CH634574A5 - Verfahren zur herstellung von 7-(2,3-dihydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-propyl-xanthin, die als Bronchodilatator, d.h. als Bronchialmuskel-Relaxans, verwendet werden kann.

Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) der Struktur:

ist ein natürlich vorkommendes Xanthinalkaloid, das vor nahezu 55 Jahren erstmals als therapeutisches Mittel zur Behandlung von Asthma beschrieben wurde. Seine Verwendung als oraler Bronchodilatator wurde jedoch erst in den späten 1930er Jahren populär. Dabei wurde jedoch rasch festgestellt, dass - obgleich Theophyllin wirksam war - seine mangelnde Wasserlöslichkeit und die Möglichkeit unerwünschter Nebenwirkungen seine Eignung beeinträchtigten. Es wurden daher laufend Versuche durchgeführt, um die Löslichkeit des Theophyllins zu verbessern und verschiedene Derivate davon zu synthetisieren, um unter Beibehaltung der erwünschten pharmakologischen Eigenschaften die Therapiesicherheit zu erhöhen.

Die Solubilisierung von Theophyllin ist schon in der Weise erhalten worden, dass man Additionsverbindungen, wie Theophyllinäthylendiamin (Aminophyllin), Salze, wie Cholintheophyllinat (Oxtriphyllin) oder Kombinationen mit Natriumacetat oder Natriumglycinat hergestellt hat. Diese "löslichen" Theophyllinzubereitungen haben jedoch das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen im gastroin-testinalen, kardiovaskulären, renalen und im zentralen Nervensystem nicht nennenswert vermindern können.

Auch Versuche, die chemische Struktur des Theophyllins zu modifizieren, um eine Verbindung mit einer grösseren Bronchodilatatorselektivität zu erhalten, haben keine feststellbaren Erfolge gezeigt. Es können zwar Verbindungen mit einer gesteigerten bronchodilatatorischen Aktivität hergestellt werden, doch geschieht dies auf Kosten der Verträglichkeit. Das einzige synthetische Derivat von Theophyllin, das eine gewisse therapeutische Anwendung gefunden hat, ist Dyphyllin, nämlich 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-dimethyl-xanthin der folgenden Formel:

Dyphyllin hat zwar eine inhärente hohe Wasserlöslichkeit und nur wenige der gewöhnlichen theophyllinartigen Nebenwirkungen, doch besitzt es eine geringere bronchodilatato-15 rische Aktivität als das Theophyllin.

Aus der Aktivität des Dyphyllins wird ersichtlich, dass die 2,3-DihydroxypropyIsubstitution in 7-Stellung des basischen Theophyllin-Grundmoleküls die Gesamtaktivität sowohl hinsichtlich der therapeutischen Aktivität als auch der 20 Nebenwirkungen ausgeprägt verringert. Roth et al. (J. Phar-macol. Exp. Ther. 121:487,1957) haben die gleiche Erscheinung bei 7-ß-Hydroxypropyl-l,3-dimethylxanthin beobachtet, sowie Armitage et al. (Brit. J. Pharmacol. 17:196,1961) mit einer Reihe von 7-Hydroxyalkyl-6-thioxanthinen. Aus 25 Arbeiten von Roth et al. und McColl et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 116:343,1956) ist bekannt geworden, dass eine 7-Dihydroxypropylsubstitution die Aktivität stärker vermindert als eine 7-Monohydroxypropylsubstitution.

Andererseits haben verschiedene Autoren gefunden, dass 30 die pharmakologische Aktivität des Theophyllins durch eine Dialkylsubstitution in 1- und 3-Stellung erhöht werden kann. Kattus et al. (Bull. John Hopkins Hosp. 89:1-8,1951) haben beschrieben, dass 1,3-Diäthyl-, 1,3-Dipropyl- und 1,3-Dibu-tylxanthin extrem wirksame diuretische und emetische 35 Eigenschaften haben. Jedoch wurde nachteiligerweise keine bronchodilatatorische Wirkung festgestellt. Von Armitage und al. wurde eine ganze Reihe von 1,3-dialkylsubstituierten 6-Thioxanthinen untersucht. Die meisten der untersuchten Verbindungen mit Einschluss des 1,3-Dipropylderivats 40 besassen eine kräftige bronchialerweiternde Aktivität und sie stellten potente emetische Mittel dar.

Aus diesen Literaturberichten erscheint es daher, dass weder eine 7-Hydroxyallcyl- noch eine 1,3-Dialkylsubstitu-tion des Theophyllins allein dazu geeignet ist, um die thera-45 peutische Wirksamkeit des Moleküls als Bronchodilatator zu verbessern. Der erstgenannte Substituent vermindert zwar die Nebenwirkungen, doch auf Kosten der Aktivität, während der letztere zwar die Aktivität erhöht, jedoch auf Kosten der Verträglichkeit.

so In der US-PS 2 756 229 ist eine Reihe von substituierten Theophyllinen beschrieben, die sowohl 7-Monohydroxy-alkyl- als auch 1,3-Dialkylsubstituenten besitzen. Spezifisch sind solche Verbindungen der Formeln III und IV:

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CH^, — CH —CH.

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G H 3 7

7-(2-Hydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin

III

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7-(3-Hydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin beschrieben.

Nach den Angaben dieser Patentschrift heisst es, dass diese Verbindungen im Vergleich zu Theophyllin starke Diuretika sind und dass sie zur gleichen Zeit gut vertragen werden sollen. Jedoch finden sich in dieser Patentschrift keinerlei Angaben über bronchodilatatorische Eigenschaften dieser Verbindungen.

Untersuchungen der Anmelderin haben ergeben, dass die Verbindungen III und IV zwar wirksamere Bronchodilata-toren sind als Theophyllin, dass sie aber aufgrund unerwünschter emetischer, kardiovaskulärer und ZNS-Effekte therapeutisch ungeeignet sind.

Eine Verbindung, die mit Theophyllin als Bronchodilatator vergleichbar ist, die jedoch verringerte Nebenwirkungen und eine erhöhte Wasserlöslichkeit hat, würde daher eine Bereicherung der Therapie darstellen.

Durch die erfindungsgemässen, in den unabhängigen Ansprüchen gekennzeichneten Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-propyl-xanthin (durch die Formel V angegeben) wird nun eine Verbindung zur Verfügung gestellt, die bronchialerweiternde Eigenschaften hat, die mit denjenigen des Theophyllins vergleichbar sind, und die aber gleichzeitig weniger nachteilige Nebenwirkungen besitzt.

CHo— CH-CH ' I I

N\ OH OH

n-CoH

Auf molarer Basis ist die neue Verbindung mit Theophyllin als Bronchodilatator vergleichbar, doch ist sie hinsichtlich der akuten Toxizität sowie der unerwünschten kardiovaskulären, ZNS-, diuretischen und oralen emetischen Effekte weniger aktiv. Weiterhin ist sie erheblich stärker wasserlöslich als Theophyllin.

Im folgenden wird die Erfindung anhand des im unabhängigen Anspruch 2 gekennzeichneten meiststufigen Verfahrens beispielsweise näher erläutert.

Beispiel

Nach dem oben genannten erfindungsgemässen Verfahren wird die neue Verbindung 7-(2,3-DihydroxypropyI)-l,3-di-n-propylxanthin hergestellt, indem man l,3-Di-n-propyl-4-methylaminouracil mit Isoamylnitrit umsetzt und das so erhaltene 1,3-Di-n-propylxanthin durch Umsetzen mit l-Chlor-2,3-dihydroxypropan in die neue Verbindung überführt.

Die Ausgangssubstanz 1,3-Di-n-propyl-4-methylamino-

uracil selbst kann dabei aus n-Propylisocyanat in mehreren Stufen erhalten werden, indem man z.B. n-Propylisocyanat mit n-Propylamin zu 1,3-Di-n-propylharnstoff umsetzt, den so erhaltenen 1,3-Di-n-propylharnstoff mit Malonsäure umsetzt, um 1,3-Di-n-propylbarbitursäurezu erhalten, die 1,3-Di-n-propylbarbitursäure mit Phosphoroxidchlorid umsetzt und das so erhaltene 1,3-Di-n-propyl-4-chloruracil mit Monomethylamin zu l,3-Di-n-propyl-4-methylamino-uracil umsetzt.

In diesem Beispiel wird dann die neue Verbindung 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthin (V) durch folgende Umsetzungen hergestellt:

Ausgangssubstanz:

CHi • CH2CH2-N=C=0 + CH3CH2CH2NH2— 1,3-Di-n-pro-pylharnstoff (VI)

VI + H2C(COOH)2—1,3-Di-n-propylbarbitursäure (VII)

VII + PO Ch— 1,3-Di-n-propyl-4-chloruracil (VIII)

VIII + H2NCH3-*l,3-Di-n-propyl-4-methylaminouracil (IX)

Neue Verbindung:

IX + Isoamylnitrit-* 1,3-Di-n-propylxanthin (X)

X + CICH2CHOHCH2OH- 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthin (V)

Die einzelnen Synthesen wurden durchgeführt wie folgt:

A. Synthese von 1,3-Di-n-propylharnstoff (VI):

1700 g (98,4%) des Produkts wurden nach der Methode von Hayes et al., J. Agr. Food Chem., 17,1077 (1969) aus n-Propylisocyanat (1020 g, 12 Mol) und n-Propylamin (708 g, 4,75 Mol) hergestellt.

B. Synthese von 1,3-Di-n-propylbarbitursäure (VII): Die Synthese erfolgte nach der Methode von Goldner, Ann. Chem., 691,142(1966), wobei 1,3-Di-n-propylharnstoff (777 g, 5,38 Mol), Malonsäure (660 g, 6,34 Mol), Eisessig (1050 ml) und Essigsäureanhydrid (2160 ml) verwendet wurden. Es wurden 790 g (69,2%) Produkt mit einem Fp. von 77 bis 80°C erhalten. Die NMR- und IR-Spektren stimmten mit der zugeschriebenen Struktur überein.

Analyse für C10H16N2O3:

Ber.: C 56,58% H 7,59% N 13,20%

Gef.: C 56,50% H 7,66% N 13,08%.

C. Synthese von l,3-Di-n-propyl-4-chloruracil (VIII): Die Synthese erfolgte nach der Goldner-Methode unter Verwendung von 1,3-Di-n-propylbarbitursäure (340 g, 1,6 Mol) und Phosphoroxychlorid (1920 ml). Das Rohprodukt wurde bei 135 bis 145°C/0,05 mm destilliert, wodurch reines VIII,

1400 g (95,1 %), Fp. 64 bis 67°C, erhalten wurde. Das NMR-Spektrum stimmte mit der vorgeschlagenen Struktur überein.

D. Synthese von l,3-Di-n-propyl-4-methylaminouracil (IX):

Die Herstellung erfolgte nach einer geringfügigen Modifizierung der Goldner-Methode. Eine Lösung von 1,3-Di-n-propyl-4-chloruracil (1400 g, 6,08 Mol) in Isopropylalkohol (81) wurde mit einer Lösung von Monomethylamin (etwa 400 g) in Isopropanol (61) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wurde es zur Trockene eingedampft, mit überschüssigem Wasser behandelt, filtriert, in Wasser resuspendiert, filtriert und an der Luft getrocknet. Auf diese Weise wurden fahlweisse Kristalle mit einem Fp. von 108 bis 110°C, 1240 g, (90,64%),

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erhalten. Die IR- und NMR-Spektren standen mit der zugeschriebenen Struktur im Einklang.

Analyse für C11H19N3Q2:

Ber.: C 58,64% H 8,50% N 18,65%

Gef.: C 58,72% H 8,41% N 18,56%.

E. Synthese von l,3-Di-n-propylxanthin(X):

Die Synthese wurde nach der Goldner-Methode unter Verwendung einer Lösung von 1,3-Di-n-propyl-4-methylami-nouracil (690 g, 3,06 Mol) in Äthanol (51), Isoamylnitrit (655 g, 5,6 Mol) und einer gesättigten alkoholischen Chlorwasserstofflösung (42 ml) durchgeführt. Das Produkt wurde als fahlweisse Kristalle, 470 g (65%), Fp. 201 bis 205°C, erhalten. Die IR- und NMR-Spektren standen im Einklang mit der vorgeschlagenen Struktur.

F. Synthese von 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-pro-pylxanthin (V):

Eine Suspension von 1,3-Di-n-propylxanthin (250,1 g, 1,06 Mol) in Wasser (300 ml) wurde mit Natriumhydroxidlösung (50%, 85 ml) behandelt. Das Gemisch wurde filtriert und zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde mit einer Lösung von 1-Chlor-2,3-dihydroxypropan (170 g, 1,59 Mol) in Isopropanol (700 ml) behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht am Rückfluss gerührt, filtriert und zur Trockene eingedampft, wodurch ein brauner gummiartiger Rückstand erhalten wurde. Der Rückstand wurde in Isopro-pylalkohol aufgelöst und über Nacht mit Holzkohle (20 g) gerührt. Das Gemisch wurde filtriert, eingeengt und über Nacht bei 0 bis -5°C kristallisieren gelassen. Die Kristalle wurden abfiltriert, in Äther suspendiert, erneut filtriert und an der Luft getrocknet, wodurch weisse Kristalle (224 g, 72,17%), Fp. 88 bis 91°C, erhalten wurden. Die Dünnschichtchromatographie (5 li 1 einer 5%igen Lösung) auf einer Kieselsäureplatte, entwickelt in Chloroform: Methanol (9,5:0,5), zeigte einen Flecken. Die IR- und NMR-Spektren standen mit der vorgeschlagenen Struktur im Einklang.

Analyse für C14H22N4O4:

Ber.: C 54,18% H 7,15% N 18,05%

Gef.: C 54,39% H 7,32% N 18,03%

Die Löslichkeit in Wasser betrug 10%Gewicht/Volumen und in Chloroform etwa 31 % (Gewicht/Volumen).

Die neue Verbindung 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin (V), Theophyllin (I), 7-(2-Hydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin (III), 7-(3-Hydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthin (IV) und Dyphyllin (II) wurden nach den unten beschriebenen Testmethoden auf ihre bronchialerweiternde Aktivität, die akute Toxizität und die Nebenwirkungen untersucht.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen I und II zusammengestellt.

Testmethoden:

A. Verabreichung der Verbindungen und Darstellung der Werte:

Mit Ausnahme des Theophyllins wurden alle Verbindungen als freie Base gelöst oder suspendiert in geeigneten wässrigen Trägern verabreicht. Theophyllin wurde aufgrund seiner schlechten Löslichkeit in Form von Aminophyllin, d.h. der Äthylendiaminadditionsverbindung, verabreicht. Der Äthylendiaminteil des Moleküls ist pharmakologisch inert, ergibt aber eine Löslichkeit und Verwendungsmöglichkeit

(Simons et al., S. Med. Journ. 68:802,1975). Für den Zweck des Vergleichs wurde davon ausgegangen, dass das Aminophyllin 80 Gew.-% freies Theophyllin enthielt (Piafsky und Ogilvie, New England J. Med., 292:1218,1975). Die Endvergleiche waren immer auf der errechneten Dosis von Theophyllin aufgebaut. Aufgrund der offensichtlichen Unterschiede der Molekulargewichte wurden die Verbindungen auf molarer Basis anstelle auf Basis des absoluten Gewichts miteinander verglichen.

B. Bronchodilatatoruntersuchungen bei Meerschweinchen:

1. Isolierte Trachea-Zubereitung:

Die in-vitro-bronchialerweiternde Aktivität jeder Verbindung wurde mit einer spiralförmig geschnittenen Tracheal-streifenzubereitung des Meerschweinchens gemäss Constan-tine(J. Pharm. Pharmacol. 17:384,1965) bestimmt. Männliche Meerschweinchen (800 bis 1200 g, Large Camm English Short Hair) wurden dazu verwendet, um aus einem Tier drei spiralförmige Trachealstreifen herzustellen. Die Streifen wurden in 50-mI-Gewebebädern suspendiert, die eine modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung von 38°C enthielten und die mit 95% O2/5% CO2 belüftet wurden. Pilocarpin HCl, 1 mg/1, wurde zu der Lösung gegeben, um eine feste Konzentration aufrechtzuerhalten und um eine rasche Erholung des Muskels zu fördern. Ein Kraftverschiebungsumwandler (Grass FTQ,03) wurde zur elektronischen Aufzeichnung der Muskelantwort verwendet. Die Konzentrations-Entspannungs-Beziehung wurde für jede Verbindung ermittelt, indem logarithmisch die Badkonzentration erhöht wurde, bis eine maximale Entspannung (100%) beobachtet wurde. Die Gewebe wurden zwischen den Dosen gewaschen und sich 30 min lang erholen gelassen. Eine lineare Regressionsanalyse der prozentualen Antwort gegenüber dem Logarithmus der Badkonzentration liess die Errechnung einer Neigung und des EC50-Werts (Konzentration, die 50% der maximalen Entspannung liefert) für jede Verbindung zu. Jede Dosis jeder Verbindung wurde mindestens sechsmal getestet.

2. Schutz gegen Histaminaerosol:

In vivo wurde die bronchodilatatorische Aktivität bestimmt, indem die Fähigkeit jeder Verbindung gemessen wurde, Meerschweinchen gegen einen einschnürenden Bronchospasmus zu schützen, der durch Aussetzen an Histamin induziert wurde, wie es von Armitage et al. (British J. Pharmacol., 16:59,1961) beschrieben wird. Ausgewachsene männliche Meerschweinchen (270 bis 600 g, Adult Camm English Short Hair) wurden einzeln in einem umgedrehten Glasaquarium gehalten und kontinuierlich einem feinzerstäubten Nebel aus 0,5% Histamindiphosphat (hergestellt in einem Zerstäuber Devilbiss Nr. 40) und Druckluft von 300 mm Hg ausgesetzt. Der Zeitraum vom Beginn der Aerosolisierung bis zum Auftreten des letztlichen Kollapses oder von Konvulsionen wird als Vorkonvulsionszeit bezeichnet. Diese ist bei dem gleichen Tier relativ konstant. Die Vorkonvulsionszeiten wurden für jede Dosis jeder Verbindung bei mindestens sechs Meerschweinchen bestimmt. Kontrollvorkonvulsionszeiten wurden 3 Tage vor und 3 Tage nach der Arzneimittelverabreichung erhalten. Der prozentuale Schutz, der durch jede Verbindung erhalten wurde, wurde aus der Formel:

% Schutz = (1-C/T) x 100

errechnet, worin C die durchschnittliche Kontrollvorkonvul-sionszeit und T die Testvorkonvulsionszeit nach der Verabreichung der Verbindung, jeweils in sec, zeigt. Tiere mit Kontrollvorkonvulsionszeiten von mehr als 2 min wurden nicht verwendet. Wenn die Testvorkonvulsionszeiten länger

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als 10 min waren, dann wurde willkürlich ein Schutz von 100% angenommen. Die Dosis jeder Verbindung, die einen 50%igen Schutz (PDso) bewirkte, wurde nach der Methode von Litchfield und Wilcoxon (J. Pharmacol. Exp. Ther. 96:99, 1949) errechnet.

Der PDsu-Wert jeder Versuchsverbindung wurde sowohl nach antraperitonealer als auch oraler Verabreichung bestimmt. Ein Minimum von 3 Dosiswerten und 6 Tieren pro Dosis wurde eingesetzt, um aussagekräftige Dosisbeantwortungswerte zu erhalten. Die Schutzwirkung wurde 15 bis 20 min nach der intraperitonealen Injektion und 35 bis 40 min nach peroraler Zuführung durch eine Sonde mittels eines biegsamen Kunststoffröhrchens gemessen. Die Tiere mussten über Nacht vor der oralen Verabreichung fasten.

Alle Verbindungen wurden in wässriger Lösung mit Konzentrationen verabreicht, die eine entsprechende Volumendosis ergaben. Die Meerschweinchen wurden 1- bis 3-mal verwendet, doch erhielt kein Tier die gleiche Verbindung zweimal nacheinander, ohne dass eine 3-tägige Rastperiode zwischen den Verabreichungen eingehalten wurde.

C. Untersuchungen der akuten Toxizität:

1. Intravenöse und orale LDso-Werte bei Mäusen:

Die akute mittlere lethale Dosis (LDso) jeder Verbindung wurde bei Mäusen sowohl nach der intravenösen als auch der oralen Verabreichung bestimmt. Schweizer Albino-Mäuse (Charles River) mit einem Körpergewicht von 19,1 bis 23,2 g wurden verwendet. Die Geschlechter waren in jeder Dosisgruppe von mindestens 6 Tieren gleich vertreten. Entsprechende Dosen jeder Verbindung, aufgelöst in destilliertem Wasser, wurden intravenös in die Schwanzvene mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min injiziert oder mit einer Beschickungsnadel oral verabreicht. Die akuten Antworten und Lethalitäten wurden beobachtet und die entsprechenden LD>H-Werte wurden nach der Methode von Litchfield und Wilcoxon (J. Pharmacol. Exp. Ther. 96:99,1949) errechnet.

2. Orale LDso-Werte bei Meerschweinchen:

Die akute mittlere lethale Dosis jeder Verbindung nach oraler Verabreichung wurde ebenfalls bei Meerschweinchen bestimmt. Albino-Meerschweinchen (Camm English Short Hair) mit gleichermassen vertretenen Geschlechtern und einem Gewichtsbereich von 255 bis 311 g wurden hierzu verwendet. Mindestens 6 Tiere pro Dosiswert wurden verwendet. Die orale Verabreichung erfolgte mit einem biegsamen Röhrchen, das in den Magen eingesetzt war. Alle Meerschweinchen mussten über Nacht fasten. Aufgrund ihrer niedrigen Löslichkeiten war es erforderlich, die Verbindungen III und IV in 0,5% Methyl cellulose zu suspendieren. Die anderen Verbindungen wurden in destilliertem Wasser aufgelöst. Nach Verabreichung der entsprechenden Dosen wurden die akuten Antworten und die Lethalitäten bestimmt. Die LDso-Werte wurden nach der Methode von Litchfield und Wilcoxon (J. Pharmacol. Exp. Ther. 96:99,1949) errechnet.

D. Kardiovaskuläre Untersuchungen:

1. Hunde-Hinterbein-Durchblutungszubereitung:

Insgesamt 12 ausgewachsene Mongrel-Hunde mit jedem Geschlecht wurden dazu verwendet, um die direkte intraarterielle Ervveiterungsaktivität der fünf Versuchsverbindungen zu untersuchen. Die Tiere wurden mit Pentobarbitalnatrium, 30 bis 35 mg/kg i.V., anästhetisiert und so chirurgisch vorbereitet, dass der arterielle Blutstrom in die Schenkelarterie strömte und dass im wesentlichen das gesamte Hinterbein kontrolliert und konstant gehalten wurde. Dies erfolgte mit einer peristaltischen Pumpe mit variierbarer Geschwindigkeit nach proximaler und distaler Kannulierung der Schenkelarterie7Veränderungen des arteriellen Gefässwiderstandes spiegelten sich als Veränderungen des Durchblutungsdrucks wider, der mit einem T-Röhrchen auf der distalen Seite der Pumpe gemessen wurde. Der durchschnittliche systemische arterielle Druck wurde auch bei der kontralateralen Schenkelarterie aufgezeichnet. Arzneimittellösungen, gelöst in Kochsalzlösung, wurden in die arterielle Blutzuführung injiziert, unmittelbar bevor das Blut in die kannulierte distale Arterie eintrat. Logarithmisch ansteigende Dosen wurden in 10-min-Intervallen verabreicht. Die Antworten wurden aufgezeichnet.

2. Isolierte Kaninchenherzzubereitung:

In vitro wurde die kardiodynamische Aktivität jeder Verbindung bei dem spontan schlagenden isolierten Kaninchenherz nach der Langendorff-Methode, modifiziert nach Anderson und Craver (J. Pharmacol. Exp. Ther., 93:135, 1948), bestimmt (mit der Ausnahme von Dyphyllin).

Nachdem die aus dem extrahierten Herzen aufsteigende Aorta an der Vorrichtung befestigt worden war, wurden die Koronarien kontinuierlich mit einer belüfteten Chenoweth-Lösung (Chenoweth und Koelle, J. Lab. Clin., 31:600,1949) durchströmt, die bei einer konstanten Druckspitze und Temperatur von 38°C gehalten wurde. Die Effekte der logarithmisch zunehmenden Dosen jeder Verbindung wurden hinsichtlich der Kontraktionskraft, der Herzgeschwindigkeit und des Koronarstroms bestimmt. Die Arzneimittel wurden in minimalen Volumina von Chenoweth-Lösung aufgelöst und in 5- bis 10-min-Intervallen in das durchströmende Mittel unterhalb der Tülle injiziert.

3. Untersuchung der intravenösen kardiovaskulären Wirkung bei Hunden:

13 ausgewachsene Mongrel-Hunde mit jedem Geschlecht mit einem Gewicht von 16,7 bis 25,0 kg wurden herangezogen, um die intravenösen kardiovaskulären Gesamtaktivität von 5 Versuchsverbindungen zu vergleichen. 3 Hunde wurden für jede Verbindung mit Ausnahme für Dyphyllin (Verbindung II) verwendet, welche bei einem Tier getestet wurde.

Die Hunde wurden mit Pentobarbitalnatrium, 30 bis 35 mg/kg i.V., anästhetisiert. Sie wurden mit einem Endotra-chealrohr versehen und mit einer Harvard-Tierbeatmungs-pumpe belüftet. Eine Schenkelvene wurde für die i.V.-Arzneimittelverabreichung kannuliert. Die linke gemeinsame Karo-tidarterie wurde kannuliert und die Kannülenspitze wurde in den Aortenbogen vorgeschoben. Eine mittlere Sternotomie wurde durchgeführt. Elektromagnetische Blutflussum-wandler (Biotronex) mit entsprechender Grösse wurden um die aufsteigende Aorta angeordnet und vor der absteigenden Koronaarterie belassen. Diese Verfahrensmassnahmen gestatten eine kontinuierliche Aufzeichnung oder Errechnung der folgenden Parameter:

a) Mittlerer arterieller Druck (MAD); aus der Aortenkan-nule.

b) Herzgeschwindigkeit (HG); elektronisch aus dem pulsierend aufsteigenden Aortenfluss.

c) Kardiale Abgabe (CA); mittlerer aufsteigender aortischer Fluss.

d) Myokardiale Kontraktionskraft (MKF); dQ/dt. die erste Ableitung des Maximums der Aortenfliessgeschwindig-keit, auch als Spitzenbeschleunigung des Aorta-Flusses bekannt.

e) Schlagvolumen (SV); Quotient von CA/HG.

f) Kardiale Arbeit (KA); Produkt aus CA x MAD.

g) Gesamter peripherer Widerstand (GPW); Quotient aus MAD/CA.

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h) Koronärfluss (ÏCF); mittlerer linker vorderer absteigender Koronärfluss (LVA).

i) Koronarwiderstand (KW); Quotient von MAD/KF.

Logarithmisch zunehmende Dosen der jeweiligen Verbindung wurden in 20-min-Intervallen injiziert. Die Antworten wurden 1,2,5,10,15 und 20 min nach jeder Dosis gemessen. Die mittlere Antwort während dieses Zeitraums wurde errechnet. Theophyllin (Aminophyllin), Dyphyllin (II) und die Verbindung V wurden sowohl mit Konzentrationen von 20 als auch von 80 mg/ml in destilliertem Wasser verwendet. Die Verbindungen III und IV wurden in Konzentrationen von 10 bzw. 30 mg/ml verwendet.

E. Emetische Untersuchungen mit Hunden:

1. Intravenöse EDso:

12 erwachsene Mischlingshunde mit jedem Geschlecht wurden dazu verwendet, um die mittlere emetische Dosis (EDso) aller fünf Versuchs verbindungen nach intravenöser Verabreichung zu bestimmen. Entsprechende Dosen jeder Verbindung wurden Gruppen von 4 Tieren injiziert. Die Tiere wurden auf Emesis und Anzeichen für eine ZNS-Stimulierung untersucht. Das Einsetzen, die Frequenz und die Dauer von emetischen Episoden wurden gleichfalls aufgezeichnet. Die Hunde, die nicht zu fasten brauchten, wurden zwischen den Dosen 2 Tage lang ausruhen gelassen. Kein Tier erhielt die gleiche Verbindung zweimal nacheinander. Vorhergehende Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses Protokoll, das für die emetische Toleranz gegenüber Xan-thinen annehmbar ist, nicht auftritt und dass ein konditionierter Reflex gegenüber einer Emesis über eine solche kurze Zeitspanne schwierig einzurichten ist (McColl et al., 1956). Die EDso-Werte wurden nach der Methode von Litchfield und Wilcoxon (1949) errechnet.

2. Orale minimale emetische Dosis:

Die minimale Dosis jeder Verbindung, die eine Emesis nach einer oralen Verabreichung bewirkte, wurde bei einer Grupe von 5 ausgewachsenen Mischlingshunden jeden Geschlechts bestimmt. Logarithmisch ansteigende oder abnehmende (je nach der Antwort) Dosen jeder Verbindung wurden oral auf dem Wege über ein biegsames Magenrohr verabreicht. Die Verbindungen wurden in destilliertem Wasser in solchen Konzentrationen aufgelöst, dass eine Dosis mit 5 ml/kg mit konstantem Volumen erhalten wurde. Die Tiere mussten vor der Verabreichung über Nacht fasten. Sie erhielten zwischen den Dosen eine minimale Rast von 3 Tagen und sie erhielten die gleiche Verbindung niemals zweimal nacheinander. Das Einsetzen, die Frequenz und die Dauer der emetischen Episoden sowie die Anzeichen für eine ZNS-Stimulierung wurden gleichfalls aufgezeichnet.

F. Untersuchungen bei Mäusen über die freiwillige motorische Aktivität:

Um zu versuchen, die ZNS-Aktivität quantitativ zu messen, wurde jede Verbindung hinsichtlich ihres Einflusses auf die freiwillige motorische Aktivität bei Mäusen nach der Methode von Dews (British J. Pharmacol., 8:46, 1953) untersucht. Drei zylindrische Aktophotometerkäfige wurden gleichzeitig verwendet, wobei jeder 6 Lichtbündel und 6 photoelektrische Zellen aufwies. Einzelne Digitalzähler wurden mit jedem Aktivitätskäfig verbunden. Männliche Schweizer Albino-Mäuse mit Gewichten zwischen 19 und 24 g wurden verwendet. Die Verbindungen wurden in destilliertem Wasser aufgelöst und sie wurden intraperitoneal in logarithmisch abgestuften Dosen Gruppen von 5 Tieren injiziert, wobei 3 Gruppen pro Dosiswert verwendet wurden. Die

Kontrollgruppen erhielten Kochsalzlösung. Unmittelbar nach der Injektion wurden die 5 Mäuse in den Aktivitätskäfig eingebracht und die Zählung wurde für eine 15-min-Periode erhalten.

G. Diuretische Untersuchungen:

1. Akute orale Untersuchung bei Ratten:

Der orale diuretische Effekt jeder Verbindung wurde bei Ratten nach einer Modifizierung der von Lipschitz et al. beschriebenen Methode (J. Pharmacol. Exp. Ther., 79:97, 1943) bestimmt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Car-worth) mit einem Gewicht von 153 bis 220 g wurden über Nacht fasten gelassen. Gruppen von jeweils 5 Tieren wurden drei entsprechend logarithmisch abgestufte Dosen jeder Verbindung, gelöst in Kochsalzlösung, mit einer Dosis von 25 ml/kg mit konstantem Volumen auf dem Wege über eine orale Zuführungsnadel verabreicht. Die Kontrolltiere erhielten die gleiche Dosis von nur Kochsalzlösung. Die Ratten wurden sodann in einzelne Stoffwechselkäfige gebracht und für den Rest des Experiments von Futter und Wasser ausgeschlossen. Am Ende der 6 h wurde jede Ratte dazu gezwungen, dass sie Urin in der Blase abgab, indem sie an der Basis des Schwanzes gezogen wurde. Die gemessenen Parameter schlössen das Urinvolumen, den pH-Wert und die Natrium- und Kaliumexkretion, gemessen durch Atomabsorptionsanalyse, ein. Die 6-h-Werte wurden für jede Dosis der Verbindung und für die Kontrolltiere gemittelt und entsprechend verglichen.

2. Akute intravenöse Untersuchung bei Hunden:

Die akute intravenöse diuretische Aktivität von 3 logarithmisch abgestuften Dosen jeder Verbindung wurde bei ausge- *. wachsenen weiblichen Mischlingshunden nach einer ähnlichen Methode wie von Ross und Cafruny (J. Pharmacol. Exp. Ther., 140:125,1963) bestimmt. Die Verbindungen wurden jeweils bei 2 Hunden getestet. Die Tiere wurden am Anfang oral mit 30 ml/kg Wasser hydratisiert und sodann mit Pentobarbitalnatrium, 30 bis 35 mg/kg i.V., anästhetisiert. Eine Schenkelvene wurde kannuliert und eine konstante intravenöse Infusion von warmer Kochsalzlösung (3 ml/min) wurde begonnen und durch das Experiment hindurch fortgeführt. Die kontralaterale Schenkelvene wurde auch zur intravenösen Verabreichung des Arzneimittels kannuliert. Der Urin wurde direkt von einer bilateralen Ureter-kannüle gesammelt. Nach einer 20-minütigen Kontrollsam-melperiode wurde die erste Dosis der entsprechenden Verbindung injiziert und der Urin wurde in 20-min-Intervallen über einen Zeitraum von 1 h gesammelt. Diese Verfahrensweise wurde für 2 zusätzliche Dosen der gleichen Verbindung wiederholt. Das Urinvolumen, der pH-Wert und die Natrium- und Kaliumwerte wurden für jede 20-minütige Sammelperiode bestimmt. Die Summen wurden für die 1-h-Periode nach jeder Dosis erhalten. Die Testergebnisse, die als aufeinanderfolgende Veränderungen jedes Parameters aufgezeichnet wurden, wurden entsprechend verglichen.

Ergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle I zusammengestellt, in der die pharmakologische und toxikologische Aktivität gegenüber derjenigen von Theophyllin auf molarer Basis ausgedrückt ist. Aufbauend auf diesen Werten, sind in Tabelle II die tatsächlichen Dosen jeder Verbindung abgeschätzt, die der empfohlenen therapeutischen Dosis von Theophyllin äquivalent sind, sowie das Ausmass der Hauptnebenwirkungen, die durch diese Dosis erzeugt würden.

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

634574

Tabelle I

Zusammenstellung der relativen molaren Aktivitäten

Untersuchung

I II III IV

bronchialerweiternde Aktivität

Tabelle II

Abgeleitete pharmakologische Effekte bei äquivalenten therapeutischen Dosen in

IV

in vitro

(Trachealstreifen)

1,00

0,16

1,86

2,05

0,99

in vivo i.p.

(Meerschweinchen)

1,00

0,12

3,26

0,94

1,56

in vivo, oral

( Meerschweinchen)

1,00

0,13

3,30

0,92

0,75

oral LDii/oral PD'-„

(Meerschweinchen)

1,00

2,00

5,43

3,57

3,75

Mittelwert

1,00

0,60

3,46

1,87

1,76

Akute Toxizität und

Nebenwirkungsaktivität

i.v. LDso (Mäuse)

1,00

0,22

1,79

1,54

0,68

orale LDso (Mäuse)

1,00

0,11

1,67

0,64

0,25

orale LDso

(Meerschweinchen)

1,00

0,06

0,61

0,26

0,20

Vasodilator; HBDZC

(Hunde)

1,00

0,06

0,76

1,06

0,40

in vitro; MKF, HG, CFd

(Kaninchenherz)

1,00

_e

1,40

1,81

0,93

i.v. kardiovaskulär

(Hunde)f

1,00

0,36

1,16

2,02

0,91

oral emetisch (Hunde)

1,00

<0,50

251,00

6,00

0,50

i.v. emetisch (Hunde)

1,00

0,09

134,17

12,88

1,91

oral diuretisch (Ratten)

1,00

0,71

7,29

1,48

1,05

i.v. diuretisch (Hunde)

1,00

0,26

0,50

0,45

0,59

i.p. ZNS-Stimulierung

(Mäuse)

1,00

0,18

1,73

0,48

0,30

Mittelwert

1,00

0,26

36,55

2,60

0,70

Therapeutische

Wirksamkeit8

1,00

2,31

0,09

0,72

2,51

Wasserlöslichkeit %

(Gewicht/Volumen)

0,8

33,0

1,0

3,0

10,0

geschätzter Bronchodilatator für den Menschen Dosisa(HBD): (mg/70 kg) (mg/kg)

200 2,9

2353 33,6

99 1,4

347 5,0

299 4,3

15

würde folgende Nebenwirkungen bewirken:

20 kardiovaskuläre:

(i.v. Hunde)

MADb(A -12 -20 mmHG)

HG (A BPM) +11 +11 25 MKF (% A) +17 - 5 CA (% A) + 7 -15 CAR (% A) - 5 -30 GPW (% A) -12 + 3 CF (% A) +21 +10

30

+21 +28 + 10 + 2 -15 + 8

-25

+80 +20 + 2 -26 - 5 + 4

- 5

+ 7 + 15 + 6 + 2

- 9 + 17

Mittelwert

(12) (13) (13) (23)

(9)

35 emetische i.v. Hunde keine keine

(EDso mg/kg) (58) (900)

P.O. Hunde keine keine

(MED mg/kg) (128) (>362)

40

schwere mässige keine

(0,7) (7,5) (53)

schwere keine keine

(0,8) (33) (442)

ZNS-Aktivität:

i.p. Mäuse mässige

(% A) (+23)

schwere mässige keine (-60) (-17) (-1)

45

I Theophyllin

II Dyphyllin

III 7-(2-Hydroxyprpyl)- i ,3-di-n-propylxanthin

IV 7-(3-Hydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthin

V 7-(2,3-Dihydroxypropyl )-1,3-di-n-propylxanthin a orale LDs«: mittlere lethale Dosis b orale PDs»: mittlere Schutzdosis c HBDZ: Hinterbein-Durchblutungszubereitung d mittlere relative Aktivität für MKF, myokardiale Kontraktionskraft: HG Herzgeschwindigkeit: CF Koronärfluss.

e bei diesem Versuch wurde Dyphyllin nicht getestet t" mittlere relative Aktivität der Effekte auf den arteriellen Druck, die Herzgeschwindigkeit, die Kontraktionskraft, die kardiale Abgabe, das Schlagvolumen, die kardiale Arbeit, den totalen peripheren Widerstand, den Koronärfluss und den Koronarwiderstand.

g mittlere bronchialerweiternde (therapeutische) Aktivität, dividiert durch die mittlere akute Toxizität und Nebenwirkungsaktivität.

diuretische Aktivität:

i.v. Hunde milde mässige milde milde milde

50 '

I Theophyllin

II Dyphyllin

III 7-(2-Hydroxypropyl)-I,3-di-n-propylxanthin

IV 7-(3-Hydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthin

V 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthin

55

c

60 d

Dosis: bezogen auf die empfohlene Dosis für Theophyllin und die relativen Aktivitäten bei den Bronchodilatatorversuchen.

MAD: mittlerer arterieller Druck; HG: Herzgeschwindigkeit; MCK: myokardiale Kontraktionskraft; CA: kardiale Abgabe; CAR: kardiale Arbeit; GPW: Gesamtperipherer Widerstand; CF: Koronärfluss.

EDso: mittlere emetische Dosis, MED: minimale emetische Dosis.

nicht bestimmbar.

Therapeutisch wirksame bronchialerweiternde, d.h. Bronchialmuskel relaxierende Mengen von 7-(2,3-Dihydroxy-propyl)-l,3-di-n-propylxanthin können einem lebenden Tier 65 verabreicht werden, das an einer reversiblen Obstruktion der Luftwege leidet, die auf eine Bronchokonstriktion zurückzuführen ist. Die Verabreichung kann durch alle beliebigen Massnahmen und in jeder geeigneten Form erfolgen. Wei-

634574 8

terhin können wirksame Mengen von 7-(2,3-Dihydroxy- allgemeinen ist die Menge von 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-

propyl)-1,3-di-n-propylxanthin in eine Arzneimittelzuberei- di-n-propylxanthin, die verabreicht wird, etwa 1,0 mg bis tung der üblicherweise für die orale und parenterale Ver- etwa 10,0 mg pro kg Körpergewicht des Tiers. Vorzugsweise abreichung verwendeten Form eingearbeitet werden, und liegt die verabreichte Menge im Bereich von etwa 3,0 bis dem lebenden Tierkörper verabreicht werden. Pharmazeu- s 7,0 mg pro kg Körpergewicht des Tieres.

tische Zubereitungen für die orale Verabreichung, die die Weitere Vergleichsversuche hinsichtlich der oralen Ver-

erfindungsgemäss hergestellte Verbindung enthalten, können abreichung von 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-di-n-propyl-in flüssiger Form vorliegen, z.B. als Lösungen, Suspensionen xanthin und von Dyphyllin bei Hunden haben folgende oder Sirups, oder in fester Form, z.B. als Tabletten, Kapseln signifikante Ergebnisse ergeben:

oder Pulver. Die Zubereitungen für die parenterale Verabrei- to chung können in Form von sterilen wässrigen Lösungen oder 1. Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung wird Suspensionen vorliegen. Vorteilhafterweise können die phar- nach oraler Verabreichung leicht absorbiert, wobei die Kon-mazeutischen Zubereitungen, die die erfindungsgemäss her- zentration des Arzneimittels im Plasma innerhalb einer gestellte Verbindung enthalten, in Dosiseinheitsform herge- Stunde nach Verabreichung auf ein Maximum ansteigt. Die stellt werden, wobei pharmazeutisch annehmbare Träger, wie is Absorptionsrate und -Geschwindigkeit sind bei Hunden sehr Stärke, Glukose, Laktose, Gelatine, Saccharose, Stearate, ähnlich wie bei Dyphyllin.

Phosphate, Wasser zur Injektion und dergleichen, verwendet 2. Nach der Erreichung der anfänglichen maximalen Piaswerden. Auch Puffer und Konservierungsmittel sowie andere makonzentrationen fällt der Gehalt der erfindungsgemäss pharmazeutische Hilfsstoffe können vorhanden sein. hergestellten Verbindung im Plasma erheblich langsamer ab

Die Menge von 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-di-n-propyl- 20 als derjenige von Dyphyllin (die biologischen Halbwerts-xanthin, die dem lebenden Tierkörper verabreicht wird, Zeiten für die zwei Verbindungen - Plasma T1 /i - sind bei der hängt naturgemäss unter anderem von der Grösse des Tier- erfindungsgemäss hergestellten Erfindung mehr als 5 körpers, dem jeweiligen zu behandelnden Tier, dem Schwere- Stunden im Gegensatz zu etwa 2 Stunden bei Dyphyllin).

grad der reversiblen Obstruktion der Luftwege aufgrund Die bei diesen Untersuchungen im Verhältnis zu Dyphyllin einer Bronchokonstriktion und dem allgemeinen Gesund- 25 erhaltenen Werte sind sehr ähnlich denjenigen Werten, die heitszustand des lebenden Tierkörpers ab. Es kann jede belie- bislang bei Menschen hinsichtlich von Dyphyllin erhalten bige pharmazeutisch wirksame Menge verwendet werden, die wurden. Der bei diesen Untersuchungen erhaltene Plasmaausreichend ist, um den bronchialen Muskel zu entspannen T'/i-Wert von mehr als 5 Stunden der erfindungsgemäss her-und auf diese Weise die Obstruktion der Luftwege aufzu- gestellten Verbindung ist mit dem Plasma T - V^-Wert von 4 bis heben oder teilweise aufzuheben. Die Dosis kann anhand 30 6 Stunden vergleichbar, der in veröffentlichten Arbeiten über eingeführter medizinischer Methoden bestimmt werden. Im klinische Versuche am Menschen berichtet worden ist.

ß

Claims (3)

634574 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von 7-(2,3-Dihydroxy-propyl)-l,3-di-n-propylxanthin durch Umsetzen von 1,3-Di-n-propylxanthin mit l-Chlor-2,3-dihydroxypropan.

2. Verfahren zur Herstellung von 7-(2,3-Dihydroxy-propyl)-l,3-di-n-propylxanthin, dadurch gekennzeichnet, dassman l,3-Di-n-propyl-4-methylaminouracilmit Isoamyl-nitrit umsetzt und das so erhaltene 1,3-Di-n-propylxanthin nach dem Verfahren des Patentanspruchs 1 in das 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin überführt.

3. 7-(2,3-Dihydroxypropyl)-l,3-di-n-propylxanthinhergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspurch 1.

•CH, I 2 OH

II