CH423095A - Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung eines   Tollwutimpfstoffes   
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines verbesserten Tollwutimpfstoffes, der geschwächte, lebende oder tote Tollwutviren enthält.



   Seit der ersten Herstellung von Tollwutimpfstoff durch Pasteur im Jahre 1885 gewann dieses dadurch mögliche Behandlungsverfahren eine grosse Bedeutung zum Schutz von Mensch und Tier. Die bisher reproduzierten Impfstoffe oder Vaccine waren mit verschiedenen Fremdproteinen verunreinigt bzw. wurden nur zusammen mit diesen erhalten. Diese Fremdproteine stammen aus dem Nährmedium, in welchem der Impfstoff erzeugt wird. Man hat dies bisher als ein notwendiges   Übel    angesehen und die häufig ungünstigen Nebenwirkungen als Preis des Schutzes gegen Tollwut akzeptiert.



   Seit Pasteurs ursprünglicher Arbeit unter Verwendung von Kaninchen, auf welche der Tollwutvirus adaptiert worden war, sind eine Reihe von Verbesserungen bei der Herstellung des Impfstoffes versucht und erzielt worden. So sind beispielsweise unter Verwendung chemischer Zusätze, von Bestrahlung oder anderen Verfahren verschiedene Impfstoffe mit toten Viren hergestellt worden. Diese Totviren-Vaccine besitzen den Nachteil, dass die mit ihnen erzeugte Immunität nicht dauerhaft ist und eine jährliche Nachimpfung erfordert, ohne dass dabei eine Verminderung der Verunreinigung durch fremde tierische Gewebe und der dadurch bedingten unerwünschten Nebenwirkungen zu erreichen ist. Man hat schon vorgeschlagen, virulenten Tollwutvirus vor dem Abtöten in Entenembrios zu züchten.

   Der entstehende Impfstoff enthält jedoch immer noch Fremdstoffe aus den Geweben des Entenembrios und bietet das gleiche Bild der unerwünschten Nebenwirkungen. Schliesslich ist im amerikanischen Patent Nr.   2 768 114    ein Verfahren zur Herstellung von Tollwut-Lebendvaccin durch serienweise Hindurchführung des Virus durch Hühnerembrios beschrieben.



  Es hat sich gezeigt, dass dieser Impfstoff eine ausgezeichnete dauerhafte Immunität verleiht, jedoch ebenfalls nicht frei von fremdem, tierischem Gewebe ist und immer noch unerwünschte Nebenwirkungen auslöst.



   Es sind schon manche Virus arten in Gewebekulturen gezüchtet worden und dieses Verfahren bietet zahlreiche Vorteile. Es war jedoch bisher nicht für den Tollwutvirus geeignet, weil der Virus, obwohl er einige Zeit in einem solchen Medium wächst, bald den Gleichgewichtszustand erreicht und sogar degeneriert. Die Gründe für das Versagen, den Virus in Gewebskulturen zu züchten, und das Versagen dieser Methode selbst unter Verwendung von Hühnerembrios ist nicht bekannt, wobei zu bemerken ist, dass der Virus sich in den Hühnerembrios selbst vervielfacht. Die Anwendung von Gewebskulturverfahren für die Herstellung von Tollwutvaccin ist daher wirtschaftlich unbrauchbar.



   Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass Tollwutvaccin in wirkungsvoller Weise in Gewebskulturen gezüchtet werden kann, wenn diese Kulturen Collagenderivate enthalten, welche offensichtlich den biochemischen Vorgang bei der Vaccinherstellung entscheidend beeinflussen. Die Gewebskulturen können dabei insbesondere aus Hühnerembrios erhalten werden. Das Collagenderivat muss so weit hydrolysiert sein, dass es in kaltem Wasser dispergierbar ist, darf aber noch nicht bis zum Peptonzustand hydrolysiert sein. Vorzugsweise wird hydrolysierte Gelatine verwendet, doch können auch andere Collagenderivate mit ähnlichen Eigenschaften verwendet werden. Hydrolysierte Gelatine ist ein Handels artikel und alle erhältlichen Produkte dieser Art sind verwendbar. Die Menge des  zugesetzten Collagenderivates ist nicht besonders kritisch.

   Bei einer Menge von weniger als   1%    beginnt die Wirksamkeit abzusinken und im allgemeinen sind Konzentrationen von unter 0,5 % nicht zweckmässig.



  Ein ausgezeichneter Bereich liegt zwischen 1 und 5 %, mit einem Optimalwert von ungefähr   2%.    Höhere
Prozentanteile geben schlechtere Ergebnisse.



   Ein Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass es mit allen üblichen Gewebskulturmethoden durchführbar ist, beispielsweise mit der in Suspension arbeitenden Methode, der Einschichtmethode ( Monolayer ) und dergleichen. Es ist zu bemerken, dass der Ausdruck  Einschicht  in seiner üblichen Bedeutung verwendet wird und eine einzige Gewebsschicht auf einem Substrat bedeutet.



  Der Ausdruck bedeutet nicht notwendigerweise, dass die Schicht nur eine Zelle dick ist. In den Beispielen ist eine typische Kulturmethode durch Herstellung einer Einschicht in sogenannten     Povitsky   -Flaschen    beschrieben. Diese Verfahrensweise dient jedoch lediglich als ein typisches Beispiel der Gewebskultur und das erfindungsgemässe Verfahren kann auch mit anderen Methoden angewendet werden.



   Zusätzlich zu den grossen Verfahrensvorteilen, die durch die Gewebskulturmethode zugänglich werden, besitzt das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung einen wahrscheinlich noch wesentlicheren Vorteil. Es ermöglicht nämlich die Herstellung eines klaren Impfstoffes, der in solchem Masse frei von Verunreinigungen ist, dass Nebenwirkungen stark vermindert und in manchen Fällen vollständig ausgeschaltet werden. Dies stellt einen erheblichen Vorteil des mit dem Verfahren erhältlichen Produktes dar, weil der Impfstoff alle wesentlichen Eigenschaften von Impfstoff mit Lebendvirus beibehält, nämlich eine langdauernde Immunität, und weil gleichzeitig die unerwünschten Nebenwirkungen, die bisher als ernsthafter, aber unvermeidlicher Nachteil von Tollwutimpfungen empfunden wurden, beseitigt werden.



  Das klare Vaccin kann durch Gefriertrocknung aufgearbeitet werden und ist in trockenem Zustand lange haltbar. Mit destilliertem Wasser kann es leicht wieder regeneriert werden und der regenerierte oder wieder hergestellte Impfstoff behält die hohe Wirksamkeit des ursprünglichen Produktes.



   Ein Lebendvirusvaccin kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren durch Impfen der Gewebskultur, entweder mit geschwächtem lebendem Virus, dem sogenannten  fixierten Virus , wie er zuerst von Pasteur hergestellt wurde und auf Kaninchen adaptiert ist, oder mit irgend einem anderen lebenden Tollwutvirus hergestellt werden. Alle diese Virusformen vermehren sich in der Gewebskultur in Gegenwart des hydrolysierten Collagenderivates rasch.



  Für veterinärmedizinische Zwecke, bei denen Lebendvirus-Impfstoff verwendet werden kann, ist das Vaccin direkt als Impfstoff brauchbar. Für die Humanmedizin kann das Vaccin in üblicher Weise getötet werden, wobei immer noch die Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens bezüglich verringerter Verunreinigung des erhaltenen Vaccins zur Geltung kommen.



   Das Gewebskulturverfahren ist sehr anpassungsfähig und erfordert ausser der Zugabe von hydrolysierter Gelatine oder einem anderen Collagenderivat keine besonderen Massnahmen. Selbstverständlich muss die für die Gewebskultur übliche Sorgfalt aufgewendet werden. Vorzugsweise werden mit Enzym behandelte Zellen von Hühnerembrios verwendet, z. B. mit Trypsin behandelte Zellen von Hühnerembrios. Diese Enzymbehandlung der Zellen ist bei der Gewebskultur üblich und kann bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens in gleicher Weise durchgeführt werden wie bei anderen Ge  webskulturverfahren.   



   Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass es bezüglich des genauen Zeitpunktes, bei welchem die Impfung des Kulturmediums mit Virus erfolgt, nicht kritisch ist. Sie kann z. B. beim Schichtverfahren zu Beginn erfolgen, d. h. ehe die Zellen in Schichtform vorliegen, doch kann das Medium auch nach Schichtbildung angeimpft werden. Der Zeitpunkt der Impfung der Kulturzellen ist offensichtlich ohne Bedeutung. Die Inkubation oder das Brüten der Gewebskultur kann in wirksamer Weise bei den üblichen Temperaturen durchgeführt werden. Da der Tollwutvirus in animalischen Zellen wächst, ist die Körpertemperatur von ungefähr 370 C optimal. Die Temperatur ist jedoch nicht besonders von Bedeutung; die Kultivierung kann in einem Temperaturbereich von   30400    C durchgeführt werden.



   In den folgenden Beispielen sind Teile, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht bezogen.



   Beispiel 1
Es wird eine Kultur von mit Trypsin behandelten Hühnerembriozellen in einem Medium verwendet, das 0,5 % Lactalbumin-Hydrolysat in der ausgeglichenen oder physiologischen Salzlösung nach Earle enthält. Ein Medium enthält auch   2 %    hydrolysierte Gelatine und   1-5 %    steriles Pferdeserum. Das Medium wurde mit Keimen aus einem lebenden Tollwutvirus angeimpft, der in Hühnerembrios gezüchtet worden war. Der Virus wurde so lange durch Hühnerembrios geführt, dass er für Säugetiere avirulent war. Das angeimpfte Medium, welches die Zellen und die Gelatine enthielt, wurde in Povitsky-Flaschen abgefüllt und die Ausbildung der Einschicht wurde abgewartet.



  Es wurde während etwa 20 Stunden bei 370 C inkubiert. Dann wurde das Medium abgegossen, die Zellen mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann mit folgendem Medium versetzt:
Tryptose-Phosphatbrühe   10 %   
Lösliche hydrolysierte Gelatine   2 %   
0,5 Lactalbumin-Hydrolysat in der Salzlösung nach Earle 88 %.



   Die Zellen wurden in einer Dicke von 6,3 bis 12,7 mm mit dem Medium bedeckt und bei 370 C  bis zum Spitzentiter bebrütet, was je nach dem Virusstamm ungefähr 3-5 Tage erfordert. Das den Virus enthaltende überstehende Medium wurde dann abgegossen und der Gefriertrocknung unterworfen.



  Das trockene Produkt ist gut haltbar und kann mit Wasser unter Bildung des Vaccins regeneriert werden.



  Es ist praktisch frei von animalischem Fremdstoff.



   Die Viruskonzentration wurde in verschiedenen Flaschen zu Beginn und zum Schluss gemessen, wobei ein mittlerer Virustiter von   1040    und ein auswertbarer Titer von   107'3    pro ml festgestellt wurde.



  Dies entspricht einer Zunahme um den Faktor 2000.



  Bei anderen Beispielen betrug die Zunahme   1O,a    bis   10593,    was einen Zuwachsfaktor von 1000 bis   101,5    bis   106,1    entsprechend einem Zuwachs von 63 000 bedeutet.



   Beispiel 2
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, die Impfung jedoch durchgeführt, nachdem sich die Hühnerembriozellen zur Einschicht ausgebildet hatten. Ein beispielhafter Titerzuwachs betrug   103'5    bis   107,0.   



   Beispiel 3
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, die Hühnerembriozellen jedoch nicht mit Trypsin, sondern mit   Pancreatin    behandelt. Das verwendete Kulturmedium war das Medium nach Eagle. Es wurden im wesentlichen gleiche Ergebnisse erhalten. Man erhält klare überstehende Flüssigkeiten und die Zunahme des Virustiters liegt in den Tausenderwerten. a) Es wurde die Stabilität des erfindungsgemäss hergestellten Vaccins in flüssiger Form mit der Stabilität von handelsüblichem Tollwutvaccin verglichen, das einen Titer von   1055    besitzt. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Vac   cin besass einen Titer von 105, 3. In verschlossenen Kol-    ben wurden Proben abgefüllt, die bei Raumtemperatur und bei etwas erhöhten Temperaturen geprüft wurden.

   Das handelsübliche Produkt, das eine schwere Suspension und keine klare Flüssigkeit war, verlor seine ganze Lebensfähigkeit nach 24 Stunden.



  Das erfindungsgemäss hergestellte Vaccin zeigte eine erheblich höhere Stabilität, wie in der folgenden Tabelle wiedergegeben ist:    Raumtemperatur (22,80 C) 370 C   
Zeit (Tage) Titerlml Zeit (Stunden) Titer/ml
0 5,9 12 5,7
1 4,9 24 3,9
2 5,4 36 4,6
3 4,6 48 4,1
4 4,1 60 2,7
5   4,4    72 3,4
6 4,2 84 2,2
7 4,2 96 2,2
Obwohl der obige Test zeigt, dass das flüssige Vaccin nicht unbegrenzt lagerfähig ist, sollte dies nicht mit der Haltbarkeit des durch Gefriertrocknung erhaltenen lange Zeit haltbaren Produktes verwechselt werden. Wenn jedoch der Impfstoff mit Wasser wiederhergestellt ist, soll es zweckmässigerweise eine vernünftige Lebensdauer besitzen.

   Das erfindungsgemäss hergestellte Produkt kann in wirksamer Weise während mehreren Tagen verwendet werden, was einen praktischen Vorteil von erheblicher Bedeutung darstellt. b) Mit einem klaren Impfstoff, der durch Wiederherstellung des gefriergetrockneten Produktes von Beispiel 1 mit Wasser erhalten worden war, wurde die Standardzahl Meerschweinchen behandelt, die für diesen Virus gemäss den Angaben des Standard AIQD-Stärketestes die üblichen Versuchstiere sind.



  Die Hälfte der Meerschweinchen erhielt eine Dosis von 0,25 ml eines zehn ach verdünnten Virus, der einen Mäusetiter von   10430    aufwies. Die Meerschweinchen wurden intramuskulär geimpft und keines der geimpften Tiere zeigte irgendwelche Krankheitszeichen. Die geimpften Meerschweinchen und die üblichen fünf ungeimpften Vergleichstierchen wurden dann mit einem Standardstamm von virulentem Tollwutvirus infiziert. Die Infektion geschah durch intramuskuläre Injektion.



   Alle zu Vergleichszwecken verwendeten, nicht geimpften Meerschweinchen entwickelten Tollwut und starben. Keines der geimpften Meerschweinchen erkrankte. c) Die Stärke des nach Beispiel 1 hergestellten Vaccins wurde nach dem bekannten Habel-Test geprüft. Wie üblich wurden Mäuse zu diesem Test verwendet. Die Versuchstiere wurden mit verschiedenen Mengen des Vaccins von Beispiel 1 und mit einem handelsüblichen Totvaccin, sowie einem über Hühnerembrios geführten Vaccin geimpft. Die Impfung wurde jeweils am Tag Null und am Tag 7 durchgeführt. Alle Mäuse wurden am Tag 14 intracerebral mit gleichen Dosen eines virulenten Tollwutvirus infiziert. Die Infektionsdosis betrug 12,7 Mäuse-LD50.



  Die zum Schutz von 50 % der Mäuse erforderliche Vaccinmenge ist wie folgt: Totvaccin 0,55 mgm Abgeschwächtes Hühnerembrio- 6900   Mäuse-LD50    vaccin (6,9 X 103) Vaccin nach Beispiel 1, wieder- 3800   Mäuse-LD50    hergestellt aus dem trockenen (3,8 X 103).   

Claims (1)

1. Produkt PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Tollwutvaccin, dadurch gekennzeichnet, dass als Kulturmedium ein Gewebemedium verwendet wird, das ein Collagenderivat enthält, welches bis zur Kaltwasserlöslichkeit, aber nicht bis zum Peptonzustand hydrolysiert ist.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass für das Kulturmedium Hühner embriogewebszellen sowie mindestens 0,5X und höchstens 5 % des hydrolysierten Collagenderivates verwendet werden.

   2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen lebenden Tollwutvirus in dem Kulturmedium züchtet, und dass dieses mindestens 0,5 % hydrolysierte lösliche Gelatine enthält.

   3. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus bei 370 C gezüchtet wird.

   4. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hühnerembriozellen vorgängig mit Enzym behandelt werden.

   5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung des Virus während höchstens eines Tages erfolgt, dass das verbrauchte Medium entfernt wird, dass die Gewebszellen der Kultur mit frischem Kulturmedium versetzt werden, welches mit hydrolysierter löslicher Gelatine versetzt ist, und dass die Züchtung fortgesetzt wird, bis ein ausbeutefähiger Virustiter erzielt ist.

   6. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung in Hühnerembriozellen erfolgt, welche in Form einer Einschicht angeordnet sind.

   7. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hühnerzellen vorgängig mit Trypsin behandelt werden.