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CN101044161A - 纯化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白（agp）组合物 - Google Patents

纯化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白（agp）组合物 Download PDF

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CN101044161A CNA2005800355154A CN200580035515A CN101044161A CN 101044161 A CN101044161 A CN 101044161A CN A2005800355154 A CNA2005800355154 A CN A2005800355154A CN 200580035515 A CN200580035515 A CN 200580035515A CN 101044161 A CN101044161 A CN 101044161A
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agp
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acid
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万堤它·斯瑞瓦斯它哇
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Abstract

本发明涉及一种通过选择性方法从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的纯化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白(AGP)组合物。同样涉及一种从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的纯化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白(AGP)组合物，其具有一种或多种以下的效果：免疫抑制、淋巴细胞转化免疫抑制，细胞因子调节如IL－2抑制、IFN－γ抑制、或IL－10诱导；角质细胞增殖抑制，角质分离活性和在小鼠耳肿实验(MEST)中的抑制活性。

Description

纯化的阿拉伯半乳聚糖－蛋白（AGP）组合物
技术领域
本发明涉及通过选择性方法从蓟罂粟(Argemone mexicana)植物的叶和/或茎分离得到的一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物。
本发明也涉及从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物，其具有一种或多种如下效果：免疫抑制、淋巴细胞增殖抑制、细胞因子调节如IL-2抑制、IFN-γ抑制或IL-10诱导；角质细胞增殖抑制、角质分离活性以及在小鼠耳肿实验(MEST)中的抑制活性。
缩写/符号说明
阿拉伯半乳聚糖-蛋白(Arabinogalactan-Protein)：AGP
高分子量阿拉伯半乳聚糖-蛋白：AGP-HM
低分子量阿拉伯半乳聚糖-蛋白：AGP-LM
附图说明
图1：纯化的AGP组合物的选择性分离方法的流程图。
图2：表示AGP组合物的建议结构。
图3：表示AGP组合物的IL-10诱导效果。
图4：表示AGP组合物的IL-2百分比抑制效果。
图5：表示AGP组合物的IFNγ百分比抑制效果。
图6：表示AGP组合物的GMCSF抑制效果。
图7：表示AGP组合物的人类TNFα抑制效果。
图8：表示AGP组合物对NGF诱导的人类角质细胞的增殖效果。
图9：表示AGP组合物对NGF诱导的人类角质细胞的增殖效果。
图10：表示AGP组合物对PPD激发豚鼠的皮肤厚度的效果。
图11：表示AGP组合物在TPA(12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯)诱导Balb/c小鼠表皮厚度的抑制效果。
图12：表示AGP组合物在DNFB诱导雌性C(57)BL/6小鼠的小鼠耳肿实验中的效果。
背景技术
银屑病是一种皮肤病，其特征为发炎和异常的表皮角质细胞过量增殖导致表皮增生、变厚以及产生红色鳞斑。根据特殊的临床症状来识别慢性皮肤病，特征是外周红色的斑上覆盖白色的鳞片导致发痒、鳞片状皮肤。银屑病是一种非常明显的疾病，常常发作于面部，头皮，躯干和四肢。这种慢性疾病对身体的损害随病情的缓解和加重而变化。
虽然银屑病显然是一种皮肤病，但是不遵从任何理论的，它被认为是一种细胞调节减弱或有缺陷的免疫疾病。由于银屑病的临床症状主要是表皮变化引起的，因此这种疾病通常被认为是角质细胞过度增殖和异常分化。目前的证据表明银屑病中的表皮变化是由皮肤病变区域的T淋巴细胞的活动引起，T淋巴细胞诱导或维持疾病的进程。银屑病被描述为一种自体免疫疾病，其中活化的T淋巴细胞产生多种细胞因子导致继发性表皮异常。病变的淋巴细胞制造细胞因子以刺激凋亡-抵抗角质细胞的增殖。银屑病皮肤病变的特点是发炎，伴随T细胞和中性粒细胞渗透真皮和表皮，并且产生与表皮过量增殖和角质细胞异常分化相关的鳞屑[Reich K.，Garbe C，Blaschke V.，Maurer C，Middel P.，Westhal G.，Lippert U.，andNeumann C，J.Invest.Dermatol，2001，116，319]。
自体免疫紊乱是身体对自身组织产生的免疫反应疾病。自体免疫疾病的病因不为人所知，但是在很多自体免疫疾病的发展过程中似乎存在遗传易患病体质。
在少数几种自体免疫疾病(例如风湿热)中，细菌或病毒触发免疫反应，抗体或T-细胞攻击正常细胞，因为它们某些部分的结构和感染病菌的部分结构相似。
自体免疫疾病分为两种常规类型：损害许多器官的(系统性自体免疫疾病)，以及那些仅仅只有一个单独的器官或组织直接被自体免疫过程直接损害的(局部的)。自体免疫紊乱最常见的一些类型归纳如下：
系统性自体免疫疾病 局部自体免疫疾病
风湿性关节炎(关节；少数情况下是肺、皮肤) I型糖尿病(胰岛)
狼疮[系统性狼疮](皮肤、关节、肾、心脏、大脑、血红细胞，其它) 淋巴瘤性甲状腺肿，Graves病(甲状腺)
硬皮病(皮肤、肠，少数情况下是肺) 腹腔疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎(消化道)
干燥综合症(唾液腺、泪腺、关节) 多重硬化*、格林巴利综合症(大脑)
古德帕斯彻氏综合症(肺、肾) 阿狄森氏病(肾上腺)
韦格纳肉芽肿病(窦、肺、肾) 原发性胆硬化、硬化性胆管炎、自体免疫性肝炎(肝脏)
发炎过程包括一系列可能被众多因素引起的事件(例如感染试剂，缺血，抗原-抗体相互作用，以及热或其它物理性损伤)。每种类型的刺激因素激发一种特定的应答方式，代表一种相对微小的主题变化。从宏观水平看，应答通常伴随着熟悉的临床症状，即红斑、水肿、压痛和疼痛。
对银屑病患者观察到的症状包括表皮细胞增生和异常角质化(归因于高代谢导致的细胞过度更新)、表皮层炎症反应减弱、血管舒张和白细胞迁移并渗透到表皮细胞层中。然而，目前认为表皮增生是对病灶皮肤区域的免疫系统活化的反应，其依次通过聚集在患病皮肤中的CD8+和CD4+T淋巴细胞调节。的确，银屑病现在被认为是人类最普遍的T细胞调节的炎性疾病。因此，银屑病的症状表现为角质细胞的过快生长并且从皮肤表面脱落。在银屑病患者的病变区域中，角质细胞细胞更新时间缩短了大约8倍(36，正常皮肤311小时)，分化细胞的数目加倍，导致表皮增生。药物治疗着眼于减缓该过程。
已经发现PUVA治疗耗尽淋巴细胞，和疾病的改善相呼应。这些数据与T细胞在发病机理中的角色相一致。环孢霉素是一种已知的免疫抑制剂，对于疾病活性具有重大的效果。由于环孢霉素对T细胞活性具有主要的抑制效果，因此有人认为银屑病根本上是一种炎性疾病。
T淋巴细胞必须渗透到真皮然后粘附到角质细胞上以产生银屑病斑。因此，分子调节的T细胞黏附和穿越成为合理的治疗靶标，并且其在病理生理学中的角色非常重要。通过阻滞趋化因子触发反应或阻滞整合素结合反应(LFA-I至ICAM-I)来抑制血管内黏附的发生。整合素阻滞或减少其表面表达对淋巴细胞穿越很重要，能够辅助治疗银屑病。
已经知道，抗银屑病活性涉及到免疫抑制、淋巴细胞增殖抑制、细胞因子调节如IL-2抑制、IFN-γ抑制或IL-10诱导；角质细胞增殖抑制、角质分离活性、MEST中的抑制活性。
用于改善银屑病的不同的甚至是毒性治疗的次数是这种疾病抵抗性质的证据。由于大多数(90％)银屑病病人具有该疾病的有限类型，局部治疗可以使用包括地蒽酚、焦油制品、皮质甾类以及最近提出的维生素D3类似物(钙泊三醇、骨化三醇)。少数(10％)银屑病病人情况更为严重，对于他们使用一些系统性治疗形式。特定的系统性治疗包括UVB、PUVA、甲氨蝶呤、维生素A衍生物(阿维A)和免疫抑制剂如环孢霉素A。环孢霉素和FK-506的有效性证明了T细胞是银屑病主要诱因的假说。
皮质甾类的局部作用在于减轻银屑病的症状。然而，当需要长时间对银屑病患者病变区域进行给药治疗时，必须增加剂量或者使用更强的药物从而引起药物耐受性，即会导致萎缩和色素缺乏或正常皮肤周边失去色素[British National Formulary(BNF)，March 2001，No.41]。
利用光学治疗方法(用紫外线照射)或者光化学治疗方法，其包括补骨脂素体外或体内给药，以及用长波紫外线照射感染区，伴随着如加速老化或皮肤色素沉着和致癌的缺点[British National Formulary(BNF)，March2001，No.41]。
和甾体相比，体外使用煤焦油伴随较少的副作用，但是比较脏而且具有包括强烈异味和腐蚀皮肤等的缺点。甚至可能导致刺激性皮炎。
尽管甲氨蝶呤是一种治疗银屑病患者的可选药物，但是需要谨慎监测，因为它可能会导致肝脏损害和/或减少载氧血红细胞的产量、抗炎白血球和促凝血小板。长期使用补骨脂素和甲氨蝶呤会显著增加银屑病患者患鳞状细胞癌的风险[Stern R.S.，and Laird N.，Cancer，1994，73，2759]。
顽固性银屑病患者可以内服类视色素如阿维A；然而它是致畸的，并且可能在体内长期累积，因此怀孕期间禁用[Stern R.S.，and Laird N.，Cancer，1994，73，2759]。
使用大环免疫抑制剂如环孢菌素、他克莫司和子囊霉素可能损伤肾功能或引起高血压。羟基脲可能引起贫血以及白血球和血小板的减少。
钙泊三醇(一种合成维生素D3的类似物)是一种广泛描述的银屑病治疗剂。然而，其比潜在表面皮脂甾类更严重地刺激皮肤。通常的副作用包括损害或外周损害刺激、面部或头皮刺激或急性发作银屑病[Ashcroft D.M.，Wan Po A.L.，Williams H.C.and Griffiths C.E.M.，BMJ，2000，320，963]。
目前的治疗银屑病的生物技术方法涉及到细胞增殖方面或者疾病免疫组分方面的直接药物调节发作。已经知道免疫生物学的免疫抑制剂如Clenoliximab、MEDI-507、ICM3、IDEC-114、SMART Anti-CD3、Zenapax、Amavive、HuI 134、Xanelim、HuMaxCD4、IC747、IDEC-114 IDEC-131、Nuvion、DAB389IL-2、ONTAK和Etarnercept能够阻滞不同阶段的免疫应答，它们目前正处于不同的临床测试阶段。
然而，上述提到的治疗剂没有一种是广泛安全和有效的。银屑病的影响大小类似于其它疾病如抑郁症、高血压和充血性心力衰竭。在美国治疗该疾病的平均费用是每人每年800美元，且该疾病可导致生产力的重大损失[Feldman S.R.，American Academy of Dermatology，August 2000]。
由于其散发性的过程，该疾病对治疗剂的反应不同，也可能具有不利作用。因而，它是一种难以治愈的疾病。银屑病的毁灭性本质被其副作用的程度所加重，患者希望疾病得到缓解，他们知道疾病迟早会复发。
并且，除了临床上的表现和不便，疾病对病人的心理冲击是巨大的。银屑病是一种复杂疾病，影响到病人的各方面情感并且损害病人的身体，实质上降低了全世界数以百万计患者的生活质量。加之其经常是清楚可见的，因此使患者遭受痛苦、窘迫和不舒服[Fortune D.G.，Richards H.L.，Main C.J.，and Griffiths C.E.M.，J.Am.Acad.Dermatol，1998，39，196]。
我们美国专利公开文本2003/0194456A1公开一种植物来源的组合物，它提供了一种安全的、耐受性好且有效的银屑病治疗剂，克服了现有治疗剂的缺点和限制。
美国专利公开文本2003/0194456A1公开了有用的治疗剂/组合物的体内外免疫学和药理学活性，该治疗剂包括蓟罂粟植物的叶和/或茎的萃取物，或者与孜然(Cuminum cyminum)植物果实的萃取物联合使用，用于治疗和预防银屑病和其它的疾病。所述萃取物(可以是一种水、乙醇或水-乙醇萃取物)除了表现出有用的免疫学和药理学活性，还显著降低了银屑病的区域和冲击指数(PASI)分值，在正常的可接受的限度范围内有较好的耐受性。作为患有慢性斑型银屑病的患者的概念性研究的证据，当将一种包含上述提到的萃取物的组合物进行口服给药时，PASI得分从6.33±2.84降至0.90±1.27，一些病人治疗8周之后病愈。
美国专利公开文本2003/0194456A1中进一步报道了蓟罂粟植物的叶和/或茎的萃取物的急性毒性(LD50)：在小鼠和大鼠通过口服和/或静脉给药方式的评价中，每kg动物体重给药量＞1000mg/时有50％的死亡率。
需要说明的是，蓟罂粟植物由各种化合物组成，尤其包括：
i)生物碱，如金英花碱、硝基金英花碱、小檗碱、硝基小檗碱、隐品碱、别隐品碱、黄连碱、盐酸血根碱、二氢盐酸血根碱、去甲血根碱、6-丙酮基二氢盐酸血根碱、二氢白屈菜红碱、白屈菜红碱、去甲基白屈菜红碱、6-丙酮基二氢白屈菜红碱、(-)cheilanthifolin、(-)-[β]-延胡索单酚碱methohydroxide、(-)-[a]-刺罂粟碱(-)-[a]和[β]-刺罂粟碱methohydroxides、(-)-cheilanthifolin、6-丙酮基二氢盐酸血根碱、(-)-[a]-四氢掌叶防己碱methohydroxide、瑞枯灵、白蓬草福林、隐品巴马亭、argemonine、norargeminine、argemexicaine A、argemexicaine B、N-去甲基氧基(demethyloxy)盐酸血根碱；(+)-1，2，3，4-四氢-1-(2-羟基甲基-3，4-二甲氧基苯基甲基)-6，7-亚甲二氧基-异喹啉、helleritrine和oxyhydrastinine；
ii)黄酮类，如异鼠李素、异鼠李素-3-葡糖苷；异鼠李素-3-O-葡糖苷、异鼠李素-3，7-二葡糖苷；3-甲氧基槲皮素、槲皮素5，3′，4′三甲基酯；木犀草素、argemexitin和北美圣草素；
iii)脂肪酸，如软脂酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、月桂酸、山俞酸、木蜡酸、十六碳烯酸、蓖麻油酸、11-氧-三十烷酸和11-羟基-三十烷酸；
iv)氨基酸，如组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、丝氨酸、天门冬酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、羟基辅氨酸、辅氨酸、L-谷酰胺、羟基辅氨酸、β-丙氨酸和天门氨酸；
v)碳水化合物，如葡萄糖、果糖和葡糖苷；
vi)有机酸，如琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸和苹果酸；和
vii)其它化合物，如蜡醇、β-谷甾醇、硝酸钾、磷酸钙和硫酸钙。
根据美国专利公开文本2003/0194456A1，利用萃取过程如浸泡和过滤，使用水、乙醇和它们的混合物，从蓟罂粟植物的叶和/或茎得到的萃取物实质上包括所有上述化合物。换句话说，该萃取物由供萃取植物部分中的所有化合物组成，即由生物碱、类黄酮、脂肪酸、有机酸、氨基酸、糖和盐的混合物组成。
按照美国专利公开文本2003/0194456A1描述的过程得到的萃取物具有体内外免疫学和药理学活性，已知它们和抗银屑病活性有关，例如免疫抑制、淋巴细胞增殖抑制、细胞因子调节如IL-2抑制、IFNγ抑制和IL-10诱导；角质细胞增殖抑制、角质分离活性、内皮细胞增殖抑制、细胞粘附分子表达抑制如ICAM-I、MEST抑制和酶抑制如p60src酪氨酸激酶。
进一步地说，美国专利公开文本2003/0194456A1教导对上述蓟罂粟植物的叶和/或茎的萃取物利用醇类溶剂如正丁醇和甲醇进行分离，由此得到的组分也表现出包括抗银屑病活性的体内外免疫学和药理学活性。
专利申请公开号2003/0194456A1描述的蓟罂粟植物的叶和/或茎的水溶性萃取物的分离过程，是通过多级步骤、液-液分离色谱、沉淀和干燥该萃取物进行的，得到的各组分中的主要组分实质上是不同种类的化合物。
例如，按照美国专利公开文本2003/0194456A1描述的方法，向蓟罂粟植物的叶和/或茎的水溶性萃取物中加入正丁醇制备正丁醇可溶性组分，从水层中分离出正丁醇层，接着用水洗涤正丁醇层并在减压条件下蒸发溶剂得到的正丁醇可溶性组分的粘稠物质。该水层和甲醇混合，结果沉淀出固体物质。分离固体物质，将该物质溶于水并且冻干得到甲醇不溶性组分。将从甲醇-水混合物中分离甲醇不溶性沉淀之后得到的滤液蒸发，得到甲醇可溶性组分固体物质。
通常地，蓟罂粟植物产生约3-4.5％的正丁醇可溶性组分，46-54％的甲醇可溶性组分，总碱值在290-340之间；以及24-30％的甲醇不溶性组分，总碱值在350-380之间。这里所用的碱值是指中和1克样品中的所有碱性组分的酸的用量。
正如上述提到的，三种组分的实质差别在于它们所包括的化合物组成。正丁醇可溶性组分包括生物碱、类黄酮和其它低分子化合物；甲醇可溶性组分包括氨基酸、有机酸和盐；甲醇不溶性组分包括糖、有机酸和盐。
尽管对蓟罂粟植物的不同部分进行了多年的广泛的化学研究，并且分离出一系列生物碱、类黄酮、氨基酸、有机酸、脂肪酸等，然而，从来没有系统地研究和报道关于该植物中其它成分的分离和鉴定。
在植物王国中普遍发现的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)就是其中一种成分，它本质上是其中的碳水化合物和蛋白相关或相连的多糖类大分子。AGP主要由阿拉伯糖和半乳糖残基组成。它们以多聚糖存在于植物中，并且与不同数量的蛋白有关，通常包括高比例的碳水化合物和相对少量的蛋白、通常少于10的蛋白，但是也发现了较高蛋白含量的AGP。AGP广泛分布于大多数高等植物中，如紫锥菊、花烟草、欧洲葡萄、柿树、唐菖蒲、黑麦草[Anderson，R.L.，Clarke，A.E.，Jermyn，M.A.，Knox，R.B.andStone，B.A.，Australian J.Plant Physiol，1977，4，143-158]、菜豆[Hawes，G.B.，Adams，G.A，Phytochemistry，1972，H，1461-1465]和Acacia arabica[Classen，B.，Witthohn，K.，and Blaschek，W.，Carbohydrate Research，，2000，327，497-504]。
AGP具有粘附性和储水特性，并且对植物的伤口和感染有响应。这些性质确定细胞鉴定和特定相互作用。在细胞和组织分化及控制菌体胚胎形成中，它们也扮演着角色。它们也对各种生物行为有价值[WO01/00682A1，2001]。存在两种类型的AGP，即AGPI和AGPII。后者即AGPII包括半乳糖中心并且是高度分支的，通常包括少于10％的蛋白，侧链被阿拉伯呋喃糖残基和偶尔其它糖(如鼠李糖、葡萄糖、甘露糖等)高度取代。也有报道称存在糖醛酸和取代的衍生物。
正如上文所描述的，虽然已经对蓟罂粟所有部分的进行了化学研究，然而，没有对存在于该植物特定部分的AGP的分离、表征和生物性质进行研究。
发明内容
本发明提供了一种从蓟罂粟植物的叶和/或茎的萃取物中以纯化的形式分离AGP的选择性方法，其表现出比美国专利申请公开2003/0194456A1中的蓟罂粟植物的叶片和/或茎的萃取物和组分明显优异的抗银屑病活性和其它有用的免疫学和药理学活性。尤其是，从该选择性方法得到的纯化的AGP表现出的优异的抗银屑病活性在制备药物组合物方面非常有用，因而提供了一种安全、有效和耐受性好的治疗方法，由此形成本发明的基础。
因此，本发明的一个方面是提供一种以高纯度形式从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离出纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)的选择性方法。
另一方面，本发明提供一种分离自蓟罂粟植物的叶和/或茎的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)，具有从10KD至150KD的平均分子量。
本发明的又一方面是提供一种来自于蓟罂粟植物的叶和/或茎的治疗银屑病的抗银屑病组合物和治疗方法，其不仅是高安全性的、有效的并且耐受性好的，而且克服了现有治疗框架下的缺陷和限制。
本发明的另一方面是提供通过一种选择性方法从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物，其表现出有用的免疫学和药理学性质，如一种或多种免疫抑制、淋巴细胞增殖抑制、细胞因子调节如IL-2抑制、IFN-γ抑制或IL-10诱导、角质细胞增殖抑制、角质分离活性和MEST抑制。
本发明的又一方面是提供通过一种选择性方法从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物，用于治疗或预防一种或多种疾病，如皮炎、硬皮病、湿疹、炎症和其它的自体免疫疾病，如银屑病关节炎、风湿性关节炎、克罗恩病、多重硬化、肠易激综合症、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症和/或过敏如哮喘和慢性阻塞性肺病。
本发明还有一方面是提供一种可用于治疗和/或预防前述疾病的药物组合物，其包括通过一种选择性方法从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物。
除非另有定义，本发明包含的所有科技术语具有本领域的技术人员通常理解的含义。
这里使用的术语“纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物”含义是基本上仅包含阿拉伯半乳聚糖-蛋白的一种组合物，其中可包含痕量的根据本发明从蓟罂粟植物的茎和/或叶的萃取物得到的其它组分。该纯化的AGP组合物区别于包含AGP组合物的药物组合物，因为纯化的AGP组合物不包含任何药理学可接受的赋形剂。
我们的美国专利申请公开文本2003/0194456A1公开了一种从蓟罂粟植物的叶和/或茎获得萃取物的方法，以及利用正丁醇和甲醇分离萃取物分别得到正丁醇可溶性、甲醇可溶性和甲醇不溶性组分。
美国专利申请公开文本2003/0194456A1中公开的制备蓟罂粟植物的茎和/或叶的各种组分的方法包括以下步骤：
i)通过一系列萃取步骤制备蓟罂粟植物的叶和/或茎的萃取物，优选方案是在室温条件下，利用溶剂如水、乙醇或其混合物通过多步骤、连续浸泡和渗滤，得到相应的萃取物，其由生物碱、类黄酮、氨基酸、有机酸、糖和盐组成。可以采用这些萃取物或将其冻干，二者都可以用来分离；
ii)用正丁醇分离步骤i)得到的萃取物或冻干物质的水溶液，将正丁醇层从水层中分离，接着用水洗涤正丁醇层，然后在减压条件下蒸发溶剂，得到正丁醇可溶性组分粘稠物质，其主要由生物碱、类黄酮和其它低分子量化合物组成；
iii)将步骤ii)得到的水层和其6-7倍体积的甲醇混合并搅拌，过滤/离心沉淀的固体并干燥，得到甲醇不溶性组分，其主要由多糖、有机酸和盐组成。将该物质溶于水并冷冻得到冻干粉；和
iv)在减压条件下浓缩从步骤iii)得到的滤液即水-甲醇溶液，得到甲醇可溶性组分的固体物质，其主要由氨基酸、有机酸和无机盐组成。
根据美国专利申请公开2003/0194456A1的方法分离得到的甲醇不溶性组分的产率约为33％。虽然在说明书中提到该组分由糖、有机酸和盐组成，然而这些组分在那时并没有被表征。
目前的研究揭示，按照公开在US2003/0194456A1中的方法得到的甲醇不溶性组分包含约3％重量的AGP(相对于水溶性萃取物)，其余的组分为有机酸、氨基酸和无机盐。也即，根据US2003/0194456A1中的方法得到的甲醇不溶性组分由AGP混合其它组分组成。虽然浓度和纯度都很低，但甲醇不溶性组分包含AGP。
本发明人发现AGP能够以纯化的形式被分离，其相对于蓟罂粟植物的茎和/或叶的产率约为0.06％，或相对于通过一种高选择性方法制备得到的冻干的水溶性萃取物约为1％，被分离出来的AGP比那些通过US2003/0194456A1中公开的方法得到的产品表现出更为优异的抗银屑病活性。
以纯化的形式从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离AGP的选择性方法包括以下步骤：
a)用1至10重量份的水、C1-C3醇或其混合物萃取1重量份的蓟罂粟植物的叶和/或茎，得到一种水溶性萃取物，其可以但不必部分或完全浓缩或冻干；
b)从步骤a)得到的水溶性萃取物、部分浓缩的萃取物、完全浓缩或冻干的萃取物的水溶液中除去碱性和酸性组分，将部分浓缩的萃取物或浓缩萃取物的水溶液通过离子交换色谱，得到中性的水溶性萃取物；
c)用正丁醇分离步骤b)得到的中性水溶性萃取物，得到正丁醇可溶性组分；
d)将从步骤c)得到的水溶性洗液和甲醇或乙醇混合并搅拌，分离沉淀的固体，得到甲醇或乙醇不溶性组分；和
e)将步骤d)得到的甲醇或乙醇不溶性组分连续通过凝胶色谱和体积排阻色谱(size exclusion chromatography)，得到纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)。
图1概述了该分离纯化AGP的选择性方法。
蓟罂粟植物的叶、茎或二者都可用于萃取。优选使用新鲜的叶、茎或二者，且在萃取之前，最好将它们粉碎成或粗或细的糊状物。
在本发明的一个技术方案中，1重量份新鲜蓟罂粟的粉碎的叶和/或茎用1-10重量份的水、C1-C3的醇或它们的混合物萃取2至4次，且合并的萃取液在20EC至45EC的温度条件下渗滤2至20小时。
在另一个技术方案中，1重量份蓟罂粟的新鲜的粉碎的叶和/或茎被1-3重量份的水、C1-C3的醇或它们的混合物萃取2至4次，合并的萃取液在20EC至45EC的温度条件下渗滤2至16小时。
在另一个技术方案中，1重量份新鲜蓟罂粟的粉碎的叶和/或茎用1-1.5重量份的水、C1-C3的醇或它们的混合物萃取2至4次，合并的萃取物在室温下渗滤16小时。
C1-C3的醇选自甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇，优选乙醇。
渗滤之后过滤或离心该萃取物，滤液可被部分浓缩至相对于原始萃取液的一定体积或被浓缩至干燥或被冻干。
当萃取物被部分浓缩时，可以浓缩至萃取液原始体积的1/5至1/10。当原始萃取液被浓缩至干燥或被冻干时，在离子交换色谱之前，1重量份干燥的萃取物或冻干的粉末可被再次溶解到12-50倍重量的水中。
在一个优选的技术方案中，在离子交换色谱之前，冻干的水溶性萃取物被溶解到12倍的水中。
或者该部分浓缩的萃取物的溶液，或者原始萃取物经过完全浓缩得到的浓缩物或冻干粉的水溶液，通过顺序离子交换色谱，即阳离子交换树脂然后阴离子交换树脂色谱，或者在另一个离子交换色谱技术方案中，阴离子交换树脂之后是阳离子交换树脂色谱，得到中性的水溶性萃取物。
使用的阳离子和阴离子交换树脂的比例是相对于萃取物体积1至50重量份。
可使用的合适的阳离子交换树脂包括磺化的聚苯乙烯强酸阳离子交换剂和羧酸型弱酸阳离子交换剂。合适的阳离子交换树脂包括但不限于商业使用的和通常使用的磺化的聚苯乙烯强酸阳离子交换剂，如AG 50W(Bio-Rad，USA)、Amberlite IR-20(Rohm and Haas，USA)、Dowex 50W(DowChemical Co.，USA)、Duolite 225(Dia-Prosim Ltd)、Permutit RS(PermutitAG，Germany)和Permutite C50D(Philips and Pain-Vermorel，France)；羧酸型弱酸阳离子交换剂如Amberlite IRC-50(Rohm and Haas，USA)、Bio-Rex 70(Bio-Rad，USA)、Chelax 100(Bio-Rad，USA)、Duolite 436(Dia-Prosim Ltd)、Permutit C(Permutit AG，Germany)和Permutit H和H-70(Permutit Co.，USA)。
可使用的合适的阴离子交换树脂包括脂肪胺型弱碱阴离子交换剂和强碱阴离子交换剂。阴离子交换树脂包括但不限于商业使用的和通常使用的脂肪胺型弱碱阴离子交换剂，如Amberlites IR-45和IRA-67(Rohm andHaas，USA)、Dowex 3(Dow Chemical Co.，USA)、Permutit E(Permutit AG，Germany)、Permutit A 240A(Philips and Pain-Vermorel，France)；强碱阴离子交换剂如AG 2×8(Bio-Rad，USA)、Amberlite IRA-400(Rohm and Haas，USA)、Dowex 2×8(Dow Chemical Co.，USA)、Duolite 113(Dia-Prosim Ltd)、Permutit ESB(Permutit AG，Germany)和Permutite 330D(Philips andpain-Vermorel，France)。
冻干由此得到的中性水溶性萃取物，然后将冻干物质利用正丁醇和水进行分离。或者，同样的中性水溶性萃取物可选用正丁醇进行分离。考虑到成本因素，通过阳离子和阴离子交换树脂之后得到的中性组分的溶液优选采用正丁醇进行分离。
通常来说，将上述提到的中性萃取物的冻干物质分散到水和正丁醇的混合物中，静置该溶液并且分离水层和正丁醇层。重复该步骤2至4次，合并后的水层用甲醇或乙醇进一步分离。
在本发明的一个例子中，通过阳离子(Amberlite IR 120)和阴离子(Amberlite IRA 400)交换树脂之后得到的1体积份的中性水溶液组分加入到约10体积份的正丁醇中。混合、静置，从水相中分离正丁醇层。重复该步骤2至4次，合并的水层用甲醇或乙醇进一步分离。
从上述步骤中得到的合并的水相与甲醇或乙醇混合并搅拌，使其沉淀出甲醇/乙醇-不溶性组分。通常每1体积份水溶性萃取物使用1-20倍体积的甲醇或乙醇。
使用传统的方法分离沉淀出来的固体(其中包含AGP)，如倾滤、过滤、离心等，然后干燥得到一种褐色的无定形粉末。
接着，将得到的固体AGP(其中包含AGP-HM和AGP-LM)先后通过凝胶色谱和体积排阻色谱，得到纯化的AGP-HM和AGP-LM。
凝胶色谱采用常规技术和聚合物吸附剂，例如Amberlite吸附剂XAD-2、XAD-4或XAD-7，优选XAD-7。将不纯的固体AGP置于(requisite)柱顶端的狭窄带并用移动相(即水)洗涤。收集包含AGP的组分。
进一步通过体积排阻色谱，利用常规技术纯化含有不纯的AGP的洗提液。可以采用Sephacryl(1∶25-1∶50)以获得本发明纯化的AGP、AGP(HM)和AGP(LM)。可以使用商业上的Sephracyl S-100、S-200 HR和S-300 HR，优选S-200 HR。以1-2重量份相对于25到250体积份通过凝胶色谱得到的AGP溶液来使用Sephracyl。
在一个技术方案中，将粗AGP(100mg)溶解到水中并加载到sephacrylS-200(25ml)上。以0.5ml/分钟的速度洗提该柱子，收集50份。用HPLC-ELSD监测所有的组分。以HPLC为基础，合并组分10-20得到AGP-HM，合并组份25-35得到AGP-LM。AGP组合物的具有10KD至150KD的平均分子量。
体积排阻色谱之后，本发明纯化的AGP可通过常规技术手段如蒸发、冻干、喷雾干燥、冷冻干燥等从水溶液中分离出来。
获得的纯化AGP具有10KD至150KD之间的平均分子量。其具有一种或多种如下的效果：免疫抑制、淋巴细胞增殖抑制、细胞因子调节如IL-2抑制、IFN-γ抑制、IL-10诱导、角质细胞增殖抑制、角质分离活性和MEST抑制。我们已经知道这些效果与发炎紊乱、自体免疫疾病和过敏有关。我们知道这些效果也与抗银屑病活性、皮炎、硬皮病、湿疹和鳞状局部发痒有关。炎性疾病和自体免疫疾病包括银屑病关节炎、类风湿性关节炎、克罗恩疾病、多重硬化、肠易激综合症、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症。银屑病的类型包括斑块型银屑病、点滴状银屑病、脓疱性银屑病和银屑病甲。过敏包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病。IL-10诱导也可用于其它的慢性、复发性和其它包括皮肤淋巴抗原或皮肤白血球抗原的皮肤疾病。
纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物具有优异的体内和体外抗银屑病活性(通过IL-10诱导调控)。
通过体积排阻色谱如sephacryl得到的本发明纯化AGP(水溶性)由几种具有不同分子量的组分组成。这些组分的平均分子量可高达115至150KD、低至10至15KD。高分子量的AGP表示为AGP-HM，低分子量的AGP表示为AGP-LM。通常来说，AGP组合物由不同比例的AGP-HM和AGP-LM组成。前述的AGP是通过生物途径形成的，其中的碳水化合物/单糖不断地寻找蛋白以形成共价键，最终形成低分子量(AGP-LM)和高分子量(AGP-HM)AGP。这种共价键结构不断延伸，在某种特定的方法中，是以平均分子量小于10KD的AGP-LM结束，还是以平均分子量大于150KD的AGP-HM结束，取决于多种因素，例如所使用的植物的部位的状态即用于萃取的蓟罂粟植物的叶或茎是否新鲜，叶片的采集条件即是否是在雨季采集，等等。因此，由于前面提到的因素，通过本发明方法得到的纯化AGP组合物的平均分子量可能在10KD至150KD的范围之外。根据以上的观点，平均分子量在10KD至150KD范围外的AGP组合物仍然在本发明的范围之内。例如，AGP组合物的平均分子量下限为9KD或上限为155KD。
根据本发明方法得到的AGP的主要部分是碳水化合物和少量蛋白。AGP中的碳水化合物组分是阿拉伯糖、鼠李糖、甲基化糖醛酸、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和其它未鉴定的糖。它们和蛋白组分(包含各种氨基酸)相连，所述氨基酸是门冬氨酸、谷氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等，可以从说明书表-I和II清楚地看到。
我们发现，AGP-HM和AGP-LM不仅仅在糖基组成方面类似，即它们中单糖和蛋白的比率类似，而且它们的糖基连接也相似。
我们进一步发现，这两种分子量组分的生物活性是可比的，没有太大的区别。也就是说，分子量为10KD的纯化AGP-LM具有一种或多种免疫抑制，淋巴细胞增殖抑制，细胞因子调节如IL-2抑制、IFN-γ抑制、和IL-10诱导，角质细胞增殖抑制，角质分离活性，MEST抑制和最重要的抗银屑病活性，其能力和那些分子量为150KD的纯化的AGP-HM的能力相当。
本发明AGP组合物由AGP(AGP-HM和AGP-LM)组成，基本上不含有植物萃取物中的其它成分(它们为生物碱、类黄酮、有机酸、氨基酸、糖、多糖、蛋白、蛋白聚糖类(不包括AGP)和盐的混合物)。此处使用的术语“基本上不含有”是指AGP组合物包含从约0.0001％至约10％重量的植物萃取物中的其它组分。
正丁醇组分包含生物碱(如金英花碱、硝酸金英花碱、小檗碱、硝酸小檗碱、隐品碱、别隐品碱、黄连碱、盐酸血根碱、二氢盐酸血根碱、去甲基盐酸血根碱、6-丙酮基二氢盐酸血根碱、二氢白屈菜红、白屈菜红、去甲基白屈菜红、6-丙酮基二氢白屈菜红、(-)cheilanthifolin、(-)-[β]-延胡索单酚碱methohydroxide、(-)-[a]-刺罂粟碱methohydroxide、6-丙酮基二氢盐酸血根碱、(-)-[a]-四氢掌叶防己碱methohydroxide、瑞枯灵、白蓬草福林、隐品巴马亭、argemonine、norargeminine、helleritrine、oxyhydrastinine)，类黄酮(如异鼠李素、异鼠李素-3-葡糖苷和异鼠李素-3，7-二葡糖苷)及其它低分子量化合物的混合物；
甲醇可溶性组分包含氨基酸(如组氨酸、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、精氨酸、丝氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、羟基辅氨酸、辅氨酸和天门氨酸)、糖和盐；且
甲醇不溶性组分包含有机酸(如琥珀酸、柠檬酸、酒石酸和苹果酸)、单糖、多糖、蛋白多糖(包括AGP)和盐。
在本发明的一个技术方案中，AGP组合物中其它植物萃取物组分的重量低于1％。
通过本发明的方法分离得到的纯化的AGP组合物是一种优秀的ConA活化的人PBMCs的IL-10诱导剂。在浓度为200μg/ml它产生约371％诱导，大大高于通过US2003/0194456A1方法得到的甲醇不溶性组分的数值(以同样的浓度200μg/ml，约171％)。
特别值得注意的是，即使在非常低的0.2至2.0μg/ml的浓度，分离的AGP组合物表现出的IL-10诱导作用等价于或大于那些通过US2003/0194456A1中的方法得到的甲醇不溶性组分。
本发明中的AGP和通过US2003/0194456A1中描述的方法得到的甲醇不溶性组分的ConA诱导人PBMCs的IL-10诱导作用的浓度效果对比概括在表IA中。
表IA：本发明的AGP组合物和US2003/0194456A1中描述的方法制备得到的甲醇不溶性组分的ConA诱导人PBMCs的IL-10诱导作用的效果的对比
编号   本发明AGP组合物的浓度(μg/ml) 平均诱导率  根据US2003/0194456A1的方法制备得到的甲醇不溶性组分的浓度   平均诱导率(和US2003/0194456A1表8相同)
  01   200.00  371.40  200.00   171.10
  02   20.00  303.80  20.00   162.10
  03   2.00  237.30  2.00   98.30
  04   0.20  137.20  0.20   24.60
  05   0.02  114.30  0.02   -4.00
  06   0.002  106.00  0.002   -5.00
  07   0.0002  102.60  0.0002   --
*数值从底部以相对于对照百分数增长来进行描述。
**按照US2003/0194456A1中公开的方法得到的甲醇不溶性组分平均诱导率％在浓度200μg/ml时为171％。
通过所述方法获得的AGP的强大的有效活性使其可以非常低的浓度(按照US2003/0194456A1描述的方法得到的萃取物/组分浓度的1/100至1/1000的剂量)来给药，因而提供一种节约成本的、有效的和耐受性好的治疗银屑病和其它疾病的方法。
本发明提供一种药物组合物，其中包含有效量的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物(平均分子量为10KD至150KD，通过上文列举的选择性方法从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到)和药理学可接受的赋形剂混合。本发明的组合物安全、有效并且耐受性好。
适合用于本发明的药物组合物包括可达到治疗目的有效量的活性成分。有效量指的是AGP组合物的量可引起组织、细胞、系统、动物、非人类哺乳动物或人类哺乳动物生物学或医学反应。所述情形中可存在疾病/症状的减速、中断、稳定或停止，但是疾病和症状不必然完全消除，但是包括疾病的预防治疗。
与一种或多种药学可接受的赋形剂混合，如载体、稀释剂、填料和其它类似物，本发明AGP组合物可制成合适的剂型。合适的剂型是指适于口服或局部使用。这种剂型的实例包括但不限于液体、干粉、粉状浓缩物、胶囊、片剂、糖丸、颗粒、凝胶、软膏、乳膏、乳状液、悬浮液、分散液、洗液、丸剂及其类似物。
通常情况下，口服的药物组合物包含的AGP组合物活性成分在50-5000mg之间，优选200mg。
通常情况下，典型的局部使用的药物组合物包含AGP组合物活性成分0.1-10％重量，优选2％重量。
AGP组合物或包含AGP组合物的药剂的预防或治疗剂量是每天50mg至5000mg，优选每天200mg。该剂量可以一次给药或多次给药。
然而，病人或医疗卫生人员可根据患者的情况、疾病发展状况以及是治疗还是预防来选择具体的剂型、给药方式和剂量。具有患病风险的群体可以给予预防的剂量。风险因素包括但不限于遗传和环境因素。最佳情况是，药物组合物剂量能产生期望的结果又不会产生消极的副作用。术语“病人”意思是动物、非人类哺乳动物或人类哺乳动物。
混合本发明的AGP组合物和药学可接受的载体，制备合适的口服和局部使用药剂。
适合口服给药的剂型包括片剂、胶囊、浓缩粉、糖浆、酏剂或悬浮剂。适合局部使用的剂型包括软膏、油膏、洗剂、油或经皮药剂传送体系。
合适的药学可接受赋形剂包括糖如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和木糖醇；淀粉如玉米淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；磷酸钙如磷酸二钙和磷酸三钙；硫酸钠；硫酸钙；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；非离子、阳离子和阴离子表面活性剂；乙烯乙二醇聚合物；β-环糊精；脂肪醇；水解谷类固体；以及其它非毒性相容填料、粘合剂、分解剂、缓冲剂、保护剂、抗氧化剂、润滑剂、调味剂等。
本发明的组合物可以根据本领域已知的常规技术制备。
药学可接受的组合物是指它们适用于人和/或动物。
本发明的AGP组合物和药学组合物用于治疗和/或预防这里描述的疾病。
本发明的AGP组合物或包含本发明AGP组合物的药物组合物可用于治疗和/或预防银屑病类皮肤病，如银屑病(包括斑块型银屑病、点滴状银屑病、脓疱性银屑病、和银屑病甲)，包括给予需要治疗或具有患银屑病风险的哺乳动物有效量的AGP组合物，或含有治疗有效量的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物的药物组合物。
AGP组合物或包含AGP组合物的药物组合物可用于治疗或预防炎性疾病；自体免疫疾病如银屑病关节炎、类风湿性关节炎、克罗恩病、多重硬化、刺肠易激综合症、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮和干燥综合症；过敏如哮喘和慢性阻塞性肺病；治疗或预防包括给予需要治疗的哺乳动物或具有患病风险或正在发作这些疾病之一的哺乳动物治疗有效量的AGP组合物或包含治疗有效量的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物的药物组合物。
由于本发明的组合物可引起免疫抑制，因此对于那些希望进行或已经接受器官移植的病人也有用。
AGP组合物的结构说明和表征
测定AGP组合物中的碳水化合物的含量
以D-半乳糖为标准，通过苯酚-硫酸方法测定本发明AGP组合物中的总碳水化合物的含量。AGP组合物、AGP-HM和AGP-LM分别溶解到蒸馏水中至浓度为0.16mg/ml。三种溶液各取1ml，分别加入1ml 5％的苯酚溶液和10ml的硫酸。将它们旋转混合，冷却至室温。在480nm测定其吸光度。和半乳糖标准相比，AGP组合物中碳水化合物的含量分别在45-98％范围内。
测定AGP组合物的蛋白含量
通过Bradford方法测定本发明AGP组合物中的总蛋白含量。AGP组合物、AGP-HM和AGP-LM中的蛋白含量在2-20％之间。使用标准、通过氨基酸分析仪鉴定，AGP组合物中的氨基酸组成为门冬氨酸、谷氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。
利用水解和薄层色谱(TLC)来鉴定AGP组合物中的糖基和氨基酸含量。将通过体积排阻色谱后的20mg中性组分加入密封小瓶内，用2M三氟乙酸(TFA，200μl)进行水解。在100℃加热小瓶1小时，浓缩并冻干。利用标准的糖和氨基酸样品对混合物进行薄层色谱(TLC)。观察到的结果表明存在单糖如阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖。也观察到了氨基酸如缬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、γ-氨基丁酸、异亮氨酸和组氨酸。
测定AGP组合物中的糖基含量
通过AGP-HM和AGP-LM酸性甲醇分解产生的单糖甲基葡萄糖的对-O-三甲基硅烷(TMS)衍生物，结合气相色谱/质谱(GC/MS)分析来进行糖基含量分析。
先将AGP的干品在80℃条件下(18-22小时)，于存在1M盐酸的甲醇中醇解，制备甲基葡萄糖，接着用吡啶和乙酸酐在甲醇中再次N乙酰化(测定氨基糖)。样品接着用三硅酸(Pierce)在80℃条件下处理(0.5小时)进行对-O-三甲基硅烷化。这些程序和描述York，W.S.，Darvill，A.G.，McNeil，M.，Stevenson，T.T.，and Albersheim，P.，Methods Enzymol，1985，230，1-15和Methods Enzymol，1985，118，3-40中的一致。
TMS甲基葡萄糖的GC/MS分析用HP 5890 GC连接5970 MSD进行，采用All Tech EC-1熔合硅胶柱(30m×0.25mm ID)。
表I概括了AGP组合物中的糖基组分
表I：AGP组合物中的糖基组分
  组分    AGP组合物(摩尔％)
  阿拉伯糖(Ara)    34.00
  鼠李糖(Rha)    3.40
  甲基化糖醛酸(MUA)    5.00
  甘露糖(Man)    2.20
  半乳糖(Gal)    48.90
  葡萄糖(Glc)    未测出
  未鉴定的糖    6.50
测定AGP组合物中的糖基连接
NaOH方法：AGP组合物的样品全甲基化、降解、还原和乙酰化；得到部分甲基化糖醇乙酸(PMAAs)，通过之前描述过的气相色谱-质谱(GC-MS)进行糖基分析(York，W.S.，Darvill，A.G.，McNeil，M.，Stevenson，T.T.，and Albersheim，P.，Methods Enzymol.，1985，230，1-15；York，W.S.，Darvill，A.G.，McNeil，M.，Stevenson，T.T.，and Albersheim，P.，MethodsEnzymol，1985，118，3-40)。
起初，一份样品全甲基化(通过Ciukanu and Kerek，Carbohydr.Res.，1984，131，209-217中的方法)，包括用氢氧化钠和甲基碘在干燥的DMSO中处理。重复两次全甲基化以帮助聚合物完全甲基化。之后是样品诊断，用2M三氟乙酸水解全甲基化材料(在密封瓶中，121℃反应2小时)，用NaBD4还原，用无水乙酸/吡啶乙酰化。得到的部分甲基化糖醇乙酸(PMAAs)用Hewlett Packard 5890 GC连接5970 MSD分析(质量选择性检测器，电子轰击电离源)；在30m Supelco 2330键合相融合硅胶柱上进行分离。
表-II概括了糖基连接的百分比。
表II：AGP组合物中的糖基连接
  糖基残基     AGP组合物中的百分比
  端基吡喃鼠李糖基残基(t-Rhap)     3.00
  端基阿拉伯呋喃糖基残基(t-Ara f)     22.00
  端基阿拉伯吡喃糖基残基(t-Ara p)     1.00
  混合物3-吡喃鼠李糖基残基(3-Rha p)4-吡喃鼠李糖基残基(4-Rha p) 1.00
  端基吡喃葡萄糖基残基(-Glc p)     3.00
  端基半乳吡喃糖基残基(t-Gal p)     5.00
  5-联阿拉伯呋喃糖基残基(5-Ara f)     5.00
  2-联甘露吡喃糖基残基(2-Man p)     痕量
  2-联吡喃葡萄糖基残基(2-Glc p)     痕量
  3-联半乳吡喃糖基残基(3-Gal p)     16.00
  4-联(linked)半乳吡喃糖基残基(4-Gal p)     1.00
  6-联吡喃葡萄糖基残基(6-Glc p)     2.00
  6-联半乳吡喃糖基残基(6-Gal p)     8.00
  3，6-联吡喃葡萄糖基残基(3，6-Glc p)     2.00
  3，6-联半乳吡喃糖基残基(3，6-Gal p)     31.00
测定AGP组合物的分子量
对AGP组合物、AGP-HM和AGP-LM，采用水体含水凝胶渗透色谱(GPC)仪器Model Alliance 2690(装有累积溶剂和样品管理单元及折光率检测器，包括热隔离流体单元和逆流光学热交换器，以实现更好的基线稳定性)分析。色谱工作站包括数据采集和控制软件以及数据处理软件Millenium。GPC柱来自于Tosoh公司(TSK-GEL PW型)，由基于半刚性凝胶的亲水溶性聚合物组成。对多糖(葡聚糖)的排除限制从1,000至7,000,00分子量。这些柱子设计成用于分析和制备分离合成的水溶性聚合物、低聚物和生物学物质如多糖、核酸、蛋白、肽等。普鲁兰(pullulan)试剂盒由用于柱标定的不同分子量的多糖样品组成。
可以根据各种分析条件如不同孔隙的柱、移动相的浓度和性质、流体速率、检测灵敏度等来利用GPC方法。通过0.2M硝酸钠溶液获得最佳的多糖样品分离结果，以下是表征基于多糖的药物分子的分析条件。
通过比较体积排阻色谱的洗脱时间来测定AGP组合物的分子量。通过对比，我们发现AGP组合物的平均分子量在10KD至150KD之间。
以类似的方式测定AGP-LM和AGP-HM的分子量。通过对比，我们发现各组分的平均分子量分别为13KD和115KD。
AGP组合物的傅利叶变换红外光谱(FT-IR)
利用KBr小球中的石蜡糊，通过傅利叶变换红外色谱(8201 PCShimadzu)测定本发明AGP-HM的红外光谱。结果表明在3400cm-1有宽的吸收峰，揭示其中存在羟基基团，2850-2960cm-1的峰揭示有CH键的拉伸。
h)AGP组合物的1H核磁共振光谱
本发明的AGP的1H核磁共振光谱用Bruker DRX 500核磁共振光谱仪记录在D2O中，500MHz。
通过甲基化分析检测所有主要连接键的大规模质子定位。在1H核磁共振光谱中，检测到了对应于β-D-Gal-p残基(d 4.22-4.47)和a-L-Ara-f残基(d 5.17-5.33)的H-1信号。d 3.53-4.22之间有多个信号，对应于β-D-Gal-p残基的H-2至H-6、a-L-Ara-f残基的H-2至H-5、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖小残基的H-2至H-5。进行2D同核和异核试验，以分辨并将这些信号定位至特定的残基。不同的连接键在2D光谱中的每个自旋体系上的定位，与表II中的连接键数据和文献中报道的其它AGP的NMR数据比较相一致。
端基质子：在d 5.33和d 5.17中观察到的端基质子被分别定位到端位和5联(linked)a-L-Ara-f残基。在d 5.17的信号也被定位到端基a-L-Rhap，d 5.10的信号定位至4联a-L-Rha p。类似地，在d 4.61的信号被定位到3联a-L-Rha p。在d 4.56的信号被定位到6联β-D-Gal p。在d 4.61的信号被定位到3联β-D-Gal p，在d 4.56和4.57的信号被定位到端基β-D-Gal p和3联、6联β-D-Gal p。
H-2质子：在d 4.31和4.22的信号被分别定位到端基和5联a-L-Araf残基的H-2。进一步地，在d 3.45的信号被定位到β-D-Gal p，在d 3.74的信号被定位到3联、6联和3，6联β-D-Gal p残基。在d 4.03，3.74和3.57的信号被分别定位到4联、3联和端基a-L-Rha p的H-2质子。
H-3质子：在d 4.03的信号被定位到端基和5联a-L-Ara f残基。进一步地，在d 3.81的信号被定位到端基和6联β-D-Gal p。类似地，在d 4.31的信号被定位到3联和3，6联β-D-Gal p基团。在d 3.93、3.63和3.57的信号被分别定位到4联、3联和端基a-L-Rha p。
H-4质子：在d 4.22的信号被定位到端基和5联a-L-Ara f。在d 3.63的信号被定位到3联和6联β-D-Gal p残基。进一步地，在d 3.86和4.03的信号被分别定位到端基和3，6-联β-D-Gal p。类似地，在d 3.63、3.09和2.82的信号被定位到4联、3联和端基的a-L-Rha p基团。
H-5质子：在d 3.81的信号被定位到6联和3，6联β-D-Gal p。类似地，在d 4.03的信号被定位到端基和3联β-D-Gal p。在d 3.91和3.93的信号被分别定位到端基和5联a-L-Ara f。在d 4.22、4.03和3.09的信号被定位到端基、4联和3联(linked)a-L-Rha p的H-5。在d 4.03，3.45和4.03的信号被分别定位到3联β-D-Gal p和端基β-D-Gal p残基的H-5。
H-6质子：在d 3.93的信号被定位到6联和3，6联β-D-Gal p。在d 3.91和3.81的信号被分别定位到端基和3联β-D-Gal p。在d 1.03、1.34和1.40观察到的甲基质子被定位到3联、4联和端基的a-L-Rha p基团。
上述定位被HOMOCOSY试验进一步证实。
氨基酸残基：在d 1.03观测到缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的甲基，而苏氨酸和丙氨酸的甲基分别在d 1.34和1.40。
在d 1.3-2.8之间观测到精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和缬氨酸的Ca、Cβ(C-H，CH2)、Cγ(CH2)和Cd(CH2)质子。
在d 2.8-3.5之间观测到门冬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的Cβ(CH2，CH)、Cγ、Cd的质子。
在d 3.5-3.9之间观测到丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和缬氨酸的Ca质子。
在d 3.90-4.2之间观测到门冬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸的Ca质子和丝氨酸、苏氨酸中的Cβ质子。
在低磁场区域d 6.6-7.5的弱信号被定位到苯胺和酪氨酸的N-H和芳香质子。
i)AGP组合物的13C核磁共振光谱
端基碳：在13CNMR光谱中，在d 109.10和107.37的信号被定位到端基和5联a-L-Ara f基团的端基碳。在d 103-102之间的信号被定位到端基、3联、6联和3，6联β-D-Gal p残基的端基碳。在d 103-102之间重叠的同样信号被定位到4联β-D-Glu p，4联β-D-xyl p，端基β-D-Glc p和3联a-L-Rha p的端基碳。
C-2：在d 81.97的信号被定位到5联a-L-Ara f基团。在d 72.94和72.72的C-2信号被分别定位到端基和6联β-D-Gal p残基。在d 72.56的信号被定位到3联和3，6联的β-D-Gal p残基。类似地，在d 74.81、74.60和73.33观测到的信号被分别定位到端基和6联β-D-Glc p的C-2。在d 80.02、76.55和70.68观测到的信号分别被定位到端基、3联和4联的a-L-Rha p残基中的C-2。在d 81.24的信号被定位到2联β-D-Man p残基。
C-3：在d 76.55的信号被定位到端基和5联a-L-Araf。在d 74.81的信号被定位到端基和6联β-D-Galp。进一步地，在d 81.97的信号被定位到3联和3，6联β-D-Galp残基。在d 76.55和74.81的信号被定位到端基、4联和6联β-D-Glc p基团。类似地，在d 80.02、76.55和70.6的信号被分别定位到端基、3联和4联a-L-Rha p基团。
C-4：在d 83.85的信号被定位到端基和5联a-L-Ara f基团。在d 70.15的信号被定位到端基β-D-Galp残基。在d 70.68的信号被定位到3联和6联β-D-Gal p残基。而在d 73.33的信号被定位到3，6联β-D-Gal p残基。在d 80.02，70.68和70.15的信号被分别定位到6联和端基β-D-Glc p基团的C-4。在d 81-83的信号被定位到3联、4联和端基a-L-Rha p基团的C-4。
C-5：在d 69.17观测到的信号被定位到5联a-L-Ara f中的C-5，而在d 61.25观测到的信号被定位到端基a-L-Ara f的C-5。在d 74-77之间观测到的信号被定位在3联、6联和端基β-D-Gal p残基的C-5，在d 75-76之间观测到的信号被定位到端基β-D-Glc p基团的C-5。
C-6：在d 69.17观测到的信号被定位到6联、3，6联β-D-Gal p残基的C-6，在d 60.93和61.25观测到的信号被分别定位到3联和端基β-D-Galp残基的C-6。在d 60-62之间观测到的信号被定位到端基β-D-Glc p中的C-6，在d 70.1观测到的信号被定位到6联β-D-Glc p中的C-6。
甲基：在d 16.7、19.9和22.2观测到的信号被定位到a-L-Rha p的甲基。
上述信号的定位通过HETCOR试验进一步证实。
氨基酸：在d 16.70的信号被定位到缬氨酸的Cγ和Cd甲基、丙氨酸的Cβ甲基和甲硫氨酸的Cd甲基。在d 19.97的信号被定位到苏氨酸的Cγ甲基。在d 22.22的信号被定位到精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的Cγ(CH2)，Cγ(C-H)和亮氨酸的Cd和Ce甲基。
在d 31.01的信号被定位到精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、脯氨酸的Cβ(CH2)和谷酰胺的Cγ(CH2)。
在d 38.05的信号被定位到门冬酰胺、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的Cβ(CH2)、甘氨酸的Ca和精氨酸、赖氨酸的Cd(CH2)。在d 48.45的信号被定位到丙氨酸、门冬氨酸、亮氨酸的Ca质子以及脯氨酸的Cd。
在d 59.81的信号被定位到精氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸的Ca质子。在d 60.9的信号被定位到缬氨酸和苏氨酸的Ca质子，在61.25的信号被定位到脯氨酸的Ca质子和丝氨酸的Cβ质子。
在d 68.38的信号被定位到丝氨酸的Cβ(CH)。
在d 108-140之间的信号被定位到组氨酸的烯族质子和苯丙氨酸的芳香质子。
在d 155.64的信号被定位到精氨酸的Ce和酪氨酸的C-4，在d 166.19的羰基信号被定位到谷氨酸。
在低磁场区域，在d 171-175之间观测到的信号被定位到氨基酸丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羰基基团。
总之，AGP-HM的结构以6联吡喃半乳糖和3，6联吡喃半乳糖作为骨架，终端位置有呋喃阿拉伯糖基、吡喃阿拉伯糖基、吡喃鼠李糖基、吡喃葡萄糖基和吡喃半乳糖基。AGP进一步包含3联、4联吡喃鼠李糖基，2联吡喃甘露糖基，2联吡喃葡萄糖基，3联、4联吡喃半乳糖基，6联、3，6联吡喃半乳糖基和4联吡喃木糖糖基以及甲基糖醛酸。经鉴定AGP组合物的氨基酸组成为门冬氨酸、谷氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。然而，氨基酸的连接位置还没有确定。AGP-LM也具有类似的结构但是分子量不同。基于前述的数据，提出AGP组合物的以下结构(图2)。AGP-HM和AGP-LM均拥有类似的生物学活性，因此AGP组合物已经被用于所有的生物学研究。
AGP组合物的免疫学和药理学性质
以下部分描述细胞因子化验如IL-2、IFN-γ、IL-10和其它的体内活性，如豚鼠中的迟发型过敏反应(DTH)。表-III为按照US2003/0194456A1公开的方法得到的水溶性萃取物和本发明的AGP组合物的生物活性对比。
表III：按照US2003/0194456A1公开的方法得到的水溶性萃取物(1)和本发明的AGP组合物(2)的生物活性对比
 序列号     参数    水溶性萃取物(1)     AGP组合物(2)
1     IL-10诱导(EC50单位μg/ml) 2.54 1.075
2     IL-2抑制(20ng/ml的抑制％) 29.32±5.26 51.10±4.33
3     IFNγ抑制(20ng/ml的抑制％) 33.27±6.52 54.50±4.00
4     TNFa抑制(2μg/ml的抑制％) 44.34±6.64 60.68±9.03
5     GMCSF抑制(200ng/ml的抑制％) 35.57±9.45 43.28±6.21
6     TPA诱导皮肤增生(ED50mg/kg) 36.3 2.31
7     DTH模型(ED50mg/kg) 4.34 0.58
8     MEST(ED50mg/kg) 14.0 6.43
AGP组合物的毒性研究
通过大鼠和小鼠口服、静脉注射评价AGP组合物的急性毒性(LD50)。每种类型、每种方式、每种剂量的10只动物作为一组进行给药，在第15天计算结果。
对于AGP组合物观测到以下数值
小鼠口服LD0       ：  ＞5000mg/kg重量
小鼠静脉注射LD0   ：  ＞1000mg/kg重量
大鼠口服LD0       ：  ＞5000mg/kg重量
大鼠静脉注射LD50  ：  ＞250mg/kg重量
AGP组合物的生物学试验
评价人类IL-10产生的方法
为了评价AGP组合物治疗银屑病的潜在效力，用ConA诱导PBMCs产生IL-10的试验评价体内IL-10的诱导效果[Raychudhuri S.P.，Farber E.M.，Raychudhuri S.K.，Int.J.Immunopharmacol.，1999，21，609]。
简要地说，分离人类PBMCs(末梢血同核细胞)并用10μg/ml的ConA加上各种浓度的AGP组合物激活，在CO2保温器中于5％CO2存在下37℃保温48小时。收集上清液并在-70℃冷冻直到ELISA定量检测。所用的人类IL-10 ELISA试剂盒来自用于检测培养物上清液中IL-10的R和D系统。根据对照来计算诱导百分率。结果归纳在表IV中。
分离自蓟罂粟的AGP组合物在0.0002μg/ml至200μg/ml的范围内增加了ConA活化人类PBMCs的IL-10产量(图3)。IL-10在银屑病治疗中是调节细胞因子，众所周知其在抗银屑病治疗中产生诱导作用。
IL-10诱导在治疗和/或预防银屑病、皮炎、硬皮病、炎性疾病和其它自体免疫疾病如银屑病关节炎、斑块型银屑病、点滴状银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多重硬化、肠应激综合症、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症、过敏如哮喘、慢性阻塞性肺疾病和相关疾病如湿疹和鳞状发痒斑块中非常有用。IL-10诱导在其它慢性、复发性和其它皮肤疾病(涉及到皮肤淋巴抗原或皮肤白血球抗原的)中也有用。
表IV：AGP组合物通过ConA诱导人类PBMCs的IL-10诱导效果
  萃取物的浓度(μg/ml)  平均诱导百分率
  200  371.40
  20  303.80
  2  237.30
  0.2  137.20
  0.02  114.30
  0.002  106.00
  0.0002  102.60
*数值以相对于底部的百分率增长来描述。
评价人类IL-2和IFN-γ产生的方法
为了评价AGP组合物对于银屑病治疗潜力的效力，通过植物血凝素(PHA)诱导PBMCs的IL-2和IFN-γ产生抑制试验来评价其体外调节IL-2和IFN-γ的效果[Brynskov J，Tvede N.，Out，1990，31(7)，795]。
这项研究的目的是评价AGP在PHA诱导产生人类淋巴细胞的IL-2和IFN-γ方面的效果。简要地说，从健康个体采集末梢血同核细胞(PBMC)。每毫升一百万PBMC用PHA(5μg/ml)加上从蓟罂粟分离得到的各种浓度的AGP组合物在存在5％CO2的CO2保温器中于37℃激活48小时。收集上清液并在-70℃冷冻。使用的人类IL-2和人类IFN-γELISA试剂盒来自检测培养物上清液中EL-2和IFN-γ的R和D系统。根据对照计算诱导百分率。
在浓度0.002μg/ml至20μg/ml之间，从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到的AGP组合物抑制有丝分裂素(mitogen)诱导IL-2产生(图4)。我们已经知道对有丝分裂素IL-2产生的抑制活性是免疫抑制，并在治疗和/或预防银屑病方面非常有用。结果概括在表V中。
表V：AGP组合物对PHA诱导人类PBMCs产生IL-2的效果
  AGP组合物的浓度(μg/ml)   平均抑制百分率
  20.00   54.53
  2.00   54.49
  0.20   53.97
  0.02   51.10
  0.002   30.56
  0.0002   10.87
  0.00002   3.75
*该数值是相对于对照的抑制百分率
浓度在0.0002μg/ml至2μg/ml之间的分离自蓟罂粟的AGP组合物抑制有丝分裂素诱导IFNγ产生(图5)。已知对有丝分裂素诱导IFN-γ产生的抑制活性是免疫抑制，并在治疗和/或预防银屑病方面非常有用。结果概括在表VI中。
表VI：AGP组合物对PHA诱导人类PBMCs产生IFN-γ的效果
AGP组合物的浓度(μg/ml) 平均抑制百分率
    20.00     55.19
    2.00     57.07
    0.20     53.69
    0.02     54.50
    0.002     38.62
    0.0002     15.34
    0.00002     4.04
*该数值是相对于对照的抑制百分率
人类GMCSF和TNF-a产生的评价方法
为了评价本发明AGP组合物的银屑病治疗潜力的效果，通过ConA和LPS激活PBMCs的GMCSF和TNFγ产生抑制试验来评价其体外粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和TNF-a调节作用。
简要来说，从健康志愿者的血液分离得到人类PBMCs，用10μg/mlConA加上各种浓度的AGP组合物激活，在CO2保温器中5％CO2存在下于37℃保温48小时。加入5μg/ml的LPS，在同样条件下保温24小时。收集上清液并冷冻至用ELISA定量检测细胞因子。根据对照计算抑制百分率。
在浓度0.02μg/ml至2μg/ml之间，从蓟罂粟分离得到的AGP组合物抑制有丝分裂素诱导GMCSF产生(图6)。已知对有丝分裂素GMCSF产生的抑制活性是免疫抑制，并在治疗和/或预防银屑病方面非常有用。结果概括在表VIII中。
表VII：AGP组合物通过ConA和LPS诱导人类PBMCs产生GMCSF的效果
  AGP组合物的浓度(μg/ml)   平均抑制百分率
  2.00   32.31
  0.20   43.28
  0.02   35.41
*该数值是相对于对照的抑制百分率
在浓度0.002μg/ml至2μg/ml之间，从蓟罂粟分离得到的AGP组合物抑制有丝分裂素诱导产生TNF-a(图7)。已知对有丝分裂素TNF-a产生的抑制活性是免疫抑制，并在治疗和/或预防银屑病方面非常有用。结果概括在表VIII中。
表VIII：AGP组合物通过ConA和LPS诱导人类PBMCs产生TNF-a的效果
 AGP组合物的浓度(μg/ml)  平均抑制百分率
 2.00  60.68
 0.20  46.18
 0.02  22.02
 0.002  10.30
*该数值是相对对照的抑制百分率
AGP组合物对于NGF诱导人类角质细胞增殖的效果
角质细胞从GIBCO(USA)购买，并补充生长因子，保持在角质细胞-血清自由培养基(GIBCO，#10744-019)中。将含有2000个细胞的大约150μl的角质细胞生长介质(KGM)加入到96孔平底培养板的每个孔中。第二天将介质变为体积比为1∶2的KGM∶KBM(角质细胞基础介质)。将30微升的稀AGP组合物一式三份加入到除对照细胞孔之外的每个孔中。将100ng/ml的神经生长因子(NGF)加入到每个孔中。保温8天之后除去介质。细胞用PBS淋洗。加入LDH(乳酸脱氢酶)展开溶解溶液(development lysis solution)并在37℃保温10分种。在波长为492nm时用ELISA读写器测定OD。计算增殖/抑制百分率。结果概括在表IX中。
表IX：AGP组合物在NGF诱导人类角质细胞增殖方面的效果
  AGP组合物(μg/ml)   平均抑制百分率
  40.00   79.15
  8.00   74.53
  1.60   71.49
  0.32   66.78
  0.064   55.75
  0.0128   26.78
  0.0025   15.36
  0.0005   6.18
  0.0001   3.03
*该数值是相对于对照的抑制百分率
在浓度0.0001μg/ml至40μg/ml之间，分离自蓟罂粟的AGP组合物抑制NGF诱导人类角质细胞增殖(图8和9)。已知NGF诱导人类角质细胞增殖的抑制活性是免疫抑制，并在治疗和/或预防银屑病方面非常有用。
利用豚鼠的延迟型过敏反应评价体内免疫抑制效果的方法
利用标准化程序来评价AGP组合物抑制纯化的蛋白衍生物(PPD)诱导豚鼠的延迟型过敏反应的能力的体内效果。简单地说，豚鼠用100μg的PPD结合福氏完全佐剂皮下注射敏化。随后用100μg的PPD结合福氏不完全佐剂间隔一星期给药以增强。AGP组合物口服给药一天一次，连续28天。在第28天给动物皮下激发100μg的PPD，激发24小时之后用Varnier′s测径器测量对照和注射了PPD的皮肤厚度的差异。通过减去同一只豚鼠用盐水注射后的皮肤厚度来计算皮肤厚度的差异。通过对照盐水激活的动物来计算抑制百分率。
当口服0.10-100mg/kg时，从蓟罂粟分离得到的AGP组合物的PPD敏化和PPD激发豚鼠的免疫抑制活性为20-65.89％。PPD激发豚鼠引起皮肤厚度50％抑制的有效剂量(ED50)为口服0.508mg/kg(图10)。证明了免疫抑制活性有效，并且对于治疗银屑病有用。
在DTH模型中的免疫抑制对于要求免疫抑制的很多疾病有用，如银屑病、皮炎、硬皮病、发炎紊乱和其他自体免疫疾病如银屑病关节炎、斑块状银屑病和点滴状银屑病。结果概括在表X中。
表X：AGP组合物对于PPD激发豚鼠的皮肤厚度的效果
    AGP组合物的浓度(mg/kg)   应答百分率
    0.01   0.000
    0.10   20.000
    1.00   62.680
    10.00   67.930
    30.00   61.510
    100.00   65.880
TPA的评价方法
随机抽取Balb/C小鼠，在实验前适应新笼子5天。局部使用AnneFrench除去毛发并适当清洁。分组，每组由六只小鼠组成。同时进行丙酮对照组、TPA(12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯)对照组和药物测试组。AGP组合物溶解在推荐介质(丙酮)中，动物口服药物4天，每天一次。第二天在干净的皮肤表面施用20微升100nM TPA并使其吸收。使用TPA72小时之后杀死动物。皮肤切片用10％福尔马林浸泡3天。随后按照标准方法制作组织病理学切片。利用眼测量仪(oculometer)测量至少10个不同区域的表皮厚度，抑制结果以百分率表示(图11)。结果概括在表XI中。
表XI：AGP组合物对TPA模型的效果
  组别    剂量(mg/kg，口服)  表皮厚度的增加(μm)   抑制百分率
  丙酮对照组    -  23.08   -
  TPA对照组    -  52.88   0.00
AGP组合物    30.00  25.38   92.30
   10.00  29.67   77.89
   3.00  35.63   57.90
   1.00  50.08   9.37
   0.30  52.63   0.84
   0.10  52.67   0.70
*该数值以相对于TPA对照的抑制百分率表示。
通过小鼠耳肿实验(MEST)评价体内免疫抑制的方法
采用标准程序评价AGP组合物对于小鼠的DNFB诱导延迟型过敏反应能力的体内抑制效果[Cornacoff J.B，House R.V，Dean J.H.，Fundam.Appl.Toxicol，1988，10(1)，40；Fundam.Appl.Toxicol.，1992，19(1)，157]。
简要地说，该项试验中用到C57BL6小鼠。用0.2％DNFB(1∶4的橄榄油和丙酮)涂在小鼠背部使其敏化。随后每三天用一次DNFB。用0.2％DNFB涂在小鼠耳廓将其激发。在24小时之后用Vamier′s测径器测量耳朵中心部位的厚度。进行分析，相对于阴性对照组(口服不同剂量)计算抑制百分率。结果概括在表-XII中。
表XII：AGP组合物对于DNFB诱导雌性C57/BL6小鼠的小鼠耳肿实验的效果
  序列号     处理     抑制百分率
1     Milli Q水10ml/kg，口服AGP组合物的阴性对照 0.00
2     2％吐温80，10ml/kg，口服环孢菌素的阴性对照 0.00
  3     AGP组合物-0.1mg/kg，口服     0.00
  4     AGP组合物-1mg/kg，口服     18.00
  5     AGP组合物-3mg/kg，口服     33.05
    6     AGP组合物-10mg/kg，口服     43.62
    7     AGP组合物-30mg/kg，口服     58.52
    8     AGP组合物-100mg/kg，口服     69.51
    9     环孢菌素25mg/kg，口服     65.16
每个数据都来自于7-12只动物的抑制百分率。AGP组合物和Milli Q水处理组比较，环孢菌素和2％吐温80处理的动物比较。
来自蓟罂粟的叶和/或茎的AGP组合物对DNFB敏化的C57BL6小鼠具有免疫抑制作用。经测定，AGP组合物的ED50为6.43mg/kg(图12)。说明具有明显的免疫抑制性质，可以用于治疗或预防银屑病。
MEST模型中的免疫抑制可以用于评价很多要求免疫抑制的疾病，如银屑病、皮炎、硬皮病、发炎紊乱和其它自体免疫疾病如银屑病关节炎、斑块状银屑病、点滴状银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多重硬化、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症、过敏如哮喘、慢性阻塞性肺病，以及相关的疾病如湿疹、鳞状发痒斑块。
通过以下的非限定实施例进一步说明本发明。
具体实施方式
[实施例1]
分离AGP组合物、AGP-HM和AGP-LM
10Kg蓟罂粟(Argemone mexicana)的新鲜叶片，粉碎并用软水(15升)萃取。离心浆料，真空条件下、低于40℃浓缩水溶性萃取物。冻干浓缩物质，得到0.54Kg干的固体。
将500g干的水溶性萃取物溶解在6升水中，离心、倾析。上清液以10ml/分钟的速度通过阳离子交换柱(5升)。收集洗脱液(7.5升)，浓缩(2.5升)并通过阴离子交换柱(5升)。将洗脱液(3升)浓缩至约1.5升。用另一份0.5kg材料(水溶性萃取物)重复该试验。
将合并洗脱液(1.5升)混合并浓缩至2.5升，并通过阳离子交换柱。将洗脱液(3升)浓缩至1.2升并通过阴离子交换柱。冷冻洗脱液(1.5升)，得到42.39g粉末。
将42g的上述粉末溶解在600ml水中，用正丁醇(3×400ml)和水进行分离。丢弃正丁醇层。水层(600ml)中加入3升甲醇直至得到固体沉淀。离心溶液，倾析上清液。将上清液浓缩至体积为300ml。再次加入甲醇(1升)使甲醇不溶性组分沉淀出来。离心溶液，倾析上清液。冷冻两次试验得到的固体沉淀(8.75g)。将干物质溶解到水中，过XAD-2柱两次。冻干水洗脱液，得到6.10g AGP组合物。接着过sephacryl色谱柱得到5mgAGP-HM和10.3mg AGP-LM。
[实施例2]
分离AGP组合物、AGP-HM和AGP-LM
22Kg蓟罂粟的新鲜叶片，粉碎并用软水(36升)萃取。离心桨料，在真空条件下、低于40℃浓缩水溶性萃取物。冻干浓缩物质，得到1.25Kg干的固体。
将1.2kg干的水溶性萃取物溶解到12升水中，离心、倾析。上清液以10ml/分钟的速度通过阳离子交换柱(5升)。收集洗脱液(15.5升)，浓缩(5.5升)并通过阴离子交换柱(5升)。浓缩洗脱液(6.25升)至约3.2升。
将洗脱液(3.2升)浓缩至2.6升并通过阳离子交换柱。将洗脱液(4升)浓缩至1.5升并通过阴离子交换柱。冻干洗脱液(1.6升)，得到54g粉末。
将40g上述粉末溶解到700ml水中，用正丁醇(3×500ml)和水进行分离。弃去正丁醇层。将4升甲醇倒入水层(675ml)直至出现固体沉淀。离心溶液，倾析上清液。浓缩上清液至400ml。再次加入甲醇(3升)得到甲醇不溶性组分沉淀。离心溶液，倾析上清液。冻干固体沉淀(7.3g)。将得到的干物质溶解在水中，通过XAD-2柱两次。冻干水洗脱液得到5.5g AGP组合物。进一步通过sephacryl色谱柱得到4.5mgAGP-HM和12.4mgAGP-LM。
[实施例3]
表XIII：包含本发明的AGP和药学可接受的载体的胶囊制剂的单位剂量
    序列号   成分           剂量(mg/胶囊 )
    01   AGP   50  200
02   微晶纤维素USNF(Avicel PH 102) 39 39
03   交联羧甲基纤维素钠USNF(Ac-Di-SOL) 10 10
04   胶体二氧化硅USNF(Aerosil 200) 0.5 0.5
    05   硬酯酸镁   0.5  0.5
  总和   100  250
06 硬胶囊   1(“2”号是橙色身和橙色盖)  1(“00”号是橙色身和红色盖)
混合上述表XIII提及的成分直至均匀，填充在“00”号的硬胶囊中。处理过程中最好保持在相对湿度40+5％(RH)和18-22EC。
制备本发明组合物的通常过程如下：
混合活性成分、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、硬酯酸镁和胶体二氧化硅直至均匀。将它们填充在“00”号的硬胶囊中。处理过程最好保持在相对湿度40+-5％(RH)和在18EC to 22EC。
当局部用药时，蓟罂粟植物的量相对于萃取物的重量为0.1％至10％。
包含本发明的AGP和药学可接受的载体的局部使用软膏的单位剂量概括在表XIV中。
表XIV：包含本发明的AGP和药学可接受载体的局部使用软膏的单位剂量
    序列号     成分     剂量
    01     AGP     1.0gm
    02     水     100ml
    03     羟丙基甲基纤维素     4.0gm
制备局部使用的软膏的通常过程包括：通过常规方法将所有成分缓慢混合成光滑的凝胶，然后填装到管中。

Claims (31)

1.一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白(AGP)组合物，平均分子量10KD至150KD，通过以下步骤从蓟罂粟植物的叶和/或茎分离得到：
i)用1至10重量份的水、C1-3醇或其混合物萃取1重量份蓟罂粟植物的叶和/或茎，得到水性萃取物；部分或完全浓缩或冻干所述萃取物；
ii)将水性萃取液、部分浓缩的水性萃取物或步骤i)获得的完全浓缩或冻干的萃取物的水溶液连续通过离子交换色谱，得到中性水性萃取物；
iii)用正丁醇分离步骤ii)中得到的中性水性萃取物，分离水相和正丁醇相；
iv)将步骤iii)得到的水相与甲醇或乙醇混合并搅拌，分离固体沉淀，得到不溶性组分；和
v)将步骤iv)得到的不溶性组分先后通过凝胶色谱和体积排阻色谱，获得纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其中的C1-3醇选自甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇。
3.根据权利要求1的组合物，其中的离子交换色谱是先阳离子交换色谱后阴离子交换色谱。
4.根据权利要求1的组合物，其中的离子交换色谱是先阴离子交换色谱后阳离子交换色谱。
5.根据权利要求3或4的组合物，其中的阳离子交换色谱使用磺化聚苯乙烯强酸阳离子交换剂或羧酸型弱酸阳离子交换剂。
6.根据权利要求3或4的组合物，其中的阴离子交换色谱使用脂肪胺型弱碱阴离子交换剂或强碱阴离子交换剂。
7.根据权利要求1的组合物，基本上不存在蓟罂粟植物的叶和/或茎中的其它生物碱、黄酮类、氨基酸、有机酸、脂肪酸和其它化合物。
8.根据权利要求1的组合物，其骨架为6-吡喃半乳糖和3，6-吡喃半乳糖，并且呋喃阿拉伯糖、吡喃阿拉伯糖、吡喃鼠李糖基、吡喃葡萄糖和吡喃半乳糖残基位于末端位置，还包括3-、4-吡喃鼠李糖基，2-吡喃甘露糖基，2-吡喃葡萄糖基，3-、4-吡喃半乳糖基，6-、3，6-吡喃葡萄糖基，4-吡喃木糖基和甲基糖醛酸。
9.根据权利要求1的组合物，其由45-98％重量的碳水化合物组成。
10.根据权利要求1的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白组合物，由2-20％重量的蛋白质组成。
11.一种分离阿拉伯半乳聚糖-蛋白组合物的方法，包括：
i)用1至10重量份的水、C1-3醇或其混合物萃取1重量份的蓟罂粟植物的叶和/或茎，得到水性萃取物，部分或完全浓缩或冻干该萃取物；
ii)将该水性萃取物、从步骤i)得到的部分浓缩的水性萃取物或完全浓缩/冻干的萃取物的水溶液先后通过离子交换色谱得到中性水性萃取物；
iii)用正丁醇分离步骤ii)得到的中性水性萃取物，分离水相和正丁醇相；
iv)混合并搅拌步骤iii)得到得水相和甲醇或乙醇，分离固体沉淀，得到不溶性组分；以及
v)将步骤iv)得到的不溶性组分通过连续凝胶色谱和体积排阻色谱，得到纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白组合物。
12.根据权利要求11的方法，其中的C1-3醇选自甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇。
13.根据权利要求11的方法，其中的离子交换色谱是阳离子交换色谱之后接着阴离子交换色谱。
14.根据权利要求11的方法，其中的离子交换色谱是阴离子交换色谱之后接着阳离子交换色谱。
15.根据权利要求13或14的方法，其中的阳离子交换色谱使用磺化聚苯乙烯强酸阳离子交换剂或羧酸型弱酸阳离子交换剂。
16.根据权利要求13或14的方法，其中的阴离子交换色谱使用脂肪胺型弱碱阴离子交换剂或强碱阴离子交换剂。
17.根据权利要求11的方法，其中的凝胶色谱使用Amberlite聚合吸附剂。
18.根据权利要求11的方法，其中的体积排阻色谱使用sephacryl。
19.根据权利要求11的方法，其中的凝胶色谱选自XAD-2、XAD-4和XAD-7的Amberlite聚合吸附剂。
20.根据权利要求11的方法，其中体积排阻色谱选自sephacryl S-100、sephacryl S-200 HR、和sephacryl S-300 HR的sephacryl。
21.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1-10任一项所述的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白和药学可接受载体。
22.根据权利要求21的组合物，进一步包括至少一种非毒性相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂或调味剂。
23.根据权利要求21的组合物，其中的药学可接受载体选自糖、淀粉、纤维素以及它们的磷酸钙、硫酸钠衍生物；硫酸钙；聚乙烯吡烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；植物油；非离子、阳离子和阴离子表面活性剂；乙二醇聚合物；β-环糊精；脂肪酸或水解谷类固体。
24.一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白，平均分子量10KD至150KD，分离自蓟罂粟植物的叶和/或茎。
25.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求59所述的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白和药学可接受的载体。
26.一种纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白，平均分子量10KD至150KD，分离自蓟罂粟植物的叶和/或茎。
27.权利要求1-10、24或26中任一项的纯化的阿拉伯半乳聚糖-蛋白在制药中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物银屑病、炎症、自体免疫疾病、过敏、湿疹或鳞状发痒斑块或皮肤病。
28.权利要求21-23、25中任一项的组合物在制药中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物银屑病、炎症、自体免疫疾病、过敏、湿疹或鳞状发痒斑块或皮肤病。
29.根据权利要求24或25的用途，其中的疾病选自皮炎、硬皮病、湿疹、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、克罗恩氏疾病、多重硬化、刺激性肠病、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症和鳞状发痒斑块。
30.根据权利要求24或25的用途，其中的过敏是哮喘或慢性阻塞性肺病。
31.根据权利要求24或25的用途，其中的银屑病选自斑块型银屑病、点滴状银屑病、脓疱性银屑病和银屑病甲。
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