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CN101052420A - 用于治疗自体免疫疾病的并用药 - Google Patents

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CN101052420A
CN101052420A CNA2005800374032A CN200580037403A CN101052420A CN 101052420 A CN101052420 A CN 101052420A CN A2005800374032 A CNA2005800374032 A CN A2005800374032A CN 200580037403 A CN200580037403 A CN 200580037403A CN 101052420 A CN101052420 A CN 101052420A
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camk
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CNA2005800374032A
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English (en)
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田头秋三
福岛晃久
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Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供用于预防和/或治疗自体免疫疾病的并用药。更具体的讲，提供含有CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物的用于预防和/或治疗自体免疫疾病的并用药，用于该并用的药物组合物、商业包装和试剂盒等；含有CaMK II抑制剂作为有效成分的具有疾病缓解性抗风湿病药物的预防和/或治疗自体免疫疾病的效果的增强剂；适用于并用的CaMK II抑制剂的筛选方法等。

Description

用于治疗自体免疫疾病的并用药
技术领域
[0001]本发明涉及用于预防和/或治疗自体免疫疾病的并用药。
背景技术
[0002]生物体通常对自己的构成成分(自身抗原)不显示出免疫应答，保持着免疫学的恒定性。这样的恒定性称为自然免疫宽容。该宽容状态被破坏，有时产生与自身抗原反应的抗体和淋巴细胞。这样的现象称为自体免疫，自体免疫触发引起的疾病称为自体免疫疾病。自体免疫疾病分为全身性自体免疫疾病和器官特异性自体免疫疾病。代表性疾病，前者为全身性红斑狼疮、关节风湿病，后者为多发性硬化症、重症肌无力症、自体免疫性喀血性贫血、桥本氏甲状腺炎等。全身性自体免疫疾病过去归入特征为结缔组织增生的称为胶原病的范畴。而近年来，一直在研究它们的成因，人们认为至少部分与自体免疫有关，但不清楚的地方还很多。而在器官特异性自体免疫疾病中，自身抗体的致病性作用清楚的情况比较多。根据到目前为止的研究可以推定器官特异性自体免疫疾病是由受到抗原刺激的T淋巴细胞引起的疾病。关于自身抗体的产生机制，提出了各种各样的想法。第1是参与特定的自身抗体产生的基因的参与说。第2是通常血中微量存在的抗原因某些原因大量释放，或抗原因某些原因被修饰引起的。第3参与抗体产生的淋巴细胞方面出现异常，脱离宽容状态引起的。人们认为也许是这些现象重复进行产生自身抗体的。
[0003]关节风湿病(rheumatoid arthritis)是自体免疫疾病的一种，主要特征为多发性关节炎，是同时损伤多个器官的原因不明的全身性炎症疾病，缓解和恶化过程反复进行，发展到慢性，如果不治疗放任下去，招致关节的破坏和变形，不久就会呈现出运动功能损伤，是时常有威胁生命可能性的疾病。然而就现在的医学来说，认为对于关节风湿病既不能完全治愈，也不能完全预防。因此，目前的治疗目标是进行早期诊断，通过从早期开始进行积极治疗，尽可能迅速而且最大限度地抑制风湿病性炎症，防止非可逆的变化的出现，或阻止其进展，谋求提高患者身体的、精神的、社会的生活质量(QOL)。
[0004]在关节风湿病治疗中使用的主要药物是非类固醇类抗炎症药(以下、记为“NSAIDs”)、疾病缓解性抗风湿病药物(diseasemodifying anti-rheumatic drugs：以下、往往记为“DMARDs”)和肾上腺皮质类固醇药。
[0005]NSAIDs是关节风湿病患者最初使用的药物，很快获得镇痛效果，在1～2周后表现出抗炎症作用。NSAIDs虽然有使炎症程度减轻的作用，但没有阻止风湿病性炎症进行的作用、防止关节破坏的作用。而NSAIDs的副作用往往伴随着其药理作用(环加氧酶-1抑制活性)，消化道损伤害等屡屡妨碍治疗。
[0006]DMARDs是通过改正关节风湿病的免疫异常，以使风湿病性炎症缓解，直至消失为目的的药物的总称。DMARDs一般具有迟效性，如果出现效果，可长期维持效果。DMARDs没有镇痛效果，给予开始时与速效性的NSAIDs和肾上腺皮质类固醇药并用。另一方面作为问题点，已知偶尔出现骨髓抑制、肾炎、间质性肺炎等严重的副作用和最适用量存在个体差异。而以往由于持续给予DMARDs，常常表现出抗性(逃逸现象)、其效果在2～3年内减弱，直至给予中止的例子也不少。
[0007]肾上腺皮质类固醇药虽然迅速且确实地抑制风湿病性炎症，虽然时间短，但可显着改善关节风湿病患者的QOL，然而长期连用会导致效果减弱、停药困难(反弹现象、停药综合征)、不能阻止关节破坏的进行、以及诱发感染症、肾上腺功能不全、消化道损伤、骨质疏松等严重副作用的出现等，弊处也很多。
[0008]已知自体免疫疾病、特别是关节风湿病的病状形成与各种各样的细胞都有关。作为代表性的细胞，如T淋巴细胞、巨噬细胞细胞、破骨细胞(与关节的破坏有关)、成纤维细胞(与关节强直有关)等。(G.S.Firestein et al.，”RHEUMATOID ARTHRITIS”；OXFORD UNIVERSITY PRESS，2000)。
对于难治性关节风湿病，也研究了DMARDs的并用疗法(例如、来福米特与甲氨蝶呤的并用疗法)，但对此疗法也出现了难治或药剂抗性的关节风湿病患者。另外一直在研究将多数非类固醇类抗炎症药、DMARDs和肾上腺皮质类固醇药随患者的状态一起变更的治疗方法，例如、尝试了Pyramid方式和Sawtooth方式、Step-down bridge方式。
1.Pyramid方式是最初使用非类固醇抗炎症药，在没有效果时，追加DMARDs或肾上腺皮质类固醇药的方式。
2.Sawtooth方式
最初开始使用DMARDs，在没有效果(逃逸现象)时，向下面的DMARDs变更的方式。也可平行实施DMARDs的多剂并用。
3.Step-down bridge方式
最初开始将肾上腺皮质类固醇药、DMARDs多剂并用，在可抑制炎症的阶段，由强力的DMARDs开始慢慢中止下去的方式。
然而，即使使用这些方式，对于自体免疫疾病、特别是关节风湿病，没有充分效果的预防剂和/或治疗剂，期盼更优良的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂。
钙/钙调蛋白依赖性磷酸化酶II(CaM激酶II：在本说明书中简写为“CaMK II”)作为在鼠脑中活化色氨酸羟化酶(神经递质之一的5-羟色胺生生物合成的限速酶)的新型的钙调蛋白依赖性磷酸化酶是在1980年被发现的酶。已知该酶可被因细胞外刺激使得细胞内增加的Ca2+和钙调蛋白的复合物活化。随着最近研究的进展，逐渐阐明该酶在记忆等高级神经功能的调控和各种细胞功能的调节中起着重要的作用。该酶具有1)大量存在于脑中，2)存在可溶型和颗粒结合型、3)底物特异性宽、4)存在器官特异性同工型、5)可通过自磷酸化控制活性等显着的特征。特别是该酶在脑神经系显示出参与神经递质的生物合成、神经递质的释放、被认为记忆的基本原理的长期增强作用、记忆、特别是空间记忆。到现在为止，作为CaMK II的同工型(亚型)已知CaMK II α、β、β’、γ和δ，还知道γ又分为γA、γB和γC型。其中CaMK IIα、β和β’的同工型分布于脑。
然而，尚且未知通过对CaMK II的表达或活性进行调节，可以达到预防和/或治疗自体免疫疾病的的报告。对于以预防和/或治疗自体免疫疾病的目的并用CaMK II抑制剂和DMARDs就完全不知道。
作为具体的CaMK II抑制剂的例子，已知有以下列举的。
·KN-93 N-(2-[N-[4-氯肉桂基]-N-甲基氨基甲基]苯基)-N-(2-羟乙基)-4-甲氧苯磺酰胺(特开平6-293730、非专利文献1)
Figure A20058003740300201
·1-[1-氧-11-(5，6-二氢-3-亚氨基苯并[h]シノリン-2(3H)-基)十一烷基]-4-(2-嘧啶基)-哌嗪(非专利文献2)
Figure A20058003740300202
·具有序列
Lys-Lys-X-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr(式中、X为Ala或Lys。)所示的氨基酸序列的肽(专利文献1)
·具有序列
Lys-Lys-Ala-Leu-His-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Cys-Leu(KKALHRQEAVDCL)所示的氨基酸序列的肽(专利文献2、特表2001-509808；表现出抗心律失常用途)
然而，有关这些具体的CaMK II抑制剂对自体免疫疾病的作用还不清楚。
另外有关下式1a表示的3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑(以下、也称为“化合物(I)”)，报道了对于作为代表性的关节风湿病模型动物的佐剂关节炎大鼠和胶原关节炎小鼠具有抗关节炎作用(参照例如专利文献3和非专利文献3～5)。
式1a：
Figure A20058003740300211
另外有关下式2表示的4-[1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-2-(甲氨基)噻唑(以下也称为“化合物(II)”)，报道了在佐剂关节炎大鼠中的抗关节炎作用、和在小鼠III型变应性反应试验中的抑制浮肿作用(参照例如专利文献4)。
式2：
Figure A20058003740300212
然而，化合物(I)、化合物(II)对CaMK II的作用到目前为止还完全不清楚。另外，这些化合物与DMARDs的并用效果到目前为止也完全不清楚。
[0020]专利文献1：特开平11-152298号公报
专利文献2：国际公开第98/33491号小册子
专利文献3：专利第3237608号说明书
专利文献4：特公平4-80035号公报
非专利文献1：Biochem Biophys Res Commun 1991；181(3)：p.968-75
非专利文献2：J.Med.Chem.，2002，45，p.563-566
非专利文献3：田头秋三、“炎症·再生”、Vol.21、No.4、p.472(2001)
非专利文献4：F.Nishikaku、“Annals of the RheumaticDiseases”、vol.60 supplement 1，p.159(2001)
非专利文献5：F.Nishikaku、“Annals or the RheumaticDiseases”，vol.61 supplement 1，p.194(2002)
发明的内容
发明要解决的课题
[0021]本发明的目的在于提供用于预防和/或治疗自体免疫疾病的良好的并用药。另外，本发明另一目的是提供用于探索并取得成为该并用药的有效成分的候选物质的有用的筛选方法。
用于解决课题的手段
[0022]本发明人等为了解决上述课题，进行了锐意研究，结果得到了以下I和II的令人惊讶的发现。
1.CaMK II抑制剂可用作自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂
(1)化合物(I)、化合物(II)和它们的衍生物表现出抑制CaMKII的作用。(实施例1、2)
(2)CaMK II抑制剂对于参与自体免疫疾病、特别是关节风湿病的病状形成的各种细胞(T淋巴细胞、巨噬细胞细胞、破骨细胞、成纤维细胞、滑膜细胞等)，化合物(I)、KN-93等有抑制作用。(实施例3～7)
(3)作为CaMK II抑制剂众所周知的KN-93等在自体免疫疾病的动物模型实验中表现出有用性。(实施例10)
(4)在自体免疫疾病的动物模型实验中，在罹患部产生CaMK II的细胞的比率亢进，即CaMK II与自体免疫疾病的病状形成有关。(实施例12)
(5)对于由CaMK II引起的磷酸化而变动的各种因子，化合物(I)和KN-93具有以下(a)-(c)的作用。
(a)化合物(I)和KN-93抑制IκBα分解。(实施例13)
(b)化合物(I)和KN-93抑制由bFGF导致的细胞周期蛋白D1的表达增强。
(实施例14)
(c)化合物(I)和KN-93抑制Akt的磷酸化。(实施例14)
(6)在单核类细胞中，通过炎性刺激诱导CaMK II的表达，即CaMKII与自体免疫疾病的病状形成有关。(实施例15)
(7)由于对CaMK II序列特异的siRNA的作用，滑膜细胞的细胞增殖被抑制(实施例16)。即通过抑制CaMK IIγ的表达、或抑制活性，可抑制滑膜细胞的异常增殖，由此可达到改善患关节风湿病等疾病的关节的病状(慢性炎症的抑制、关节破坏的抑制、关节变形发展的抑制等)。
(8)在关节风湿病的动物模型实验中，化合物(I)表现出良好的抑制关节破坏效果。(实施例20和21)
与CaMK II相关而变动的因子已知有IκBα、细胞质磷脂酶A2(cPLA2)、细胞周期因子细胞周期蛋白D1、细胞表面受体CD44、EGF受体、Stat1等很多蛋白质(J.Biol.Chem.276，36008-36013；J.Biol.Chem，276，39653-39660；Exp.Cell Res.240，218-227；Biochem.J.357，843-850；J.Biol.Chem.274，16168-16173；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5971-5976)。
本发明人等着重对其中的IκBα和细胞周期蛋白D1进行了锐意研究，结果获得了上述(5)的见解。根据这些见解认为化合物(I)等CaMK II抑制剂抑制IκBα的分解，抑制T淋巴细胞的活化。而通过使用化合物(I)等CaMK II抑制剂，由于在成纤维细胞中CaMK II被抑制，所以Akt的磷酸化被抑制，认为借助于这种抑制方式，下游的细胞周期蛋白D1的表达被抑制，使得细胞周期停止，即细胞增殖被抑制。
[0024]本发明人等根据上述见解在发现这些化合物(化合物(I)、KN-93等)通过抑制CaMK II作用，发挥自体免疫疾病的病状改善效果的同时，确信抑制CaMK II的表达或活性的物质可作为自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂有效利用。
[0025]II.通过并用CaMK II抑制剂和DMARDs，在预防和/或治疗自体免疫疾病中可以获得优良的并用效果
本发明人等发现在将CaMK II抑制剂化合物(I)与各种疾病缓解性抗风湿病药物(DMARDs)并用时，对自体免疫疾病具有由各自单独治疗效果不能预测的显着优良的预防效果和/或治疗效果，即，CaMKII抑制剂与DMARDs并用在预防和/或治疗自体免疫疾病中表现出显着的有用性(实施例17～23)。特别是发现了对于以往已知的凭借抗风湿病药单独疗法难以得到抑制关节破坏的充分效果，CaMK II抑制剂与DMARDs的并用疗法表现出良好的抑制关节破坏的效果(实施例20)。
如果利用本发明可以达到仅利用CaMK II抑制剂或DMARDs任一方治疗不能达到的良好的自体免疫疾病预防和/或治疗效果。另外仅利用CaMK II抑制剂或DMARDs任一一方的治疗中存在副作用的问题，以通过将各自的给予量减少，进行并用以减少副作用的方式也可以达到良好的自体免疫疾病预防和/或治疗效果。
本发明是基于以上I和II的见解完成的。
即，本发明的内容如下。
[1]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，含有CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物。
[2]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，含有用于与疾病缓解性抗风湿病药物并用的CaMK II抑制剂。
[3][2]所述的预防剂和/或治疗剂，在给予疾病缓解性抗风湿病药物的同时，分开或连续给予。
[4]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，含有CaMK II抑制剂，所述CaMK II抑制剂用于对于由于副作用的缘故，罹患不能给予获得充分的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的量的疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病的哺乳动物，在给予疾病缓解性抗风湿病药物的同时，分开、或连续给予。
[5][4]所述的预防剂和/或治疗剂，其中副作用是肝损伤、肾损伤和胃肠损伤中的一种或多种。
[6][1]～[5]中任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式1：
Figure A20058003740300251
[式中、D代表氢原子、卤素原子、羟基、巯基、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨甲酰基、可被取代的氨磺酰基、磺基、-R5、-OR5、-CO2R6、-SR7、-(CO)SR7、-(CS)OR7或-CS2R7(式中、R5代表可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的环链烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基。R6代表可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基。R7代表可被取代的烷基或可被取代的芳基。)。
A和B中的一方代表下式表示的基团。
Figure A20058003740300252
(E代表单键或亚烷基。
2条虚线，其中一条与实线一起表示双键，则另一条与实线一起表示单键。R1与氮原子结合，该氮原子与虚线和实线一起表示的单键结合。
R1、R2、R3和R4各自独立地代表氢原子、卤素原子、羟基、巯基、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨基甲酰基、可被取代的氨磺酰基、磺基、NH基的保护基、-R5、-OR5、-CO2R6、-SR7、-(CO)SR7、-(CS)OR7或-CS2R7(式中、R5、R6和R7与上述同义。)。另外也可以R1、R2、R3和R4其中的任意两个结合在一起，与氮原子共同形成可被取代的杂环。此外，式：-NR3R4可以代表由式：-N＝C(NH2)NR43R44表示的基团。
R43和R44如以下的(1)或(2)所示。
(1)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n表示1～3的整数。)、-(CH2)n-CO2R32(n与上述同义。R32代表碳原子数1～3的烷基。)、-(CH2)n-CONR33R34(n与上述同义。R33和R34独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基。)、-(CH2)m-OR35(m代表2或3。R35代表氢原子、碳原子数1～3的烷基或-(CH2)m-OR36(m与上述同义。R36代表氢原子或碳原子数1～3的烷基。)。)、-(CH2)m-NR37R38(m与上述同义。R37和R38独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基，或R37和R38一起与氮原子共同表示吡咯烷、哌啶、氮杂环庚三烯(azepane)、吗啉或N-甲基哌嗪(其中吡咯烷、哌啶、氮杂环庚三烯、吗啉和N-甲基哌嗪可被1或2个甲基取代。)。)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40各自代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、苯基或吡啶基。)。
(2)与氮原子一起表示由5～7元饱和含氮杂环基(5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基任意选出的1或2个取代基取代。)表示的基团。)
A和B中另一方代表由式：-J-G表示的基团。
(式中、G代表可被取代的芳基、或可被取代的杂环基。J代表-C(R8R9)-或-C(＝CR8R9)-。R8和R9各自代表氢原子、可被取代的低级烷氧基、或可被取代的低级烷基。另外也可以R8和R9结合在一起，与碳原子共同形成可被取代的烃环、可被取代的1，3-二烷环或可被取代的1，3-二氧戊环。)]。
[7][6]所述的预防剂和/或治疗剂，其中E是单键或低级亚烷基。
[8][6]或[7]任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中D为氢原子、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨甲酰基、-R5或-CO2R6(式中、R5和R6与[6]中的意义同义。)。
[9][8]所述的预防剂和/或治疗剂，其中D是氢原子、羧基、-R5或-CO2R6(式中、R5和R6与[6]中的意义同义)。
[10][6]～[9]任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中R1、R2、R3和R4各自代表氢原子、羟基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的烷氧基、可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的环链烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基，或代表由式：-N＝C(NH2)NR43R44(R43和R44与[6]中的意义同义。)表示的式：-NR3R4基团，或R1、R2、R3和R4中任意两个结合与氮原子一起形成可被取代的杂环。
[11][10]所述的预防剂和/或治疗剂，其中R1、R2、R3和R4各自代表氢原子、羟基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的烷氧基、可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基，或代表由式：-N＝C(NH2)NR43R44(R43和R44与[6]中的意义同义。)表示式：-NR3R4基团、或R1、R2、R3和R4自的任意两个结合与氮原子一起形成可被取代的杂环。
[12][6]～[11]任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中G是可被取代的苯基、可被取代的萘基、可被取代的呋喃基、可被取代的噻吩基、可被取代的吲哚基、可被取代的异噻唑基、可被取代的苯并噻吩基、可被取代的异苯并呋喃基、可被取代的吡咯基、可被取代的苯并呋喃基、可被取代的咪唑基、可被取代的吡唑基、可被取代的异唑基、可被取代的异噻唑基、可被取代的噻唑基、可被取代的唑基、可被取代的苯并咪唑基、可被取代的苯并噻唑基、可被取代的苯并唑基、可被取代的吡啶基、可被取代的吡嗪基、可被取代的嘧啶基、可被取代的哒嗪基、可被取代的三嗪基、可被取代的喹啉基、可被取代的异喹啉基、可被取代的喹唑啉基、可被取代的喹啉基、可被取代的2，3-二氢-苯并[1，4]二二烯基或可被取代的咔唑基。
[13][6]所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式A1或式A2表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式A1：
Figure A20058003740300281
[式中、G1代表苯基、联苯基-4-基、3-苯甲酰苯基、4-苯甲酰苯基、1H-吲哚-2-基、1H-吲哚-3-基、1-甲基-1H-吲哚-2-基、1-甲基-1H-吲哚-3-基、2，3-二氢-苯并[1，4]二二烯-6-基、1-苯并呋喃-5-基、1-苯并呋喃-6-基、喹啉基、异喹啉基、苯基吡啶基、苯基嘧啶基、苯基哒嗪基或苯基吡嗪基(其中苯基、联苯基-4-基、3-苯甲酰苯基、4-苯甲酰苯基、1H-吲哚-2-基、1H-吲哚-3-基、1-甲基-1H-吲哚-2-基、1-甲基-1H-吲哚-3-基、2，3-二氢-苯并[1，4]二二烯-6-基、1-苯并呋喃-5-基、1-苯并呋喃-6-基、喹啉基、异喹啉基、苯基吡啶基、苯基嘧啶基、苯基哒嗪基和苯基吡嗪基可被从氟原子、氯原子、溴原子、乙酰基、氰基、-CO2R29(R29代表碳原子数1～3的烷基。)和-CONR30R31(R30和R31独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基。)中任意选出的1或2个基团取代。)。
R23和R24独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、甲氧基或乙氧基、或都代表亚甲基。
式：＝C(NR25R26)NR27R28如以下(1)、(2)或(3)所述。
(1)R25和R26如以下(a)或(b)所述、R27和R28如以下(c)或(d)所述。
(a)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与[6]中意义同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与[6]中的意义同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与权利要求6中的意义同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与[6]中的意义同义。)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与[6]中的意义同义。)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与[6]中的意义同义。)。
(b)与氮原子一起代表5～7元饱和含氮杂环基(5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代。)。
(c)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义。)、-(CH2)n-COR32(n和R32与上述同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义。)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义。)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义。)。
(d)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(此处，5～7元饱和含氮杂环基可被由烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代。)。
(2)R26和R27一起与2个氮原子、碳原子表示5～7元饱和含氮杂环基(此处，5～7元饱和含氮杂环基可被由烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代)。
R25和R28各自代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、乙酰基或-(CH2)m-OR36(m与上述同义。R36与[6]中的意义同义。)。
(3)式：＝C(NR25R26)NR27R28表示式：＝C(NR41R42)N＝C(NH2)NR43R44。
R41和R42如以下(a1)或(b1)所述，R43和R44如以下(c1)或(d1)所述。
(a1)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义。)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义。)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义。)。
(b1)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代。)。
(c1)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义。)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义。)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义。)。
(d1)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代。)。]
式A2：
Figure A20058003740300301
[式中、G1、R23和R24与上述同义。
式：-N(R45)C(NR46R47)＝NR48如以下(11)或(21)所述：
(11)R45代表碳原子数1～3的烷基或酰基。R48代表氢原子、碳原子数1～3的烷基或酰基。
R46和R47如以下的(a2)或(b2)所述：
(a2)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义。)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义。)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义。)。
(b2)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代。)。
(21)R45和R46与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(其中5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代。)。
R47和R48独立地代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、乙酰基或-(CH2)m-OR36(m与上述同义。R36与上述意义同义。)]。
[14][6]所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式A3表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式A3：
[式中、G2代表2-氟-联苯基-4-基、2’-氟-联苯基-4-基或3-苯甲酰苯基。R49代表甲基。R50代表氢原子、甲基、甲氧基或乙氧基。
式：＝C(NR51R52)NR53R54如(12)、(22)或(32)所述。
(12)R51和R52如以下的(a3)、(b3)或(c3)所述、R53和R54如以下的(d3)、(e3)或(f3)所述。
(a3)独立地代表氢原子或碳原子数1～4的烷基。
(b3)一方表示氢原子，另一方表示-(CH2)n-COCH3(n与[6]中的意义同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与[6]中的意义同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与[6]中的意义同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与[6]中的意义同义。)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与[6]中的意义同义。)。
(c3)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶和4位被可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代。)。
(d3)独立地表示氢原子或碳原子数1～4的烷基。
(e3)一方表示氢原子，另一方表示-(CH2)n-COCH3(n与前述的意义同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与前述的意义同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与前述的意义同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与前述的意义同义。)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与前述的意义同义。)。
(f3)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶和4位被可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代。)。
(22)式：＝C(NR51R52)NR53R54代表由下式表示的基团：
Figure A20058003740300331
(式中、R55代表碳原子数1～3的烷基、乙酰基或-(CH2)m-OR56(m与上述同义。R56代表氢原子或碳原子数1～3的烷基。)。
(32)式：＝C(NR51R52)NR53R54代表式：＝C(NR57R58)N＝C(NH2)NR59R60。
R57和R58如以下的(a4)、(b4)或(c4)所述，R59和R60如以下的(d4)、(e4)或(f4)所述。
(a4)独立地表示氢原子或碳原子数1～4的烷基。
(b4)一方表示氢原子，另一方表示-(CH2)n-COCH3(n与前述的意义同义。)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与前述的意义同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与前述的意义同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与前述的意义同义。)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与前述的意义同义。)。
(c4)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位被可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、和4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代。)。
(d4)独立地代表氢原子或碳原子数1～4的烷基。
(e4)一方代表氢原子，另一方代表-(CH2)n-COCH3(n与前述的意义同义。)、-(CH2)n-COR32(n和R32与前述的意义同义。)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与前述的意义同义。)、-(CH2)m-OR35(m和R35与前述的意义同义。)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与前述的意义同义。)。
(f4)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、和4位被可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代。)。]。
[15][6]所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式A4代表的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式A4：
[式中、G2、R49和R50与14中的意义同义。
式：＝C(NR61R62)NR63R64如以下的(13)、(23)或(33)所述。
(13)R63和R64都代表氢原子。
R61和R62如以下的(a5)、(b5)或(c5)所述。
(a5)独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基。
(b5)一方代表氢原子，另一方代表-(CH2)n-CO2R32(n和R32与权利要求6中的意义同义。)、-(CH2)m-OR65(m代表2或3。R65代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、2-羟乙基或3-羟丙基。)或-(CH2)m-NR66R67(m与上述同义。R66和R67独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基、或R66和R67与氮原子一起代表吡咯烷、哌啶、吗啉或N-甲基哌嗪(其中吡咯烷、哌啶、吗啉和N-甲基哌嗪可被1或2个甲基取代。))。
(c5)与氮原子一起代表吡咯烷、哌啶、吗啉或N-甲基哌嗪(其中吡咯烷、哌啶、吗啉和N-甲基哌嗪可被1或2个甲基取代。)。
(23)式：＝C(NR61R62)NR63R64表示由下式表示的基团：
Figure A20058003740300351
(R68代表碳原子数1～3的烷基、2-羟乙基或3-羟丙基。)。
(33)R61和R62与氮原子一起代表吗啉，R63和R64一起表示氨基-吗啉-4-基-亚甲基。]。
[16][15]所述的预防剂和/或治疗剂，其中G2为2-氟-联苯基-4-基或2’-氟-联苯基-4-基、R50是氢原子或甲基、R63和R64都是氢原子、R61和R62如以下的(a6)或(b6)所述。
(a6)独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基；
(b6)与氮原子一起代表吗啉(吗啉可被1或2个甲基取代。)。
[17][1]～[5]任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
[18][1]～[17]任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中疾病缓解性抗风湿病药物是从下述选出的1个或多个药剂：
来氟米特、甲氨蝶呤、D-青霉胺、布西拉明、柳氮磺吡啶、阿克他利、氯苯扎利、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、咪唑立宾、硫唑嘌呤、金诺芬、金硫丁二钠、aurotiosulfate、金硫葡糖、环孢菌素、硫酸羟氯喹、氯喹、他克莫司、伊那西普、英夫利昔单抗、阿那白滞素、凯利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和人源化抗IL-6R抗体。
[19][18]所述的预防剂和/或治疗剂，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
[20][1]～[19]任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中自体免疫疾病是选自下面的任一种疾病：
关节风湿病、全身性红斑狼疮、圆板状红斑狼疮、多发性肌肉炎、强皮症、混合结缔组织病、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒症、恶性贫血、Good-pasture综合征、急性进行性肾小体肾炎、重症肌无力症、寻常性天疱疮、水疱性类天疱疮、胰岛素抗性糖尿病、青年性糖尿病、I型糖尿病、艾迪生病、萎缩性胃炎、男性不育症、早发性更年期、晶状体原性眼色素膜炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、自体免疫性血液性疾病、自体免疫性溶血性贫血、突发性血小板减少症、发作性血色素尿症、突发性血小板减少性紫瘢病、间质性肺腺维症和肖格伦综合征。
[21][20]所述的预防剂和/或治疗剂，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
[22]作为有效成分含有CaMK II抑制剂的增强剂，它能增强疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果。
[23][22]所述的增强剂，其中CaMK II抑制剂是通过包括下述
(a)、(b)和(c)的筛选方法选择的物质：
(a)使待测物质与CaMK II酶和底物接触的步骤、
(b)测定通过接触了待测物质的CaMK II酶所引起的底物的磷酸化水平，将该磷酸化水平与不接触待测物质的对照酶的上述磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活性的待测物质的步骤。
[24][23]所述的增强剂，其中CaMK II抑制剂是于10μM浓度下对CaMK II的抑制率在30％以上的物质。
[25][22]所述的增强剂，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
[26][22]～[25]任一项所述的增强剂，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
[27][22]～[26]任一项所述的增强剂，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
[28]用于与第2药物组合物共用在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的总和，其中该第2药物组合物是含有疾病缓解性抗风湿病药物的组合物、该第1药物组合物是含有CaMK II抑制剂的组合物。
[29]用于与第2药物组合物共用在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果，其中该第2药物组合物是含有疾病缓解性抗风湿病药物的组合物、该第1药物组合物是含有CaMK II抑制剂的组合物。
[30][28]或[29]任一项所述的组合物，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
[31][28]～[30]任一项所述的组合物，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
[32][28]～[31]任一项所述的组合物，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
[33]包含以下(1)和(2)的商业包装：
(1)含有CaMK II抑制剂的药物组合物；
(2)有关记载该药物组合物的记载物，它记载该药物组合物与疾病缓解性抗风湿病药物并用，可以在自体免疫疾病预防和/或治疗用途中使用或者应该使用。
[34]包含以下的(1)和(2)的商业包装：
(1)含有CaMK II抑制剂的药物组合物；
(2)有关记载该药物组合物的记载物，它记载该药物组合物可以在增强疾病缓解性抗风湿病药物所致的自体免疫疾病预防和/或治疗效果用途中使用或者应该使用。
[35][33]或[34]所述的商业包装，其中CaMK II抑制剂是3[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
[36][33]～[35]任一项所述的商业包装，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
[37][33]～[36]任一项所述的商业包装，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
[38]自体免疫疾病预防和/或治疗用的试剂盒，包装内含有包含CaMK II抑制剂的第1组合物、和包含疾病缓解性抗风湿病药物的第2组合物。
[39]CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物在制造用于自体免疫疾病预防和/或治疗用的药物组合物中的使用。
[40]CaMK II抑制剂在制造用于自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂中的使用，其特征是与疾病缓解性抗风湿病药物并用。
[41]CaMK II抑制剂在制造用于增强疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病的预防和/或治疗效果的增强用药物组合物中的使用。
[42]预防和/或治疗自体免疫疾病的方法，其特征是将CaMK II抑制剂与疾病缓解性抗风湿病药物并用给予。
[43]疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的增强方法，其中包括给予CaMK II抑制剂。
[44]自体免疫疾病的预防和/或治疗方法，包括对罹患通过使用疾病缓解性抗风湿病药物不能获得充分预防和/或治疗效果的自体免疫疾病的哺乳动物，给予对增强疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果有效量的CaMK II抑制剂。
另外，作为本发明的方式还有如下列举的方式。
[45]包括以下步骤(a)、(b)和(c)的疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果增强剂的筛选方法：
(a)使待测物质与CaMK II酶和底物接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触的CaMK II酶引起的底物磷酸化水平，将该磷酸化水平与没有接触待测物质的对照酶的上述磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活性的待测物质的步骤。
[46]与疾病缓解性抗风湿病药物并用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的筛选方法，其特征是包括如下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使待测物质与CaMK II酶和底物接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触的CaMK II酶引起的底物磷酸化水平，将该磷酸化水平与没有接触待测物质的对照酶的上述磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活性的待测物质的步骤。
另外，作为本发明的方式还有如下列举的方式。
[47]含有用于与CaMK II抑制剂并用的疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂。
[48]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，含有疾病缓解性抗风湿病药物，所述疾病缓解性抗风湿病药物用于对由于副作用的缘故，不能给予获得充分自体免疫疾病预防和/或治疗效果的CaMK II抑制剂的量的罹患自体免疫疾病的哺乳动物，在给予CaMK II抑制剂的同时，分开给予、或连续给予。
[49][48]项所述的预防剂和/或治疗剂，其中副作用是肝损伤、肾损伤和胃肠损伤中的一种或多种。
[50]CaMK II抑制剂所致的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的增强剂，其中含有疾病缓解性抗风湿病药物作为有效成分。
[51]用于与第2药物组合物共用在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的总和，该第2药物组合物含有CaMK II抑制剂、该第1药物组合物含有疾病缓解性抗风湿病药物的组合物。
[52]用于与第2药物组合物共用在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果，其中该第2药物组合物含有CaMK II抑制剂、该第1药物组合物含有疾病缓解性抗风湿病药物的组合物。
[53]含有CaMK II抑制剂的药物组合物和有关记载该药物组合物的记载物的商业包装，该记载物记载该药物组合物与与CaMK II抑制剂并用，可以在自体免疫疾病预防和/或治疗用途中使用或应该使用。
[54]包含含有疾病缓解性抗风湿病药物的药物组合物和记载该药物组合物的商业包装，该记载物记载该药物组合物可以在CaMK II抑制剂的自体免疫疾病预防和/或治疗效果增强的用途中使用或应该使用。
[55]疾病缓解性抗风湿病药物在制造用于自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂中的使用，其特征是与CaMK II抑制剂并用。
[56]疾病缓解性抗风湿病药物在制造用于CaMK II抑制剂的预防和/或治疗自体免疫疾病的效果增强用药物组合物中的使用。
[57]CaMK II抑制剂的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的增强方法，包括给予疾病缓解性抗风湿病药物。
[58]自体免疫疾病的预防和/或治疗方法，包括对使用CaMK II抑制剂不能获得充分预防和/或治疗效果的罹患自体免疫疾病的哺乳动物，给予增强对CaMK II抑制剂的自体免疫疾病预防和/或治疗的效果的有效量的疾病缓解性抗风湿病药物。
[59][22]～[58]任一项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中CaMK II抑制剂是[6]所述的式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐。
[60][22]～[59]任一项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
[61][60]项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐的给予量换算为3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑的游离体(free体)，为每日约40～约240mg/人。
[62][60]项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容的盐的给予量换算为3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑的游离体，为每日约140～约240mg/人。
[63][22]～[62]任一项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中疾病缓解性抗风湿病药物是从下面选出的1个或多个药剂：
来氟米特、甲氨蝶呤、D-青霉胺、布西拉明、柳氮磺吡啶、阿克他利、氯苯扎利、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、咪唑立宾、硫唑嘌呤、金诺芬、金硫丁二钠、aurotiosulfate、金硫葡糖、环孢菌素、硫酸羟氯喹、氯喹、他克莫司、伊那西普、英夫利昔单抗、阿那白滞素、凯利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和人源化抗IL-6R抗体。
[64][63]所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中疾病缓解性抗风湿病药物为甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
[65][64]所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、药物组合物、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中甲氨蝶呤的给予量为1周约5～约30mg/人。
[66][64]所述的预防剂和/或治疗剂1增强剂、药物组合物、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中柳氮磺吡啶的给予量为1日约0.5～约4g/人。
[67][64]所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、药物组合物、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中来氟米特的给予量为1日约5～约30mg/人。
[68][22]～[67]任一项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中自体免疫疾病为从下面选择的任一种疾病：
关节风湿病、全身性红斑狼疮、圆板状红斑狼疮、多发性肌肉炎、强皮症、混合结缔组织病、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒症、恶性贫血、Good-pasture综合征、急性进行性肾小体肾炎、重症肌无力症、寻常性天疱疮、水疱性类天庖疮、胰岛素抗性糖尿病、青年性糖尿病、I型糖尿病、艾迪生病、萎缩性胃炎、男性不育症、早发性更年期、晶状体原性眼色素膜炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、僚发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、自体免疫性血液性疾病、自体免疫性溶血性贫血、突发性血小板减少症、发作性血色素尿症、突发性血小板减少性紫瘢病、间质性肺腺维症和肖格伦综合征。
[69][68]项所述的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
另外，作为本发明的方式，列举以下。
[70]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，由CaMK II抑制剂与疾病缓解性抗风湿病药物组合而成。
[71]药物，CaMK II抑制剂与疾病缓解性抗风湿病药物组合而成。
如上所述，本发明的CaMK II抑制剂由于通过与疾病缓解性抗风湿病药物(DMARDs)的并用疗法表现出良好的抑制关节破坏效果(特别是抑制罹患自体免疫疾病的哺乳动物的关节破坏效果)，所以作为本发明的方式还有如下列举的方式。
[72]关节破坏抑制剂，含有CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物。
[73]关节破坏抑制剂，含有用于与疾病缓解性抗风湿病药物并用的CaMK II抑制剂。
[74][73]项所述的关节破坏抑制剂，其特征是在给予疾病缓解性抗风湿病药物的同时，可以分别给予，或持续给予。
[75]疾病缓解性抗风湿病药物的关节破坏效果的增强剂，其特征是含有CaMK II抑制剂作为有效成分。
[76]用于抑制关节破坏的试剂盒，其中含有：包含CaMK II抑制剂的第1组合物、和含有疾病缓解性抗风湿病药物的第2组合物。
[77]CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物在制造用于抑制关节破坏用药物组合物中的使用。
[78]CaMK II抑制剂在制造用于其特征是与疾病缓解性抗风湿病药物并用关节破坏抑制剂中的使用。
[79]CaMK II抑制剂在制造其特征是用于疾病缓解性抗风湿病药物的抑制关节破坏效果的增强用药物组合物中的使用。
[80]抑制关节破坏方法，其特征是将CaMK II抑制剂与疾病缓解性抗风湿病药物并用给予。
[81]增强疾病缓解性抗风湿病药物的抑制关节破坏效果的增强方法，包括给予CaMK II抑制剂。
[82]抑制关节破坏方法，其中包括对于罹患使用疾病缓解性抗风湿病药物不能达到充分的预防和/或治疗效果的自体免疫疾病的哺乳动物，给予有效量的增强疾病缓解性抗风湿病药物的抑制关节破坏效果的CaMK II抑制剂。
另外，在上述[1]～[71]项中，将“自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂”改写为“关节破坏的抑制剂”、“自体免疫疾病预防和/或治疗效果”改写为“抑制关节破坏效果”、“自体免疫疾病预防和/或治疗用途”改写为“抑制关节破坏用途”、“自体免疫疾病预防和/或治疗用”改写为“抑制关节破坏用”、“自体免疫疾病预防和/或治疗方法”改写为“抑制关节破坏的方法”的形态也都包括在本发明的方式中。
另外就像上述所述和实施例1-16给出的那样，本发明的CaMK II抑制剂也可用作自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，单独给予。因此作为本发明的形态，也如以下所列举的形态。
[B1]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂的筛选方法，包括以下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使待测物质与CaMK II酶和底物接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触的CaMK II酶引起的底物磷酸化水平，将该磷酸化水平与没有接触待测物质的对照酶的上述磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活性的待测物质的步骤。
[B2][B1]所述的筛选方法，其中自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂是免疫的异常亢进改善剂。
[B3][B1]所述的筛选方法，其中自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂是关节风湿病患者的慢性炎症的抑制剂、关节破坏的抑制剂、关节变形的进行抑制剂、或身体功能的改善剂。
[B4][B1]～[B3]中任一项所述的筛选方法，其中包括选择10μM浓度下，CaMK II的抑制率在30％以上的物质的步骤。
[B5][B1]～[B3]中任一项所述的筛选方法，其中包括选择10μM浓度下，CaMK II的抑制率在60％以上的物质的步骤
[B6]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中作为有效成分含有使用[B1]～[B5]任一项所述的筛选方法选择的物质。
[B7]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中作为有效成分含有具有抑制CaMK II作用的物质。
[B8][B7]所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中具有抑制CaMK II作用的物质是在10μM浓度下，CaMK II的抑制率在30％以上的物质。
[B9][B7]所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中具有抑制CaMK II作用的物质是在10μM浓度下，CaMK II的抑制率在60％以上的物质。
[B10][B6]～[B9]任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中该预防剂和/或治疗剂是关节风湿病的预防剂和/或治疗剂。
[B11][B6]～[B9]任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其特征是用于关节风湿病患者的慢性炎症的抑制、关节破坏的抑制、关节变形的进行抑制、或身体功能的改善。
[B12]以[6]所述的式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐为有效成分的CaMK II抑制剂。
[B13][B12]所述的CaMK II抑制剂，其中E为单键或低级烯基。
[B14][B12]或[B13]任一项所述的CaMK II抑制剂，其中D为氢原子、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨甲酰基、-R5或-CO2R6(式中，R5和R6与[B12]中的意义同义。)。
[B15][B14]所述的CaMK II抑制剂，其中D为氢原子、羧基、-R5或-CO2R6(式中，R5和R6与[B12]中的意义同义。)。
[B16][B12]～[B15]任一项所述的CaMK II抑制剂，其中R1、R2、R3和R4各自独立地代表氢原子、羟基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的烷氧基、可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的环链烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基；或式：-NR3R4是用式：-N＝C(NH2)NR43R44(R43和R44与[B12]中的意义同义。)表示的基团；或R1、R2、R3和R4中的任意2个结合在一起，与氮原子共同形成可被取代的杂环。
[B17][B16]所述的CaMK II抑制剂，其中R1、R2、R3和R4各自独立地代表氢原子、羟基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的烷氧基、可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或代表酰基；或式：-NR3R4为用式：-N＝C(NH2)NR43R44(R43和R44与[B12]中的意义同义。)表示的基团；或R1、R2、R3和R4中的任意2个结合在一起，与氮原子共同形成可被取代的杂环。
[B18][B12]～[B17]任一项所述的CaMK II抑制剂，G为可被取代的苯基、可被取代的萘基、可被取代的呋喃基、可被取代的噻吩基、可被取代的吲哚基、可被取代的异噻唑基、可被取代的苯并噻吩基、可被取代的异苯并呋喃基、可被取代的吡咯基、可被取代的苯并呋喃基、可被取代的咪唑基、可被取代的吡唑基、可被取代的异唑基、可被取代的异噻唑基、可被取代的噻唑基、可被取代的唑基、可被取代的苯并咪唑基、可被取代的苯并噻唑、可被取代的苯并唑基、可被取代的吡啶基、可被取代的吡嗪基、可被取代的嘧啶基、可被取代的哒嗪基、可被取代的三嗪基、可被取代的喹啉基、可被取代的异喹啉基、可被取代的喹唑啉基、可被取代的喹啉基、可被取代的2，3-二氢-苯并[1，4]二二烯基或可被取代的咔唑基。
[B19][B12]所述的CaMK II抑制剂，其特征是以[13]所述的式A1或式A2表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐作为有效成分。
[B20][B12]所述的CaMK II抑制剂，其特征是以[14]项所述的式A3表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐作为有效成分。
[B21][B12]所述的CaMK II抑制剂，其特征是以[15]项所述的式A4表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐作为有效成分。
[B22][B21]所述的CaMK II抑制剂，其中G2为2-氟联苯基-4-基或2’-氟联苯基-4-基，R50为氢原子或甲基，R63和R64都是氢原子，R61和R62如以下的(a6)或(b6)所示：
(a6)独立表示氢原子或碳原子数1～3的烷基；
(b6)与氮原子一起表示吗啉(吗啉可用1或2个甲基取代。)。
[B23]CaMK II抑制剂，其特征是作为有效成分含有3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
[B24]CaMK II抑制剂，其特征是作为有效成分含有4-[1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-2-(甲氨基)噻唑或其药学上容许的盐。
[B25]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其特征是作为有效成分含有具有IκBα的分解抑制作用的物质。
[B26]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其特征是作为有效成分含有对细胞周期蛋白D1的表达增强具有抑制作用的物质。
[B27]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其特征是作为有效成分含有具有Akt的磷酸化抑制作用的物质。
[B28][B7]-[B11]任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中具有抑制CaMK II作用的物质是至少具有CaMK II基因碱基序列中连续15个碱基的聚核苷酸和/或与该聚核苷酸互补的聚核苷酸。
[B29][B7]-[B11]任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中具有抑制CaMK II作用的物质是对应于CaMK II基因的siRNA。
[B30][B29]所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中siRNA为用以下序列表示的siRNA：
有义链：5’-CGUGAGGCUCGGAUAUGUCdTdT-3’
反义链：5’-GACAUAUCCGAGCCUCACGdTdT-3’
[B31][B7]-[B11]中任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中具有抑制CaMK II作用的物质是抗CaMK II抗体。
[B32]哺乳动物的预防和/或治疗自体免疫疾病的方法，其特征是包括对该哺乳动物体内的CaMK II的表达或活性进行对自体免疫疾病的预防和/或治疗有效程度的抑制。
[B33]哺乳动物的预防和/或治疗自体免疫疾病的方法，其特征是包括给予该哺乳动物具有抑制CaMK II作用的物质，给予量对自体免疫疾病的预防和/或治疗有效。
[B34]具有抑制CaMK II作用的物质的使用，其特征是该物质用于自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂的制造。
另外，作为本发明的方式还有以下列举的方式。
[B35]包括以下步骤(a)、(b)和(c)的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂的筛选方法：
(a)使待测物质与CaMK II表达细胞接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触的CaMK II表达细胞内的CaMK II蛋白量，将该蛋白量与没有接触待测物质的对照细胞内的上述蛋白量进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II产生的待测物质的步骤。
[B36]包括以下步骤(a)、(b)和(c)的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂的筛选方法：
(a)使待测物质与CaMK II表达细胞接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触的CaMK II表达细胞内的CaMK II基因表达量，将该基因表达量与没有接触待测物质的对照细胞内的上述基因表达量进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II的基因表达的待测物质的步骤。
[B37]包括以下步骤(a)、(b)和(c)的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂的筛选方法：
(a)使待测物质与脱磷酸化CaMK II酶接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触的CaMK II酶的磷酸化水平，将该磷酸化水平与没有接触待测物质的对照酶该磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活化的待测物质的步骤。
作为本发明的理想方式，还有如下列举的方式。
[B38][B1]-[B5]任一项所述的筛选方法，其中CaMK II为CaMK II γ或CaMK II δ。
[B39][B1]-[B5]任一项所述的筛选方法，其中CaMK II是CaMK IIγ。
[B40][B6]-[B11]任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II为CaMK II γ或CaMK II δ。
[B41][B6]-[B11]任一项所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II为CaMK II γ。
[B42][B32]或[B33]所述的预防和/或治疗方法，其中CaMK II为CaMK II γ或CaMK II δ。
[B43][B32]或[B33]所述的预防和/或治疗方法，其中CaMK II为CaMK II γ。
[B44][B34]所述的使用，其中CaMK II为CaMK II γ或CaMK II δ。
[B45][B34]所述的使用，其中CaMK II为CaMK II γ。
另外，作为本发明的其它方式，还有如下列举的方式。
[B46]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其特征是作为有效成分含有用[B1]-[B5]或[B35]-[B39]任一项所述筛选方法选择的物质(但以下的(1)和(2)除外)：
(1)[B12]所述的式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐；
(2)4-[1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-2-(甲氨基)噻唑或其药学上容许的盐。
[B47]自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其特征是作为有效成分含有具有抑制CaMK II作用的物质(但以下的(1)和(2)除外)：
(1)[B12]所述的式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐；
(2)4-[1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-2-(甲氨基)噻唑或其药学上容许的盐。
[B48][B47]所述的自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，该制剂是关节风湿病的预防剂和/或治疗剂。
[B49]免疫的异常亢进改善剂，其特征是作为有效成分含有[B12]-[B24]任一项所述的CaMK II抑制剂。
[B50]风湿病患者慢性炎症的抑制剂、关节破坏的抑制剂、关节变形的进行抑制剂或身体功能的改善剂，其特征是作为有效成分含有[B12]-[B24]任一项所述的CaMK II抑制剂。
[B51][B2]所述的筛选方法，其中自体免疫疾病是关节风湿病、全身性红斑狼疮、圆板状红斑狼疮、多发性肌肉炎、强皮症、混合结缔组织病、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒症、恶性贫血、Good-pasture综合征、急性进行性肾小体肾炎、重症肌无力症、寻常性天疱疮、水疱性类天疱疮、胰岛素抗性糖尿病、青年性糖尿病、艾迪生病、萎缩性胃炎、男性不育症、早发性更年期、晶状体原性眼色素膜炎、交换性脉炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、凉发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、自体免疫性溶血性贫血、发作性血色素尿症、突发性血小板减少性紫瘢病或肖格伦综合征。
[B52][B2]所述的筛选方法，其中自体免疫疾病是关节风湿病或多发性硬化症。
发明的效果
本发明可以提供用于预防和/或治疗自体免疫疾病的良好的药剂、特别是并用药。另外，本发明还提供对探索、获得可成为该预防药、治疗药、或并用药的有效成分的候选物质筛选有用的筛选方法。
附图说明
[图1]是表示用豆蔻酸佛波乙酯(PMA)和钙离子载体A23187刺激小鼠T淋巴细胞系细胞株EL-4细胞时IL-2产生量的曲线图。各组结果都是以与6孔的平均值的标准偏差表示。给出了添加化合物(I)组(1-30μM)、添加KN-93组(1-10μM)和对照组的结果。
[图2]是表示用脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞细胞株J774A.1细胞时的IL-6产生量的曲线图。各组结果都是以与6孔的平均值的标准偏差表示。给出了添加化合物(I)组(1-30μM)、添加KN-93组(1-3μM)和对照组的结果。
[图3]是表示用重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激小鼠成纤维细胞株L929细胞时细胞增殖的曲线图。以波长450nm的吸光度测定作为细胞增殖的指标的5-溴脱氧尿苷(Brd-U)的掺入。各组结果都是以与6孔的平均值的标准偏差表示的。▲表示添加化合物(I)组(0.3-10μM)的结果。■表示添加KN-93组(1-30μM)的结果。○表示无刺激对照组的结果。●表示刺激对照组的结果。
[图4]是表示来自人滑膜的细胞SW982细胞的增殖的曲线图。各组结果都是以与6孔的平均值的标准偏差表示。▲表示添加化合物(I)组(1-30μM)的结果。■表示添加KN-93组(1-30μM)的结果。●表示对照组的结果。
[图5]是表示培养来自胶原关节炎小鼠关节炎罹患部的细胞时的破骨细胞形成数的曲线图。各组结果都是以与6孔的平均值的标准偏差表示。给出了添加化合物(I)组(0.5-20μM)组、添加KN-93组(0.3-5μM)和对照组的结果。
[图6]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢的浮肿量变化的曲线图。各组结果都是以10例的平均值与标准偏差表示。给出了给予化合物(I)组(2.5-80mg/kg)、给予吲哚美辛组(0.5mg/kg)和对照组的结果。
[图7]表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左右后肢浮肿量变化的曲线图。给出了给予化合物(II)组(10-50mg/kg)(各组7例的平均值和标准偏差)和对照组(8例的平均值和标准偏差)的结果。
[图8]表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左右后肢体积与致敏后天数的曲线图。曲线图中，○表示给予化合物(I)(2.5mg/kg)组的结果。■表示给予化合物(I)(5mg/kg)组的结果。□表示给予化合物(I)(10mg/kg)组的结果。▲表示给予化合物(I)(20mg/kg)组的结果。△表示给予化合物(I)(40mg/kg)组的结果。●表示给予化合物(I)(80mg/kg)组的结果。◇表示给予吲哚美辛(0.5mg/kg)组的结果。×表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。+表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值表示。使用AUC值进行统计解析。在Williams的多重比较、单侧检验中，给予化合物(I)(20mg/kg)组在右后肢体积(p＜0.01)和左后肢体积(p＜0.05)方面有意义，给予化合物(I)(40mg/kg)组和给予化合物(I)(80mg/kg)组在左右任一个后肢体积都有意义(p＜0.01)。另外在Student的t检验、在两侧检验中，吲哚美辛(0.5mg/kg)给予组在左右任一个后肢体积都有意义(p＜0.01)。
[图9]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左右后肢浮肿量与致敏后天数的曲线图。曲线图中、●表示给予化合物(II)(50mg/kg)组的结果。△表示给予D-青霉胺(50mg/kg)组的结果。○表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以10-12例的平均值表示。
[图10]是表示使用关节风湿病的动物模型胶原关节炎小鼠，试验化合物(I)时的关节炎发病率的曲线图。○表示给予化合物(I)(5mg/kg)组的结果。Δ表示给予化合物(I)(10mg/kg)组的结果。□表示给予化合物(I)(20mg/kg)组的结果。▲表示给予化合物(I)(40mg/kg)组的结果。■表示给予化合物(I)(80mg/kg)组的结果。×表示给予泼尼松龙(3mg/kg)组的结果。●表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以10例的平均值表示。在使用bonferroni修正Fisher的直接概率法进行的频度检验中，给予化合物(I)(5mg/kg)组(p＜0.05)、给予化合物(I)(10，20，40和80mg/kg)组(p＜0.01)任一个都表现出有意义差。而在使用Fisher的直接概率法进行的频度检验中，给予泼尼松龙(3mg/kg)组表现有意义差(p＜0.01)。
[图11]是表示使用关节风湿病的动物模型胶原关节炎小鼠，试验化合物(I)时的关节炎评价的曲线图。○表示给予化合物(I)(5mg/kg)组的结果。△表示给予化合物(I)(10mg/kg)组的结果。□表示给予化合物(I)(20mg/kg)组的结果。▲表示给予化合物(I)(40mg/kg)组的结果。■表示给予化合物(I)(80mg/kg)组的结果。×表示给予泼尼松龙(3mg/kg)组的结果。●表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以10例的平均值表示。在Shirley.Williams的多重比较检验中，给予化合物(I)(5mg/kg)组(p＜0.05)、给予化合物(I)(10，20，40和80mg/kg)组(p＜0.01)任一个都表现出有意义差。而在Wilcoxon检验中，给予泼尼松龙(3mg/kg)组表现出有意义差(p＜0.01)。
[图12]是表示使用多发性硬化症的动物模型实验的变应性脑脊髓炎小鼠，试验KN-93时的病状评价的曲线图。*表示给予KN-93(1mg/kg)组的结果。●表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以10例的平均值表示。
[图13]是表示使用多发性硬化症的动物模型实验的变应性脑脊髓炎小鼠，试验化合物(I)时的病状评价的曲线图。□表示给予化合物(I)(20mg/kg)组的结果。▲表示给予化合物(I)(40mg/kg)组的结果。■表示给予化合物(I)(80mg/kg)组的结果。×表示给予泼尼松龙(3mg/kg)组的结果。●表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。+表示正常对照组的结果。对照组9例、其它各组都是以10例的平均值表示。
[图14]是表示使用多发性硬化症的动物模型实验的变应性脑脊髓炎小鼠，试验化合物(I)时对体重增加的作用的曲线图。□表示给予化合物(I)(20mg/kg)组的结果。▲表示给予化合物(I)(40mg/kg)组的结果。■表示给予化合物(I)(80mg/kg)组的结果。×表示给予泼尼松龙(3mg/kg)组的结果。●表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。+表示正常对照组的结果。对照组9例、其它各组都是以10例的平均值表示。
[图15]是CIA小鼠滑膜部位处CaMK II的免疫染色的结果。显黑色的细胞表示CaMK II表达细胞。
[图16]是CIA小鼠血管翳(肉芽状组织)处CaMK II的免疫染色的结果。显黑色的细胞表示CaMK II表达细胞。
[图17]是通过免疫印迹法检测用豆蔻酸佛波乙酯(PMA)和钙离子载体A23187刺激小鼠T淋巴细胞系细胞株EL-4细胞时的细胞质内的IκBα表达的结果。给出了添加化合物(I)30μM、添加KN-9310μM和对照的结果。
[图18]是通过免疫印迹法检测用重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激小鼠成纤维细胞株L929细胞时的细胞内细胞周期蛋白D1表达的结果。给出了添加化合物(I)(1.25-20μM)、添加KN-93(5-20μM)、无刺激对照和刺激对照的结果。
[图19]是通过免疫印迹法检测重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激小鼠成纤维细胞株L929细胞时的细胞内磷酸化Akt和Akt表达的结果。给出了添加化合物(I)20μM、添加KN-93 20μM、无刺激对照和刺激对照的结果。
[图20]表示通过免疫印迹法检测用LPS+IFNγ刺激人单核系细胞株THP-1细胞时的细胞内CaMK II γ和CaMK II δ表达的结果。
[图21]表示使用荧光标记siRNA研究最适导入条件时，作为对照没有转染时的流式细胞仪解析的结果。纵轴表示细胞数，横轴用Log标度表示荧光强度。
[图22]表示使用荧光标记siRNA研究最适导入条件时，最适条件时(siRNA 60pmol)的流式细胞仪解析的结果。纵轴表示细胞数，横轴用Log标度表示荧光强度。
[图23]是通过免疫印迹法检测将CaMK II γsiRNA(A)、(B)和(C)分别导入来自人滑膜细胞SW982细胞时的CaMK II γ表达的结果。图中的(A)、(B)和(C)分别表示导入了CaMK II γsiRNA(A)、(B)和(C)时的结果。SC表示对照导入了Scramble II Duplex(SC)时的结果。Mock表示只是用不含有任何siRNA的导入用试剂进行转染时的结果。图中，用“CaMK II γ→”表示的带是CaMK II γ带。
[图24]是表示向来自人滑膜细胞SW982细胞分别导入CaMK II γsiRNA(A)、(B)和(C)时细胞增殖的曲线图。作为细胞增殖的指标测定添加Alamar Blue(R)后的荧光强度(激发：544nm、波长：590nm)。图中的(A)、(B)和(C)表示分别导入CaMK II γsiRNA(A)、(B)和(C)时的结果。SC表示作为对照导入Scramble II Duplex(SC)时的结果。Mock表示只是用不含有任何siRNA的导入用试剂进行转染时的结果。
[图25]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢的浮肿量变化的曲线图。曲线图中，A表示化合物(I)(10mg/kg)和来氟米特(5mg/kg)并用给予组的结果。B表示单独给予化合物(I)组(10mg/kg)的结果。C表示单独给予来氟米特组(5mg/kg)的结果。D表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以7例的平均值表示。曲线图中的百分比表示抑制浮肿率。
[图26]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢的浮肿量变化的曲线图。曲线图中，A表示化合物(I)(10mg/kg)与柳氮磺吡啶(400mg/kg)并用给予组的结果。B表示单独给予化合物(I)组(10mg/kg)的结果。C表示单独给予柳氮磺吡啶组(400mg/kg)的结果。D表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以7例的平均值表示。曲线图中的百分比表示抑制浮肿率。
[图27]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢的体积与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◇表示化合物(I)(10mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(10mg/kg)的结果。▲表示单独给予甲氨蝶呤组(0.060mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示没有引起佐剂诱发关节炎的正常动物组(正常对照组)的结果。各组都是以8例的平均值表示。
[图28]是表示大鼠的佐剂诱发关节炎的发病率与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◇表示化合物(I)(10mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(10mg/kg)的结果。▲表示单独给予甲氨蝶呤组(0.060mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以8例的平均值表示。
[图29]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢的体积与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◇表示化合物(I)(10mg/kg)与甲氨蝶呤(0.045mg/kg)的并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(10mg/kg)的结果。▲表示单独给予甲氨蝶呤组(0.045mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以8例的平均值表示。
[图30]是表示大鼠的佐剂诱发关节炎的发病率与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◇表示化合物(I)(10mg/kg)与甲氨蝶呤(0.045mg/kg)的并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(10mg/kg)的结果。▲表示单独给予甲氨蝶呤组(0.045mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。各组都是以8例的平均值表示。
[图31]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢体积的增加量(初始时刻的体积与分次测量时的体积的差)与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(20mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(20mg/kg)的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值表示。
[图32]是表示大鼠的佐剂诱发关节炎的发病率与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(20mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(20mg/kg)的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值表示。
[图33]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢体积的增加量(初始时刻的体积与分次测量时的体积的差)与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(40mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(40mg/kg)的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值。
[图34]是表示大鼠的佐剂诱发关节炎的发病率与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(40mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(40mg/kg)的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值。
[图35]是表示大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢体积的增加量(初始时刻的体积与分次测量时的体积的差)与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(80mg/kg)的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值。
[图36]是表示大鼠的佐剂诱发关节炎的发病率与致敏后天数关系的曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组(80mg/kg)的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。各组都是以10例的平均值。
[图37]是大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢体积增加量的AUC(将给予期间中的各时点的体积增加量对时间作图得到的曲线的曲线下面积)曲线图。曲线图中，◆表示化合物(I)(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组的结果。○表示单独给予化合物(I)组的结果。△表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)的结果。■表示未给予被实验化合物组(对照组)的结果。□表示正常对照组的结果。
[图38]是大鼠患佐剂诱发关节炎的右后肢关节破坏评价的曲线图。结果各组都是以10例的平均值和标准偏差表示。给出了正常对照组、未给予被实验化合物组(对照组)、甲氨蝶呤(0.06mg/kg)单独给予组、化合物(I)(20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组、和化合物(I)(20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg)单独给予组的结果。
[图39]是佐剂诱发关节炎大鼠右后肢的软X线像。照片是表示对照组组中平均评分个体的代表例(评分10)。
[图40]是佐剂诱发关节炎大鼠右后肢的软X线像。照片是表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)组中平均评分个体的代表例(评分9)。
[图41]是佐剂诱发关节炎大鼠右后肢的软X线像。照片是表示单独给予化合物(I)组(40mg/kg)中平均评分个体的代表例(评分5)。
[图42]是佐剂诱发关节炎大鼠右后肢的软X线像。照片是表示化合物(I)(40mg/kg)+甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组组中平均评分个体的代表例(评分2)。
[图43]是大鼠患佐剂诱发关节炎的左后肢关节破坏评价的曲线图。结果各组都是以10例的平均值和标准偏差表示。给出了正常对照组、未给予被实验化合物组(对照组)、甲氨蝶呤(0.06mg/kg)单独给予组、化合物(I)(20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)的并用给予组、和化合物(I)(20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg)单独给予组的结果。
[图44]是佐剂诱发关节炎大鼠左后肢的软X线像。照片是表示对照组中平均评分个体的代表例(评分3)。
[图45]是佐剂诱发关节炎大鼠左后肢的软X线像。照片是表示单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kg)组中平均评分个体的代表例(评分2)。
[图46]是佐剂诱发关节炎大鼠左后肢的软X线像。照片是表示单独给予化合物(I)组(40mg/kg)中平均评分个体的代表例(评分1)。
[图47]是佐剂诱发关节炎大鼠左后肢的软X线像。照片是表示化合物(I)(40mg/kg)+甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组组中平均评分个体的代表例(评分0)。
[图48]表示当用豆蔻酸佛波乙酯(PMA)和钙离子载体A23187刺激小鼠T淋巴细胞系细胞株EL-4细胞时化合物(I)与甲氨蝶呤并用对IL-2产生的效果。图中的fa表示抑制IL-2产生的抑制率，CI表示Combination Index。
具体实施方式
以下对本发明进一步进行详细说明。
本说明书中的氨基酸、肽等用缩略号的表示是根据IUPAC、IUB的规定、“用于包括碱基序列或氨基酸序列的说明书等的制作指南”(专利厅编)以及该领域中的惯用标记给出的。
芳基，例如碳原子数6～14的芳基，具体来说如苯基、1-萘基、2-萘基、菲基、蒽基等。优选苯基、1-萘基、2-萘基。
作为所述的杂环基，例如含有1～6个的氮原子、氧原子和/或硫原子的1～3环的5～7元环的饱和杂环基或不饱和杂环基。
作为这样的饱和杂环基，具体来说如四氢呋喃基、吡啶烷基、吡唑烷基、咪唑烷基等1～3环的5元环饱和杂环基、吡啶基、吗啉基、チアモルホリニル、哌嗪基、六氢嘧啶基等1～3环的6元环饱和杂环基、アゼパニル等1～3环的7元环饱和杂环基等。
作为所述的不饱和杂环基，具体的如呋喃基、噻吩基、吲哚基、异噻唑基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡咯基、苯并呋喃基、咪唑基、4，5-二氢-1H-咪唑基、吡唑基、异唑基、异噻唑基、噻唑基、呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、咔唑基等1～3环的5元环不饱和杂环基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、1，4，5，6-四氢-嘧啶基、3，6-二氢-2H[1，3，5]氧杂二嗪基、哒嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹啉基、氧杂萘基、2，3-二氢-苯并[1，4]ジオキサニル等1～3环的6元环不饱和杂环基、4，5，6，7-四氢-1H-[1，3]二氮杂基等1～3环的7元环不饱和杂环基等。
作为取代芳基和取代杂环基中的取代基，例如下面的a)至g)各组中包括的任意的基团，它们可以任意进行1个或多个取代。
a)：卤素原子、硝基、氰基、叠氮基、巯基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的低级烷氧基氨基、羟基、酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨甲酰基、可被取代的氨甲酰氧基、磺基、可被取代的氨磺酰基
b)：-R10、-OR10、-CO2R10、-SO3R10、-SR10、-OCH2R10、-SCH2R10、-C(＝NOH)R10
[式中、R10代表苯基或单环的杂环基。苯基或单环的杂环基可以被例如任意选自卤素原子、低级烷基、低级卤代烷基、氰基、硝基、迭氮基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、可被取代的氨基、可被取代的氨甲酰基、羧基、低级烷基碳酰基、低级烷氧碳酰基、低级烷基硫代基、低级烷基亚硫酰基和低级烷基硫酰基等中的1或多个基团取代。]
c)：烷基、烷氧基、烷氧碳酰基、烷氧基(硫碳酰基)基、烷基硫代基、(烷基硫代)硫碳酰基、(烷基硫代)碳酰基、烷基碳酰基、烷基硫代基、烷基亚硫酰基、烷基硫酰基、烷基碳酰氧基、アルキルチオイルオキシ基、烷基磺酰氧基
[该组中的各个基团可以用例如任意选自卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、羟基、酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨甲酰基、可被取代的氨甲酰氧基、磺基、可被取代的氨磺酰基、-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10、-SCH2R10(式中、R10与上述同义。)、
低级环烷基(低级环烷基可以用例如任意选自卤素原子、低级烷基、低级卤代烷基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基和低级卤代烷氧基等组中的1或多个基团取代。)、
低级烷氧基、低级烷氧碳酰基和低级烷基硫代基(低级烷氧基、低级烷氧碳酰酰基和低级烷基硫代基可以用例如任意选自卤素原子、低级环烷基、单环的杂环基、苯基、氰基、硝基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、可被取代的氨基、可被取代的氨甲酰基、羧基、低级烷基碳酰基、低级烷氧基碳酰基、低级烷基硫代基、低级烷基亚硫酰基和低级烷基硫酰基等组中的1或多个基团取代。)等组中的1或多个基团取代。]
d)：链烯基
[链烯基可以用例如任意选自卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、低级烷氧基碳酰基、低级烷基硫代基、酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨甲酰基、-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10和-SCH2R10(式中、R10与上述同义。)等组中的1或多个基团取代。]
e)：炔基
[炔基可以用例如任意选自卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、低级烷氧碳酰基、低级烷基硫代基、酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨甲酰基、-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10和-SCH2R10(式中、R10与上述同义。)等组中的1或多个基团取代。]
f)：链烯氧基、链烯氧碳酰基、链烯碳酰基、链烯碳酰氧基、炔氧基、炔氧碳酰基
[该组中的各个基团可以用例如任意选自卤素原子、羰基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、酰基、酰氧基、低级烷基硫代基、羧基、可被取代的氨甲酰基、低级烷氧碳酰基和苯基等组中的1或多个基团取代。]
[0074]g)：低级环烷基、低级环炔氧基、低级环炔碳酰基、低级环炔碳酰氧基、低级环炔基氧碳酰基、低级环链烯基、低级环链烯氧基、低级环链烯碳酰基、低级环链烯碳酰氧基、低级环链烯氧碳酰基
[该组中的各个基团可以用例如任意选自卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、低级烷基、低级卤代烷基、可被取代的氨基、水酸基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、酰基、酰氧基、低级烷基硫代基、羧基、可被取代的氨甲酰基和低级烷氧基碳酰基等组中的1个或多个基团取代。]
作为取代芳基和取代杂环基的取代基，具体来说如甲基、2-甲基-1-丙基、己基、2-甲基-2-丙基、2-丙基、苯基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、1，1，2，2，2-五氟乙基、6，6，6-三氟己基、羟甲基、羟乙基、甲氧基甲基、己基氧甲基、环丙基甲氧甲基、乙酰氧基甲基、N，N-二甲基氨甲酰氧甲基、甲磺酰氧甲基、N，N-二甲基氨磺酰氧甲基、2-(1-吡啶烷基)乙氧基甲基、2-甲氧基乙基、羧甲基、甲氧基碳酰甲基、氨甲酰甲基、脒甲基、甲基硫代甲基、氰基甲基、氨甲基、氨乙基、N-酰基氨甲基、乙烯基、2-丙烯基、乙炔基、2-丙炔基、2-甲氧碳酰乙烯基、氟、氯、溴、硝基、氰基、羟基、氨基、N，N-二甲氨基、巯基、磺基、羧基、脒基、甲氧基、环氟甲氧基、2-(1-吡啶烷基)乙氧基、甲氧羰基甲氧、2-乙酰氧基乙氧基、2-羟基乙氧基、2-甲氧基乙氧基、4，4，5，5，5-五氟戊氧基、2-甲亚磺酰基乙氧基、苯氧基、联苯酰氧基、4-甲氧基联苯酰氧基、甲氧碳酰氧基、1-吡咯烷基、3-羟基-1-吡啶烷基、酰基氨基、N-酰基-N-甲氨基、N-甲磺酰氨基、N-甲磺酰-N-甲氨基、甲氧基碳酰基、2-甲基-2-丙基氧碳酰基、2，2，2-三氟乙氧碳酰基、氨甲酰、N，N-二甲基氨甲酰基、2-噻唑烷基、2-唑烷基、5-四唑基、甲亚磺酰基、氨磺酰基、N，N-二甲基氨磺酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰、三氟乙酰基、甲酰基、乙撑二氧甲基、亚氨基、甲氧亚氨基等。
在这样的取代基中作为理想的取代基，具体的如甲基、2-甲基-1-丙基、己基、2-甲基-2-丙基、2-丙基、苯基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、羟甲基、羟乙基、甲氧基甲基、环丙基甲氧甲基、乙酰氧基甲基、N，N-二甲基氨甲酰羟甲基、甲磺酰氧甲基、N，N-二甲基氨磺酰氧甲基、2-(1-吡啶烷基)乙氧基甲基、2-甲氧基乙基、羧甲基、甲氧基碳酰甲基、氨甲酰甲基、脒甲基、甲基硫代甲基、氰基甲基、氨甲基、氨乙基、N-乙酰氨甲基、氟、氯、溴、硝基、氰基、羟基、氨基、N，N-二甲氨基、甲氧基、2-(1-吡啶烷基)乙氧基、甲氧碳酰甲氧基、2-乙酰氧基乙氧基、2-羟基乙氧基、2-甲氧基乙氧基、2-甲亚磺酰基乙氧基、1-吡啶烷基、3-羟基-1-吡啶烷基、乙酰氨基、N-乙酰-N-甲氨基、N-甲磺酰氨基、N-甲磺酰-N-甲氨基、甲氧基碳酰基、2-甲基-2-丙基氧碳酰基、2，2，2-三氟乙氧基碳酰基、氨甲酰基、N，N-二甲基氨甲酰基、甲亚磺酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰、三氟乙酰基等。
芳基和杂环基中理想的取代基数如1、2或3。此外，芳基和杂环基没有取代更好。
作为烷基，例如直链或分支的碳原子数1～10的烷基，具体的如甲基、乙基、丙基、1-甲乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基-1-丙基、1，1-二甲乙基、戊基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-甲基丁基、3-甲基丁基、己基、2-甲基戊基、3，3-二甲基丁基、庚基、1-乙基戊基、5-甲基己基、辛基、1，5-二甲基己基、2-乙基己基、壬基、癸基等。作为低级烷基，如碳原子数1～6的烷基。
作为取代烷基中的取代基，例如包括在下面的a)至d)各组中的任意基团，这些基团可以任意地进行1个或多个取代。
a)：卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的低级烷氧基氨基、羟基、酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨基甲酰基、可被取代的氨甲酰氧基、磺基、可被取代的氨磺酰基
b)：低级环烷基、低级环炔氧基、低级环炔碳酰基、低级环炔碳酰氧基、低级环炔基氧碳酰基、低级环链烯基、低级环链烯氧基、低级环链烯碳酰基、低级环链烯碳酰氧基、低级环链烯氧碳酰基
[该组中的各个基团可被例如任意选自卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、低级烷基、低级卤代烷基、可被取代的氨基、水酸基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、酰基、酰氧基、低级烷基硫代基、羧基、可被取代的氨甲酰基和低级烷氧基碳酰基等组中的1个或多个基团取代。]
c)：烷氧基、烷氧基碳酰基、烷氧基(硫代碳酰基)基、烷基硫代基、(烷基硫代)硫代碳酰基、(烷基硫代)碳酰基、烷基碳酰基、アルキルチオイル基、烷基亚硫酰基、烷基硫酰基、烷基碳酰氧基、アルキルチオイルオキシ基、烷基磺酰氧基
[该组中的各个基团可以被任意选自如下各组中一个或多个基团取代：
卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、羟基、乙酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨基甲酰基、可被取代的氨甲酰氧基、磺基、可被取代的氨磺酰基、-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10、-SCH2R10(式中，R10与上述同义。)、
低级环烷基(低级环烷基可被从例如卤素原子、低级烷基、低级卤代烷基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基和低级卤代烷氧基等中选出的1个或多个基团取代。)、
低级烷氧基、低级烷氧基碳酰基和低级烷基硫代基(低级烷氧基、低级烷氧基碳酰基和低级烷基硫代基可被任意选自例如卤素原子、低级环烷基、单环的杂环基、苯基基、氰基、硝基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、可被取代的氨基、可被取代的氨基甲酰基、羧基、低级烷基碳酰基、低级烷氧基碳酰基、低级烷基硫代基、低级烷基亚硫酰基和低级烷基硫酰基等组中的1个或多个基团取代。]
d)：-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10、-SCH2R10(式中、R10与上述同义。)
作为取代烷基，具体来说如三氟甲基、2-硝基乙基、2-氰基丙基、4-巯基丁基、3-羰基丁基、2-哌啶子基乙基、2-羟乙基、3-甲氧基丙基、乙氧基羰基甲基、环丙烷基甲基、环己烷基甲基、6-环己烷基己基、3-环己烯丁基、2-苯基丁基、联苯酰基、2-萘基甲基、苯乙基、2-吡啶甲基、3-吡啶甲基、4-吡啶甲基、2-喹啉基甲基、3-喹啉基甲基、3-噻吩基丙基、羟甲基、羟乙基、氨甲基、氨乙基、羧甲基、乙氧基碳酰甲基、氨甲酰甲基等。
而所谓的低级卤代烷基指的是被1～5个卤素原子取代的低级烷基。
所谓烷氧基指的是烷基结合了羟基。具体来说如甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、1，1-二甲基乙氧基、戊氧基、己氧基等。取代烷氧基的取代基如与取代烷基的取代基同样的基团。作为取代烷氧基，具体来说如环丙烷基甲氧基、三氟甲氧基、2-吡咯烷乙氧基、联苯酰氧基、2-吡啶基甲氧基等。
而所谓卤代烷氧基指的是被1～5个卤素原子取代的烷氧基。
所谓烷氧基碳酰基指的是烷氧基结合了碳酰基。具体来说如甲氧基碳酰基、乙氧基碳酰基、丙氧基碳酰羰基、2-丙氧基碳酰羰基等。作为取代烷氧基碳酰基中的取代基。如与取代烷基的取代基相同的基团。
作为链烯基，如具有1～3个双键的碳原子数2～10的直链或支链的链烯基。具体的如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、4-戊烯基、3-甲基一2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、1，3-辛二烯基、2-壬烯基、1，3-壬二烯基、2-癸烯基等。作为理想的链烯基，例如乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基。作为低级链烯基，如碳原子数2～6的链烯基。
作为取代链烯基的取代基，例如卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、低级烷氧基碳酰基、低级烷基硫代基、乙酰基、酰氧基、羧基、可被取代的氨甲酰基、-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10、-SCH2R10(式中、R10与上述同义。)等。
另外所谓链烯氧基指的是链烯基结合了羟基。
作为炔基，如具有1～3个三键的碳原子数2～10的直链或支链的炔基。具体来说如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、4-戊炔基、1-辛炔基、6-甲基-1-庚炔基、2-癸炔基等。作为理想的炔基，例如1-丙炔基、1-丁炔基等。作为低级炔基，如碳原子数2～6的炔基。
作为取代炔基的取代基，例如卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、乙酰基、酰氧基、低级烷基硫代基、羧基、可被取代的氨甲酰基、低级烷氧基碳酰基、-R10、-OR10、-SR10、-OCH2R10、-SCH2R10(式中、R10与上述同义。)等。
而所谓炔氧基指的是炔基结合了羟基。
作为环烷基，例如碳原子数3～10的环烷基，具体来说如环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚基等。作为低级环烷基如碳原子数3～6的环烷基。另外作为环烷基羟基如结合了环烷基的羟基。
作为环链烯基例如碳原子数3～10的环链烯基，具体来说如环己烯基等。作为低级环链烯基如碳原子数3～6的环链烯基。
另外所谓环链烯氧基指的是环链烯基结合了羟基。
作为取代环烷基和取代环链烯基的取代基例如卤素原子、硝基、氰基、巯基、羰基、硫代基、低级烷基、低级卤代烷基、可被取代的氨基、羟基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、乙酰基、酰氧基、低级烷基硫代基、羧基、可被取代的氨基甲酰基、低级烷氧基碳酰基等。
作为酰基例如式-Z-R11(式中、Z代表-CO-、-CS-、-SO-或-SO2-、R11代表可被取代的烷基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基。)表示的酰基等。作为酰基，具体来说如甲酰基、乙酰基、丙酰基、2-丙酰基、新戊酰、戊酰基、新戊酰、三氟乙酰基、苯甲酰基、萘酰、ニコチノイル、甲磺酰基、三氟甲磺酰基、p-甲苯磺酰基等。作为理想的酰基，如乙酰基等。而所谓的酰氧基指的是酰基结合了羟基。
作为取代氨甲酰基中的取代基，例如芳基或可被杂环基取代的烷基、和芳基、杂环基等，同一或不同的多个基团可独立取代。作为取代氨甲酰基具体来说如乙基氨甲酰基、二甲基氨甲酰基、苯基氨甲酰基、2-吡啶基氨甲酰基、联苯酰基氨甲酰基、(3-吡啶甲基)氨甲酰基等。
作为取代氨磺酰基中的取代基，例如烷基、芳基、杂环基等，同一或不同的多个基团可独立取代。作为取代氨磺酰基，具体来说如乙基氨磺酰基、二甲基氨磺酰基、苯基氨磺酰基、2-吡啶基氨磺酰基等。
作为取代氨基中的取代基，例如酰基、烷基等，同一或不同的多个基团可独立以取代。作为具体的取代氨基如乙酰胺基、丙酰胺基、丁酰胺基、2-丁酰胺基、甲氨基、2-甲基-1-丙氨基、二乙氨基等。
取代羟氨基的取代基如可取代为氮原子、氧原子中的任一个原子，作为该取代基如与取代氨基中的取代基相同的基团。
作为卤素原子，例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
作为亚烷基，例如碳原子数1～10的直链或带分支的亚烷基。具体来说如亚甲基、乙撑、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚甲基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、甲基亚甲基、乙基亚甲基、二甲基亚甲基、1，1-二甲基乙撑、1，2-二甲基乙撑、1-甲基三亚甲基、2-甲基三亚甲基、1，1-二甲基三亚甲基、1，2-二甲基三亚甲基、1，3-二甲基三亚甲基、2，2-二甲基三亚甲基、1-乙基三亚甲基、2-乙基三亚甲基、1，1-二乙基三亚甲基、1，2-二乙基三亚甲基、1，3-二乙基三亚甲基、2，2-二乙基三亚甲基等。
作为低级亚烷基，例如碳原子数1～6的直链或带分支的烷撑基。
作为NH基的保护基，可以是通常使用的各种保护基，适合的例如甲氧碳酰基、乙氧碳酰基、叔丁氧碳酰基、联苯酰氧碳酰基等氨基甲酸盐型的保护基、乙酰基、苯甲酰基等酰胺型的保护基、联苯酰基、硝基、p-甲苯磺酰基、甲磺酰基等。
作为R1、R2、R3和R4中任意2个结合在仪器，与氮原子共同形成的可被取代的杂环中的杂环，例如含有1～6个的氮原子、氧原子和/或硫原子(至少含有一个氮原子)的5～7元环的单环或双环的饱和杂环或不饱和杂环。具体来说如吡咯烷、咪唑啉、4，5-二氢-1H-咪唑、哌啶、哌啶-4-酮、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、1，4，5，6-四氢嘧啶、六氢嘧啶、3，6-二氢-2H-[1，3，5]氮杂二嗪等。作为取代杂环中的取代基，如与取代杂环基中的取代基相同的基团。
作为R8和R9结合与碳原子后一起共同形成的可被取代的烃环，例如可被取代的碳原子数3～8的环烷烃环或可被取代的碳原子数3～8的环炔烃环等。作为这样的环烷烃环或环炔烃环，具体来说如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯等。作为取代烃环中的取代基，如与取代环烷基中的取代基相同的基团。
在式1的异唑衍生物中，向异唑环导入具有极性的官能基的化合物特别能够改善体内动态，副作用也少，可长期间给予。
作为式1的异唑衍生物的药学上容许的盐，如酸性盐和碱性盐。作为酸性盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、醋酸盐、蚁酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、カンフア一-スルホン酸盐等有机酸盐。作为碱性盐，如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等无机碱盐、三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐、二异丙基铵盐等有机碱盐等。
在本发明中的CaMK II抑制剂中包含了本说明书中列举的具体化合物(例如式1的异唑衍生物、化合物(I)、化合物(Ib)、化合物(Ic)、化合物(II)等)所有的立体异性体、光学活性体、互变异性体、プロドラツグ、衍生物等。另外本发明还包含这些化合物的水和物等溶剂化物和所有形式的结晶形的化合物。
式1的异唑衍生物可以通过例如专利文献3所述的方法制造。
以下就本发明的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂和本发明的CaMK II抑制剂的筛选方法进行详细说明。
I.自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂
一般“自体免疫疾病”是由于与构成自己组织的成分反应的抗体或淋巴细胞在体内持续产生造成组织损害的疾病，大致分为下面给出的器官特异性自体免疫疾病和脏器非特异的自体免疫疾病(全身性自体免疫疾病)两类。
[0097](1)器官特异性自体免疫疾病：桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒症、恶性贫血、Good-pasture综合征、急性进行性肾小体肾炎、重症肌无力症、寻常性天疱疮、水疱性类天疱疮、胰岛素抗性糖尿病、青年性糖尿病、I型糖尿病、艾迪生病、萎缩性胃炎、男性不育症、早发性更年期、水品体原性眼色素膜炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、自体免疫性血液性疾病(例如、自体免疫性溶血性贫血、突发性血小板减少症等)、发作性血色素尿症、突发性血小板减少性紫瘢病、间质性肺腺维症和肖格伦综合征。
(2)脏器非特异的自体免疫疾病(全身性自体免疫疾病)：关节风湿病、全身性红斑狼疮、圆板状红斑狼疮、多发性肌肉炎、强皮症和混合结缔组织病
[0099]本发明是任意以这些“自体免疫疾病”作为对象。优选如关节风湿病和多发性硬化症，更优选关节风湿病。本发明的预防剂和/或治疗剂、增强剂、组合物、商业包装、试剂盒、使用或方法可以任意以罹患这些自体免疫疾病的哺乳动物作为对象，更理想的是以罹患自体免疫疾病的患者作为对象。
[0100]而本发明的“自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂”对于上述各种自体免疫疾病具有以下(1)和(2)所示作用中的1种或多种作用。
(1)预防作用：抑制其发病的作用(抑制发病作用)、和使其发病延迟的作用(延迟发病作用)
(2)治疗作用：意思是指发病后减轻或改善其症状的作用(缓和症状作用、改善症状作用)、抑制病状进行的作用(抑制进行作用)、抑制病状进展的作用(抑制进展作用)、或治愈疾病的作用(治愈作用)，在本发明的“自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂”中包括白己免疫疾病预防剂(在自体免疫疾病预防剂中包括自体免疫疾病发病抑制剂和白己免疫疾病发病延迟剂等)、自体免疫疾病治疗剂(在自体免疫疾病治疗剂包括自体免疫疾病症状缓和剂、自体免疫疾病症状改善剂、自体免疫疾病进行抑制剂和自体免疫疾病进展抑制剂等)和同时具有自体免疫疾病的预防作用和治疗作用的制剂。预防作用也可换言之为预防效果，而治疗作用可换言之为治疗效果。
本发明中所谓“抑制CaMK II作用”泛指不管其作用机制如何，可抑制CaMK II的功能表达的作用。另外此处“抑制CaMK II的功能表达的作用”中包含抑制CaMK II的蛋白质合成(包括CaMK II的基因表达)和分泌的作用、抑制表达的CaMK II的活化(磷酸化)的作用、使活化的CaMK II失活(脱磷酸化)的作用、以及抑制活化的CaMK II酶活性的作用。在本说明书中，也将这样的CaMK II的功能表达的抑制简单地称为抑制CaMK II作用或CaMK II的抑制。
另外本发明的“CaMK II抑制剂(具有抑制CaMK II作用的物质)”只要是具有上述揭示的抑制作用中至少一种作用的物质，而不管其形态或性状如何。而本发明的“CaMK II抑制剂”只要是至少对人CaMK II具有抑制作用，对人以外的哺乳类或来自其它生物种的CaMK II有无抑制作用没有特别限制。
在本发明的CaMK II抑制剂中也包括蛋白质、肽、以及低分子化合物等。具有抑制CaMK II作用的例如低分子化合物可以通过对于低分子化合物文库(例如、CamBridge Research Laboratories公司等的低分子化合物文库)等实施下述的本发明的筛选方法，就可以获得。
当本发明的CaMK II抑制剂是抗CaMK II抗体时，该抗体只要是特异识别CaMK II的抗体，无论什么样的抗体都可以，这样的抗体可以使用CaMK II蛋白质，通过众所周知的方法制备。在本发明的抗CaMK II抗体中包含多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体和Fab片段、通过Fab表达文库等生物合成的片段那样的具有抗原结合性的上述抗体的一部分。
作为本发明的CaMK II抑制剂，也可以是具有CaMK II基因的碱基序列中连续的至少15个碱基的聚核苷酸和/或与该聚核苷酸互补的聚核苷酸。作为CaMK II基因，可以是α、β、β’、γ、δ等任一种同工型，优选CaMK II γ基因或CaMK II δ基因，更优选CaMK II γ基因。
例如、可以利用在GenBank(基因文库)中以以下的AccessionNo.登记的基因序列。
人CaMK II α    Accession No.AF145710
人CaMK II β    Accession No.NM_172084
人CaMK II γ    Accession No.L07044
人CaMK II δ    Accession No.AF071569
另外，在GenBank中登录了CaMK II基因的各同工型中的各种变异体的基因序列，也可以利用这些序列信息。
此处所谓的互补的聚核苷酸(互补链、反向链)，指的是对于由CaMK II基因的碱基序列构成的聚核苷酸的全长序列、或至少具有该碱基序列中的连续1 5碱基长度的碱基序列的部分序列(在此为了方便也将它们称之为“正链”)，根据A:T和G:C的碱基对关系，处于碱基互补关系的聚核苷酸。但这样的互补链不限于与作为对象的正链的碱基序列完全形成互补序列的情况，也可以是与作为对象的正链在严格条件下具有能够杂交程度的互补序列。而这里的严格条件如Bergerand Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques Methodsin Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)所示那样，可以根据与复合体或探针结合的核酸的融解温度(Tm)决定。例如、作为杂交后的清洗条件，如通常“1×SSC、0.1％SDS、37℃”那样程度的条件。互补链在这样的条件下即使清洗，仍维持与作为对象的正链杂交状态。虽然没有特别限制，作为更严格的杂交条件，如“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”程度、作为更为严格的杂交条件如“0.1×SSC、0.1％SDS、65℃”程度的清洗条件。具体来说作为这样的互补链，如由与对象正链的碱基序列处于完全互补关系的碱基序列构成的链以及由与该链至少具有90％、优选95％同源性的碱基序列构成的链。
而在作为正链的聚核苷酸中，不仅包括具有上述CaMK II基因的碱基序列、或其部分序列，还包括由与上述互补链的碱基序列具有互补关系的碱基序列构成的链。
上述正链的聚核苷酸和互补链(反向链)的聚核苷酸可以以各个单链的形式作为疾病标志使用，也可以以双链的形式作为疾病标志使用。
另外，作为本发明的CaMK II抑制剂，作为与至少具有CaMK II基因的碱基序列中连续的15个碱基的聚核苷酸和/或与该聚核苷酸互补的聚核苷酸的一个形式，如针对CaMK II基因的siRNA(small interferingRNA)。所谓siRNA是在RNAi(RNA干扰；RNA interference)中使用的21～23个碱基的双链RNA的总称。所谓RNAi是导入到细胞的双链RNA具有抑制与其相同序列的基因的表达(蛋白质合成)的现象，该方法通过破坏靶基因(mRNA)抑制表达，作为基因的功能解析中有效的方法近年来引人注目。
针对CaMK II基因的siRNA可以以与CaMK II基因(可以是α、β、β’、γ、δ等中任一个同工型)有关的上述碱基序列情报(GenBank等)为基础，通过众所周知的方法进行各种设计、制备。例如、作为siRNA的设计方法，可以使用Chalk et al.，“Improved and automatedprediction of effective siRNA”，Biochem Biophys ResCommun.2004；319(1)：264-74、或Reynolds et al.，“RationalsiRNA design for RNA interference”，Nature Biotechnology 2004；22，326-330所述的方法。也可以利用网络上可利用的siRNA设计程序(例如、Cold Spring Harbor Laboratory，”siRNA sequence finder”，http：//www.sinc.suny sb.edu/Stu/shilin/rnai.html等)，设计合适的siRNA。这样设计、制备的siRNA可以通过例如实施例16列举的试验方法确认实际是否具有抑制CaMKH基因表达的作用。
以上说明的CaMK II抑制剂可用作自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂，特别是作为与DMARDs并用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂。而CaMK II抑制剂不限定于上述具体给出的物质，也可以通过如下所述的本发明的筛选方法获得。
因此，本发明在与作为对象的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂、特别是与DMARDs并用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂中也包含：
(1)含有有效量的上述CaMK II抑制剂的制剂；以及
(2)含有通过下述筛选方法获得的有效量的CaMK II抑制剂的制剂中的任一种。而这里的CaMK II抑制剂的有效量只要是含有该制剂的白己免疫疾病预防剂和/或治疗剂，结果可以发挥CaMK II抑制效果那样的CaMK II抑制作用物质的配合量，并没有特别限制。而自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂除了抑制CaMK II作用的物质以外还可以含有药学上容许的载体和各种添加剂。
有关这样的载体和添加剂的种类、自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的形态、以及自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的用法(给予方式、给予方法、给予量)在下面的(III)栏中详细说明。
II.自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂(特别是与DMARDs并用有效的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂)的有效成分的筛选方法
本发明人等就像下面的实施例所示的那样，取得了可以通过抑制CaMK II的功能表达抑制自体免疫疾病的发病，和/或改善病状的新的见解。由此认为CaMK II抑制剂可用作自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的有效成分。另外，本发明人等就像实施例给出的那样，取得了通过将CaMK II抑制剂和DMARDs组合给予，对于自体免疫疾病具有不能由它们单独的效果预测的显著良好的预防效果和/或治疗效果的新的见解。由此认为CaMK II抑制剂可用作用于与DMARDs并用的自体免疫疾病预防和/或治疗的并用剂，另外可用作疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的增强剂。
本发明的筛选方法是基于上述那样见解开发的方法，通过从待测物质中探索CaMK II抑制剂，获得了(i)即使单独使用也有效的自己免疫疾病预防剂和/或治疗剂、或(ii)用于与DMARDs并用的自己免疫疾病预防和/或治疗的并用剂的有效成分。
[0114]成为本发明的筛选方法对象的“CaMK II抑制剂”只要是作为结果可以抑制CaMK II的功能表达(功能发挥、作用)的物质，对其作用机制没有特别限定。作为抑制CaMK II作用，具体来说如1)抑制活化的CaMK II酶活性的作用、2)抑制CaMK II活化的作用、3)使活化的CaMK II失活(脱磷酸化)的作用、以及4)抑制CaMK II表达或分泌的作用。CaMK II抑制剂只要是至少具有这样的抑制CaMK II作用之一就可以。
[0115]作为可作为CaMK II抑制剂的候选物质，如核酸、肽、蛋白质、有机化合物(包括低分子化合物)、无机化合物等。本发明的筛选方法以这些可作为候选物质的物质或含有该物质的样品(将这些物质统称为“待测物质”)为对象实施。另外，作为含有候选物质的样品(待测物质)，也可以使用细胞提取液、基因文库的表达产物、微生物培养上清、和菌体成分等。
[0116]本发明的CaMK II抑制剂只要是药学上容许的，无论什么样结构的制剂都可以，并不限定于以下给出的，作为理想的具体例子如下列举的。
·式1的异唑衍生物
式1：
Figure A20058003740300731
[式中、A、B和D表示与上述项[6]相同意义]
式1的异唑衍生物中，理想的如上述的项[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]和[16]所述的化合物。
·3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑(化合物(I))
·N’-{3[1-(2-氟联苯基-4-基)-乙基]-异唑-5-基}-N，N-二甲基-胍盐酸盐(化合物(Ib))
·N-乙基-N’-{3[1-(2-氟联苯基-4-基)-乙基]-异唑-5-基}-胍盐酸盐(化合物(Ic))
·4-[1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-2-(甲氨基)噻唑(化合物(II))
·KN-93：N-(2-[N-[4-氯肉桂基]-N-甲基氨基甲基]苯基)-N-(2-羟乙基)-4-甲氧苯磺酰胺
·1-[1-氧-11-(5，6-二羟基-3-亚氨基苯并[h]シノリン-2(3H)-基)十一烷基]-4-(2-嘧啶基)-哌嗪
·具有序列
Lys-Lys-X-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr(式中、X为Ala或Lys。)表示的氨基酸序列的肽
·具有序列
Lys-Lys-Ala-Leu-His-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Cys-Leu表示的氨基酸序列的肽
本发明的筛选方法通过以从这样的待测物质中揭示出的抑制CaMK II作用作为指标探索至少具有上述抑制CaMK II作用之一的物质进行实施。这样选择获得的待测物质在用作自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的有效成分的同时，也可用作与DMARDs并用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的有效成分。
[0119]作为本发明的筛选方法的具体的方式，没有限定，例如以下给出的方法。
方法1
包括以下步骤(a)、(b)和(c)的CaMK II抑制剂的筛选方法：
(a)使待测物质与CaMK II酶和底物接触的步骤、
(b)通过测定与待测物质接触了的CaMK II酶引起的底物磷酸化水平，将该磷酸化水平与没有接触待测物质的对照酶的上述磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果选择抑制CaMK II活性的待测物质的步骤。
方法2
包括如下工程(a)、(b)和(c)的具有抑制CaMK II产生的作用的物质的筛选方法：
(a)使待测物质与CaMK II发现细胞(Jurkat细胞、THP-1细胞等)接触的步骤、
(b)测定与待测物质接触了的CaMK II表达细胞内的CaMK II蛋白量(免疫印迹法等)、将该蛋白量与没有接触待测物质的对照细胞内的上述蛋白量进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果选择抑制CaMK II产生的待测物质的步骤。
方法3
包括如下工程(a)、(b)和(c)的具有抑制CaMK II基因表达作用的物质的筛选方法：
(a)使待测物质与CaMK II表达细胞(Jurkat细胞、THP-1细胞等)接触的步骤、
(b)测定接触待测物质了的CaMK II表达细胞内的CaMK II基因表达量(Northern印迹法、RT-PCR法等)、将该基因发现量与没有接触待测物质的对照细胞内的上述基因表达量进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II基因表达的待测物质的步骤。
方法4
包括如下工程(a)、(b)和(c)的具有抑制CaMK II活化作用的物质的筛选方法：
(a)使待测物质与脱磷酸化CaMK II酶接触的步骤、
(b)测定接触了待测物质的CaMK II酶的磷酸化水平，将该磷酸化水平与没有接触待测物质的对照酶磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活化的待测物质的步骤。
在上述方法1～方法4中，筛选时的待测物质的浓度，以及用于判定“具有抑制CaMK II作用”的判定基准可以适当设定。例如作为待测物质的浓度，对此没有限定，如100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、以及它们之间的浓度(5μM、3μM、2μM、0.5μM、0.3μM、0.2μM等)。作为用于判定“具有抑制CaMK II作用”的判定基准，对此没有限定，与对照比较的CaMK II的抑制率，例如以下的抑制率。
(1)在待测物质的浓度10μM下CaMK II的抑制率在30％以上；
(2)在待测物质的浓度10μM下CaMK II的抑制率在40％以上；
(3)在待测物质的浓度10μM下CaMK II的抑制率在60％以上；
(4)在待测物质的浓度1μM下CaMK II的抑制率在40％以上；
(5)在待测物质的浓度1μM下CaMK II的抑制率在60％以上；
(6)在待测物质的浓度0.1μM下CaMK II的抑制率在40％以上；和
(7)在待测物质的浓度0.1μM下CaMK II的抑制率在60％以上。
作为优选的判定基准，如上述基准中的(1)、(2)、(3)、(4)或(5)。更优选(1)、(3)或(4)。进一步优选(3)或(4)。
[0121]另外，在上述的筛选方法中使用的CaMK II可以是α、β、β’、γ、δ等任一种同工型，优选CaMK II γ或CaMK II δ，更优选CaMK II γ。
[0122]本发明中的CaMK II抑制剂的筛选方法不限定于上述方式，可根据本领域技术人员的技术常识适当设计。
[0123]将通过以上说明的CaMK II抑制剂的筛选方法从待测物质中选出的候选物质再提供给使用例如模拟人的各种自体免疫疾病的疾病模型动物的药效试验(特别是与DMARDs的并用药效试验)或安全性试验，进一步可以获得作为有效成分的实用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂(特别是适于与DMARDs并用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂)。
[0124]更具体来说，如关于通过本发明的筛选方法筛选出的候选物质，作为自体免疫疾病的治疗剂是否有用，特别是对于风湿病等慢性炎症是否有效，可以通过使用关节风湿病的疾病模型动物(例如、胶原诱导性关节炎[Trentham DE，Townes AS，Kang AH：Autoimunityto type II collagens：An experimental model of arthritis J ExpMed 146：857-868，1977]、抗原诱导性关节炎、或佐剂诱导性关节炎[Pearson CM：Development of arthritis，periarthritis andperiotitis in rats given adjuvant.Proc Soc Expe Biolo Med 91：95-101，1956]等中的任一个小鼠或大鼠)进行的药效试验进行评价。
[0125]特别是通过使用大鼠的佐剂关节炎模型，可以对该候选物质对关节风湿病的抑制效果(预防效果、治疗效果)进行详细评价。大鼠的佐剂关节炎是发病机制有淋巴细胞参与，主要进行关节的软骨·骨变化和纤维化实验的关节炎，广泛用作慢性炎症的基础研究和治疗药的药效药理研究的疾病模型。佐剂关节炎的病状通常按照下述那样的过程进行：(1)仅注射足肿胀的非特异的1次炎症期(高峰：4～5天后)、(2)在所属淋巴结内活化淋巴细胞增加的诱导期(期间：5～9天)、(3)多发性关节炎发病的佐剂关节炎的恶化期(高峰：15～17天)、和(4)遗留关节变形·破坏，炎症缓解的自然治愈期(25天以后的期间)。注射足侧由于佐剂致敏引起的非特异的1次炎症也与病状的进行有关，相反人们认为非注射足侧由于T淋巴细胞的参与，发病的病状一直进行下去，看到更接近关节风湿病的现象。另外，药物作用研究了从接种日开始给予的预防效果和关节炎发病后开始给予的治疗效果。作为药效评价的指标，一般使用(1)左右各个后肢的体积、(2)通过测定在药物给予前后左右各个后肢体积，算出给予前后的体积差得到的浮肿量的变化、(3)通过软X线对骨的形态学的评价、和(4)通过组织切片进行的病理学的评价等。
[0126]另外，关于筛选的候选物质，可以通过使用多发性硬化症的疾病模型动物(例如诱导EAE发病小鼠)进行的药效试验，就该候选物质对多发性硬化症的抑制效果(预防效果、治疗效果)进行评价。
[0127]在以上述使用自体免疫疾病(关节风湿病、多发性硬化症等)的疾病模型动物的药效试验中，可以通过进行与DMARDs并用给予的试验，就该候选物质与DMARDs并用时的自体免疫疾病预防和/或治疗效果进行评价。
[0128]这样筛选、取得的物质再根据其结构解析结果，通过化学合成、生物合成(发酵)或基因操作，可以进行工业制造。
[0129]用以上那样的本发明筛选方法选择的CaMK II抑制剂可用作上述那样的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的有效成分，特别是可用作与DMARDs的并用剂。这里的自体免疫疾病具体来说如本说明书第I章所述的任意列举的各种疾病，特别是作为本发明对象的CaMK II抑制剂可有效用于关节风湿病、多发性硬化症、以及全身性红斑狼疮、优选关节风湿病和多发性硬化症、更优选关节风湿病。
[0130]本发明提供含有通过上述筛选方法得到的CaMK II抑制剂的可与DMARDs并用的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂。另外在本发明中还包括并用剂、增强剂、试剂盒、使用、方法等其它实施方式，有关其它方式在下面的(III)栏中进行详细说明。
[0131]III.关于自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂的形态和用法
以下就本发明中用于自体免疫疾病预防和/或治疗的并用剂的制造方法、给予方式、给予方法和给予量等进行说明。
[0132]本发明中的用于自体免疫疾病预防和/或治疗的并用剂是将至少一种CaMK II抑制剂和至少一种疾病缓解性抗风湿病药物(DMARDs)组合而成的制剂，可将两者分别单独做成药或与适当的药理学容许的载体或赋形剂混合后做成药，用于口服或非口服给予。作为并用剂的形态，例如将作为有效成分的CaMK II抑制剂和DMARDs(1)根据众所周知的制剂学的制造法，根据要求与适当的制剂学上容许的赋形剂等一起制造成单一的制剂、(2)将它们分别根据要求使用制剂学上容许的赋形剂等制成各制剂，同时或设定时差组合使用(并用)，或(3)也可以将它们分别根据常法与适当赋形剂一起做成制剂后组成试剂盒(试剂盒剂等)等。本发明的制剂只要是在各个化合物分别做成制剂时达到本发明的目的，可将制剂分别、同时或设定时间差，用于同一给予对象，各制剂的给予途径和给予次数也可以不同。在本发明的用于自体免疫疾病预防和/或治疗的并用剂中，所有有效成分都可以包含在一个制剂中，另外也可以将各个有效成分或一部分分别做成制剂。
[0133]即在本发明中作为用于预防和/或治疗自体免疫疾病的并用方式，没有限定，包括以下给出的那样方式。
(1)含有CaMK II抑制剂和DMARDs的预防剂和/或治疗剂；
(2)含有用于与DMARDs并用的CaMK II抑制剂的预防剂和/或治疗剂；
(3)作为有效成分含有CaMK II抑制剂的DMARDs的预防和/或治疗效果的增强剂；
(4)包括含有CaMK II抑制剂的第1组合物和含有疾病缓解性抗风湿病药物的第2组合物的试剂盒；
(5)含有用于与CaMK II抑制剂并用的DMARDs的预防剂和/或治疗剂；和
(6)作为有效成分含有DMARDs的CaMK II抑制剂的预防和/或治疗效果的增强剂；
在这些方式中，预防剂可以分别换言之为“预防用药物组合物”，治疗剂为“治疗用药物组合物”和增强剂为“增强用药物组合物”。
[0134]另外，作为本发明的方式，如将上述用于制造各种预防剂和/或治疗剂、增强剂、试剂盒等的CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物中的一方、或两方组合使用的方式。
另外，作为本发明的方式，如特征为将CaMK II抑制剂与疾病缓解性抗风湿病药物并用给予的预防和/或治疗自体免疫疾病的方法。另外作为本发明方式，还有包括给予CaMK II抑制剂的疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的增强方法。
[0135]当CaMK II抑制剂为低分子化合物、肽或抗体等蛋白质时，对于这些物质可以制备成通常使用的一般的药物组合物(医药制剂)的形式，可以根据其形式经口或非经口给予。如以下那样的一般给予方式和给予方法。
[0136]作为给予方式，其代表性方式，如片剂、丸剂、散剂、粉末剂、颗粒剂以及胶囊剂等固体制剂，和溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂等液剂等方式。上述各种形式根据给予途径，可以分为经口给予剂以及经鼻剂、经皮剂、直肠给予剂(栓剂)、舌下剂、阴道剂、注射剂(经静脉、经动脉、经肌肉、皮下、皮内)和点滴剂等非经口给予剂。例如，作为经口给予剂，可以采用例如片剂、丸剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液、悬浮液、乳液以及糖浆等，或作为直肠给予剂和阴道剂，例如片剂、丸剂、胶囊剂等形态。作为经皮剂，也可以采用例如洗剂等液剂以及乳膏剂和软膏等半固体剂的形态。
[0137]作为注射剂，例如可以采用溶液、悬浮液或乳剂等形态，具体的如无菌处理的水、水-丙二醇溶液、缓冲液、0.4重量％浓度的生理盐水等。另外注射剂制备成液剂后，也可以进行冷冻处理或冷冻干燥处理，通过这种方式保存。后者的经冷冻干燥处理制备的冷冻干燥制剂在用时加注射用蒸馏水等再溶解后使用。
[0138]对于上述的药物组合物(医药制剂)形态，可以使用该领域实施的通常手法通过将CaMK II抑制剂和药学上容许的载体配合制备。作为药学上容许的载体，如赋形剂、稀释剂、填充剂、增量剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、润滑剂和分散剂等。另外还可以配合领域中通常使用的添加剂。这样的添加剂可以根据制备的药物组合物的形态从例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、增粘剂、pH调整剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、香料、着色料、张力调节剂、螯合剂、表面活性剂等中适当选择利用。
[0139]对于CaMK II抑制剂为式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐时，作为含有CaMK II抑制剂的制剂，可以使用例如特开平11-240873、WO98/47880、特开2000-186077等所述的方法制造的制剂。另外，含有化合物(I)的制剂也可以用例如国际公开第02/092094号小册子(对应EP专利：EP1374871A1)所述的方法制造。
[0140]上述的含有CaMK II抑制剂的制剂可以与含有DMARDs的制剂并用，例如可以做成将DMARDs加到上述制剂后配合的制剂。另外也可以根据医师的处方将两者混合后制造药物。对于并用的情况，CaMKII抑制剂、DMARDs可以通过各种不同的途径同时或分别、或例如同日错开时间，或过数日～数周甚至数月，在确定的间隔给予。
[0141]这些药物组合物中的CaMK II抑制剂的给予量或给予次数要考虑给予方式、患者的疾病和其病状的程度、患者的年龄、体重、一般的健康状态、性别、饮食、给予时间、排泄速度、药物的组合等、或其它要因后决定。典型的有关CaMK II抑制剂和DMARDs并用的各自一日给予量为相对于单独给予时的实际情况(推荐临床给予量)的最少推荐临床给予量的约1/50以上最大推荐临床给予量以下的范围。例如、作为CaMK II抑制剂的给予量，通常对成人，每日有效成分的量为约0.0001～约1000mg的范围，优选约0.001～约300mg的范围，更优选约0.1～约300mg的范围，可以1天1次或分数次给予。优选经口给予。而它们的给予量要随时观察与并用的DMARDs的并用效果，也可适当减量。
当CaMK II抑制剂为化合物(I)时，对于成人，每日给予量优选约20～约300mg的范围，更优选约30～约300mg的范围，进一步优选约40～约240mg的范围，特别优选约80～约240mg的范围，可以1天1次或分数次经口给予。给予次数优选1日1次给予。更具体来说例如1天1次80mg，1天1次120mg，或1天1次240mg经口给予。另外，它们的给予量也可以观察与并用的DMARDs的并用效果，适当减量。
作为与CaMK II抑制剂并用的疾病缓解性抗风湿病药物(DMARDs)，如通过消除关节风湿病的免疫异常，使风湿病性炎症缓解，直至消失的药物。具体来说可以举出以下的药物。
来氟米特(leflunomide：Lancet.1999 Jan 23；353(9149)：259-66)
甲氨蝶呤(methotrexate：US2512572)
D-青霉胺(D-penicillamine：Nature，151，107(1943))
布西拉明(bucillamine：US4305958)
柳氮磺吡啶(salazosulfapyridine：Br Med J.1980 Feb 16；280(6212)：442-4；
也称为柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine))
阿克他利(actarit：US4720506)
氯苯扎利(lobenzarit：J Rheumatol.1984 Oct；11(5)：615-23)
环磷酰胺(cyclophosphamide：Naturwiss，45，64(1957))
苯丁酸氮芥(chlorambucil：US2944079)
咪唑立宾(mizoribine：US3888843)
硫唑嘌呤(azathioprine：US3056785)
金诺芬(auranofin：US3635945)
金硫丁二钠(gold sodium thiomalate：Rheumatol Rehabil 1975May；14(2)：101-14)
金チオ硫酸(aurotiosulfate)
金硫葡糖(aurothioglucose：Agents Actions 1976 Feb；6(1-3)：355-63)
环孢菌素(cyclosporine：US4117118)
硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine：US2546658)
氯喹(chloroquine：US2233970)
他克莫司(tacrolimus，FK506：EP184162)
伊那西普(Etanercept：Ann Pharmacother 1997 Nov；31(11)：1335-8)
英夫利昔单抗(Infliximab：Lancet 1994 Oct 22：344(8930)：1105-10)
阿那白滞素(Anakinra：Expert Opin Inyestig Drugs.2000 Jan；9(1)：113-27)
凯利昔单抗(keliximab：J Rheumatol 2002 Feb；29(2)：220-9)
阿达木单抗(adalimumab，D2E7：Ann Rheum Dis.1999 Nov；58 Suppl 1：I70-2)
利妥昔单抗(rituximab，IDEC-102：Blood 1994 Jan；83(2)：435-45，Blood 1997 Sep；90(6)：2188-95)
人源化抗IL-6R抗体(MRA：Ann Rheum Dis.2000 Nov；59 Suppl1：i21-7)
这些DMARDs中，优选来氟米特、甲氨蝶呤和柳氮磺吡啶。更优选甲氨蝶呤。
在这些DMARDs的使用中，屡屡出现副作用问题。副作用例如肝损伤、肾损伤、胃肠损伤、血液损伤、或骨髓损伤等。更具体来说，例如作为DMARDs选择氨甲喋呤或来氟米特时，对于带有肝损伤、血液损伤、或骨髓损伤的自体免疫疾病(例如、关节风湿病)患者，由于副作用，氨甲喋呤或来氟米特服用困难。另外，给予开始时虽然没有出现这些症状，但持续给予期间出现这些副作用，导致持续给予这些DMARDs(氨甲喋呤或来氟米特)变得困难，或不得已减少给予量，或进一步增加DMARDs量变得困难。另一方面，使本发明的CaMK II抑制剂(例如、化合物(I)代表的式1的异唑衍生物)由于这些副作用没有或很少，所以对于用氨甲喋呤或来氟米特等DMARDs不能充分治疗的上述自体免疫疾病患者特别有效。另外通过将CaMK II抑制剂与DMARDs并用，由于可相互补充各自的作用，所以对于上述由于副作用不能给予可获得充分自体免疫疾病预防和/或治疗效果的DMARDs量的自体免疫疾病患者，通过将DMARDs与本发明的CaMK II抑制剂并用，与单剂给予的场合相比可以通过减少DMARDs给予量的方式提高有效性(预防和/或治疗效果)。因此，通过本发明可以提供副作用少，而且有效性高的综合良好的自体免疫疾病预防剂和/或治疗剂。
[0146]当DMARDs为低分子化合物、肽或抗体等蛋白质时，对于这些物质可以制备成通常用的一般药物组合物(医药制剂)的形态，根据其形态，可以经口或非经口给予。一般来说如以下那样的给予形态和给予方法。
[0147]作为给予形态，其代表性形态如片剂、丸剂、散剂、粉末剂、颗粒剂和胶囊剂等固体制剂，以及溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂等液剂等形态。各种形态可以根据给予途径分为经口给予剂和经鼻剂、经皮剂、直肠给予剂(栓剂)、舌下剂、阴道剂、注射剂(经静脉、经动脉、经肌肉、皮下、皮内)和点滴剂等非经口给予剂。例如，作为经口给予剂，可以采用例如片剂、丸剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液、悬浮液、乳液和糖浆等，或作为直肠给予剂和阴道剂可以采用例如片剂、丸剂、胶囊剂等形态。作为经皮剂也可以采用例如洗剂等液剂以及乳膏剂和软膏等半固体剂的形态。
[0148]作为注射剂，可以采用例如溶液、悬浮液或乳剂等形态，具体的如无菌处理的水、水-丙二醇溶液、缓冲液、0.4重量％浓度的生理盐水等。另外注射剂可以在制备成液剂后，进行冷冻处理或冷冻干燥处理，通过这种方式可以保存。后者的经冷冻干燥处理制备的冷冻干燥制剂在用时加注射用蒸馏水等再溶解后使用。
[0149]对于上述的药物组合物(医药制剂)的形态，可以通过在该领域运用的通常手法通过与DMARDs和药学上容许的载体配合制备。作为药学上容许的载体，如赋形剂、稀释剂、填充剂、增量剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、润滑剂和分散剂等。另外还可以配合在该领域中通常用的添加剂。这样的添加剂可以根据制备的药物组合物的形态，从例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、增粘剂、pH调整剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、香料、着色料、张力调节剂、螯合剂、表面活性剂等中适当选用。
具有这样形态的药物组合物可以根据治疗的疾病、靶器官等通过适当的给予途径给予。例如、可以经口给予、或静脉、动脉、皮下、皮内或肌肉内给予，或直接给予证实病变的组织本身，也可以经皮给予或直肠给予。
[0150]这些药物组合物中的DMARDs的给予量和给予次数要考虑到给予形态、患者的疾病或其病状的程度、患者的年龄、体重、一般的健康状态、性别、饮食、给予时间、排泄速度、药物的组合等，或其它要因后决定。典型的做法是有关与DMARDs和CaMK II抑制剂并用的各个成分的一日给予量为相对于它们单独给予时的实际情况(推荐临床给予量)最少推荐临床给予量的约1/50以上最大推荐临床给予量以下的范围。例如，作为DMARDs的给予量，通常对于成人，每天有效成分的量在约0.0001～约4000mg的范围、优选约0.001～约3000mg的范围、更优选约0.1～约300mg的范围，可以1天1次或分数次给予。另外，给予周期为1周，可以1周1次，或分2～3次给予。
作为各个DMARDs的具体的临床给予量和用法，如以下所示。如果是来氟米特，每天5-30mg、优选10-20mg，1天给予1次。如果是甲氨蝶呤，每周5-30mg、优选6-25mg，可以一次，或分2-3次给予。如果是柳氮磺吡啶，每天0.5-4g、优选1-3g，可以1天1次、或分2-3次给予。无论哪一种制剂最好是经口给予。它们的给予量在观察了与并用的CaMK II抑制剂的并用效果后，适当减量。
本发明的并用药还可以再与非类固醇类抗炎症药或肾上腺皮质类固醇药等并用。作为非类固醇类抗炎症药，具体来说如水杨酸类(阿司匹林等)、邻氨基苯甲酸类(甲芬那酸、氟芬那酸等)、吲哚醋酸类(吲哚美辛、舒林酸、阿西美辛等)、苯基醋酸类(双氯芬酸、芬布芬等)、丙酸类(布洛芬、酮洛芬、氯索洛芬、甲氧奈普酸、噻洛芬等)、吡罗西康类(吡罗西康、替诺西康、アンピロキシカム等)、吡唑酮类(ケトフエン、丁氯酮等)等。作为肾上腺皮质类固醇药，具体的如地噻米松、氢化可的松、可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙、曲安奈德、倍氯米松、氟轻松醋酸酯、氟轻松、卤泼尼松等。这些化合物可以被酯化，可以是钠盐等盐的形态，也可以是水和物等溶剂化物。
所谓本发明的“治疗效果”指的是对自体免疫疾病的治疗作用。如上所述，所谓对自体免疫疾病的治疗作用如发病后其症状减轻或改善的作用(缓和症状作用、改善症状作用)、抑制病状进行的作用(抑制进行作用)、抑制病状进展的作用(抑制进展作用)、或治愈疾病的作用(治愈作用)等。
当自体免疫疾病为关节风湿病时，本发明的“治疗效果”可以以关节风湿病患者的慢性炎症的抑制效果、关节破坏的抑制效果、关节变形的进行抑制效果和身体功能的改善效果等为指标，判断其效果。
[0155]所谓关节风湿病患者的“身体功能的改善”，指的是改善因滑膜的慢性炎症引起的关节的疼痛·膨胀等关节症状，通过抑制关节的破坏或变形，改善日常生活动作能力。日常生活动作能力，例如可以以穿脱衣类·打扮、起立、饮食、步行、卫生、伸展、握力和活动作为指标进行评价。具体来说，例如用患者的HAQ(HealthAssessment Questionnaire)(Fries JF，et al.，ArthritisRheumatism，23，p.137-145，1980)进行评价。
[0156]为了对关节风湿病的“治疗效果”进行评价，可以使用由美国风湿病学会制定的改善基准(ACR20；Felson Dt et al.TheAmerican College of Rheumatology preliminary definition ofimprovement in rheumatoid arthritis.，Arthritis Rheum，1995，38：p.727-735；1996，39：p.34-40)。
美国风湿病学会制定的改善基准(ACR20)：确认以下的1)和2)中20％以上的改善，而且在3)-7)5项中至少有3项确认有20％以上的改善时，可作为“由美国风湿病学会制定的基准：20％改善”(ACR基准20％改善)。
1)疼痛关节数的减少
2)膨胀关节数的减少
3)由患者进行的疾病活动性的整体评价
4)由主治医进行的疾病活动性的整体评价
5)由患者进行疼痛度评价
6)由患者进行的身体功能评价
7)CRP或血沉值
同样确认1)和2)中50％以上的改善，而且在3)-7)5项中至少有3项确认有50％以上的改善时，可作为“由美国风湿病学会制定的基准：50％改善”(ACR基准50％改善)。而确认1)和2)中70％以上的改善，而且在3)-7)5项中至少有3项确认有70％以上的改善时，可作为“由美国风湿病学会制定的基准：70％改善”(ACR基准70％改善)。
[0157]另外通过对利用X线像对手·足的关节破坏的进行度进行评价，可以评价抑制关节破坏效果，判断治疗效果。作为评价方法，例如可以使用Larsen评价或Sharp评价(Acta RadiologicaDiagnosis 18：481-491，1977；J Rheumatol 22(10)：1974-1975，1995；Bailliere’s Clinical Rheumatology：10(3)：435-453，1996)。
[0158]通过使用从满足ACR基准20％改善的患者的比例、满足ACR基准50％改善的患者的比例、满足ACR基准70％改善的患者的比例、或抑制关节破坏效果(X线)等评价指标中任意选择的指标，对CaMKII抑制剂或DMARDs任一个单独给予组(或两者的组)的治疗效果和并用给予组的治疗效果进行比较，可以评价本发明的CaMK II抑制剂与DMARDs并用的并用效果。
[0159]本发明中的所谓“由于副作用的原因，不能给予可获得充分的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的量的疾病缓解性抗风湿病药物(DMARDs)的自体免疫疾病患者”例如以下给出的患者，但不限定以下给出的。
(1)虽然已给予了通常用的该DMARDs的最大用量(以下称为“最大推荐临床给予量”)，但没有获得充分的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的患者；
(2)将给予该DMARDs的量从少量开始给予，边观察效果，边阶段地增加用量，但由于副作用的出现，不能再增加现在用量的患者；
(3)虽然以一定用量(此时的用量要考虑最大推荐临床给予量的情况，以及低用量两种情况)可以持续给予该DMARDs，但由于上述的脱逸现象(给予继续表现出耐性，显示出效果减弱的状态)，不能获得充分的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的状态的患者，由于副作用，对不能增加超过以上用量的患者；和
(4)对于由于给予该DMARDs易引起的副作用，存在易发生该副作用因素的患者，如如果单独给予该DMARDs，为了达到效果给予的推荐给予量因副作用认为危险的患者等。
作为具体的DMARDs的副作用如上所述。
[0160]对于这些自体免疫疾病患者，通过与本发明的CaMK II抑制剂并用给予，可不使DMARDs给予量增加，通过并用达到良好的自体免疫疾病预防和/或治疗效果。因此，通过减少副作用的方式，可以达到良好的自体免疫疾病预防和/或治疗效果。
[0161]所谓“充分的治疗效果”是通过从上述的各种评价指标选择的指标可评价的效果，但因患者的疾病和其病状等种种要因不同而有变化，例如对于关节风湿病的情况，可以以上述的“由美国风湿病学会制定的基准：20％改善”、或“由美国风湿病学会制定的基准：50％改善”等作为具体的基准给出。
[0162]在本发明的以下方式(1)和(2)中，就“超过治疗效果的总和”、和“超过治疗效果”的意思进行以下具体说明。
(方式1)作为与第2药物组合物共用，用于在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过通过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的总和，该第2药物组合物含有疾病缓解性抗风湿病药物，该第1药物组合物含有CaMK II抑制剂的组合物。
(方式2)作为与第2药物组合物共用，用于在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过通过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果，该第2药物组合物含有疾病缓解性抗风湿病药物，该第1药物组合物含有CaMK II抑制剂的组合物。
[0163]假设进行例如比较对照以下4组的试验。在A组和C组之间，将第1药物组合物的有效给予量(有效成分的给予量)做成相等，在B组与C组之间，将第2药物组合物的有效给予量(有效成分的给予量)做成相等。
P组：不给予药物组(或给予安慰剂组)
A组：单独给予第1药物组合物组
B组：单独给予第2药物组合物组
C组：第1药物组合物和第2药物组合物并用给予组
在该场合下，关于引人注目的特定的治疗效果指标(假如定为E)，当P、A、B和C组用指标E给出的效果分别为E(P)、E(A)、E(B)和E(C)时，上述“方式1”中的所谓“超过治疗效果的总和”，指的是C组的效果超过A组效果和B组效果的总和，即E(C)＞E(A)+E(B)。为了比较，通常作为E，使用与不给予药物组(或给予安慰剂组)比较的值，即E(P)＝0那样标准化的值。
而上述“方式2”中所谓“超过治疗效果”指的是C组的效果超过A组的效果，而且也超过B组的效果，即“E(c)＞E(A)，且E(C)＞E(B)。作为指标E，可以是定量的指标，也可以是定性的指标。作为定量的指标，例如满足上述的ACR基准20％改善的患者的比例和满足ACR基准50％改善的患者的比例等，作为定性的指标，例如通过上述的X线像评价的抑制手、足关节破坏的效果(通过评分进行的评价)等。
[0164]实施例
以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
在实施例中使用以下的化合物。
化合物(I)：3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑(例如，可以根据专利第3237608号说明书所述的方法合成)
式1a：
Figure A20058003740300901
化合物(Ib)：N’-{3-[1-(2-氟联苯基-4-基)-乙基]-异唑-5-基}-N，N-二甲基-胍盐酸盐(例如，可以根据专利第3237608号说明书所述的方法合成)
式1b：
Figure A20058003740300902
化合物(Ic)：N-乙基-N’-{3{1-(2-氟联苯基-4-基)-乙基1-异唑-5-基}-胍盐酸盐(例如，可以根据专利第3237608号说明书所述的方法合成)
式Ic：
Figure A20058003740300903
化合物(II)：4-[1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-2-(甲氨基)噻唑(例如，可以根据特公平4-80035号公报所述方法合成)
式2：
Figure A20058003740300911
KN-93：N-(2-[N{4-氯肉桂基]-N-甲基氨基甲基]苯基)-N-(2-羟乙基)-4-甲氧苯磺酰胺(可以根据特开平6-293730号公报所述的方法合成)
式3：
[0169]
Figure A20058003740300912
实施例1
[0170]实施例1抑制CaMK II活性的研究(1)
待测物质溶解于DMSO中，用CaMK II反应缓冲液(50mM Tris-HCl：pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇(DTT))(所有都为NakalaiTesque公司产品)稀释成各种浓度。将来自大鼠的CaMK II α(最终浓度0.75μg/ml)(Santa Cruz公司)在待测物质存在下与溶解于CaMK II反应缓冲液的Autocamtide-2(R)(40μM)(CALBIOCHEM公司)和CaMK II活化缓冲液(1mM CaCl2，1μM钙调蛋白)(NakalaiTesque公司)混合，再通过加ATP(50μM)(Nakalai Tesque公司)开始反应。反应于30℃下进行5分钟，然后加SDS-PAGE样品缓冲液，煮5分钟终止反应。反应液中的蛋白通过15％SDS-PAGE进行分离，印迹在PVDF膜上。使掺入到Autocamtide-2的磷与抗磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体(Santa Cruz公司)反应，使用ECL系统(Amersham公司)和NIH Image(可从http：//rsb.info.nih.gov/nih-image/下载)进行定量。
各待测物质的抑制CaMK II活性表示在表1中。显然无论那一个待测物质在1μM或10μM以上的浓度下都具有抑制CaMK II活性的作用。
表1.待测物质抑制CaMK II的作用
  待测物质   浓度   抑制率
  化合物(I)化合物(II)化合物(Ib)化合物(Ic)KN-93   1010.11010.11010.11010.11010.1   854739926245714213683611775825
实施例2
实施例2抑制CaMK II活性的研究(2)
CaMK II γ基因是通过根据GenBank的Accession No.L07044序列为基础合成的2种引物(5’-TC GGA TCC AGC ATG GCC ACC ACC GCCACC TG-3’[序列4]、5’-TA GAA TTC ACA CTG CAG CGG TGC GGC AGG[序列5])，和以根据定法制备的来自培养细胞Jurket T细胞的cDNA作为模板的PCR法制备的。制备的CaMK II γ基因用BamHI，EcoRI酶切，导入到转移载体pFastBacl的MCS。以该载体为基础制备、扩增表达病毒。详细讲根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen社)的手册进行。表达的CaMK II γ的纯化根据文献所述的方法(Biochemical & Biophysical Research Communications.173(2)：578-84，1990)进行。即通过超声波将表达细胞破碎，从经离心操作得到的细胞可溶性级分通过最终浓度60％的硫铵分级、钙调蛋白琼脂糖(Amasham Biosciences公司)柱的亲和层析纯化制备。表达的确认使用γ特异的抗CaMK II抗体、sc1541(SantaCruz公司)，用蛋白印迹法进行。
取代来自大鼠的CaMK II α，使用通过上述步骤制备的人CaMK IIγ，其它条件与实施例1同样，测定待测物质抑制CaMK II γ的活性。各待测物质抑制CaMK II的活性如表2所示。显然KN-93在1μM以上的浓度，化合物(I)在10μM以上的浓度，任一种都具有抑制CaMKII的活性。
表2.待测物质抑制CaMK II的作用
 待测物质   浓度   抑制率
 化合物(I)KN-93   3010130101   5733710710127
实施例3
实施例3对T淋巴细胞的作用
就化合物(I)和KN-93对用豆蔻酸佛波乙酯(PMA)和钙离子载体A23187刺激T淋巴细胞时产生IL-2的作用进行评价。
将EL-4细胞(小鼠T淋巴细胞细胞株)用含有10％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM：GIBCO社)培养，供实验用。按照5×104个/well的比例将细胞加到96孔板中，添加含被实验化合物的DMEM培养基和含刺激剂PMA和A23187的DMEM培养基，培养20小时。被实验化合物和刺激剂的最终浓度制备成化合物(I)为1-30μM、KN-93为1-10μM、PMA为25ng/ml、A23187为250ng/ml。将培养后板离心，用微量移液管回收上清。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法对上清中的IL-2量进行定量。定量方法根据试剂盒(MOUSEIL-2 Immunoassay；R & D Systems)的使用说明书实施。
就像图1所示那样，化合物(I)和KN-93剂量依赖性地抑制IL-2的产生。
实施例4
实施例4对巨噬细胞的作用
就化合物(I)和KN-93对用脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞时产生IL-6的作用进行评价。
将J774A.1细胞(小鼠巨噬细胞细胞株)用含有10％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM：GIBCO社)培养，供实验用。按照5×104个/well的比例将细胞加到96孔板中，添加含被实验化合物的DMEM培养基和含刺激剂LPS的DMEM培养基，培养24小时。被实验化合物和刺激剂的最终浓度制备成化合物(I)为1-30μM、KN-93为1-3μM、LPS为1μg/ml。将培养后的板离心，用微量移液管回收上清。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法对上清中的IL-6量进行定量。定量方法根据试剂盒(MOUSE IL-6 Immunoassay；R & DSystems)的使用说明书实施。
就像图2所示那样，化合物(I)和KN-93剂量依赖性地抑制IL-6的产生。
实施例5
实施例5对成纤维细胞增殖的作用
就化合物(I)和KN-93对用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激成纤维细胞时的细胞增殖的作用进行评价。
将L929细胞(小鼠成纤维细胞株)用含有10％胎牛血清MEMア-ル培养基(E-MEM：GIBCO公司)培养，供实验用。将细胞悬浮于不含血清的E-MEM，按照2×104个/well的比例将细胞加到96孔板中，培养72小时。添加含被实验化合物的E-MEM培养基后，培养1小时，添加含刺激剂重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的E-MEM培养基，培养20小时。向各孔中添加5-溴脱氧尿苷(Brd-U)溶液，于37℃下再培养4小时。固定细胞，用Cell proliferation ELISA system(Amersham)检测掺入的Brd-U，用微孔板式测读仪测定450nm的吸光度。将该吸光度值作为细胞增殖的指标。
就像图3所示那样，化合物(I)和KN-93抑制成纤维细胞的增殖呈剂量依赖性。
实施例6
实施例6对来自人滑膜细胞增殖的作用
就化合物(I)和KN-93对来自人滑膜株SW982细胞增殖的作用进行了评价。
将SW982细胞(人滑膜细胞株；从ATCC获得)用含有FCS(SIGMA社制)的DMEM培养基(GIBCO社制)培养，供实验用。将SW982在无血清下按照4×104/孔加到96孔平底板中。加细胞同时添加药剂，以200μl/孔进行培养。18小时后，向各个孔添加20μl alamar blue(BIOSOURCE公司)，再培养6小时，用微孔板式测读仪测定各个孔的吸光度。吸光度于570nm和600nm的2个波长下测定。当A1＝570nm的吸光度(加了细胞的孔)、A2＝600nm的吸光度(加了细胞的孔)、B1＝570nm的吸光度(只加了培养基的孔)、B2＝600nm的吸光度(只加了培养基的孔)时，算出(A1-A2)-(B1-B2)的值，作为细胞数的指标表示。
就像图4所示那样，作为CaMK II抑制剂的化合物(I)和KN-93抑制人滑膜细胞SW982的增殖呈剂量依赖性。这些结果表明CaMK II活性与SW982增殖的维持有关，化合物(I)和KN-93明显表现出通过抑制CaMK II诱导SW982细胞的死亡。
实施例7
实施例7对破骨细胞形成的作用
就化合物(I)和KN-93对破骨细胞形成的作用进行了评价。
採取患有胶原关节炎的小鼠的罹患足，于含10％胎牛血清的α-MEM培养基(GIBCO社)中在分散酶(合同酒造)和胶原酶S1(新田ゼラチン)存在下37℃下处理5-6小时，回收分散为单细胞的悬浮液。通过将该悬浮液离心、再悬浮进行清洗，供实验用。按照2×104个/well的比例将细胞加到96孔板中，添加含有被实验化合物的α-MEM培养基，培养9天。培养后使用TRAP染色用试剂盒(Sigma公司)进行染色，在显微镜下计测每个孔的破骨细胞数。TRAP染色根据试剂盒的使用说明书实施。
就像图5所示那样，化合物(I)和KN-93抑制破骨细胞的形成呈剂量依赖性。
实施例8
实施例8对佐剂诱发关节炎的作用
佐剂诱发关节炎模型是引起大鼠的典型的慢性炎症模型，被广泛用于抗炎症剂和抗风湿病剂的药理评价。在此使用该模型，通过治疗试验或预防发病试验研究化合物(I)和化合物(II)的效果。在治疗试验中，为了研究通过给予药物的抑制浮肿效果，算出给予期间前后的后肢体积的差，研究浮肿量的变化。在预防发病试验中，给予期间中随时测定后肢体积，研究药物经过一段时间的效果。而作为药效评价的指标使用后肢体积或浮肿量，所谓浮肿量是来自对佐剂不致敏的正常后肢体积的增加部分，无论那一个指标意义几乎相同，都可以使用。
(实验方法)
将Mycobacterium butyricum(佐剂)的液体石蜡悬浮液(1mg/200μl)注入到SD或Lewis大鼠(都是雄性、6周龄)的右侧后肢足蹠皮下诱发关节炎。从佐剂注入后第17天开始，将按照每100g体重1ml给予量制备的化合物(I)或化合物(II)的0.5％甲基纤维素悬浮液经口给予，1天1次，连续给予5天。作为阳性对照给予同样制备的吲哚美辛悬浮液。给予前和最终给予5小时后通过水置换法测定左右的后肢体积，算出刚给予前的值与最终给予5小时后的值的差作为浮肿量的变化。在预防发病试验中从注入佐剂当天开始1天1次，连续给予21天。隔日用水置换法测定左右后肢体积。而在化合物(II)的预防发病试验中作为对照同样给予抗风湿病药D-青霉胺悬浮液。另外作为对照，与上述同样只给予不含有被实验化合物的0.5％甲基纤维素。
(结果)
注入佐剂后10天前后，在左后肢(非注射足)发生关节炎，肢体积在第17天前后增大，达到最大值。图6给出了1天1次连续5天经口给予化合物(I)(2.5-80mg/kg)时的左后肢处浮肿量变化。图7给出了1天1次连续5天经口给予化合物(I)(10-50mg/kg)时的左后肢处浮肿量变化。另外图8给出了从佐剂注入的当天开始连续21天经口给予化合物(I)(2.5-80mg/kg)时的左右后肢体积。图9给出了从佐剂注入当天开始连续21天经口给予化合物(II)(50mg/kg)时的浮肿量。为了比较对照，阳性对照吲哚美辛(0.5mg/kg)、D-青霉胺(50mg/kg)和对照组的结果也一并表示在各图中。
就像图6和图7表示的那样，在通过注入佐剂引起的左后肢的浮肿达到最大值后开始给予的试验中，在化合物(I)与化合物(II)给予组中，看到显著的抑制浮肿效果。另外在左后肢呈现浮肿前开始给予的预防发病试验中就像图8和图9所示那样，化合物(I)和化合物(II)表现出显著的抑制浮肿效果。
实施例9
[0181]实施例9对胶原关节炎小鼠的作用
使用关节风湿病动物模型胶原关节炎小鼠，进行化合物(I)的药效评价。胶原关节炎的诱发根据常法进行。即在乙醚麻醉下，向小鼠(DBA/1J、雄性、日本チヤ一ルズリバ一)的尾根部注入0.1ml的乳剂，进行初次免疫。乳剂是将牛II型胶原溶液(2mg/ml胶原研修会)和氟氏完全佐剂(Difco)等量混合制作的。3周后，再将同组成的乳剂0.1ml注入尾根部，进行追加免疫，诱发关节炎。关节炎的程度通过根据以下基准进行的评价表示。
0：无症状
1：2关节以下的肿胀
2：3关节以上的肿胀/手足的轻度发红·浮肿
3：3关节以上的肿胀/手足的中度发红·浮肿
4：手足的重度的发红·浮肿/关节强直
为了对各肢用0-4点进行评价，1个个体可获得的最大评价为16。
化合物(I)和阳性对照泼尼松龙悬浮于0.5％甲基纤维素溶液，按照每10g小鼠体重0.1ml经口给予。对于对照组只是经口给予0.5％甲基纤维素溶液。给予与初次免疫同时开始，1天1次，连续实施35天。
其结果如图10和图11所示。对照组小鼠10只中有9只发生关节炎，其程度都为严重。而在给予化合物(I)的小鼠中，抑制发病呈剂量依赖性，关节炎的程度都轻微。
实施例10
[0182]实施例10对实验的变应性脑脊髓炎的作用
使用多发性硬化症动物模型实验的变应性脑脊髓炎小鼠进行KN-93的药效评价。实验的变应性脑脊髓炎的诱发根据Bradley等人的方法(J.Clinical Investigation，107：995-1006，2001)进行。即向7周龄的雌性SJL/J小鼠(从チヤ一ルズリバ一购入)的背后部皮下注射混合在Freund完全佐剂的PLP部分肽(PLP139-151：NH2-HSLGKWLGHPDKF-COOH；序列12)150μg。症状的严重程度根据如下基准进行的评价(病状评价)表示。
0：无症状
0.5：尾轻度麻痹
1：尾麻痹
2：轻度的后肢麻痹
3：从中程度到强度的后肢麻痹、或轻度的前肢麻痹
4：完全的后肢麻痹、或中程度至强度的前肢麻痹
5：处于四肢麻痹或死亡危险期
6：死亡
将KN-93悬浮于0.5％甲基纤维素溶液(0.1mg/ml)后，按照小鼠的每10g体重0.1ml皮下给予。对照组只是皮下给予0.5％甲基纤维素溶液。给予从致敏第7天开始，1天1次、连续实施24天。
其结果如图12所示。对照组的小鼠发生严重的实验的变应性脑脊髓炎，在试验期间中10只中有7只因神经麻痹死亡。而给予了KN-93(1mg/kg)的小鼠虽然也发病，但症状与对照组相比轻得多，死亡例，10只中有2只。
实施例11
[0183]实施例11对实验的变应性脑脊髓炎的作用
使用多发性硬化症动物模型实验的变应性脑脊髓炎小鼠进行化合物(I)的药效评价。实验的变应性脑脊髓炎的诱发根据Bradley等人的方法(J.Clinical Investigation，107：995-1006，2001)进行。即向7周龄的雌性SJL/J小鼠(由チヤ一ルズリバ一购入)的背后部皮下注射混合在Freund完全佐剂的PLP部分肽(PLP139-151)150μg。症状的严重程度根据如下基准进行的评价(病状评价)表示。
0：无症状
0.5：尾轻度麻痹
1：尾麻痹
2：轻度的后肢麻痹
3：从中程度到强度的后肢麻痹、或轻度的前肢麻痹
4：完全的后肢麻痹、或中程度至强度的前肢麻痹
5：处于四肢麻痹或死亡危险期
6：死亡
将化合物(I)悬浮于0.5％甲基纤维素溶液后分别制备8mg/ml(80mg/kg给予组)、4mg/ml(40mg/kg给予组)和2mg/ml(20mg/kg给予组)的给予液，按照小鼠的每10g体重0.1ml经口给予。在作为阳性对照的泼尼松龙组，将泼尼松龙悬浮于0.5％甲基纤维素溶液后，制备0.3mg/ml的给予液，按照每10g小鼠体重0.1ml经口给予。对于对照组只将0.5％甲基纤维素溶液给予皮下。给予从致敏日开始，1天1次、连续实施40天。在正常组，都不进行PLP139-151致敏和给予待测物质。其结果如表3、图13和图14所示。化合物(I)无论任一给予量都抑制病状评价，其作用呈剂量依赖性。而在对照组所有例(9只中9只)都发病、在试验期间中9只中有4只因神经麻痹死亡，相反在给予化合物(I)组中，在给予80mg/kg组中除了10只中有1只死亡以外，再没有死亡例。泼尼松龙强烈抑制发病(10只中只有2只发病)，与对照组和给予化合物(I)组不同，强烈抑制由于发育导致的体重的自然增加。这一结果是由于泼尼松龙连续给予的作用，成为对慢性病状进行长期给予时的问题。
即，表明CaMK II抑制剂化合物(I)并不伴随在代表的给予类固醇泼尼松龙组中看到的长期给予时的很强的体重增加抑制，而是用量依赖性地抑制实验的变应性脑脊髓炎的病状重症化。
表3.在实验的变应性脑脊髓炎小鼠中的效果
 待测物质   用量(mg/kg)   n   发病率   死亡率
 对照组正常组泼尼松龙化合物(I) 3204080   91010101010   9/90/102/108/107/108/10   4/90/100/100/100/101/10
实施例12
实施例12CaMK II在胶原关节炎(CIA)小鼠关节炎罹患部的表达
制作CIA小鼠关节炎罹患部的组织切片，通过免疫染色法研究CaMK II蛋白在炎症部位的表达。
CIA通过常法诱发。即在乙醚麻醉下，向小鼠(DBA/1J、雄性、日本チヤ一ルズリバ一)的尾根部注入0.1ml的乳剂，进行初次免疫。乳剂是将牛II型胶原溶液(2mg/ml胶原研修会)和氟氏完全佐剂(Difco)等量混合制作的。3周后，再将同组成的乳剂0.1ml注入尾根部，进行追加免疫，再饲养4周后，获取发生关节炎的小鼠的后肢，于4％多聚甲醛中进行固定。由固定的后肢制作病理组织标本，用于免疫染色。免疫染色使用ベクタステイン(R)ABC-PO(兔IgG)试剂盒(Vector社)，作为一次抗体使用经50倍稀释的家兔抗CaMK II多克隆抗体(M-176；Santa Cruz Biotechnology)，于湿盒内反应过夜。其它按照试剂盒的使用说明书实施。
如图15所示，在正常滑膜中几乎看不到CaMK II表达细胞，但在滑膜炎部位看到很多CaMK II表达细胞。另外如图16所示，在炎症亢进的血管翳(肉芽状组织)中也观察到很多CaMK II表达细胞。以上现象表明CaMK II与风湿病的病状形成有关。
实施例13
实施例13对IκBα分解的作用的研究
就化合物(I)和KN-93对用豆蔻酸佛波乙酯(PMA)与钙离子载体A23187刺激T淋巴细胞时的IκBα分解的作用进行评价。
将EL-4细胞(小鼠T淋巴细胞系细胞株)用含10％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM：GIBCO社)培养，供实验用。将增殖到接近汇合的细胞进行离心回收，按照5×106cells/tube分装到Eppendorf离心管。添加化合物(I)(终浓度30μM)或KN-93(终浓度10μM)，于37℃水浴下进行预温育后，用PMA(终浓度125ng/ml)和A23187(终浓度1μg/ml)进行刺激(总体积500μl)。刺激后进行15分或30分温育后，添加冰冷的终止液(1×PBS、1mMNa3VO4、5mM EDTA)1ml，使反应终止。离心清洗后，用TNE缓冲液(50mMTris-HCl、1％NP-40、20mM EDTA、100μg/ml PMSF、30μl/mlAprotinin、1mM Na3VO4、5mM NaF、12mMβ-甘油磷酸)溶解。进行12％SDS-PAGE后，将蛋白质转移到PVDF膜，使用抗IκBα抗体(C-21、Santa Cruz公司)进行蛋白印迹。
如图17所示，化合物(I)和KN-93抑制IκBα的分解。
实施例14
实施例14对细胞周期蛋白D1的表达以及对Akt磷酸化的作用的研究
对化合物(I)和KN-93对用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激成纤维细胞时的细胞周期蛋白D1的表达和Akt磷酸化的作用进行了评价。
将L929细胞(小鼠成纤维细胞株)用含10％胎牛血清的MEMア一ル培养基(E-MEM：GIBCO社)进行培养，供实验用。然后将细胞悬浮于不含血清的E-MEM培养72小时。添加含被实验化合物的E-MEM培养基后培养1小时，添加含刺激剂重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的E-MEM培养基后再进行培养。用RIPA缓冲液溶解细胞，得到全细胞裂解液。SDS-PAGE后，将蛋白质转移到PVDF膜上，使用抗细胞周期蛋白抗体或抗Akt抗体(都为Santa Cruz公司产品)进行蛋白印迹。
如图18和图19所示，化合物(I)和KN-93抑制细胞周期蛋白D1的表达增强，也抑制Akt的磷酸化。
实施例15
实施例15通过炎性刺激引起CaMK II表达变化
实验使用人单核系细胞株THP-1(由大日本制药购入)。使用含10％FCS(SIGMA)的RPMI1640培养基(GIBCO)将THP-1细胞配制成5×105cells/ml的浓度，然后向24孔板各个孔各加0.5ml。再各加入0.25μl用含10％FCS(SIGMA)的RPMI1640培养基(GIBCO)配成的4μg/ml的脂多糖(LPS：Difco)配成400U/ml的IFN-γ(ナカライテスク)，开始培养。对于无刺激组只添加含10％FCS(SIGMA)的RPMI1640培养基(GIBCO)。然后培养一段时间后回收细胞，通过RIPA缓冲液配制细胞溶解液后，使用蛋白量测定试剂盒(Bio-Rad DcProtein Assay：BIO RAD)对蛋白量进行定量。将细胞溶解液50μg添加到8-16％梯度胶(旭テクノグラス)上进行SDS-PAGE。转移到PVDF膜上后，与封闭剂(ECL Blocking agent：Amersham)反应1小时，然后与用封闭剂稀释了500倍的1次抗体抗CaMK II γ抗体(SantaCruz)或抗CaMKI1δ抗体(Santa Cruz)溶液于室温反应1小时。将膜洗净后，使该膜与用封闭剂稀释了2000倍的2次抗体horseradishi peroxidase标记抗山羊1gG抗体(Amersham)溶液反应40分钟。然后将膜洗净，使用ECL Plus(Amersham)检测印迹在膜上的蛋白。
结果如图20所示。显然在THP-1细胞中，通过炎性刺激可诱导CaMK II的表达。
实施例16
实施例16siRNA对来自人滑膜细胞增殖的作用
为了进-步明确CaMK II与自体免疫疾病的关系，设计、制作对CaMKII序列特异的siRNA，使用来自人滑膜细胞株SW982细胞研究CaMK II序列特异的siRNA的影响。
1.CaMK II序列特异的siRNA(small interfering RNA)的设计和制作
作为CaMK II序列特异的siRNA，根据CaMK II γ基因(GenBankAccession No.L07044)的碱基序列情报，设定如表4所示的3种特异的siRNA序列，从日本バイオサ一ビス购入由有义链与反义链形成的双链的siRNA(以下将3种siRNA分别称为CaMK II γsiRNA(A)、(B)和(c))。
表4.CaMK II γsiRNA的序列
 siRNA名   序列序 序列编号   位置
 (A)有义链(A)反义链(B)有义链(B)反义链(C)有义链(C)反义链   5’-CGUGAGGCUCGGAUAUGUCdTdT-3’5’-GACAUAUCCGAGCCUCACGdTdT-3’5’-CAUCCAAACAUCGUGCGCCdTdT-3’5’-GGCGCACGAUGUUUGGAUGdTdT-3’5’-GCAGAUGCCAGCCACUGUAdTdT-3’5’-UACAGUGGCUGGCAUCUGCdTdT-3’ 67891011   199-217229-247352-370
(“位置”表示登录在GenBank Accession No.L07044的CaMKII γ序列中的位置号。)
作为对照，使用用哺乳类中不存在的序列制作的siRNA ScrambleII Duplex(DHARMACON)。
2.对因CaMK II γ表达抑制引起的细胞增殖的效果
SW982细胞(从ATCC获得)用含有FCS(SIGMA)的DMEM培养基(GIBCO)进行培，供实验用。按照1×105cell/well将该细胞添加到24孔板中，24小时后向各个孔中加入CaMK II γsiRNA 3μl(60pmol)和GeneSilencer(Gene Therapy Systems，Inc)10.5μl。
为了研究siRNA的导入效率，取代CaMK II γsiRNA添加标记了荧光的siRNA荧光标记的荧光素酶GL2 Duplex(DHARMACON)。培养24小时后，导入效率通过流式细胞仪测定siRNA的掺入到细胞内的荧光标记的荧光素酶GL2 Duplex。而细胞内的CaMK II量，在siRNA导入3天后回收细胞，用RIPA缓冲液制备细胞溶解液后，用蛋白量测定试剂盒(Bio-Rad Dc Protein Assay：BIO RAD)对蛋白量进行定量，将其中50μg添加到8-16％梯度胶(旭テクノグラス)后进行SDS-PAGE。转移到PVDF膜后，与封闭剂(ECL Blocking agent：Amersham)反应1小时，然后与用封闭剂稀释了500倍的1次抗体抗CaMK II γ抗体(Santa Cruz)溶液于室温反应1小时。将膜洗净后，使该膜与用封闭剂稀释了2000倍的2次抗体辣根过氧化物酶标记抗山羊IgG抗体(Amersham)溶液反应40分钟。然后将膜洗净，使用ECLPlus(Amersham)检测印迹在膜上的蛋白。
细胞的增殖以Alamar Blue(R)的掺入为指标进行测定。即在导入siRNA后将细胞培养3天，然后换成不含血清的DMEM培养基，再培养24小时。之后向各个孔添加Alamar Blue(R)，1小时后用荧光光度计测定荧光强度(激发：544nm、波长：590nm)。
该结果确认在本实验条件下约80％的细胞导入了siRNA(图21和图22)。图23给出了通过CaMK II γ的表达量研究3种siRNA效果的结果。在SW982细胞中确认了CaMK II γ的表达，通过将(A)序列的siRNA导入细胞内观察到CaMK II γ的表达被抑制。另外在只导入了(A)序列的siRNA的细胞中证实增殖被抑制(图24)。
3.考察
就像上述所述那样，表明如果添加CaMK II抑制剂化合物(I)或KN-93，来自人滑膜细胞SW982细胞的增殖几乎完全被抑制(实施例6)，以及由在导入了作为抑制CaMK II γ表达的siRNA的CaMK II γsiRNA(A)的sw982，细胞增殖被抑制(本实施例)表明CaMK II γ的表达与SW982细胞的增殖有密切关系。这表明通过抑制CaMK II γ的表达，或抑制活性，可抑制滑膜细胞的异常增殖，因此可达到改善患关节风湿病等疾病的关节的病状(抑制慢性炎症、抑制关节破坏、抑制关节变形的进行等)。
实施例17
实施例17对佐剂诱发关节炎的并用效果
佐剂诱发关节炎模型是引起大鼠的典型的慢性炎症模型，被广泛用于抗炎剂和抗风湿病剂的药理评价。在此使用该模型，研究CaMK II抑制剂3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑(化合物(I))与DMARDs(来氟米特和柳氮磺吡啶)的并用效果。
(实验方法)
将Mycobacterium butyricum(佐剂)的液体石蜡悬浮液(1mg/200μl)注入Lewis大鼠(雄性、6周龄)的右侧后肢足蹠皮下诱发关节炎。从佐剂注入后第17天开始，将按照每100g体重0.5ml的给予量制备的化合物(I)(10mg/kg)和DMARDs(来氟米特(5mg/kg)或柳氮磺吡啶(400mg/kg))的0.5％甲基纤维素悬浮液单独或并用经口给予，1天1次，连续给予5天。刚给予前和最终给予5小时后通过水置换法测定左后肢体积，算出差作为浮肿量的变化。另外作为对照，与上述同样只给予不含有被实验化合物的0.5％甲基纤维素。
(结果)
注入佐剂后10天前后，在左后肢(非注射足)发生关节炎，肢体积在第17天前后增大，达到最大值。图25和图26给出了并用给予化合物(I)和作为DMARDs的代表例来氟米特或柳氮磺吡啶时的浮肿量的变化。为了比较对照，单独给予化合物(I)组、单独给予DMARDs组、和对照组的结果也一并表示在各图中。
就像图25和图26表示的那样，在通过注入佐剂引起的左后肢的浮肿达到最大值开始给予的试验中，在化合物(I)与DMARDs的并用给予组中，与单独给予化合物(I)或单独给予DMARDs组相比，看到显著的抑制浮肿效果。
实施例18
实施例18对佐剂诱发关节炎的并用效果
与实施例17同样对化合物(I)与DMARDs(甲氨蝶呤)的并用效果进行研究。
(实验方法)
与实施例17同样，对引发的佐剂诱发关节炎的大鼠，从注入佐剂的当天开始给予DMARDs(甲氨蝶呤(0.060mg/kg或0.045mg/kg；0.5％甲基纤维素悬浮液))，1天1次，连续给予21天经口给予。从致敏后第10天开始单独或并用给予化合物(I)(10mg/kg)，1天1次，连续给予12天经口给予。隔日通过水置换法测定左后肢体积。另外作为对照与上述同样只给予不含有被实验化合物的0.5％甲基纤维素。
(结果)
从注入佐剂当天开始给予作为DMARDs的代表例甲氨蝶呤(0.060mg/kg、0.045mg/kg)，从第10天开始并用给予化合物(I)(10mg/kg)时的左后肢体积如图27和图29所示，左后肢的发病率如图28和图30所示。用于比较对照，单独给予化合物(I)组、单独给予DMARDs组和对照组的结果也-并表示在各图中。
就像图27和图28所示的那样，在左后肢出现浮肿前开始给予DMARDs的试验中，即使在单独给予化合物(I)组几乎看不到效果的情况下，与单独给予DMARDs组的预防发病效果、抑制浮肿效果相比，化合物(I)与DMARDs的并用给予组一方表现出显著的预防发病效果、抑制浮肿效果。另外就像图29和图30所示那样，即使将在DMARDs单独给予组几乎看不到效果的用量与化合物(I)并用给予时，并用给予组都表现出显著的抑制浮肿效果。
实施例19
实施例19 对佐剂诱发关节炎的并用效果
与实施例17同样对大鼠佐剂诱发关节炎的并用效果进行研究。
(实验方法)
用与实施例17同样的方法引发关节炎，从注入佐剂的当天将按照每100g体重0.5ml的给予量制备的化合物(I)和作为DMARDs的代表例的甲氨蝶呤的0.5％甲基纤维素悬浮液单独或并用经口给予，1天1次，连续给予17天。刚给予前和最终给予后通过水置换法测定左后肢体积，再通过求出左后肢体积增加量的AUC(将给予期间对应于各时点值分别收集时的值的差对时间作图，得到的曲线的曲线下面积)。另外通过X线测定左后肢(非注射足)和右后肢(注射足)的关节破坏，以此作为评价指标也可以对并用效果进行评价。
(结果)
并用给予化合物(I)(20mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)时的浮肿量(左后肢体积的增加量，即，用初始时刻的体积与分次测量时的体积的差表示)的变化、和左后肢的发病率如图31和图32所示。同样并用给予化合物(I)(40mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)时的结果如图33和图34所示，并用给予化合物(I)(80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)时的结果如图35和图36所示。为了比较对照，单独给予化合物(I)和单独给予甲氨蝶呤和对照组的结果也-并表示在各图中。另外各用量、单独给予和并用给予的左后肢体积增加量的AUC(将给予期间中的各时点的体积增加量对时间作图，所得曲线的曲线下面积)汇总在图37中。
就像图31和图32所示那样，在从佐剂注入日开始给予的试验中，单独给予化合物(I)(20mg/kg)组表现出抑制浮肿效果，单独给予甲氨蝶呤(0.060mg/kg)组表现出预防发病效果和抑制浮肿效果，但并用给予化合物(I)(20mg/kg)与甲氨蝶呤组与各单独给予组比较表现出显著的抑制浮肿效果。另外，就像图33-图36所示那样，单独给予化合物(I)(40和80mg/kg)组和单独给予甲氨蝶呤(0.060mg/kg)组无论那一组都表现出预防发病效果和抑制浮肿效果，而此时化合物(I)(40mg/kg和80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)的并用给予组与各用量的单独给予化合物(I)组和单独给予甲氨蝶呤组中的任一组比较都表现出显著的预防发病效果和抑制浮肿效果。另外如图37所示那样，显然即使在以左后肢体积增加量的AUC作为指标时，化合物(I)(20、40、和80mg/kg)与甲氨蝶呤(0.060mg/kg)的并用给予组与各用量的单独给予组比较都表现出显着的抑制浮肿效果。
实施例20
[0195]实施例20对佐剂诱发关节炎的并用效果(抑制关节破坏效果)
与实施例17同样对大鼠佐剂诱发关节炎的并用效果进行研究。
(实验方法)
用与实施例17同样的方法引发关节炎，从注入佐剂的当天将按照每100g体重0.5ml的给予量制备的化合物(I)和作为DMARDs的代表例的甲氨蝶呤的0.5％甲基纤维素悬浮液单独或并用经口给予，1天1次，连续给予17天。最终给予后，对所有大鼠通过使它们吸收二氧化碳气实施安乐死。将两后肢从颈骨的中间部分切断。两后肢使用10％中性缓冲甲醛液固定。拍摄软X线像，用显微镜观察关节部位的构造。对关节破坏的程度进行评价，并纪录。观察部位取胫骨·踵骨·足根骨3个部位，可取得的最大评分定位12。
关节破坏评价
0：正常
1：轻度的关节与骨破坏和软骨的新生
2：中等度的关节与骨破坏和软骨的新生以及轻度的骨化化
3：重度的关节与骨破坏和骨化化
4：显着的关节和骨破坏和变形以及强度的骨化化
(结果)
图38汇总了通过于各用量(化合物(I)按照每日20，40或80mg/kg、甲氨蝶呤按照每日0.06mg/kg)下单独给予和并用给予的右后肢关节破坏评分。而有关对照组(图39)、单独给予甲氨蝶呤组(0.06mg/kgl图40)、单独给予化合物(I)组(40mg/kg；图41)和化合物(I)(40mg/kg)+甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组(图42)4个组，在表示各组中平均评分的个体代表例给出了关节炎大鼠右后肢的软X线像。
同样图43汇总了通过各用量下单独给予和并用给予的左后肢关节破坏评分。而有关对照组(图44)、给予组甲氨蝶呤单独(0.06mg/kg；图45)、单独给予化合物(I)组(40mg/kg；图46)和化合物(I)(40mg/kg)+甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组(图47)4个组，在表示各组中平均评分的个体代表例给出了关节炎大鼠左后肢的软X线像。
就像图38-图47所示那样，在从佐剂注入日开始给予的试验中，单独给予化合物(I)组对于左右两侧后肢表现出用量依赖性的抑制关节破坏效果。而化合物(I)通过与甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予，甲氨蝶呤引起的右后肢和左后肢的抑制关节破坏的效果呈剂量依赖性，而且显著增强。总之，化合物(I)(80mg/kg)+甲氨蝶呤(0.06mg/kg)并用给予组完全抑制左后肢的关节破坏，表现出极高的并用效果。
如以上所述，表明通过化合物(I)与甲氨蝶呤的并用给予，与各单独给予比较，获得显著优越的抑制关节破坏效果，该并用在关节风湿病的预防和/或治疗中表现出显著的有用性。
与以上所述的实施例同样，通过进行化合物(I)与除甲氨蝶呤以外的DMARDs的并用给予试验，可以确认并用效果。
实施例21
实施例21 对T细胞的并用效果
就化合物(I)与甲氨蝶呤对于用豆蔻酸佛波乙酯(PMA)和钙离子载体A23187刺激T淋巴细胞时的IL-2的产生的并用效果进行评价。
(实验方法)
将EL-4细胞(小鼠T淋巴细胞系细胞株)用含有10％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM：GIBCO公司)进行培养，供实验用。按照5×104个/well的比例将细胞将到96孔板，添加含有被实验化合物的DMEM培养基和作为刺激剂含有PMA和A23187的DMEM培养基，培养3天。被实验化合物做成化合物(I)与甲氨蝶呤的各单个试剂和并用，并用时的添加比率按照化合物(I)和甲氨蝶呤为10∶1那样进行阶段稀释制备。刺激剂的最终浓度PMA制备成25nM、A23187制备成250ng/mL。将培养后板进行离心，用微量移液器回收上清。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法对上清中的IL-2量进行定量。定量方法按照试剂盒(MOUSE IL-2I mmunoassay；R & D Systems)的使用说明书实施。
(Combination Index的算出方法)Combination Index(CI)用以下的方法算出。
fa/f＝(D/Dm)m...式(F1)
fa：由药剂引起的抑制率(fa＝1-f)...式(F2)
D：药剂浓度
Dm：IC50
m：药剂浓度-曲线的参数
由式(F1)和式(F2)得到
(1-f)/f＝(D/Dm)m...式(F3)
由式(F3)得到
D＝Dm×((1-f)/f)1/m
＝Dm×(fa/(1-fa))1/m...式(F4)
由化合物(I)、甲氨蝶呤(MTX)的单试剂处理时、并用处理时的实验结果，用式(F4)可分别求各自的D。
CI＝Dc1/Df1+Dc2/Df2+(Dc1×Dc2)/(Df1×Df2)...式(F5)
D1：化合物(I)的浓度
D2：MTX的浓度
加字母f：单剂
加字母c：并用
由式(F5)求CI，使用fa＝0.8时的CI进行评价。
CI＜1时表示协同效果，CI＝1时表示相加效果，CI＞1时表示拮抗。
(结果)
就像图48所示的那样，用The SAS system Release 8.2(SASInstitute Inc.)求得的于fa＝0.8(80％抑制浓度)的CI值是0.368(95％置信区间：0.144-0.619)。由此表明在并用化合物(I)和甲氨蝶呤时由T细胞产生IL-2的抑制效果是有意义协同效果(危险率5％)。
实施例22
实施例22对风湿病患者的并用效果
对于在甲氨蝶呤的治疗过程中认为甲氨蝶呤没有效果，或效果不理想的关节风湿病患者，除了甲氨蝶呤外，1日1次，饭后经口给予化合物(I)。甲氨蝶呤的用量与前治疗同量，或按照在每周6mg-25mg的范围适合患者状态进行选择。化合物(I)的用量，定为安慰剂、80mg/日和240mg/日(各组约100病例)。给予期间定为48周，在第24周，没有达到规定的有效基准的人除外(在疼痛关节数、膨胀关节数或血沉值任一项中确认有20％以上改善的情况定位达到规定的有效基准)。达到基准者维持盲检直至连续给药48周。在给予开始16周、24周后，通过将满足“由美国风湿病学会制定的基准(ACR基准)：20％改善”的患者的比例与给予安慰剂、80mg/日、240mg/日组间进行比较，可以评价通过化合物(I)与甲氨蝶呤的并用给予产生的有效性(化合物(I)导致甲氨蝶呤的关节风湿病治疗效果的增强作用)。而在本说明书的实施例中，有关ACR基准的3)由患者引起的疾病活动性的整体评价、4)由担当医引起的疾病活动性的整体评价，和5)由患者引起的愈痛度评价可以通过视觉模拟标度(VAS)评价。所谓“VAS(visual analog scale；视觉模拟标度)、100mm是评价者通过将评价表示为从0至100mm的线上进行评价的指标，以0至100的整数表示。线分的长度即使是100mm以外(例如200mm等)也可以，在本说明书中所谓VAS(视觉模拟标度)指的是在0至100的范围内进行评价的标度。
实施例23
实施例23对风湿病患者的并用效果
对于在甲氨蝶呤治疗过程中认为甲氨蝶呤没有效果，或效果不理想的关节风湿病患者，除了甲氨蝶呤外，1日1次，饭后经口给予化合物(I)。甲氨蝶呤的用量与前治疗同量，或按照在每周10mg-25mg范围适合患者状态下进行选择。给予期间定为48周，头24周，作为化合物(I)的用量，在双盲检测下给予安慰剂、120mg/日和240mg/日(各组约100病例，共计约300例)。在后24周，在非盲检测下(开放试验)对于所有的被实验者给予240mg/日。在给予开始24周后，通过将满足“由美国风湿病学会制定的基准(ACR基准)：20％改善”的患者的比例与给予安慰剂120mg/日和240mg/日组间进行比较，可以评价通过化合物(I)与甲氨蝶呤的并用给予产生的有效性(化合物(I)对于甲氨蝶呤的关节风湿病治疗效果的增强作用)。
实施例24
[0199]实施例24对风湿病患者的并用效果(抑制关节破坏的效果)
对于在甲氨蝶呤的治疗过程中认为甲氨蝶呤没有效果，或效果不理想的关节风湿病患者，除了甲氨蝶呤外，1日1次，饭后经口给予化合物(I)。甲氨蝶呤的用量与前治疗同量，或按照在每周6mg-25mg的范围适合患者状态下进行选择。化合物(I)的用量，定为安慰剂、80mg/日和240mg/日(各组约100病例)。给予期间定为48周，在第24周，没有达到规定的有效基准的人除外(在疼痛关节数、膨胀关节数或血沉值任一项中确认有20％以上改善的情况定为达到规定的有效基准)。达到基准者维持盲检直至连续给药48周。在给予开始48周后，通过X线像对手·足的关节破坏的进行度进行评价，评价抑制关节破坏的效果。通过将该效果与给予安慰剂80mg/日和240mg/日组间进行比较，可以评价通过化合物(I)与甲氨蝶呤并用给予产生的有效性(化合物(I)对于甲氨蝶呤的关节风湿病治疗效果的增强作用)。
实施例25
实施例25 对风湿病患者并用的效果(抑制关节破坏的效果)
对于在用甲氨蝶呤的治疗过程中认为甲氨蝶呤没有效果，或效果不理想的关节风湿病患者，除了甲氨蝶呤外，1日1次，饭后经口给予化合物(I)。甲氨蝶呤的用量与前治疗同量，或按照在每周10mg-25mg的范围适合患者的状态进行选择。给予期间定为48周，头24周，作为化合物(I)的用量，在双盲检测下给予安慰剂、120mg/日和240mg/日(各组约100病例，共计约300例)。在后24周，在非盲检测下(开放试验)对于所有的被实验者给予240mg/日。在给予开始24周、48周后，通过X线像对手·足的关节破坏的进行度进行评价，评价抑制关节破坏的效果。通过将该效果与给予安慰剂120mg/日和240mg/日组间进行比较，可以评价通过化合物(I)与甲氨蝶呤的并用给予产生的有效性(化合物(I)对于甲氨蝶呤的关节风湿病治疗效果的增强作用)。
上述所述的实施例(实施例17～25)表明通过CaMK II抑制剂(例如化合物(I)等)与DMARDs(例如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特等)并用，可以达到由它们单独的效果不能预测的显著优越的自体免疫疾病的预防效果和/或治疗效果，即CaMK II抑制剂与DMARDs并用在预防和/或治疗自体免疫疾病中表现出显著的有用性。
而由另外进行的大鼠和人的反复给予试验的结果判明为了使化合物(I)的血中浓度(AUC)相等，大鼠的给予量5mg/kg(1日1次经口给予)相当于人中给予量14.2～18.8mg/人(1日1次经口给予)。因此，认为在上述实施例中化合物(I)给予大鼠的1日给予量10～80mg/kg对应为人的1日给予量应为约28～约300mg/人。
产业上利用的可能性
本发明可以提供用于预防和/或治疗自体免疫疾病的优良的并用药。另外本发明可以提供为了探索获得可成为该并用药的有效成分的候选物质的有用的筛选方法。
序列表
序列1：抑制剂肽
序列2：抑制剂肽
序列3：抑制剂肽
序列4：引物
序列5：引物
序列6：siRNA
序列7：siRNA
序列8：siRNA
序列9：siRNA
序列10：siRNA
序列11：siRNA
序列12：PLP(139-151)
                                 序列表
<110>大日本住友制药株式会社
<120>用于治疗自体免疫疾病的并用药
<130>533923
<150>JP 2004-318771
<151>2004-11-02
<160>12
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抑制剂肽
<400>1
Lys Lys Ala Leu Arg Arg Gln Glu Ala Phe Asp Ala Tyr
1                5                    10
<210>2
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抑制剂肽
<400>2
Lys Lys Lys Leu Arg Arg Gln Glu Ala Phe Asp Ala Tyr
1                5                    10
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抑制剂肽
<400>3
Lys Lys Ala Leu His Arg Gln Glu Ala Val Asp Cys Leu
1                5                    10
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
tcggatccag catggccacc accgccacct g                                   31
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
tagaattcac actgcagcgg tgcggcagg                                        29
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA/正义1-19是RNA，20-21是DNA
<400>6
cgugaggcuc ggauauguct t                                                21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA/反义1-19是RNA，20-21是DNA
<400>7
gacauauccg agccucacgt t                                                21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA/正义1-19是RNA，20-21是DNA
<400>8
cauccaaaca ucgugcgcct t                                                21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA/反义1-19是RNA，20-21是DNA
<400>9
ggcgcacgau guuuggaugt t                                                21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA/正义1-19是RNA，20-21是DNA
<400>10
gcagaugcca gccacuguat t                                                21
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA/反义1-19是RNA，20-21是DNA
<400>11
uacaguggcu ggcaucugct t                                                21
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PLP(139-151)
<400>12
His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe
1                5                    10

Claims (49)

1.自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中含有CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物。
2.自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中含有用于与疾病缓解性抗风湿病药物并用的CaMK II抑制剂。
3.权利要求2所述的预防剂和/或治疗剂，在给予疾病缓解性抗风湿病药物的同时，分开或连续给予。
4.自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，其中含有CaMK II抑制剂，用于对于由于副作用的缘故，罹患不能给予获得充分的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的量的疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病的哺乳动物，在给予疾病缓解性抗风湿病药物的同时，分开、或连续给予。
5.权利要求4所述的预防剂和/或治疗剂，其中副作用是肝损伤、肾损伤和胃肠损伤中的一种或多种。
6.权利要求1～5中任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMKII抑制剂是式1表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式1：
Figure A2005800374030002C1
式中、D代表氢原子、卤素原子、羟基、巯基、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨甲酰基、可被取代的氨磺酰基、磺基、-R5、-OR5、-CO2R6、-SR7、-(CO)SR7、-(CS)OR7或-CS2R7(式中、R5代表可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的环链烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基，R6代表可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的芳基或可被取代的杂环基，R7代表可被取代的烷基或可被取代的芳基)，
A和B中的一方代表下式表示的基团，
Figure A2005800374030003C1
(E代表单键或亚烷基，
2条虚线，其中一条与实线一起表示双键，则另一条与实线一起表示单键，R1与氮原子结合，该氮原子与虚线和实线一起表示的单键结合，
R1、R2、R3和R4各自独立地代表氢原子、卤素原子、羟基、巯基、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨基甲酰基、可被取代的氨磺酰基、磺基、NH基的保护基、-R5、-OR5、-CO2R6、-SR7、-(CO)SR7、-(CS)OR7或-CS2R7(式中、R5、R6和R7与上述同义)，另外也可以R1、R2、R3和R4其中的任意两个结合在一起，与氮原子共同形成可被取代的杂环，此外，式：-NR3R4可以代表由式：-N＝C(NH2)NR43R44表示的基团，
R43和R44如以下的(1)或(2)所示：
(1)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n表示1～3的整数)、-(CH2)n-CO2R32(n与上述同义，R32代表碳原子数1～3的烷基)、-(CH2)n-CONR33R34(n与上述同义，R33和R34独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基)、-(CH2)m-OR35(m代表2或3，R35代表氢原子、碳原子数1～3的烷基或-(CH2)m-OR36(m与上述同义，R36代表氢原子或碳原子数1～3的烷基))、-(CH2)m-NR37R38(m与上述同义，R37和R38独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基，或R37和R38一起与氮原子共同表示吡咯烷、哌啶、氮杂环庚三烯、吗啉或N-甲基哌嗪(其中吡咯烷、哌啶、氮杂环庚三烯、吗啉和N-甲基哌嗪可被1或2个甲基取代))、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40各自独立地代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、苯基或吡啶基)，
(2)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基，所述5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代，
A和B中另一方代表由式：-J-G表示的基团，
式中、G代表可被取代的芳基、或可被取代的杂环基，J代表-C(R8R9)-或-C(＝CR8R9)-，R8和R9各自代表氢原子、可被取代的低级烷氧基、或可被取代的低级烷基，另外也可以R8和R9结合在一起，与碳原子共同形成可被取代的烃环、可被取代的1，3-二烷环或可被取代的1，3-二氧戊环。
7.权利要求6所述的预防剂和/或治疗剂，其中E是单键或低级亚烷基。
8.权利要求6或7任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中D为氢原子、硝基、氰基、羧基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的氨甲酰基、-R5或-CO2R6，式中、R5和R6与权利要求6中的意义同义。
9.权利要求8所述的预防剂和/或治疗剂，其中D是氢原子、羧基、-R5或-CO2R6，式中、R5和R6与权利要求6中的意义同义。
10.权利要求6～9任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中R1、R2、R3和R4各自独立，代表氢原子、羟基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的烷氧基、可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的环链烯基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基；或式：-NR3R4为由式：-N＝C(NH2)NR43R44(R43和R44与权利要求6中的意义同义。)表示的基团；或R1、R2、R3和R4中任意两个结合在一起，与氮原子共同形成可被取代的杂环。
11.权利要求10所述的预防剂和/或治疗剂，其中R1、R2、R3和R4各自独立，代表氢原子、羟基、可被取代的氨基、可被取代的羟氨基、可被取代的烷氧基、可被取代的烷基、可被取代的链烯基、可被取代的炔基、可被取代的环烷基、可被取代的芳基、可被取代的杂环基或酰基；或式：-NR3R4为由式：-N＝C(NH2)NR43R44(R43和R44与权利要求6中的意义同义)表示的基团；或R1、R2、R3和R4中的任意两个结合在一起，与氮原子共同形成可被取代的杂环。
12.权利要求6～11任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中G是可被取代的苯基、可被取代的萘基、可被取代的呋喃基、可被取代的噻吩基、可被取代的吲哚基、可被取代的异噻唑基、可被取代的苯并噻吩基、可被取代的异苯并呋喃基、可被取代的吡咯基、可被取代的苯并呋喃基、可被取代的咪唑基、可被取代的吡唑基、可被取代的异唑基、可被取代的异噻唑基、可被取代的噻唑基、可被取代的唑基、可被取代的苯并咪唑基、可被取代的苯并噻唑基、可被取代的苯并唑基、可被取代的吡啶基、可被取代的吡嗪基、可被取代的嘧啶基、可被取代的哒嗪基、可被取代的三嗪基、可被取代的喹啉基、可被取代的异喹啉基、可被取代的喹唑啉基、可被取代的喹啉基、可被取代的2，3-二氢-苯并[1，4]二二烯基或可被取代的咔唑基。
13.权利要求6所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式A1或式A2表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式A1：
式中、G1代表苯基、联苯基-4-基、3-苯甲酰苯基、4-苯甲酰苯基、1H-吲哚-2-基、1H-吲哚-3-基、1-甲基-1H-吲哚-2-基、1-甲基-1H-吲哚-3-基、2，3-二羟基-苯并[1，4]二二烯-6-基、1-苯并呋喃-5-基、1-苯并呋喃-6-基、喹啉基、异喹啉基、苯基吡啶基、苯基嘧啶基、苯基哒嗪基或苯基吡嗪基(其中苯基、联苯基-4-基、3-苯甲酰苯基、4-苯甲酰苯基、1H-吲哚-2-基、1H-吲哚-3-基、1-甲基-1H-吲哚-2-基、1-甲基-1H-吲哚-3-基、2，3-二氢-苯并[1，4]二二烯-6-基、1-苯并呋喃-5-基、1-苯并呋喃-6-基、喹啉基、异喹啉基、苯基吡啶基、苯基嘧啶基、苯基哒嗪基和苯基吡嗪基可被从氟原子、氯原子、溴原子、乙酰基、氰基、-CO2R29(R29代表碳原子数1～3的烷基，)和-CONR30R31(R30和R31独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基，)中任意选出的1或2个基团取代，)，
R23和R24独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、甲氧基或乙氧基、或一起表示亚甲基，
式：＝C(NR25R26)NR27R28如以下(1)、(2)或(3)所述：
(1)R25和R26如以下(a)或(b)所述、R27和R28如以下(c)或(d)所述：
(a)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与权利要求6中意义同义)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与权利要求6中的意义同义)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与权利要求6中的意义同义)，
(b)与氮原子一起代表5～7元饱和含氮杂环基，所述5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代，
(c)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义)、-(CH2)n-COR32(n和R32与上述同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义)，
(d)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(此处，5～7元饱和含氮杂环基可被由烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代)，
(2)R26和R27一起与2个氮原子、碳原子表示5～7元饱和含氮杂环基，此处，5～7元饱和含氮杂环基可被由烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代，
R25和R28各自独立地代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、乙酰基或-(CH2)m-OR36(m与上述同义，R36与权利要求6中的意义同义，)，
(3)式：＝C(NR25R26)NR27R28表示式：＝C(NR41R42)N＝C(NH2)NR43R44，
R41和R42如以下(a1)或(b1)所述，R43和R44如以下(c1)或(d1)所述：
(a1)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义)，
(b1)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基(5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代)，
(c1)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义)、-(CH2)m-NR37R37(m、R37和R38与上述同义)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义)，
(d1)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基，此处，5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代，
式A2：
Figure A2005800374030008C1
式中、G1、R23和R24与上述同义，
式：-N(R45)C(NR46R47)＝NR48如以下(11)或(21)所述：
(11)R45代表碳原子数1～3的烷基或乙酰基，R48代表氢原子、碳原子数1～3的烷基或乙酰基，
R46和R47如以下的(a2)或(b2)所述：
(a2)独立地代表氢原子、碳原子数1～4的烷基、-(CH2)n-COCH3(n与上述同义)、一(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述同义)、-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述同义)、苯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、四唑基、苯偶酰基、吡啶甲基、嘧啶甲基、哒嗪甲基、吡嗪甲基、四唑甲基、羟基、碳原子数1～3的烷氧基或-NR39R40(R39和R40与上述同义)，
(b2)与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基，此处，5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代，
(21)R45和R46与氮原子一起表示5～7元饱和含氮杂环基，其中5～7元饱和含氮杂环基可被从烷基、氨基、羟基、烷氧基、氧(代)基中任意选出的1或2个取代基取代，
R47和R48独立地代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、乙酰基或-(CH2)m-OR36(m和R36与上述同义)。
14.权利要求6所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式A3表示的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式A3：
Figure A2005800374030009C1
式中、G2代表2-氟-联苯基-4-基、2’-氟-联苯基-4-基或3-苯甲酰苯基，R49代表甲基，R50代表氢原子、甲基、甲氧基或乙氧基，
式：＝C(NR51R52)NR53R54如(12)、(22)或(32)所述，
(12)R51和R52如以下的(a3)、(b3)或(c3)所述、R53和R54如以下的(d3)、(e3)或(f3)所述，
(a3)独立地代表氢原子或碳原子数1～4的烷基，
(b3)一方表示氢原子，另一方表示-(CH2)n-COCH3(n与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与权利要求6中的意义同义，)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与权利要求6中的意义同义，)，
(c3)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶和4位被可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代，)，
(d3)独立地表示氢原子或碳原子数1～4的烷基，
(e3)一方表示氢原子，另一方表示-(CH2)n-COCH3(n与上述意义同义)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述意义同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述意义同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述意义同义，)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述意义同义，)，
(f3)与氮原子-起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶和4位被可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代，)，
(22)式：＝C(NR51R52)NR53R54代表由下式表示的基团：
Figure A2005800374030010C1
(式中、R55代表碳原子数1～3的烷基、乙酰基或-(CH2)m-OR56(m与上述同义，R56代表氢原子或碳原子数1～3的烷基，)，
(32)式：＝C(NR51R52)NR53R54代表式：＝C(NR57R58)N＝C(NH2)NR59R60，
R57和R58如以下的(a4)、(b4)或(c4)所述，R59和R60如以下的(d4)、(e4)或(f4)所述，
(a4)独立地表示氢原子或碳原子数1～4的烷基，
(b4)一方表示氢原子，另一方表示-(CH2)n-COCH3(n与上述意义同义)、-(CH2)n-CO2R32(n和R32与上述意义同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述意义同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述意义同义，)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述意义同义，)，
(c4)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位被可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、和4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代，)，
(d4)独立地代表氢原子或碳原子数1～4的烷基，
(e4)一方代表氢原子，另一方代表-(CH2)n-COCH3(n与上述意义同义)、-(CH2)n-COR32(n和R32与上述意义同义)、-(CH2)n-CONR33R34(n、R33和R34与上述意义同义)、-(CH2)m-OR35(m和R35与上述意义同义，)或-(CH2)m-NR37R38(m、R37和R38与上述意义同义，)，
(f4)与氮原子一起表示吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、或4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶(其中吡咯烷、氮杂环庚三烯、吗啉、噻唑啉、哌啶-2-酮、哌啶-4-酮、硫代吗啉、4位可被碳原子数1～3的烷基取代的哌嗪、4位被可被碳原子数1～3的烷氧基取代的哌啶、4-羟基哌啶、和4位可被1或2个的碳原子数1～3的烷基取代的氨基取代的哌啶都可被1或2个甲基取代，)。
15.权利要求6所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMK II抑制剂是式A4代表的异唑衍生物或其药学上容许的盐，
式A4：
Figure A2005800374030012C1
式中、G2、R49和R50与权利要求14中的意义同义，
式：＝C(NR61R62)NR63R64如以下的(13)、(23)或(33)所述，
(13)R63和R64都代表氢原子，
R61和R62如以下的(a5)、(b5)或(c5)所述，
(a5)独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基，
(b5)一方代表氢原子，另一方代表-(CH2)n-CO2R32(n和R32与权利要求6中的意义同义)、-(CH2)m-OR65(m代表2或3，R65代表氢原子、碳原子数1～3的烷基、2-羟乙基或3-羟丙基，)或-(CH2)m-NR66R67(m与上述同义，R66和R67独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基、或R66和R67与氮原子一起代表吡咯烷、哌啶、吗啉或N一甲基哌嗪(其中吡咯烷、哌啶、吗啉和N-甲基哌嗪可被1或2个甲基取代，))，
(c5)与氮原子一起代表吡咯烷、哌啶、吗啉或N-甲基哌嗪(其中吡咯烷、哌啶、吗啉和N-甲基哌嗪可被1或2个甲基取代，)，
(23)式：＝C(NR61R62)NR63R64表示由下式表示的基团：
Figure A2005800374030012C2
(R68代表碳原子数1～3的烷基、2-羟乙基或3-羟丙基，)，
(33)R61和R62与氮原子一起代表吗啉，R63和R64一起表示氨基-吗啉-4-基-亚甲基。
16.权利要求15所述的预防剂和/或治疗剂，其中G2为2-氟-联苯基-4-基或2’-氟-联苯基-4-基、R50是氢原子或甲基、R63和R64都是氢原子、R61和R62如以下的(a6)或(b6)所述。
(a6)独立地代表氢原子或碳原子数1～3的烷基；
(b6)与氮原子一起代表吗啉(吗啉可被1或2个甲基取代。)。
17.权利要求1～5任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中CaMKII抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
18.权利要求1～17任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中疾病缓解性抗风湿病药物是从下述选出的1个或多个药剂：
来氟米特、甲氨蝶呤、D-青霉胺、布西拉明、柳氮磺吡啶、阿克扎利、氯苯扎利、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、咪唑立宾、硫唑嘌呤、金诺芬、金硫丁二钠、aurotiosulfate、金硫葡糖、环孢菌素、硫酸羟氯喹、氯喹、他克莫司、伊那西普、英夫利昔单抗、阿那白滞素、凯利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和人源化抗IL-6R抗体。
19.权利要求18所述的预防剂和/或治疗剂，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
20.权利要求1～19任一项所述的预防剂和/或治疗剂，其中自体免疫疾病是选自下面的任一种疾病：
关节风湿病、全身性红斑狼疮、圆板状红斑狼疮、多发性肌肉炎、强皮症、混合结缔组织病、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒症、恶性贫血、Good-pasture综合征、急性进行性肾小体肾炎、重症肌无力症、寻常性天疱疮、水疱性类天疱疮、胰岛素抗性糖尿病、青年性糖尿病、I型糖尿病、艾迪生病、萎缩性胃炎、男性不育症、早发性更年期、晶状体原性眼色素膜炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、自体免疫性血液性疾病、自体免疫性溶血性贫血、突发性血小板减少症、发作性血色素尿症、突发性血小板减少性紫瘢病、间质性肺腺维症和肖格伦综合征。
21.权利要求20所述的预防剂和/或治疗剂，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
22.作为有效成分含有CaMK II抑制剂的增强剂，它能增强疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果。
23.权利要求22所述的增强剂，其中CaMK II抑制剂是通过包括下述的步骤(a)、(b)和(c)的筛选方法选择的物质：
(a)使待测物质与CaMK II酶和底物接触的步骤、
(b)测定通过接触了待测物质的CaMK II酶所引起的底物的磷酸化水平，将该磷酸化水平与不接触待测物质的对照酶的上述磷酸化水平进行比较的步骤、
(c)根据上述(b)的比较结果，选择抑制CaMK II活性的待测物质的步骤。
24.权利要求23所述的增强剂，其中CaMK II抑制剂是于10μM浓度下对CaMK II的抑制率在30％以上的物质。
25.权利要求22所述的增强剂，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
26.权利要求22～25任一项所述的增强剂，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
27.权利要求22～26任一项所述的增强剂，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
28.用于与第2药物组合物共用在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果的总和，其中该第2药物组合物是含有疾病缓解性抗风湿病药物的组合物、该第1药物组合物是含有CaMK II抑制剂的组合物。
29.用于与第2药物组合物共用在罹患自体免疫疾病的哺乳动物中达到自体免疫疾病预防和/或治疗效果的第1药物组合物，该效果超过分别给予该第1和第2药物组合物达到的自体免疫疾病预防和/或治疗效果，其中该第2药物组合物是含有疾病缓解性抗风湿病药物的组合物、该第1药物组合物是含有CaMK II抑制剂的组合物。
30.权利要求28或29任一项所述的组合物，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
31.权利要求28～30任一项所述的组合物，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
32.权利要求28～31任一项所述的组合物，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
33.包含以下(1)和(2)的商业包装：
(1)含有CaMK II抑制剂的药物组合物；
(2)有关记载该药物组合物的记载物，它记载该药物组合物与疾病缓解性抗风湿病药物并用，可以在自体免疫疾病预防和/或治疗用途中使用或者应该使用。
34.包含以下的(1)和(2)的商业包装：
(1)含有CaMK II抑制剂的药物组合物；
(2)有关记载该药物组合物的记载物，它记载该药物组合物可以在增强疾病缓解性抗风湿病药物所致的自体免疫疾病预防和/或治疗效果用途中使用或者应该使用。
35.权利要求33或34所述的商业包装，其中CaMK II抑制剂是3-[(1S)-1-(2-氟联苯基-4-基)乙基]-5-{[氨基(吗啉-4-基)亚甲基]氨基}异唑或其药学上容许的盐。
36.权利要求33～35任一项所述的商业包装，其中疾病缓解性抗风湿病药物是甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶或来氟米特。
37.权利要求33～36任一项所述的商业包装，其中自体免疫疾病是关节风湿病。
38.自体免疫疾病预防和/或治疗用的试剂盒，包装内含有包含CaMK II抑制剂的第1组合物、和包含疾病缓解性抗风湿病药物的第2组合物。
39.CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物在制造用于自体免疫疾病预防和/或治疗用的药物组合物中的使用。
40.CaMK II抑制剂在制造其特征是与疾病缓解性抗风湿病药物并用的、用于自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂中的使用。
41.CaMK II抑制剂在制造用于增强疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病的预防和/或治疗效果的增强用药物组合物中的使用。
42.预防和/或治疗自体免疫疾病的方法，其特征是将CaMK II抑制剂与疾病缓解性抗风湿病药物并用给予。
43.疾病缓解性抗风湿病药物所致自体免疫疾病预防和/或治疗效果的增强方法，包括给予CaMK II抑制剂。
44.自体免疫疾病的预防和/或治疗方法，包括对罹患通过使用疾病缓解性抗风湿病药物不能获得充分预防和/或治疗效果的自体免疫疾病的哺乳动物，给予对增强疾病缓解性抗风湿病药物的自体免疫疾病预防和/或治疗效果有效量的CaMK II抑制剂。
45.自体免疫疾病的预防剂和/或治疗剂，由CaMKH抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物组合而成。
46.药物，由CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物组合而成。
47.关节破坏抑制剂，含有CaMK II抑制剂和疾病缓解性抗风湿病药物。
48.关节破坏抑制剂，含有用于与疾病缓解性抗风湿病药物并用的CaMK II抑制剂。
49.疾病缓解性抗风湿病药物所致的关节破坏效果的增强剂，其中作为有效成分含有CaMK II抑制剂。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20071010