KR102394110B1

KR102394110B1 - 신규 화합물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102394110B1
Application number: KR1020200008356A
Authority: KR
Inventors: 양철우; 신동윤; 조미라; 이선영; 임선우; 신유진
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2022-05-04
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: KR20210094753A; US20230095498A1; WO2021149971A1

Abstract

본 발명은 신규한 화합물 및 이의 면역질환 치료 용도에 대한 것이다.

Description

신규 화합물 및 이의 용도{NOVEL COMPOUND AND USES OF THE SAME}

면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 전 세계에서 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.

염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 산화질소(NO) 등). 그러나 염증의 이들 매개자중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.

또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상 (림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다. 자가면역 질환으로서는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 류마티스성 질환, 건선, 전신성 피부근염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 또는 항원에 의한 면역반응 악화, 즉, 천식, 약물 또는 음식에 대한 알레르기 등. 이러한 질환들은 모두 제한성이고 만성인 질환들이며, 경우에 따라서는 치명적이고, 현재까지 상기 질환들을 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는 실정이다. 그러므로 당해 질환의 진행 중에 질환을 경감시키거나 완화시킬 수 있는 약물, 의약 또는 매체라면 환자의 건강을 위해서 중요한 해결 수단이 된다고 할 것이다.

자가면역 질환의 치료방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 집중적인 노력을 해왔다. 오늘날, 자가면역 질환의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용에 근거한 것이다. 그러나 이와 같은 약리 요법은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로, 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 이러한 약리 요법을 장기간 사용하였을 경우 여러 가지 세포 독성 작용이 문제가 되어, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써, 환자를 감염증 및 암에 걸릴 위험에 노출시킬 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적 증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다.

따라서 자가면역질환, 염증성 질환 등과 같은 면역질환을 치료할 수 있는 물질로서, 부작용이 없으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제10-2013-0069737호

이에, 본 발명의 발명자들은 인체 부작용이 적으면서 면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 소재를 모색하던 중, 새로이 합성한 신규 화합물이 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 신장 보호 효능을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 S1P lyase 활성을 억제할 수있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 신규한 화합물은 체내에 독성을 나타내지 않으면서도 면역학적 조절 능력이 우수하며, 종래 면역억제제와 달리 신장독성이 없고 오히려 신장 보호 효과를 가지고 있어, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 치료를 위한 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 면역세포에 대한 독성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 ROS 생산 억제 효능을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 면역학적 조절력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 S1P lyase 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 ROS 생산 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서 SD911 화합물의 세포 사멸 감소 효과를 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하에서는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기 화합물은 하기 반응식에 도시된 바와 같은 공정을 통해 합성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 포함할 수 있으며, 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 화합물은 신장 보호 효능을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

타크리니무스 등과 같은 종래의 면역억제제는 신장 독성이 있어 장기간 복용에 문제가 있으나, 본 발명의 신규한 화합물은 신장 보호 효능을 가지고 있어, 부작용이 없는 면역억제제로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.

본 발명에서 예방 및 치료할 수 있는 상기 면역질환은 류마티스 관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군, 궤양성 대장염, 이식거부반응, 이식편대숙주질환(GVDH) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화합물 또는 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물의 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³ ~1 x 10¹² 세포/kg 이다.

본 발명의 화합물은 S1P lyase 활성 억제력을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물에서, 상기 화합물은 1 내지 20 μM의 농도로 포함되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 15 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 5 μM, 2 내지 20 μM, 5 내지 20 μM 또는 10 내지 20 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

제조예 1. SD911 화합물의 제조

6-((R)-4(1-클로로프탈라진-4-일)-2-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-카보니트릴 (3)

(2)번 화합물(502mg, 2.48mmol)을 NMP(3.5ml) 용액에 1,4-다이클로나프탈레인(494mg, 2.48mmol)을 가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 화합하여 물로 세척하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : N-헥산 = 1:2)로 정제하여 화합물 (3)(49.4mg, yield = 5.46%)을 얻었다. MS (ESI) [M+H]+ 365

6-((R)-2-메틸-4-(1-페녹시프탈라진-4-일)피페라진-1-일)피리딘-3-카보니트릴 (SD-911)

(3)번 화합물(15.7mg, 0.043mmol)과 페놀(5.3mg,0.059mmol)을 DMF 용매(0.05ml)에 K₂CO₃ (16mg, 0.1161mmol)을 가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 화합하여 물로 세척하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : N-헥산 = 1:2)로 정제하여 화합물을 수득하고 이를 “SD-911”로 명명하였다(14.5mg, yield = 80%).

¹H NMR (600MHz, CDCl₃) 6(ppm) = 8.43 (d, J = 6.0Hz, 1H), 8.40 (t, J = 6.0Hz, 1H), 8.15 (m, 1H), 7.92 (m, 2H), 7.64 (m, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.28 (d, J = 12Hz, 2H), 7.23 (m, 1H), 6.64 (d, J = 6.0Hz, 1H), 4.74 (bs, 1H), 4.32 (d, J = 18Hz, 1H), 3.80 (d, J = 18Hz, 1H), 3.67 (d, J = 18Hz, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.29 (m, 1H), 3.20 (d, J = 6.0Hz, 1H), 3.15 (m, 1H), 1.52 (d, J = 6.0Hz ,3H); HMS (ESI) [M+H]+ 423.

실시예 1. 세포주 배양

본 실험에 사용한 human kidney-2 세포주는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 이들 세포들은 10% fetal bovine serum(FBS; Wisent, St. Bruno, Que, Canada), 100 U/mL penicilllin과 100 mg/mL streptomycin (Wisent)이 들어있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Wisent)에서 5% CO₂, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다.

실시예 2. 세포 생존률 조사

HK-2 세포를 80% seeding 한 뒤 24시간 후 타크리니무스(tacrolimus)를 60 ~ 70 ㎍/㎖와 SD911을 1 ~ 20μM 농도로 처리하고 3 ~ 12시간 반응시키고, 마우스의 비장조직에서 single cell로 분리한 세포의 경우 96-well plate에 2 x 10⁵/cell/200 ㎕를 triplicate로 seeding한 후 각 SD911 화합물을 1 ~ 20μM 로 처리하고 3일한 반응시켰다. 이후 cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo molecular, Rockville, MA, USA) 시약을 2시간 동안 처리한 뒤 450nm의 흡광도에서 측정하고 분석하였다.

HK-1세포에서 SD911의 세포 생존력 확인

타크리니무스(Tac)에 의한 HK-2 세포 독성유도 하에서 SD911 화합물의 세포 보호 효과를 조사하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, Nil에 비해 1, 5, 10, 20 μM 농도의 SD911는 자체의 약물독성은 확인되지 않았다. Nil을 100%로 보았을 때 타크리니무스(Tac)은 56.7%의 생존율을 보였으나 1, 5, 10 μM의 SD911을 타크리니무스(Tac)와 병합 처리한 경우는 각각 81.7%, 81.8%, 72.0%의 생존율을 유의하게 향상시켰으나, 20 μM의 SD911은 타크리니무스(Tac) 단독에 비해 37.4%의 낮은 생존율을 확인할 수 있었다(^$P<0.05 vs. Nil; ^#P<0.05 vs. Tac).

Mouse splenocyte에 대한 SD911의 독성검사

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, SD911 화합물(1,5,20μM)의 면역세포에 대한 독성조사를 실시한 결과 Nil군에 비해 유의한 차이는 보이지 않았다.

실시예 3. 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)측정

HK-2 세포를 80% seeding 한 뒤 24시간 후 타크리니무스(tacrolimus)를 60 ~ 70 ㎍/㎖와 SD911을 1 ~ 20μM 농도로 처리하고, 3 ~ 12시간 반응시킨 뒤 10μM DCF-DA(Molecular probes, Carlebad, CA, USA)를 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음 0.05% Trypsin과 0.53 mM EDTA로 세포를 수확하여 분석하였다. 분석은 FACS Calibur(BD bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 FSC(forward side scatter)와 SSC(side scatter) 산점도(dot plot)를 이용하여 응집된, 혹은 깨진 세포는 제거한 뒤, FL-1H channel(Excitation 488 nm, Emission 513 ~ 535 nm)에서 형광분율을 분석하였다.

실시예 1의 세포 생존력 확인 결과를 기초로 1, 5, 10 μM의 SD911에 대한 ROS 생성 억제 효과를 조사하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 1, 5, 10 μM의 SD911 단독에 대하여, ROS 검출하는 시약인 DCF-DA의 형광분율은 control인 Nil과 거의 차이가 없었다. 타크리니무스(Tac)에 의한 HK-2 세포 독성 유도시 31.6%의 비율로 ROS가 증가되었으며 5, 10 μM에서는 각각 13.7% 9.3%로 유의하게 감소하였다. 하지만 1 μM의 SD911 병합군은 오히려 36.5%로 타크리니무스(Tac)군과 크게 차이를 보이지 않았다(^#P<0.05 vs. Tac).

실시예 4. ELISA 분석

ELISA용 세포배양은 24-well plate에 조건수만큼 mouse anti-CD3 항체를 0.5 ㎍/㎖로 ccPBS에 희석해서 250 ul로 코팅하였다. 2 시간 동안 인큐베이션한 후 상청액을 걷어내고 세포를 1 X 10⁶/cells/1 ㎖ 로 seeding 후 각 약물 처리를 하였다. 3 일 동안 배양한 후 세포 배양액만 걷어내어 IL-10, IL-17 ELISA sample로 이용하였다.

도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, anti-CD3에 의한 면역활성 하에서 SD911 약물은 SD911 화합물을 처리하지 않은 군에 비해 농도 의존적인 경향으로 IL-17은 감소시키고, IL-10은 증가시키는 것을 확인하였다(^#P < 0.05 vs. aCD3 only; ^&P < 0.05 vs. 1 μM SD911; ^$P < 0.05 vs. 5 μM SD911).

실시예 5. 통계학적 분석 방법

분석결과는 PRISM software (version7.03 for Windows; GraphPad Software, LaJolla, CA, USA) 통계 프로그램을 이용하여 multiple comparison은 1-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc test를 사용하여 각 군 간의 평균치를 검정하였으며, P값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다.

실시예 6. SD911 화합물의 SPL 억제효과

실험동물의 간 조직을 lysis buffer에서 homogenize한 뒤 단백질 정량을 시행하여 농도를 확보하고 하기 표 1의 조건으로 혼합액을 만들어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 20ul 0.1nmol/ul heptadecanal(C17) 및 180ul MeOH를 넣고 하기 표 2와 같이 standard를 만들어 HPLC로 측정하고 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, Control에 비해서 SPL(S1P lyase) inhibitor인 SD911 화합물이 약 30% 감소된 S1P(Sphingosine 1-phosphate) lyase 활성을 보이고 있어 S1P lyase 활성 억제력이 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같이, SD911 화합물이 SPL활성 억제력을 가지고 있어 비이상적인 면역활성과 관련된 질환의 치료에 적용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

실시예 7. 신장 보호 효과 확인

HK-1세포에서 SD911의 ROS production 억제력 및 세포 사멸 감소 효과를 확인하였다. 실시예 2의 세포 생존력 실험 결과(도 2)를 기초로 1, 5, 10 μM의 SD911에 대한 ROS production억제 효과를 조사하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 1, 5, 10 μM의 SD911 화합물 단독에 대한 ROS 검출하는 시약인 DCF-DA의 형광분율은 control인 Nil과 거의 차이가 없었다. Tac에 의한 HK-2 세포 독성유도시 31.6%의 비율로 ROS가 증가되었으며 5, 10 μM에서는 각각 13.7% 9.3%로 유의하게 감소하였다. 하지만 1 μM의 SD911 병합군은 오히려 36.5%로 Tac군과 크게 차이를 보이지 않았다(^#P<0.05 vs. Tac).

또한, Tac에 의한 세포 사멸에 대한 SD911의 효과를 조사하기 위해 PI와 Annexin-V의 약물로 분석한 결과 Tac과 SD911(10 μM)의 병합군에서 Necrotic cells, apoptotic cells, 그리고 early apoptotic cell & necrotic cell의 비율이 Tac 단독에 비해 현저히 완화되는 효과를 확인하였다(도 7).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

신장 세포 보호 효과 및 S1P lyase 활성을 억제하는 효과를 갖는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]

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제1항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는 S1P lyase 활성을 억제를 통한 면역억제용 약학 조성물.
제1항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 S1P lyase 활성에 의해 유발되는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제5항에 있어서, 상기 화합물은 신장 보호 효능을 갖는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 화합물은 S1P lyase 활성 억제력을 갖는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.