DE69817000T2

DE69817000T2 - Verfahren zur schnellen isolierung von rns

Info

Publication number: DE69817000T2
Application number: DE69817000T
Authority: DE
Inventors: J. Gerard GUNDLING
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2018-09-12
Also published as: WO1999014224A1; EP1017705A1; DE69817000D1; US5817798A; ES2205545T3; EP1017705B1; JP2001516763A; CA2303398A1; ATE246698T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegene Erfindung bezieht sich auf die Nukleinsäurereinigung und insbesondere bezieht sie sich auf die Reinigung von Ribonukleinsäure (RNA) und Messenger-RNA (mRNA).
Hintergrund der Erfindung
Das Interesse an Verfahren zur Isolierung und anderweitigen Reinigung von Nukleinsäuren aus Testproben, wie zum Beispiel Blut oder Serum, ist seit der Einführung von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen, wie zum Beispiel PCR oder LCR, angestiegen. Anpassungen wurden an diesen Amplifikationsreaktionen vorgenommen, so daß sie verwendet werden können, um eine Vielzahl an Krankheiten zu detektieren. Während Anpassungen an den Amplifikationsverfahren vorgenommen wurden, welche eine relativ schnelle Detektion von Krankheiten erlauben, ist die Herstellung der Nukleinsäuren, welche durch solche Verfahren amplifiziert werden, noch immer ein limitierender Faktor hinsichtlich der Gesamtzeit, die benötigt wird, um eine Krankheit unter Verwendung eines Amplifikationsreaktions-basierten Assays zu detektieren.
Während viele Nukleinsäurereinigungsverfahren wohl bekannt sind und seit Jahren existieren, können diese Verfahren zeitaufwendig sein und Reagenzien verwenden, die Gefahren darstellen für diejenigen, die die Reinigung durchführen. Beispielsweise ist es seit langem bekannt, daß DNA und RNA leicht in einer gereinigten Form von einer Testprobe unter Verwendung von organischen Extraktionsverfahren erhalten werden können, aber solche Verfahren können verschiedene Extraktionen erfordern und können deshalb zeitaufwendig sein. Zusätzlich ist die Verwendung von organischen Lösungsmitteln nicht wünschenswert und gefährlich, wenn die geeigneten Vorsichtsmaßnahmen nicht befolgt werden.
In jüngerer Zeit haben Nukleinsäurereinigungsverfahren die Affinität ausgenutzt, die Nukleinsäuren für feste Trägermaterialien haben, wie zum Beispiel Glas, in der Anwesenheit eines chaotropen Reagenzes. Gemäß solchen Verfahren kann eine Testprobe, die zelluläres oder virales Material umfaßt, mit einem chaotropen Reagenz und einem festen Trägermaterial in Kontakt gebracht werden. Das chaotrope Reagenz lysiert jegliche Zellen in der Testprobe, um die Nukleinsäure, die in den Zellen enthalten ist, freizusetzen, welche dann auf dem festen Trägermaterial eingefangen wird. Gemäß diesen Verfahren können jedoch zusätzliche Schritte und Reagenzien erforderlich sein, um differenziert DNA von RNA zu reinigen.
Ein Verfahren zur selektiven Reinigung von Messenger-RNA (mRNA) von anderen Nukleinsäuren nimmt den Poly A Schwanz in Anspruch, der typischerweise auf Strängen von mRNA gefunden wird. Genauer gesagt wird ein Trägermaterial, das mit einem Polythyminoligonukleotid beschichtet ist, verwendet, um jegliche mRNA in der Originalprobe zu binden und sie deshalb von anderen Spezies der Nukleinsäure, wie zum Beispiel DNA abzutrennen. "Oligo dT Säulen" werden üblicherweise für diesen Zweck verwendet. Obwohl Säulen dieser Art effektiv sind, ist die Menge an Material, das über die Säule läuft, relativ begrenzt, weil das Ausgangsmaterial im allgemeinen wegen der Anwesenheit von DNA und RNA zusätzlich zu der gewünschten mRNA in dem Ausgangsmaterial ziemlich viskos ist. mRNA kann aus größeren Volumina von Ausgangsmaterial gereinigt werden, aber Verfahren für Reinigungen von größeren Volumina machen üblicherweise Gebrauch von der Verwendung von vorläufigen organischen Extraktionsverfahren, um die gesamte RNA aus der DNA zu isolieren, bevor die mRNA aus der Gesamt-RNA mit der Oligo dT Säule abgetrennt wird. Zusätzlich zu den Problemen, die durch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln dargeboten sind, hinterlassen die Verfahren zur differenzierten Abtrennung von RNA aus DNA die RNA in einem unlöslichen Stadium. Als ein Ergebnis muß die gesamte RNA, wenn sie aus der DNA gereinigt wurde, wieder aufgelöst werden vor der Reinigung der mRNA aus der gesamten RNA. Daraus folgt, daß diese Verfahren zusätzlich zu den Einschränkungen, die durch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln dargeboten werden, zusätzliche Schritte erfordern, um die weitere Reinigung zu ermöglichen.
B. K. Raj et al., Chemical Abstracts, Band 69, Nukleinsäure-Reinigungsverfahren. 9, 26. August 1968 Columbus, Ohio, US; Abstrakt Nr. 32950a: "A Simple Method for the Separation of Soluble Ribonucleic Acid form Ribosomal Nucleic Acids using Zinc Ions as a Precipitant", Seite 3070; Spalte 1; XP002093837 offenbart ein Verfahren, in welchem divalente Zinkionen zu einer Probe hinzugefügt werden, um lösliche RNA von ribosomaler RNA abzutrennen nach der Phenolextraktion der Proteine, und die lösliche Fraktion wird weiter über einem Ionenaustauscherharz (Dowex) gereinigt.
P. K. Ganguli et al., Chemical Abstracts, Band 80, Nukleinsäure-Reinigungsverfahren. 17, 29. April 1974 Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 92893w: "Simultaneous Extraction of RNA and DNA form Rat Liver with Cupric Sulfate", Seite 166; Spalte 1; XP00209389 offenbart ein Verfahren, in welchem zuerst die Deproteinisierung einer Probe, die RNA und DNA enthält, durch Extraktion mit 0,5 mM CuSO₄, 0,5% Natriumdodecylsulfat und Phenol ausgeführt wird, und dann werden im nächsten Schritt die Nukleinsäuren unter Verwendung von 95% Ethanol in der Anwesenheit von NaCl ausgefällt. Das erhaltene Produkt enthielt 20% DNR und 11% RNA.
WO 89/07603 offenbart ein Verfahren, in welchem anorganische oder organische Salze das Protein in einer biologischen Probe aus den Nukleinsäuren ausfällen, wobei sowohl RNA als auch DNA in dem Überstand zurückbleiben. Bevorzugte Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Kalziumchlorid, Ammoniumacetat, Natriumacetat, Kaliumacetat und Natriumbenzoat, wobei Ammoniumacetat das am meisten bevorzugte Salz ist unter sowohl den anorganischen als auch den organischen Salzen. Die DNA wird aus der DNA durch nachfolgende Behandlung des Überstandes mit Ethanol abgetrennt.
Dementsprechend besteht ein Bedürfnis nach einem sicheren, effektiven und geeigneten Verfahren zum Abtrennen der Gesamt-RNA aus DNA ebenso wie zum Abtrennen von mRNA aus anderen Nukleinsäurespezies, das nicht durch die Menge an Ausgangsmaterial, das gereinigt werden kann, limitiert ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegene Erfindung liefert Verfahren zum Abtrennen der Gesamt-RNA aus anderer Nukleinsäure in einer Testprobe und liefert weiterhin Verfahren zum Abtrennen von mRNA aus der Gesamt-RNA. In vorteilhafter Weise erfordert das hierin bereitgestellte Verfahren nicht die Verwendung von organischen Lösungsmitteln zur Abtrennung von Nukleinsäurespezies, und kann an großformatigen Proben angewendet werden. Daraus folgt, daß das Verfahren sicherer und leichter durchzuführen ist als die zuvor bekannten Verfahren.
Gemäß der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Reinigung oder Abtrennung von Gesamt-RNA aus anderen Nukleinsäurespezies, die in einer Testprobe anwesend sein können, folgende Schritte: (a) in Kontakt bringen einer Testprobe mit einem Übergangsmetallion, das eine Wertigkeit von mindestens +2 hat, um ein Präzipitat zu bilden, das DNA und andere Kontaminanten umfaßt, und einen Überstand; (b) Abtrennen des Präzipitats von dem Überstand; und (c) Sammeln des Überstands, um dabei eine gereinigte Lösung von Gesamt-RNA zu erhalten. In Fällen, wo die Nukleinsäuren innerhalb von Organismen enthalten sind, wie zum Beispiel Viruspartikel oder Zellen, kann das Verfahren den zusätzlichen Schritt Aussetzen der Testprobe gegenüber einem lysierenden Wirkstoff vor, zur selben Zeit, oder nachdem die Testprobe mit einem Übergangsmetallion in Kontakt gebracht wurde, verwenden.
Gemäß einer Ausführungsform kann die mRNA aus oder von anderen Nukleinsäurespezies in einer Testprobe abgetrennt werden. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform wird die Gesamt-RNA wie oben gesammelt, und die mRNA wird aus der Gesamt-RNA abgetrennt. Das Abtrennen der mRNA aus der Gesamt-RNA kann unter Verwendung von Methodiken durchgeführt werden, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, und Oligo dT Matrizen sind für diesen Zweck geeignet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegene Erfindung Verfahren bereit zum Abtrennen der Gesamt-RNA aus der Gesamtnukleinsäure in einer Testprobe, ebenso wie Verfahren zum Abtrennen von mRNA aus einer Testprobe durch Abtrennen der mRNA aus der gereinigten Gesamt-RNA.
Der Ausdruck "Gesamt-RNA" wie hierin verwendet, soll alle RNA bedeuten, die in einer Testprobe vorhanden sein kann. In anderen Worten, Nukleinsäuresequenzen, die aus Ribonukleotidmonomeren bestehen, welche beispielsweise genomische RNA, subgenomische RNA Fragmente, mRNA, Transfer RNA (tRNA) und ribosomale RNA (rRNA) einschließen können. "Gesamtnukleinsäure", wie hierin verwendet, beabsichtigt die Gesamt-RNA, die in einer Testprobe enthalten ist, und Nukleinsäuresequenzen, die aus Deoxyribonukleotidmonomeren bestehen, einschließlich beispielsweise genomischer DNA, subgenomischer DNA Fragmente und Produkten aus DNA Amplifikationsreaktionen.
Eine "Testprobe" ist alles, was RNA oder mRNA neben DNA und anderen Kontaminanten enthält. Die Testprobe ist oder kann abgeleitet sein von irgendeiner biologischen Quelle, wie beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Zerebrospinalflüssigkeit, Milch, Ascitesflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Fruchtwasser, Gewebe, Fermentationsbrühen, Zellkulturen und dergleichen. Die Testprobe kann entweder (i) direkt wie aus der Quelle erhalten oder (ii) nach einer Vorbehandlung, um den Charakter der Testprobe zu modifizieren, verwendet werden. Daher kann die Testprobe vor der Verwendung vorbehandelt sein, durch beispielsweise Herstellen von Plasma aus Blut, Zerstören der Zellen oder der viralen Partikel, Amplifizieren von Nukleinsäuren, Herstellen von Flüssigkeiten aus festen Materialen, Verdünnen von viskosen Flüssigkeiten, Filtern von Flüssigkeiten, Destillieren von Flüssigkeiten, Konzentrieren von Flüssigkeiten und dergleichen.
Die Erfindung macht Gebrauch von der Entdeckung, daß Übergangsmetallionen, die eine Valenz von +2 oder größer haben, effektiv und selektiv Kontaminanten (Substanzen, die nicht Gesamt-RNA sind), die in einer Testprobe anwesend sein können, ausfällen. Beispielsweise, in Fällen, wo die Probenlösung aus einer biologischen Quelle, wie zum Beispiel Blut abgeleitet ist, fällen Übergangsmetallionen, die diese Eigenschaften haben, die Kontaminanten, wie zum Beispiel die zelluläre Debris und andere Proteine effektiv aus. Desweiteren bleibt, während solche Kontaminanten ausgefällt werden, die Gesamt-RNA in Lösung, und kann leicht aus dem ausgefälltem Material, das DNA einschließt, abgetrennt werden. Als ein Ergebnis wird die Gesamt-RNA gewonnen und die mRNR kann aus dieser Lösung direkt durch in Kontakt bringen mit beispielsweise einer Oligo dT Matrix gereinigt werden, ohne die Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder die Notwenigkeit, die Gesamt-RNA vor dem in Kontakt bringen mit der Oligo dT Matrix wieder aufzulösen.
Übergangsmetallionen, die eine Valenz von +2 oder größer haben, sind diejenigen Elemente, die traditionell "Übergangelemente" genannt werden, und die eine Oxidationszahl von +2 oder mehr haben. Während viele dieser Elemente vielfache Valenzen haben, sind die folgenden ionischen Formen der folgenden Elemente bevorzugt: Cobaltionen (Co⁺² oder Co⁺³), Zinkionen (Zn⁺²) , Kupferionen (Cu⁺²) , Vanadiumionen (V⁺² oder V⁺³) und Nickelionen (Ni⁺²). Es wird natürlich verstanden werden, daß diese Ionen mit einer Testprobe durch die Verwendung einer Lösung von Salzen dieser Elemente, welche dabei diese Ionen enthält, in Kontakt gebracht werden können. Beispielsweise sind Sulfat- und Chlorsalze dieser Ionen leicht verfügbar und können löslich gemacht werden, um Lösungen der zuvor genannten Ionen zu bilden. Typischerweise werden Lösungen, die Konzentrationen dieser Ionen von größer als 5 mM enthalten, verwendet, vorzugsweise ist die Konzentration zwischen 10 mM und 500 mM, und noch bevorzugter ist die Konzentration solcher Ionen zwischen 15 mM und 150 mM.
Während die Testproben nur gelöste Nukleinsäuren mit wenigen anderen Kontaminanten enthalten können, und deshalb relativ "sauber" sind, können einige Testproben intakte Zellen oder Viruspartikel enthalten, aus denen Nukleinsäuren freigesetzt werden müssen. Eine Vielzahl von Verfahren und Reagenzien zum Freisetzen von Nukleinsäuren aus Zellen und Viruspartikeln sind wohl bekannt und sind eine Frage der Auswahl für einen, der im Fachgebiet bewandert ist. Solche Reagenzien oder Verfahren werden hierin als "lytische Wirkstoffe" bezeichnet. Beispielsweise schließen einige chemische Verfahren zum Lysieren von Zellen oder Viruspartikeln das in Kontakt bringen der Zellen oder Viruspartikel mit einem Puffer ein, der einen Denaturierungsstoff, wie zum Beispiel Chaotrope, Detergentien oder Harnstoff enthält, sie sind aber nicht begrenzt darauf. Solche Denaturierungsstoffe liegen üblicherweise in einer Konzentration von mindestens 1 M und typischerweise in einer Konzentration von zwischen ungefähr 2 M und ungefähr 5 M in einer gepufferten Lösung vor, die einen neutralen pH von zwischen ungefähr 6 und ungefähr 8 hat. Zusätzlich sind alkalische Lösungen, die einen pH von größer als ungefähr 8,5 haben, bekannt, daß sie Zellwände oder virale Hüllen von verschiedene Organismen zerstören, und können deshalb auch als lysierende Wirkstoffe verwendet werden.
In ähnlicher Weise können saure Lösungen, die einen pH von weniger als ungefähr 5 haben, auch als lysierende Wirkstoffe verwendet werden, aufgrund ihrer Fähigkeit, Zellwände oder virale Hüllen zu zerstören.
Puffer, die chemische lysierende Wirkstoffe enthalten, können auch andere Inhaltsstoffe umfassen, welche beispielsweise eine stabile Umgebung für Nukleinsäuren schaffen können, die aus zellulären oder viralen Materialien freigesetzt werden. Solche anderen Inhaltsstoffe können Salze einschließen, wie zum Beispiel Lithiumacetat oder Natriumchlorid; oder Waschsubstanzen, wie zum Beispiel N-Lauroylsarcosin oder TWEEN^®.
Alternativ können lysierende Wirkstoffe in der Form von mechanischen Mitteln zum Lysieren von Zellen oder Viruspartikeln vorliegen, um dabei Nukleinsäuren freizusetzen. Solche Mittel sind leicht erhältlich und können Homogenisatoren, Sonikatoren oder Kügelchen-Schlagelemente einschließen. Daraus folgt, daß eine Testprobe gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden kann, um Einheiten zu denaturieren, die Nukleinsäuren enthalten, vor, begleitend mit, oder nach dem in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Übergangsmetallion, das eine Valenz von +2 oder mehr hat.
Nachdem die Nukleinsäuren aus einer Einheit freigesetzt wurden, die sie enthält, wenn nötig, und nach in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Übergangsmetallion, das eine Valenz von +2 oder größer hat, um dabei DNA und andere Kontaminanten, wie zum Beispiel zelluläres Material, auszufällen, kann die Gesamt-RNA aus dem Präzipitat abgetrennt werden. Wie oben angedeutet, bleibt die Gesamt-RNA in Lösung und ist Teil des Überstands, und das Sammeln des Überstands liefert eine Lösung der Gesamt-RNA, die weiter gereinigt werden kann, um mRNA aus der Gesamt-RNA zu sammeln. Das Abtrennen und Sammeln des Überstands kann erreicht werden in einer Vielzahl von Wegen, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind. Zum Beispiel kann die Abtrennung und Sammlung des Überstands erreicht werden durch Zentrifugation, Filtrierung oder einfach indem man dem Präzipitat erlaubt, sich abzusetzen und man den Überstand weg von dem sedimentierten Präzipitat abpipetiert.
Wenn der Überstand einmal abgetrennt und gesammelt ist, kann er weiter verarbeitet werden, um die mRNA aus der Gesamt-RNA zu gewinnen. Die mRNA kann aus der Gesamt-RNA gesammelt werden unter Verwendung eines spezifischen Bindeglieds, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist. Wie hierin verwendet, bedeutet "spezifisches Bindeglied" ein Glied eines Bindungspaars, zum Beispiel zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch beispielsweise chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das andere Molekül bindet. Zusätzlich zu Antigen- und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren schließen andere spezifische Bindungspaare ein, sollen aber nicht beschränkt sein auf, Avidin und Biotin; Haptene und Antikörper, die spezifisch sind für Haptene; ebenso wie komplementäre Nukleinsäuresequenzen oder Analoge davon. "Feste Trägermaterialien", wie hierin verwendet, bezieht sich auf irgendein Material, welches unlöslich ist, oder welches unlöslich gemacht werden kann durch eine nachfolgende Reaktion.
Das feste Trägermaterial kann ausgewählt werden nach seiner intrinsischen Fähigkeit, ein Polynukleotid anzuziehen oder zu imobilisieren, oder alternativ kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor zurückhalten, welcher die Fähigkeit hat, ein Polynukleotid anzuziehen und zu immobilisieren. Die feste Phase kann daher ein Latex, ein Kunststoff, ein derivatisierter Kunststoff, ein magnetisches oder nicht magnetisches Metall, eine Glas- oder eine Silikonoberfläche oder Oberflächen von Teströhrchen, Mikrotiteraussparungen, Blätter, Kügelchen, Mikropartikel, Chips, und andere Konfigurationen sein, die denjenigen von durchschnittlicher Befähigung im Fachgebiet bekannt sind. Fest Trägermaterialien können ebenfalls poröse Materialien umfassen, wie zum Beispiel natürliche polymere Kohlenhydrate und deren synthetisch modifizierte, quervernetzte oder substituierte Derivate, wie zum Beispiel Agar, Agarose oder quervernetze Alginsäure. Alle dieser Materialien können in geeigneten Gestalten oder Formen verwendet werden, wie zum Beispiel Filmen, Blättern, Platten, Kügelchen, Mikropartikeln und dergleichen.
Daraus folgt, daß unter Verwendung eines spezifischen Bindungsglieds, das an einen festen Träger gebunden ist, mRNA aus der Gesamt-RNA direkt isoliert werden kann, so dass, wenn eine Sequenz, die spezifisch ist für eine spezielle mRNA Sequenz, an das Trägermaterial gebunden wird. Alternativ kann eine Sequenz, die spezifisch ist für eine spezielle mRNA Sequenz, mit einem anderen spezifischen Bindeglied derivatisiert werden, wie zum Beispiel einem Antigen, das spezifisch einen Antikörper auf dem festen Trägermaterial bindet. Feste Trägermaterialien, die immobilisierte Oligonukleotide besitzen, die Sequenzen typischerweise im Bereich von ungefähr 10 bis 50 Thyminresten enthalten, sind gut geeignet für die Zwecke der Reinigung von mRNA aus Gesamt-RNA. Insbesondere dienen solche Thyminpolynukleotide als Affinitätsreagenzien für Adeninpolynukleotidreste, die allgemein auf mRNA gefunden werden. Ein spezielles Beispiel eines solchen beschichteten festen Trägers schließt eine Oligo dT Säule ein.
Wenn gewünscht, kann mRNA, die an ein festes Trägermaterial durch ein spezifisches Bindeglied gebunden ist, aus dem Trägermaterial eluiert werden, unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt sind, wie zum Beispiel durch Ändern der Temperatur oder Ionenstärke in der Umgebung des festen Trägermaterials. Als eine weitere Alternative kann, während mRNA aus einer Oligo dT Säule eluiert werden kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt sind, mRNA einfach mit Wasser eluiert werden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu illustrieren, und sollen die Erfindung nicht einschränken.
Beispiele
Die folgenden Beispiele zeigen die mRNA Isolierung durch das schnelle und effiziente Verfahren der vorliegenden Erfindung. Dieses Verfahren wurde mit zwei im Fachgebiet bekannten Verfahren verglichen, das eine unter Verwendung von RNAZol und ein zweites unter Verwendung von Oligo dT beschichteten Mikropartikeln, um mRNA aus Zellen in Vollblut zu isolieren. Die Prostata-Lymphknotenkarzinom (LNCaP)-Zellinie wurde gewählt als die expermimentelle Probe, wobei RT/PCR verwendet wurde, um das Prostata spezifische Antigen (PSA) mRNA Produkt aus all den Verfahren zu detektieren. Das RT/PCR Verfahren verwendete DNA Oligomer Primer und Sonden, die spezifisch sind für PSA mRNA von den Exons 2 und 3 des PSA Gens.
Beispiel 1
Herstellung einer LNCaP Zellprobe
Prostata-Lymphknotenkarzinom (LNCaP)-Zellen sind menschliche Prostataadenokarzinomzellen aus einer metastatsierenden Zellinie. Die LNCaP Zellinie wurde erhalten von der American Type Culture Collection, ATCC Nr. 1740-CRL, Rockville, Maryland. Die LNCaP Zellprobe wurde hergestellt, indem zuerst die Gewebekulturmedien aus den anhaftenden LNCaP Zellen in der Gewebekultur dekantiert wurden. Die Zellen wurden mit Salzlösung gewaschen, dann für 3 Minuten bei 37°C trypsinisiert, um sie aus dem Gewebekulturkolben zu entfernen. Zusätzliche Gewebekulturmedien (RPMI-1640, das 10% fetales Kälberserum enthielt) wurden zu dem Kolben hinzugefügt, und die Zellen wurden resuspendiert und in ein Zentrifugenröhrchen gegossen. Die Zellen wurden bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden in kaltem RPMI-1640, das 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, resuspendiert, dann durch einen Nylonfilter gegeben, welcher vorher mit kaltem RPMI-1640/BSA angefeuchtet wurde. Die Zellen wurden auf dem Cell-Dyn automatisierten Hematologyanalysator gezählt, und auf 1 × 10⁵ Zellen/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) eingestellt.
Eine Einheit von Vollblut wurde für 10 Minuten auf einem Schüttler platziert, um zu Mischen, damit die Homogenität gesichert ist, dann aufgeteilt in 4 × 100 ml Aliquote. LNCaP Zellen wurden seriell in PBS verdünnt, dann in die Aliquote von Vollblut gegeben, um Endkonzentrationen von 1, 10 oder 100 LNCaP Zellen/ml Vollblut zu ergeben. Zu einem der 100 ml Aliquote von Vollblut wurden keine LNCaP Zellen hinzugefügt, zur Verwendung als eine negative Kontrolle. Alle 100 ml Aliquote wurden dann gemischt und weiter in 5 ml Aliquote aufgeteilt.
Beispiel 2
mRNA Isolierung unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung
Zellen wurden aus Duplikaten der 5 ml Aliquote lysiert, die 0, 1, 10 und 100 LNCaP Zellen/ml Vollblut enthielten, hergestellt in Beispiel 1, indem jedes Aliquot mit einem gleichen Volumen von 2 × Lysepuffer, der aus 4,5 M Guanidinisothiocyanat, 1 M Lithiumacetat und 2% N-Lauroylsarcosin bestand, gemischt und gevortext wurde. Zehn ml (gleich dem gesamten vorherigen Volumen) von Präzipitatlösung, die aus 1 × Lysepuffer (2,25 M Guanidinisothiocyanat, 0,5 M Lithiumacetat, 1% N-Lauroylsarcosin) bestand, die 100 mM Cobaltchlorid (CoCl₂) enthielt, um die zellulären Kontaminanten auszufällen, wurde dann hinzugefügt, gevortext und für 30 Minuten ausfällen gelassen. Die Mischung wurde bei 1000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um das Präzipitat, das Zelldebris enthielt, zu entfernen.
Der Überstand, der die gelöste mRNA enthielt, wurde auf eine 20 mg Oligo-dT Zellulosesäule gegeben (Collaborative Biomedical Product Type T3, Nr. 20003, Bedford, MA) auf einem Promega Vac-Man (Promega, Madison, WI) Vakuumsammler. Die Säule wurde mit 5 ml von 1 × Lysepuffer gewaschen, gefolgt von 5 ml von 100 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 7,2. Die Säule wurde dann auf ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert, um restliche Flüssigkeit zu entfernen. Die Säule wurde zweimal mit 200 μl von 100 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 7, 2, gewaschen. Die Säule wurde auf ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die mRNA wurde mit 3 Volumina von jeweils 75 μl (insgesamt 225 μl) Wasser in Molekularbiologie-Reinheit eluiert. Das gesammte Verfahren wurde bei Raumtemperatur ausgeführt.
Beispiel 3
mRNA Isolierung unter Verwendung von RNAZol
Zellen wurde aus Duplikaten der 5 ml Aliquote isoliert, die 0, 1, 10 und 100 LNCaP Zellen/ml Vollblut enthielten, hergestellt in Beispiel 1, unter Verwendung von Ficoll-hypaque, dann mit 10 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 2000 rpm in einer Beckman J6 Zentrifuge pelletiert und in 1 ml PBS resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und durch Mikrozentrifugation für 5 bis 10 Minuten pelletiert.
Das Pellet wurde in RNAZol (Tel-Test, Inc., Friendwood, TX) aufgelöst, gemäß den Anweisungen des Herstellers, und die RNA wurde gereinigt unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Einhundert μl von Chloroform in Molekularbiologie-Reinheit wurden zu 1 ml der RNAZol Mischung hinzugefügt und 50 Sekunden gevortext, dann für 5 Minuten auf Eis gegeben. Nach der Mikrozentrifugation für 15 Minuten wurde die wässerige Schicht entfernt und in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Ein gleiches Volumen von kaltem Isopropanol wurde hinzugefügt und die Mischung wurde für 15 Sekunden gevortext, dann über Nacht bei –20°C inkubiert, um die RNA auszufällen. Nach der Ausfällung wurde die Mischung mikrozentrifugiert bei 14,000 × g für 30 Minuten bei 4°C, um das Präzipitat zu pelletieren. Ein ml von kaltem 75%igem Ethanol wurde dann zu dem Pellet hinzugefügt und die Mischung wurde gevortext, bis das Pellet aufschwamm, dann bei 14,000 × g für 15 Minuten bei 4°C mikrozentrifugiert, um das Präzipitat zu pelletieren. Wiederum 1 ml von kaltem 75%igem Ethanol wurden zu dem Pellet hinzugefügt, die Mischung wurde gevortext, dann wie zuvor mirkozentrifugiert. Nach dem Dekantieren und Abtupfen von jeglicher überschüssiger Flüssigkeit von dem Röhrchen ließ man das Pellet für 30 Minuten lufttrocknen, dann wurde es in 12 μl Rnase-freiem Wasser aufgelöst. Die gereinigte RNA wurde quantitativ durch Spektrophotometrie bestimmt unter Verwendung einer Extinktions-Abtastung bei 260 nm und einem Extinktionskoeffizienten von 40. Die Probe wurde dann verdünnt, um 1 μg RNA in 25 μl Rnase-freiem Wasser zu enthalten.
Beispiel 4
mRNA Isolierung unter Verwendung von Oligo dT Mikropartikeln
Zellen wurden aus Duplikaten der 5 ml Aliquote lysiert, die 0, 1, 10 und 100 LNCaP Zellen/ml Vollblut enthielten, hergestellt in Beispiel 1, durch Mischen von jedem Aliquot mit einem gleichen Volumen von 2 × Lyselösung bestehend aus aus 4 M Guanidinisothiocyanat, 8,; Dithiothreitol, 1% Sarcosyl, 1% Trion X-100, 100 mM NaCl in 20 mM MOPS, pH 7,0, bis die Lyse eintrat (ungefähr 30 Sekunden).
Die mRNA wurde dann isoliert durch Hinzufügen von 120 μl Dynaloligo (dT)₂₅ magnetischen Mikropartikeln (Dynal Katalog Nr. 610.05, Oslo, Norwegen), die vorgewaschen worden waren und in 1 × Lyselösung (2 M Guanidinisothiocyanat, 4 mM Dithiothreitol, 0,5% Sarcosyl, 0,5% Triton X-100, 50 mM NaCl in 10 mM MOPS, pH 7,0) resuspendiert wurden, zu jeder lysierten Probe, und Schütteln für 15 Minuten. Die Proben wurden für 5 Minuten bei 2500 rpm in einer Beckmann GS-6R Zentrifuge zentrifugiert. Die pelletierten Mikropartikel (Kügelchen) wurden gewaschen, indem sie in 0,5 ml 1 × Lyselösung resuspendiert wurden. Unter Verwendung der Dynal magnetischen Vorrichtung (Dynal Katalog Nr. 190.02, Oslo, Norwegen) wurden die Kügelchen eingefangen und die Waschlösung abgezogen. Die Kügelchen wurden mit einer zusätzlichen 0,5 ml 1 × Lyselösung gewaschen, eingefangen und die Waschlösung wurde abgezogen. Die Kügelchen wurden dann zweimal mit 200 μl kalter Waschlösung B (10 mM MOPS, pH 7, 0, die 50 mM NaCl, 0,5% Triton X-100 enthielt) gewaschen, indem sie vorsichtig gevortext wurden, um sie zu resuspendieren, gefolgt vom Einfangen der Kügelchen unter Verwendung der magnetischen Vorrichtung, abziehen der Waschlösung und Wiederholung. Die Kügelchen mit der mRNA Bindung wurden dann in 25 μl einer kalten Lösung von 16S und 23S rRNA resuspendiert (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 206938, Indianapolis, IN), verdünnt auf 20 ng/ml in Wasser.
Beispiel 5
PSA mRNA Detektion durch RT/PCR
Die Menge an PSA mRNA, die in jedem der 4 Aliquote anwesend war, hergestellt durch die 3 unterschiedlichen Verfahren in Beispielen 2, 3 und 4 oberhalb, wurde bestimmt durch RT/PCR und Oligonukleotidhybridisierung mit markierter Sonde, wie beschrieben in WO 97/07235.
Die Ziel-spezifischen Primer und Sonden wurden hergestellt, um eine mRNA Zielsequenz (Sequenzidentifikationsnr. 1) aus den Exonen 2 und 3 des PSA Gens durch Oligonukleotidhybridisations-PCR zu detektieren. Der Stromaufwärts-Primer (Sequenzidentifikationsnr. 2) wird in Exon 2 des PSA Gens gefunden und der Stromabwärts-Primer (Sequenzidentifikationsnr. 3) enthält zwei Nukleotide, welche an dem 3'-Ende von Exon 2 hybridisieren, wobei die restlichen der Primernukleotide mit der angrenzenden mRNA Region von Exon 3 des PSA Gens hybridisieren. Die Detektionssonde (Sequenzidentifikationsnr. 4) wird in Exon 2 des PSA Gens gefunden, und wurde als eine interne Hybridisationssonde für die amplifizierte PSA Zielsequenz entwickelt.
Die Primersequenzen wurden synthetisiert unter Verwendung von Standard-Oligonukleotidsynthese-Methodik und mit Adamantan an ihren 5'-Enden haptenisiert unter Verwendung von Standard- Cyanoethylphosphoramidit-Kopplungschemie, wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,424,414. Die Sondensequenz wurde auch synthetisiert unter Verwendung von Standard-Oligonukleotidsynthese-Methodik und haptenisiert mit einem Carbazol an dem 3'-Ende und einem Carbazol an dem 5'-Ende unter Verwendung von Standard-Cyanoethylphosphoramidit-Kopplungschemie, wie beschrieben in US Patent Nr. 5,464,746.
Die RNA Proben, die aus Beispielen 2, 3 und 4 oberhalb resultieren, wurden revers transkribiert, PCR amplifiziert und detektiert unter Verwendung der PSA Primer und der PSA Detektionssonde, die oben beschrieben ist, und zwar folgendermaßen: rekombinante Thermus thermophilus Polymerase wurde verwendet bei einer Konzentration von 5 Einheiten/Reaktion, mit dATP, dGTP, dTTP und dCTP, anwesend bei einer Endkonzentration von jeweils 0,15 mM, und dUTP, anwesend bei einer Endkonzentration von 0,2 mM in einem Gesamtreaktionsvolumen von 0,2 ml. Alle Reaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung von 5 × Bicinepuffer, pH 8,24, bestehend aus 50 mM Bicine, 92 mM Kaliumacetat, 19 mM Kaliumhydroxid, 0,868 M Glycerol, bei einer Endkonzentration von 1 ×. Die Reaktionsmischungen verwendeten Primer bei einer Konzentration von jeweils 125 nM, einer Sondenkonzentration von 5 nM, und einer Endkonzentration von 2,5 mM Manganacetat. Der Test wurde ausgeführt auf doppelten Proben unter Verwendung von 25 μl.
Die Reaktionsmischungen wurden zuerst bei 68°C für 60 Minuten inkubiert, um die RNA revers zu transkribieren, gefolgt von eine PCR Amplifikation durch Inkubation bei 94°C für 2 Minuten, dann einem Zyklus bei 94°C für 60 Sekunden/66°C für 80 Sekunden für 40 Zyklen in einem Perkin-Elmer 480 Thermozykler. Nachdem die Reaktionsmischungen thermozyklisiert wurden, wurden die Mischungen bei 97°C für 5 Minuten gehalten und die Sondenoligohybridisierung wurde durchgeführt, indem die Temperatur in ungefähr 2 Minuten auf 15°C abgesenkt wurde. Nach der Sondenhybridisierung wurden die Proben bei 15°C für bis zu 24 Stunden gehalten, bevor sie getest wurden.
Die Reaktionsprodukte wurden auf dem Abbott LCx^® Sytem detektiert (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Eine Suspension von anti-Carbazol Antikörper-beschichteten Mikropartikeln und eines anti-Adamantan-Antikörper/alkalische Phosphatase-Konjugats (die alle kommerziell erhältlich sind von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) wurde in Verbindung mit dem LCx^® verwendet, um die Reaktionsprodukte einzufangen und zu detektieren. Die Resultate aus diesem Experiment (berechnet als Zähler/Sekunde/Sekunde; c/s/s) sind in Tabelle 1 dargestellt, und sie zeigen die Detektion von PSA mRNA aus LNCaP Zellen durch die verschiedenen verwendeten Verfahren.
Tabelle 1
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bewieß, daß es das empfindlichste der 3 Verfahren zur Detektion von PSA mRNA ist, wie dadurch gezeigt, daß es die höchste LCx^® Geschwindigkeit bei der 1 LNCaP Zell/ml Konzentration hat. Dieses Verfahren schloß ebenfalls die geringste Probenhandhabung ein und war das am schnellsten durchzuführende; die mRNA wurde innerhalb ungefähr 90 Minuten durch dieses Verfahren isoliert, wohingegen das RNAZol Verfahren (Beispiel 3) 2 Tage erforderte, und das Oligo-dT Mikropartikelverfahren (Beispiel 4) benötigte ungefähr 2 Stunden, um vollständig zu sein.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein Verfahren zur Reinigung von RNA von einer Testprobe, die ebenfalls DNA enthält, welches folgende Schritte umfasst: (a) in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Übergangsmetallion, das eine Valenz von mindestens +2 hat, um ein Präzipitat, welches DNA und andere Kontaminanten umfasst, und einen Überstand zu bilden; (b) Abtrennen des Präzipitats aus dem Überstand; und (c) Sammeln des Überstandes, um dadurch eine gereinigte Lösung von der gesamten RNA zu erhalten.
Das Verfahren von Anspruch 1, das weiterhin den Schritt Abtrennen der mRNA von der gesamten RNA umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 2, worin der Abtrennungsschritt das in Kontakt bringen des Überstandes mit einer Oligo dT Matrix umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 2, worin der Abtrennungsschritt das in Kontakt bringen des Überstandes mit einem spezifischen Bindungsglied, das an eine feste Phase gebunden ist, umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 4, worin das spezifische Bindungsglied eine Nukleinsäure-Sequenz oder ein Analog davon ist, das spezifisch ist für eine spezielle mRNA-Sequenz.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das polyvalente Metallion gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Co⁺³, Co⁺², Zn⁺², Cu⁺², V⁺² und Ni⁺².
Das Verfahren von Anspruch 1, worin das polyvalente Metallion in einer Konzentration von größer als 5 mM vorliegt.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Testprobe vorher oder gleichzeitig mit Schritt (a) mit einem lysierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht wird.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin das lysierende Mittel ein chaotropisches Mittel, ein Salz und ein Detergens umfasst.
Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin ein organisches Lösungsmittel nicht zu der Testprobe hinzugefügt wird.