CN100569940C - 人胚胎肾(hek)293细胞无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的无血清培养基，其是在现有基础培养基的基础上添加了转铁蛋白、胰岛素、Primatone、类脂混合物、氨基酸、无机盐和维生素等物质构成。该培养基能使(HEK)293细胞旺盛生长且成本低，是一种具有商业价值的细胞培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的培养基，具体地说，涉及一种用于HEK 293细胞培养的无血清培养基。
背景技术
人胚胎肾(HEK)293细胞首先由Graham等在1977年建立，是生产重组腺病毒的理想宿主。
HEK 293细胞的传统培养基是有血清培养基。但随着人们对动物血清可能污染生产过程、甚至最终产品的认识不断提高，有血清培养基的使用受到限制。无血清培养基，以其具有无源性污染、批次之间差异性小及有利于表达产物的分离纯化等优点越来越受到人们的关注。
目前已有适合HEK 293细胞培养的无血清培养基有：293-SFMII(Invitrogen)、Ex-Cell 525(JRH)、IS293-SF(Irvine Scientific)、Pro293s-CDM(Cambrex)、CD 293 Medium、FreestyleTM 293和Expression Medium(Gibco)等，但是这些无血清培养基的价格比较昂贵。因此本领域迫切需要研发一种低成本且适合HEK 293细胞培养的无血清培养基。
发明内容
本发明目的在于，提供了一种低成本且适用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的无血清培养基。
本发明的构思是这样的：
无血清培养基中由于缺少血清，必需添加血清替代因子，当前，替代血清的补充因子种类有很多，通常包括生长因子、激素、脂类、结合蛋白和微量元素等。为了开发适合HEK 293细胞的无血清培养基，本发明添加了以下血清替代物：
(1)转铁蛋白：一种结合铁的糖蛋白，与细胞表面专一受体作用，传递铁离子。
(2)胰岛素：胰岛β细胞分泌的多肽激素，促进细胞生长，调节葡萄糖和脂类的代谢。
(3)Primatone：一种蛋白胨，可以通过与维生素、脂类、金属离子、激素和生长因子结合而起到稳定和调节上述物质在无血清培基中的活性作用。在搅拌培养系统中，通过影响培养基的粘度和胶体渗透压而发挥对细胞的机械性保护作用。
(4)类脂混合物：磷脂是细胞的组成部分，添加类脂混合物可以促进磷脂的合成，加快细胞膜的合成，增加细胞膜的光滑性。
由于缺少血清的作用，细胞在无血清培养时的代谢情况会发生相应的变化，营养需求相应发生改变，为此，必需在有血清培养时的基础培养基的营养成分的基础上改变成分的含量。氨基酸是蛋白质合成的前体，它的利用也为细胞生长和产物生产提供能量。氨基酸还可以缓解氨的产生、二氧化碳和渗透压的影响。腺病毒的生产对氨基酸有较大的需求，因此，本发明的HEK 293细胞无血清培养基含有比一般基础培养基更多的氨基酸。
本发明所说的用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的无血清培养基，由氨基酸、维生素、无机盐和其它部分组成，其包括如下组分及含量：
氨基酸部分：
L-丙氨酸 0～30mg/L
L-精氨酸 50～300mg/L
L-谷氨酸 10～150mg/L
L-天冬酰胺 10～200mg/L
L-天冬氨酸 20～300mg/L
L-半胱氨酸 20～300mg/L
L-胱氨酸 50～600mg/L
L-甘氨酸 0～50mg/L
L-组氨酸 40～700mg/L
L-异亮氨酸 50～700mg/L
L-亮氨酸 80～1200mg/L
L-赖氨酸 90～1500mg/L
L-甲硫氨酸 20～400mg/L
L-苯丙氨酸 30～500mg/L
L-脯氨酸 0～50mg/L
L-苏氨酸 50～600mg/L
L-丝氨酸 50～200mg/L
L-色氨酸 10～200mg/L
L-酪氨酸 50～800mg/L
L-缬氨酸 50～700mg/L
L-谷氨酰胺 100～9000mg/L
维生素部分：
生物素 0.001～0.01mg/L
氯化胆碱 5～20mg/L
泛酸钙 2～10mg/L
叶酸 0～5mg/L
肌醇 5～20mg/L
维生素B1 2～10mg/L
维生素B2 0.1～0.5mg/L
维生素B6 2～10mg/L
维生素B12 0.2～1.0mg/L
烟酰胺 2～5mg/L
硫辛酸 0.1～0.5mg/L
无机盐部分：
柠檬酸铁 5～20mg/L
NaF 2～20mg/L
Fe(NO3)3.9H2O 2～10mg/L
FeSO4.7H2O 5～20mg/L
KCl 200～500mg/L
MgCl2 20～50mg/L
CuSO4.5H2O 0.001～0.01mg/L
CaCl2 2～200mg/L
Na2HPO4.2H2O 50～100mg/L
NaH2PO4.2H2O 50～100mg/L
亚硒酸钠 0.005～0.05mg/L
NaHCO3 2000mg/L
NaCl 6999.5mg/L
MgSO4 30～50mg/L
ZnSO4.7H2O 0.2～0.5mg/L
其它部分：
葡萄糖 2000～5000mg/L
胰岛素 2～20mg/L
转铁蛋白 2～20mg/L
聚乙二醇20000 2～10mg/L
Primatone 1000～5000mg/L
类脂混合物 0.1v/v％～0.5v/v％
氢化可的松 0.05～0.5mg/L
HEPES 1000～5000mg/L
Pluronic F-68 1～10g/L
葡聚糖 10～100mg/L
还原型谷胱甘肽 0～3mg/L
次黄嘌呤 4～10mg/L
胸腺嘧啶 0.3～0.5mg/L
其中：所说的类脂混合物为GIBCO公司生产的化学成分确定的脂质，其组成如下
花生四烯酸 2mg/L1
胆固醇 220mg/L1
DL-醋酸α-生育酚 70mg/L1
亚油酸 10mg/L1
亚麻酸 10mg/L1
豆蔻酸 10mg/L1
油酸 10mg/L1
棕榈烯酸 10mg/L1
棕榈酸 10mg/L1
硬脂酸 10mg/L1
吐温80 2200mg/L1
Pluronic F-68 100000mg/L1
用mg/L表示浓度单位的地方是该物质在无血清培养基中的浓度，用mg/L1表示浓度单位的地方是该物质在所购买的类脂混合物中的浓度，所用聚乙二醇分子量为20000。
上述所涉及的原料均为市售品，其中Primatone、HEPES和Pluronic F-68均购自Sigma公司。
制备本发明所说的无血清培养基的主要步骤是：将上述原料根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于20～30℃混合，使各组分含量如上所列，调节所得混合液的pH值至7.2，定容后即得目标物。
本发明所说的无血清培养基的使用方法与现有无血清培养基的使用方法相同。
附图说明
图1为实施例2和对比例1的试验结果图示。
其中：◇-采用DMEM+10％胎牛血清的培养基的细胞密度；
◆-采用无血清培养基的细胞密度。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的内容作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1
本发明所说的用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的无血清培养基的制备：
将下列原料根据其各自溶解特性分类溶解(按供应商提供的操作步骤进行)，然后将所得溶液于20～30℃混合，使各组分含量如下所列，调节所得混合液的pH值至7.2，定容后即得目标物。
氨基酸部分：
| 品名 | mg/L |
| L-色氨酸 | 20 |
| L-半胱氨酸 | 30 |
| L-胱氨酸 | 60 |
| L-酪氨酸 | 70 |
| L-异亮氨酸 | 90 |
| L-亮氨酸 | 120 |
| L-缬氨酸 | 92 |
| L-谷氨酸 | 14.5 |
| L-天冬酰胺 | 15 |
| L-甘氨酸 | 18.75 |
| L-脯氨酸 | 17.25 |
| L-丙氨酸 | 4.45 |
| L-精氨酸 | 14.75 |
| L-天冬氨酸 | 30 |
| L-组氨酸 | 62.75 |
| L-赖氨酸 | 275 |
| L-甲硫氨酸 | 26.68 |
| L-苯丙氨酸 | 54.8 |
| L-丝氨酸 | 87.5 |
| L-谷氨酰胺 | 584 |
| L-苏氨酸 | 54.5 |
无机盐部分：
| 品名 | mg/L |
| KCl | 311.8 |
| MgCl<sub>2</sub> | 28.61 |
| MgSO<sub>4</sub> | 48.84 |
| ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O | 0.432 |
| CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O | 0.001 |
| CaCl<sub>2</sub> | 2.220 |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O | 89.025 |
| NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O | 70.65 |
| 柠檬酸铁 | 6.1225 |
| Fe(NO<sub>3</sub>)<sub>3</sub>.9H<sub>2</sub>O | 2.050 |
| FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O | 3.417 |
| NaF | 4.2 |
| NaHCO<sub>3</sub> | 2000 |
| NaCl | 6999.5 |
| 亚硒酸钠 | 0.005 |
维生素部分：
| 品名 | mg/L |
| 泛酸钙 | 2.24 |
| 氯化胆碱 | 8.89 |
| 叶酸 | 2.65 |
| 肌醇 | 12.6 |
| 烟酰胺 | 2.0 |
| 维生素B6 | 2.0 |
| 维生素B1 | 4.17 |
| 维生素B2 | 0.219 |
| 维生素B12 | 0.68 |
| 生物素 | 0.0037 |
| 硫辛酸 | 0.1 |
其它部分：
| 品名 | mg/L |
| 还原型谷胱甘肽 | 0.75 |
| 次黄嘌呤 | 4.39 |
| 胸腺嘧啶 | 0.365 |
| 胰岛素 | 20 |
| 转铁蛋白 | 20 |
| 聚乙二醇20000 | 2 |
| Primatone | 4000 |
| 类脂混合物 | 0.2％(v/v) |
| 氢化可的松 | 0.05 |
| 葡萄糖 | 4500 |
| HEPES | 4000 |
| Pluronic F-68 | 1000 |
| 葡聚糖 | 100 |
| 酚红 | 10 |
实施例2
按与实施例1所述方法制得另一种用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的无血清培养基：其组成及含量如下：
L-丙氨酸 30mg/L
L-精氨酸 300mg/L
L-谷氨酸 150mg/L
L-天冬酰胺 200mg/L
L-天冬氨酸 300mg/L
L-半胱氨酸 300mg/L
L-胱氨酸 600mg/L
L-甘氨酸 50mg/L
L-组氨酸 700mg/L
L-异亮氨酸 700mg/L
L-亮氨酸 1200mg/L
L-赖氨酸 1500mg/L
L-甲硫氨酸 400mg/L
L-苯丙氨酸 500mg/L
L-脯氨酸 50mg/L
L-苏氨酸 600mg/L
L-丝氨酸 200mg/L
L-色氨酸 200mg/L
L-酪氨酸 800mg/L
L-缬氨酸 700mg/L
L-谷氨酰胺 9000mg/L
维生素部分：
生物素 0.01mg/L
氯化胆碱 20mg/L
泛酸钙 10mg/L
叶酸 5mg/L
肌醇 20mg/L
维生素B1 10mg/L
维生素B2 0.5mg/L
维生素B6 10mg/L
维生素B12 1.0mg/L
烟酰胺 5mg/L
硫辛酸 0.5mg/L
无机盐部分：
柠檬酸铁 20mg/L
NaF 20mg/L
Fe(NO3)3.9H2O 10mg/L
FeSO4.7H2O 20mg/L
KCl 500mg/L
MgCl2 50mg/L
CuSO4.5H2O 0.01mg/L
CaCl2 200mg/L
Na2HPO4.2H2O 100mg/L
NaH2PO4.2H2O 100mg/L
亚硒酸钠 0.05mg/L
NaHCO3 2000mg/L
NaCl 6999.5mg/L
MgSO4 50mg/L
ZnSO4.7H2O 0.5mg/L
其它部分：
葡萄糖 5000mg/L
胰岛素 20mg/L
转铁蛋白 20mg/L
聚乙二醇(20000) 10mg/L
Primatone 5000mg/L
类脂混合物 0.5v/v％
氢化可的松 0.5mg/L
HEPES 5000mg/L
PluronicF-68 10g/L
葡聚糖 100mg/L
还原型谷胱甘肽 3mg/L
次黄嘌呤 10mg/L
胸腺嘧啶 0.5mg/L
实施例3
在125ml的方瓶中培养已经适应了无血清悬浮培养的HEK 293细胞，接种密度为3×105cells/ml，装液量为20ml，再将接好种子细胞的方瓶置于摇床(型号：TZ-03，SHENERGYBIOCOLOR)上培养(摇床放在36.5℃，5％CO2培养箱中)，转速为120r/min，培养5天，最大细胞密度达到3.8×106cells/ml。结果如图1。本实施例使用的无血清培养基是由实施例1制得的。
对比例1
在125ml的方瓶中培养贴壁的HEK293细胞，接种密度为3×105cells/ml，方瓶放在36.5℃，5％CO2培养箱中，所不同的是：加入的培养基为DMEM+10％胎牛血清(FBS)，装液量为10ml，静止培养，培养5天，最大细胞密度为2.6×106cells/ml。结果如图1，本发明的无血清培养基适合于HEK 293细胞高密度生长。
Claims (1)
1、一种用于人胚胎肾(HEK)293细胞培养的无血清培养基，其特征在于，所说的无血清培养基由：将下列原料根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于20℃～30℃混合，使各组分含量如下所列，调节所得混合液的pH值至7.2，定容后即得目标物：
氨基酸部分：
L-色氨酸 20mg/L
L-半胱氨酸 30mg/L
L-胱氨酸 60mg/L
L-酪氨酸 70mg/L
L-异亮氨酸 90mg/L
L-亮氨酸 120mg/L
L-缬氨酸 92mg/L
L-谷氨酸 14.50mg/L
L-天冬酰胺 15mg/L
L-甘氨酸 18.75mg/L
L-脯氨酸 17.25mg/L
L-丙氨酸 4.45mg/L
L-精氨酸 14.75mg/L
L-天冬氨酸 30mg/L
L-组氨酸 62.75mg/L
L-赖氨酸 275mg/L
L-甲硫氨酸 26.68mg/L
L-苯丙氨酸 54.8mg/L
L-丝氨酸 87.5mg/L
L-谷氨酰胺 584mg/L
L-苏氨酸 54.5mg/L
无机盐部分：
KCl 311.8mg/L
MgCl2 28.61mg/L
MgSO4 48.84mg/L
ZnSO4.7H2O 0.432mg/L
CuSO4.5H2O 0.001mg/L
CaCl2 2.220mg/L
Na2HPO4.2H2O 89.025mg/L
NaH2PO4.2H2O 70.65mg/L
柠檬酸铁 6.1225mg/L
Fe(NO3)3.9H2O 2.050mg/L
FeSO4.7H2O 3.417mg/L
NaF 4.200mg/L
NaHCO3 2000mg/L
NaCl 6999.500mg/L
亚硒酸钠 0.005mg/L
维生素部分：
泛酸钙 2.240mg/L
氯化胆碱 8.890mg/L
叶酸 2.650mg/L
肌醇 12.600mg/L
烟酰胺 2.000mg/L
维生素B6 2.000mg/L
维生素B1 4.170mg/L
维生素B2 0.219mg/L
维生素B12 0.680mg/L
生物素 0.0037mg/L
硫辛酸 0.100mg/L
其它部分：
还原型谷胱甘肽 0.750mg/L
次黄嘌呤 4.390mg/L
胸腺嘧啶 0.365mg/L
胰岛素 20mg/L
转铁蛋白 20mg/L
聚乙二醇20000 2mg/L
Primatone 4000mg/L
类脂混合物 0.2％(v/v)
氢化可的松 0.05mg/L
葡萄糖 4500mg/L
HEPES 4000mg/L
Pluronic F-68 1000mg/L
葡聚糖 100mg/L
酚红 10mg/L。
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Granted publication date: 20091216 Termination date: 20140816 |
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