CH517826A - Verfahren zur Gewinnung von farblosen Mikroorganismen und deren Verwendung - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Gewinnung von farblosen Mikroorganismen und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von farblosen, zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, wie z. B. Arthrobacter oder Brevibacterium linens (Weigmann, 1910, 1953 Kul   tur).    Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der nach diesem Verfahren gewonnenen Mikroorganismen, zur Herstellung von Käsen insbesondere von Weichkäsen, wie z. B. Camembert und Brie.



   Brevibacterium linens, das zu der Brevibacterium Gattung (Familie von Brevibacteriaceae der Ordnung Eubacteriales) gehört, wird von Mulder und seinen Mitarbeitern ( Journal of Applied Bacteriology , 29,   1966,    Seiten 44-71) als ein Corynoid-Organismus angesehen, verwandt der Arthrobacter-Gattung (Familie von Corynebacteriaceae der Ordnung Eubacteriales) (siehe   Berbey    Manual of Determinative Bacteriology, Breed et al., 7. Auflage, verlegt von Baillere Ltd., London 1957). Die Kolonien der meisten Organismen dieser Gattungen zeigen variierende Farbintensitäten.   KulF    turen von Brevibacterium linens bewegen sich hinsichtlich Farbe von Orange bis Rotbraun, Kulturen von Arthrobacter von Rotbraun bis Farblos.

  Das Auftreten dunkel gefärbter Zellen in einer Kultur von Brevibacterium linens und von verschiedenen Arthrobacter im Entwickungsprozess scheint durch Licht und gewöhnliche Salzlösungen (z. B.   4oloige    Lösungen) beeinflusst zu sein.



   Die in Rede stehenden Mikroorganismen können zahlreiche Anwendungen finden, z. B. beim Abbau von Peptiden und im besonderen demjenigen bitterer Geschmackstoffe, wie sie z. B. während der Reifung bestimmter Käsesorten auftreten.



   Diese proteolytischen Organismen werden für die Herstellung von Camembert und Brie verwendet.



   Camembert und Brie werden auf weitgehend gleiche Weise hergestellt. Camembert ist im allgemeinen in Gestalt glatter Zylinder vom Durchmesser 8-11 cm und mit einer Dicke von 34 cm; er wurde ursprünglich in der Normandie erzeugt. Brie besitzt die gleiche Gestalt, aber einen Durchmesser von 30 cm und eine Dicke von 34 cm; er wurde ursprünglich in der Nähe von Paris hergestellt.



   Die Reifung von   Camembert    und Brie wurde durch die Aktivität von   Milchsäure-Bazillen,    Penicillium caseicolum (Bainier), Penicillium camemberti (Thom) und anderen Mikroorganismen wie z. B. Brevibacte   riurn    linens und Arthrobacter stark beeinflusst. Frische Milch enthält stets Milchsäurebazillen. Die beschriebe   nen      Räserarten    können daher durch Zusatz einer Kultur von Penicillium caseicolum und/oder Penicillium camemberti zur Milch vor ihrer Gerinnung oder durch Aufsprühen einer Suspension der Sporen dieser Kryptogamen auf den frisch bereiteten Käse erhalten werden. Wenn pasteurisierte Milch verwendet wird, wie es heutzutage üblich ist, müssen Milchsäurebazillen zwecks Säuerung der Milch angewendet werden.

  Brevibacterium   Iinens,    das ein stark proteolytischer Mikroorganismus ist, welcher orangefarbige bis rotbraune Kolonien bildet, können den Käse in den frühen Stadien des Reifungsprozesses infizieren, aufgrund der   tatsache,    dass er in der natürlichen   Flora    von Käsereien vorkommt. Das gleiche gilt für Arthrobacter und andere Organismen. Verbesserung der hygiensichen Verhältnisse in Käsereien und die Reinigung aller Gefässe und Ergänzungseinrichtungen haben das Verschwinden von Brevibacterium linens wie auch von Arthrobacter und anderen Organismen der natürlichen Flora verursacht.



   Jedoch wiesen Camembert und Brie, die in Abwesenheit dieser Organismen gereift waren, einen ungefälligen, bitteren Geschmack auf. Daher wurde es notwendig, eine Kultur eines oder mehrerer dieser proteolytischen Organismen zuzusetzen, z.B. der Milch vor ihrer Gerinnung, der zum Salzen des Käses verwendeten Sole, oder die Kultur auf den bereiteten Käse zu sprühen.



   Diese Organismen und im besonderen Brevibacte   riurn    linens sind stark aerobe Organismen, die sich auf der Oberfläche von Käsen entwickeln. Kleine Kolonien dieser   Qrganismen,    besonders von   Brevibactenum     linens, können in Form rotbrauner bis orangener Verfärbungen auf dem weissen Myzel von Penicillium caseicolum auf Käse gefunden werden.



   Das Ziel der vorliegenden Erfindung war es zur Käseherstellung geeignete Mikroorganismen wie z. B.



  Arthrobacter und speziell Brevibacterium linens zu gewinnen, von deren angestammten Eigenschaften einige verändert sind, vornehmlich durch künstliche Massnahme.



   Ein weiteres Ziel der Erfindung war es Mikroorganismen herzustellen mit denen es gelingt, Käse wie Camembert oder Brie mit vorzüglichem Aussehen und gutem Aroma, frei von Bitterkeit, herzustellen. Diese und weitere Ziele der Erfindung werden aus ihrer anschliessenden Beschreibung deutlich hervorgehen.



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von farblosen, zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Kulturen von gefärbten zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen derart behandelt, dass farblose Mutanten der Mikroorganismen erhalten werden.



   Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Mikroorganismen bei der Erzeugung von Weichkäse. Käse wie Camembert und Brie reifen in Anwesenheit von Penicillium caseicolum. Dies verursacht das Auftreten bitterer Geschmacksstoffe. Die proteolytischen Organismen wie Arthrobacter und Brevibacterium linens zerstören diese Gescmacksstoffe, so dass der Käse mild wird und weiterreift.



   Es ist nun gefunden worden, dass es möglich ist, durch Auswahl Organismen zu erhalten, die nicht gefärbt sind und die als Mutanten gefärbter Kulturen proteolytischer Organismen wie z. B. Arthrobacter und Brevibacterium linens angesehen werden können.



  Jedoch sind diese farblosen Mutanten ohne eine vorangehende Massnahme sehr schwer zu identifizieren bzw.



  isolieren. Daher wird es vorgezogen, die anfängliche gefärbte Kultur einer Vorbehandlung zu unterwerfen.



  Es wurde gefunden, dass diese Vorbehandlung verhältnismässig einfach sein kann; z. B. kann die Kultur eine gewisse Zeit lang dem Sonnenlicht ausgesetzt werden.



  Eine geeignete Vorbehandlung besteht in Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen einer Wellenlänge kleiner als 320   m,u,    z. B. mit künstlichem Ultraviolettlicht, welchem die anfängliche gefärbte Kultur ausgesetzt wird. Es wurde ferner gefunden, dass es vorteilhaft ist, die anfängliche Kultur während des logarithmischen Wachstums der Mikroorganismen dem Ultraviolettlicht auszusetzen, weil auf diese Weise eine grössere Anzahl farbloser Mutanten erzeugt wird.



   Gemäss einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wiId die Kultur von gefärbten Mikroorganismen, z. B. von orangefarbigem bis rotbraunem Brevibacterium linens, Ultraviolettlicht einer Wellenlänge von etwa   210-210 m,    vorzugsweise   230-280 m,u,    eine gewisse Zeit lang ausgesetzt.



   Es wurde gefunden, dass Ultraviolettlicht einer Wellenlänge von 260 mu den günstigsten Mutationseffekt hervorbringt. Das grösste Verhältnis von farblosen Mutanten zu überlebenden Zellen wird nach Ultraviolettlichtbestrahlung der Dauer von 2,5-3 Minuten erzielt, was einer Dosis von 2500-3000 Erg pro   mm2    entspricht.



   Für einige gemäss der Erfindung ausgeführte Versuche wurde eine salzresistente Kultur von dunkelrotem Brevibacterium linens verwendet. Diese Kultur wurde etwa 40 Stunden lang auf einem geeigneten Nährmedium gehalten, um logarithmisches Wachstum hervorzurufen. Hernach wurde die Kultur etwa 40 Stunden lang einem Ultraviolettlicht von   210-300my    ausgesetzt, vorzugsweise in einem Abstand   von - 10    cm von der Bestrahlungsquelle. Es zeigte sich, dass nach etwa 5 Minuten Bestrahlung mit Ultraviolettlicht einer Intensität von etwa 1000 Erg pro   mm2    pro Minute die Kultur, welche sich in einem albuminfreien Medium befindet, weitgehend stationär bleibt,   d. h.    die Anzahl überlebender Zellen bleibt verhältnismässig konstant.



  Bestrahlung wird daher bei dieser Intensität 2-6 Minuten lang aufrecht erhalten und im besonderen ist eine Exponierung für etwa 5 Minuten zu bevorzugen. Eine längere Bestrahlungsdauer, z. B. 10 Minuten, ergibt keine merklich besseren Resultate. Ferner ermöglicht eine so kurze Bestrahlungsdauer wie z. B. 2 Minuten, farblose   Mutanten    zu isolieren, deren Zucht fortgesetzt werden kann. Sehr gute Ergebnisse kann man durch Bestrahlung der anfänglichen auf einem albuminfreien Substrat (z. B. mittels Waschens) abgesetzten Mikroorganismen erhalten. Am Ende des Bestrahlungsvorganges, während dessen, nach Meinung von Fachleuten, das Albumin und besonders die Desoxyribose-Nukleinsäuren Licht einer Wellenlänge von 260   m,    absorbieren, werden die Mikroorganismen vorzugsweise eine Zeit lang im Dunklen gehalten.

  Nach Meinung der Experten wird die Struktur der Desoxyribose-Nukleinsäuren der Mikroorganismen örtlich unter dem Einfluss der Ultraviolettbestrahlung verändert, und diese Veränderung mag nicht von Dauer sein, wenn die bestrahlten Mikroorganismen nicht im Dunklen gehalten werden. Durch diese Dunkel lagerung der Mikroorganismen scheint die   erwähnte    Strukturveränderung zu einer permanenten gemacht zu werden.



   Farblose Mutanten können auch auf andere Weise als durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht erhalten werden. Beispielsweise kann die besagte Mutation durch Betrahlung mit Gammastrahlen, Röntgenstrahlen oder Neutronen zustande gebracht werden. Chemische Mutationsmitte.l wie z. B. Yperit, salpetrige Säure, Formamid und Iminoacetylen können auch zwecks Erzielung farbloser Mutanten verwendet werden.



   Wenn man salzresistente Mutanten erhalten will und diese sind zur Erzeugung von Käsen wie z. B.



  Camembert und Brie notwendig - kann eine Kultur   saizresistentcr    Organismen von Anfang an verwendet werden, aber es wird vorgezogen, eine normale Auswahl der erhaltenen Mutanten nach ihrer Salzresistenz zu treffen.

 

   Das Gleiche gilt im allgemeinen für Arthrobacter.



   Die erfindungsgemässen Organismen können mit bestem Erfolg bei der Herstellung von Brie und Camembert verwendet werden.



   Vorzugsweise werden die erfindungsgemässen Organismen bei diesen Herstellungen so verwendet, dass man den Käse mittels einer   200logen    Kochsalzlösung salzt, welcher gerade vor der Käsesalzung eine Kultur des erfindungsgemässen Organismus zugesetzt worden ist. Der Mikroorganismus, welcher - gemeinsam mit anderen Mikroorganismen wie Milchsäurebazillen und Penicillium caseicolum - Brie und Camembert zu vollständiger Reifung bringt, vermehrt sich an der Oberfläche des Käses. Es bildet sich eine gut gekennzeichnete    Reifungsfront',    welche sich von aussen nach innen in den Käse ausbreitet.  



   Durch Verwendung der erfindungsgemässen Mutanten ist es möglich, Käse von bemerkenswert guter Farbe, d. h. ohne von Orange bis zu Rotbraun reichende   Flecke    oder Stellen zu erhalten.



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiterhin veranschaulicht.



   Beispiel 1
Die Basis-Kultur war eine Kultur von salzresistentem Brevibacterium linens   Nur. 9174    der Amerikanischen   Typensamrn lung    von Mikroorganismen (American type Culture Collection of Rockville, Maryland, USA, 12301 Park Lawn Drive), empfangen im Mikrobiologie-Laboratorium der Landwirtschaftlichen Hochschule (Landbouwhogeschool) in Wageningen, Holland.

  Diese Kultur liess man 40 Stunden lang in einem Medium wachsen, welches    MgSO4.7H2O    0,1 g/l    CaCl . 2H2O      0;02    g/l    Fels .      6O    0,01 g/l
MnSO4.   4H2O    1,0 mg/l    CuSO4 .      5H2O    0,1 mg/l    ZnSO4.      7H2O    0,1 mg/l
CoCl2. 6H20 0,01 mg/l    H3BO3    0,01 mg/l
Na2MoO4 0,01 mg/l enthielt und dem auch die folgenden Stoffe in den folgenden Mengen zugesetzt worden sind:   1,0ovo    technischer Casaminosäuren (erhalten durch saure Hydrolyse von Kasein, siehe  Difco Manual , 9.

  Auflage, 1953), 0,50/0 Extrakt von  Bacto-Yeast  (gebildet von den wasserlöslichen Komponenten autolytischer Hefe, siehe  Difco Manual , Seite 270), 0,50/o Glukose und Sörensen-Puffer. Das Ganze wird durch Zugabe von   desil;    liertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der Sörensen Puffer wird aus 40 ml einer 0,667 molaren Lösung von KH2PO4 und 60 ml einer 0,667 molaren Lösung von   NaHPO. 2H2O    bereitet. Der pH-Wert des Mediums beträgt   7,01.    Das erhaltene Medium wird durch vorheriges 5 Minuten langes Erhitzen bei   1200    C sterilisiert.



   Die Mikroorganismen werden in dieses Medium gesät.



   Nachdem die Zellen der Mikroorganismen 40 Stunden lang in einem Fernbach-Kolben bei 200 C wachsen gelassen wurden, wobei mittels eines Magnetgieren bei einer Fliehkraft von 20 000 g für 5 Minuten rührers Belüftung erfolgte, wurden sie durch Zentrifuisoliert; hernach wurde das Substrat durch eine sterile physiologische Kochsalzlösung   (0,850/oige NaCl-Lösung)    ersetzt, in welcher die Zellen in Suspension gebracht wurden. Die Operation wurde wiederholt, um die Proteinverbindung durch Waschen zu entfernen.



   Von der Suspension gewaschener stäbchenförmiger Zellen mit einer Konzentration von   106    Zellen pro ml wurden 30 ml entnommen und in eine   Petri-Schale    gegeben, welche offen gehalten wurde, um sie in einer Entfernung von 10 cm mittels einer 6 Watt-Niedrigdruck-Gasentladungslampe, die als Keimtötungsinstrument dient und ultraviolettes Licht einer Wellenlänge von   254 mg      (85 , o    der biologisch aktivsten Wellenlänge von 260 mic) aussendet, zu bestrahlen. Die In   Intensität    des ausgesendeten Lichtes betrug   0,85,xW    pro   cm2    bei einer Entfernung von 1 m. Im Laufe der Bestrahlung wurde die Suspension der Zellen magnetisch gerührt, um gleichmässige Bestrahlung aller Zellen sicherzustellen.

  Die Intensität der Bestrahlung betrug etwa 1000Erg pro mm2 pro Minute. Die Bestrahlung dauerte 2 Minuten und führte zu einer Absterbung von etwa 990/0 der Zellen. Die Suspension wurde dann 3 Stunden lang bei   20     C im Dunklen gehalten, wonach eine Kultur aller überlebenden stäbchenförmigen Zellen in einem Medium der oben erwähnten Zusammensetzung in   Ferubach-Kolben    bei 200 C erzeugt wurde, unter Belüftung mittels eines Magnetrührers. Nach 24 Stunden wurden die Verdünnungen auf   Feldehen    aus Agar-Agar gesät, wodurch es ermöglicht wurde, 50-100 Kolonien je Feldchen zu erhalten. Die Kolonien farbloser Zellen wurden auf Oberflächen von Agar-Agar überführt, die schräg in   Reagensgiäsern    erstarrt waren.

  Die auf diese Weise erhaltenen Organismen wurden auf verschiedene Medien mit einem Kochsalzgehalt von   5-70/0    gesät, im Tageslicht inkubiert und hernach hinsichtlich Salzresistenz ausgewählt.



   Zur Herstellung von Camembert wurden 100 Liter Milch, deren Fettgehalt auf   3,50/o    eingestellt worden war, durch Erhitzen für 40 Sekunden bei 720 C (Hoch   temperatur-Kurzzei t-Prinzip)    pasteurisiert. Der auf   32  C    gekühlten pasteurisierten Milch wurden   3 /o    einer Lactobazillen-Kultur, enthaltend 1010 bis   1011    Zellen pro ml, und hernach 10 ml einer Suspension von   Penicillium-caseicolum-Sporen      (20-30X106    Sporen pro ml) auf 100 Liter Milch zugesetzt. Nach Umrühren wurden 2 g Labpulver in Form einer   0,01 0/oigen    Lösung in Wasser zugegeben. Die derart behandelte Milch wurde 2 Stunden lang bei   32     C gehalten.



   Die durch Einwirkung des Labs geronnene Milch wurde grob aufgeteilt und in kleinen Fässchen eines Fassungsvermögens von etwa 1 Liter gesammelt.



  Darin wurden die Quarkmassen   20 Stunden    lang belassen und in dieser Zeit schied sich das Milchserum ab, so dass nach Ablauf dieser Zeit der Käse gebildet war. Die Temperatur der Quarkmassen fiel von 320 auf 230 C und das pH betrug dann 4,4. Das Redoxpotential ging um 100-12- Millivolt hinunter und war dann niedriger als -100 Millivolt. Die Temperatur wurde in diesem Fall bei   21-22     C gehalten, die relative Feuchtigkeit bei   950/o.   

 

   Sogleich nach Bildung der Käse wurden sie in ein 200/oiges   Kochsalzbad    getaucht, so dass sie etwa   2,50/o    Salz aufnehmen konnten.



   Gerade vor der Salzung des Käses wurden etwa 2,5 ml einer Kultur von mutiertem Brevibacterium linens, erhalten wie im Vorgehenden beschrieben, an 100 Liter Salzlösung zugefügt, so dass 10 000 Keime pro ml Sole da waren. Vorzugsweise verwendet man keine höheren   Keimkonzentrationen.    Die Mikroorganismen beginnen zu wachsen, sobald das pH des Käses mindestens etwa 6,0 beträgt.



   Der Käse wurde in Kammern gereift, in denen eine Temperatur von 160 C und eine relative Feuchtigkeit von 900/0 gehalten wurden. Schimmel entwickelte sich auf dem Käse in Form einer weissen Schicht. Nachdem die Käse hier 10 Tage lang gehalten worden waren,  wurden sie in perforierte Aluminiumfolie verpackt.



  Das Brevibacterium linens konnte sich in dieser Pakkung weiter   entwickeln.    Mehrere Tage bis mehrere Wochen nach Beginn der Reifung der Käse waren sie reif genug für Verzehr. Die Reifung der Käse durch Schimmel begann an der Oberfläche und schritt zur Mitte zu weiter. Während des Reifungsprozesses stieg der pH-Wert fortschreitend von 4,4 (Beginn des Reifungsprozesses) auf 6,0 (2 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses) und schliesslich auf etwa 7,5 (6 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses). Diese Werte gelten für die Aussenfläche. Im Innern des Käse stieg das pH von 4,3 (Beginn des Reifungsprozesses) auf 6,3 (6 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses).



   Aus mikrobiologischer Untersuchung des Käses 4 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses ergab sich, dass keine gefärbten Organismen Brevibacterium linens anwesend waren. Bei dieser Untersuchung wurden 20 g der Oberfläche und 20 g aus dem Innern des Käses getrennt in je 40 ml einer 0,01 n NaOH-Lösung, die 60 g Natriumcitrat und 10 g Natriumbikarbonat pro 1000 ml enthielt, suspendiert.



   Aus dieser Suspension wurde eine Reihe von Dezimallösungen in einem   0,85 /o    NaCl und   O,10/o    Pepton enthaltenden wässrigen Medium bereitet.



   Von den verschiedenen Lösungen wurden 0,1 ml entnommen und auf Agar-Agar gebracht. Das Agar Agar enthielt 5 g Bactopepton, 3 g Liebig-Fleischextrakt, 12,5g Na2HPO4. 12H2O,   55 g    NaC1 und 15g Agar-Agar pro 1000 ml. Das Medium wurde bei   115C    C 20 Minuten lang sterilisiert und bei   25C    C 5 Tage lang inkubiert. Nur farbloses Brevibacterium linens liess sich demonstrieren.



   Die Keimkonzentrationen betrugen   2,1 x 108    pro Gramm Käse von der Oberfläche und   8,4 X 10S    pro Gramm Käse vom Innern.



   Beispiel 2
Die in Beispiel 1 beschriebenen Operationen wurden wiederholt, aber die Bestrahlung erfolgte 6 Minuten lang statt 2 Minuten lang, um eine Bestrahlungsdosis von 6000 Erg pro mm2 zu erhalten. Auswahl der weissen Zellen aus den überlebenden Zellen wurde durch die Tatsache erleichtert, dass die meisten der überlebenden Zellen farblos waren.



     Käse    wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. In diesem Käse wurden keine gefärbten Organismen gefunden, wie sich bei der in Bespiel 1 beschriebenen mikrobiologischen Untersuchung ergab.



   Beispiel 3
Wie in Beispiel 1 wurde eine Suspension gebildet.



     Von    der Suspension gewaschener stäbchenförmiger Zellen mit einer Konzentration von 108 Zellen pro ml wurde 1 ml in einen Erlenmeyerkolben von 1,5 ml Fassungsvermögen gebracht und bei einer Entfernung von 2 cm mit einer spektrographischen Wolfram-Röhre (Type Philips pw 2164/00,) deren Spannung 100kW und Stromstärke 4 mA betrug, bestrahlt.



   Die Intensität der Bestrahlung in einer Entfernung von 2 cm betrug 0,4 Mrad/Stunde. Bestrahlung dauerte 2 Minuten und führte zu einem Absterben von etwa   990/o    der Zellen. Die erhaltenen Zellen wurden gesät,   inl;nbiert    und bezüglich Farbe und Salzresistenz in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise- ausgewählt.



   Der mit den erhaltenen Organismen hergestellte Käse enthielt keine gefärbten Organismen, wie sich bei der in Beispiel 1 beschriebenen mikrobiologischen Untersuchung zeigte.



   Die derart erhaltenen Käse besassen ein Gesamtgewicht von 10 kg, ein ausgezeichnetes   Äusseres,    frei von Stellen und Flecken mit einer Farbe, die sich von der der restlichen Käseoberfläche merkbar unterschied, und sehr gefälligen Geruch und Geschmack.



   Die Mutanten des Brevibacterium linens, die   erhalt    ten wurden und in den vorgenannten Beispielen zur Herstellung von Käse verwendet wurden, wurden im  Laboratorium voor   Microbiologie    van de Technische Hogeschool  in Delft (Niederlande) unter den folgenden Nummern hinterlegt: Beispiel 1: Kultur No. m 2, Beispiel 2: Kultur No. m 14, Beispiel 3: Kultur No. m 49.



   PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur   Gewinnung    von farblosen zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturen von gefärbten zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen derart behandelt, dass farblose Mutanten der Mikroorganismen erhalten werden.



   UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturen der Mikroorganismen Arthrobacter oder Brevibacterium linens behandelt.



   2. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen einer physikalischen Mutation-Behandlung unterworfen werden.



   3. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen einer chemischen Mutations-Behandlung unterworfen werden.



   4. Verfahren gemäss Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen elektromagnetischer Bestrahlung mit Strahlen einer Wellenlänge kleiner als 320   ma    ausgesetzt werden.

 

   5. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Kulturen im Stadium logarithmischen Wachstums der elektromagnetischen Bestrahlung ausgesetzt werden.



   6. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen in einem albuminfreien Medium elektromagnetischer Bestrahlung ausgesetzt werden.



   7. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Bestrahlung   Ultrvioletilichthestralung    ist.



   8. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultraviolettlicht künstlich erzeugt ist.



   9. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Ultraviolettlicht einer Wellenlänge 

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.



   

Claims (1)

1. **WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. wurden sie in perforierte Aluminiumfolie verpackt.

   Das Brevibacterium linens konnte sich in dieser Pakkung weiter entwickeln. Mehrere Tage bis mehrere Wochen nach Beginn der Reifung der Käse waren sie reif genug für Verzehr. Die Reifung der Käse durch Schimmel begann an der Oberfläche und schritt zur Mitte zu weiter. Während des Reifungsprozesses stieg der pH-Wert fortschreitend von 4,4 (Beginn des Reifungsprozesses) auf 6,0 (2 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses) und schliesslich auf etwa 7,5 (6 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses). Diese Werte gelten für die Aussenfläche. Im Innern des Käse stieg das pH von 4,3 (Beginn des Reifungsprozesses) auf 6,3 (6 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses).

   Aus mikrobiologischer Untersuchung des Käses 4 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses ergab sich, dass keine gefärbten Organismen Brevibacterium linens anwesend waren. Bei dieser Untersuchung wurden 20 g der Oberfläche und 20 g aus dem Innern des Käses getrennt in je 40 ml einer 0,01 n NaOH-Lösung, die 60 g Natriumcitrat und 10 g Natriumbikarbonat pro 1000 ml enthielt, suspendiert.

   Aus dieser Suspension wurde eine Reihe von Dezimallösungen in einem 0,85 /o NaCl und O,10/o Pepton enthaltenden wässrigen Medium bereitet.

   Von den verschiedenen Lösungen wurden 0,1 ml entnommen und auf Agar-Agar gebracht. Das Agar Agar enthielt 5 g Bactopepton, 3 g Liebig-Fleischextrakt, 12,5g Na2HPO4. 12H2O, 55 g NaC1 und 15g Agar-Agar pro 1000 ml. Das Medium wurde bei 115C C 20 Minuten lang sterilisiert und bei 25C C 5 Tage lang inkubiert. Nur farbloses Brevibacterium linens liess sich demonstrieren.

   Die Keimkonzentrationen betrugen 2,1 x 108 pro Gramm Käse von der Oberfläche und 8,4 X 10S pro Gramm Käse vom Innern.

   Beispiel 2 Die in Beispiel 1 beschriebenen Operationen wurden wiederholt, aber die Bestrahlung erfolgte 6 Minuten lang statt 2 Minuten lang, um eine Bestrahlungsdosis von 6000 Erg pro mm2 zu erhalten. Auswahl der weissen Zellen aus den überlebenden Zellen wurde durch die Tatsache erleichtert, dass die meisten der überlebenden Zellen farblos waren.

   Käse wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. In diesem Käse wurden keine gefärbten Organismen gefunden, wie sich bei der in Bespiel 1 beschriebenen mikrobiologischen Untersuchung ergab.

   Beispiel 3 Wie in Beispiel 1 wurde eine Suspension gebildet.

   Von der Suspension gewaschener stäbchenförmiger Zellen mit einer Konzentration von 108 Zellen pro ml wurde 1 ml in einen Erlenmeyerkolben von 1,5 ml Fassungsvermögen gebracht und bei einer Entfernung von 2 cm mit einer spektrographischen Wolfram-Röhre (Type Philips pw 2164/00,) deren Spannung 100kW und Stromstärke 4 mA betrug, bestrahlt.

   Die Intensität der Bestrahlung in einer Entfernung von 2 cm betrug 0,4 Mrad/Stunde. Bestrahlung dauerte 2 Minuten und führte zu einem Absterben von etwa 990/o der Zellen. Die erhaltenen Zellen wurden gesät, inl;nbiert und bezüglich Farbe und Salzresistenz in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise- ausgewählt.

   Der mit den erhaltenen Organismen hergestellte Käse enthielt keine gefärbten Organismen, wie sich bei der in Beispiel 1 beschriebenen mikrobiologischen Untersuchung zeigte.

   Die derart erhaltenen Käse besassen ein Gesamtgewicht von 10 kg, ein ausgezeichnetes Äusseres, frei von Stellen und Flecken mit einer Farbe, die sich von der der restlichen Käseoberfläche merkbar unterschied, und sehr gefälligen Geruch und Geschmack.

   Die Mutanten des Brevibacterium linens, die erhalt ten wurden und in den vorgenannten Beispielen zur Herstellung von Käse verwendet wurden, wurden im Laboratorium voor Microbiologie van de Technische Hogeschool in Delft (Niederlande) unter den folgenden Nummern hinterlegt: Beispiel 1: Kultur No. m 2, Beispiel 2: Kultur No. m 14, Beispiel 3: Kultur No. m 49.

   PATENTANSPRUCH I Verfahren zur Gewinnung von farblosen zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturen von gefärbten zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen derart behandelt, dass farblose Mutanten der Mikroorganismen erhalten werden.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturen der Mikroorganismen Arthrobacter oder Brevibacterium linens behandelt.

   2. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen einer physikalischen Mutation-Behandlung unterworfen werden.

   3. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen einer chemischen Mutations-Behandlung unterworfen werden.

   4. Verfahren gemäss Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen elektromagnetischer Bestrahlung mit Strahlen einer Wellenlänge kleiner als 320 ma ausgesetzt werden.

   5. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Kulturen im Stadium logarithmischen Wachstums der elektromagnetischen Bestrahlung ausgesetzt werden.

   6. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen in einem albuminfreien Medium elektromagnetischer Bestrahlung ausgesetzt werden.

   7. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Bestrahlung Ultrvioletilichthestralung ist.

   8. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultraviolettlicht künstlich erzeugt ist.

   9. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Ultraviolettlicht einer Wellenlänge

   von 210-310 m,u, vorzugsweise 230-280 my und im besonderen 260 m, verwendet wird.

   10. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass gefärbte Kulturen 2-6 Minuten lang Ultraviolettlicht einer Intensität von etwa 1000 Erg pro mm2 pro Minute ausgesetzt werden.

   11. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Bestrahlung Röntgenbestrahlung ist.

   12. Verfahren gemäss Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Röntgenstrahlen einer Wellenlänge von 10-4-10 A, vorzugsweise 10-3-5.10-t A, im besonderen 0,182 A oder 0,210 Ä verwendet werden.

   13. Verfahren gemäss Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die gefärbten Kulturen t/2-8 Minuten lang Röntgenbestrahlung mit einer Intensität von etwa 1,42 Mrad/Stunde ausgesetzt werden.

   14. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen nach der Mutationsbehandlung eine Zeit lang im Dunkeln gehalten werden, bevor die farblosen Mutanten aus ihnen ausgewählt werden.

   PATENTANSPRUCH II Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I gewonnenen farblosen Mikroorganismen bei der Erzeugung von Weichkäse.

   UNTERANSPRÜCHE 15. Verwendung nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man fablose Mutanten der Mikroorganismen Arthrobacter oder Brevibacterium diens verwendet.

   16. Verwendung nach Patentanspruch II oder Unteranspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man Camembert oder Brie herstellt.