心15分钟。回收包含抗体的上清液后，在偶联之前通过在280nm处的分光光度测量证实其浓度。

b)制备用于偶联的胶体金

通过加入Milli-Q水将胶体金颗粒的OD_530nm调节到1。

通过加入0.2 M K₂CO₃将胶体金颗粒溶液的pH调节到6.5±0.1。

c)通过吸附偶联

将抗体溶液与0.2mg/ml的胶体金颗粒溶液以比值1/10(抗体体积/金颗粒体积)混和，例如1.85ml的抗体对18.5ml的胶体金颗粒。

在室温(22-25℃)下搅拌两分钟。

d)偶联后的稳定以及偶联物的回收

加入1.2ml的1％PEG₂₀₀₀₀并在室温(22-25℃)下涡旋振荡2分钟。

加入2.4ml的1％BSA并在室温(22-25℃)下涡旋振荡2分钟。

在4℃、9000rpm下离心1小时。

除去上清液并在20mM Tris缓冲液、pH 8.2、PEG₂₀₀₀₀、1％BSA、0.09％叠氮化钠中回收残余物。

将回收的偶联物通过0.2μm过滤。

光谱表征偶联物。

测量λ_max和OD_max。

制备鸡IgG-胶体金颗粒RMC偶联物。

以相同的步骤制备RMC偶联物。主要区别在于偶联浓度和偶联pH：0.1mg/ml和9.5。

浸透偶联物储器以及沉积偶联物

以1ml溶液/试验的量将PTR5膜(MDI，India)浸没于浸透溶液(PBS、1％牛奶、5％蔗糖)中。在室温下放置1小时，并搅拌。

除去浸透溶液后，在恒温箱中、在37℃下干燥储液膜3h。

以8μl/cm，即4μl/试验的量将两个偶联物(试验和RMC)的混合物沉积到浸透的偶联物储器上，偶联物储器为0.5cm宽。使用Air Jet系统(Bio dot)进行沉积。

沉积后，将偶联物储器在恒温箱中、在37℃下干燥1h。

实施例4

D-二聚体测定试验盒：免疫色谱检测条

使用的检测条的不同组成成分如下：

·吸收剂(17 CHR，Whatman，USA)；

·样品过滤器(GF 3596，Schleicher&Schüell，Germany)；

·硝酸纤维膜(SHF 0900405，Millipore，USA)，包被的；

·沉积偶联物的储器(PT-R5，MDI，India)。

这些被组装在称为“基础”(010白色聚酯GL-187、G&L、USA)的刚性惰性支持物上。

图4显示了组装图。

组装后，用刀具(Bio dot，USA)切割出宽5mm、长70mm的条。

将每个条插入到与图6所示相似的塑料盒中。

插入条后，封闭塑料盒并装入含有干燥剂(BO54/Indice 1，Airsec，France)的铝袋(Soplaril，France)中，随后在2-8℃保存。

实施例5

使用本发明的方法测定D-二聚物

装置

迁移缓冲液：0.5％PBS酪蛋白、0.1％triton X100；

D-二聚物校准试剂：从人血浆制备的D-二聚物(Stago，France)；

检测条读取器：Rapi-kit(77 Elektronika，Hungary)。

检测条读取器：Rapi-kit(77 Elektronika，Hungary)。

方法

操作方案

使用下述方案：

·使检测条、缓冲液、样品在室温(22-25℃)下稳定；

·将15μl的D-二聚物校准试剂或血浆样品沉积在塑料盒的样品孔中；

·加入150μl的迁移缓冲液；

·室温放置10分钟；

·用免疫色谱检测条读取器(77 Elektronika)读取结果。所有试验重复进行两次。

获取和解释结果

首先，测定从0至4000ng/ml的不同浓度的重配后的稳定的D-二聚物标准试剂建立标准曲线。对每次测定，通过读取器测量两个信号：检测和RMC，并计算检测/RMC比值。

通过将这种比值转换成D-二聚物校准试剂浓度的函数建立标准曲线。它对一组给定的检测盒是有效的。技术人员在约为4000±500的信号/复合物曲线的上升部分选择RMC信号，所述复合物是RMC捕获试剂和RMC之间形成的。

其次，将每次测定中测量的血浆与未知的D-二聚物浓度的比值转换到所述标准曲线中。随后就可能将测量的比值转化为所研究分析物的浓度。

生成校准曲线的步骤如下：

a)用MilliQ水重配校准试剂约(4500ng/ml)；

b)使校准试剂稳定30分钟。一旦重配后，将校准试剂在AT稳定4小时；

c)在迁移缓冲液中稀释校准试剂获得下述D-二聚物浓度：

250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml和4000ng/ml；

d)重复试验两次；

e)将15μl的样品沉积在样品孔中(对校准曲线的0点，沉积15μl的迁移缓冲液)；

f)加入150μl的迁移缓冲液(10mM PBS-0.5％酪蛋白-0.1％triton X100-0.095％叠氮化钠)；

g)室温放置10分钟；

h)使用读取器读取结果；

i)将结果转换为结果膜；

j)绘制校准曲线[D-二聚物的含量＝f(检测/RMC比值)]；

k)按照a至i的方案测定血浆和对照。

标准曲线结果，实例

校准试剂	D-二聚物(ng/ml)	检测编号	RMC面积	检测面积	检测/RMC比值	平均检测/RMC比值
							1	0	1	4664	116	0.025	0.027
2	4503	132	0.029
				2	250	1			4392	431	0.098	0.098
2	4953	483	0.098
						3	500	1	4529	1127	0.249		0.267
2	3744	1068	0.285
				4	1000			1	4234	2368	0.559	0.573
2	4554	2669	0.586
						5	2000	1	4992	5335	1.069		1.056
2	4551	4752	1.044
				6	4000			1	5256	6866	1.306	1.376
2	4835	6994	1.447

血浆测定实例

血浆名称	检测编号	RMC面积	检测面积	检测/RMC比值	RMC方法测定(ng/ml)	比较方法测定(ng/ml)
							0105290294	1	3492	369	0.106	280	310
2	4963	606	0.122
				0107020181	1	4821		5493	1.139	2750	2600
2	4622	5844	1.264
					0105100264	1	5009	5694	1.137			2325	2250
2	3223	3638	1.129
				0105290418		1	5227	4610	0.882	1420	3370
2	4059	3147	0.775
					0105050112	1	3930	5326	1.355			3400	＞4000
2	4299	5402	1.257
				0106160147		1	4778	3848	0.805	1450	1490
2	5583	4844	0.868
					0106190137	1	4646	3314	0.713			1300	1830
2	5010	3988	0.796
				0107060177		1	4293	5252	1.223	3450	3850
2	3587	4963	1.384
					0105240148	1	4299	2637	0.613			1125	1080

	2	3805	2567	0.675
							0105220259	1	5251	853	0.162	375	260
2	4166	796	0.191
				0105250240	1	4462		2848	0.638	1100	780
2	5803	3633	0.626
					0105250267	1	3921	1398	0.357			660	580
2	4754	1794	0.377
				0105300196		1	3718	5575	1.499	3625	＞4000
2	4142	4839	1.168
					0106070275	1	4575	3392	0.741			1250	1560
2	3551	2856	0.804
				0106010160		1	5015	2687	0.536	1050	1130
2	4604	3039	0.660
					9740	1	4296	4631	1.078			2400	2078
2	3930	4693	1.194
				9432		1	4378	4963	1.134	2100	2405
2	4873	4982	1.022
					7355	1	3261	4574	1.403			＞4000	3391
2	3216	4848	1.507
				8199		1	4439	5950	1.340	＞4000	5534
2	3980	6230	1.565
					9666	1	3370	5212	1.547			＞4000	31093
2	4614	6539	1.417
				8967		1	3845	565	0.147	380	412
2	4261	792	0.186
					6616	1	3571	6111	1.711			＞4000	9041
2	4996	7021	1.405

将使用本发明方法获得的测定结果与基于ELISA、AsserachromDDimère(Stago，France)的参照方法获得的结果相比较。

我们可看出本发明方法获得的结果与参照方法获得的结果非常接近。

因此，我们提供了定量测定的方法，它能够提供与参照方法的结果相当的结果。本发明的主题RMC使得加权了免疫色谱法技术固有的变化(由于载体和样品等造成的变化)。

有可能从获得的结果估计这种加权。

RMC加权的效果

每个测定重复进行两次。从每个测定获得的两个值之间的绝对偏差估计由于RMC的加权效果。对于理想的理论加权系统，相同测定的两个值之间的偏差应该等于0。

校准试剂或血浆	检测信号绝对差异	绝对差异比值
			0	16	0.004
250	52	0.001
			500	59	0.036
100	301	0.027
			2000	583	0.025
4000	128	0.140
			0105290294	237	0.016
0107020181	351	0.125
			0105100264	2056	0.008
0105290418	1463	0.107
			0105050112	76	0.099
0106160147	996	0.062
			0106190137	674	0.083
0107060177	289	0.160
			0105240148	70	0.061
0105220259	57	0.029
			0105250240	785	0.012
0105250267	396	0.021
			0105300196	736	0.331
0106070275	536	0.063
			0106010160	352	0.124
9740	62	0.116
			9432	19	0.111
7355	274	0.105
			8199	280	0.225
9666	1327	0.129
			8967	227	0.039
6616	910	0.306
			平均值	475.4	0.092

这些结果显示仅由本发明系统获得最小差异。

与此相反，缺乏RMC时，因此仅使用单一试验信号，测定是可能的但测量的不确定性更大。

通过重复性测试进一步证实了加权效果。在这种情况下，使用本发明方法测定同一样品21次。

重复性试验

血浆1

测试	血浆1
					检测	RMC	检测/RMC比值	D-二聚物测定(ng/ml)
	1	2063	5699	0.36					650
2					2518	6103	0.41	725
	3	2395	5822	0.41					725
4					1997	4451	0.45	775
	5	2236	4637	0.48					770
6					1559	4314	0.36	650
	7	2186	4955	0.44					760
8					2368	5799	0.41	725
	9	1911	5310	0.36					650
10					1939	5508	0.35	630
	11	1608	4523	0.36					650
12					2067	5247	0.39	680
	13	1989	5276	0.38					675
14					1442	4383	0.33	600
	15	2312	5801	0.40					700
16					2411	5482	0.44	760
	17	2228	5471	0.41					725
18					2392	5560	0.43	750
	19	1872	5652	0.33					600
20					2008	5351	0.38	675
	21	2043	4718	0.43					750
平均值					2073.52381	5241.04762	0.396	696.429
	标准偏差	292.10	540.45	0.04					55.46
C.V.(％)					14.09	10.31	10.45	7.96

由于这些重复测定，本发明方法使得所述变化被加权。与单独的检测信号相比，观察到变化增加了4％至6％。

Claims (37)

1.通过免疫色谱法定量测量液体样品中至少一种目标分析物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包括条状的固体载体的免疫色谱装置，所述载体包括样品应用区带、迁移区带、用于每个所研究分析物的特异性捕获区带和比值计量测量对照区带(RMC)，所述一条或多条特异性捕获区带中每条区带包含固定在载体上的捕获试剂，所述捕获试剂与所研究分析物之一形成特异结合对，所述RMC区带包含固定在载体上的对照捕获试剂，所述试剂与带有检测标记的对照试剂形成特异结合对；

b)使样品与带有可检测标签的对照试剂以及偶联物或偶联物混合物相接触，每个偶联物由与所研究分析物之一形成特异结合配偶体的试剂构成并携带与对照试剂的标签在相同波长处吸收的可检测标签；

c)将已经与所述对照试剂和所述偶联物或偶联物混合物接触的样品沉积到所述载体的应用区带上；

d)将所述装置维持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个特异性偶联物形成结合对，以及使所述一个或多个所研究分析物和对照试剂通过毛细管作用沿固体载体向针对所述一个或多个所研究分析物的每条特异性捕获区带和RMC区带迁移；

e)将所述装置维持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个捕获试剂在一条或多条捕获区带上进一步结合，以及使对照试剂与对照捕获试剂在RMC区带结合；

f)测量在每条捕获区带处与所研究分析物结合的偶联物所产生的检测信号的强度以及由RMC区带处对照试剂所产生的RMC对照信号的强度；由此，所述样品中每个目标分析物的量与每个检测信号和RMC对照信号的比值直接成比例。

2.通过免疫色谱法定量测量液体样品中至少一种目标分析物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包括条状的固体载体的免疫色谱装置，所述载体包括样品应用区带、迁移区带、每个所研究分析物的特异性捕获区带和比值计量测量对照区带(RMC)，所述应用区带包括含有携带有可检测标签的对照试剂以及偶联物或偶联物混合物的储器，每个偶联物由与所研究分析物之一形成特异结合配偶体的试剂构成并携带有与对照试剂的标签在相同波长处吸收的可检测标签，所述RMC区带包含固定在载体上的对照捕获试剂，所述试剂与带有可检测标签的对照试剂形成特异结合对；

b)将样品沉积到载体的应用区带；

c)将所述装置维持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个特异性偶联物形成结合对，以及使所述一个或多个所研究分析物和对照试剂通过毛细管作用沿固体载体向针对所述一个或多个所研究分析物的每条特异性捕获区带和RMC区带迁移；

d)将所述装置维持在如下条件下：足以使一个或多个所研究分析物与一个或多个捕获试剂在一条或多条捕获区带上进一步结合，以及使对照试剂与对照捕获试剂在RMC区带结合；

e)测量在每条捕获区带处由固定在所研究分析物上的偶联物产生的检测信号的强度以及由RMC区带处对照试剂产生的RMC对照信号的强度；由此，所述样品中每个目标分析物的量(或比值)与每个检测信号和RMC对照信号的比值直接成比例。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于使用干形式的偶联物或偶联物混合物和RMC对照试剂。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于RMC区带的区域中捕获的对照试剂和所研究分析物没有交叉反应。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于当对人源的样品进行测定时，所述RMC选自动物源的分子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述对照试剂选自动物源的免疫球蛋白，且其捕获试剂为针对该动物物种的所述对照试剂的抗体。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述RMC对照试剂和其特异性捕获试剂形成的结合对为抗原/抗体类型。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于用于所述偶联物或偶联物混合物上的标签为在相同波长处吸收的用于所述RMC对照试剂上的标签。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于用于所述偶联物或偶联物混合物上的标签与用于RMC对照试剂上的标签相同。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所使用的标签为特定的类型。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所使用的标签为胶体金。

12.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于使用检测条读取器读取检测信号和RMC信号。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于通过反射率或透射率进行测量。

14.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于将检测信号/RMC信号比值与从多个浓度的参照分析物的测定和RMC测定建立的标准校准曲线相比较，校准曲线上的每个点对应与分析物信号/RMC信号比值直接成比例的分析物含量。

15.如权利要求1至14中任一权利要求所述的方法，其特征在于它还包括在样品迁移开始时自动检测所述标记向检测条的给定区带(28)中的推移、自动开始对检测所述推移的预定时间段的记时、以及在所述时间段结束时自动开始获取检测条的检测区带和对照区带中的标记所产生的信号。

16.通过免疫色谱法定量测定液体样品中存在的物质的方法，包括使液体样品与偶联物以及对照产品相接触，所述偶联物能够与待测定物质反应形成复合物，所述偶联物和对照产品包括检测标记；样品在毛细管作用下与偶联物和对照产品在多孔材料条带(22)中迁移，所述多孔材料条带(22)包括含有能够与复合物反应的试剂的检测区带(34)和含有能够与对照产品反应的试剂的对照区带(36)；检测由检测区带(34)和对照区带(36)中的标记产生的信号；产生所述信号的比值以及由此推断出所述样品中存在的待测定物质的量；其特征在于它还包括在样品迁移开始时自动检测所述标记向检测条的给定区带(28)中的推移、自动开始对检测所述推移的预定时间段的记时、以及在所述时间段结束时自动开始获取检测条的检测区带(34)和对照区带(36)中的标记产生的信号。

17.如权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其特征在于它包括测量检测区带和对照区带中的标记产生的信号面积A、计算所述面积的比值和从所述比值推断出所述样品中存在的物质的量。

18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于所述标记在给定波长处具有光吸收峰值，且所述方法包括在该波长处照射检测条(22)、使用至少一个光电探测器或一组光电探测器(40)在该波长处测量由所述标记反射或漫射的光强度、以及处理由所述一个或多个光电探测器发出的信号以获得由所述标记产生的信号面积A。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于它包括使用阵列光电探测器(40)在检测条(22)的不同点捕获由所述标记产生的信号。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于它包括使用与扫描检测条(22)的装置相连的光电探测器(40)来捕获作为扫描距离函数的由标记产生的信号并确定所述信号的面积A。

21.如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于从在样品迁移开始时检测所述标记向给定区带(28)中的推移到获取检测区带(34)和对照区带(36)中的信号之间的时间段约为10分钟。

22.如权利要求1-21中任一权利要求所述的方法在测定血液样品中的D-二聚物中的用途。

23.如权利要求22所述的用途，其特征在于对在血浆样品进行测定。

24.如权利要求22或23所述方法的用途，用于排除静脉血栓栓塞的诊断。

25.通过免疫色谱法进行定量方法测量液体样品中至少一种目标分析物的试剂盒，包括：

a)惰性载体，在其上的不同区带固定有称为捕获化合物的不同类型的化合物，使得(i)当所述分析物与由带有可检测标签的试剂构成的偶联物形成特异结合配偶体时，所述分析物的每个捕获化合物通过所述捕获化合物和包含在样品中的分析物之间的特异性结合反应捕获检测样品中的预定分析物，以及(ii)对照试剂的捕获化合物捕获带有可检测标签的对照试剂；

b)偶联物或不同偶联物的混合物，每个偶联物由能够与生物学样品中所研究的预定分析物特异性结合的试剂构成，所述偶联物还带有可检测标签，所述偶联物被包含在浸透的偶联物储器中；

c)带有与偶联物标签在相同波长处吸收的可检测标签的对照试剂(RMC：比值计量测量对照)；

d)对于每个分析物，对所述分析物特异的标准曲线，通过测定多个浓度的与偶联物相连的参照分析物和在相同条件下测定给定浓度的对照试剂(RMC)建立所述标准曲线，曲线上的每个点对应由分析物捕获化合物所捕获的与分析物相连的偶联物所产生的信号和由对照试剂的捕获化合物所捕获的对照试剂所产生的信号之间的比值；

e)包含用于进行检测的惰性载体的一个或多个支持物(基础)；

f)如果适合，包含惰性载体及其附件的容器形成待放置到信号读取器中的盒子；

g)如果适合，使用所述试剂盒测量一个或多个分析物的量的说明书。

26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述惰性载体为硝酸纤维膜。

27.如权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述捕获化合物为捕获抗体，特别是捕获所述分析物的单克隆抗体和捕获RMC的多克隆抗体。

28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述捕获抗体以2±0.1mg/ml的浓度固定在所述惰性载体上。

29.如权利要求25-28中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述RMC捕获抗体为与生物素结合的IgG，其浓度为1±0.05mg/ml。

30.如权利要求25-29中任一权利要求所述的试剂盒，其中用于沉积不同捕获化合物的区带彼此间隔约5±0.5mm。

31.如权利要求25-29中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述的所研究分析物为D-二聚物，所述分析物捕获化合物为抗-D-二聚物单克隆抗体，并且建立D-二聚物的量在0至4000ng/ml之间和RMC对照的值对应1200-1600ng/ml范围的D-二聚物的所述标准校准曲线。

32.实施前述任一权利要求所述方法的装置，包括条状支持物(20)，其上形成有至少一个用于沉积样品的开口(24)和用于在所述条带的检测区带(34)和对照区带(36)处读取结果的窗口(26)，以及用于捕获由检测区带和对照区带中的标记所产生信号的装置(40)，其特征在于它包括用于在样品迁移开始时检测标记向所述条带(22)的给定区带(28)中推移的装置(40)、测量时间的装置和装置(42)，装置(42)用于控制从检测标记向所述条带的给定区带(28)中的推移起所述测量时间的装置，并控制在经过预定时间段之后捕获由检测区带和对照区带中的标记所产生信号的装置(40)。

33.如权利要求32所述的装置，其特征在于所述用于检测标记推移的装置由捕获检测区带(34)和对照区带(36)中的标记所产生信号的装置(40)构成。

34.如权利要求33所述的装置，其特征在于所述检测和捕获装置包括在给定波长处照射所述标记的装置(38)和至少一个与扫描所述条带的被照射区带的装置相连的光电探测器(40)。

35.如权利要求32-34中任一权利要求所述的装置，其特征在于它包括确定检测区带(34)和对照区带(36)中的标记产生的信号面积A的装置和计算所述面积的比值的装置。

36.如权利要求32-35中任一权利要求所述的装置，其特征在于所述条带的支持物包括放置和固定条带(22)的外壳(20)，所述外壳(20)具有顶面，其包括至少一个开口(26)用于在样品迁移开始时检测标记的推移以及用于捕获检测区带(34)和对照区带(36)中的标记产生的信号。

37.如权利要求36所述的装置，其特征在于所述开口(26)在样品迁移的方向延伸，该开口的一端(28)位于在迁移开始时检测标记推移的所述区带，其另一端(32)位于检测区带(34)和对照区带(36)。

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