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CN100487116C - 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法 - Google Patents

应用非织造织物纯化和检测核酸的方法 Download PDF

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CN100487116C CNB028155246A CN02815524A CN100487116C CN 100487116 C CN100487116 C CN 100487116C CN B028155246 A CNB028155246 A CN B028155246A CN 02815524 A CN02815524 A CN 02815524A CN 100487116 C CN100487116 C CN 100487116C
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nucleic acid
supatex fabric
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cell extract
cell
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Abstract

从如血液或培养液的含细胞样本中分离和纯化核酸的方法。根据本发明的方法，通过细胞破坏所获得的细胞提取液吸附到由非织造织物制成的滤器上且在洗涤滤器后洗脱核酸。可应用pH 12或更高pH的碱性条件洗脱核酸，或通过用活性氧处理或通过应用表面活性剂洗脱吸附到滤器上的核酸。由本发明方法分离和纯化的核酸可用于核酸扩增和核酸序列分析技术。

Description

应用非织造织物纯化和检测核酸的方法
技术领域
本发明涉及应用非织造织物从细胞中以高纯度制备核酸的一种简单方法，以及涉及其制备试剂盒。本发明进一步涉及从已吸附核酸的非织造织物扩增核酸的方法，从已吸附核酸的非织造织物检测核酸序列的方法，以及制备用于以上方法中提及的已吸附核酸的非织造织物的方法和试剂盒。
背景领域
包括DNA在内的核酸通常从细胞中制备，所述制备通过用SDS或蛋白酶K处理含细胞的样本、然后用酚变性并移除蛋白质以纯化核酸而实现(分子克隆，第二版，9.16-9.23，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。由于该操作所需时间长且操作繁琐，因此，需要更为简单的方法。
在EP0389063中公开了应用二氧化硅的一种更为简单方法的示例。在此方法中，首先用离液剂处理细胞以使细胞裂解并释放出核酸。然后，核酸吸附到由二氧化硅或其衍生物组成的可结合核酸的支持物上，用离液剂或有机溶剂离心支持物并轻洗。最后，用低盐缓冲液洗脱核酸。尽管该方法比酚方法简单，但其缺点在于需要多个步骤以及需要离心过程。此外，由于其应用的离液剂或乙醇可强烈抑制PCR和其他酶反应，该方法的不利之处在于需要通过复杂且费时的操作移除这些物质。
特公平8-24583号和特开平8-280384号公开了应用吸附细胞的纤维集聚物例如白细胞分离滤器从外周血白细胞中纯化核酸的方法。
根据在特公平8-24583号中描述的方法，血液首先通过白细胞分离滤器以将血液的白细胞吸附到滤器上并将其从血液中的其他组份中分离开来。然后用TE缓冲液(10mM Tris；1mM EDTA；pH7.6)漂洗滤器以移除血红蛋白和其他蛋白质。例如，将已分离并漂洗的白细胞-80℃冻于每一滤器上，然后置室温以使白细胞溶解。然后，将TE缓冲液混合物(TE缓冲液，10mMNaCl，1.5mM MgCl2，pH7.5)加到纤维状材料中，且从纤维状材料中回收吸附到滤器的纤维状材料上的白细胞。但是，从特公平8-24583号的方法回收的白细胞中提取基因组DNA是通过现有技术步骤完成的。具体地，向白细胞中加入表面活性剂如10％十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶(蛋白酶K)，在65℃孵育15小时，且在进一步的37℃孵育1小时之前加入RNA酶(RNA酶A)。然后用酚处理并用乙醇沉淀以及纯化DNA。
在特开平8-280384号公开的方法中，有核细胞吸附后随之提取有核细胞中的核酸或蛋白质。提取核酸或蛋白质的方法通过将溶细胞溶液通过结合细胞的超细纤维集聚物而实施，以用于裂解或破坏细胞。该方法的优点在于吸附的细胞可直接被破坏或裂解。此外，由于吸附细胞的破坏或裂解无需分离吸附细胞，与需分离吸附细胞的方法相比该方法更易于进行。但是描述的用于细胞裂解后纯化核酸的方法为现有的技术方法，其中并未公开新的方法。也就是，吸附细胞的超细纤维集聚物用纯化水或表面活性剂处理，且用常规的酚-氯仿方法从已通过超细纤维集聚物的溶细胞溶液中纯化核酸。
应用吸附细胞的纤维集聚物作为白细胞分离滤器从外周血白细胞中制备核酸的此类方法已经公知，但这些方法的缺点在于，所公开的过滤方法应用到白细胞分离或核酸提取步骤之后，必需通过现有的核酸纯化方法纯化核酸，因此使方法变得复杂且需要更多的时间和操作。
最近，已在WO00/21973中公开了应用滤器从细胞中直接纯化核酸的方法。该方法包括以下步骤：(1)含细胞的样本通过滤器以将细胞吸附到滤器上；(2)裂解吸附到滤器上的细胞；(3)应用滤器进行过滤；(4)漂洗吸附在滤器上的核酸；(5)从滤器上洗脱核酸。吸附的核酸在加热到40℃至125℃间进行洗脱，且洗脱缓冲液的pH值在5到11的范围内，其可具有或高或低的盐浓度。纯化核酸的A260/A280吸光率为1.8且其可用作PCR模板。WO00/21973提及Whatman GF/D变体滤器用作滤器可用于核酸的纯化，且Whatman GF/C滤器作为不可用滤器的示例。其中陈述适于该方法的滤器的特征为，当纯化的DNA通过滤器时不可能被捕获，以及当裂解细胞通过滤器时DNA产量减少80％，因此并不实用。此外，当用此方法从血液中制备核酸时，实验者必需在裂解白细胞前使红细胞溶血。在将细胞吸附到滤器之后进行纯化的此类方法也具有这样的缺点，即必须根据细胞的类型来选择滤器。
美国专利号5,187,083和美国专利号5,234,824公开的方法中通过用表面活性剂裂解血液细胞且然后将其通过具有0.2到0.8μm孔径的滤器进行DNA的纯化。在美国专利号5,234,824中要求的方法为从血液细胞中快速制备纯化DNA的方法，并包括以下的步骤。(1)用含表面活性剂和粘度增强剂的溶液温和裂解细胞2到40分钟，避免高强度的剪切力，以制备含细胞DNA的裂解物。DNA的分子量必须足够大以使其可被滤器捕获。(2)然后用具有从0.2到0.8μm孔径的滤器过滤提取物以在滤器中捕获DNA。(3)在约100℃的纯化水中加热滤器5到15分钟以提取DNA。提取物也可含高达100mM的镁或钙。用于步骤(1)的粘度增强剂可为聚乙烯醇(分子量：70,000-100,000)、水溶聚合物、糖、多肽、明胶等。此外，血液必须至少稀释10倍以用此方法从血液中纯化DNA。否则，粘度太高则不能通过滤器进行过滤。
特表2001-520894号公开了通过以下步骤分离核酸的方法，(1)按规定方向将核酸上样到表面，(2)将核酸固定在表面，(3)从表面释放固定的核酸，以及(4)基本上以上样的方向移除从表面释放的核酸。可用膜作为表面，且膜可为疏水或亲水的。可应用的膜材料为尼龙、聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯，以及丙烯酸共聚物、聚氨基甲酸酯、聚酰胺、聚氯乙烯、聚氟碳酸酯、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚乙烯-四氟乙烯共聚物、聚乙烯-三氟氯乙烯共聚物或聚苯硫。膜孔的直径为0.001-50μm，优选地为0.01-20μm且最优选地为0.05-10μm。核酸固定可应用无机酸和碱或碱土金属的盐，碱或碱土金属和一价酸、多价酸或多官能团有机酸的盐，脂族或无环饱和或不饱和烃的羟基衍生物，酚或多酚，或离液剂。
该方法的缺点在于在吸附中必须加入醇或离液剂以增加核酸的产量。例如，当将RNA吸附到具有1.2μm大小孔径的疏水尼龙膜Hydrolon(Pall)上时，应用1M NaCl作为结合溶液时的产量为0.15μg，而用含36％乙醇的1M NaCl时的产量提高了10倍，为1.55μg。此外，应用含36％乙醇的500mM异硫氰酸胍或含36％乙醇的1M盐酸胍作为结合溶液的产量分别为2.3μg或6.7μg。应用离液剂时需要随后用含乙醇的缓冲液充分洗涤，之后进行干燥。
特表平11-501504号公开了从样本中分离核酸的方法，该方法包括将样本与表面活性剂和固定支持物接触以使样本中的可溶性核酸结合到支持物上，然后从样本中分离出结合核酸的支持物。以DYNABEADS名字出售的磁微粒被提及特别适用于作为本发明的固定支持物，且专门地用于实施例中。表面活性剂可为任何类型的表面活性剂，即，阴离子或阳离子表面活性剂，或非离子或兼性表面活性剂。
当应用磁微粒时，样本体积通常为几微升到几十微升。因此较大的样本体积需要前期的细胞浓缩，所述浓缩通过如离心或在移除不需要的细胞和基质后浓缩靶细胞实现。例如，当纯化0.5ml-血液中的白细胞DNA时，需要的操作包括溶血，随后离心以制备白细胞沉淀。收集的DNA为胶状的DNA/DYNABEADS复合体，该复合体可通过如吹打的操作容易地进行分散。因此洗涤时必须注意要轻柔操作以避免打碎复合体并由此显著降低DNA产量。
用活性氧或碱洗脱固体表面固定的核酸目前为止还未见报道。
随着近年人类基因组分析的快速发展，在医疗保健中已作出尝试将生成的基因组信息与定性改进进行活性结合。对单核苷酸多态性(SNPs)的数据处理将允许区分不同个体间的药物效果以确定用于每一患者的最佳药物和剂量，由此打开了所谓“针对个体的医疗处理”的大门。为实现应用SNPs的针对个体的医疗处理，研发快速、精确且价廉的SNP分型技术是必需的。在此，SNP分型技术包含从样本处理到输出最终的检测结果中所应用的所有技术，包括基因组的提取和纯化、核酸扩增以及核酸序列分析。
对于通过如聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增反应对特定核酸序列进行的扩增，或对于通过SNP分型技术对核酸序列进行的分析，扩增或序列分析的靶核酸通常以液体状态提供给反应系统。在以上引用的所有参考文献(WO00/21973、美国专利号5,187,083、美国专利号5,234,824，特表2001-520894号)中，收集的核酸为溶液形式。核酸制备的方法通常公知，但洗脱是费时的且需要设定合适的洗脱条件。通过减少核酸洗脱的时间或通过缩短洗脱过程自身并延续至随后的检测步骤可显著缩短用于检测所必须的时间。
美国专利号5,756,126描述了直接分析吸附到滤器上的核酸的方法。在此方法中，(1)将含核酸物质的样本加到干燥的固体介质上，所述介质上吸附了弱碱、螯合剂和阴离子表面活性剂以及用于分析所必须的组份，(2)保存样本，(3)移除样本中的蛋白质或血红蛋白，以及(4)分析样本。美国专利号5,972,386描述了直接分析吸附到滤器上的核酸的方法，该方法使用的用于保存核酸的干燥固体介质包含以下3个元件：(a)已吸附蛋白质变性剂的固体基质，(b)用于分析所必须的组份，以及(c)用于将该组份保留到基质上的保留剂。特别地，(1)将含核酸物质的样本加到干燥固体介质上，(2)保存样本，(3)移除样本中的蛋白质或血红蛋白，以及(4)分析样本。
在这两篇专利中，其上吸附有尿酸、Tris、EDTA和SDS的纤维素纸被提及作为干燥固体介质的示例。在将3μl血液置于9mm2大小的纤维素纸上，或将100μl血液置于100mm2大小的纸上，干燥并保存之后，对样本进行分析。在此例子中涉及的分析为PCR或基于内切酶片段长度多态性(RFLP)的电泳。这些方法的缺点在于，他们需要制备干燥固体介质的操作，以及可加到干燥固体介质上的样本的体积受到限制，因此减小了可固定在介质上的核酸的密度，以及必须应用如酚或乙醇的有机溶剂以移除包括血红蛋白在内的蛋白质，操作因此复杂且费时。
EP389,063描述的分离核酸的方法中，将样本、螯合剂和结合核酸的固相混合，核酸结合到固相上，然后分离并洗涤固相。提及的结合核酸的固相的示例为二氧化硅珠，以及PVDF滤器(MILLIPORE)、硝酸纤维素(Schleicher和Schuell)、Hybond-N(Amersham)等。也描述了直接以吸附核酸的滤器作为模板的PCR方法。核酸溶液与硫氰酸胍溶液和滤器混合以将核酸吸附到滤器上，然后用螯合剂和70％的乙醇洗涤并在56℃干燥。滤器直接加入到PCR反应系统中以允许靶核苷酸的扩增。但该方法的缺点包括需要应用螯合剂和有机溶剂，以及需要彻底移除强烈抑制PCR反应的螯合剂和乙醇，因此操作复杂且费时。此外，由于滤器通常用于杂交，因此并不适用于从如血液的生物物质中纯化核酸的目的。
WO98/51693描述了应用核酸检测样本中细胞的一般方法，其中(1)样本中的细胞结合到固体上，(2)裂解细胞，(3)从细胞中解离的核酸结合到与(1)相同的固体上，(4)检测靶细胞中的核酸。该方法的缺点在于，由于细胞必须首先结合到固体上，因此必须选择固体以使其与细胞类型匹配，并且过滤的流速也存在限制，这是因为细胞结合时不能破坏细胞。
发明内容
本发明的一个目的在于提供从含血细胞或类似细胞的样本中纯化核酸的方法，该方法较现有技术更为简便且产量更高。本发明的另一目的是提供制备可用于常规核酸扩增技术或核酸序列分析技术的核酸的快速且简便的方法。
本发明因此提供以下的内容：
(1)从含细胞的样本中制备细胞核酸的方法，该方法包括：
(a)破碎细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)使细胞提取液与非织造织物接触以将细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤；以及
(c)从非织造织物上洗脱核酸的步骤；
(2)(1)的方法，其中吸附到非织造织物上的核酸加热到40℃到100℃间的温度范围，优选地加热到80℃到95℃间的温度范围以洗脱核酸。
(3)(1)或(2)的方法，其中吸附到非织造织物上的核酸在pH12或更高pH的碱性条件下进行处理以洗脱核酸。
(4)(1)或(2)的方法，其中吸附到非织造织物上的核酸经过断裂以进行洗脱。
(5)(4)的方法，其中活性氧用于断裂核酸。
(6)(5)的方法，其中通过将二价金属离子加至还原糖产生所用的活性氧。
(7)(5)的方法，其中活性氧为过氧化氢。
(8)(5)的方法，其中通过将二价金属离子加至过氧化氢产生所用的活性氧。
(9)(4)的方法，其中应用酶来断裂核酸。
(10)(1)或(2)的方法，其中吸附到非织造织物上的核酸用表面活性剂处理以进行洗脱。
(11)(10)的方法，其中表面活性剂为非离子型表面活性剂或兼性表面活性剂。
(12)从含细胞的样本中制备并扩增细胞核酸的方法，该方法包括：
(a)破碎细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤；
(c)将核酸扩增溶液加到非织造织物并以吸附到非织造织物上的核酸为模板用于进行核酸扩增的步骤；以及
(d)回收反应液的步骤。
(13)(12)的方法，其中核酸的扩增通过PCR或LAMP方法进行。
(14)从含细胞的样本中制备细胞核酸并检测特定核酸序列的方法，该方法包括：
(a)破碎细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤；
(c)将用于检测核酸序列的溶液加入到非织造织物上进行反应的步骤；以及
(d)检测反应液的步骤。
(15)从含细胞的样本中制备细胞核酸并检测特定核酸序列的方法，该方法包括：
(a)破碎细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤；
(c)将用于检测核酸序列的溶液加入到非织造织物上进行反应的步骤；以及
(d)检测非织造织物表面的步骤。
(16)(14)或(15)的方法，其中核酸序列通过PCR或LAMP法检测。
(17)(15)的方法，其中通过应用探针进行杂交来检测特定核酸序列。
(18)(14)或(15)的方法，其中通过应用引物和聚合酶进行核酸延伸反应来检测特定核酸序列。
(19)(18)的方法，其中通过在核酸延伸反应中掺入标记核苷酸来完成检测。
(20)(18)的方法，其中对由核酸延伸反应产生的焦磷酸进行检测。
(21)制备吸附细胞核酸的非织造织物的方法，该方法包括：
(a)破碎细胞制备细胞提取液的步骤；以及
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤。
(22)从含细胞的样本中制备细胞核酸以及标记核酸的方法，该方法包含：
(a)破碎细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤；以及
(c)将核酸标记溶液加到非织造织物上并与之反应的步骤。
(23)(22)的方法，其中核酸用生物素、荧光或半抗原进行标记。
(24)(22)或(23)的方法，其中对吸附到非织造织物上的核酸自身进行标记。
(25)(1)到(24)中的任何一种方法，其中非织造织物材料为聚酯、聚丙烯或尼龙。
(26)(1)到(24)中的任何一种方法，其中非织造织物材料为聚对苯二甲酸乙二酯。
(27)(1)到(26)中的任何一种方法，其中非织造织物的孔径大小为2-150μm。
(28)(1)到(27)中的任何一种方法，其中非织造织物纤维大小为0.3-20μm。
(29)(1)到(28)中的任何一种方法，其中应用的细胞提取液不含粘度增强剂、离液剂或醇。
(30)(1)到(29)中的任何一种方法，其中应用含盐的细胞提取液。
(31)(30)的方法，其中细胞提取液中的盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐、磷酸盐、硫酸盐或盐酸盐。
(32)(30)的方法，其中细胞提取液中的盐为氯化钠，且其浓度为从10mM到1000mM。
(33)(30)的方法，其中细胞提取液中的盐为氯化镁，且其浓度为从1mM到100mM。
(34)(30)的方法，其中细胞提取液中的盐为磷酸钠，且其浓度为2mM到100mM。
(35)(30)的方法，其中细胞提取液中的盐为硫酸铵，且其浓度为20mM到1000mM。
(36)(1)到(35)中的任何一种方法，其中应用的溶细胞溶液含有阴离子表面活性剂、兼性表面活性剂或非离子型表面活性剂。
(37)(1)到(36)中的任何一种方法，其中破碎细胞制备细胞提取液的步骤在80℃到110℃的温度范围内进行。
(38)(1)到(37)中的任何一种方法，其中破碎细胞制备细胞提取液的步骤在还原剂存在下进行。
(39)(38)的方法，其中还原剂为含硫羟基的化合物。
(40)(1)到(39)中的任何一种方法，其中使细胞提取液与非织造织物接触的方法为过滤。
(41)(1)到(40)中的任何一种方法，其中在细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤之后进行洗涤非织造织物的步骤。
(42)(41)的方法，其中洗涤非纺织纤纤维的溶液不含离液剂或乙醇。
(43)(41)或(42)的方法，其中非织造织物用溶细胞溶液进行洗涤。
(44)(41)到(43)中的任何一种方法，其中洗涤非织造织物的盐溶液的浓度在0.5M到2M之间。
(45)用于从含细胞的样本中制备细胞核酸的试剂盒，该试剂盒包含：
(a)安装有非织造织物的装置；以及(b)含溶细胞溶液或含核酸洗脱液的溶液。
(46)用于从细胞中提取核酸以及用于制备其上吸附有核酸的非织造织物的试剂盒，该试剂盒包含：
(a)安装有非织造织物的装置；以及(b)含溶细胞溶液或含洗涤溶液的溶液。
(47)通过在pH12或更高pH的碱性条件下处理，用以洗脱吸附在固相表面的核酸的方法。
(48)通过用活性氧处理来洗脱固相表面吸附的核酸的方法。
(49)通过用表面活性剂处理来洗脱固相表面吸附的核酸的方法。
(50)已吸附核酸的非织造织物。
现在将更为详细地解释本发明。
根据本发明，“细胞”为真核细胞、原核细胞或病毒，且特别包括人的体细胞、人外周血白细胞以及感染性真菌、细菌和病毒。
根据本发明，含细胞的样本可为含有细胞的任何样本，包括血液、尿、脊髓液、痰、体液、细胞悬液、细胞培养物等。也可为通过某种形式处理这些样本而获得的处理溶液。处理方法包括，例如，高粘度样本的溶解，如用痰处理试剂处理痰。
根据本发明，细胞提取液为含细胞构成组份的混合物，通过细胞破碎而获得，且可通过将溶细胞溶液作用于含细胞的样本进行制备。溶细胞溶液为用于破碎细胞并提取核酸的溶液，包括表面活性剂、酶、EDTA等，尽管并非所有的这些成份均为必需。应用的酶可为蛋白酶，例如蛋白酶K，但根据细胞的类型也可应用溶菌酶、金葡溶菌酶(葡萄球菌(Staphylococcus))、β1，3-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、几丁酶(真菌)等。如果需要移除RNA，可加入如RNA酶A的核糖核酸酶。并非所有的情况下都需要加入酶，通过用低渗溶液处理样本也使动物细胞破碎。EDTA用于抑制降解DNA的酶，且通常的应用浓度为25mM。也可用机械力制备细胞提取液，例如将含细胞的样本用超声波处理或用匀浆器进行裂解。
优选地应用含盐的细胞提取液以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上。盐可加入到溶细胞溶液中，或在细胞提取液与非织造织物接触时加入。尽管可应用多种不同的盐，优选的盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐、磷酸盐、硫酸盐和盐酸盐。促进核酸吸附的浓度范围根据应用的盐而有所不同。例如，用于核酸吸附的适宜的氯化钠浓度为从10mM到1000mM，且优选地为从50mM到200mM，适宜的氯化镁浓度为从1mM到100mM，且优选地为从2mM到20mM，适宜的磷酸钠浓度为从2mM到100mM，且优选地为从20mM到100mM，适宜的硫酸铵浓度为从20mM到1000mM，且优选地为从20mM到200mM。核酸优选地在pH6-11范围内进行吸附，且优选的pH为6-8之间。
根据本发明，非织造织物为应用机械、热或化学方法通过粘合或缠绕纤维而形成的任何片状或网结构(纤维手册(Fiber Handbook)，第二版，日本纤维协会，Maruzen Pub1.)。非织造织物通过多种方法产生，但基本的步骤为网的形成(具有一定方向性排列的纤维团片)，网的粘合及网的完成。从天然纤维到化学纤维的多种类型的纤维被用于非织造织物，最常用的为棉、人造纤维、聚酯、聚丙烯和尼龙，以及丙烯、聚乙烯醇纤维、玻璃纤维、纸浆、碳纤维等。用于形成网的系统主要分为湿、干和直接方法。直接方法也称为熔融纺丝法，其中从熔化的聚合物溶液中纺成的纤维直接聚集成网。此方法包括无纺、纺丝粘合、熔融鼓风(melt blow)、针刺、缝编法。通过熔融鼓风方法产生的超细纤维非织造织物最适合用于本发明。
根据本发明，细胞提取液和非织造织物的接触可通过，例如，在细胞提取液中漂浮非织造织物、在细胞提取液中漂浮和浸湿非织造织物或将细胞提取液灌注在非织造织物的表面而实现。
根据本发明，进行洗涤意在洗去粘附在非织造织物表面的如蛋白质和脂类的物质。如SDS或Triton X100的表面活性剂或盐溶液(如0.5M或更高浓度的NaCl)可用作洗涤溶液，但并非仅限定于此，且洗涤溶液可根据粘附物质的类型进行选择。在一些情况下，洗涤步骤甚至可以忽略。
根据本发明，“碱处理”意指将纤维浸在pH为12或更高pH的水溶液中。通常应用的碱溶液包括但不限于NaOH、KOH等。碱处理后优选地需进行中和以使pH返回中性，中和应用具有近中性缓冲能力的化合物或酸，例如磷酸盐。
用于本发明的活性氧包括(但不限于)严格意义上的活性氧、广义的活性氧以及来自这些活性物质与生物分子(例如不饱和脂肪酸L)间的反应所产生的化合物，其中所述严格意义上的活性氧即过氧化物(O2·-)自由基(该自由基为3O2的单电子还原形式)，过氧化氢(H2O2)的双电子还原形式，单态氧(1O2)(其为电子激发状态下的氧分子形式)，或羟基自由基(HO·)，所述广义的活性氧即主要是金属氧复合物(包括金属含氧酸)，所述产生的化合物包括过氧自由基(LOO·)、烷氧自由基(LO·)、羟基过氧化物(LOOH)和氧化一氮(NO)。活性氧在“Kassei Sanso”[活性氧](蛋白质、核酸和酶，增加版，33卷，No.16)和“KosankaBusshitsu no Subete”[有关抗氧化剂](Sentan Igakusha)中详细描述。
已报道了产生活性氧的几种方法，例如，可通过以下方法容易地产生活性氧。尽管过氧化氢自身为活性氧形式，将二价金属离子如Ca2+或Fe2+加入到过氧化氢中可使过氧化氢充当氧化剂以生成羟基自由基(HO·)。也有报道将金属离子Cu2+加到如D-核糖的还原糖中可生成活性氧，并产生细胞毒性和核酸损伤。已知抗肿瘤抗生素博莱霉素在铁(II)和氧或铁(III)和过氧化氢存在条件下可产生切割DNA的活性氧复合物形式。
根据本发明的特别优选的活性氧形式包括，通过将如Cu2+或Fe2+的二价金属离子加到如D-核糖-5-磷酸或D-果糖-6-磷酸的还原糖中而产生的羟基自由基，以及通过将如Cu2+或Fe2+的二价金属离子加到过氧化氢中而产生的羟基自由基。当加入二价金属离子产生活性氧时，优选地将如EDTA的金属螯合剂加到活性氧反应混合物中，这是由于该螯合剂可阻止活性氧的产生并防止其对核酸的过度损伤。应用活性氧处理核酸的时间可为从1秒钟到10分钟，优选地从1秒种到5分钟且更优选地从10秒种到1分钟。
用于洗脱吸附到非织造织物上的核酸的优选条件取决于所吸附的核酸量和类型，例如，当通过将Fe2+作为二价金属离子加入到D-核糖-5-磷酸中产生羟基自由基时，D-核糖-5-磷酸的浓度可为从1mM到1M，优选地从10mM到500mM且更优选地从50mM到200mM。Fe2+浓度可从0.001mM到10mM，优选地从0.01mM到10mM且更优选地从0.05mM到5mM。反应温度可为30-65℃，优选地从40-60℃且更优选地从45-55℃。
根据本发明，吸附到非织造织物上的核酸可通过应用活性氧之外的方法片段化，例如应用识别并切割核酸的特异序列的限制性内切酶法，或使用降解核酸的酶，例如切割任意序列的DNase。也可将非织造织物暴露于紫外线以使核酸片段化。用于本发明的优选的限制性内切酶包括但不限于HaeIII、Sau3AI、EcoRI和BamHI。识别的核酸长度将根据限制性内切酶的不同而有所不同，例如4碱基识别序列的限制性内切酶优选于6碱基识别序列的限制性内切酶，这是因为前者产生更小的核酸片段并因此增加了从非织造织物上的洗脱效率。当应用酶时，酶量(浓度、比例等)将根据核酸的量和酶的类型而定。
根据本发明，“将核酸扩增溶液加入”或“将核酸序列检测溶液加入”到非织造织物上意指不进行核酸洗脱将全部或部分的吸附核酸的非织造织物直接提供给用于核酸扩增或用于核酸序列检测的反应系统。
根据本发明，核酸扩增方法为扩增特异靶核酸序列的方法且通常为PCR，但也可应用PCR以外的方法，包括连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、分枝DNA(bDNA)试验、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、循环探针技术(CPT)、Q-β复制酶扩增技术、滚环扩增技术(RCAT)、环介导的等温扩增(LAMP)以及等温和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)，且并不限于以上方法。Q-β复制酶、RCAT、NASBA、SDA、TMA、LAMP、ICAN等在等温条件下完成扩增反应，而PCR和LCR通过热循环完成扩增反应。
根据本发明，核酸序列检测方法为允许在滤器上分析核酸序列而不应用电泳或质谱分析的技术。此技术包括，例如应用荧光、发光、生色或同位素的常用探针杂交技术，应用核酸嵌入剂的方法，以及SNPs分型技术。SNPs分型技术的特定示例包括InvaderTM试验、TaqManTM、滚环扩增(RCA)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、引物延伸、LAMP和UCAN。
根据本发明，应用引物和核酸合成酶的核酸延伸反应为引物特异的5’→3’的DNA或RNA合成反应，应用依赖DNA的DNA聚合酶、依赖DNA的RNA聚合酶、依赖RNA的RNA聚合酶、反转录酶、链置换DNA聚合酶等。可应用的DNA聚合酶为克列诺片段、T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等，且并不限于此。应用引物和DNA聚合酶通过核酸延伸反应检测特定核酸序列的方法的示例包括前面提到的焦磷酸测序、引物延伸、LAMP的SNPs分型技术等。
根据本发明，离液剂为在水溶液中破坏水分子结构的物质的通用术语。
根据本发明，“表面活性剂”为具有亲水部分和亲脂部分的化合物，且表面活性剂主要分为离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂可通常分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和兼性表面活性剂。用于本发明的溶细胞溶液中的表面活性剂可为阴离子表面活性剂、兼性表面活性剂或非离子型表面活性剂，但不能应用阳离子表面活性剂。提及的阴离子表面活性剂的示例可为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基-N-肌氨酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺脱氧胆酸钠。提及的兼性表面活性剂的示例可为3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸、棕榈酰-溶血卵磷脂、十二烷基-N-甜菜碱和十二烷基-β-丙氨酸。提及的非离子型表面活性剂的示例可为辛基葡糖苷、庚基硫葡糖苷、葵酰基-N-甲基葡糖酰胺、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯七甲基己基醚、聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯和聚氧乙烯山梨醇酯。
根据本发明，“其中吸附到非织造织物上的核酸为自身标记”意指标记直接导入到吸附的核酸而不用重新合成核酸。此类标记法的示例包括非酶法导入或化学导入生物素或地高辛配基，或荧光物质如罗丹明、荧光素、Cy3、Cy5等，且试剂可从供应商获得。另一方面，“对吸附到非织造织物上的核酸进行标记”包括前面提到的直接标记，以及应用核酸合成酶和标记的核苷酸通过合成核酸的互补链而进行的标记。本发明的“半抗原”为这样的化合物，其自身具有低免疫原性但当其化学结合到载体时可诱导特异抗体的产生。例如，在以上描述的地高辛配基标记的情况下，地高辛配基用作半抗原。
现在将更详细地解释本发明。本发明者试验了不需应用离液剂或有机溶剂如乙醇的方便且快速的纯化核酸的方法。结果是，发现非织造织物非常适于核酸的纯化。发现一些其他类型的多孔滤器，例如在比较实施例2中描述的具有8μm孔径的聚碳酸酯轨道蚀刻(track-etched)的膜不能吸附核酸，且因此并非所有的多孔滤器均能用于核酸的纯化。轨道蚀刻的膜包被以薄膜双分子层，以SiCN作为顶层。另一方面，无论使用何种材料，发现孔大小为约10-130μm且纤维大小为约1.2-20μm的非织造织物适于从血液中纯化核酸。即，只要非织造织物的平均孔径大小为2-150μm，即可应用该非织造织物，其中7-13μm的孔径为特别优选。此外，可应用平均纤维大小为0.3-20μm的织物，0.7-1.7μm的大小为特别优选。尽管不同材料的非织造织物从血液中回收核酸的产量和纯度有高有低，发现聚酯、纤维素、丙烯酰、聚丙烯和尼龙中的每一种均可单独或与其他联合使用。将聚对苯二甲酸乙二酯(PET)薄层膜和非织造织物浸到含合适盐的纯化基因组DNA溶液中后，令人惊异地发现，基因组DNA可结合到非织造织物而不是薄层膜上。在此，“PET薄层膜”指完全无孔的PET薄膜。由于仅通过将DNA溶液与非织造织物接触即可使DNA结合到非织造织物上，因此认为DNA通过物理吸附结合到非织造织物上，而不是被滤器过滤了。这些结果表明，非织造织物形式特别适用于核酸的纯化。
进一步的试验发现，PET非织造织物，特别是孔径大小约10μm且纤维大小约1.2μm的PET非织造织物优于其他的非织造织物。仅将纯化的基因组DNA与PET非织造织物接触即可使80-90％的DNA吸附到非织造织物上。尽管如NaCl、MgCl2、HPO4 2-等的盐对核酸与非织造织物的结合是必需的，但并不需要如在特表2001-520894号中所描述的加入离液剂或乙醇来增加核酸产量，其实际上，乙醇的加入显著降低了吸附量。加热或打断核酸对洗脱结合到非织造织物上的核酸是必需的。此外，尽管用于核酸洗脱时在TE缓冲液中必须在95℃持续加热20分钟，发现在碱溶液中时间可缩短到5分钟，且应用活性氧可在室温下10秒种内完成洗脱。
本发明者进一步发现了吸附核酸的非织造织物的令人惊异的特性。具体地说，发现不仅可不洗脱核酸通过PCR等扩增吸附的核酸以及可将探针杂交到非织造织物上，而且也可在非织造织物上进行依赖引物的核酸延伸。因此用此方法可使得在同一非织造织物上进行核酸的纯化和检测，因此显著简化了操作时间和步骤。由于非织造织物具有光滑、薄层样的表面，因此在非织造织物上进行检测是可能的。本发明完全基于以上所描述的研究。
现在将更详细地解释本发明。本发明的特征是可以简便且快速的方式纯化细胞核酸，而不需应用离液剂或如乙醇的有机溶剂。由于离液剂或如乙醇的有机溶剂可强烈抑制包括PCR的酶反应，应用这些试剂的方法必须随之以充分洗涤的步骤，在应用乙醇的例子中，需进行充分的干燥。由于本发明不使用这些试剂且因此不需要此类充分洗涤和干燥的步骤，因此细胞核酸的纯化可以简单且快速的方式完成。
本发明的另一特征是该方法的高度灵活性，可适用于任何类型的细胞，这是因为细胞核酸可从细胞中释放出来并以液体状态应用于非织造织物。细胞可为如人白细胞的真核细胞，如大肠杆菌的原核细胞，甚至病毒。在细胞首先直接捕获到滤器上然后进行裂解的方法中，对特定的细胞类型必须优化滤器特性和吸附条件。此外，由于细胞结合到滤器上时不能被破坏，因此过滤的速度受到限制，通常需要低速通过滤器。根据本发明，通过滤器的是细胞提取液，且因此提高了流速。
而本发明的另一特性在于仅通过将细胞提取液通过非织造织物即可使核酸吸附到非织造织物上。此外，只要在纤维吸附核酸能力允许的范围之内，对样本中细胞数目或样本体积并无限制。相反，在用细胞溶液如FTATM浸润基片后裂解细胞的方法中，可被基片吸附的最大样本体积限制了处理体积，因此该方法并不非常适用于从大体积样本中提取核酸。例如，当从低细胞密度的大体积样本中的总细胞含量中获得核酸时，需要首先通过离心或其他方法浓缩细胞。而本发明的滤器并无对样本体积的此类限制。
制备细胞提取液的方法至关重要。细胞提取液优选地为无杂质溶液。细胞提取液的粘度优选不应太高，太高则会阻碍其通过非织造织物。尽管蛋白酶K(终浓度：0.1mg/ml)为优选，但并非必须。例如在室温裂解血液的情况下，蛋白酶K的加入可提高核酸产量，但不用蛋白酶K也同样可完成核酸的纯化。另一方面，50℃裂解血液时蛋白酶K的加入是必须的，这是由于在此温度下不加蛋白酶K时所制备的血液提取物当应用到非织造织物时，将易于引起阻塞并阻碍核酸的纯化。室温下处理5分钟是足够的，当也可少于5分钟。将处理时间延长到60分钟也不会发生问题。当根据本发明制备细胞提取液时，并不需要进行血液的10倍或更多倍的稀释或加入如在美国专利号5,234,824中所描述的如聚乙烯醇的粘度增强剂。本发明者也发现，高粘度样本如痰可在80-110℃的温度范围内进行热处理，或在还原剂存在下进行处理，以减小其粘度并促进其通过非织造织物。例如，如果痰不进行热或还原剂处理，将引起阻塞并不能通过非织造织物。热或还原剂处理将使痰中引起粘性的蛋白质和其他物质变性，因此降低其粘度并使其通过非织造织物而不引起阻塞。加热温度优选地为80℃或更高，但过高的温度可降解核酸因此并非优选。优选的上限温度为110℃。加热时间可为足以加热样本内部的时间，在以上详细描述的温度范围内加热时间通常至少为1分钟，且优选地为1-15分钟。应用的还原剂为使蛋白质变性但并不影响核酸的任何物质。含硫羟基的物质为优选的还原剂，且其示例包括二硫苏糖醇、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸和β-巯基乙醇。还原剂的最佳浓度及处理时间将根据应用的还原剂的还原能力而变化。例如，在为二硫苏糖醇的情况下，约1-10mM的浓度及约1-10分钟的处理时间为优选。热处理和还原剂处理也可一同进行。
只要细胞核酸没有降解，可应用任何方法保存的样本根据本发明来制备核酸。例如，含细胞的样本可为取样或制备后立即冷冻保存的样本。当为血液时可从新鲜血液或冷冻保存的血液中纯化核酸。
本发明的一个特征是，应用非织造织物作为多孔滤器。非织造织物的优点在于，用于本发明的非织造织物的平均孔径大于孔径为0.2-0.8μm的滤器(在美国专利号5,234,824中公开)，因此可达到更高的流速来防止阻塞。当从高粘度的样本中提取核酸时特别有利，所述高粘度样本如血液裂解溶液。例如，A040C01的平均孔径为10μm。此处，非织造织物的平均孔径为用水银测孔计测量的(中位)值。平均孔径为与纤维缠绕程度和构成滤器元素的裂隙大小有关的指标。由于非织造织物上的纤维以与液流垂直的平面方向排列且装填均匀，产生较小的侧流，因此在维持高处理速度时也可呈现卓越的核酸吸附能力。当出现阻塞问题时，可联合应用具不同纤维尺寸或孔径大小的非织造织物。此外，非织造织物可仅通过用其进行过滤即可实现与DNA溶液的接触，因此优于磁珠。为使磁珠与DNA有效接触，应用磁珠的方法必须使用最小的样本体积，体积通常限制在几微升到几十微升。这样就需进行特殊的处理，例如，通过如离心的方法将靶细胞浓缩。
用于核酸纯化的非织造织物可为，例如，亲水的包被产物如HM-3-包被的A040C01或未包被的产物如未包被的A040C01。发现A040C01比HM-3-包被的A040C01具有更大的吸附纯化基因组DNA的能力。A040C01为PET非织造织物，由Asahi Kasei公司生产。通过用共聚物包被A040C01获得HM-3-包被的A040C01，其中所述共聚物由溶于乙醇的HM-3(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(此后简写为HEMA)和甲基丙烯酸N，N-二甲基乙基酯(此后简写为DM)；HEMA:DM＝93:7)组成，且其用作Asahi医学有限公司
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的主要滤器。优选的非织造织物为，其成分例如表面包被剂在80-100℃的温度间不能洗脱，且可抵抗阻塞。非织造织物的白细胞吸附能力和其核酸吸附能力间并无特定的关联。显示出核酸吸附能力的非织造织物包括具有极好的白细胞吸附能力的HM-3-包被的A040C01和A040C01，也包括如E05070的实际上没有白细胞吸附能力的滤器。这是用于本发明的滤器的特性和在如WO00/21973中所需要滤器的特性间存在的一个显著差异。
与在WO00/21973中描述的直接在滤器中捕获细胞后裂解细胞的方法相比，本发明为一更简便的方法，具有更少的步骤。例如，从血液中纯化核酸时，WO00/21973的方法在核酸吸附到滤器前需要以下三个步骤：1)倒入血液，2)倒入溶血溶液以破坏红细胞，以及3)倒入溶细胞溶液以破坏白细胞。但根据本发明，仅将血液和溶细胞溶液混合并通过滤器。
仅将滤器浸在水中并在10-30℃放置1-2分钟并不能洗脱吸附到非织造织物上的核酸，这一点在特表2001-520894号中描述。用水或低盐缓冲液洗脱吸附在非织造织物上的核酸，通过在40-100℃且优选地在80-95℃温度间实现。特别地，根据本发明核酸洗脱可通过在TE缓冲液中80℃加热60分钟或95℃加热20分钟实现。也发现了用碱处理来洗脱的方法，该方法非常有用，因为与TE缓冲液相比该方法可在较短的时间洗脱吸附的DNA。加热进一步提高了洗脱速率，导致95℃5分钟内洗脱。由于已知碱处理使双链DNA变性为单链DNA，因此认为该变性过程促进了吸附到滤器上的核酸的洗脱。顺便提一下，有报道用1.2N的NaOH在90℃处理10分钟导致核酸中的腺嘌呤和胞嘧啶，特异是腺嘌呤，发生更多的选择性修饰(酶学方法，65卷，537页(1980))。由于实施本发明所应用的NaOH的浓度不高于0.2N，因此认为发生此类碱基修饰的机会很小。碱洗脱的核酸实际上也可用作PCR反应的模板，甚至在与碱洗脱相同的条件下处理杂交探针也可进行杂文。
碱洗脱的特征在于产生具有大分子量的洗脱核酸。当用TE缓冲液在95℃加热20分钟进行洗脱时，收集的核酸为几千到几万碱基的片段，而通过在碱溶液中95℃加热5分钟洗脱时，则产生几十万碱基或更大的片段。当需要制备大分子量的基因组DNA时，碱洗脱是非常有用的。本发明的碱洗脱方法对从根据本发明制备的核酸吸附滤器上洗脱核酸也是有效的，从核酸吸附滤器例如通过在WO00/21973、美国专利号5,187,083或美国专利号5,234,824中描述的方法所生产的核酸吸附滤器洗脱核酸也是有效的。
本发明也试验了在酸性条件下的洗脱。结果发现，在pH为3到5，优选地在pH为4到5之间的酸性溶液中，加热至70-100℃的温度范围内可促进核酸洗脱。例如，95℃ 10分钟从滤器上洗脱核酸，且该核酸可用作PCR模板。但是，该PCR扩增与在TE缓冲液中进行的洗脱相比较不易进行，可能是酸洗脱的核酸受了某种程度的损伤。实际上，已公知DNA中的脱氧核糖和嘧啶碱基之间的糖苷键在酸性条件下是稳定的，而与嘌呤碱基形成的糖苷键在酸性条件下发生水解，产生脱嘌呤核酸。应用的反应基于Maxam-GilbertDNA测序法，该方法为碱基特异的化学降解法，并且在此情况下，在pH值调节到2的0.1M的甲酸哌啶中于20℃处理60分钟(酶学方法，65卷，535页(1980))。为本发明描述的pH条件为pH3到5，且因此可发生核酸序列的损伤。
用碱洗脱时，洗脱后必须进行将其pH值恢复到中性的操作。本发明人发现在表面活性剂存在下的洗脱方法不需要这样的后续操作。非织造织物吸附的核酸在水中加热或在低盐条件下进行洗脱，但通过加入表面活性剂可进一步促进核酸洗脱。与用TE缓冲液的洗脱相比，表面活性剂具有降低洗脱温度及缩短洗脱时间的效果。由于在约1％浓度下的非离子型表面活性剂和兼性表面活性剂并不抑制PCR或杂交反应，因此它们非常适合用作洗脱剂以产生可直接应用的洗脱核酸。
本发明人进一步发现了在短时间内洗脱而在洗脱时无需控制温度的方法。通过用活性氧处理进行非织造织物吸附的核酸的洗脱是非常有用的，这是因为该方法与用TE缓冲液或用碱洗脱的方法相比，其使得吸附DNA的洗脱更为简单且时间更短。已公知核酸残基的磷酸酯键可被活性氧破坏，引起核酸的断裂，且认为断裂使得吸附到滤器上的核酸更易于洗脱。与不加入金属离子的情况相比，应用加入金属离子的过氧化氢可在更短的时间内断裂并洗脱滤器吸附的基因组。当增加过氧化氢的浓度时，基因组DNA断裂所需的时间缩短且洗脱可在更短的时间内完成。
已知作用于核酸的活性氧不仅切断核酸残基的磷酸酯键，特别地也对核酸的碱基部分造成损伤，且因此通过在短时间内进行活性氧处理的操作或将活性氧从洗脱的核酸溶液中快速移除，可能将核酸损伤的程度减到最小。移除活性氧的方法可为，例如，应用如NucleoSpinTM(Marcherey-Nagel)的核酸纯化柱以在核酸洗脱液中移除活性氧的方法，应用超滤膜以仅浓缩和纯化核酸的方法，或通过在盐存在条件下加入适量的乙醇以沉淀核酸的核酸纯化方法，后者通常称为乙醇沉淀法。当需要在金属离子存在下产生活性氧时，可在含金属离子的该活性氧反应液中加入金属离子螯合剂以阻止活性氧的产生。一备选方法是加入活性氧消除剂(自由基清除剂)以减少活性氧对核酸的剪切和损伤。例如，已知超氧化物歧化酶(SOD)为超氧化物的清除剂，且已公知抗坏血酸和谷胱甘肽为羟自由基和超氧化物的清除剂。用活性氧处理洗脱的基因组DNA实际上已成功地用NucleoSpinTM柱进行了纯化，且可用于PCR反应的模板，甚至在与用活性氧洗脱相同的条件下处理杂交探针时，杂交也是可能的。
作为一更为直接的方法，从非织造织物洗脱的基因组DNA可用作杂交的靶，或用作探针。特别地，基因组DNA制备物为生物素标记的并与从非织造织物洗脱的基因组DNA杂交，或从非织造织物洗脱的基因组DNA为生物素标记并与基因组DNA制备物杂交。结果证明由在TE缓冲液或碱溶液中热洗脱以及用活性氧洗脱而获得的核酸均可用作靶和探针。
本发明的另一特征是，吸附核酸的非织造织物可直接用于如PCR的核酸扩增，或核酸序列检测，而无需洗脱核酸。特别地，核酸提取/纯化和核酸扩增或核酸提取/纯化和核酸序列检测可在同一滤器上完成。由于不需洗脱过程，这使得从核酸提取到检测的整个过程得以大大简化，而处理时间也显著缩短。如果非织造织物以阵列排列，或核酸在同一非织造织物上以阵列形式点样，可容易地进行多重检测。根据本发明的从核酸提取、纯化到核酸扩增的步骤均可随之以靶核酸序列的分析，前述分析的检测方法如电泳或DNA微阵列，或应用质谱。
吸附到本发明非织造织物上的核酸的特征是其难以释放，且此特征允许探针的杂交或核酸的延伸反应在非织造织物上进行而无需特别的固定操作。扫描电子显微镜分析显示出吸附到非织造织物纤维表面的纤维状核酸。在电子显微镜下所见的纤维状核酸的分子量巨大，且由于其在多点与非织造织物纤维存在相互作用，因此认为如此长的核酸链很难释放。本发明吸附核酸的纤维的特征也在于，当Mg2+或如NaCl的盐加入到溶液中时，甚至通过加热也难以释放。结果，甚至在应用通常使双链DNA转换为单链DNA的热变性或碱变性条件下，核酸仍吸附到纤维上，因此可不应用如紫外照射的特定固定操作来进行杂交。在核酸扩增反应中，例如PCR反应通过向PCR反应液中加入小片的已吸附基因组DNA的非织造织物而实施，所述基因组DNA用作模板，从溶液中回收PCR扩增产物。
而本发明的另一特征是，应用吸附的核酸作模板的DNA延伸反应在非织造织物上进行。与以上描述的PCR扩增产物不同，DNA延伸链仍吸附在非织造织物上而不释放入溶液中。此方面的特征可用于构建高度敏感的检测系统。加入的标记核苷酸用作核酸延伸反应中DNA聚合酶的底物，这使得可通过在新合成的DNA中标记核苷酸的掺入实现对延伸反应的检测。应用的标记核苷酸可为，例如荧光标记的核苷酸或地高辛配基(DIG)标记的核苷酸(Roche Diagnostics)。当为DIG系统时，可如所公知的那样通过荧光、发光或生色反应与标记的抗DIG抗体联合完成检测，也可检测在DNA合成中产生的焦磷酸而不是检测标记核苷酸。可应用类似于焦磷酸测序反应以及萤光素-萤光素酶系统的发光通过使焦磷酸转换为ATP完成对其的检测，或通过测量焦磷酸镁形成时的混浊度完成检测。
根据本发明，也可直接标记吸附到非织造织物上的核酸。这优于对溶液形式的核酸标记，因为通过洗涤易于移除非织造织物上未反应的标记试剂。由于通过本发明描述的方法易于洗脱非织造织物上的标记核酸，故可用于如杂交的检测反应。
本发明的非织造织物允许每单位面积处理大量的细胞或允许处理大体积样本，且因此易于增加每单位面积内固定核酸的量(核酸密度)。由于较大量的待检核酸有利于进行检测，该方法在需要高敏感性的情况下特别有用，例如在感染诊断或在不需扩增以及样本相对易于获得的检测时。
附图简述
图1显示从血液中纯化的核酸的0.7％琼脂糖电泳。1泳道：1kb的DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：标记7GT(Nippon Gene)；3泳道：用HM-3-包被的A040C01纯化的核酸；4泳道：A040C01；5泳道：P020A(EL)；6泳道：P020C；7泳道：P090D；8泳道：N05070；9泳道：E05070。
图2显示PCR扩增产物的2％琼脂糖电泳。应用从血液中纯化的核酸作模板通过PCR扩增G3PDH基因。1泳道：100bpDNA梯(GibicoBRL)；2泳道：阴性对照；3泳道：阳性对照；4泳道：HM-3-包被的A040C01，5泳道：A040C01；6泳道：P020A(EL)；7泳道：P020C；8泳道：P090D；9泳道：N05070；10泳道：E05070。
图3显示从大肠杆菌扩增的核酸的0.7％琼脂糖电泳。1泳道：1kbDNA梯(GibicoBRL)；2泳道：标记7GT(Nippon Gene)；3泳道：用HM-3-包被的A040C01纯化的核酸。
图4显示PCR扩增产物的3％琼脂糖电泳。应用从大肠杆菌中纯化的核酸作模板通过PCR扩增核糖体蛋白L25基因。1泳道：BioMarker LoW(BioVentures)；2泳道：阴性对照；3泳道：阳性对照；4泳道：用HM-3-包被的A040C01纯化的核酸。
图5显示血液处理时间。■：室温，+蛋白酶K；□：室温，-蛋白酶K；●：50℃，+蛋白酶K；O：50℃，-蛋白酶K。
图6显示非织造织物上白细胞吸附率，以及相应的回收DNA产量。
图7显示在碱性条件下的DNA洗脱。吸附核酸的非织造织物浸在TE缓冲液、0.2N NaOH或0.05N NaOH并在95℃加热5-20分钟，并测量洗脱DNA的量。◆：TE缓冲液；■：0.2N NaOH；▲：0.05N NaOH。
图8显示在碱性条件下洗脱核酸的0.7％琼脂糖电泳。1泳道：1kb DNA梯(GibicoBRL)；2泳道：标记7GT(Nippon Gene)；3泳道：TE缓冲液，95℃，20分钟；4泳道：0.2N NaOH，95℃，5分钟；5泳道：0.2N NaOH，95℃，10分钟；6泳道：0.2N NaOH，95℃，20分钟；7泳道：0.05N NaOH，95℃，5分钟；8泳道：0.05N NaOH，95℃，10分钟；9泳道：0.05N NaOH，95℃，20分钟。
图9显示PCR扩增产物的2％琼脂糖电泳。以碱性条件下洗脱的核酸为模板通过PCR扩增G3PDH基因。1泳道：100bp DNA梯(GibicoBRL)；2泳道：阴性对照；3泳道：阳性对照；4泳道：TE缓冲液，95℃，20分钟；5泳道：0.2N NaOH，95℃，5分钟；6泳道：0.2N NaOH，95℃，10分钟；7泳道：0.2N NaOH，95℃，20分钟；8泳道：0.05N NaOH，95℃，5分钟；9泳道：0.05N NaOH，95℃，10分钟；10泳道：0.05N NaOH，95℃，20分钟。
图10显示温度对碱洗脱的影响。□：TE缓冲液；■：0.2N NaOH；：0.05N NaOH。
图11显示在酸性条件下洗脱的核酸的0.7％琼脂糖电泳。1泳道：1kb的DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：标记7GT(Nippon Gene)；3泳道：TE缓冲液，95℃，20分钟；4泳道：10mM的柠檬酸盐(pH4.5)/1mM EDTA，95℃，10分钟。
图12显示PCR扩增产物的2％琼脂糖电泳。以在酸性条件下洗脱的核酸作模板通过PCR扩增G3PDH基因。1泳道：100bp DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：阴性对照；3泳道：阳性对照；4泳道：TE缓冲液，95℃，20分钟；5泳道：10mM的柠檬酸盐(pH4.5)/1mM EDTA，95℃，10分钟。
图13显示碱洗脱对DNA探针的影响。DIG标记的DNA探针用0.05N的NaOH在95℃处理5分钟(点1、2)以及未处理的(3、4)。固定的λDNA的量为10ng(点1、3)和1ng(点2、4)。
图14显示用过氧化氢洗脱的核酸的0.7％琼脂糖电泳。用含0.1mMCuCl2的3％过氧化氢进行洗脱。1泳道：1kb DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：过氧化氢处理，室温，1分钟；3泳道：过氧化氢处理，室温，2分钟；4泳道：过氧化氢处理，室温，3分钟；5泳道：过氧化氢处理，室温，5分钟。
图15用过氧化氢洗脱的核酸为模板的PCR扩增产物的2％琼脂糖电泳。通过PCR扩增人G3PDH的部分序列，所述扩增的模板为用含0.1mM CuCl2的3％过氧化氢洗脱的核酸。1泳道：100bp DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：过氧化氢处理，室温，1分钟；3泳道：过氧化氢处理，室温，2分钟；4泳道：过氧化氢处理，室温，3分钟；5泳道：过氧化氢处理，室温，5分钟。
图16显示用还原糖和金属离子洗脱的核酸的0.7％琼脂糖电泳。用含100mM D-核糖5-磷酸和0.1mM CuCl2的活性氧溶液进行洗脱。1泳道：1kbDNA梯(GibcoBRL)；2泳道：50℃，1分钟；3泳道：50℃，3分钟；4泳道：50℃，5分钟；5泳道：50℃，10分钟；6泳道：50℃，30分钟；7泳道：用TE缓冲液洗脱，95℃，20分钟(对照)。
图17显示以还原糖洗脱的核酸为模板所获得的PCR扩增产物的2％琼脂糖电泳。通过PCR扩增人G3PDH的部分序列，所述扩增的模板为用含100mM D-核糖5-磷酸和0.1mM CuCl2的活性氧溶液洗脱的核酸。1泳道：100bp DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：50℃，1分钟；3泳道：50℃，3分钟；4泳道：50℃，5分钟；5泳道：100bp DNA梯；6泳道：50℃，10分钟；7泳道：50℃，30分钟。
图18显示用限制性酶从非织造织物上洗脱的核酸的0.7％琼脂糖电泳。1泳道：1kb DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：室温，5分钟；3泳道：室温，5分钟(柱纯化)；4泳道：室温，10分钟；5泳道：室温，10分钟(柱纯化)；6泳道：室温，30分钟；7泳道：室温，30分钟(柱纯化)；8泳道：37℃，5分钟；9泳道：37℃，5分钟(柱纯化)；10泳道：37℃，10分钟；11泳道：37℃，10分钟(柱纯化)；12泳道：37℃，30分钟；13泳道：37℃，30分钟(柱纯化)；14泳道：1kb的DNA标记物(GibcoBRL)。
图19显示活性氧处理对杂交的影响。应用用终浓度为50mM D-核糖5-磷酸和25μM CuCl2处理的DIG标记探针进行杂交，且DNA固定在尼龙膜上。不用活性氧处理或在TE缓冲液中95℃处理20分钟的DIG标记的DNA探针用作对照。
图20显示以吸附了作为模板的人类基因组DNA的非织造织物而进行的PCR。从血液提取的核酸吸附到非织造织物上并用于通过PCR扩增G3PDH基因。1泳道：100bp DNA梯(GibcoBRL)；2泳道：阴性对照；3泳道：阳性对照；4泳道：HM-3-包被的A040C01；5泳道：A040C01；6泳道：P020A(EL)；7泳道：P090D；8泳道：N05070；9泳道：E05070。
图21显示应用吸附了作为模板的大肠杆菌基因组DNA的非织造织物进行的PCR反应。从大肠杆菌提取的核酸吸附到HM-3-包被的A040C01上并用于通过PCR扩增核糖体蛋白L25基因。1道：BioMarker Low(BioVentures)；2道：阴性对照；3道：阳性对照；4道：HM-3-包被的A040C01。
图22显示了对非织造织物吸附的人类基因组DNA的检测。放射性同位素标记的DNA探针标记与两种不同的非织造织物HM-3-包被的A040C01和A040C01进行杂交，所述织物吸附有从0.25ml血液中提取的人类基因组DNA。固定了1μg人类基因组DNA(hgDNA)和1μg Lambda DNA(λDNA)的Hybond-N+尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech)用作对照。图例显示人类G3PDH探针和λDNA探针的混合比例。所有的混合物具有的总放射性为448,000Cpm。
图23显示吸附非织造织物吸附的核酸的扫描电子显微图。
A：非织造织物P03050(对照)；B：吸附血液核酸的非织造织物P03050。
图24显示对用于溶细胞溶液中的表面活性剂的检验。
X-114(Triton X-114)，TOC(Nissan Dispanol TOC)，X-100(TritonX-100)，CA630(Igepal CA630)，NS-208.5(Nissan N0nionNS-208.5)，HPC(氯化十六烷基吡啶鎓)，HPB(溴化十六烷基吡啶鎓)，HTAC(氯化十六碳烷基三甲铵)，HTAB(溴化十六碳烷基三甲铵)，CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-1-丙磺酸盐)，CHAPSO(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐)，SDS(十二烷基硫酸钠)。
图25显示NaCl浓度与纯化的基因组DNA吸附的相关性。
◆A040C01；▲A066A；■A040B
图26显示MgCl2浓度与纯化的基因组DNA吸附的相关性。
◆A040C01；▲A066A；■A040B；●E01030
图27显示HPO4 2-浓度与纯化的基因组DNA吸附的相关性。
◆A040C01；▲A066A；■A040B；●A040C01/HM-3
图28显示(NH4)2SO4浓度与纯化的基因组DNA吸附的相关性。
◆A040C01；■A066A；▲E01030
图29显示乙醇对纯化的基因组DNA吸附的影响。
将乙醇加到10mM的磷酸缓冲液(pH7.4)中并检测其对纯化的基因组DNA吸附的影响。
■10mM磷酸(pH7.4)；
Figure C02815524D0032092828QIETU
10mM的磷酸(pH7.4)/10％乙醇；
Figure C02815524D0032092812QIETU
10mM的磷酸(pH7.4)/20％乙醇；
Figure C02815524D0032092835QIETU
10mM的磷酸(pH7.4)/40％乙醇。
图30显示纯化的基因组DNA的振动吸附(1)。
■10mM Tris(pH8)/1mM EDTA/50mM NaCI；
Figure C02815524D00331
10mM Tris(pH8)/2mM MgCl2；
Figure C02815524D00332
50mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.4)。
图31显示纯化的基因组DNA的振动吸附(2)。
■10mM磷酸(pH7.4)；
Figure C02815524D00333
10mM磷酸(pH7.4)/0.2M硫酸铵；10mM磷酸(pH7.4)/0.5M硫酸铵；□10mM磷酸(pH7.4)/1.0M硫酸铵；
图32显示通过DNA产量对非织造织物的筛选。用新鲜血液作为样本。Gr1到Gr5代表所用血液来自不同的血液供体。
图33显示通过DNA纯度(A260/A280)对非织造织物的筛选。应用与图31相同的样本来检测A260/A280吸光度比值。
图34显示通过热处理从加入大肠杆菌的痰中纯化核酸(1)。这些是实施例27的源自大肠杆菌的核酸的检测结果。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1泳道：DNA分子量标记物；2泳道：从加入105个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；3泳道：从加入104个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；4泳道：从加入103个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；5泳道：从不加入大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物。
图35显示通过热处理从加入大肠杆菌的痰中纯化核酸(2)。这些是实施例27的源自人的核酸的检测结果。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1泳道：DNA分子量标记物；2泳道：从加入105个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；3泳道：从加入104个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；4泳道：从加入103个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；5泳道：从不加入大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物。
图36显示通过还原剂处理从加入大肠杆菌的痰中纯化核酸(1)。这些是实施例28的源自大肠杆菌的核酸的检测结果。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1泳道：DNA分子量标记物；2泳道：从加入105个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；3泳道：从加入104个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；4泳道：从加入103个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；5泳道：从不加入大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物。
图37显示通过还原剂处理从加入大肠杆菌的痰中纯化核酸(2)。这些是实施例28的源自人的核酸的检测结果。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1泳道：DNA分子量标记物；2泳道：从加入105个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；3泳道：从加入104个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；4泳道：从加入103个大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物；5泳道：从不加入大肠杆菌的痰样本中获得的核酸提取物的PCR扩增产物。
图38显示在非织造织物上进行的核酸延伸反应。两引物bACT1和bACT2与克列诺大片段酶反应液杂交，剂量分别为10μg、100ng、1ng和0ng，且延伸反应在37℃进行。
图39显示通过LAMP法在非织造织物上进行核酸扩增和检测。用Loopamp扩增的牛基因组DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳。1泳道：分子量标记物；2泳道：以吸附人基因组DNA的非织造织物为模板；3泳道：以吸附牛基因组DNA的非织造织物为模板；4泳道：以在TE缓冲液中热洗脱的吸附牛基因组DNA的非织造织物的上清为模板；5泳道：无模板；6泳道：以试剂盒提供的牛基因组DNA对照为模板。
图40显示用非织造织物纯化的基因组DNA的杂交(1)。试验通过TE缓冲液洗脱法和碱洗脱法进行。1μl用非织造织物纯化的DNA溶液点样到Hybond N+膜上并用作杂交的目标。
图41显示用非织造织物纯化的基因组DNA的杂交(2)。试验通过TE缓冲液洗脱法和过氧化氢洗脱法进行。1μl用非织造织物纯化的DNA溶液点样到Hybond N+膜上并用作杂交的目标。
图42显示用非织造织物纯化的基因组DNA的杂交(3)。试验通过TE缓冲液洗脱法、碱洗脱法和过氧化氢洗脱法进行，应用以非织造织物纯化的标记DNA作为杂交探针。
图43为显示用表面活性剂洗脱核酸的图表。加入500μl的含0.5％表面活性剂的水溶液或TE缓冲液，并在80℃加热20分钟用于洗脱吸附到非织造织物上的核酸。将在TE缓冲液中95℃加热20分钟所洗脱的核酸量定义为100％。
图44显示用表面活性剂洗脱的核酸的电泳。用NucleoSpin柱浓缩并纯化图43的洗脱样本并进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。
图45显示用表面活性剂洗脱的核酸的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。图43的洗脱样本用作G3PDH基因的PCR扩增模板。
图46显示PCR产物的电泳。用于基因组洗脱的表面活性剂加入到PCR反应体系用于PCR扩增G3PDH基因。1kb的分子量梯(GibicoBRL)用作DNA标记物。
图47显示应用生物素化学连结标记的核酸探针的杂交。生物素化学连接标记的核酸探针1或2与用人基因组DNA或λDNA点样的膜进行杂交。
实施例
本发明将通过以下的实施例更为详细地进行说明。但是，这些实施例仅用作阐述的目的且不构成本发明技术范围的限制。
[实施例1]用非织造织物从新鲜人血液中纯化核酸。
从健康供体中采取血液，并以每毫升血液10个单位的剂量加入肝素钠(Shimizu Pharmaceutical)作为抗凝剂。应用LeucoCOUNT试剂盒(Becton Dickinson)以流式血细胞计数器(FACS Calibur，BectonDickinson)测定血液中的白细胞数。在0.25ml血液中的白细胞数为1.16 x 106。应用的非织造织物为Asahi Kasei公司产品。非织造织物切成12mm直径的圆盘，四个圆盘堆积在一起并放置在滤器固定器(SWINNEX，MILLIPORE)上，用10ml的玻璃注射器置于上部且用一吸泵置于下部与滤器固定器连接。非织造织物最初用3ml的消化缓冲液(10mM Tris，pH8；100mM NaCl；25mM EDTA；0.5％ SDS)洗涤。
然后将0.05μg的蛋白酶K(PCR级，Roche)加到0.25ml的人血液中，且在进一步加入0.25ml的2X消化缓冲液(20mM Tris，pH8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％ SDS)后，将混合物置室温5分钟。该处理导致红细胞和白细胞的完全破坏。将血液提取物加到非织造织物上并立即进行吸滤。然后在吸滤下倒入8ml的消化缓冲液洗涤滤器。
之后，倒入3ml含1M NaCl的PBS/1mM EDTA并最后倒入3ml TE缓冲液(10mM Tris，pH8；1mM EDTA)进一步洗涤非织造织物。四个非织造织物圆盘从滤器固定器上移出并放置在带锁紧设备的Eppendorf管内，并加入0.5ml TE缓冲液。在80℃孵育1小时后，用UV-1600UV-可见光分光光度计(Shimadzu)测量流出液的A260(260nm处的吸光度)和A280(280nm处的吸光度)。认为A260/A280比值在1.8-2.0之间的流出液基本上为纯核酸。表1列出了A260/A280比值在1.8-2.0之间的非织造织物。通过以下公式计算DNA浓度(应用UV1600附带的软件：蛋白质程序包2.00版)。
DNA浓度(μg/ml)＝K1＊A260-K2＊A280
(K1＝62.90，K2＝36.00)
表1
Figure C02815524D00361
[实施例2]分析纯化的人核酸
在实施例1中获得的纯化核酸进行0.7％琼脂糖凝胶电泳并确认大小。向10μl实施例1的流出液中加入1.5μl的10X上样缓冲液(1％ SDS，50％甘油，0.05％溴酚蓝，TaKaRa)并彻底混匀后，将其全部进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。在Mupid Minigel Migration Tank(Advance)中50V电泳90分钟后，凝胶用溴化乙锭染色并用Bi0Image Gel Print 2000i/VGA照相。如在图1中所显示的，纯化的核酸含从几千到几万碱基的不同大小的核酸片段。
然后证实在实施例1中所获得的纯化DNA可用作PCR模板。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)0.45kb Control Amplimer Set(Clontech提供，目录号5405-3)用作引物。实施例1的流出液用蒸馏水10倍稀释并取5μl加入到PCR反应混合物中(终浓度：10mM Tris-HCl，pH8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mM dATP；0.2mM dGTP；0.2mMdCTP；0.2mMdTTP；1.25U AmpliTaq(Applied Biosystems)；0.5μM G3PDH3′-引物；0.5μM G3PDH5’-引物)，终体积为50μl。
混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，参数为：94℃5分钟1个循环；94℃30秒，55℃1分钟，72℃1.5分钟，30个循环；然后72℃7分钟。PCR反应结束后，向10μl反应液中加入1.5μl的10X上样缓冲液并与其彻底混匀，并将全部溶液进行2％琼脂糖电泳。在50V电泳45分钟后，凝胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print 2000i/GVA照相。结果如在图2中显示的。从所有纯化DNA片段中扩增出452bp的PCR产物，表明它们可用作PCR的模板。
[实施例3]大肠杆菌核酸的纯化
将HM-3-包被的A040C01(Asahi Kasei)切成12mm直径大小的圆盘，四个堆积在一起并放置在滤器固定器(SWINNEX，MILLIPORE)上，将10ml注射器置于滤器的上部并将吸泵置于滤器下部。非织造织物最初用3ml消化缓冲液(10mM Tris，pH8；100mM NaCl；25mM EDTA；0.5％SDS)洗涤。
向3ml LB培养基(1g胰蛋白胨(DIFCO)；0.5g酵母提取物(DIFCO)；1g NaCl；200μl 1N NaOH；100ml蒸馏水)加入50μl的大肠杆菌DH5甘油菌种后，将混合物在37℃培养4.5小时直到培养液的A600＝1.56。基于该吸光度的大肠杆菌的密度大约为6.2 X 109个细胞/ml。取1.6ml培养液(1010个大肠杆菌细胞)并以15,000转/分钟离心1分钟。细胞沉淀重悬在0.25mlLB培养基中。加入0.05μg/2.6μl的蛋白酶K(PCR级，Roche)且然后加入0.25ml 2X消化缓冲液(20mM Tris，pH8；200mM NaCl；50mMEDTA；1％ SDS)后，混合物置室温5分钟。混合物置于先前制备的HM-3-包被的A040C01上并立即进行吸滤。然后在吸滤下倒入8ml的消化缓冲液进行洗涤。
然后，倒入3ml的含1M NaCI的PBS/1mM EDTA以及最后倒入3ml的TE缓冲液(10mM Tris，pH8；1mM EDTA)进一步洗涤HM-3-包被的A040C01。从滤器固定器上移出四个HM-3-包被的A040C01并放置在带锁紧设备的Eppendorf管内，并加入0.5ml的TE缓冲液。在80℃孵育1小时后，测量流出液的吸光度。A260/A280比值为1.84的纯化核酸的产量为64.1μg。
[实施例4]大肠杆菌核酸的分析
在实施例3中获得的纯化核酸进行0.7％琼脂糖凝胶电泳并确认大小。向10μl的实施例3中的流出液中加入1.5μl的10X上样缓冲液(1％ SDS，50％甘油，0.05％溴酚蓝，TaKaRa)并彻底混匀后，将其全部进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。在Mupid Minigel Migration Tank(Advance)中50V电泳90分钟后，凝胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print 2000i/VGA照相。如在图3中所显示的，纯化的核酸含从几千到几万碱基的不同大小的核酸片段。
然后证实在实施例3中所获得的纯化DNA可用作PCR模板。以下化学合成的序列作为PCR引物从Sigma公司订购：从编码大肠杆菌核糖体蛋白L25的rplY基因293位的C到413位的A的核酸序列(SEQ ID NO：1)以及从与从567位的C到587位的A的核酸序列互补的序列(SEQ ID NO：2)。PCR扩增产物的长度为195bp。实施例3的流出液用蒸馏水4000倍稀释并取10μl加入到PCR反应混合物中，终体积为25μl(终浓度：60mM Tris/15mM(NH4)2SO4，pH10.0；50mM KCl；3.5mM MgCl2；0.2mM dATP；0.2mMdGTP；0.2mM dCTP；0.2mM dTTP；1.25U Takara Ex Taq(TakaraShuzo)；每一引物0.5μM)。
混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，参数为：94℃2分钟1个循环；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；然后72℃7分钟。PCR反应结束后，向10μl反应液中加入1.5μl的10X上样缓冲液并与其彻底混匀，将全部溶液进行3％ NuSieve 3:1琼脂糖电泳(Bi0WhittakerMolecular Applications)。在Mupid Minigel Migration Tank(Advance)中100V电泳40分钟后，凝胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print2000i/GVA照相。结果如在图4中显示的。扩增出195bp的PCR产物，表明混合物可用作PCR的模板。
[实施例5]从冷冻保存的人血液中纯化核酸
从健康供体中采取血液，并以每毫升血液10个单位的剂量加入肝素钠(Shimizu Pharmaceutical)作为抗凝剂。应用LeucoCOUNT试剂盒(Becton Dickinson)以流式血细胞计数器(FACS Calibur，BectonDickinson)测定血液中的白细胞数。在0.25ml血液中的白细胞数为1.16 x 106。
将0.25ml的血液置于Eppendorf管中并在-80℃冷冻。将37℃加热的0.25ml 2X消化缓冲液(20mM Tris，pH8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％ SDS)以及0.05μg的蛋白酶K(PCR级，Roche)加到0.25ml冷冻保存的血液中后，混合物在涡旋振动器上搅拌，其间定时在37℃水浴中加热，以达到完全溶解。溶液置室温5分钟后，将血液提取物加到非织造织物上并立即进行吸滤。之后根据在实施例1中描述的方法制备核酸。新鲜血液以同样方式处理作为对照。结果如在表2中所显示。从冷冻保存的血液中获得纯化核酸的方式与从新鲜血液中获得纯化核酸的方式相同。
表2
 
DNA(μg) A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>
新鲜血液 4.4 1.92
冷冻保存的血液 3.0 1.90
[实施例6]基因组DNA吸附至非织造织物
向6.20 X 107个人外周血白细胞加入620μl消化缓冲液(10mM Tris，pH8；100mM NaCl；25mM EDTA；0.5％ SDS)和蛋白酶K(终浓度：0.1mg/ml，PCR级，Roche)以悬浮白细胞。50℃孵育12小时后，加入等量的酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1(GibcoBRL)，充分混匀后于1700g离心10分钟。收取上清并重复操作两次。然后将上清转移到透析管中并用100倍体积的TE缓冲液(10mM Tris，pH8；1mM EDTA)在4℃透析三次。获得了531μg的A260/A280比率为1.76的基因组DNA。
将HM-3-包被的A040C01非织造织物切成12mm直径大小的圆盘，四个堆积在一起并放置在滤器固定器上(SWINNEX MILLIPORE)。10ml的玻璃注射器置于滤器固定器的上部，用TE-311 Terfusion注射泵(Terumo)以26.2ml/hr流速倒入3ml的PBS洗涤非织造织物圆盘。然后，26.3μg的基因组DNA溶解在1ml的PBS中并用HM-3-包被的A040C01过滤。然后用3ml的PBS洗涤非织造织物圆盘。回收所有的滤出液。最后，从滤器固定器上移出非织造织物并放置在带锁紧设备的Eppendorf管内，并加入0.5ml的TE缓冲液。80℃孵育1小时后，回收TE缓冲液。测量所有滤出物和流出液的体积和吸光度以计算DNA产率，结果如在表3中所显示。用HM-3-包被的A040C01过滤26.3μg的DNA时，约吸附65％的DNA且回收到51％的DNA(13.5μg)。DNA产率通过以下公式计算：
产率(％)＝100*回收DNA(μg)/26.3(μg)
表3
 
总DNA 滤过 洗涤 洗脱
DNA(μg) 26.3 6.6 2.7 13.5
产率(％) 100％ 25％ 10％ 51％
[实施例7]血液裂解条件
在实施例1相同的条件下进行实验，以检测血液处理时间、处理温度和蛋白酶K存在的影响。用HM-3-包被的A040C01作为非织造织物。向0.25ml的血液中加入蛋白酶K和2X消化缓冲液后，将混合物置室温或50℃处理5-60分钟，然后用HM-3-包被的A040C01纯化核酸。结果在图5中显示。在蛋白酶K存在下50℃处理5-15分钟，由于阻塞血液不能通过非织造织物，使得不能回收核酸。当在室温下处理5-60分钟时，加入或不加入蛋白酶K均可成功纯化核酸。
[实施例8]白细胞吸附能力和核酸吸附能力
用HM-3-包被的A040C01、A040C01、N05070和E05070作为非织造织物。每一非织造织物切成12mm直径大小的圆盘，四个圆盘堆积在一起并放置在滤器固定器中(SWINNEX，MILLIPORE)。10ml的玻璃注射器置于滤器固定器上部，且该玻璃注射器放置在TE-311 Terfusion注射器泵(Terumo)内。非织造织物圆盘流过3ml的乙醇之后流过3ml的PBS进行预处理。用注射器泵将流速设置为26.2ml/hr。将1ml的血液通过已预处理的非织造织物圆盘后，用6ml的PBS进行洗涤。最后，空气通过非织造织物圆盘以使所有的洗涤液体流出。回收所有排出的血液和洗液(作为滤液)，并测定体积和白细胞数量。应用LeucoCOUNT试剂盒(Becton Dickinson)以流式血细胞计数器(FACS Calibur，Becton Dickinson)测定用非织造织物过滤前血液中的白细胞量及存在于滤液中的白细胞量。通过以下公式计算白细胞表面覆盖度。
白细胞表面覆盖度(％)＝100*(1ml血液中的白细胞数量-滤液中的白细胞数量)/(1ml血液中的白细胞数量)
图6显示用以上方法测定的白细胞表面覆盖度对表1中显示的DNA产量的点绘图。在非织造织物的白细胞吸附能力(白细胞移除能力)和核酸吸附能力之间不存在相关性。
[实施例9]在碱性条件下洗脱核酸
在与实施例5相同的条件下进行实验以测定在碱性条件下的核酸洗脱。应用的非织造织物为Asahi Kasei公司的HM-3-包被的A040C01。用实施例5的方法将0.25ml冷冻保存的血液加到非织造织物圆盘上，并在最后倒入3ml的TE缓冲液洗涤非织造织物后，从滤器固定器上移出4个非织造织物圆盘并放置在带锁紧设备的Eppendorf管内，然后加入0.5ml的TE缓冲液，0.05N的NaOH或0.2N的NaOH以使其浸湿非织造织物，之后在热盒内95℃孵育5-20分钟。反应结束后，加入1/10体积(50μl，对于0.2N的NaOH)或1/40体积(12.5μl，对于0.05N的NaOH)的3M NaH2PO4以进行中和反应。应用
Figure C02815524D00421
单链DNA定量试剂盒(产品号0-11492，MolecularProbes)测定洗脱DNA的量。以试剂盒提供的18碱基寡核苷酸作为标准，用ARVOsx-3荧光读板仪(Wallac Berthold日本有限公司)在Ex485nm、Em535nm进行定量。非织造织物洗出液用TE缓冲液10倍稀释，并通过加入终浓度为2.5μg/ml的无DNase的RNase(产品号1119915，Roche)并在37℃反应30分钟以移除RNA。该处理使RNA降解并导致在OliGreen试验系统中确实检测不出RNA。用16S RNA和23S rRNA产物对此进行了确证。
测量结果在图7中显示。95℃下TE缓冲液洗脱的DNA量随反应时间增加(图7)，约20分钟时达到平台期。另一方面，95℃下在0.05N或0.2N的NaOH碱溶液中5分钟洗脱出相同数量的DNA。
将10μl的纯化DNA进行0.7％琼脂糖电泳并确认其大小。如在图8中所显示，在碱性条件下洗脱的DNA要大于用TE缓冲液洗脱的DNA。随着95℃洗脱5分钟、10分钟和20分钟反应时间的延长，洗脱DNA的大小减小。用0.05N的NaOH洗脱的DNA大于用0.2N的NaOH洗脱的DNA，但在这两种情况下DNA大小达到从几千到几十万个碱基。
然后证实在碱性条件下获得的纯化DNA可用作PCR模板。用与实施例2相同的方法进行PCR及其分析。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)0.45kbControl Amplimer Set(Clontech提供)用作引物。结果在图9中显示。甚至从碱性条件下洗脱的纯化DNA片段中扩增出452bp的PCR产物，表明DNA可用作PCR的模板。
[实施例10]温度对碱洗脱的影响
根据实施例9的方法制备吸附有血液来源的核酸的HM-3-包被的A040C01非织造织物，并检测洗脱温度的影响。用TE缓冲液95℃20分钟，用0.05N的NaOH95℃或70℃10分钟，以及用0.2N的NaOH 95℃、70℃、60℃、50℃或40℃10分钟进行洗脱，并比较洗脱DNA的量。以实施例9中相同的方法用
Figure C02815524D00431
单链DNA定量试剂盒测试DNA量。如在图10中所显示的，洗脱DNA的量随温度的提高而增加，在70℃或70℃以上时达到显著水平。
[对比实施例1]在酸性条件下洗脱DNA
根据实施例9的方法制备吸附有血液来源的核酸的HM-3-包被的A040C01非织造织物。用TE缓冲液95℃10分钟和20分钟，或用10mM的柠檬酸盐(pH4.5)/1mM EDTA缓冲液95℃10分钟进行洗脱。洗脱后，立即将1M的Tris(pH8.0)加入到洗脱液中进行中和。然后用UV-1600UV可见光分光光度计(Shimadzu)测定流出液的A260(260nm处的吸光度)和A280(280nm处的吸光度)，并计算洗脱核酸的量。结果在表4中显示。通过以下公式计算DNA浓度(应用UV1600附带的软件：DNA蛋白质程序包2.00版)。
DNA浓度(μg/ml)＝K1＊A260-K2*A280
(K1＝62.90，K2＝36.00)
表4
 
洗脱的DNA(μg)
TE，95℃，10分钟 1.1
TE，95℃，20分钟 6.4
pH4.5，95℃，10分钟 4.5
用与实施例9相同的方法对洗脱DNA进行0.7％琼脂糖电泳以证实核酸大小。结果在图11中显示。在pH4.5，95℃，10分钟下洗脱的核酸大小在从几千到几万个碱基的范围内。然后证实在酸性条件下洗脱的纯化DNA可用作PCR模板。同样用与实施例9中相同的方法完成试验。结果发现，在酸性条件下洗脱的DNA也可用于PCR(图12)。
[参考实施例1]碱洗脱对DNA探针的影响
为评估从非织造织物碱洗脱的DNA是否可用于杂交，以碱洗脱相同的条件用地高辛配基-11-dUTP(DIG)标记的DNA进行杂交。应用Roche的PCR DIG探针合成试剂盒和PCR DIG标记混合物进行DNA的DIG标记，并且用Roche DIG-HighPrime DNA标记/检测试剂盒完成杂交检测。制备50μl的PCR反应液(PCR缓冲液含1.5mM MgCl2(终浓度)；0.2mM dATP；0.2mM dGTP；0.2mM dCTP；0.19mM dTTP；0.01mM地高辛配基-11-dUTP；2.6U Expand High Fidelity AmpliTaq)，该PCR反应液含1ng的λDNA(Takara)和化学合成的DNA引物SEQ ID NO：3(终浓度：0.4μM)和DNA引物SEQ ID NO：4(终浓度：0.4μM)，从Nihon Bioservice订购，溶液在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，循环参数为：94℃3分钟，1个循环；94℃30秒，60℃1分钟，72℃3分钟，30个循环；然后72℃5分钟。用NucleoSpin柱通过Macherey-Nagel纯化标记DNA，产生50μl的DNA溶液。之后加入NaOH使其终浓度为0.05N或0.2N，混合物在热盒内95℃孵育5-20分钟并置于与用于碱洗脱相同的条件下。孵育过后通过加入1/10体积的3M NaH2PO4(对应于0.2N的NaOH)或加入1/40体加的3MNaH2PO4(对应于0.05N的NaOH)进行中和反应。再次用NucleoSpin柱纯化DNA溶液以获得50μl用于杂交的DIG标记的DNA探针。λDNA以从0.01ng到10μg点到Hybond N+膜(Amersham-Pharmacia)上，且在碱变性转换成单链后，通过UV交联固定在膜上。将其浸在DIG Easy Hyb(Roche)溶液中并42℃预杂交3小时，之后加入已预先热变性的单链DIG标记的DNA探针并在42℃孵育18小时进行杂交。之后用2XSSC、0.1％ SDS室温洗涤5分钟，洗涤两次，然后用0.1XSSC、0.1％SDS于68℃洗涤15分钟，洗涤两次。用洗涤缓冲液(终浓度：0.1M马来酸；0.15M NaCl；0.3％吐温20，pH7.5)平衡1分钟后，将膜浸到用马来酸缓冲液(终浓度：0.1M马来酸；0.15M NaCl，pH7.5)10倍稀释的封闭液(Roche)中1个小时。之后加入3μl的碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体(Roche)，将混合物室温放置30分钟。用洗涤缓冲液室温洗涤两次，每次15分钟，之后用碱性磷酸酶缓冲液(终浓度：0.1M Tris，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)平衡2分钟，并在加入1/100体积的现成CSPD(Roche)后，在37℃孵育20分钟。用HyperECL胶片(Amersham-Pharmacia))感光30分钟后，用显影器(Konica)显影。结果是，可检测到的碱性溶液处理的DNA探针信号与非碱性溶液处理的DNA探针信号强度相当(图13)。这些结果表明，在实施例9中显示的碱性条件下洗脱的DNA可用于杂交。
[实施例11]用过氧化氢水洗脱核酸
用与实施例5中相同的条件进行实验来检测用过氧化氢水洗脱核酸。应用的非织造织物为Asahi Kasei公司的HM-3-包被的A040C01。通过实施例5的方法将0.25ml冷冻保存的血液加到非织造织物上，倒入3ml含1M NaCl的PBS/1mM EDTA和10ml的纯化水洗涤后，加入1ml含3％过氧化氢水和0.1mM CuCl2的活性氧溶液，并缓慢压注射器将溶液注入整个非织造织物。置室温1、2、3和5分钟后，推动注射器以使全部自由基溶液流出，且用1ml的TE缓冲液洗脱吸附到非织造织物上的核酸。用NucleoSpin柱(Macherey-Nagel)对核酸进行快速纯化，去除流出液中的过氧化氢和金属离子。
通过测量OD260nm对纯化核酸进行定量。纯化核酸进行0.7％琼脂糖电泳以测定断裂程度。结果在图14中显示。这些结果显示出用过氧化氢处理短时间来洗脱吸附到滤器上的核酸。
然后证实用自由基溶液洗脱的纯化基因组DNA可用作PCR模板。用于实施例2中相同的方法进行PCR及其分析。特别地，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)0.45kb Control Amplimer Set(Clontech提供)用作引物。结果在图15中显示。结果表明，用过氧化氢洗脱的纯化基因组DNA可作为模板用于通过PCR扩增核酸。
[实施例12]用还原糖和金属离子洗脱核酸
用与实施例11相同的方法制备吸附有人核酸的HM-3-包被的A040C01非织造织物。然后将其从柱固定器上移除并转移到24孔板(SUMILON)并将各250μl的100mM D-核糖5-磷酸(SIGMA)和0.1mM的CuCl2作为自由基溶液加入，且织物置50℃并搅拌。在1、3、5、10和30分钟后加入50μl的0.5M EDTA以防止产生活性氧。取10μl的产物进行0.7％琼脂糖胶电泳。在50V进行45分钟电泳后，用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print2000i/VGA照相。结果在图16中显示。结果表明，通过加入二价金属离子的还原糖产生的活性氧已洗脱了吸附到滤器上的核酸。
通过与实施例11相同的方法，证实用该自由基溶液洗脱并纯化的基因组DNA可用作PCR模板。结果在图17中显示。结果表明，通过在短时间内的活性氧反应，应用由加入二价金属离子的还原糖产生的活性氧从滤器上洗脱的纯化人基因组DNA为模板，来PCR扩增核酸是可能的。
[实施例13]通过限制性酶洗脱核酸
用与实施例11相同的方法制备吸附有人核酸的HM-3-包被的A040C01非织造织物。然后将其从柱固定器上移出并转移到24孔板(SUMILON)并加入含2.5μl限制性酶Sau3AI(Takara)的酶溶液50μl，并将织物置室温或37℃5、10和30分钟。其中的50μl用NucleoSpin柱纯化以获得50μl洗脱的基因组溶液。取10μl的产物进行0.7％琼脂糖胶电泳。50V电泳45分钟后，胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print 2000i/VGA照相。结果在图18中显示。结果表明，滤器吸附的基因组DNA已被限制性酶切割并已被洗脱。
[参考实施例2]活性氧洗脱对DNA探针的影响
通过与参考实施例1相同的方法，证实用活性氧洗从非织造织物打断并洗脱的基因组DNA是否可用于杂交。应用地高辛配基-11-dUTP(DIG)标记的DNA进行杂交实验。应用Roche的PCR DIG合成试剂盒和PCR DIG标记混合物进行DNA的标记，并且用Roche DIG-High Prime DNA标记/检测试剂盒完成杂交和检测。制备50μl的PCR反应液含1ng的λDNA(Takara)和化学合成的DNA引物SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4(终浓度：各0.4μM)，溶液在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，循环参数为：94℃3分钟，1个循环；94℃30秒，60℃1分钟，72℃3分钟，30个循环；然后72℃5分钟。用NucleoSpin柱通过Macherey-Nagel纯化标记DNA，产生50μl的DIG标记的DNA探针溶液。含100mM D-核糖5-磷酸和0.05mM CuCl2的活性氧溶液50μl加到DIG标记的DNA探针，并将混合物置50℃2分钟和10分钟。用NucleoSpin柱进行再次纯化之后，移除溶液中的活性氧以获得活性氧处理的DIG标记DNA探针。随后的操作用与参考实施例1中相同的方法进行。结果在图19中显示。结果表明，活性氧处理的DIG标记的DNA探针也能够与固定在膜上的DNA进行杂交。
[实施例14]吸附到非织造织物上的人基因组DNA的PCR
通过与实施例11相同的方法用0.25ml冷冻保存的血液(白细胞数：1.15 X 106)处理来制备吸附有人核酸的非织造织物HM-3-包被的A040C01、A040C01、P020A(EL)、P090D、E05070和N05070。倒入3ml的含1M NaCl的PBS/1mM EDTA、3ml的TE缓冲液以及最终倒入3ml的纯化水洗涤后，将四个非织造织物圆盘从滤器固定器上移出并将在最上面(起始端)的非织造织物从中央切出3mm X 3mm的长方形并将其置于0.5ml PCR管的底部。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)0.45kb Control Amplimer Set(Clontech提供，Cat.No.5405-3)用作PCR体系。将非织造织物织物置入PCR管，并通过与实施例2相同的方法，加入50μl的PCR反应液并将混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中进行反应，循环参数为：循环参数为：94℃5分钟，1个循环；94℃30秒，55℃1分钟，72℃1.5分钟，30个循环；然后72℃7分钟。PCR反应结束后，将1.5μl的上样缓冲液加入到10μl的反应液中并彻底混匀，全部进行2％琼脂糖胶电泳。在50V进行45分钟电泳后，凝胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print 2000i/VGA照相。结果在图20中显示。从所有吸附核酸的非织造织物中扩增出452bp的PCR产物，表明吸附到非织造织物上的人基因组DNA可用作PCR模板。
[实施例15]非织造织物吸附的大肠杆菌基因组DNA的PCR
在3ml LB培养基加入50μl的大肠杆菌DH5甘油菌种后，将混合物在37℃培养3.5小时直到培养物溶液的A600＝0.9。基于该吸光度的大肠杆菌的密度大约为3.6 X 109个细胞/ml。取1.4ml培养物溶液并以15,000转/分钟离心1分钟。细胞沉淀重悬在0.25mlLB培养基中，并应用与实施例3相同的方法，制备吸附大肠杆菌核酸的HM-3-包被的A040C01。倒入3ml的TE缓冲液洗涤非织造织物后，从滤器固定器上移出四个非织造织物圆盘，并将在最上面(起始端)的非织造织物从中央切出3mm X 3mm的长方形并将其置于0.5ml PCR管的底部。应用与实施例4相同的PCR体系进行PCR反应，靶向扩增编码大肠杆菌核糖体蛋白L25的rplY基因，并将产物进行琼脂糖电泳分析。结果在图21中显示。扩增出195bp的PCR产物，因此证实非织造织物吸附的大肠杆菌基因组DNA可用作PCR模板。
[实施例16]通过探针杂交检测非织造织物吸附的人基因组DNA
通过与实施例11相同的方法用0.25ml冷冻保存的血液(白细胞数：1.15 X 106)来制备吸附有人核酸的非织造织物HM-3-包被的A040C01和A040C01。倒入3ml含1M NaCl的PBS/1mM EDTA然后倒入3ml的TE缓冲液洗涤非织造织物圆盘。
然后将经洗涤的非织造织物圆盘从滤器固定器上移出并将其转移到用于悬浮细胞培养的24孔板(SUMILON)，并通过碱变性将吸附到非织造织物圆盘上的基因组DNA转换成单链。立即加入0.5ml的杂交缓冲液(5XDenhardt’s；2X SSPE，0.2％SDS；10ng/ml鲑鱼精子DNA(Sigma))而不将基因组DNA固定在膜表面，之后置65℃1小时以进行预杂交。
通过以下方法制备用于人G3PDH基因的放射性同位素标记的DNA探针和用于λDNA的放射性同位素标记的DNA探针。首先，Clontech提供的G3PDH Control Amplimer Set用于以下的PCR反应。将PCR反应混合物(终浓度：10mM Tris-HCl，pH8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mMdATP；0.2mM dGTP；0.2mM dCTP；0.2mM dTTP；1.25UAmpliTaq(Applied Biosystem)；0.5μM G3PDH 3’-引物；0.5μM G3PDH5’-引物)加到含10ng人基因组DNA(GibicoBRL)的PCR管中，终体积为50μl。对于λDNA探针，加到PCR管中的终体积为50μl的PCR反应混合物(终浓度：10mM Tris-HCl，pH8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mMdATP；0.2mM dGTP；0.2mM dCTP；0.2mM dTTP；1.25UAmpliTaq(Applied Biosystem))含lng的λDNA(Takara)和化学合成的DNA引物SEQ ID NO：3(终浓度：0.4μM)以及DNA引物SEQ ID NO：4(终浓度：0.4μM)，从Nihon Bioservice订购。PCR反应混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，循环参数为：96℃5分钟，1个循环；96℃30秒，60℃1分钟，72℃3分钟，30个循环；然后72℃5分钟。PCR结束后，NucleoSpin提取试剂盒(Macherey-Nagel)纯化每一PCR产物以获得人G3PDH基因和λDNA的部分序列DNA片段。含20ng每一DNA片段的45μl的TE缓冲液置96℃5分钟，并迅速置冰浴5分钟以转换成单链DNA。加入Rediprime II DAN标记体系(Amersh am Pharmacia Biotech)和1.85MBq的Readyview[α-32P]dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)的标记反应混合物并轻轻混合后，将混合物置于37℃10分钟进行标记。然后用BioSpin柱G-30(BIO RAD)纯化以移除未反应的[α-32P]dCTP，并再次置96℃5分钟并置冰浴5分钟用以转换成单链DNA，以获得放射性同位素标记的人G3PDH DNA探针和λDNA探针。
用闪烁计数器测量每一放射性同位素标记的探针的放射活性，并以等量总放射活性将人G3PDH探针和λDNA探针按不同比例混合，然后将它们加入此前的预杂交液并将混合物置65℃18小时进行杂交。杂交后，将非织造织物圆盘转移到新的24孔板，加入0.5ml的2XSSC、1％ SDS于65℃洗涤10分钟，然后加入0.5ml的0.1XSSC、1％ SDS于65℃洗涤10分钟，即共进行两次洗涤。洗涤后，移出非织造织物圆盘并转移到含5ml液体闪烁剂的小瓶中，并用闪烁计数器测量非织造织物上的残余放射活性。结果在图22中显示。用G3PDH探针检测到非织造织物圆盘上的基因组DNA，用低比例的人G3PDH探针检测出较低水平的放射活性，表明检测到人G3PDH探针和非织造织物圆盘上的人基因组DNA中G3PDH基因间的特异杂交。
[实施例17]吸附在非织造织物上的核酸的释放
通过与实施例11相同的方法用0.25ml冷冻保存的血液(白细胞数：1.15 X 106)处理来制备吸附有人核酸的非织造织物HM-3-包被的A040C01。倒入3ml的纯化水洗涤非织造织物，然后从滤器固定器移出四个非织造织物圆盘并将其置于1.5ml的Eppendorf管中。制备5组，每组处理温度、时间及加入的溶液均不同，如在表5中列出的。用热盒进行95℃处理。相对洗脱率(％)为在列出条件下洗脱核酸的量与以在TE缓冲液中95℃20分钟处理洗脱的核酸量作为100％的比值。表5的结果表明在含Mg2+或高浓度盐的溶液中甚至当加热到95℃时核酸也不易释放，并且在碱性变性条件下室温时核酸也不易释放。
表5
 
溶液 温度(℃) 时间(分钟) 相对洗脱率(％)      
TE 95 20 100
10mM Tris(pH8.0)/1mM MgCl<sub>2</sub> 95 20 5
10mM Tris(pH8.0)/10mM MgCl<sub>2</sub> 95 20 3
含1M NaCl/1mM EDTA的PBS 95 20 4
0.05N NaOH 25 10 2
[实施例18]非织造织物吸附的核酸的电子显微照片
以与实施例14相同的方法用非织造织物P03050制备吸附核酸的滤器。倒入纯化水洗涤非织造织物圆盘后，从滤器固定器上移出四个非织造织物圆盘，并用DC-41冷冻干燥仪(Yamato)在最上面(起始端)冷冻干燥非织造织物圆盘。用相同的方法制备另一非织造织物组，不同之处在于倒入的是血液，该组也经冷冻干燥作为对照。干燥的非织造织物切成大约5mm的正方形并用碳胶固定到SEM样本台。风干后用OPC-80锇等离子涂布机(Nippon Laser and Electronics)进行锇等离子覆盖，厚度为20nm，以制备显微样本。用S-900场致发射的扫描电子显微镜(Hitachi)以1KV的加速电压通过SEM观测样本。在图23中显示的照片清楚地表明，核酸为纤维状的并已吸附到非织造织物纤维的表面。
[实施例19]表面活性剂的研究
用与实施例5相同的条件进行实验以研究用于核酸提取的表面活性剂类型。应用的非织造织物为Asahi Kasei公司的HM-3-包被的A040C01。0.25ml冷冻保存血液中的白细胞量为1.50 x 106个。向0.25ml冷冻保存的血液中加入加热到37℃的0.25ml 2X消化缓冲液(20mM Tris，pH8；200mM NaCl；50mMEDTA；1％表面活性剂)。应用的表面活性剂选自以下的表面活性剂。特别地，所用的表面活性剂为阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)，兼性表面活性剂3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-1-丙磺酸盐(CHAPS)或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)，非离子型表面活性剂聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-114)、聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)、聚氧乙烯烷基醚(Nissan Dispanol TOC)、(辛基苯氧基)聚乙氧基醇(Igepal CA630)或Nonoxynol-8.5(Nissan Nonion NS-208.5)，或阳离子表面活性剂氯化十六烷基吡啶鎓(HPC)、溴化十六烷基吡啶鎓(HPB)、氯化十六碳烷基三甲铵(HTAC)或溴化十六碳烷基三甲铵(HTAB)。加入2X消化缓冲液并进一步加入0.05μg的蛋白酶K(PCR级，Roche)后，将混合物在涡旋振动器上搅拌，其间间歇地在37℃水浴中加热，以达到完全溶解。溶液置室温5分钟后，将血液提取物加到非织造织物圆盘上并立即进行吸滤。然后倒入8ml的含相同表面活性剂的消化缓冲液洗涤滤器。
然后倒入3ml含1M NaCl的PBS/1 mM EDTA和3ml的TE缓冲液(10mM Tris，pH8；1mM EDTA)洗涤非织造织物圆盘。从滤器固定器上移出非织造织物并置于带锁紧设备的Eppendor管中，且将非织造织物浸在0.5ml的TE缓冲液中并用热盒在95℃孵育20分钟。
以与实施例9相同的方法用
Figure C02815524D00521
单链DNA定量试剂盒测试从非织造织物圆盘上洗脱的DNA量。如在图24中所示，当应用阴离子表面活性剂、兼性表面活性剂或非离子表明活性剂时可纯化核酸，但应用阳离子表面活性剂时不能回收到核酸。
[比较实施例2]不为非织造织物的多孔滤器
用与实施例1相同的条件进行实验以测试不为非织造织物的多孔滤器是否可用于核酸纯化。应用的多孔滤器为多孔的聚氨酯薄膜(IMUGUARDIII-RC Main Filter，Terumo)和孔大小为8μm并涂覆有SiCN薄膜作为顶层的聚碳酸酯轨道蚀刻膜(OIA流通膜，US BioStar)，而Asahi Kasei公司的HM-3-包被的A040C01非织造织物作为对照。
将滤器切成12mm直径的圆盘，并将每一多孔聚氨酯薄膜或IOA流通膜，和四个A040C01/HM-3非织造织物圆盘放置在滤器固定器(SWIMMEX，MILLIPRORE)上。10ml的玻璃注射器置于上部且吸泵置于下部与滤器固定器连接。滤器首先用3ml的消化缓冲液(10mM Tris，pH8；100mM NaCl；25mM EDTA；0.5％ SDS)洗涤。
然后，向0.25ml人血液(白细胞数：1.62 x 106)中加入0.05μg的蛋白酶K(PCR级，Roche)，且在进一步加入0.25ml的2X消化缓冲液(20mMTris，pH8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％ SDS)后，将混合物置室温5分钟。将血液提取物加到滤器上并立即进行吸滤。随后的实验用与实施例1相同的方法进行，且基于吸光度测定洗脱核酸的量。如在表6中所显示，多孔聚氨酯薄膜能够纯化核酸，尽管其核酸产量和纯度均低于A040C01/HM-3非织造织物，但用IOA流通膜不能纯化核酸。此结果表明，甚至一些具有约8μm孔径大小的多孔滤器也不能用于核酸纯化。
表6
 
多孔滤器 DNA(μg) A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>
多孔聚氨酯薄膜 5.2 1.70
OIA流通膜 0.2 1.21
A040C01/HM-3 8.6 1.95
[实施例20]纯化基因组DNA吸附条件的研究(1)-盐的影响
用纯化的基因组DNA测试溶液组成对非织造织物吸附DNA的影响。在实施例6中纯化的基因组DNA作为样本。将Asahi Kasei公司的非织造织物A040C01、HM-3-包被的A040C01、A066A、A040B或E01030中的一个切成12mm直径大小的圆盘，四个圆盘堆积在一起并放置在滤器固定器(SWIMEX，MILLIPORE)上。然后用3ml乙醇再用3ml的TE缓冲液洗涤非织造织物圆盘，且最终倒入3ml的样本缓冲液进行平衡。10ml的玻璃注射器置于滤器固定器的上游并安置在HARVARD APPARATUS MODEL55-2219注射器泵(HARVARD APPARATUS Inc.)内。
用于溶解纯化的基因组DNA的样本缓冲液为10mM Tris(pH：8)/1mMEDTA/0-1000mM NaCl，10mM Tris(pH：8)/0-100mM MgCl2，0-100mMNa2HPO4/NaH2PO4(pH：7.4)，或10mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH：7.4)/0-1000mM(NH4)2SO4。约800ng的纯化基因组DNA悬浮在5ml的样本缓冲液中并以26.2ml/hr的流速通过非织造织物。用另外的6ml样本缓冲液洗涤后，倒入3ml的TE缓冲液。最后从滤器固定器上移出非织造织物并将其置于带锁紧设备的Eppendorf管中，并加入0.5ml的TE缓冲液。95℃孵育30分钟后，收集TE缓冲液。
以与实施例9相同的方法用
Figure C02815524D00541
单链DNA定量试剂盒测试从非织造织物上洗脱的DNA量。试剂盒提供的18残基寡核苷酸作为标准，且用SPECTRA MAX GEMINI XS荧光读板器(Molecular Devices)在Ex485nm、Em 535nm处进行定量。结果在图25、26、27和28中显示。结果证明，如NaCl、MgCl2、磷酸盐和(NH4)2SO4的盐促进了基因组DNA的吸附。
[实施例21]对纯化的基因组DNA吸附条件的研究(2)-乙醇的影响
用与实施例20相同的方法测试乙醇对非织造织物吸附DNA的影响。用与实施例6相同的方法纯化基因组DNA。应用的非纺织织为Asahi Kasei公司的A040C01、A066A和E01030。用于溶解纯化的基因组DNA的样本缓冲液为10mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH：7.4)/0-40％乙醇。约800ng的纯化基因组DNA悬浮在5ml的样本缓冲液中并以26.2ml/hr的流速通过非织造织物。用另外的6ml样本缓冲液洗涤后，倒入3ml的TE缓冲液。最终，从滤器固定器上移出非织造织物并将其置于带锁紧设备的Eppendorf管中，并加入0.5ml的TE缓冲液。95℃孵育30分钟后，回收TE缓冲液。
用
Figure C02815524D00551
单链DNA定量试剂盒测试从非织造织物上洗脱的DNA量。如在图29中所显示，向溶解纯化基因组DNA的样本缓冲液中加入乙醇使DNA的产量减少。
[实施例22]DNA振动吸附
将PET非织造织物或PET薄膜加到纯化的基因组DNA溶液中并振动以测定是否DNA可吸附其上。用与实施例6相同的方法纯化基因组DNA。所用的非织造织物为Asahi Kasei公司的A040C01、A066A或E01030。将已切成12mm直径大小的四个PET非织造织物圆盘或PET薄膜圆盘放置在15ml的聚丙烯试管(IWAKI)中。将3ml乙醇加到试管中以使非织造织物圆盘湿润。吸干乙醇后，加入3ml的TE缓冲液以洗涤非织造织物圆盘，并以同样的方式吸干。最后，用3ml的样本缓冲液以同样的方式处理非织造织物圆盘。应用的样本缓冲液为10mM Tris(pH：8)/1mM EDTA/50mM NaCl，10mM Tris(pH：8)/2mM MgCl2，50M Na2HPO4/NaH2PO4(pH：7.4)，或10mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH：7.4)/0.2-1.0M(NH4)2SO4。
之后，将5ml的样本缓冲液加到含非织造织物圆盘的试管中，且加入约800ng的纯化基因组DNA并将其彻底搅拌。将试管置于MIX-ROTARVMR-5(IUCHI)中80转/分钟处理30分钟。吸干试管中的DNA溶液后，加入6ml的样本缓冲液并以80转/分钟15分钟重复同样的处理。移除样本缓冲液后，加入3ml的TE缓冲液，并再次以80转/分钟15分钟进行处理。将非织造织物移出试管并置于带锁紧设备的Eppendorf管中，加入0.5ml的TE缓冲液并在95℃孵育30分钟。用
Figure C02815524D00552
单链DNA定量试剂盒测试从非织造织物上洗脱的DNA的量。如在图30中所显示的，基因组DNA已吸附到PET非织造织物上并得以回收，但不能吸附到PET薄膜上。该结果表明非织造织物的形式对DNA吸附是重要的。
图31为对10mM磷酸加入硫酸铵的影响。硫酸铵可特别显著地促进非织造织物E01030对DNA的吸附。与实施例20的过滤吸附相比，当振动吸附时E01030而非A040C01显示出提高的吸附能力，约可回收80％的DNA。该结果表明，用于核酸纯化的非织造织物的最佳类型根据吸附条件而异。
[实施例23]非织造织物的筛选
用与实施例1相同的方法进行实验以筛选可用于DNA纯化的非织造织物。从5个健康供体采取血液，在0.25ml的血液中白细胞数为0.94-1.91 x 106。应用的非织造织物在表7中列出。均为Asahi Kasei公司产品。平均孔径大小用水银测孔计进行测量并从SEM像片计算平均纤维大小。
向0.25ml的血液中加入0.05μg的蛋白酶K且进一步加入0.25ml的2X消化缓冲液后，将混合物置室温5分钟。随后进行与实施例1相同的处理，并最后倒入3ml的TE缓冲液洗涤非织造织物圆盘。从滤器固定器上移出四个非织造织物圆盘并将其置于带锁紧设备的Eppendorf管中，并加入0.5ml的TE缓冲液。80℃孵育1小时后，回收TE缓冲液。
表7
 
商品名 产品号 材料 厚(mm) 平均孔径大小(μm)    平均纤维大小(μm)
A040C01/HM-3 PET/HM-3包被 0.235
A040C01 PET 0.235 10 1.2
A066A PET 0.400 13 1.7
Bemliese PS140 纤维素 0.080
Bemliese TS327 纤维素 0.270
Bemliese TS507 纤维素 0.320
Bemliese TS100 纤维素 0.400 45 12
HYBRID Bemliese QT409 纤维素 0.290
HYBRID Bemliese RK629 纤维素 0.420
MICROWEB A040B 聚酯 0.130 10
MICROWEB A040C 聚酯 0.100
MICROWEB A045A 聚酯 0.130
 
MICROWEB A080A 聚酯 0.180
MICROWEB A090D 聚酯 0.370
MICROWEB P020A(EL) 聚丙烯 0.140
MICROWEB P020B(EL) 聚丙烯 0.200
MICROWEB P020C 聚丙烯 0.170
MICROWEB P050D(EL) 聚丙烯 0.470
MICROWEB P090C 聚丙烯 0.660
MICROWEB P090D 聚丙烯 0.740
ELTAS N05020 尼龙 0.130
ELTAS N05030 尼龙 0.170
ELTAS N05040 尼龙 0.190
ELTAS N05050 尼龙 0.210
ELTAS N05070 尼龙 0.250
ELTAS E01012 聚酯 0.090 66 14
ELTAS E01015 聚酯 0.110
ELTAS E01020 聚酯 0.130
ELTAS E01025 聚酯 0.170
ELTAS E01030 聚酯 0.200 130 12
ELTAS E01040 聚酯 0.250
ELTAS E01050 聚酯 0.290
ELTAS E01070 聚酯 0.360
ELTAS E05070 聚酯 0.230
ELTAS P03015 聚丙烯 0.140 67
ELTAS P03020 聚丙烯 0.190
ELTAS P03025 聚丙烯 0.210
ELTAS P03040 聚丙烯 0.340
ELTAS P03050 聚丙烯 0.400 75 20
ELTAS P03070 聚丙烯 0.500
SHALERIA C1050 90％丙烯；10％聚酯 0.350
SHALERIA C3040 70％丙烯；30％聚酯 0.260
 
SHALERIA CR050 65％丙烯；35％人造纤维 0.320
SHALERIA RC040S 35％丙烯；65％人造纤维 0.270
SMASH Y15050 聚酯 0.160 58
SMASH Y15100 聚酯 0.250
SMASH Y15150 聚酯 0.340
SMASH Y15200 聚酯 0.440
SMASH Y15250 聚酯 0.530
用TE缓冲液10倍稀释包含在每一回收溶液中的核酸量后，用
Figure C02815524D00581
单链DNA定量试剂盒测试核酸量。结果在图32中显示。用UV-1600UV可见光分光光度计(Shimadzu)测量流出液的A260(260nm处的吸光度)和A280(280nm处的吸光度)并计算A260/A280以测定核酸纯度。结果在图33中显示。尽管核酸产量和纯度不同，应用这些具有不同特性和材料的非织造织物成功完成了核酸纯化。
[实施例24]用非织造织物纯化核酸中的RNA
用
Figure C02815524D00582
单链DNA定量试剂盒证实实施例3中制备的大肠杆菌核酸中的RNA存在。OliGreen试验系统能够检测RNA以及DNA。这样，通过将向核酸溶液加入RNase处理以选择性降解RNA后的测试值与不加入RNase处理的测试值比较，就可能估算出在核酸溶液中存在的RNA量。通过应用rRNA的对照实验证实了这一点。
取150μl的非织造织物流出液，并以0.375μg/0.75μl(终浓度：2.5μg/ml)加入牛胰腺无DNase的RNase(产品号：1,119,915，Roche)。作为对照，不加入RNase溶液代之以加入TE缓冲液并进行同样的处理。37℃孵育30分钟后，混合物在冰上冷却并用TE缓冲液40倍稀释，并取100μl用OliGreen进行测试。未用RNase处理的核酸量为75.3μg，而用RNase处理的核酸量减到10.0μg。该结果表明核酸溶液中含有约10μg的DNA和约65μg的RNA，且DNA和RNA均能通过非织造织物进行纯化。
[实施例25]样本的热处理
从自愿者采取痰样本，将来自6个人的样本混合后，混合物分装到Eppendorf管中，每管0.2ml并冷冻保存于-20℃。用一次性塑料白金环从大肠杆菌DH5(Toyobo)甘油菌种将细胞转移到LB培养基(1g胰蛋白胨(Difco)；0.5g酵母提取物(Difco)；1g NaCl；200μl 1N NaOH；100ml蒸馏水)。将液体在37℃培养16小时直到培养物溶液的A600＝3.5。基于该吸光度的培养物溶液中大肠杆菌的密度大约为1.4 X 1010个细胞/ml。用培养液制备2 X 106个细胞/ml、2 X 105个细胞/ml和2 X 104个细胞/ml的细胞悬液。溶解先前分装的痰样本并将50μl的每种悬液加到容器中以制备加入大肠杆菌的痰样本。
应用的非织造织物为Asahi Kasei公司的A040C01。非织造织物切成12mm直径大小的圆盘，四个圆盘堆积在一起并置于滤器固定器(SWINNEX，MILLIPORE)上，将10ml的玻璃注射器置于上游并将吸泵置于下游与滤器固定器连接。最初用3ml的消化缓冲液(10mM Tris，pH：8；100mM NaCl；25mM EDTA；0.5％ SDS)洗涤非织造织物圆盘。
向每一加入了大肠杆菌的痰样本中加入0.25ml的2X消化缓冲液(20mM Tris，pH：8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％ SDS)后，在98℃处理1分钟。在冷却后，加入0.05mg的蛋白酶K(PCR级，Roche)并将混合物在37℃水浴中处理5分钟，其间间歇搅拌。将加入了大肠杆菌的痰样本提取物加到非织造织物圆盘上并进行吸滤。然后在吸滤下倒入8ml的消化缓冲液洗涤滤器。最后，倒入3ml含1M NaCl的PBS，1mM EDTA和3ml的TE缓冲液(10mM Tris，pH：8；1mM EDTA)洗涤非织造织物圆盘。
将四个非织造织物圆盘从滤器固定器上移出并将位于最上面(起始端)的非织造织物圆盘取出并将其置于Eppendorf管中。加入0.2ml的TE缓冲液(10mM Tris，pH：8；1mM EDTA)后，在95℃处理20分钟以进行洗脱。流出液进行PCR反应并检测大肠杆菌和人DNA。
用以下方法检测流出液中的大肠杆菌DNA。作为PCR引物，从Invitrogen订购以下化学合成的序列：从编码大肠杆菌ProteinPII蛋白质的基因的1283位的g到1302位的a的核酸序列(SEQ ID NO：5)以及与从2229位的t到2248位的g的核酸序列互补的序列(SEQ ID NO：6)。取10μl的流出液加到PCR反应液中，反应液总体积为25μl(终浓度：10mM Tris/HCl，pH：8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mMdCTP，0.2mM dTTP；1.25U Taq(Sigma)；0.5μM的每一引物)。混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，循环参数为：94℃2分钟，1个循环；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，40个循环；然后72℃5分钟。
用以下方法检测流出液中的人DNA。作为PCR引物，从Invitrogen订购以下化学合成的序列：从编码人HGFR(肝细胞生长因子受体)蛋白质基因的483位的c到502位的c的核酸序列(SEQ ID NO：7)以及与从1039位的c到1058位的c的核酸序列互补的序列(SEQ ID NO：8)。取10μl的流出液加到PCR反应液中，反应液总体积为25μl(终浓度：10mM Tris/HCl，pH：8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mMdCTP，0.2mM dTTP；1.25U Taq(Sigma)；0.5μM的每一引物)。混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，循环参数为：94℃2分钟，1个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，40个循环；然后72℃5分钟。每一PCR结束后，将1.5μl的10X上样缓冲液加到10μl的每一反应混合物中并彻底混匀，并将全部进行1.5％琼脂糖(GibocoBRL)电泳。在Mupid MinigelMigration Tank(Advance)中100V进行30分钟电泳后，凝胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print 2000i/VGA照相。结果在图34和35中显示。从图34可以看出，当加入大肠杆菌的痰样本中含有103或更多的大肠杆菌细胞时，扩增出966bp的大肠杆菌来源的PCR产物。如在图35中所显示的，无论加入多少量的大肠杆菌均可检测出577bp的人源的PCR产物。因此证实，通过热处理样本并随后用非织造织物纯化核酸可提取并纯化样本中的细胞DNA，且可检测该DNA，如在此实施例中所阐述的。
[实施例26]样本的还原处理
向根据实施例25所制备的加入大肠杆菌的痰样本中加入0.25ml的2X消化缓冲液(20mM Tris，pH：8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％ SDS)后，加入5μl的10％二硫苏糖醇溶液并在室温处理混合物2分钟，同时搅拌。之后，加入0.05mg的蛋白酶K(PCR级，Roche)并将混合物在37℃水浴中处理5分钟，其间间歇搅拌。将加入大肠杆菌的痰样本提取物加到A040C01非织造织物上并进行吸滤。然后在吸滤下倒入8ml的消化缓冲液洗涤滤器。最后，倒入3ml的含1M NaCl的PBS/1mM EDTA和3ml的TE缓冲液(10mMTris，pH8；1mM EDTA)洗涤非织造织物圆盘。
从滤器固定器上移出四个非织造织物圆盘并将在最上面(起始端)的非织造织物圆盘移出并置于Eppendorf管中。加入0.2ml的TE缓冲液(10mMTris，pH8；1mM EDTA)后，在95℃处理20分钟进行洗脱。流出液用与实施例25相同的方法进行PCR反应并检测大肠杆菌和人DNA。结果在图36和37中显示。如从图36中所见，当加入大肠杆菌的痰样本中含有103或更多的大肠杆菌细胞时，扩增出966bp的大肠杆菌来源的PCR产物。如在图37中所显示的，无论加入多少量的大肠杆菌均可检测出577bp的人源的PCR产物。因此证实，通过还原处理样本并随后用非织造织物纯化核酸可提取并纯化样本中的细胞DNA，且可检测该DNA，如在此实施例中所阐述的。
[比较实施例3]不用热处理或还原处理从加入大肠杆菌的痰样本中纯化核酸
用与实施例25中相同的方法制备加入大肠杆菌的痰样本和吸附核酸的滤器。向加入大肠杆菌的痰样本中加入0.25ml的2X消化缓冲液(20mM Tris，pH：8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％ SDS)后，加入0.05mg的蛋白酶K(PCR级，Roche)，而不进行实施例25中的热处理或实施例26中的还原处理，将混合物在37℃水浴中处理5分钟，其间间歇搅拌。在此实施例中，与实施例25和26不同的是，痰没有均一地溶解成澄清，而是保持非均一性的团块并形成混浊状态。
之后，将加入大肠杆菌的痰提取物加到非织造织物上进行吸滤。未溶解的痰团块结合到非织造织物的表面，阻碍了吸滤的进行。继续进行吸滤时，液体部分滤出而结合到非织造织物表面的痰团块不能完全滤过，使得很难继续操作。
[实施例27]非织造织物上的核酸延伸反应
用吸附到非织造织物上的基因组DNA为模板以检测是否可在非织造织物上进行核酸延伸反应。应用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)和PCRDIG标记混合物(Roche)进行DNA的DIG标记，并应用DIG-High PrimeDNA标记/检测试剂盒(Roche)完成杂交和检测。
通过与实施例11相同的方法用0.25ml冷冻保存的血液(白细胞数：1.15 X 106)处理来制备吸附有人核酸的非织造织物HM-3-包被的A040C01。倒入3ml的TE缓冲液洗涤非织造织物圆盘后，将非织造织物圆盘置于含0.2ml的DIG Easy Hyb缓冲液(Roche)的24孔板中并置42℃2个小时。加入如SEQ ID NO：9所列出的DNA引物bACT1和如SEQ ID NO：10所列出的DNA引物bACT2，前述引物为从Nihon Bioservice订购的化学合成序列，并将混合物置42℃18个小时。用适宜的洗涤溶液洗涤移除多余的引物后，加入200μl的酶反应液(PCR缓冲液，含1.5mM MgCl2(终浓度)；0.2mM dATP；0.2mM dGTP；0.2mM dCTP；0.2mM dTTP；0.01mM地高辛配基-11-dUTP；5U克列诺大片段(Biolabs))并将混合物置37℃18个小时。然后用适宜的洗涤溶液洗涤并用碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体处理，并用NBT/BCIP底物检测在核酸延伸反应中掺入的DIG。结果在图38中显示。可检测的信号随加入引物量的增加而增加，表明核酸延伸反应以引物依赖的方式在非织造织物圆盘上进行。
[实施例28]通过LAMP方法扩增和检测非织造织物上的核酸
用吸附到非织造织物上的基因组DNA为模板以测定是否可通过LAMP方法扩增核酸。LAMP方法应用Loopamp Bovine Embryo Sexing试剂盒(Eiken化学有限公司)进行。首先，通过以下方法将牛基因组DNA吸附到作为非织造织物的Asahi Kasei公司生产的A040C01。向0.25ml牛的冷冻保存血液(Nihon Biotest Laboratory有限公司)中加入加热到37℃的0.25ml 2X消化缓冲液(20mM Tris，pH8；200mM NaCl；50mM EDTA；1％SDS)，进一步加入0.05μg的蛋白酶K(PCR级，Roche)并在涡旋振荡器中搅拌混合物，同时在37℃水浴中间歇加热，以使其完全溶解。将溶液置室温5分钟后，将血液提取物加到非织造织物上并立即进行吸滤。然后在吸滤下倒入8ml的消化缓冲液洗涤滤器。之后，进一步倒入3ml含1M NaCl的PBS/1mM EDTA和3ml的TE缓冲液(10mM Tris，pH8；1mM EDTA)洗涤非织造织物。将非织造织物切成3mm的正方形并置于0.5ml的微量试管中。然后加入40μl的Loopamp反应混合物II和1μl的Bst DNA聚合酶，之后在63℃孵育。1小时后，检测扩增溶液的混浊度，并取部分进行琼脂糖电泳。结果表明，用吸附到非织造织物上的牛基因组DNA为模板通过LAMP发生了核酸扩增(图39)。
[实施例29]洗脱的基因组DNA的杂交
研究了用在实施例9和11中描述的洗脱方法获得的基因组DNA是否可用于杂交。首先向1μg的人基因组DNA(Clontech)中加入1μl的BiotinChem-Link(Roche)和水以使总体积达到20μl，在85℃孵育1个小时后，加入5μl的反应终止液以获得生物素标记的基因组DNA溶液。之后，将通过每一洗脱方法获得的基因组DNA点到Hybond N+尼龙滤器(Amersham-Pharmacia)上，且用碱溶液变性转换成单链后，通过UV交联进行固定。加入Easy Hyb杂交液(Roche)42℃预杂交1小时，之后加入已预先制备的生物素标记的基因组DNA并在42℃孵育18小时进行杂交。洗涤并与碱性磷酸酶标记的抗生物素蛋白反应后，加入碱性磷酸酶底物CSPD(Roche)进行反应，并将X射线胶片进行适当时间的曝光以检测信号。如在图40和41中所显示的，通过用TE缓冲液、碱和过氧化氢洗脱而获得的基因组DNA全部可用于杂交。
[实施例30]用洗脱的基因组DNA为探针的杂交
研究了用在实施例9和11中描述的洗脱方法获得的基因组DNA是否可用作杂交探针。首先向1μg每种非织造织物洗脱的人基因组DNA中加入1μl的Biotin Chem-Link(Roche)和水以使总体积达到20μl，在85℃孵育1个小时后，加入5μl的反应终止液以获得生物素标记的洗脱基因组DNA溶液。之后，将人基因组DNA(Clontech)和λDNA(Takara)点到HybondN+尼龙滤器(Amersham-Pharmacia)上，且用碱溶液变性并通过UV交联进行固定。加入Easy Hyb杂交液(Roche)在42℃预杂交1小时，之后加入每一已预先制备的生物素标记的基因组DNA样本并在42℃杂交18小时。洗涤并与碱性磷酸酶标记的抗生物素蛋白反应后，加入碱性磷酸酶底物CSPD(Roche)进行反应，并将X射线胶片进行适当时间的曝光以检测信号。结果在图42中显示，通过用TE缓冲液、碱和过氧化氢洗脱而获得的基因组DNA全部可用作杂交探针。
[实施例31]用表面活性剂洗脱核酸
通过与实施例11相同的方法用0.25ml冷冻保存的血液(白细胞数：1.16 X 106)处理来制备吸附有人核酸的非织造织物A040C01。倒入5ml的TE缓冲液洗涤非织造织物后，将四个非织造织物圆盘中的每一个从滤器固定器上移除并置于1.5ml的Eppendorf管内。选择在实施例19中应用的表面活性剂，它们为兼性表面活性剂CHAPS和CHAPSO以及非离子型表面活性剂Triton X-114、Triton X-100、Nissan Dispanol TOC、Igepal CA630和NissanNonion NS-208.5，并将以上表面活性剂0.5％水溶液取0.5ml加入。加入0.5ml的TE缓冲液制备另一体系。将混合物在80℃加热20分钟并洗脱吸附到每一非织造织物上的核酸。以与实施例9中相同的方法应用
Figure C02815524D0064094450QIETU
单链DNA定量试剂盒测试从非织造织物上洗脱的DNA量并用TE缓冲液将流出液10倍稀释。结果在图43中显示。将在TE缓冲液中95℃加热20分钟洗脱的DNA量定义为100％。与应用TE缓冲液相比，所有的表面活性剂促进了核酸洗脱。
图44显示了洗脱核酸的电泳结果。洗脱核酸用NucleoSpin柱浓缩并取10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。在表面活性剂存在下洗脱核酸的分子量与用TE缓冲液洗脱的核酸的分子量相同。然后证实在表面活性剂存在下洗脱的纯化DNA是否可用作PCR模板。用与实施例2相同的方法进行PCR分析，不同之处在于应用Clontech的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)ControlAmplimer Set(Cat No.5406-3)作为引物。结果在图45中显示。从用表面活性剂洗脱的纯化DNA中也扩增出983bp的PCR产物，表明其可用作PCR模板。
[参考实施例3]表面活性剂对PCR的影响
测试了阴离子表面活性剂、兼性表面活性剂和非离子型表面活性剂对PCR的影响。
将SEQ ID NO：11的合成DNA作为5’引物且将SEQ ID NO：12的合成DNA作为3’引物各自以0.4μM的终浓度作为PCR引物加入到PCR反应液(终浓度：10mM Tris/HCl，pH：8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mMdATP，0.2mM dGTP，0.2mM dCTP，0.2mM dTTP；0.5U AmpliTaq(Applied Biosystems))中，前述PCR溶液中含5ng的人基因组DNA(Clontech)。
将前述在实施例19中应用的阴离子表面活性剂SDS，兼性表面活性剂CHAPS和CHAPSO以及非离子型表面活性剂Triton X-114、Triton X-100、Nissan Dispanol TOC、Igepal CA630和Nissan Nonion NS-208.5，加入以使其终浓度为1％、0.5％和0.1％，且PCR反应液调整为20μl。
将每一混合物在DNA热循环仪(Perkin Elmer)中反应，循环参数为：94℃3分钟，1个循环；94℃30秒，60℃1分钟，72℃3分钟，30个循环；然后72℃7分钟。PCR反应结束后，将1μl的10X上样缓冲液加到5μl的反应液中并彻底混匀，并将全部进行1.5％琼脂糖电泳。50V进行45分钟电泳后，凝胶用溴化乙锭染色并用BioImage Gel Print 2000i/VGA照相。结果在图46中显示。
除了SDS外，表面活性剂在用于洗脱的浓度下不会对PCR产生影响。SDS甚至在0.1％的浓度也对PCR产生影响。
[实施例32]非织造织物吸附核酸的生物素化
研究了非织造织物吸附的核酸是否可直接进行标记。通过与实施例11相同的方法用0.25ml冷冻保存的血液(白细胞数：1.16 X 106)处理来制备吸附有人核酸的非织造织物A040C01。将其切成4个等份并置于0.5ml的微量试管中，并加入95μl的水和5μl的生物素Chem-Link(Roche)，并在85℃进行生物素标记1个小时。将上清转移到单独的试管中，置95℃5分钟将核酸转换成单链后，在冰上冷却以制备探针1。将已与生物素Chem-Link反应的非织造织物转移到含100μl TE缓冲液的试管中并置95℃20分钟，用于同时进行从非织造织物洗脱核酸和核酸的单链转换。然后将其置冰上冷却以制备探针2。将从100ng到0.1ng的人基因组DNA(Clontech)和λDNA(Takara)点到Hybond N+膜(Amersham-Pharmacia)上，并进行碱变性和UV交联固定。将其转移到合适的封闭容器内，并加入Easy Hyb(Roche)。置42℃1小时后，将20μl的探针1或探针2加到1ml的Easy Hyb中，且随后将探针在42℃杂交18小时。然后用2X SCC和0.1％SDS室温洗涤两次，每次5分钟，之后用0.1X SCC和0.1％SDS 68℃洗涤两次，每次15分钟。随后用洗涤缓冲液(终浓度：0.1M马来酸；0.15M NaCl；0.3％Tween20，pH7.5)平衡1分钟，之后浸到用马来酸缓冲液10倍稀释的封闭缓冲液(Roche)(终浓度：0.1M马来酸；0.15M NaCl，pH7.5)中1个小时。之后向5ml的液体中加入1μl的结合了碱性磷酸酶的抗生物素蛋白(CAL BIOCHEM)，将混合物置室温30分钟逐渐进行渗透。用洗涤缓冲液室温洗涤两次，每次15分钟，随后用碱性磷酸酶缓冲液(终浓度：0.1MTris，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)平衡2分钟，之后加入2/100体积的NBT/BCIP(Roche)以生成颜色。结果在图47中显示。探针1和探针2均可与点到Hybond N+膜上的人基因组DNA杂交，表明非织造织物捕获的核酸已经被生物素标记。
工业应用
根据本发明的方法，易于从含细胞(如白细胞和细菌)的样本中纯化核酸。本发明可用于从吸附核酸的滤器上快速洗脱核酸。本发明的方法也允许应用非织造织物从含细胞(如白细胞或细菌)的样本中快速纯化核酸，并直接扩增或检测非织造织物上核酸的核酸序列。因此可简化从样本处理到核酸扩增和核酸序列检测的步骤，使得处理在较短的时间内得以完成。
序列表(无序列数据)
SEQ ID NO：1：合成DNA
SEQ ID NO：2：合成DNA
SEQ ID NO：3：合成DNA
SEQ ID NO：4：合成DNA
SEQ ID NO：5：合成DNA
SEQ ID NO：6：合成DNA
SEQ ID NO：7：合成DNA
SEQ ID NO：8：合成DNA
SEQ ID NO：9：合成DNA
SEQ ID NO：10：合成DNA
SEQ ID NO：11：合成DNA
SEQ ID NO：12：合成DNA
序列表
<110>旭化成株式会社
<120>应用非织造织物纯化和检测核酸的方法
<130>PH-1593-PCT
<150>JP 2001-208514
<151>2001-07-09
<150>JP 2001-364878
<151>2001-11-29
<160>12
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>1
Figure C02815524D00681
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>2
Figure C02815524D00691
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>3
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>4
Figure C02815524D00701
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<23>合成的DNA
<400>5
Figure C02815524D00702
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>6
Figure C02815524D00703
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>7
Figure C02815524D00711
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>8
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>9
Figure C02815524D00713
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>10
Figure C02815524D00721
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>11
Figure C02815524D00722
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的DNA
<400>12
Figure C02815524D00731

Claims (40)

1.从含细胞的样本中制备细胞核酸的方法，该方法包括：
(a)破坏细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以使细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤；以及
(c)从非织造织物洗脱核酸的步骤，
其中，非织造织物材料为聚酯、聚丙烯、尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯，非织造织物的孔径大小为2-150μm，非织造织物的纤维大小为0.3-20μm。
2.权利要求1的方法，其中将吸附到非织造织物上的核酸在40℃到100℃的温度范围内加热以洗脱核酸。
3.权利要求1或2的方法，其中将吸附到非织造织物上的核酸在pH12或更高pH的碱性条件下处理以洗脱核酸。
4.权利要求1或2的方法，其中将吸附到非织造织物上的核酸断裂以进行洗脱。
5.权利要求4的方法，其中使用活性氧断裂核酸。
6.权利要求5的方法，其中通过将二价金属离子加到还原糖中产生所使用的活性氧。
7.权利要求5的方法，其中活性氧为过氧化氢。
8.权利要求5的方法，其中通过将二价金属离子加到过氧化氢中产生所使用的活性氧。
9.权利要求1或2的方法，其中使用酶断裂吸附到非织造织物上的核酸以进行洗脱。
10.权利要求1或2的方法，其中用表面活性剂处理吸附到非织造织物上的核酸以进行洗脱。
11.权利要求10的方法，其中表面活性剂为非离子型表面活性剂或兼性表面活性剂。
12.从含细胞的样本中制备和扩增细胞核酸的方法，该方法包括：
(a)破坏细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以将细胞提取液中的核酸吸附到所述非织造织物上的步骤；
(c)将核酸扩增液加到所述非织造织物上并以吸附到所述非织造织物上的核酸为模板扩增核酸的步骤；以及
(d)回收所述反应液的步骤，
其中，非织造织物材料为聚酯、聚丙烯、尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯，非织造织物的孔径大小为2-150μm，非织造织物的纤维大小为0.3-20μm。
13.权利要求12的方法，其中通过PCR法或LAMP法扩增核酸。
14.从含细胞的样本中制备细胞核酸并检测特定核酸序列的方法，该方法包括：
(a)破坏细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以将细胞提取液中的核酸吸附到所述非织造织物上的步骤；
(c)将用于检测核酸序列的溶液加到非织造织物上进行反应的步骤；以及
(d)检测反应液的步骤，
其中，非织造织物材料为聚酯、聚丙烯、尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯，非织造织物的孔径大小为2-150μm，非织造织物的纤维大小为0.3-20μm。
15.从含细胞的样本中制备细胞核酸并检测特定核酸序列的方法，该方法包括：
(a)破坏细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以将细胞提取液中的核酸吸附到所述非织造织物上的步骤；
(c)将核酸序列检测溶液加到所述非织造织物上进行反应的步骤；以及
(d)检测所述非织造织物表面的步骤，
其中，非织造织物材料为聚酯、聚丙烯、尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯，非织造织物的孔径大小为2-150μm，非织造织物的纤维大小为0.3-20μm。
16.权利要求14或15的方法，其中通过PCR法或LAMP法检测核酸序列。
17.权利要求16的方法，其中应用探针通过杂交检测特定核酸序列。
18.权利要求14或15的方法，其中应用引物和聚合酶通过核酸延伸反应检测特定核酸序列。
19.权利要求18的方法，其中通过在核酸延伸反应中掺入标记的核苷酸完成检测。
20.权利要求18的方法，其中检测通过核酸延伸反应产生的焦磷酸。
21.制备吸附细胞核酸的非织造织物的方法，该方法包括：
(a)破坏细胞制备细胞提取液的步骤；以及
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以将细胞提取液中的核酸吸附到所述非织造织物上的步骤，
其中，非织造织物材料为聚酯、聚丙烯、尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯，非织造织物的孔径大小为2-150μm，非织造织物的纤维大小为0.3-20μm。
22.从含细胞的样本制备细胞核酸并标记核酸的方法，该方法包括：
(a)破坏细胞制备细胞提取液的步骤；
(b)将细胞提取液与非织造织物接触以将细胞提取液中的核酸吸附到该非织造织物上的步骤；以及
(c)将核酸标记溶液加入到所述非织造织物进行反应的步骤，
其中，非织造织物材料为聚酯、聚丙烯、尼龙或聚对苯二甲酸乙二酯，非织造织物的孔径大小为2-150μm，非织造织物的纤维大小为0.3-20μm。
23.权利要求22的方法，其中核酸用生物素、荧光或半抗原进行标记。
24.权利要求22或23的方法，其中对吸附到非织造织物上的核酸本身进行标记。
25.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中使用不含粘度增强剂、离液剂或醇的细胞提取液。
26.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中使用含盐的细胞提取液。
27.权利要求26的方法，其中细胞提取液中的盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐、磷酸盐、硫酸盐或盐酸盐。
28.权利要求26的方法，其中细胞提取液中的盐为氯化钠，且其浓度为从10mM到1000mM。
29.权利要求26的方法，其中细胞提取液中的盐为氯化镁，且其浓度为从1mM到100mM。
30.权利要求26的方法，其中细胞提取液中的盐为磷酸钠，且其浓度为从2mM到100mM。
31.权利要求26的方法，其中细胞提取液中的盐为硫酸铵，且其浓度为从20mM到1000mM。
32.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中应用含阴离子表面活性剂、兼性表面活性剂或非离子型表面活性剂的溶细胞溶液。
33.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中破坏细胞制备细胞提取液的步骤在80℃到110℃的温度范围内进行。
34.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中破坏细胞制备细胞提取液的步骤在还原剂存在下进行。
35.权利要求34的方法，其中还原剂为含硫羟基的化合物。
36.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中细胞提取液与非织造织物接触的方法为过滤。
37.权利要求1、2、12-15和21-23中任何一项所述的方法，其中在细胞提取液中的核酸吸附到非织造织物上的步骤后是洗涤非织造织物的步骤。
38.权利要求37的方法，其中非织造织物用不含离液剂或醇的溶液洗涤。
39.权利要求37的方法，其中非织造织物用溶细胞溶液洗涤。
40.权利要求37的方法，其中非织造织物用浓度范围在0.5M-2M的盐溶液洗涤。
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