Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Polypeptidamid der Formel
EMI1.1
seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe sowie Verfahren zu seiner Herstellung.
Das Polypeptidamid der obigen Formel kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden. wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Die Verknüpfung derAminosäure und oder Peptideinheiten erfolgt z.
B. in der Weise dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Ami- nogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid-. anhvdrid. -imidazolid. -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids oder N.N-Carbonyl-diimidazolo aktiviert werden. Vorzugsweise wird als Kondensationsmethode die Carbodiimidmethode. die Azidmethode. die Methode der aktivierten Ester, die Anhydridmethode oder die Merrifieldmethode verwendet.
In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester. wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.
An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktionelle Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.
So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz B die Nitrogruppe, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen. wie die Tosylgruppe, die p Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)- 3,4.5.6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blokkierung der ,-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz D, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxv. die Äthoxy-. die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der eI)-Aminogruppe des Lysinrestes.
beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C, kann eine Carbo-tert.-alkoxygruppe. vorzugsweise die Carbo-tert.-butoxygruppe verwendet werden.
Als Mercaptoschutzgruppe in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen EF verwendet man vorzugsweise die Ben zyl- oder die Tritylgruppe. Üblicherweise werden die zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzyl- bzw. Tritylschutzgruppen sowie die Herstellung der S-S-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptids erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige vom Zinks in Frage.
Das erfindungsgemäss hergestellte neue Polypeptid stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Es senkt den Calciumplasmaspiegel und bewirkt als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die biologische Wirkung der neuen Verbindung wurde an Ratten geprüft.
Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewünschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab. Im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie ist ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist. z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renal bedingte Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Dieses enthält die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet: Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl) Bzl = Benzyl BOC = tert.-Butyloxycarbonyl Trt = Trityl = Triphenylmethyl OTB = tert.-Butyloxy ONP = p-Nitrophenylester OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy OMe = Methoxy OEt = Athoxy NO = Nitro Ser = L-Seryl Asn = L-Asparaginyl Asp = L-Aspartyl Lèu = L-Leucyl Thr = L-Threonyl Val = L-Valyl Arg = L-Arginyl Gln = L-Glutaminyl His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl Gly = Glycyl Lys = L-Lysyl Phe = L-Phenylalanin Cys = L-Cysteinyl Ala = L-Alanyl
OSu = N-Oxysuccinimid
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturan .gaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt 1.
Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen vorliegen.
Teilsequenz A: H-Ala-Gly-Val-Pro-NH a) Z-Val-Pro-NH2
Man löst 75 g H-Pro-NH2 in 850 ml Dimethylformamid, versetzt mit 312 g Z-Val-OCP und lässt anschliessend die Lösung für 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand aus Essigester umkristallisiert. Man erhält Z-Val-Pro-NH2. Smp.: 1301310, [a]D' = 410G in Dimethylformamid.
b) Z-Gly-Val-Pro-NH2
Man löst Z-Val-Pro-NH2 in 2200 ml Methanol, gibt 85 ml 6N methanolische Salzsäure zu. hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 200 und Normaldruck und filtriert darauf vom Katalysator ab. Das Produkt wird mit Äther ausgefällt, gewaschen und anschliessend getrocknet. 120 g des erhaltenen H-Val-Pro-NH2.HCl (Zp: 217-2180; [2]DO = - 57o in Methanol) suspendiert man in 1800 ml Dimethylformamid, gibt 196 g Z-Gly-OCP, dann 67 ml Triäthylamin zu und schüttelt für 17 Stunden bei 200. Das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Den Rückstand löst man in einem Gemisch Essigester/Wasser.
Nach Trocknen über Na2SO4 und Eindampfen erhält man Z-Gly-Val-Pro-NH2. Smp.: 820 (mit Zers.) [alD = -760C in Methanol.
c) Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2
Man löst 101 g Z-Gly-Val-Pro-NH2 in 800 ml Methanol und hydriert bei Normaldruck und 200 in Anwesenheit von Palladiumkohle. Man filtriert, dampft im Vakuum zur Trockne ein, löst den Rückstand in 1000 ml Dimethylformamid, gibt
111 g Z-Ala-OCP zu, schüttelt und lässt 17 Stunden bei 200 stehen. Hierauf dampft man die Lösung im Vakuum zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit
1 N Salzsäure und 1 N NH40H. Man trocknet über Na2SO4, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther, trocknet und erhält Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2. Smp.: 1650, [ctl2DO = - 490C in Dimethylformamid.
d) H-Ala-Gly-Val-Pro-NH2, Sulfat
Man suspendiert 27,5 g Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96 %Der Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10%). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rfs = 0,4.
System: Chloroform/Methanol 7:3 + 0,5% Wasser.
Teilsequenz B: BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt
Man löst 43 g H-Thr-Gly-OEt in 500 ml Dimethylformamid und hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle. Man filtriert, gibt 60 g Z Asn-OCP zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, konzentriert auf ca. 250 ml, gibt Essigester zu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Essigester gewaschen und getrocknet. Man erhält Z-Asn-Thr-Glv-OEt. Smp.: 2250, [a]D = - 40C in Dimethylformamid.
b) Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt
Man löst 29 g Z-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle, filtriert und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-N3, das aus 30 g Z-Thr-NHNH2 hergestellt wurde. Nach 12 Stunden bei 00 dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Wasser, Ather und Äthanol. Man erhält Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt, Smp. 2300, [a]D = - 80C in Dimethylformamid.
c) BOC-Arg.Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2
Man löst 22 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle und filtriert. Man löst 23 g BOC-Arg(NO2)-OH in 500 ml Dimethylacetamid, gibt 12 ml Triäthylamin zu, kühlt auf - 100, gibt 9,4 ml Chlorameisensäureisobutylester hinzu, lässt 10 Minuten reagieren und gibt die oben erhaltene Tetrapeptidlösung zu. Näch 30 Min.
bei 250 fügt man 100 ml Wasser hinzu, behandelt die erhaltene Lösung mit Amberlit-IRA-410 (OH-Form) bis zur negativen Chlorreaktion, filtriert und dampft zur Trockne ab. Man wäscht den Rückstand mit Chloroform, Essigester und Äther und trocknet. Man erhält BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn-Thr-Gly- OEt. Smp. 1000, [zeo = 4o in Dimethylformamid. Man löst 12 g BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt in einem Gemisch von 200 ml Essigsäure und 40 ml Wasser, hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 200 und Normaldruck, filtriert und dampft im Vakuum bei 200 zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Dimethylformamid und dampft ab.
Diese Behandlung wird wiederholt, bis keine Essigsäure mehr nachweisbar ist. Man löst den Rückstand in 120 ml Dimethylformamid, gibt 6 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Äther, Methanol/Äther (1:1) und danach wiederum mit Äther und trocknet. Man erhält BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2, Smp. 1750 (mit Zersetzung), [abo = 420C in Dimethylformamid/HCl 1 N (1:1).
Teilsequenz AB: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val Pro-NH 2 CH3COOH Maro löst 13,5 g BOC-Arg.Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 (Teilsequenz B) in 270 ml Dimethylformamid/Wasser (8:2), kühlt auf - 150, gibt 40 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,5 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei - 150, gibt 28 ml Triäthylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 g H Ala-Gly-Val-Pro-NH (Teilsequenz A) zu, rührt 16 Stunden bei 00. Danach dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man lässt den Rückstand in Methanol, gibt einen Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache Menge Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung durch eine Säule von 500 g Kieselgel.
Nach Eluierung mit einer steigenden Menge an Methanol erhält man nach Eindampfen BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2.
Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und rührt während 2 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,2 N Essigsäure, behandelt mit Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form) und lyophylisiert die wässrige Lösung. Hierauf wäscht man den Rückstand mit Äther, Essigester und wieder Äther und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält H-Arg-Thr Asn-Thr-Gly-Ala-GlyWal-Pro-NH -2 2 CH3COOH. Smp.
155 (mit Zers.) [a]Db = -38C in Dimethylformamid.
Teilsequenz C: Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 176 g Z-Phe-Pro-OMe in 1000 ml Methanol/HCl
1 N, hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 20 und
1 Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in 400 ml Dimethylformamid, gibt bei 00 100 ml Triäthylamin zu, filtriert das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid ab und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-N3 (hergestellt aus 87 g Z-Thr-NHNH2 durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und Versetzen mit 35 ml N Natriumnitrit). Man lässt hierauf 16 Stunden bei 00 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein. Man pulverisiert den Rückstand in Heptan, wäscht mit Petroläther und trocknet.
Man erhält Z-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp. 920 (Zers.), [a]D) = - 16C in Dimethylformamid.
Man löst 53 g Z-Thr-Phe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt 100 ml 2 N Natronlauge zu lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 50 ml 2 N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml, gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die wässrige Lösung zweimal mit Essigester, stellt anschliessend mit 4 N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert das ausgeschiedene Tripeptid Z-Thr-Phe-Pro-OH mit Essigester, trocknet und dampft ein. Smp. 105 [a]20 = - 280 in Dimethylformamid.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und 100 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in
Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trock net. Man erhält H-Thr-Phe-Pro-OH, Smp. 1920 (mit Zersetzung), [a]20 = -4lin Essigsäure (956X), b) Z-Leu-Gln-OMe
Man löst 70 g Z-Gln-OH in 1,5 1 Dioxan und lässt soviel ätherische Diazomethanlösung zufliessen, bis die Lösung gelb gefärbt bleibt. Anschliessend wird die Lösung eingedampft und der weisse Rückstand mit Äther verarbeitet. Man erhält Z
Gln-OMe, Smp. 1360, [a]D = 210 in Dimethylformamid.
Man löst 71 g Ester in 1,7 1 Methanol. Danach werden 5 g lO c Palladium auf Aktivkohle mit 59 ml einer 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 3stündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei wird ca. 83 % der theoretischen Menge an Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Gln-OMe HCl in Form eines zähen Öls erhalten wird.
Man löst 64 g Z-Leu-OH in 200 ml Acetonitril, versetzt mit
27,7 g N-Hydroxysuccinimid und kühlt auf - 10o ab. Dazu giesst man eine Lösung von 50 g Dicyclohexylcarbodiimid in
100 ml Acetonitril. In ca. 30 Minuten wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat versetzt man mit 47,3 g H Gln-OMe - HCl, gelöst in Dimethylformamid, unter gleichzeitiger Zugabe von einem äquivalenten N-Methylmorpholin.
Man lässt 4 Stunden stehen und dampft ein. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und mit 5% Natriumbicarbonatlösung, 1 N Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein. Nach Umkristallisation aus Methanol und Äther erhält man Z-Leu-Gln-OMe, Smp. 1790, [a]2" = - 16C in Dimethylformamid.
c) Z-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe
42 g Z-Leu-OMe werden in 1500 ml Methanol gelöst.
Danach werden 16 g 10% Palladium auf Aktivkohle mit 25,8 ml einer 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 8-stündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden 95% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält H-Leu-Gln-OMe - HCl in Form eines Schaumes. Man löst hierauf H-Leu-GLn-OMe . HCI in 300 ml Dimethylformamid, gibt 34 g Z-Lys(BOC)-OCP und 8,4 ml Triäthylamin zu.
Nach Umschütteln lässt man während 16Stunden¯stehen.
Hierauf wird das Reaktionsgemisch am Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird mit Wasser behandelt und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend löst man in wenig Methanol und fällt mit Äther. Nach Filtration und Trocknen erhält man Z-Lys (BOC)-Leu-Gln-OMe, [a]0 = -21oC in Dimethylformamid.
d) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2
Man löst 38 g Z-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe in 300 ml Dimethylformamid, gibt 15 g 10%ige Palladiumkohle zu, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur und filtriert vom Katalysator ab. Hierauf versetzt man mit aus 52,2 g Z-His NHNH2 hergestelltem Z-His-N3, lässt 5 Stunden bei 200 stehen, dampft ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab, und wäscht den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu Gln-OMe, Smp.1200 (mit Zersetzung), [a]D =- 190 in Dimethylformamid. Man löst 33 g Z-His-Lys-(BOC)-Leu-Gln-OMe in 330 ml Methanol, versetzt mit 7,5 ml Hydrazinhydrat, lässt zwei Tage bei 250 stehen und dampft anschliessend zur Trockne ein.
Man löst hierauf in Dimethylformamid, dampft ein und wiederholt diese Behandlung, bis keine Spuren von Hydrazin mehr nachweisbar sind. Man wäscht den Rückstand mit Äther, Wasser und Äther, trocknet und erhält Z-His Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2, Smp. 1 99o, [a]D = - 22oC in Methanol.
e) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-CH
Man löst 40 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 in 400 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 75 ml Dioxan/HCl 2 N und anschliessend 6 ml. tert.-Butylnitril zu, rührt 10 Minuten bei - 200, gibt 30 ml Triäthylamin und 20 g H Thr-Phe-Pro-OH zu und lässt 16 Stunden bei 250 reagieren.
Man dampft hierauf zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther, verdünnter Essigsäure, Äther und schliesslich mit heissem Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum und erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH, Smp.
2000 (Zersetzung), [a]Do = - 470C in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABC: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 3 CH3CO2H
Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Hydroxysuccinimid, kühlt auf 00 ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt 3 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf 30 ml und fällt den entstandenen Heptapeptidoxysuccinimidester H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln Thr-Phe-Pro-OSu durch Zusatz von Äther aus. Nach Auswaschen mit Äther löst man den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10 g Nonapeptidamid (Teilsequenz AB) und lässt während 16 Std. reagieren. Man gibt 500 ml Essigester zu und filtriert.
Man löst den Rückstand in Dime thylformamid, gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man filtriert, wäscht mit Essigester sowie Äther und trocknet. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe- Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 2 AcOH, [a]D = - 310 in Dimethylformamid, das man direkt in 80 %iger Essigsäure löst. Anschliessend werden 5 g Palladiumkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Man filrteirt, dampft bei 200 im Hochvakuum zur Trockne und wäscht den Rückstand mit Äther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man die Teilsequenz ABC, Smp.
1640 (mit Zers.), [a]D = - 190C in Dimethylformamid.
Teilsequenz D Trt-Gly-Lys(B OC)-Leu-Ser-Gln-Asp (OTB)-Leu-NHNH2 a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 151 g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinim id in 700 ml Acetonitril und kühlt auf - 200C ab. Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 350 ml Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Filtrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden stehen gelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester/Wasser (2:1). Die organische Phase wird hierauf mit 5 % Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen, nach dem Neutralwaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem 1% Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer Kieselgelsäure (10-fache Menge). Man erhält Z Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 1310, [a]Dn = 230 in Dimethylformamid.
b) H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 118 g Z-Asp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol. Danach werden 15 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 63 ml 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp(OTB)-Leu-OMe . HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 h H-Asp(OTB)-Leu-OMe HCI werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 5 ml N-Methylmorpholin versetzt. Man lässt 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser gut verarbeitet und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält Z-Gln Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 1900 (Zers.), [a]D0 - 280 in Dimethylformamid. Man löst 44,4 g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu OMe in 1200 ml Methanol/Dimethylformamid (1:1). Danach werden 15 g 10%ges Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Wasser versetzt und in die Lösung gegeben. Nach ca. 2-stündiger Hydrierzeit ist fast die quantitative Menge an Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat am Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigester gelöst und dreimal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen.
Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und dampft das Filtrat auf ca. 1/3 des ursprünglichen Volumens ein.
Nach Zugabe von Petroläther lässt sich das feste Tripeptid abfiltrieren. Man erhält H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp.
1750, [a]20 = - 180in Dimethylformamid.
c) Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 80 g Z-Lys(BOC) OCP in 400 ml Dimethylformamid, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 25 Stunden bei 250 stehen, filtriert das ausgeschiedene Triäthylamin ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünnter Salzsäure sowie verdünnter Kaliumbicarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, filtriert und dampft ein. Man kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Äther um und erhält Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe, Smp. 1100, [a]D = - 140in Dimethylformamid.
d)Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH
Man löst 158 g Trt Gly-OH in 2000 ml Dichloromethan und 72 ,1 Triäthylamin, kühlt auf - 5o, versetzt mit 50 ml Chlorameisensäureäthylester und rührt 10 Minuten bei - 5o, Gleichzeitig löst man 300 g Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe in 3000 ml Dioxan/Wasser (8:2), hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei Zimmertemperatur und Normaldruck, filtriert und dampft ab. Man löst den Rückstand in Chloroform und versetzt mit dem oben erhaltenen gemischten Anhydrid. Man lässt 1 Stunde bei 00 stehen, wäscht die Chloroformlösung mit verdünnter Essigsäure und anschliessend mit verdünnter Kaliumbicarbonatlösung, trocknet und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in 1250 ml Methanol, versetzt mit 175 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 25o stehen.
Man konzentriert auf 500 ml, versetzt mit Wasser, filtriert, wäscht den Rückstand mit Wasser und trocknet über Phosphorpentoxid. Man erhält Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser NHNH2, Smp. 2040, [ol]D = - 60 in Dimethylformamid.
e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-NHNH2
Man lässt 76 g Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH2 in 300 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 75 ml Dioxan/HCl 4 N und anschliessend 11,6 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 15 , versetzt mit 70 ml Triäthylamin und mit 49,5 g H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe. Hierauf rührt man während 16 Stunden bei 00. Man filtriert das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid ab, konzentriert das Filtrat auf ca. 100 ml und versetzt den Rückstand mit Wasser. Man filtriert den ausgeschiedenen Rückstand ab, der anschliessend mit Wasser durchgewaschen wird und trocknet schliesslich im Hochvakuum bei 500. Der Rückstand wird mit Essigester ausgekocht, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Der erhaltene Heptapeptidester Trt-Gly-Lys(B OC)-Leu-Ser-Gln- Asp(OTB-Leu-OMe (Smp. 2110), [G]D0 = - 380C in Dimethylformamid) wird in 200 ml Dimethylformamid gelöst, mit 4 ml Hydrazin versetzt und 24 Stunden bei 25o stehen gelassen.
Nach Konzentrieren auf ca. 100 ml gibt man 500 ml Wasser zu, filtriert vom ausgeschiedenen Material ab, wäscht mit Wasser bis zur Neutralreaktion und trocknet über Phosphorpentoxid bei 500. Man erhält Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln Asp(OTB)-Leu-NHNH2, Smp. 2200, [J]D0 = 290 in Dimethylformamid/Wasser (8:2).
Teilsequenz ABCD: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-His-Lys(BOC).
Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly Val-Pro-NH2 3 AcCH 3 H20
Man löst 3 g Heptapeptidhydrazid (Teilsequenz D) in 30 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 2 ml Dioxan/HCl 4 N und anschliessend 0,3 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt während 10 Minuten bei 200, gibt 2 ml Triäthylamin und 3 g Hexadecapeptidamid (Teilsequenz ABC) zu, rührt 16 Stunden bei 00 dampft zur Trockne ab. Man wäscht den Rückstand bei 00 mit verdünnter Essigsäure und anschliessend mit Wasser, filtriert, löst den Rückstand in Methanol/Wasser (9:1), filtriert über Kieselgel, dampft dem Rückstand ab, wäscht mit Essigester, löst in 200 ml 80% Essigsäure auf, lässt 4 Stunden bei 25o stehen, dampft bei 200 zur Trockne, wäscht den Rückstand mit Äther, Essigester und Äther, filtriert und trocknet.
Man erhält die Teilsequenz ABCD. Smp. 188 (mit Zers.), [u]2' = - 7C in Dimethylformamid,
Teilsequenz E:
H-Thr-Cy(Bzl)-Val-Leu-OH a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21.0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val-Leu OMe HCI in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat. dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther.
Man erhält Z-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [z]D2O = - 28 in Dimethylformamid. das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 1680, [α]D20= = + 14C in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 gibt 100 ml einer Lösung von 2 N Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 20 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein. Iöst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäure äthylester/ Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natriumsulfat. dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.
Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe; Smp. 2080, {]D2O = -27 in Dimethylformamid. Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluor essigsäure1Essigester (1:1) auf. leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus MethanoliDiäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu
OMe 1 ,3HBr. Smp. 202 [a]2E' = - lots in Dimethylformamid.
c) H-Thr-Cvs(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr in 1800 ml Methanol. gibt 900 ml 7 N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 25o stehen. gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1 N Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält H Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 2190, [a]D) = -53C in 1 N Ammoniak.
Teilsequenz F1
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
Man löst g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn
ONP in 400 ml Dimethylformamid auf. gibt 22 ml Triäthyl amin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um,Man erhält BOC-Asn-Leu-Ser-OMe. Smp. 1900, [α]D20 = -24O in Dimethylformamid. das man in 500 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein. Iöst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, Smp. 1800, [a]D' = - 23 C in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
Man löst 39.5 g BOC-Ser-NHNH in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf-20 . gibt 200 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure und Dioxan und anschliessend 20 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 90 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350 [i2o - - 220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4 N Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25o stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser- OMe HCI.
Smp. 155o (Zers.), [a]D = - 150C in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe . HCI und 18 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält BOC-Cys(Bzl)-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [rc]D - - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/ Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl) Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2, Smp. 2240, [a]D = - 130C in Dimethylformamid.
EMI5.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (Teilsequenz F) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 40 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OH (Teilsequenz E) zu und rührt 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit
1N Essigsäure durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys(Bzl) Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 217 , [α]D20 = -17 in Dimethylformamid. Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu.
Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzuge Saugt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1 N Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp.
2480 (Zers.), [a]2OD = 410 in Dimethylformamid/Wasser (3:1). Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01 N Ammoniak auf, gibt unter Rühren 1 N Wasserstoffperoxid bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert. Man erhält
EMI5.2
[(lIDO = - 180C in Dimethylformamid/Wasser (3:1).
EMI5.3
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz EF) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 25 , filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet.
Man erhält
EMI6.1
Smp. 2420, das man in 10 ml Dimethylformamid löst. Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Diacetat (Teilsequenz ABCD) und 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 25 . Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriaconapeptid, das man in 50 ml eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser (70:30:5) löst: Man schichtet die erhaltene Lösung auf eine Kieselgelsäule (5 x 100 cm), die mit dem obengenannten Gemisch äquilibriert wurde. Die Elution wird mit einer steigenden Konzentration von Methanol durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden abgedampft, anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält die Titelverbindung, Smp. 1980 (mit Zers.), [cl]D = - 46" in Dimethylformamid.
EMI6.2
Hexaacetat Decahydrat
Man löst 3,3 g geschütztes Dotriacontapeptid diacetat tri hydrat (Beispiel 1) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 200 stehen und dampft zur Trockne ein. Man löst in 300 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxyd im Hochvakuum. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 172 (Zers.), [(liDO = - 680 in 50%iger Essigsäure.