CN101103042A

CN101103042A - Irta-2抗体及其用途

Info

Publication number: CN101103042A
Application number: CNA200680002111XA
Authority: CN
Inventors: R·格拉齐诺; D·J·金; M·斯里尼瓦桑; J·卡达雷尔利; 黄海春
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2005-01-12
Filing date: 2006-01-12
Publication date: 2008-01-09
Also published as: JP2008526260A; CA2594318A1; EP1846449A2; WO2006076691A3; IL184024A0; EP1846449A4; WO2006076691A8; US20080247944A1; KR20070115881A; WO2006076691A2; AU2006204709A1

Abstract

本发明提供以高亲和力特异性结合IRTA-2的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明抗体的核酸分子，用于表达本发明抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含本发明抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。本发明还提供了检测IRTA-2的方法，以及治疗包括非何杰金氏淋巴瘤在内的各种B细胞恶性肿瘤的方法。

Description

IRTA-2抗体及其用途

发明背景

免疫受体易位相关(IRTA)基因/蛋白，也被称作Fc受体同源物(FcRH)基因，由包括5个成员的免疫球蛋白样细胞表面受体家族组成(Miller等，(2002)Blood.99：2662；Davis等，(2002)Immunological Reviews 190：123)。IRTA最早是通过分析含有1q21染色体重排的多发性骨髓瘤细胞系的断裂点而发现的(Hatzivassiliou等，(2001)Immunity.14：277)。每个IRTA糖蛋白含有3-9个胞外Ig样域(Miller，2002，同上)。IRTA的特征还在于具有在特定基序内含有3-5个酪氨酸残基的胞质域，提示免疫酪氨酸抑制性基序(ITIM)和免疫酪氨酸激活样(ITAM样)基序的存在(Miller，2002，同上；Hatzivassiliou，2001，同上)。

IRTA一般在包括淋巴结、扁桃体在内的外周淋巴样组织、静息外周B细胞和正常生发中心B细胞中表达(Davis等，(2001)PNAS.98：9772)。IRTA-2、-3、-4、-5均在脾脏中高水平表达，而与之相比，在脾脏中只检测到低水平的IRTA1。已经分析了人扁桃体组织B细胞区内的IRTA表达。IRTA1以边缘区模式在在淋巴滤泡外部表达并且在上皮内淋巴细胞中表达。IRTA2和3在生发中心内表达，在富含中央细胞的明区中表达水平最高。IRTA4和5在外套层内表达水平最高，表明在幼稚B细胞中表达(Miller，2002，同上)。

已经证明IRTA基因在B细胞非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤中高度表达(Davis，2001，同上)。

发明概述

本发明提供与IRTA-2结合并且表现出许多所需特性的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。这些特性包括：与人IRTA-2高亲和力结合，但是缺乏与IRTA-3或IRTA-4的实质交叉反应性。而且，本发明的抗体显示与B细胞肿瘤细胞系结合。

在本发明优选的实施方案中，人IRTA-2包括具有如SEQ ID NO：25[Genbank登录号NP_112571]所示氨基酸序列的多肽；人IRTA-1包括具有如SEQ ID NO：26[Genbank登录号NP_112572]所示氨基酸序列的多肽；人IRTA-3包括具有如SEQ ID NO：27[Genbank登录号AAL59390]所示氨基酸序列的多肽；人IRTA-4包括具有如SEQ IDNO：28[Genbank登录号AAL60249]所示氨基酸序列的多肽；和/或人IRTA-5包括具有如SEQ ID NO：29[Genbank登录号AAL60250]所示氨基酸序列的多肽。

在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(b)与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(c)基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

(d)与Granta 519肿瘤细胞结合，并且基本不与Raji或Ramos肿瘤细胞结合。

该抗体优选为人抗体，但是在替代实施方案中，该抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在一个优选实施方案中，该抗体基本不与Daudi、IM-9、Karpas1106P或SU-DHL-4肿瘤细胞结合。

在更优选的实施方案中，该抗体以5×10^-8M或更低的K_D与人IRTA-2结合，以2×10^-8M或更低的K_D与人IRTA-2结合，以1×10^-8M或更低的K_D与人IRTA-2结合，以5×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合，以4×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合，以3×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合，或以2.1×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合。

在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体交叉竞争结合IRTA-2，该参比抗体包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：13和14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的轻链可变区。

在各种实施方案中，所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区；

或者所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H3-23基因的重链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。本发明也提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H1-8基因的重链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_KL6基因的轻链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_KL18基因的轻链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

(a)人V_H3-23或1-8基因的重链可变区；和

(b)人V_KL6或V_KL18的轻链可变区；

其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

在一个优选实施方案中，所述抗体包含人V_H3-23基因的重链可变区和人V_KL6基因的轻链可变区。在另一个优选实施方案中，所述抗体包含人V_H1-8基因的重链可变区和人V_KL18基因的轻链可变区。

在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：

(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：5和6的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(d)与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(e)该抗体基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

(f)该抗体与Granta 519肿瘤细胞结合，并且基本不与Raji或Ramos肿瘤细胞结合。

优选地，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：3和4的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。优选地，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：7和8的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO：13和14的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(d)与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(e)该抗体基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

在优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列的重链可变区CDR1；

(b)包含选自SEQ ID NO：3和4的氨基酸序列的重链可变区CDR2；

(c)包含选自SEQ ID NO：5和6的氨基酸序列的重链可变区CDR3；

(d)包含选自SEQ ID NO：7和8的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；

(e)包含选自SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和

(f)包含选自SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；

其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

一种优选的组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：3的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：5的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：7的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：9的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：11的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：4的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：6的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：8的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：10的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR3。

本发明的其他优选抗体或其抗原结合部分包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：13和14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

一种优选的组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

在本发明的另一方面，提供了与上述任意抗体竞争结合IRTA-2的抗体或其抗原结合部分。

本发明的抗体可以是，例如，如IgG1或IgG4同种型的全长抗体。或者，这些抗体可以是抗体片段，如Fab或Fab’2片段，或单链抗体。

本发明也提供一种免疫偶联物，其包含与诸如细胞毒素或放射性同位素等治疗剂连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明也提供一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本发明的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。

还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子和药学上可接受的载体的组合物。

本发明也包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体，和包含这些表达载体的宿主细胞。而且，本发明提供一种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的抗体，以及由这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生本发明的抗体。

另一方面，本发明提供一种为需要治疗的受试者治疗B细胞恶性肿瘤的方法，包括给该受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，从而使该受试者的B细胞恶性肿瘤得到治疗。该疾病可以是，例如，非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、B系弥散性大细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

本发明还提供基于本文提供的抗-IRTA-2抗体序列制备“第二代”抗-IRTA-2抗体的方法。例如，本发明提供制备抗-IRTA-2抗体的方法，该方法包括：

(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：1和2的CDR1序列、选自SEQ ID NO：3和4的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：5和6的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：7和8的CDR1序列、选自SEQ ID NO：9和10的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：11和12的CDR3序列；

(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和

(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。

本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、Genbank项、专利和公布的专利申请的内容均在此处特别引入作为参考。

附图说明

图1A显示9D12人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：17)和氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：3)和CDR3(SEQ ID NO：5)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图1B显示9D12人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：19)和氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：7)、CDR2(SEQ ID NO：9)和CDR3(SEQ ID NO：11)区，并指出了V和J的种系来源。

图2A显示8A1人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：18)和氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：2)、CDR2(SEQ ID NO：4)和CDR3(SEQ ID NO：6)区，并指出了V和J的种系来源。

图2B显示8A1人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：20)和氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：8)、CDR2(SEQ ID NO：10)和CDR3(SEQ ID NO：12)区，并指出了V和J的种系来源。

图3显示9D12的重链可变区氨基酸序列与人种系V_H3-23氨基酸序列(SEQ ID NO：21)的比对。

图4显示8A1的重链可变区氨基酸序列与人种系V_H1-8氨基酸序列(SEQ ID NO：22)的比对。

图5显示9D12的轻链可变区氨基酸序列与人种系V_KL6氨基酸序列(SEQ ID NO：23)的比对。

图6显示8A1的轻链可变区氨基酸序列与人种系V_KL18氨基酸序列(SEQ ID NO：24)的比对。

图7A-C显示证明抗人IRTA-2的人单克隆抗体9D12和8A1与人IRTA-2特异性结合的实验结果。图7A是显示与被IRTA-2转染的CHO细胞结合的条图。图7B是显示与被IRTA-3转染的CHO细胞缺乏结合的条图。图7C是显示与被IRTA-4转染的CHO细胞缺乏结合的条图。

图8显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人IRTA-2的人单克隆抗体9D12和8A1与CD19+B细胞结合。

图9显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人IRTA-2的人单克隆抗体9D12和8A1不与B细胞肿瘤细胞系Ramos、Raji、Daudi或IM-9的细胞表面结合。

图10显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人IRTA-2的人单克隆抗体9D12和8A1与B细胞肿瘤系Karpas 1106P、SU-DHL-4和Granta 519结合。

图11显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人IRTA-2的人单克隆抗体9D12和8A1与B细胞肿瘤系SU-DHL-6和JEKO-1结合。

发明详述

本发明涉及以高亲和力特异性结合IRTA-2的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体源自特定重链和轻链种系序列，和/或包含特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备该抗体的方法、含有该抗体的免疫偶联物和双特异性分子、和含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用该抗体的方法，例如用于检测IRTA-2，以及治疗与IRTA-2表达有关的疾病，如表达IRTA-2的B细胞恶性肿瘤。因此，本发明也提供使用本发明的抗-IRTA-2抗体治疗B细胞恶性肿瘤的方法，例如治疗非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、B系弥散性大细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在发明详述内容中说明。

术语“免疫球蛋白超家族受体易位相关基因2”和“IRTA-2”可互换使用，包括人IRTA-2的变体、同种型和物种同源物。因此，本发明的人抗体在某些情况下可与来自人类以外物种的IRTA-2交叉反应。在其他情况下，该抗体对于人IRTA-2可能是完全特异性的，并且可能不表现出物种或其他类型的交叉反应性。人IRTA-2的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_112571(SEQ ID NO：25)。

术语“IRTA-1”、“IRTA-3”、“IRTA-4”和“IRTA-5”分别包括人“IRTA-1”、“IRTA-3”、“IRTA-4”和“IRTA-5”的变体、同种型和物种同源物。人IRTA-1的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP_112572(SEQ ID NO：26)。人IRTA-3的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NP AAL59390(SEQ ID NO：27)。人IRTA-4的完整氨基酸序列的Genbank登录号为AAL60249(SEQ ID NO：28)。人IRTA-5的完整氨基酸序列的Genbank登录号为AAL60250(SEQ IDNO：29)。

术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，导致选择性损伤、破坏或从人体中清除侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常人细胞或组织。

“信号转导途径”是指在信号从一个细胞的一部分向一个细胞的另一部分传送中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。本文使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号和跨过细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个例子是IRTA-2受体。

这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个V_H和V_L均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如IRTA-2)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中V_L和V_H区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

本文使用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与IRTA-2特异性结合的分离的抗体基本不含与除IRTA-2以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与IRTA-2特异性结合的分离的抗体与诸如来自其他物种的IRTA-2分子等其他抗原可能具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。

本文使用的术语“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，构架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不包括其中源自另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。

术语“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)中获得。

本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列尽管是源自人种系V_H和V_L序列并与之相关的序列，但可能不是在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分(repertoire)中。

本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。

短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。

术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和其它试剂或抗体的偶联物。

术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。

术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。

本文使用的术语“与人IRTA-2特异性结合”的抗体是指以1×10^-7M或更低、更优选5×10^-8M或更低、更优选3×10^-8M或更低、更优选1×10^-8M或更低、甚至更优选5×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合的抗体。

本文使用的术语“K_assoc”或“K_a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文使用的术语“K_dis”或“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使用的术语“K_D”是指解离常数，它是由K_d与K_a的比值获得的(即K_d/K_a)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可能用本领域建立的方法测定。测定抗体K_D的一种优选方法是使用表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统，如Biacore^系统。

本文使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的K_D为1×10^-7M或更低、更优选5×10^-8M或更低、甚至更优选5×10^-9M或更低。但是对于其他抗体同种型来说，“高亲和力”结合可能不同。例如，对于IgM同种型来说，“高亲和力”结合是指抗体具有10^-6M或更低、更优选10^-7M或更低、甚至更优选10^-8M或更低的K_D。

本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。

本发明的各个方面在下面的部分中进一步详细描述。

抗-IRTA-2抗体

本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，这些抗体与人IRTA-2特异性结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力与IRTA-2结合，例如K_D为1×10^-7M或更低。本发明的抗-IRTA-2抗体优选地表现出以下一种或多种特性：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(b)与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(c)基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；和/或

优选地，该抗体以5×10^-8M或更低的K_D与人IRTA-2结合，以2×10^-8M或更低的K_D与人IRTA-2结合，或以5×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合，或以4×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合，或以3×10^-9M的K_D与人IRTA-2结合，或以2.1×10^-9M的K_D与人IRTA-2结合。

评价抗体对IRTA-2的结合能力的标准试验在本领域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印迹分析、RIA和流式细胞术分析。合适的试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域公知的标准试验(如Biacore分析)来评价。

单克隆抗体9D12和8A1

本发明优选的抗体是如实施例1和2所述分离并进行结构表征的人单克隆抗体9D12和8A1。9D12和8A1的V_H氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：13和14中。9D12和8A1的V_L氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：15和16中。

假定这些抗体中的每一个都能够与IRTA-2结合，则V_H和V_L序列可以“混合并匹配”，从而产生本发明的其他的抗-IRTA-2结合分子。IRTA-2与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA)检测。优选地，当V_H和V_L链混合并匹配时，来自特定V_H/V_L配对的V_H序列被替换为结构上相似的V_H序列。同样，优选地，来自特定V_H/V_L配对的V_L序列被替换为结构上相似的V_L序列。

因此，在一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：13和14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与IRTA-2、优选与人IRTA-2特异性结合。

优选的重链和轻链组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明提供包含9D12和8A1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。9D12和8A1的V_H CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1和2中。9D12和8A1的V_H CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3和4中。9D12和8A1的V_H CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5和6中。9D12和8A1的V_K CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：7和8中。9D12和8A1的V_K CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9和10中。9D12和8A1的V_K CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：11和12中。CDR区用Kabat系统(Kabat，E-A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)勾画出。

假如这些抗体均能与IRTA-2结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、2和3区提供的，则V_H CDR1、CDR2和CDR3序列与V_K CDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有V_H CDR1、CDR2和CDR3和V_KCDR1、CDR2和CDR3)，从而产生本发明的其他的抗-IRTA-2结合分子。IRTA-2与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA，Biacore分析)检测。优选地，当V_H CDR序列混合并匹配时，来自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当V_KCDR序列混合并匹配时，来自特定V_K序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个V_H和/或V_LCDR区序列替换为来自此处公开的单克隆抗体9D12和8A1的CDR序列的结构上相似的序列，可以产生新的V_H和V_L序列。

因此，在另一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列的重链可变区CDR1；

(b)包含选自SEQ ID NO：3和4的氨基酸序列的重链可变区CDR2；

(c)包含选自SEQ ID NO：5和6的氨基酸序列的重链可变区CDR3；

(d)包含选自SEQ ID NO：7和8的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；

(e)包含选自SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和

(f)包含选自SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；

其中该抗体与IRTA-2、优选与人IRTA-2特异性结合。

在一个优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：3的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：5的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：7的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：9的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：11的轻链可变区CDR3。

在另一个优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：4的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：6的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：8的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：10的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR3。

具有特定种系序列的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。

例如，在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H 3-23基因的重链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H 1-8基因的重链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L6基因的轻链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L18基因的轻链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：

(a)包含产自或源自人V_H 3-23或V_H 1-8基因(该基因分别编码SEQ ID NO：21和22所示的氨基酸序列)的重链可变区；

(b)包含产自或源自人V_k L6或V_K L18基因(该基因分别编码SEQ ID NO：23和24所示的氨基酸序列)的轻链可变区；且

(c)与IRTA-2、优选与人IRTA-2特异性结合。

分别具有V_H 3-23和V_k L6的V_H和V_K的抗体的一个例子是9D12。分别具有V_H 1-8和V_k L18的V_H和V_K的抗体的一个例子是8A1。

在本文中，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获得的，则该人抗体包含“产自”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。“产自”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以这样鉴定：将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。“产自”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入而导致的氨基酸差异。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般来说，源自特定人种系序列的人抗体表现与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，该人抗体可能表现与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。

同源抗体

在另一实施方案中，本发明的抗体包含的重链和轻链可变区含有与此处所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗-IRTA-2抗体的所需功能特性。

例如，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(d)该抗体与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(e)该抗体基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

在各种实施方案中，该抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在另外一些实施方案中，V_H和/或V_L氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的V_H和V_L区高度(即80％或更高)同源的V_H和V_L区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ IDNO：17、18、19和20的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能(即以上(c)到(f)所述的功能)。

本文使用的两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数(即％同源性＝相同位点的数目/位点的总数×100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。

两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。

另外，或者可替代的，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检索，例如用来鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有保守修饰的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如9D12或8A1)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗-IRTA-2抗体的所需功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(d)该抗体与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(e)该抗体基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNO：3和4的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：7和8的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。

本文使用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括：具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以用此处所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(即以上(c)至(j)所述的功能)。

与本发明的抗-IRTA-2抗体结合相同表位的抗体

在另一实施方案中，本发明提供与本发明的任意IRTA-2单克隆抗体结合相同表位的抗体(即能够与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合IRTA-2的抗体)。在优选实施方案中，用于交叉竞争研究的参比抗体可以是单克隆抗体9D12(具有分别如SEQ ID NO：13和15所示的V_H和V_L序列)或单克隆抗体8A1(具有分别如SEQ IDNO：14和16所示的V_H和V_L序列)。这些交叉竞争抗体可以根据它们在标准IRTA-2结合测定中与9D12或8A1交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞分析来证明与本发明抗体的交叉竞争。测试抗体抑制例如9D12或8A1与人IRTA-2结合的能力证明，该测试抗体可以与9D12或8A1竞争结合人IRTA-2，因此与9D12或8A1结合人IRTA-2上相同的表位。在一个优选实施方案中，与9D12或8A1结合人IRTA-2上相同表位的抗体是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体可以如实施例所述制备和分离。

工程化抗体和修饰的抗体

本发明的抗体还可以如下制备：用具有此处所公开的一种或多种V_H和/或V_L序列的抗体作为起始材料，构建一种修饰的抗体，该修饰的抗体可以具有与起始抗体相比改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即V_H和/或V_L)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来构建抗体。另外，或者，可以通过修饰恒定区内的残基来构建抗体，例如改变该抗体的效应功能。

可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利5,225,539，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4和SEQ ID NO：5和6的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10和SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列。因此，这些抗体含有单克隆抗体9D12或8A 1的V_H和V_LCDR序列，但是可能含有与这些抗体不同的构架序列。

这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现：“VBase”人种系序列数据库(可从因特网上 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH 出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline V_HSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias mtheir Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其内容均在此引用作为参考。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中发现。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列可以根据如下Genbank登录号获得：1-69(NG_0010109，NT_024637和/或BC070333)，3-33(NG_0010109和NT_024637)和3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一个例子，在VK HCol2 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可以根据如下Genbank登录号获得：1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)，5-51(NG_0010109和NT_024637)，4-34(NG_0010109和NT_024637)，3-30.3(？)和3-23(AJ406678)。

用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的V_H 3-23构架序列(SEQ ID NO：21)和/或V_H 1-8构架序列(SEQ IDNO：22)和/或V_KL6构架序列(SEQ ID NO：23)和/或V_KL18构架序列(SEQ ID NO：24)。V_H CDR1、CDR 2和CDR 3序列和V_KCDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一种类型的可变区修饰是突变V_H和/或V_K CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能特性，可以用此处所述和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选引入(如上文所述的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变CDR区内的不超过1、2、3、4或5个残基。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗-IRTA-2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有：(a)V_H CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1和2相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：3和4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3和4相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，其包含选自SEQID NO：5和6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：5和6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_K CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：7和8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：7和8相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_K CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9和10相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_KCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：11和12的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11和12相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。

本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其V_H和/或V_K内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。例如，对于9D12，V_H的氨基酸残基#88(FR3内)是缬氨酸，而在相应的V_H3-23种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，可以通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，9D12的V_H的残基#88(FR3的残基#22)可以从缬氨酸“回复突变”为丙氨酸)。

另一个例子是，对于9D12，V_H的氨基酸残基#91(FR3内)是丙氨酸，而在相应的V_H3-23种系序列中该残基为苏氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将9D12的V_H的残基#91(FR3的残基#25)从丙氨酸“回复突变”为苏氨酸。这种“回复突变”的抗体也包括在本发明内。

另一个例子是，对于9D12，V_H的氨基酸残基#93(FR3内)是亮氨酸，而在相应的V_H 3-23种系序列中该残基为缬氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将9D12的V_H的残基#93(FR3的残基#27)从亮氨酸“回复突变”为缬氨酸。这种“回复突变”的抗体也包括在本发明内。

另一个例子是，对于8A1，V_H的氨基酸残基#2(FR1内)是甲硫氨酸，而在相应的V_H 1-8种系序列中该残基为缬氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将8A1的V_H的FR1内的残基#2从甲硫氨酸“回复突变”为缬氨酸。这种“回复突变”的抗体也包括在本发明内。

作为又一个例子，对于8A1，V_H的氨基酸残基#30(FR1内)是异亮氨酸，而在相应的V_H1-8种系序列中该残基为苏氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将8A1的V_H的FR1内的残基#30从异亮氨酸“回复突变”为苏氨酸。这种“回复突变”的抗体也包括在本发明内。

另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、乃至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等人的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。

除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本发明的抗体构建为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的抗体化学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰改变其糖基化，以改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。

在一个实施方案中，修饰CH 1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利No.5,677,425号中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数目是为了(例如)促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。

在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在Ward等人的美国专利No.6,165,745号中详细记载。

在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各种方法。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375所述，可以引入一个或多个如下突变：T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人的美国专利No.5,869,046和6,121,022所述，为了提高生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。

在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述。

在另外一个实施例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中更详细地描述。

在另外一个实施例中，改变氨基酸位点231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。

在另外一个实施例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。该方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298/kK224A和S298A/E333A/K334A。

在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点处的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利No.5,714,350和6,350,861中更详细地描述。

另外，或者可替代的，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基残基数目减少的低岩藻糖基化抗体，或等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过(例如)在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细胞在其中表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺乏岩藻糖。通过使用两种替代载体定向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因，产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见Yamane等的美国专利申请No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。另一个例子是，Hanai等的EP1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，由于减少或消除了α(1，6)键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现为低岩藻糖基化。Hanai等也描述了用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上添加岩藻糖的酶活性低或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公布WO03/035835记载了一种变异CHO细胞系，Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体为低岩藻糖基化(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342记载了表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的工程化细胞系，因此该工程化细胞系中表达的抗体表现为等分GlcNac结构增加，导致抗体的ADCC活性提高(参见，Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。此外，抗体的岩藻糖残基可以用岩藻糖苷酶切下。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.等.(1975)Biochem.14：5516-23)。

本发明涉及的对此处所述抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体的生物(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗体，一般在一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。本文使用的术语“聚乙二醇”包括用来衍生化其他蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，将要PEG化的抗体是一种无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。

抗体工程化方法

如上所述，能够利用具有此处公开的V_H和V_K序列的抗-IRTA-2抗体，通过修饰V_H和/或V_K序列或与之连接的恒定区，产生新的抗-IRTA-2抗体。因此，在本发明的另一方面，利用本发明的抗-IRTA-2抗体(例如9D12或8A1)的结构特征，产生结构上相关的抗-IRTA-2抗体，该结构上相关的抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如与人IRTA-2结合。如上所述，例如，9D12或8A1的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，从而产生另外的重组工程化的本发明的抗-IRTA-2抗体。其他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于工程化方法的起始材料是此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定必须实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。

因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-IRTA-2抗体的方法，包括：

(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。

可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。

优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗-IRTA-2抗体的一种、一些或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：

(i)以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(ii)与被IRTA-2转染的人CHO细胞结合；

(iii)基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；和/或

(iv)与Granta 519肿瘤细胞结合，并且基本不与Raji或Ramos肿瘤细胞结合。

在一个优选实施方案中，该抗体基本不与Daudi、IM-9、Karpas1106P或SU-DHL-4肿瘤细胞结合。改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述的(如实施例中所述的)标准试验(例如流式细胞术、结合测定)来评价。

在本发明抗体的工程化方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗-IRTA-2抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性和/或如此处所述的其他功能特性，筛选获得的修饰的抗-IRTA-2抗体。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。

编码本发明的抗体的核酸分子

本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。

本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的核酸。

本发明优选的核酸分子是编码9D12或8A1单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码9D1 2或8A1的VH序列的DNA序列分别在SEQ ID NO：17和18中示出。编码9D12或8A1的VL序列的DNA序列分别在SEQ ID NO：19和20中示出。

一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。

通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VH区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。

通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选的是κ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另外一个片段有效连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其VL和VH区通过该柔性连接体连接(参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348：552-554)。

本发明的单克隆抗体的产生

本发明的单克隆抗体(mAb)能够通过多种技术制备，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。

本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述获得的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美国专利No.5,225,539，和Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗IRTA-2人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在此分别被称作HuMab小鼠^和KM小鼠^的小鼠，并且在此通称为“人Ig小鼠”。

HuMab小鼠^(Medarex^，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和κ链基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠^的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，在下面的文献中详细描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology6：579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，这些文献的内容全文在此引入作为参考。进一步参见，Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；和Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布号WO92/03918,WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公布号WO 01/14424。

在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本发明的人抗体。这种小鼠在此被称为“KM小鼠^TM”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中详细描述。

再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-IRTA-2抗体。例如，可以使用一种被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。

而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-IRTA-2抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。另外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其能够用来产生本发明的抗-IRTA-2抗体。

本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例如，Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。

本发明的人单克隆抗体也可以用SCID小鼠制备，该SCID小鼠中重构了人免疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等人的美国专利No.5,476,996和5,698,767中描述。

人Ig小鼠的免疫

当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，根据Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用纯化的或富集的IRTA-2抗原和/或重组IRTA-2或IRTA-2融合蛋白的制剂免疫该小鼠。优选地，第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如，可以使用纯化的或重组的IRTA-2抗原的制剂(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。

产生抗IRTA-2完全人单克隆抗体的详细程序在下面的实施例1中描述。应用各种抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，转基因小鼠产生应答。但是，发现弗氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂时，全细胞具有高度免疫原性。在免疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，用具有足够抗-IRTA-2人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫，3天后处死并且取出脾脏。预期每次免疫可能需要2-3次融合。每一种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HCo7和HCo12转基因可以杂交，产生具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的一种小鼠。可替代的或者另外，如实施例1所述，可以使用KM小鼠^系。

产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的制备

为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。根据抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，使用50％PEG，将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。细胞以大约2×10⁵的密度接种于平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清，18％“653”条件基质，5％Origen(IGEN)，4mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中温育两周。大约两周之后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA根据人单克隆IgM和IgG抗体筛选各孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱下来的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，用1.43的消光系数根据OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

产生本发明单克隆抗体的转染瘤的制备

利用(例如)本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)science 229：1202)，也能在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。

例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将该DNA插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语“有效连接”意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分开的载体中，或者，更通常地，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，抗体基因片段上的互补限制性位点与载体连接，或者如果不存在限制性位点的活，则平端连接)。通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得V_H区段与载体中的C_H区段有效连接，而V_K区段与载体中的C_L区段有效连接，可以利用本文描述的抗体的轻链和重链可变区产生任意抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者可替代的，重组表达载体能编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基末端符合阅读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中描述。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节元件也可由来自诸如SRα启动子系统等不同来源的序列组成，SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的长末端重复序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除了抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于筛选载体已经导入其中的宿主细胞(参见，例如，Axel等人的美国专利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，选择性标记基因一般给已经导入载体的宿主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达该抗体，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，原核表达抗体基因无法高产率地产生活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，和DHFR选择性标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，用于NSO骨髓瘤细胞的另一种优选表达系统是WO 87/04462、WO89/01036和EP338,841公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，培养足以使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间，而产生抗体。可应用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

抗体与抗原结合的表征

通过(例如)标准ELISA，可以检测本发明的抗体与IRTA-2的结合。简要地说，用0.25μg/ml的纯化IRTA-2在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔中加入抗体的稀释液(例如，来自IRTA-2免疫小鼠的血浆的稀释液)，并且在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，之后和与碱性磷酸酶偶联的第二试剂(例如，对于人抗体，为山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下温育1小时。洗涤后，培养板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并且在OD 405-650下分析。优选地，用表现出最高效价的小鼠进行融合。

如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与IRTA-2免疫原有阳性反应性的杂交瘤。将与IRTA-2高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选择保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，保存在-140℃下，用于抗体纯化。

为了纯化抗-IRTA-2抗体，选择的杂交瘤在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43的消光系数根据OD₂₈₀确定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

为了确定选择的抗-IRTA-2单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用如上所述的IRTA-2包被的ELISA板，应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可以使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。

为了确定被纯化的抗体的同种型，可以用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭之后，平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应1-2小时。这些孔然后与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。

可以通过Western印迹法进一步检测抗-IRTA-2人IgG与IRTA-2抗原的反应性。简要地说，制备IRTA-2并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探查。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。

免疫偶联物

另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素等治疗性部分偶联的抗-IRTA-2抗体或其片段。这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它们的衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个例子是可作为商品购得的Mylotarg^TM；Wyeth。

可以利用本领域使用的连接体技术将细胞毒素与本发明的抗体偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的连接体类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的连接体。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的连接体，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。

关于细胞毒素的类型、用于偶联治疗剂与抗体的连接体和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)AdV.Drug DeliV.Rev.53：247-264。

本发明的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶联的放射性同位素的例子包括但不限于碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物的例子可以作为商品获得，包括Zevalin^TM(IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar^TM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。

本发明的抗体偶联物可用于修饰特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。

将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies ForDrug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy： A Review”，in MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。

双特异性分子

另一方面，本发明涉及包含本发明的抗-IRTA-2抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接到另一个功能性分子上，如另一个肽或蛋白质(例如另一个抗体或受体的配体)上，从而生成可与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以被衍生化或连接到一个以上的其他功能性分子上，从而生成可与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也包括在本文使用的术语“双特异性分子”内。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可与一个或多个其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)，从而得到双特异性分子。

因此，本发明包括双特异性分子，其具有至少一种对于IRTA-2的第一结合特异性和对于第二种目标表位的第二结合特异性。在本发明一个特定实施方案中，第二种目标表位是Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能与表达FcγR或FcαR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，又能与表达IRTA-2的靶细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达IRTA-2的细胞导向于效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达IRTA-2的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧阴离子的产生。

在其中双特异性分子是多特异性分子的本发明的一个实施方案中，除抗-Fc结合特异性和抗-IRTA-2结合特异性之外，该分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白质结合因而增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是与诸如抗原或受体等特定分子结合，从而导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可与Fc受体或靶细胞抗原结合。可替代的，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性所结合的实体。例如，抗增强因子部分可与细胞毒性T细胞结合(如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，该细胞导致针对靶细胞的免疫应答增强)。

在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括(例如)Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或单链Fv。该抗体也可以是轻链或重链二聚体，或任何其最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利No.4,946,778所述，该专利的内容引入本文作为参考。

在一个实施方案中，对于Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，该单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。本文使用的术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因的任意一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型分组为3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是72 kDa的分子，对单体IgG表现出高亲和力(10⁸-10⁹M^-1)。

某些优选抗-Fcγ单克隆抗体的制备和表征由Fanger等人在PCT申请WO 88/00052和美国专利号4,954,617中描述，在此处将其内容整体引入作为参考。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点处与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而，其结合基本不被生理学水平的IgG阻断。可用于本发明中的特定抗-FcγRI抗体为mAb 22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC保藏号为HB9469。在另外一些实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征在Graziano，R.F.等(1 995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和PCT公布WO 94/10332中描述。产生H22抗体的细胞系以HA022CL1的名称保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为CRL11177。

在另外一些优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由可与人IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，该抗体的结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”包括位于染色体19上的一个α-基因的基因产物(FcαRI)。已知该基因编码几个55-110kDa的可变剪接跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者均具有中等亲和力(约5×10⁷M^-1)，在暴露于诸如G-CSF或GM-CSF的细胞因子后该亲和力增加(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。已描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，它们被确定为A3、A59、A62和A77，它们在IgA配体结合域之外与FcαRI结合(Monteiro，R.C.等(1 992)J.Immunol.148：1764)。

FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要表达于诸如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞的免疫效应细胞上；(2)高水平表达(如每个细胞表达5,000-100,000个)；(3)是细胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)介导导向于它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。

优选人单克隆抗体，可以在本发明的双特异性分子中使用的其他抗体包括鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。

可通过应用本领域中公知的方法偶联组成的结合特异性，如抗-FcR和抗-IRTA-2结合特异性，制备本发明的双特异性分子。例如，双特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132)；Brennan等(1985)Science 229：81-83和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375所描述的方法。优选的偶联剂为SATA和sulfo-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。

当结合特异性是抗体时，它们可通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键合而偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个，优选1个巯基残基。

可替代的，两种结合特异性可在同一载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，Fab×F(ab’)₂或配体x Fab融合蛋白时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法例如在美国专利No.5,260,203、美国专利No.5,455,030、美国专利No.4,881,175、美国专利No.5,132,405，美国专利No.5,091,513、美国专利No.5,476,786、美国专利No.5,013,653、美国专利No.5,258,498和美国专利No.5,482,858中描述。

双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或Western印迹分析来证实。这些试验中的每一个通常通过应用对目标复合物具有特异性的标记试剂(如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以利用识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，这些复合物可利用多种其他免疫分析中的任一种来检测。例如，可对抗体进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见，例如，Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986年3月，在此引入作为参考)。通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或者通过放射自显影方法，能够检测放射性同位素。

药物组合物

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以含有结合靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体组合(或免疫偶联物或双特异性分子)。

本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的抗-IRTA-2抗体联合至少一种其他的抗炎剂或免疫抑制剂。可在联合治疗中使用的治疗剂的例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。

本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何与活性化合物不相容的常规介质或试剂范围外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的受试者和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

调节剂量方案，以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于抗体的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。一个治疗方案的例子需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本发明的抗-IRTA-2抗体的优选剂量方案包括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下剂量方案之一给药：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通常在有必要时多次给药。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如通过测定患者中抗靶抗原的抗体的血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

可替代地，抗体也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的抗-IRTA-2抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于IRTA-2+肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。可替代地，也可以通过本领域技术人员公知的试验检查该化合物的体外抑制能力，来评价组合物的这种性能。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如受试者的大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。如此处所用的短语“肠胃外给药”是指肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可替代地，本发明的抗体也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利在此引入作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强定向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4：273。

本发明的应用和方法

本发明的抗体，特别是人抗体，抗体组合物和方法，具有与诊断和治疗IRTA-2介导的疾病有关的许多体外和体内诊断和治疗应用。例如，这些分子可以施用于在体外或离体培养的细胞，或者例如在体内施用于人类受试者，从而治疗、预防或诊断多种疾病。本文使用的术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类动物和爬行类动物。优选的受试者包括患有IRTA-2活性介导的疾病的人类患者。这些方法特别适合治疗患有异常IRTA-2表达相关疾病的人类患者。当抗IRTA-2抗体与另一种药物一起给药时，这两种药物可以相继或同时给药。

假如与IRTA-3或IRTA-4相比，本发明的抗体与IRTA-2特异性结合，则本发明的抗体可以用来特异性检测细胞表面上的IRTA-2表达，而且能够用来通过免疫亲和纯化方法纯化IRTA-2。

此外，假如IRTA-2在各种肿瘤细胞上表达(Davis等，(2002)Immunological Reviews.190：123)，则本发明的人抗体、抗体组合物和方法能够用来治疗患有致肿瘤疾病的受试者，例如特征在于存在表达IRTA-2的肿瘤细胞的疾病，包括，例如，伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他B细胞淋巴瘤。

在一个实施方案中，本发明的抗体(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可以用于检测IRTA-2的水平或在其膜表面上含有IRTA-2的细胞的水平，然后可将该水平与特定疾病症状相关联。此外，也可以利用这些抗体抑制或阻断IRTA-2的功能，然后可以将其与特定疾病症状的预防或缓解相关联，因此提示IRTA-2作为疾病的介质。这可以如下实现，例如，在抗体与IRTA-2之间能够形成复合物的条件下，使样品和对照样品接触抗-IRTA-2抗体。检测并比较样品和对照中抗体与IRTA-2之间形成的任何复合物。

在另一实施方案中，可以在开始时检测本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与体外治疗或诊断应用相关的结合活性。例如，能够用以下实施例中所述的流式细胞分析来检测本发明的组合物。

本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物和组合物)在IRTA-2相关疾病的治疗和诊断中具有其它的应用。例如，人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物可以用来在体内或体外引发一种或多种下列生物活性：抑制表达IRTA-2的细胞的生长和/或将其杀死；介导表达IRTA-2的细胞在人效应细胞存在下的吞噬作用，或者阻断IRTA-2配体与IRTA-2的结合。

在一个特定实施方案中，本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在体内用于治疗、预防或诊断多种IRTA-2相关疾病。IRTA-2相关疾病的例子包括癌症、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他B细胞淋巴瘤。

在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)给药。使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。

如前所述，本发明的人抗-IRTA-2抗体可以与诸如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂等一种或多种其他治疗剂共同给药。抗体可以与该治疗剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该治疗剂分开给药。对于后者(分开给药)，抗体可以在治疗剂之前、之后或同时给药，或者可以与其他已知治疗如抗癌治疗例如放射治疗共同应用。这些治疗剂包括，抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲，它们本身仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/剂的剂量静脉内给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量静脉内给药，每2 1天1次。本发明的人抗-IRTA-2抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同的机制起作用。这种共同给药能够解决由于发展耐药性或肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。

靶特异性效应细胞，例如与本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)有关的效应细胞，也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞、自然杀伤细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。需要时，效应细胞可以从所治疗的受试者中获得。靶特异性效应细胞可以作为细胞在生理学可接受的溶液中的悬浮液给药。施用的细胞数可以是10⁸-10⁹个的数量级，但是根据治疗目的而不同。通常，该量足以获得在靶细胞处如表达IRTA-2的肿瘤细胞处的集中，以及通过例如吞噬作用实现对细胞的杀伤。给药途径也可以不同。

应用靶特异性效应细胞的治疗可以与其他清除靶细胞的技术一起进行。例如，使用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或具有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化学治疗一起使用。另外，可以应用联合免疫治疗将两种不同的细胞毒性效应群体导向至肿瘤细胞排斥。例如，与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗-IRTA-2抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂一起使用。

本发明的双特异性和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽以及将其清除。抗-Fc受体的混合物也可以用于该目的。

具有补体结合位点(如来自IgG1、-2或-3或IgM的补体结合部分)的本发明的组合物(例如人、人源化或嵌合抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)，也可以在补体的存在下使用。在一个实施方案中，用本发明的结合剂和适宜的效应细胞离体处理含有靶细胞的细胞群体能够通过加入补体或含有补体的血清来实现。补体蛋白的结合能够改善用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一实施方案中，用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞也能够被补体裂解。在另一实施方案中，本发明的组合物不激活补体。

本发明的组合物(例如人、人源化或嵌合抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可以与补体一起施用。因此，在本发明的范围内包括含有人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为补体与人抗体、多特异性或双特异性分子紧密接近。另外，本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清也可以分开施用。

本发明的范围内还包括药盒，该药盒包括本发明的抗体组合物(例如人抗体、多特异性或双特异性分子，或免疫偶联物)和使用说明。该药盒可以进一步包括一种或多种另外的试剂，如免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或一种或多种另外的本发明的人抗体(例如，具有补充活性的人抗体，它结合IRTA-2抗原上与第一人抗体不同的表位)。

因此，可以给用本发明的抗体组合物治疗的患者(在本发明的人抗体给药之前、同时或之后)另外施用另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，该治疗剂可以增强或增加人抗体的治疗效果。

在另外一些实施方案中，可以另外用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药物治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可以用来靶向表达FcγR或IRTA-2的细胞，例如标记这些细胞。对于这种应用，可以将结合剂与能够被检测到的分子连接。因此，本发明提供离体或在体外定位表达Fc受体如FcγR或IRTA-2的细胞的方法。可检测标记物可以是，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。

在一个特定实施方案中，本发明提供检测样品中IRTA-2抗原的存在，或测定IRTA-2抗原量的方法，包括在抗体或其部分与IRTA-2之间能够形成复合物的条件下使样品和对照样品接触可与IRTA-2特异性结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品之间复合物形成的不同指示样品中IRTA-2抗原的存在。

在另外一些实施方案中，本发明提供通过对受试者施用上述人抗体治疗受试者的IRTA-2介导的疾病的方法，该疾病例如是癌症、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤和其他B细胞淋巴瘤。这些抗体及其衍生物用来抑制IRTA-2诱导的与某些疾病有关的活性，如增殖和分化。通过将抗体与IRTA-2接触(例如通过对受试者施用抗体)，IRTA-2诱导这些活性的能力得到抑制，因此相关疾病得到治疗。抗体组合物可以单独给药或者与诸如细胞毒剂或放射性毒剂的另一种治疗剂一起给药，该另一种治疗剂与抗体组合物联合或协同作用，以治疗或预防IRTA-2介导的疾病。

在另一实施方案中，通过将化合物与抗体连接，本发明的免疫偶联物可以将该化合物(例如治疗剂，标记物，细胞毒素，放射毒素，免疫抑制剂等)靶向至具有IRTA-2细胞表面受体的细胞。因此，本发明也提供用于离体或在体内定位表达IRTA-2的细胞(例如用可检测标记物，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)的方法。可替代地，免疫偶联物通过将细胞毒素或放射毒素靶向至IRTA-2，也可以杀伤具有IRTA-2细胞表面受体的细胞。

本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将这些实施例理解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专利和公开专利申请的内容均在此引用作为参考。

实施例

实施例1：抗IRTA-2人单克隆抗体的制备

抗原

用标准重组方法制备由连接到非IRTA-2多肽上的IRTA-2胞外域组成的重组融合蛋白，作为免疫用抗原。

转基因HuMAb小鼠^和KM小鼠^

用表达人抗体基因的转基因HuMAb小鼠^的HCo7/HCo12系和转基因转染色体KM系小鼠制备抗IRTA-2的完全人单克隆抗体。在这两种小鼠系的每一种中，已经如Chen等(1993)EMBO J.12：811-820所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO01/09187的实施例1所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。该小鼠系的每一个都携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851所述。HCo7系携带HCo7人重链转基因，如美国专利Nos.5,545,806；5,625,825和5,545,807所述。HCo12系携带HCo12人重链转基因，如PCT公开WO01/09187的实施例2所述。KM小鼠^系含有SC20转染色体，如PCT公布WO02/43478所述。

HuMab和KM的免疫：

为了产生抗IRTA-2的完全人单克隆抗体，用纯化的重组IRTA-2融合蛋白免疫HuMAb小鼠^和KM小鼠^的小鼠，该融合蛋白是由用含有编码该融合蛋白的基因的表达载体转染的NS0细胞产生的。对于HuMab小鼠^的一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851和PCT公开WO98/24884中描述。在第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。利用纯化的重组IRTA-2融合蛋白制剂(5-50μg)腹膜内、皮下(Sc)或通过足垫注射免疫HuMAb小鼠和KM小鼠^。

转基因小鼠用在完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过足垫(FP)免疫两次，然后用在不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP、Sc或FP免疫3-21天(最多可达总共11次免疫)。通过眼眶后采血监测免疫应答。通过ELISA对血浆进行筛选(如下文所述)，用具有足够的抗-IRTA-2人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原经静脉内对小鼠进行加强免疫，3天及2天后处死并取出脾脏。典型地，每种抗原进行10-35次融合。每种抗原免疫几十只小鼠。

产生抗-IRTA-2抗体的HuMab或KM小鼠^的选择

为了选择产生可与IRTA-2结合的抗体的HuMab或KM小鼠^，如Fishwild，D.等(1996)所述，通过ELISA检测来自被免疫小鼠的血清。简要地说，用在PBS中浓度为1-2μg/ml的纯化重组IRTA-2以50μl/孔的量包被微量滴定板，4℃下温育过夜，然后用PBS中的5％鸡白蛋白/Tween(0.05％)以200μl/孔封闭。将来自IRTA-2免疫的小鼠的血浆稀释液加入各孔中，在室温下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体在室温下温育1小时。洗涤后，培养板用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)显色，并用分光光度计在OD 415-495处分析。用显示最高抗-IRTA-2抗体效价的小鼠进行融合。融合如下文所述进行，通过ELISA检测杂交瘤上清液的抗-IRTA-2活性。

产生抗IRTA-2人单克隆抗体的杂交瘤的产生

根据标准程序，用PEG将从HuMab小鼠和KM小鼠^中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。使用50％PEG(Sigma)将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬液与1/4数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC CRL1581)融合。将细胞以约1×10⁵/孔的密度接种于平底微量滴定板上，然后在选择性培养基中温育约两周，该培养基含有10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、在DMEM(Mediatech，CRL 10013，含有高浓度葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠)中的3-5％origen(IGEN)，加5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2周后，将细胞在用HT替代了其中的HAT的培养基中培养。然后通过ELISA(如上所述)根据人抗IRTA-2单克隆IgG抗体筛选各个孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果对于人IgG仍然是阳性，则通过有限稀释将抗IRTA-2单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量的抗体用于进一步表征。

选择HuMAb小鼠^产生的杂交瘤克隆9D12和KM小鼠^产生的8A1进一步分析。

实施例2：人单克隆抗体9D12和8A1的结构表征

利用标准PCR技术分别从9D12和8A1杂交瘤中获得编码9D12和8A1单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并利用标准DNA测序技术进行测序。

9D12的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A和SEQ ID NO：13和17中。

9D12的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1B和SEQ ID NO：15和19中。

9D12重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，9D12重链应用了来自人种系V_H 3-23的V_H区段、来自人种系7-27的D区段和来自人种系JH3b的JH区段。9D12V_H序列与种系V_H3-23序列的比对显示在图3中。利用Kabat CDR区测定系统对9D12VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1A和3以及SEQ ID NO：1、3、5所示。

9D12轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，9D12轻链应用了来自人种系V_K L6的VL区段和来自人种系JK 1的JK区段。9D12VL序列与种系V_K L6序列的比对显示于图5中。利用Kabat CDR区测定系统对9D12VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1B和5以及SEQ ID NO：7、9、11所示。

8A1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2A和SEQ ID NO：14和18中。

8A1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2B和SEQ ID NO：16和20中。

8A1重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，8A1重链应用了来自人种系V_H 1-8的V_H区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH6b的JH区段。8A1 V_H序列与种系V_H1-8序列的比对显示于图4中。利用Kabat CDR区测定系统对8A1VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2A和4以及SEQ ID NO：2、4、6所示。

8A1轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，8A1轻链应用了来自人种系V_K L18的VL区段和来自人种系JK2的JK区段。8A1 VL序列与种系V_K L18序列的比对显示于图6中。利用Kabat CDR区测定系统对8A1 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2B和6以及SEQ ID NO：8、10、12所示。

实施例3：抗-IRTA-2人单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征

在该实施例中，通过Biacore分析检测了抗-IRTA-2抗体的结合亲和力和结合动力学。也通过流式细胞分析检测了结合特异性。

结合亲和力和动力学

通过Biacore分析(Biacore AB，Uppsala，瑞典)表征了抗-IRTA-2抗体的亲和力和结合动力学。使用Biacore提供的标准酰胺偶联化学方法和试剂盒，用通过伯胺共价连接到CM5芯片(羧甲基葡聚糖包被的芯片)上的抗人IgG抗体捕获纯化的抗IRTA-2单克隆抗体。通过使在HBS EP缓冲液(Biacore AB提供)中浓度为400、300、200、100和50nM的IRTA-2-Fc抗原(由IRTA-2的胞外域与人IgG1的Fc部分连接组成的融合蛋白)以12μl/min的流速流过，来检测结合。抗原-抗体结合动力学进行20分钟(对于8A1)或5分钟(对于9D12)，解离动力学进行10分钟(对于8A1)或5分钟(对于9D12)。用BAIevaluation软件(Biacore AB)将结合和解离曲线拟合为1∶1 Langmuir结合模型。测定的K_D、k_on和k_off值显示在表1中。

表1：IRTA-2 HuMAb的Biacore结合数据

抗-IRTA-2抗体	亲和力Kd×10^-9(M)	结合速率k_on×10⁴(1/Ms)	解离速率k_off×10^-4l/s
抗-IRTA-2抗体	亲和力Kd×10^-9(M)	结合速率k_on×10⁴(1/Ms)	解离速率k_off×10^-4l/s	9D12	2.1	3.4	0.69
8A1	20.0	0.58	1.1	9D12	2.1	3.4	0.69

经流式细胞术测定的结合特异性

开发了在细胞表面表达IRTA-2、IRTA-3或IRTA-4蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，并用它来通过流式细胞术确定IRTA2单克隆抗体的特异性。用含有编码跨膜形式IRTA2、IRTA3或IRTA4的全长cDNA的表达质粒转染CHO细胞。另外，被转染的蛋白质在N末端含有myc标签，以用抗-myc抗体进行检测。通过将被转染的细胞与浓度为10μg/ml的每种IRTA-2Ab温育，评价两种抗IRTA2单克隆抗体的结合。洗涤细胞，用藻红蛋白标记的抗人IgG Ab检测其结合。用鼠抗myc Ab，然后用标记的抗鼠IgG作为阳性对照。用单独的第二抗体作为阴性对照。结果显示在图7A-C中。根据染色平均荧光强度(MFI)测定，IRTA-2单克隆抗体9D12和8A1与被IRTA-2转染的CHO细胞系结合，但是不与表达IRTA-3或-4的CHO系结合。这些数据证明了该单克隆抗体对于IRTA-2的特异性。

实施例4：IRTA-2抗体与正常B细胞和B细胞来源的肿瘤系的结合

利用双色免疫荧光法和流式细胞术证明IRTA-2HuMAb与外周血B淋巴细胞的结合。CD19是一种细胞表面标记物，它能够用于区别外周血B淋巴细胞。人外周血单核细胞与生物素化9D12、生物素化8A1或同种型对照生物素化人Ab一起温育。洗涤细胞，与FITC-标记的链霉亲和素以及藻红蛋白标记的抗CD19抗体一起温育。洗涤细胞，并通过流式细胞术进行分析。结果显示在图8中。通过染色平均荧光强度(MFI)测定，IRTA-2单克隆抗体9D12和8A1显示与CD19+细胞的结合比对照同种型抗体增高。这些数据证明，根据单克隆抗体9D12和8A1估计，正常外周血B淋巴细胞表达IRTA-2蛋白。

通过流式细胞术评价了IRTA-2 HuMAb与B细胞肿瘤系Ramos(ATCC CRL-1596)、Raji(ATCC CCL-86)、Daudi(ATCCCCL-213)、IM-9(ATCC CCL-159)、Karpas 1106P(DSMZ ACC 545)、SU-DHL-4(DSMZ ACC 495)、Granta 519(DSMZ ACC 342)、SU-DHL-6(DSMZ ACC 572)和JEKO-1(DSMZ ACC 553)的结合。Ramos、Raji、Daudi和IM-9B细胞肿瘤系与每一种IRTA-2HuMAb、抗-B-细胞阳性对照抗体或同种型匹配的阴性对照人抗体一起温育，洗涤，并用藻红蛋白标记的抗人第二抗体检测。洗涤细胞，并通过流式细胞术进行分析。图9示出了9D12和8A1抗体的结合的结果。IRTA-2HuMAb基本不与任一B细胞肿瘤系Ramos、Raji、Daudi或IM-9结合。观察到的9D12和8A1与IM-9细胞系的低水平结合与观察到的同种型对照抗体的结合水平相当，因此证明了该结合不是特异性的。Karpas 1106P、SU-DHL-4、Granta 519、SU-DHL-6和JEKO-1细胞系与IRTA-2HuMAbs或对照人抗体中的每一种温育，洗涤，并用藻红蛋白标记的抗人第二抗体检测。图10和11示出了9D12和8A1抗体的结合的结果。这些数据表明，与对照人抗体相比，抗-IRTA-2抗体与Granta 519、SU-DHL-6和JEKO-1肿瘤细胞结合，但是基本不与Karpas 1106P或SU-DHL-4肿瘤细胞结合。总之，这些数据证明了某些B细胞肿瘤系在细胞表面上表达IRTA-2蛋白。

序列表

9D12的VH CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)

1 ssams

8A1的VH CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

1 sydin

9D12的VH CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)

1 sisgsgdtty yadsvkg

8A1的VH CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)

1 wmhpnsgntg yaqkfqg

9D12的VH CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

1 nwgaafdi

8A1的VH CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)

1 grgitmvrgg iiyygmdv

9D12的VK CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

1 rasqsvssyl a

8A1的VK CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)

1 rasqgissal a

9D12的VK CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)

1 dasnrat

8A1的VK CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)

1 dassles

9D12的VK CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)

1 qqrsnwprwt

8A1的VK CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)

1 qqfnsypht

9D12的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)

1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs ssamswvrqa pgkglewvss isgsgdttyy

61 adsvkgrfti srdnskntly lqmnslrved aalyycaanw gaafdiwgqg tmvtvss

8A1的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)

1 qmqlvqsgae vkkpgasvkv sckasgytfi sydinwvrqa tgqglewmgw mhpnsgntgy

61 aqkfqgrvtm trntsistay melsslrsed tavyycargr gitmvrggii yygrmdvwgqg ttvtvss

9D12的VK的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)

1 eivltqspat lslspgerat lscrasqsvs sylawyqqkp gqaprlliyd asnratgipa

61 rfsgsgsgtd ftltisslep edfavyycqq rsnwprwtfg qgtkveik

8A1的VK的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)

1 aiqltqspss lsasvgdrvt itcrasqgis salawyqqkp gkapklliyd asslesgvps

61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycqq fnsyphtfgq gtkleik

9D12的VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)

1 GAG GTG CAA CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG

GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC

TCT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG

GTC TCA TCT ATT AGT GGT AGT GGT GAT ACC ACA TAC TAC GCA GAC TCC

GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAT ACG CTG

TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GTC GAG GAC GCG GCC TTA TAT TAC

TGT GCG GCT AAC TGG GGA GCT GCT TTT GAT ATC TGG GGC CAA GGG ACA

ATG GTC ACC GTC TCTTCA

8A1的VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)

CAA ATG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC

TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC ATT AGT TAT

GAT ATC AAC TGG GTG CGA CAG GCC ACT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG

GGA TGG ATG CAC CCT AAC AGT GGT AAC ACA GGC TAT GCA CAG AAG TTC

CAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC AGG AAC ACC TCC ATA AGC ACA GCC TAC

ATG GAA CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT

GCG AGA GGC CGA GGA ATT ACT ATG GTT CGG GGA GGT ATT ATC TAC TAC

GGT ATG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

9D12的VK的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)

GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG

GAA AGA GCC ACCCCTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC TAC

TTA GCC TGG TAC CAA CAG AAA CCT GCC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC

TAT GAT GCA TCC AAC AGG GCC ACT GGC ATC ACA GCC AGG TTC AGT GGC

AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT

GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CGG

TGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA

8A1的VK的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)

GCC ATC CAG TTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT AGC AGT GCT

TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC

TAT GAT GCC TCC AGT TTG GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT

GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CAA CAG TTT AAT AGT TAC CCT CAC

ACT TTT GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA

VH种系3-23的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)

1 evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs sylamswvrq apgkglewvs aisgsggsty

61 yadsvkgrft isrdnskntl ylqmnslrae dtavyyca

VH种系1-8的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)

1 qvqlvqsgae vkkpgasvkv kvsckasgy tftsydinwv rqatgqglew mgwmnpnsgn

61 tgyaqkfqgr vtmtrntsis taymelsslr sedtavyycar g

VK L6种系的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)

1 eivltqspat lslspgerat lscrasqsvs sylawyqqkp gqaprlliyd asnratgjpa

61 rfsgsgsgtd ftltisslep edfavyycqq rsnwp

VK L18种系的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)

1 aiqltqspss lsasvgdrvt jtcrasqgis salawyqqkp gkapklliyd asslesgvps

61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycqq fnsyp

IRTA-2的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)

1 mllwvillvl apvsgqfart prpiiflqpp wttvfqgerv tltckgfrfy spqktkwyhr

61 ylgkeilret pdnilevqes geyrcqaqgs plsspvhldf ssaslilqap lsvfegdsvv

121 lrcrakaevt lnntiykndn vlaflnkrtd fhiphaclkd ngayrctgyk esccpvssnt

181 vkiqvqepft rpvlrassfq pisgnpvtlt cetqlslers dvplrfrffr ddqtlglgws

241 lspnfqitam wskdsgfywc kaatmphsvi sdsprswiqv qipashpvlt lspekalnfe

301 gtkvtlhcet qedslrtlyr fyhegvplrh ksvrcergas isfslttens gnyyctadng

361 lgakpskavs lsvtvpvshp vlnlsspedl ifegakvtlh ceaqrgslpi lyqfhhedaa

421 lerrsansag gvaisfslta ehsgnyycta dngfgpqrsk avslsitvpv shpvltlssa

481 ealtfegatv tlhcevqrgs pqilyqfyhe dmplwssstp svgrvsfsfs lteghsgnyy

541 ctadngfgpq rsevvslfvt vpvsrpiltl rvpraqavvg dllelhceap rgsppilywf

601 yhedvtlgss sapsggeasf nlsltaehsg nysceanngl vaqhsdtisl svivpvsvpi

661 ltfrapraqa vvgdllelhc ealrgsspil ywfyhedvtl gkisapsggg asfnlsltte

721 hsgiyscead ngpeaqrsem vtlkvavpvs rpvltlrapg thaavgdlle lhcealrgsp

781 lilyrffhed vtlgnrssps ggaslnlslt aehsgnysce adnglgaqrs etvtlyitgl

841 tanrsgpfat gvaggllsia glaagallly cwlsrkagrk pasdparspp dsdsqeptyh

901 nvpaweelqp vytnanprge nvvysevrii qekkkhavas dprhlrnkgs piiysevkva

961 stpvsgslfl assaphr

IRTA-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)

1 mllwasllaf apvcgqsaaa hkpvisvhpp wttffkgerv tltcngfqfy atekttwyhr

61 hywgekltlt pgntlevres glyrcqargs prsnpvrllf ssdslilqap ysvfegdtlv

121 lrchrrrkek ltavkytwng nilsisnksw dllipqassn nngnyrcigy gdendvfrsn

181 fkiikiqelf phpelkatds qptegnsvnl scetqlpper sdtplhfnff rdgevilsdw

241 stypelqlpt vwrensgsyw cgaetvrgni hkhspslqih vqripvsgvl letqpsggqa

301 vegemlvlvc svaegtgdtt fswhredmqe slgrktqrsl raelelpair qshaggyyct

361 adnsygpvqs mvlnvtvret pgnrdglvaa gatggllsal llavallfhc wrrrksgvgf

421 lgdetrlppa pgpgesshsi cpaqvelqsl yvdvhpkkgd lvyseiqttq lgeeeeants

481 rtlledkdvs vvysevktqh pdnsagkiss kdees

IRTA-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)

1 mllwllllil tpgreqsgva pkavlllnpp wstafkgekv alicssishs laqgdtywyh

61 dekdlkikhd kiqitepgny qcktrgssls davhvefspd wlilqalhpv fegdnvilrc

121 qgkdnknthq kvyykdgkql pnsynlekit vnsvsrdnsk yhctayrkfy ildievtskp

181 lniqvqelfl hpvlrassst piegspmtlt cetqlspqrp dvqlqfslfr dsqtlglgws

241 rsprlqipam wtedsgsywc evetvthsik krslrsqirv qrvpvsnvnl eirptggqli

301 egenmvlics vaqgsgtvtf swhkegrvrs lgrktqrsll aelhvltvke sdagryycaa

361 dnvhspilst wirvtvripv shpvltfrap rahtvvgdll elhceslrgs ppilyrfyhe

421 dvtlgnssap sgggasfnls ltaehsgnys cdadnglgaq hshgvslrvt vpvsrpvltl

481 rapgaqavvg dllelhcesl rgsfpilywf yheddtlgni sahsgggasf nlslttehsg

541 nysceadngl gaqhskvvtl nvtgtsrnrt gltaagitgl vlsilvlaaa aallhyarar

601 rkpgglsatg tsshspsecq epsssrpsri dpqepthskp lapmelepmy snvnpgdsnp

661 iysqiwsiqh tkensancpm mhqeheeltv lyselkkthp ddsageassr graheeddee

721 nyenvprvll asdh

IRTA-4的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)

1 mllwsllvif davteqadsl tlvapssvfe gdsivlkcqg eqnwkiqkma yhkdnkelsv

61 fkkfsdfliq savlsdsgny fcstkgqlfl wdktsnivki kvqelfqrpv ltassfqpie

121 ggpvslkcet rlspqrldvq lqfcffrenq vlgsgwsssp elqisavwse dtgsywckae

181 tvthrirkqs lqsqihvqri pisnvsleir apggqvtegq klillcsvag gtgnvtfswy

241 reatgtsmgk ktqrslsael eipavkesda gkyycradng hvpiqskvvn ipvripvsrp

301 vltlrspgaq aavgdllelh cealrgsppi lyqfyhedvt lgnssapsgg gasfnlslta

361 ehsgnyscea nnglgaqcse avpvsisgpd gyrrdlmtag vlwglfgvlg ftgvalllya

421 lfhkisgess atneprgasr pnpqeftyss ptpdmeelqp vyvnvgsvdv dvvysqvwsm

481 qqpessanir tllenkdsqv jyssvkks

IRTA-5的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)

1 mlprllllic aplcepaelf liaspshpte gspvtltckm pflqssdaqf qfcffrdtra

61 lgpgwssspk lqiaamwked tgsywceaqt maskvlrsrr sqinvhrvpv advsletqpp

121 ggqvmegdrl vlicsvamgt gditflwykg avglnlqskt qrsltaeyei psvresdaeq

181 yycvaengyg pspsglvsit vripvsrpil mlrapraqaa vedvlelhce alrgsppily

241 wfyheditlg srsapsggga sfnlslteeh sgnysceann glgaqrseav tlnftvptga

301 rsnhltsgvi egllstlgpa tvallfeygl krkigrrsar dplrslpspl pqeftylnsp

361 tpgqlqpiye nvnvvsgdev yslayynqpe qesvaaetlg thmedkvsld iysrlrkani

421 tdvdyedam

序列表概述

SEQ IDNO：	序列	SEQ IDNO：	序列
SEQ IDNO：	序列	SEQ IDNO：	序列	1	VH CDR1氨基酸9D12	17	VH核苷酸9D12
2	VH CDR1氨基酸8A1	18	VH核苷酸8A1	1	VH CDR1氨基酸9D12	17	VH核苷酸9D12
2	VH CDR1氨基酸8A1	18	VH核苷酸8A1
3	VH CDR2氨基酸9D12	19	VK核苷酸9D12
3	VH CDR2氨基酸9D12	19	VK核苷酸9D12	4	VH CDR2氨基酸8A1	20	VK核苷酸8A1
				4	VH CDR2氨基酸8A1	20	VK核苷酸8A1
				5	VH CDR3氨基酸9D12	21	VH 3-23种系氨基酸
6	VH CDR3氨基酸8A1	22	VH 1-8种系氨基酸	5	VH CDR3氨基酸9D12	21	VH 3-23种系氨基酸
6	VH CDR3氨基酸8A1	22	VH 1-8种系氨基酸
7	VK CDR1氨基酸9D12	23	VK L6种系氨基酸
7	VK CDR1氨基酸9D12	23	VK L6种系氨基酸	8	VK CDR1氨基酸8A1	24	VK L18种系氨基酸
				8	VK CDR1氨基酸8A1	24	VK L18种系氨基酸
				9	VK CDR2氨基酸9D12	25	IRTA-2氨基酸
10	VK CDR2氨基酸8A1	26	IRTA-1氨基酸	9	VK CDR2氨基酸9D12	25	IRTA-2氨基酸
10	VK CDR2氨基酸8A1	26	IRTA-1氨基酸			27	IRTA-3氨基酸
11	VK CDR3氨基酸9D12	28	IRTA-4氨基酸			27	IRTA-3氨基酸
11	VK CDR3氨基酸9D12	28	IRTA-4氨基酸	12	VK CDR3氨基酸8A1	29	IRTA-5氨基酸
				12	VK CDR3氨基酸8A1	29	IRTA-5氨基酸
				13	VH氨基酸9D12
14	VH氨基酸8A1			13	VH氨基酸9D12
14	VH氨基酸8A1
15	VK氨基酸9D12
15	VK氨基酸9D12			16	VK氨基酸8A1

序列表

<110>米德列斯公司

R.格拉齐诺

D.J.金

M.斯里尼瓦桑

J.卡达雷尔利

黄海春

<120>IRTA-2抗体及其用途

<130>2202397-WO0

<150>60/643,689

<151>2005-01-12

<160>29

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ser Ser Ala Met Ser Trp

1 5

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ser Tyr Asp Ile Asn

1 5

<210>3

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>3

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>4

Trp Met His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>5

Asn Trp Gly Ala Ala Phe Asp Ile

1 5

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gly Arg Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Gly Ile Ile Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>7

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>8

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>9

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>10

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>11

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Arg Trp Thr

1 5 10

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>12

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr

1 5

<210>13

<211>117

<212>PRT

<213>人

<400>13

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Va1 Glu Asp Ala Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Trp Gly Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210>14

<211>109

<212>PRT

<213>人

<400>14

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp

20 25 30

Met His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly

35 40 45

Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu

50 55 60

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

65 70 75 80

Gly Arg Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Gly Ile Ile Tyr Tyr Gly Met

85 90 95

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210>15

<211>108

<212>PRT

<213>人

<400>15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Arg

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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Ala

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Pro Ala Ser Asp Pro Ala Arg Ser Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gln Glu

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Arg

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Ser Trp His Lys Glu Gly Arg Val Arg Ser Leu Gly Arg Lys Thr Gln

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Glu Ala Asp Asn Gly Leu Gly Ala Gln His Ser Lys Val Val Thr Leu

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Leu Cys Ser Val Ala Gly Gly Thr Gly Asn Val Thr Phe Ser Trp Tyr

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Arg Ser Arg Arg Ser Gln Ile Asn Val His Arg Val Pro Val Ala Asp

100 105 110

Val Ser Leu Glu Thr Gln Pro Pro Gly Gly Gln Val Met Glu Gly Asp

115 120 125

Arg Leu Val Leu Ile Cys Ser Val Ala Met Gly Thr Gly Asp Ile Thr

130 135 140

Phe Leu Trp Tyr Lys Gly Ala Val Gly Leu Asn Leu Gln Ser Lys Thr

145 150 155 160

Gln Arg Ser Leu Thr Ala Glu Tyr Glu Ile Pro Ser Val Arg Glu Ser

165 170 175

Asp Ala Glu Gln Tyr Tyr Cys Val Ala Glu Asn Gly Tyr Gly Pro Ser

180 185 190

Pro Ser Gly Leu Val Ser Ile Thr Val Arg Ile Pro Val Ser Arg Pro

195 200 205

Ile Leu Met Leu Arg Ala Pro Arg Ala Gln Ala Ala Val Glu Asp Val

210 215 220

Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Pro Ile Leu Tyr

225 230 235 240

Trp Phe Tyr His Glu Asp Ile Thr Leu Gly Ser Arg Ser Ala Pro Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Glu Glu His Ser Gly

260 265 270

Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Gly Ala Gln Arg Ser Glu

275 280 285

Ala Val Thr Leu Asn Phe Thr Val Pro Thr Gly Ala Arg Ser Asn His

290 295 300

Leu Thr Ser Gly Val Ile Glu Gly Leu Leu Ser Thr Leu Gly Pro Ala

305 310 315 320

Thr Val Ala Leu Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Lys Arg Lys Ile Gly Arg

325 330 335

Arg Ser Ala Arg Asp Pro Leu Arg Ser Leu Pro Ser Pro Leu Pro Gln

340 345 350

Glu Phe Thr Tyr Leu Asn Ser Pro Thr Pro Gly Gln Leu Gln Pro Ile

355 360 365

Tyr Glu Asn Val Asn Val Val Ser Gly Asp Glu Val Tyr Ser Leu Ala

370 375 380

Tyr Tyr Asn Gln Pro Glu Gln Glu Ser Val Ala Ala Glu Thr Leu Gly

385 390 395 400

Thr His Met Glu Asp Lys Val Ser Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Arg

405 410 415

Lys Ala Asn Ile Thr Asp Val Asp Tyr Glu Asp Ala Met

420 425

Claims

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(b)基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

(c)与Granta 519肿瘤细胞结合，并且基本不与Raji或Ramos肿瘤细胞结合。

2.权利要求1的抗体，其为人抗体。

3.权利要求1的抗体，其为嵌合抗体或人源化抗体。

4.权利要求2的抗体，其为IgG1或IgG4同种型的全长抗体。

5.权利要求2的抗体，其为抗体片段或单链抗体。

6.权利要求2的抗体，其中所述抗体以5×10^-8M或更低的K_D与人IRTA-2结合。

7.权利要求2的抗体，其中所述抗体以5×10^-9M或更低的K_D与人IRTA-2结合。

8.权利要求2的抗体，其中所述人IRTA-2包括具有如SEQ IDNO：25[Genbank登录号NP_112571]所示氨基酸序列的多肽。

9.权利要求2的抗体，其中所述人IRTA-3包括具有如SEQ IDNO：27[Genbank登录号AAL59390]所示氨基酸序列的多肽。

10.权利要求2的抗体，其中所述人IRTA-4包括具有如SEQ IDNO：28[Genbank登录号AAL60249]所示氨基酸序列的多肽。

11.权利要求2的抗体，其中该抗体实际上与SU-DHL-6或JEKO-1肿瘤细胞结合。

12.权利要求2的抗体，其中该抗体基本不与Daudi、IM-9、Karpas1106P或SU-DHL-4肿瘤细胞结合。

13.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体交叉竞争结合IRTA-2，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人IRTA-2结合；

(b)基本不与人IRTA-3或IRTA-4结合；且

14.权利要求13的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

15.权利要求13的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

16.权利要求13的抗体，其中所述人IRTA-2包括具有如SEQ IDNO：25[Genbank登录号NP_112571]所示氨基酸序列的多肽。

17.权利要求13的抗体，其中所述人IRTA-3包括具有如SEQ IDNO：27[Genbank登录号AAL59390]所示氨基酸序列的多肽。

18.权利要求13的抗体，其中所述人IRTA-4包括具有如SEQ IDNO：28[Genbank登录号AAL60249]所示氨基酸序列的多肽。

19.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自人V_H 3-23基因或人V_H 1-8基因的重链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或源自人V_K L6基因或人V_L L18基因的轻链可变区，其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

21.权利要求20的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其还包括产自或源自人V_H 3-23基因或人V_H 1-8基因的重链可变区。

22.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：3的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：5的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：7的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：9的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：11的轻链可变区CDR3。

23.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：4的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：6的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：8的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：10的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR3。

24.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：13和14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO：15和16的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与IRTA-2特异性结合。

25.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

26.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区。

27.一种组合物，其含有权利要求1的抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。

28.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的权利要求1的抗体或其抗原结合部分。

29.一种组合物，其含有权利要求28的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

30.权利要求28的免疫偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒素。

31.一种组合物，其含有权利要求30的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

32.权利要求28的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。

33.一种组合物，其含有权利要求32的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

34.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1的抗体或其抗原结合部分。

35.一种表达载体，其包含权利要求34的核酸分子。

36.一种宿主细胞，其包含权利要求35的表达载体。

37.一种制备抗-IRTA-2抗体的方法，包括在权利要求36的宿主细胞中表达该抗体，并且从所述宿主细胞中分离该抗体。

38.一种抑制表达IRTA-2的肿瘤细胞生长的方法，包括使该细胞与有效抑制肿瘤细胞生长的量的权利要求1的抗体或其抗原结合部分相接触。