Verfahren zur Gewinnung von farblosen Mikroorganismen und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von farblosen, zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, wie z. B. Arthrobacter oder Brevibacterium linens (Weigmann, 1910, 1953 Kul tur). Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der nach diesem Verfahren gewonnenen Mikroorganismen, zur Herstellung von Käsen insbesondere von Weichkäsen, wie z. B. Camembert und Brie.
Brevibacterium linens, das zu der Brevibacterium Gattung (Familie von Brevibacteriaceae der Ordnung Eubacteriales) gehört, wird von Mulder und seinen Mitarbeitern ( Journal of Applied Bacteriology , 29, 1966, Seiten 44-71) als ein Corynoid-Organismus angesehen, verwandt der Arthrobacter-Gattung (Familie von Corynebacteriaceae der Ordnung Eubacteriales) (siehe Berbey Manual of Determinative Bacteriology, Breed et al., 7. Auflage, verlegt von Baillere Ltd., London 1957). Die Kolonien der meisten Organismen dieser Gattungen zeigen variierende Farbintensitäten. KulF turen von Brevibacterium linens bewegen sich hinsichtlich Farbe von Orange bis Rotbraun, Kulturen von Arthrobacter von Rotbraun bis Farblos.
Das Auftreten dunkel gefärbter Zellen in einer Kultur von Brevibacterium linens und von verschiedenen Arthrobacter im Entwickungsprozess scheint durch Licht und gewöhnliche Salzlösungen (z. B. 4oloige Lösungen) beeinflusst zu sein.
Die in Rede stehenden Mikroorganismen können zahlreiche Anwendungen finden, z. B. beim Abbau von Peptiden und im besonderen demjenigen bitterer Geschmackstoffe, wie sie z. B. während der Reifung bestimmter Käsesorten auftreten.
Diese proteolytischen Organismen werden für die Herstellung von Camembert und Brie verwendet.
Camembert und Brie werden auf weitgehend gleiche Weise hergestellt. Camembert ist im allgemeinen in Gestalt glatter Zylinder vom Durchmesser 8-11 cm und mit einer Dicke von 34 cm; er wurde ursprünglich in der Normandie erzeugt. Brie besitzt die gleiche Gestalt, aber einen Durchmesser von 30 cm und eine Dicke von 34 cm; er wurde ursprünglich in der Nähe von Paris hergestellt.
Die Reifung von Camembert und Brie wurde durch die Aktivität von Milchsäure-Bazillen, Penicillium caseicolum (Bainier), Penicillium camemberti (Thom) und anderen Mikroorganismen wie z. B. Brevibacte riurn linens und Arthrobacter stark beeinflusst. Frische Milch enthält stets Milchsäurebazillen. Die beschriebe nen Räserarten können daher durch Zusatz einer Kultur von Penicillium caseicolum und/oder Penicillium camemberti zur Milch vor ihrer Gerinnung oder durch Aufsprühen einer Suspension der Sporen dieser Kryptogamen auf den frisch bereiteten Käse erhalten werden. Wenn pasteurisierte Milch verwendet wird, wie es heutzutage üblich ist, müssen Milchsäurebazillen zwecks Säuerung der Milch angewendet werden.
Brevibacterium Iinens, das ein stark proteolytischer Mikroorganismus ist, welcher orangefarbige bis rotbraune Kolonien bildet, können den Käse in den frühen Stadien des Reifungsprozesses infizieren, aufgrund der tatsache, dass er in der natürlichen Flora von Käsereien vorkommt. Das gleiche gilt für Arthrobacter und andere Organismen. Verbesserung der hygiensichen Verhältnisse in Käsereien und die Reinigung aller Gefässe und Ergänzungseinrichtungen haben das Verschwinden von Brevibacterium linens wie auch von Arthrobacter und anderen Organismen der natürlichen Flora verursacht.
Jedoch wiesen Camembert und Brie, die in Abwesenheit dieser Organismen gereift waren, einen ungefälligen, bitteren Geschmack auf. Daher wurde es notwendig, eine Kultur eines oder mehrerer dieser proteolytischen Organismen zuzusetzen, z.B. der Milch vor ihrer Gerinnung, der zum Salzen des Käses verwendeten Sole, oder die Kultur auf den bereiteten Käse zu sprühen.
Diese Organismen und im besonderen Brevibacte riurn linens sind stark aerobe Organismen, die sich auf der Oberfläche von Käsen entwickeln. Kleine Kolonien dieser Qrganismen, besonders von Brevibactenum linens, können in Form rotbrauner bis orangener Verfärbungen auf dem weissen Myzel von Penicillium caseicolum auf Käse gefunden werden.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung war es zur Käseherstellung geeignete Mikroorganismen wie z. B.
Arthrobacter und speziell Brevibacterium linens zu gewinnen, von deren angestammten Eigenschaften einige verändert sind, vornehmlich durch künstliche Massnahme.
Ein weiteres Ziel der Erfindung war es Mikroorganismen herzustellen mit denen es gelingt, Käse wie Camembert oder Brie mit vorzüglichem Aussehen und gutem Aroma, frei von Bitterkeit, herzustellen. Diese und weitere Ziele der Erfindung werden aus ihrer anschliessenden Beschreibung deutlich hervorgehen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von farblosen, zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Kulturen von gefärbten zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen derart behandelt, dass farblose Mutanten der Mikroorganismen erhalten werden.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Mikroorganismen bei der Erzeugung von Weichkäse. Käse wie Camembert und Brie reifen in Anwesenheit von Penicillium caseicolum. Dies verursacht das Auftreten bitterer Geschmacksstoffe. Die proteolytischen Organismen wie Arthrobacter und Brevibacterium linens zerstören diese Gescmacksstoffe, so dass der Käse mild wird und weiterreift.
Es ist nun gefunden worden, dass es möglich ist, durch Auswahl Organismen zu erhalten, die nicht gefärbt sind und die als Mutanten gefärbter Kulturen proteolytischer Organismen wie z. B. Arthrobacter und Brevibacterium linens angesehen werden können.
Jedoch sind diese farblosen Mutanten ohne eine vorangehende Massnahme sehr schwer zu identifizieren bzw.
isolieren. Daher wird es vorgezogen, die anfängliche gefärbte Kultur einer Vorbehandlung zu unterwerfen.
Es wurde gefunden, dass diese Vorbehandlung verhältnismässig einfach sein kann; z. B. kann die Kultur eine gewisse Zeit lang dem Sonnenlicht ausgesetzt werden.
Eine geeignete Vorbehandlung besteht in Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen einer Wellenlänge kleiner als 320 m,u, z. B. mit künstlichem Ultraviolettlicht, welchem die anfängliche gefärbte Kultur ausgesetzt wird. Es wurde ferner gefunden, dass es vorteilhaft ist, die anfängliche Kultur während des logarithmischen Wachstums der Mikroorganismen dem Ultraviolettlicht auszusetzen, weil auf diese Weise eine grössere Anzahl farbloser Mutanten erzeugt wird.
Gemäss einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wiId die Kultur von gefärbten Mikroorganismen, z. B. von orangefarbigem bis rotbraunem Brevibacterium linens, Ultraviolettlicht einer Wellenlänge von etwa 210-210 m, vorzugsweise 230-280 m,u, eine gewisse Zeit lang ausgesetzt.
Es wurde gefunden, dass Ultraviolettlicht einer Wellenlänge von 260 mu den günstigsten Mutationseffekt hervorbringt. Das grösste Verhältnis von farblosen Mutanten zu überlebenden Zellen wird nach Ultraviolettlichtbestrahlung der Dauer von 2,5-3 Minuten erzielt, was einer Dosis von 2500-3000 Erg pro mm2 entspricht.
Für einige gemäss der Erfindung ausgeführte Versuche wurde eine salzresistente Kultur von dunkelrotem Brevibacterium linens verwendet. Diese Kultur wurde etwa 40 Stunden lang auf einem geeigneten Nährmedium gehalten, um logarithmisches Wachstum hervorzurufen. Hernach wurde die Kultur etwa 40 Stunden lang einem Ultraviolettlicht von 210-300my ausgesetzt, vorzugsweise in einem Abstand von - 10 cm von der Bestrahlungsquelle. Es zeigte sich, dass nach etwa 5 Minuten Bestrahlung mit Ultraviolettlicht einer Intensität von etwa 1000 Erg pro mm2 pro Minute die Kultur, welche sich in einem albuminfreien Medium befindet, weitgehend stationär bleibt, d. h. die Anzahl überlebender Zellen bleibt verhältnismässig konstant.
Bestrahlung wird daher bei dieser Intensität 2-6 Minuten lang aufrecht erhalten und im besonderen ist eine Exponierung für etwa 5 Minuten zu bevorzugen. Eine längere Bestrahlungsdauer, z. B. 10 Minuten, ergibt keine merklich besseren Resultate. Ferner ermöglicht eine so kurze Bestrahlungsdauer wie z. B. 2 Minuten, farblose Mutanten zu isolieren, deren Zucht fortgesetzt werden kann. Sehr gute Ergebnisse kann man durch Bestrahlung der anfänglichen auf einem albuminfreien Substrat (z. B. mittels Waschens) abgesetzten Mikroorganismen erhalten. Am Ende des Bestrahlungsvorganges, während dessen, nach Meinung von Fachleuten, das Albumin und besonders die Desoxyribose-Nukleinsäuren Licht einer Wellenlänge von 260 m, absorbieren, werden die Mikroorganismen vorzugsweise eine Zeit lang im Dunklen gehalten.
Nach Meinung der Experten wird die Struktur der Desoxyribose-Nukleinsäuren der Mikroorganismen örtlich unter dem Einfluss der Ultraviolettbestrahlung verändert, und diese Veränderung mag nicht von Dauer sein, wenn die bestrahlten Mikroorganismen nicht im Dunklen gehalten werden. Durch diese Dunkel lagerung der Mikroorganismen scheint die erwähnte Strukturveränderung zu einer permanenten gemacht zu werden.
Farblose Mutanten können auch auf andere Weise als durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht erhalten werden. Beispielsweise kann die besagte Mutation durch Betrahlung mit Gammastrahlen, Röntgenstrahlen oder Neutronen zustande gebracht werden. Chemische Mutationsmitte.l wie z. B. Yperit, salpetrige Säure, Formamid und Iminoacetylen können auch zwecks Erzielung farbloser Mutanten verwendet werden.
Wenn man salzresistente Mutanten erhalten will und diese sind zur Erzeugung von Käsen wie z. B.
Camembert und Brie notwendig - kann eine Kultur saizresistentcr Organismen von Anfang an verwendet werden, aber es wird vorgezogen, eine normale Auswahl der erhaltenen Mutanten nach ihrer Salzresistenz zu treffen.
Das Gleiche gilt im allgemeinen für Arthrobacter.
Die erfindungsgemässen Organismen können mit bestem Erfolg bei der Herstellung von Brie und Camembert verwendet werden.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemässen Organismen bei diesen Herstellungen so verwendet, dass man den Käse mittels einer 200logen Kochsalzlösung salzt, welcher gerade vor der Käsesalzung eine Kultur des erfindungsgemässen Organismus zugesetzt worden ist. Der Mikroorganismus, welcher - gemeinsam mit anderen Mikroorganismen wie Milchsäurebazillen und Penicillium caseicolum - Brie und Camembert zu vollständiger Reifung bringt, vermehrt sich an der Oberfläche des Käses. Es bildet sich eine gut gekennzeichnete Reifungsfront', welche sich von aussen nach innen in den Käse ausbreitet.
Durch Verwendung der erfindungsgemässen Mutanten ist es möglich, Käse von bemerkenswert guter Farbe, d. h. ohne von Orange bis zu Rotbraun reichende Flecke oder Stellen zu erhalten.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiterhin veranschaulicht.
Beispiel 1
Die Basis-Kultur war eine Kultur von salzresistentem Brevibacterium linens Nur. 9174 der Amerikanischen Typensamrn lung von Mikroorganismen (American type Culture Collection of Rockville, Maryland, USA, 12301 Park Lawn Drive), empfangen im Mikrobiologie-Laboratorium der Landwirtschaftlichen Hochschule (Landbouwhogeschool) in Wageningen, Holland.
Diese Kultur liess man 40 Stunden lang in einem Medium wachsen, welches MgSO4.7H2O 0,1 g/l CaCl . 2H2O 0;02 g/l Fels . 6O 0,01 g/l
MnSO4. 4H2O 1,0 mg/l CuSO4 . 5H2O 0,1 mg/l ZnSO4. 7H2O 0,1 mg/l
CoCl2. 6H20 0,01 mg/l H3BO3 0,01 mg/l
Na2MoO4 0,01 mg/l enthielt und dem auch die folgenden Stoffe in den folgenden Mengen zugesetzt worden sind: 1,0ovo technischer Casaminosäuren (erhalten durch saure Hydrolyse von Kasein, siehe Difco Manual , 9.
Auflage, 1953), 0,50/0 Extrakt von Bacto-Yeast (gebildet von den wasserlöslichen Komponenten autolytischer Hefe, siehe Difco Manual , Seite 270), 0,50/o Glukose und Sörensen-Puffer. Das Ganze wird durch Zugabe von desil; liertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der Sörensen Puffer wird aus 40 ml einer 0,667 molaren Lösung von KH2PO4 und 60 ml einer 0,667 molaren Lösung von NaHPO. 2H2O bereitet. Der pH-Wert des Mediums beträgt 7,01. Das erhaltene Medium wird durch vorheriges 5 Minuten langes Erhitzen bei 1200 C sterilisiert.
Die Mikroorganismen werden in dieses Medium gesät.
Nachdem die Zellen der Mikroorganismen 40 Stunden lang in einem Fernbach-Kolben bei 200 C wachsen gelassen wurden, wobei mittels eines Magnetgieren bei einer Fliehkraft von 20 000 g für 5 Minuten rührers Belüftung erfolgte, wurden sie durch Zentrifuisoliert; hernach wurde das Substrat durch eine sterile physiologische Kochsalzlösung (0,850/oige NaCl-Lösung) ersetzt, in welcher die Zellen in Suspension gebracht wurden. Die Operation wurde wiederholt, um die Proteinverbindung durch Waschen zu entfernen.
Von der Suspension gewaschener stäbchenförmiger Zellen mit einer Konzentration von 106 Zellen pro ml wurden 30 ml entnommen und in eine Petri-Schale gegeben, welche offen gehalten wurde, um sie in einer Entfernung von 10 cm mittels einer 6 Watt-Niedrigdruck-Gasentladungslampe, die als Keimtötungsinstrument dient und ultraviolettes Licht einer Wellenlänge von 254 mg (85 , o der biologisch aktivsten Wellenlänge von 260 mic) aussendet, zu bestrahlen. Die In Intensität des ausgesendeten Lichtes betrug 0,85,xW pro cm2 bei einer Entfernung von 1 m. Im Laufe der Bestrahlung wurde die Suspension der Zellen magnetisch gerührt, um gleichmässige Bestrahlung aller Zellen sicherzustellen.
Die Intensität der Bestrahlung betrug etwa 1000Erg pro mm2 pro Minute. Die Bestrahlung dauerte 2 Minuten und führte zu einer Absterbung von etwa 990/0 der Zellen. Die Suspension wurde dann 3 Stunden lang bei 20 C im Dunklen gehalten, wonach eine Kultur aller überlebenden stäbchenförmigen Zellen in einem Medium der oben erwähnten Zusammensetzung in Ferubach-Kolben bei 200 C erzeugt wurde, unter Belüftung mittels eines Magnetrührers. Nach 24 Stunden wurden die Verdünnungen auf Feldehen aus Agar-Agar gesät, wodurch es ermöglicht wurde, 50-100 Kolonien je Feldchen zu erhalten. Die Kolonien farbloser Zellen wurden auf Oberflächen von Agar-Agar überführt, die schräg in Reagensgiäsern erstarrt waren.
Die auf diese Weise erhaltenen Organismen wurden auf verschiedene Medien mit einem Kochsalzgehalt von 5-70/0 gesät, im Tageslicht inkubiert und hernach hinsichtlich Salzresistenz ausgewählt.
Zur Herstellung von Camembert wurden 100 Liter Milch, deren Fettgehalt auf 3,50/o eingestellt worden war, durch Erhitzen für 40 Sekunden bei 720 C (Hoch temperatur-Kurzzei t-Prinzip) pasteurisiert. Der auf 32 C gekühlten pasteurisierten Milch wurden 3 /o einer Lactobazillen-Kultur, enthaltend 1010 bis 1011 Zellen pro ml, und hernach 10 ml einer Suspension von Penicillium-caseicolum-Sporen (20-30X106 Sporen pro ml) auf 100 Liter Milch zugesetzt. Nach Umrühren wurden 2 g Labpulver in Form einer 0,01 0/oigen Lösung in Wasser zugegeben. Die derart behandelte Milch wurde 2 Stunden lang bei 32 C gehalten.
Die durch Einwirkung des Labs geronnene Milch wurde grob aufgeteilt und in kleinen Fässchen eines Fassungsvermögens von etwa 1 Liter gesammelt.
Darin wurden die Quarkmassen 20 Stunden lang belassen und in dieser Zeit schied sich das Milchserum ab, so dass nach Ablauf dieser Zeit der Käse gebildet war. Die Temperatur der Quarkmassen fiel von 320 auf 230 C und das pH betrug dann 4,4. Das Redoxpotential ging um 100-12- Millivolt hinunter und war dann niedriger als -100 Millivolt. Die Temperatur wurde in diesem Fall bei 21-22 C gehalten, die relative Feuchtigkeit bei 950/o.
Sogleich nach Bildung der Käse wurden sie in ein 200/oiges Kochsalzbad getaucht, so dass sie etwa 2,50/o Salz aufnehmen konnten.
Gerade vor der Salzung des Käses wurden etwa 2,5 ml einer Kultur von mutiertem Brevibacterium linens, erhalten wie im Vorgehenden beschrieben, an 100 Liter Salzlösung zugefügt, so dass 10 000 Keime pro ml Sole da waren. Vorzugsweise verwendet man keine höheren Keimkonzentrationen. Die Mikroorganismen beginnen zu wachsen, sobald das pH des Käses mindestens etwa 6,0 beträgt.
Der Käse wurde in Kammern gereift, in denen eine Temperatur von 160 C und eine relative Feuchtigkeit von 900/0 gehalten wurden. Schimmel entwickelte sich auf dem Käse in Form einer weissen Schicht. Nachdem die Käse hier 10 Tage lang gehalten worden waren, wurden sie in perforierte Aluminiumfolie verpackt.
Das Brevibacterium linens konnte sich in dieser Pakkung weiter entwickeln. Mehrere Tage bis mehrere Wochen nach Beginn der Reifung der Käse waren sie reif genug für Verzehr. Die Reifung der Käse durch Schimmel begann an der Oberfläche und schritt zur Mitte zu weiter. Während des Reifungsprozesses stieg der pH-Wert fortschreitend von 4,4 (Beginn des Reifungsprozesses) auf 6,0 (2 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses) und schliesslich auf etwa 7,5 (6 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses). Diese Werte gelten für die Aussenfläche. Im Innern des Käse stieg das pH von 4,3 (Beginn des Reifungsprozesses) auf 6,3 (6 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses).
Aus mikrobiologischer Untersuchung des Käses 4 Wochen nach Beginn des Reifungsprozesses ergab sich, dass keine gefärbten Organismen Brevibacterium linens anwesend waren. Bei dieser Untersuchung wurden 20 g der Oberfläche und 20 g aus dem Innern des Käses getrennt in je 40 ml einer 0,01 n NaOH-Lösung, die 60 g Natriumcitrat und 10 g Natriumbikarbonat pro 1000 ml enthielt, suspendiert.
Aus dieser Suspension wurde eine Reihe von Dezimallösungen in einem 0,85 /o NaCl und O,10/o Pepton enthaltenden wässrigen Medium bereitet.
Von den verschiedenen Lösungen wurden 0,1 ml entnommen und auf Agar-Agar gebracht. Das Agar Agar enthielt 5 g Bactopepton, 3 g Liebig-Fleischextrakt, 12,5g Na2HPO4. 12H2O, 55 g NaC1 und 15g Agar-Agar pro 1000 ml. Das Medium wurde bei 115C C 20 Minuten lang sterilisiert und bei 25C C 5 Tage lang inkubiert. Nur farbloses Brevibacterium linens liess sich demonstrieren.
Die Keimkonzentrationen betrugen 2,1 x 108 pro Gramm Käse von der Oberfläche und 8,4 X 10S pro Gramm Käse vom Innern.
Beispiel 2
Die in Beispiel 1 beschriebenen Operationen wurden wiederholt, aber die Bestrahlung erfolgte 6 Minuten lang statt 2 Minuten lang, um eine Bestrahlungsdosis von 6000 Erg pro mm2 zu erhalten. Auswahl der weissen Zellen aus den überlebenden Zellen wurde durch die Tatsache erleichtert, dass die meisten der überlebenden Zellen farblos waren.
Käse wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. In diesem Käse wurden keine gefärbten Organismen gefunden, wie sich bei der in Bespiel 1 beschriebenen mikrobiologischen Untersuchung ergab.
Beispiel 3
Wie in Beispiel 1 wurde eine Suspension gebildet.
Von der Suspension gewaschener stäbchenförmiger Zellen mit einer Konzentration von 108 Zellen pro ml wurde 1 ml in einen Erlenmeyerkolben von 1,5 ml Fassungsvermögen gebracht und bei einer Entfernung von 2 cm mit einer spektrographischen Wolfram-Röhre (Type Philips pw 2164/00,) deren Spannung 100kW und Stromstärke 4 mA betrug, bestrahlt.
Die Intensität der Bestrahlung in einer Entfernung von 2 cm betrug 0,4 Mrad/Stunde. Bestrahlung dauerte 2 Minuten und führte zu einem Absterben von etwa 990/o der Zellen. Die erhaltenen Zellen wurden gesät, inl;nbiert und bezüglich Farbe und Salzresistenz in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise- ausgewählt.
Der mit den erhaltenen Organismen hergestellte Käse enthielt keine gefärbten Organismen, wie sich bei der in Beispiel 1 beschriebenen mikrobiologischen Untersuchung zeigte.
Die derart erhaltenen Käse besassen ein Gesamtgewicht von 10 kg, ein ausgezeichnetes Äusseres, frei von Stellen und Flecken mit einer Farbe, die sich von der der restlichen Käseoberfläche merkbar unterschied, und sehr gefälligen Geruch und Geschmack.
Die Mutanten des Brevibacterium linens, die erhalt ten wurden und in den vorgenannten Beispielen zur Herstellung von Käse verwendet wurden, wurden im Laboratorium voor Microbiologie van de Technische Hogeschool in Delft (Niederlande) unter den folgenden Nummern hinterlegt: Beispiel 1: Kultur No. m 2, Beispiel 2: Kultur No. m 14, Beispiel 3: Kultur No. m 49.
PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur Gewinnung von farblosen zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturen von gefärbten zur Käseherstellung geeigneten Mikroorganismen derart behandelt, dass farblose Mutanten der Mikroorganismen erhalten werden.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Kulturen der Mikroorganismen Arthrobacter oder Brevibacterium linens behandelt.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen einer physikalischen Mutation-Behandlung unterworfen werden.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen einer chemischen Mutations-Behandlung unterworfen werden.
4. Verfahren gemäss Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen elektromagnetischer Bestrahlung mit Strahlen einer Wellenlänge kleiner als 320 ma ausgesetzt werden.
5. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Kulturen im Stadium logarithmischen Wachstums der elektromagnetischen Bestrahlung ausgesetzt werden.
6. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturen in einem albuminfreien Medium elektromagnetischer Bestrahlung ausgesetzt werden.
7. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Bestrahlung Ultrvioletilichthestralung ist.
8. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Ultraviolettlicht künstlich erzeugt ist.
9. Verfahren gemäss Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Ultraviolettlicht einer Wellenlänge
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Process for the production of colorless microorganisms and their use
The present invention relates to a process for the production of colorless microorganisms suitable for cheese production, such as. B. Arthrobacter or Brevibacterium linens (Weigmann, 1910, 1953 culture). The invention also relates to the use of the microorganisms obtained by this process for the production of cheeses, in particular soft cheeses, such as. B. Camembert and Brie.
Brevibacterium linens, which belongs to the Brevibacterium genus (family of Brevibacteriaceae of the order Eubacteriales), is regarded by Mulder and his co-workers (Journal of Applied Bacteriology, 29, 1966, pages 44-71) as a corynoid organism related to the Arthrobacter Genus (family of Corynebacteriaceae of the order Eubacteriales) (see Berbey Manual of Determinative Bacteriology, Breed et al., 7th edition, published by Baillere Ltd., London 1957). The colonies of most organisms of these genera show varying intensities of color. Cultures of Brevibacterium linens vary in color from orange to red-brown, cultures of Arthrobacter from red-brown to colorless.
The appearance of dark colored cells in a culture of Brevibacterium linens and of various Arthrobacter in the development process seems to be influenced by light and common saline solutions (e.g. 4-ol solutions).
The microorganisms in question can find numerous applications, e.g. B. in the breakdown of peptides and in particular that of bitter flavors such. B. occur during the ripening of certain types of cheese.
These proteolytic organisms are used in the production of Camembert and Brie.
Camembert and brie are made in much the same way. Camembert is generally in the form of smooth cylinders, 8-11 cm in diameter and 34 cm thick; it was originally produced in Normandy. Brie has the same shape but a diameter of 30 cm and a thickness of 34 cm; it was originally made near Paris.
The ripening of Camembert and Brie was caused by the activity of lactic acid bacilli, Penicillium caseicolum (Bainier), Penicillium camemberti (Thom) and other microorganisms such as e.g. B. Brevibacte riurn linens and Arthrobacter strongly influenced. Fresh milk always contains lactic acid bacilli. The described grass species can therefore be obtained by adding a culture of Penicillium caseicolum and / or Penicillium camemberti to the milk before it coagulates or by spraying a suspension of the spores of these cryptogams onto the freshly prepared cheese. When pasteurized milk is used, as is common today, lactic acid bacilli must be used to acidify the milk.
Brevibacterium Iinens, which is a highly proteolytic microorganism that forms orange to reddish brown colonies, can infect the cheese in the early stages of the ripening process due to the fact that it is found in the natural flora of dairies. The same is true for Arthrobacter and other organisms. Improvement of the hygienic conditions in dairies and the cleaning of all vessels and supplementary facilities have caused the disappearance of Brevibacterium linens as well as Arthrobacter and other organisms of the natural flora.
However, Camembert and Brie, which had ripened in the absence of these organisms, had an unpleasant, bitter taste. It has therefore become necessary to add a culture of one or more of these proteolytic organisms, e.g. the milk before it coagulates, the brine used to salt the cheese, or spray the culture on the prepared cheese.
These organisms, and in particular Brevibacte riurn linens, are highly aerobic organisms that develop on the surface of cheeses. Small colonies of these organisms, especially Brevibactenum linens, can be found in the form of reddish-brown to orange discoloration on the white mycelium of Penicillium caseicolum on cheese.
The aim of the present invention was it for cheese production suitable microorganisms such. B.
To obtain Arthrobacter and especially Brevibacterium linens, some of whose ancestral properties have been changed, primarily by artificial means.
Another object of the invention was to produce microorganisms with which it is possible to produce cheese such as Camembert or Brie with an excellent appearance and good aroma, free of bitterness. These and other objects of the invention will become apparent from the description that follows.
The invention relates to a process for obtaining colorless microorganisms suitable for cheese production, which is characterized in that cultures of colored microorganisms suitable for cheese production are treated in such a way that colorless mutants of the microorganisms are obtained.
The invention also relates to the use of these microorganisms in the production of soft cheese. Cheeses such as camembert and brie ripen in the presence of Penicillium caseicolum. This causes the appearance of bitter flavors. The proteolytic organisms such as Arthrobacter and Brevibacterium linens destroy these flavorings, so that the cheese becomes mild and continues to ripen.
It has now been found that it is possible, by selection, to obtain organisms which are not stained and which are mutants of stained cultures of proteolytic organisms such as e.g. B. Arthrobacter and Brevibacterium linens can be viewed.
However, these colorless mutants are very difficult to identify or identify without a previous measure.
isolate. Therefore, it is preferred to pretreat the initial colored culture.
It has been found that this pretreatment can be relatively simple; z. B. the culture can be exposed to sunlight for a period of time.
A suitable pretreatment consists in irradiation with electromagnetic waves of a wavelength less than 320 m, u, z. With artificial ultraviolet light to which the initial colored culture is exposed. It has also been found that it is advantageous to expose the initial culture to ultraviolet light during the logarithmic growth of the microorganisms, because in this way a greater number of colorless mutants are produced.
According to a particular embodiment of the invention, the culture of colored microorganisms, e.g. B. of orange-colored to red-brown Brevibacterium linens, ultraviolet light having a wavelength of about 210-210 m, preferably 230-280 m, exposed for a certain time.
It has been found that ultraviolet light with a wavelength of 260 mu produces the most favorable mutation effect. The greatest ratio of colorless mutants to surviving cells is achieved after exposure to ultraviolet light for 2.5-3 minutes, which corresponds to a dose of 2500-3000 erg per mm 2.
For some experiments carried out according to the invention, a salt-resistant culture of dark red Brevibacterium linens was used. This culture was kept on a suitable nutrient medium for about 40 hours to produce logarithmic growth. The culture was then exposed to 210-300 my ultraviolet light for about 40 hours, preferably at a distance of -10 cm from the source of radiation. It was found that after about 5 minutes of irradiation with ultraviolet light with an intensity of about 1000 ergs per mm 2 per minute, the culture, which is located in an albumin-free medium, remains largely stationary, ie. H. the number of surviving cells remains relatively constant.
Irradiation is therefore maintained at this intensity for 2-6 minutes, and particularly exposure for about 5 minutes is preferred. A longer exposure time, e.g. B. 10 minutes does not give noticeably better results. Furthermore, such a short exposure time as, for. B. 2 minutes to isolate colorless mutants, the cultivation of which can be continued. Very good results can be obtained by irradiating the microorganisms initially deposited on an albumin-free substrate (e.g. by washing). At the end of the irradiation process, during which, in the opinion of those skilled in the art, the albumin and especially the deoxyribose nucleic acids absorb light with a wavelength of 260 m, the microorganisms are preferably kept in the dark for a while.
According to the experts, the structure of the deoxyribose nucleic acids of the microorganisms is locally changed under the influence of ultraviolet radiation, and this change may not be permanent if the irradiated microorganisms are not kept in the dark. Due to this dark storage of the microorganisms, the mentioned structural change seems to be made permanent.
Colorless mutants can also be obtained by means other than irradiation with ultraviolet light. For example, the said mutation can be brought about by exposure to gamma rays, x-rays or neutrons. Chemical mutation agents such as B. yperitol, nitrous acid, formamide and iminoacetylene can also be used to obtain colorless mutants.
If you want to obtain salt-resistant mutants and these are used to produce cheeses such as. B.
Camembert and Brie necessary - a culture of salt resistant organisms can be used from the start, but it is preferred to make a normal selection of the mutants obtained according to their salt resistance.
The same is generally true of Arthrobacter.
The organisms according to the invention can be used with the greatest success in the production of Brie and Camembert.
The organisms according to the invention are preferably used in these preparations in such a way that the cheese is salted by means of a 200 milligram saline solution to which a culture of the organism according to the invention has been added just before the cheese is salted. The microorganism which, together with other microorganisms such as lactic acid bacilli and Penicillium caseicolum, brings Brie and Camembert to full maturity, multiplies on the surface of the cheese. A well-marked ripening front is formed, which spreads into the cheese from the outside in.
By using the mutants of the invention it is possible to produce cheese of remarkably good color, i.e. H. without getting spots or spots ranging from orange to reddish brown.
The invention is further illustrated by the following examples.
example 1
The base culture was a culture of salt-resistant Brevibacterium linens Nur. 9174 of the American Type Culture Collection of Rockville, Maryland, USA, 12301 Park Lawn Drive), received at the Microbiology Laboratory of the Agricultural College (Landbouwhogeschool) in Wageningen, Holland.
This culture was grown for 40 hours in a medium containing MgSO4.7H2O 0.1 g / l CaCl. 2H2O 0; 02 g / l rock. 6O 0.01 g / l
MnSO4. 4H2O 1.0 mg / l CuSO4. 5H2O 0.1 mg / l ZnSO4. 7H2O 0.1 mg / l
CoCl2. 6H20 0.01 mg / l H3BO3 0.01 mg / l
Na2MoO4 contained 0.01 mg / l and to which the following substances were also added in the following amounts: 1.0ovo technical casamino acids (obtained by acid hydrolysis of casein, see Difco Manual, 9.
Edition, 1953), 0.50 / 0 extract of Bacto-Yeast (formed from the water-soluble components of autolytic yeast, see Difco Manual, page 270), 0.50 / 0 glucose and Sörensen buffer. The whole is made by adding desil; lated water made up to 1 liter. The Sörensen buffer is made from 40 ml of a 0.667 molar solution of KH2PO4 and 60 ml of a 0.667 molar solution of NaHPO. 2H2O prepares. The pH of the medium is 7.01. The medium obtained is sterilized by prior heating at 1200 ° C. for 5 minutes.
The microorganisms are sown in this medium.
After the cells of the microorganisms were grown for 40 hours in a Fernbach flask at 200 ° C., with aeration being carried out by means of magnet yaw at a centrifugal force of 20,000 g for 5 minutes, they were centrifugally isolated; the substrate was then replaced by a sterile physiological saline solution (0.850% NaCl solution) in which the cells were suspended. The operation was repeated to remove the protein compound by washing.
From the suspension of washed rod-shaped cells at a concentration of 106 cells per ml, 30 ml was removed and placed in a Petri dish, which was kept open, to be placed at a distance of 10 cm by means of a 6 watt low-pressure gas discharge lamp, which as A germicidal instrument is used and emits ultraviolet light with a wavelength of 254 mg (85, the most biologically active wavelength of 260 microns) to irradiate. The intensity of the emitted light was 0.85 xW per cm2 at a distance of 1 m. In the course of the irradiation, the suspension of the cells was magnetically stirred in order to ensure uniform irradiation of all cells.
The intensity of the irradiation was about 1000Erg per mm 2 per minute. The irradiation lasted 2 minutes and resulted in the death of about 990/0 of the cells. The suspension was then kept in the dark for 3 hours at 20 ° C., after which a culture of all surviving rod-shaped cells was created in a medium of the above-mentioned composition in Ferubach flasks at 200 ° C. with aeration by means of a magnetic stirrer. After 24 hours, the dilutions were sown on agar-agar fields, making it possible to obtain 50-100 colonies per field. The colonies of colorless cells were transferred to agar-agar surfaces which had solidified obliquely in test tubes.
The organisms obtained in this way were sown on various media with a saline content of 5-70 / 0, incubated in daylight and then selected for salt resistance.
To produce Camembert, 100 liters of milk, the fat content of which had been adjusted to 3.50 / o, were pasteurized by heating for 40 seconds at 720 ° C. (high-temperature short-time principle). The pasteurized milk, cooled to 32 ° C., was added to 3 / o of a lactobacillus culture containing 1010 to 1011 cells per ml, and then 10 ml of a suspension of Penicillium caseicolum spores (20-30 × 10 6 spores per ml) per 100 liters of milk. After stirring, 2 g of rennet powder were added in the form of a 0.01% solution in water. The milk thus treated was kept at 32 ° C. for 2 hours.
The milk curdled by the action of the rennet was roughly divided and collected in small kegs with a capacity of about 1 liter.
The curd masses were left in it for 20 hours and during this time the milk serum separated out, so that after this time the cheese was formed. The temperature of the curd masses fell from 320 to 230 C and the pH was then 4.4. The redox potential went down 100-12 millivolts and then was lower than -100 millivolts. The temperature in this case was kept at 21-22 C, the relative humidity at 950 / o.
Immediately after the cheeses had formed, they were immersed in a 200 per cent salt bath so that they could absorb about 2.5 per cent salt.
Just before the cheese was salted, about 2.5 ml of a culture of mutated Brevibacterium linens, obtained as described above, were added to 100 liters of salt solution, so that there were 10,000 germs per ml of brine. It is preferable not to use higher germ concentrations. The microorganisms begin to grow once the pH of the cheese is at least about 6.0.
The cheese was ripened in chambers in which a temperature of 160 ° C and a relative humidity of 900/0 were maintained. Mold developed on the cheese in the form of a white layer. After the cheeses were kept here for 10 days, they were wrapped in perforated aluminum foil.
The Brevibacterium linens was able to develop further in this package. Several days to several weeks after the cheeses began to ripen, they were ripe enough for consumption. The mold ripening of the cheese began on the surface and progressed towards the middle. During the ripening process, the pH increased progressively from 4.4 (start of ripening process) to 6.0 (2 weeks after beginning of ripening process) and finally to around 7.5 (6 weeks after beginning of ripening process). These values apply to the outside area. Inside the cheese, the pH rose from 4.3 (beginning of the ripening process) to 6.3 (6 weeks after the beginning of the ripening process).
A microbiological examination of the cheese 4 weeks after the start of the ripening process showed that no colored organisms Brevibacterium linens were present. In this test, 20 g of the surface and 20 g of the inside of the cheese were separately suspended in 40 ml each of a 0.01N NaOH solution containing 60 g of sodium citrate and 10 g of sodium bicarbonate per 1000 ml.
A series of decimal solutions in an aqueous medium containing 0.85 / o NaCl and 0.110 / o peptone were prepared from this suspension.
0.1 ml was removed from the various solutions and placed on agar-agar. The agar agar contained 5 g of bactopeptone, 3 g of Liebig meat extract, and 12.5 g of Na2HPO4. 12H2O, 55 g NaCl and 15 g agar-agar per 1000 ml. The medium was sterilized at 115 ° C for 20 minutes and incubated at 25 ° C for 5 days. Only colorless Brevibacterium linens could be demonstrated.
The germ concentrations were 2.1 x 10 8 per gram of cheese from the surface and 8.4 x 10 5 per gram of cheese from the inside.
Example 2
The operations described in Example 1 were repeated, but the irradiation was carried out for 6 minutes instead of 2 minutes in order to obtain an irradiation dose of 6000 ergs per mm 2. Selection of the white cells from the surviving cells was facilitated by the fact that most of the surviving cells were colorless.
Cheese was made in the same manner as in Example 1. No colored organisms were found in this cheese, as was shown in the microbiological examination described in Example 1.
Example 3
As in Example 1, a suspension was formed.
From the suspension of washed rod-shaped cells with a concentration of 108 cells per ml, 1 ml was placed in an Erlenmeyer flask of 1.5 ml capacity and at a distance of 2 cm with a spectrographic tungsten tube (type Philips pw 2164/00) The voltage was 100 kW and the current was 4 mA.
The intensity of the irradiation at a distance of 2 cm was 0.4 Mrad / hour. Irradiation lasted 2 minutes and resulted in death of about 990 / o of the cells. The cells obtained were sown, incubated and selected for color and salt resistance in the manner described in Example 1.
The cheese produced with the organisms obtained did not contain any colored organisms, as was shown in the microbiological examination described in Example 1.
The cheeses thus obtained had a total weight of 10 kg, an excellent appearance, free from spots and stains with a color which was markedly different from that of the rest of the cheese surface, and a very pleasant smell and taste.
The mutants of Brevibacterium linens that were obtained and were used in the above examples for the production of cheese have been deposited in the Laboratorium voor Microbiologie van de Technische Hogeschool in Delft (Netherlands) under the following numbers: Example 1: Culture No. m 2, Example 2: Culture No. m 14, Example 3: Culture No. m 49.
PATENT CLAIM I
Process for obtaining colorless microorganisms suitable for cheese production, characterized in that cultures of colored microorganisms suitable for cheese production are treated in such a way that colorless mutants of the microorganisms are obtained.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that cultures of the microorganisms Arthrobacter or Brevibacterium linens are treated.
2. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the cultures are subjected to a physical mutation treatment.
3. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the cultures are subjected to a chemical mutation treatment.
4. The method according to dependent claim 2, characterized in that the cultures are exposed to electromagnetic radiation with rays having a wavelength of less than 320 ma.
5. The method according to dependent claim 4, characterized in that cultures are exposed to the electromagnetic radiation in the stage of logarithmic growth.
6. The method according to dependent claim 4, characterized in that the cultures are exposed to electromagnetic radiation in an albumin-free medium.
7. The method according to dependent claim 4, characterized in that the electromagnetic radiation is ultraviolet light.
8. The method according to dependent claim 7, characterized in that the ultraviolet light is generated artificially.
9. The method according to dependent claim 7, characterized in that ultraviolet light of one wavelength
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