Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidamids der Formel
EMI1.1
und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze.
Das Polypeptidamid der obigen Formel kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allge- mein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese nach Bildung der Aminosäuresequenz 1 bis 7 die Disulfidbrücke gebildet und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe übergeführt wird.
Die Verknüpfung der Aminosäure und/oder Peptideinheiten erfolgt z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter oc-Ami- nogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Über- führung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids oder N,N'-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden. Vorzugsweise wird als Kondensationsmethode die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester, die Anhydridmethode und die Merrifieldmethode verwendet.
In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.
An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktionelle Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.
So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C5 die Nitrogruppe, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarhonyl)-3,4,5,6-tetrachlorobenzoyl- gruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der r-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F1, die tert. Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert. Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der -Aminogruppe des Lysinrestes, beispielsweise in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen Dl und D2, kann eine Carbo-tert.aIkoxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.butoxygruppe verwendet werden.
Als Mercaptoschutzgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F1 verwendet man vorzugsweise die Berzyl- oder die Tritylgruppe. üblicherweise werden die zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzyl- bzw. Tritylschutzgruppen sowie die Herstellung der SsJBindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptids erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethyl- cellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z.B. derjenige vom 00+ Zink in Frage.
Das erfindungsgemäss hergestellte neue Polypeptid stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Es senkt den Calciumplasmaspiegel und bewirkt als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die biologische Wirkung der neuen Verbindung wurde an Ratten geprüft.
Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewürrschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab.
im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist somit indiziert bei allen Zuständen. bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsenaewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie ist ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renal be dingte Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. (Dieses enthält die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet: Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl) Bzl = Benzyl BOC = tert.Butyioxycarbonyl Trt = Trityl = Triphenylmethyl OTB = tert.Butyloxy ONP = p-Nitrophenylester OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy OMe = Methoxy OEt = Äthoxy NO2 = Nitro Ser = L-Seryl Asn = L-Asparaginyl Asp = L-Aspartyl Leu = L-Leucyl Thr = L-Threonyl Val = tL-Valyl Arg = L-Arginyl Gln = L-Glutaminyl His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl Gly = Giycyi Lys = L-Lysyl Phe = L-Phenylalanin Cys = L-Cysteinyl Ala = L-Alanyl OSu = N-Oxysuccinimid
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen,
erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt 1. Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen vorliegen.
1. Darstellung des Ausgangsmaterials
Teilsequenz A1: H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Man suspendiert 27,5 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 mi 96%iger Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10%). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt (Sulfat) im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rfs = 0,2.
Teilsequenz B1: Z-Thr-Asn- Thr-Gly-NHNH2
Man löst 98 g Z-Thr-Asn-ir-G1y-OEt in. 1000 ml Dimethylformamid und versetzt mit 100 ml Hydrazin hydrat. Nach 16stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird abfiltriert und mit Wasser und Äther nachgewaschen. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 2210, [α]D20 = -90 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C1:
H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Prn-NH2
Man löst 13,5 g BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 in 270 ml Dimethylformamid/Wasser (8 : 2), kühlt auf -150, gibt 40 ml einer 4N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,5 mi tert.Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei -150, gibt 28 ml Triäthylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 g H-Val-Gly-AlaWPro-NH2 (Teilsequenz A1) zu, rührt 16 Stunden bei 00. Danach dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man löst den 'Rückstand in Methanol, gibt ein Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache Menge Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung durch eine Säule von 500 g Kieselgel.
Nach Eluierung mit einer steigenden Menge an Methanol erhält man nach Eindampfen BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Vai-Gly- Ala-Pro-NH2. Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4N Lösung von Salzsäure in Dioxan und rührt während 2 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,2N Essigsäure, behandelt mit Am berlit-IRA-410 (Acetat-Form) und lyophilisiert die wässrige Lösung. Hierauf wäscht man den Rückstand mit Äther, Essigester und wieder Äther und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält die Titelver- bindung in Form des Diacetates, Smp.: 195 (mit Zers.), IIalo20 = - 640 in Dimethylformamid/XCl 1N (1:1).
Teilsequenz C2:
Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Zu einer auf 150 abgekühlten Lösung von 11 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHN'H2 (Teilsequenz B1) in 350 mm Dimethylformamid gibt man 47 ml einer 1,85n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,2 ml tert.Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei - 150, kühlt auf -300 ab, versetzt mit 12 ml Triäthylamin und filtriert zur kalten Lösung von H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Teilsequenz A1) in Dimethylformamid. Nach 90 Minuten Rühren bei 00 wird im Vakuum eingeengt, mit Chloroform versetzt und das ausgefallene Material abfiltriert und getrocknet.
Eine Lösung dieses Rohproduktes in Wasser-Methanol wird durch Dowex 50 filtriert, mit Amberlite IRA 410 neutralisiert und darauf im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril verrieben, erwärmt, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 2200 (mit Zers.) [α]D20 = - 280 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C3:
Z3-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Man löst 10 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro- NH2 (Teilsequenz C3) in 800 ml Methanol-Wasser, gibt 0,5 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck.
Es wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene Öl, H-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2, wird in 100 ml Dimethylform- amid gelöst, mit 10 g Z3-Arg-OSu versetzt und 16 Stunden bei 200 stehengelassen. Die Lösung wird dann im Vakuum eingeengt, das Produkt mit Aceton ausgefällt und abfiltriert. Der Rückstand wird in Aceton fein suspendiert, aufgekocht, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 2010 (mit Zers.), [aio20 = - 150 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D1:
Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 176 g Z-Phe*Pro-OMe in 1000 ml Metha nol/HCl 1 N, hydriert in Anwesenheit von IPamadium- kohle bei 200 und 1 Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in 400 ml Dimethylformamid, gibt bei 0 100 ml Triäthylamin zu, filtriert das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid ab und versetzt das Filtrat mit Z-Thr;N3 (hergestellt aus 87 g Z-Thr-NHNH2 durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und Versetzen mit 35 ml N Natriumnitrit). Man lässt hierauf 16 Stunden bei 00 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein.
Man pulverisiert den Rückstand in Heptan, wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält Z-Thr-Phe Pro-OMe, Smp. 920 (Zers.), IX]D2O = - 160 in Dime- thylformamid.
Man löst 53 g Z-Thr-Phe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt 100 ml 2N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 50 ml 2N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml, gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die wässrige Lösung zweimal mit Essigester, stellt anschliessend mit 4N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert das ausgeschiedene Tripeptid Z Thr-Phe;Pro-C)H mit Essigester, trocknet und dampft ein. Smp. 1050, IM]D20 = 280 in Dimethylformamid.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und 100 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man erhält H-Thr-Phe Pro-OH, Smp. 1920 (mit Zersetzung), [a]D20 = 410 in Essigsäure (95 5C).
b) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 40 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 in 400 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 75 ml Dioxan/HCI 2N und anschliessend 6 ml tert.Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei 200, gibt 30 ml Triäthylamin und 20 g H-Thr-3?he-Pro-OH zu und lässt 16 Stunden bei 250 reagieren. Man dampft hierauf zur Trockne ein. wäscht den Rückstand mit Äther, verdünnter Essigsäure, Äther und schliesslich mit heissem Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum und erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu -Gln-Thr-Phe-Pro- OH, Smp.
2000 (Zersetzung), ]o2O = - 470 in Dimethylform- amid.
Teilsequenz D2: Z-His-Lys(BOC)-Leu-GIn- Thr-Phe-Pro-NHNH2 a) Z Gin-Thr-Phe4 > roOMe
84,8 g Z-Thr(tBut.)-OMe werden in 1500 mi Me,- thanol gelöst und mit 125 ml 2N Salzsäure und 10 g Palladium (10% auf Kohle) versetzt. Nach 4stündiger Hydrierung wird vom Katalysator abfiltriert und vollständig eingedampft.
61,2 g ZGln-OH und 25,6 g N'Hydroxysuccinimid werden in 1000 ml Acetonitril/'Dimethylformamid gelöst und auf - 150 abgekühlt. Zuerst wird eine Lösung von 45,7 g Dicyclohexylcarbodiimid in 200 ml Aceto nitril dazugespült, dann das oben erhaltene HCl . H- Thr(t.But.)-OMe gelöst in Dimethylformamid unter Zusatz von 30,4 mi Triäthylamin. Unter zeitweiligem Umschütteln lässt man ca. 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid bzw. der Dicyclohexylharnstoff werden abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit 1 N Salzsäure und Natriumbicarbonat 5% gewaschen.
Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Phase auf ein Volumen von ca. 200 ml eingeengt und mit Petrol äther versetzt. Das ausgefallene Öl wird in ein Pulver umgeformt und abfiltriert. Man erhält Z-Gln-Thr(t.But.)- Orte, Smp. 1060, [α]D20 = + 110 in Dimethylformamid.
78,0 g Z-Gln-Thr(t.But.)-OMe werden in 800 ml Methanol gelöst und mit 65 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mit wasser behandelt und anschliessend aus Methanol Wasser umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Thr(t.But.)- NHNH2, Smp. 2020, la1n20 = - 130 in Methanol.
45,3 g Z-Phe-Pro-OMe werden in 750 ml Methanol gelöst und mit 55 ml 2N Salzsäure und 12 g Palladium (10% auf Kohle) versetzt. Nach 2stündiger Hydrierung ist die berechnete Wasserstoffmenge fast quantitativ verbraucht. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft.
49,5 g Z-Gln-Thr(t.But.)-NHNH2 werden in 500,ml Dimethylformamid gelöst und auf - 200 abgekühlt.
Nach Zugabe von 77 mi 5 N Salzsäure in Äther und 13,4 ml tert'Butylnitrit lässt man 10 Min. weiterrühren und neutralisiert mit 54 ml Triäthylamin. Das oben erhaltene HCI . H-Phe-Pro-OMe wird in 150 ml Di methylformamid gelöst, mit 15,4 ml Triäthylamin versetzt und zum Dipeptidazid gespült. Nach 4stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird vom auskristallisierten Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mittels Chloroform/Methanol über eine Kieselgelsäule filtriert.
Wach Kristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Gln-Thr(t.But.)-Phe-Pro-OMe. Smp. 1100, [a]n20 = 410 in Methanol.
Das Tetrapeptid wird in 250 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 20 Min. Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung auf dlas halbe Volumen ein(Teent und das Produkt mit Äther ausgefällt. Durch Filtration und ausreichendes Waschen mit Äther erhält man nach Trock nuna Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe. Smp. 1540. [α]D20 = 590 in Methanol.
b) Z-His-Lys(BOC) -Leu-NHNH,
114 g Z-Lys(BOC)-OH, 48 g H-Leu-OMe und 69 g N-Hydroxysuccinimid werden in 600ml Essigester ge löst und auf - 200 abgekühlt. Eine Lösung von 65 g Dicyclohexylcarbodiimid in 300 ml Essigester wird da zugespfflt. Unter zeitweiligem Umsehütteln lässt man während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Aus kristallisierter Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Wasser behandelt. Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)- Leu-OMe, Smp. 1130, ia]20 = - 180 in Methanol.
101,5 g Z-Lys(BOC)-Leu-OMe werden in 1000 ml Essigester gelöst und mit einer vorgekühlten Lösung von 40 ml 5 N Salzsäure in Äther in 300 mi Essigester versetzt. Nach Zugabe von 5 g Palladium (10% auf Kohle) in 50 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt wird 31/2 Stunden hydriert. Die berechnete Wasserstoffmenge wird dabei fast quantitativ verbraucht. Anschliessend wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat ein 'geçlasmpft.
78,7 g Z-His-NHNH2 werden in 400 ml Dimethylformamid gelöst, mit 182 ml 5N Salzsäure in Äther versetzt und auf -IpO abgekühlt. Nach Zugabe von 32,5 mi tert.Butylnitrit lässt man noch 10 Min. weiterrühren und neutralisiert mit 140 ml Triäthylamin.
Das oben erhaltene HC1 H-Lys(BOC)-Leu-OMe wird in 300 ml Dimethylformamid gelöst, mit 36,4 ml Triäthylamin versetzt und zur Azidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Man erhält ein Öl, das in Essigester gelöst wird. Nach Waschen mit Wasser wird die organische Phase über Natriumsulfat ge 'trockner. filtriert und eingeengt. Anschliessend wird mit Petroläther gefällt und abfiltriert. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie an Kieselgel und Elution mit Chloroform/Methanol gereinigt.
Durch Kristallisation aus Äther/Petroläther erhält man Z-His-Lys(BOC)-Leu OMe, Smp. 1460, t02o = - 280 in Methanol.
64,5 g Z-His-Lys(l3OC)-Leu-OMe werden in 300 ml Methanol gelöst und mit 15 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 3 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigester/n-Butanol versetzt und mit gesättigter Natriumchloridlösung mehrere Male gewaschen. Die or organische Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/ Methanol filtriert. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu- !NHNH2, Smp. 1810 fr]¯20 = 260 in Methanol.
c) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2
38,4 g Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OiMe werden in 1500 ml Methanol/Dimethylformamid gelöst. 10 g Palladium (10% auf Kohle) werden in 50 ml Wasser aufge- schlämmt und dazugespült. Nach ca. · Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
38.6 g Z-EIis-;Lys(BoO-Leu-NHNHo werden in 250 ml Dimethyiformamid gelöst. Nach Abkühlen auf 15 werden 42 ml 5N Salzsäure in Äther und 7,3 ml tert. Butylnitrit zugesetzt. Es wird 10 Min. gerührt und mit 29,5 ml Triäthylamin neutralisiert. Das oben erhaltene H-Gln-Thr-PheEro-OIMe wird in 250 ml Dimethylformamid gelöst und zur Peptidazidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das ausge- schiedene Triäthvlaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester/n-Butanol aufgenommen und mit 1N Ammoniak, 1 N Schwefelsäure und mehrere Male mit Wasser gewaschen.
Die organische Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol/Wasser gereinigt. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp.
171 ,[α]D20 = 540 in Methanol.
43,6 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe werden in 1000 ml Methanol/Dimethylformamid gelöst und mit 44 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril ausgekocht. Nach Abkühlen auf ca. 200 wird abfiltriert.
Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro- NHNH2, Smp. 1750, fo]n20 = - 580 in Methanol.
Teilsequenz E1:
H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr- Gly-Val-Gly-A la-Pro-NH2 Methode A
Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz D1) in 100 mi Dimethylformamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Hydroxysuccinimid, kühlt auf 0 ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt 3 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf 30 ml und fällt den entstandenen Heptapeptidoxysuccinimidester Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe- Pro-OSu durch Zusatz von Äther aus. Nach Auswaschen mit Äther löst man den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10 g Nonapeptidamid (Teilsequenz C1) und lässt während 16 Stunden reagieren.
Man gibt 500 ml Essigester zu und filtriert. Man löst den Rückstand in Dimethylformamid. gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man filtriert, wäscht mit Essigester sowie Äther und trocknet.
Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 2 AcOH, [o2O = - 240 in Dimethylformamid, das man direkt in 80%iger Essigsäure löst. Anschliessend werden 5 g Palladiumkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Man filtriert, dampft bei 200 im Hochvakuum zur Trockne und wäscht den Rückstand mit Äther. Nach Trocknen über KOTI-Spänen erhält man die Teilsequenz E1: Triacetat, Smp. 1850 (mit Zers.), [α]D20 - 42 in 1N Essigsäure.
Methode B
Man löst 12 g Nonapeptid (Teilsequenz C5) in 1000 ml Dimethylformamid/Wasser, gibt 1,8 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum auf 60 ml eingeengt. Diese Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-WH2 wird bei - 200 aufbewahrt.
Zu einer auf - 150 vorgekühlten Lösung von 10 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 (Teilsequenz D2) in 100 ml Dimethylformamid gibt man 21 ml einer 1,85 n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 1,1 mi tert.Butylnitrit. Man rührt 10 Min. bei -150, kühlt auf - 300 ab, gibt 6 ml Triäthylamin zu und filtriert zur kalten Lösung von H-ArEs-Thr Asn-Thr-Gly-Val-Gly- Ala-Pro-NHO in Dimethylformamid. Nach 90 Min. Rühren bei 00 engt man die Lösung im Vakuum ein, versetzt mit Chloroform, filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit Chloroform, dann mit Essigester und trocknet.
Das Rohprodukt wird in einem Gemisch von Me thanol/Chloroform/Wasser gelöst und auf eine Kiesel gelsäule aufgetragen. Man eluiert, vereinigt die reinen Fraktionen und dampft im Vakuum zur Trockne ein.
Den Rückstand löst man in Methanol, fällt das Produkt mit Essigester, filtriert und trocknet. Man erhält Z-His Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2, Smp. 1850 (mit Zers.), ralDZO = - 290 in Dimethylformamid.
3,68 g des so erhaltenen Hexadecapeptids werden in 120 ml Dimethylformamid/Wasser gelöst, mit 3 g Palladium (10% auf Kohle) in 10 ml Wasser aufgeschlämmt versetzt und der katalytischen Hydrierung unterworfen.
Nach ca. 2 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft und die Teilsequenz E1 erhalten.
Teilsequenz F1:
Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-
NHNH2 a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 151 g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinimid in 700 ml Acetonitril und kühlt auf 200 ab. Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 350 ml Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Filtrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden stehengelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester/Wasser. Die organische Phase wird hierauf mit 5% Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen, nach dem Neutraiwaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem 1% Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer Kieselgelsäule (lOfache Menge).
Man erhält Z-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 580, IaJ20 = 160 in Dimethylformamid.
b) Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 118 g ZkAsp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol. Danach werden 15 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 63 ml 4N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp(OTB)-Leu-OMe HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 g H-Asp(OTB)-Leu OMe HCI werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 51 ml N-Methylmorpholin versetzt. Man lässt 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser gut verarbeitet und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Asp(OTB)- Leu-OMe, Smp. 1890 (Zers.), rilD20 = - 300 in Dimethylformamid.
c) Z-Ser-Gln-A sp(OTB)-Leu- OMe
Man löst 44.4 g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe in 1200 ml Methanol/lDimethylformamid. Danach werden 15 g 107,ges Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Wasser versetzt und in die Lösung gegeben. Nach ca. 2stündiger Hydrierzeit ist die berechnete Menge an Wasserstoff fast verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat am Vakuum eingedampft.
21,4 g Z-Ser-NHNH2 gelöst in 100 ml Dimethylformamid werden auf -200 abgekühlt und mit 50,6 ml 5N Salzsäure in Ather und 10,3 ml tert.Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min. Rühren wird mit 35,6 ml Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt und 34,2 g H-Gln-Asp(OT'B)- Leu-OMe in 100 ml Dimethylformamid gelöst zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei 200, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab und dampft das Filtrat vollständig ein. Nach Behandlung des Rückstandes mit Wasser und anschliessender Kristallisation aus Wasser/Methanol wird das Rohprodukt durch Filtration über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Me- thanol gereinigt. Man erhält Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu OMe, Smp. 172 , [CC]D20 = 240 in Dimethylformamid.
d) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-NHNH,
50,8 g ZLys(BOC)-Leu-OMe werden in 600 ml Essigester gelöst und nach Zugabe von 25 ml 4 N Salzsäure in Äther und 3 g Palladium (10% auf Kohle) katalytisch hydriert. Nach ca. 4 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge fast vollständig verbraucht. Vom Sa- talysator wird abfiltriert und das Filtrat auf das halbe Volumen eingeengt.
33,0 g Trt-Gly-OH und 12,0 g N-Hydroxysuccinimid werden in 150ml Dimethylformamid gelöst und auf -150 abgekühlt. Eine Lösung von 21,6 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril wird dazugespült und das Gemisch unter zeitweiligem Umschütteln während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter Zugabe von 25 ml N Methylmorpholin mit der aus obiger Hydrierung erhaltenen Dipeptidlösung versetzt. Nach 16 Stunden Stehen wird vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und bei 00 mit 1N Schwefelsäure und 5% Natriumbicarbonatlösung behandelt. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Phase vollständig eingedampft. Durch Filtration des resultierenden Schaumes über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol erhält man Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-OMe in Form eines amorphen Schaumes, ICC]D2O = 100 in Methanol.
Man löst den Rückstand in 300 ml Methanol, versetzt mit 17 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach vollständigem Eindampfen und Nachtrocknen am Hochvakuum wird mittels Chloroform/lMethanol über eine Kieselgelsäule filtriert. Durch Kristallisation aus Ghloroform/Petroläther erhält man Trt-Gly-Lys(B0e3-Leu-NIFNH?, Smp. 1750, [aJ25 = - 120 in Methanol.
e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-
NHNH2
26,6 g ZSerGln-Asp(OTB)-Leu-OMe werden in 1 Liter Methanol/'Dimethylformamid gelöst, mit 5 g Palladium (10 ,Zo auf Kohle) in 100 ml Wasser aufgeschlämmt, versetzt und der katalytischen Hydrierung unterworfen. Nach 1 Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Entfernung von Methanol eingeengt.
29,6 g Trt-Gly-Lys(BOC)JLeu-NHNH2 werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst. Es wird auf 200 abgekühlt und mit 26.2 ml 5N Salzsäure in Äther und mit 5,3 ml tert.Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min. Rüh ren werden 18,5 ml Triäthylamin und die oben erhaltene eingeengte Lösung von H-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu- OMe zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur, anschliessend wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Äther aufgenommen, zu einem Pulver verarbeitet und abgenutscht.
Dieses Rohprodukt wird durch Filtration über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol gereinigt. Man erhält Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu OMe, Smp. 2170, [iD20 = 300 in Methanol.
Das Heptapeptid wird in 400 ml Methanol gelöst, mit 1,4 ml Hydrazinhydrat versetzt und während 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Hydrazid wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Smp. 218 , [α]D20 = 160 in Dimethylformamid.
Teilsequenz G1 Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu -His-
Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-A rg-Thr-A sn-Thr Gly-VaI-Gly-AI-Pro-NHfl 2CH2COOH 3H2O
2,43 g Heptapeptid (Teilsequenz F1) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Ablkühlen auf - 200 werden 1,45 ml 5 N Salzsäure in Äther und 0,252 ml tert.Butylnitrit zugegeben. Man lässt noch während 10 Minuten weiterrühren und neutralisiert dann mit 1,01 ml Triäthylamin. ;Das Hexadecapeptid E1 wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zur Heptapeptidazidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtem .peratur wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlo- rid abgesaugt und das Filtrat vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in wenig Methanol warm gelöst und durch Zugabe von Äther gefällt. Das Rohprodukt wird an einer Kieselgelsäule chromatographiert und mit Chloroform/Methanol/Wasser eluiert. Man erhält die Titelverbindung vom Smp. 2250, 10C]D2 = - 180 in Dimethylformamid.
Beispiel
EMI6.1
650 mg Tricosapeptid (Teilsequenz G1) werden in 30 ml 60'50iger Essigsäure gelöst und während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von Wasser wird mehrere Male mit Äther gewaschen.
Die Wasserphase eluiert man durch eine Amberlite-IRA 410 Acetat-Säule und dampft darauf die Lösung vollständig ein.
Man löst 295 mg
EMI6.2
Val-Len-OH in 10 ml Diirethyisulfoxid/'Dimethylform- amid, gibt 131 mg N > Hydroxysuccinimid und 59 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und filtriert nach 6 Stunden Stehen vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab. Das oben durch Abspaltung der Schutzgruppen erhaltene Tricosapeptid wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und zum Filtrat gespült. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Zugabe von Äther ausgefällt und die überstehende Lö- sung abdekantiert. Der Niederschlag wird in wenig Methanol gelöst und durch erneute Zugabe von Äther in ein Pulver übergeführt.
Nach Absaugen und Trocknen werden 220 mg des geschützten rohen Dotriacontapeptids in 4 ml eines Methylenchlorid/Trifluoressigsäure/ Wasser-Gemisches gelöst. Die Lösung wird nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in 0,2N Essigsäure aufgenommen und auf eine BiogelsäuleJP-(1 X 300cm) geschichtet.
Die Elution wird mit 0,2N Essigsäure durchgeführt. Die vereinigten reinen Fraktionen werden eingedampft und anschliessend lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 2150 (Zers.), !aiID20 = -750 in 1N Essirg- säure.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6N, 16 Stunden) Asp 3,1; Thr 3,7; Ser 2,8; Gln 1,9; Pro 2,0; Gly 2,9; Ala 1,0; Cys 1,6; Val 2,0; Leu 5,2; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 0,9.
PATENTANSPRÜCHE
I. Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidamids der Formel
EMI6.3
und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert. wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, und dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese, nach Bildung der Aminosäuresequenz 1 bis 7 die Mercaptogruppen zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und das Reaktionsproduikt schliesslich in Form der freien Base oder eines therapeutisch wirksamen Säu readdition ssalzes gewinnt.
II. Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptidamids der Formel
EMI6.4
zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Polypeptidamid der obi- gen Formel durch Umsetzung mit lSchwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.
Anmerkung des Eidg. Amtes für geistiges Eigentum:
Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentanspruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der.Patentanspruch für den sachlichen Geltungsbereich des Patentes massgebend ist.
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