Procédé de préparation de dérivés du prégnane 6 p-hydroxylés La présente invention a pour objet un procédé de préparation de dérivés du prégnane 6(3-hydroxylés.
L'introduction d'un groupe 6(3-hydroxyle dans une molécule de stéroïde est décrite dans la litté rature. Peterson et coll., J. Amer. Chem. Soc.,<I>75,</I> 412 (1953) ont isolé 1e dérivé 6(3-hydroxylé de la substance S de Reichstein à partir de la réaction fer- mentative entre ce composé (4-prégnène-17a-21-diol- 3,20-dione)
et un micro-organisme de l'espèce Rhizo- pus arrhizus. Dans un travail antérieur (J. Amer. Soc., 74, 5933 (1952)), Peterson et coll. ont montré que la réaction entre l'organisme précité avec la progestérone donne lieu à un mélange de produits comprenant de la 11(x-hydroxy-progestérone conjoin tement avec un pourcentage faible de 6(3,
-I-lla-di- hydroxy-progestérone. L'emploi<I>d'Aspergillus</I> nidu- lans a été rapporté par Fried et coll., Recent progress Hormone Research, Vol. 11, p.
149 (1955) pour effectuer l'introduction d'un groupe 6(3-hydroxyle dans la substance S de Reichstein et la 16a-hydroxy- progestérone conjointement avec des hydroxylations en d'autres portions de la molécule. En outre,
il a été rapporté que la moisissure Gliocladium catenula- tum dans son action sur le progestérone donne nais sance à une faible quantité de 6(3-hydroxy-androstè- nedione. D'autres publications décrivent des métho des d'introduction d'un groupe 6(3-hydroxyle. Cepen dant, toutes les méthodes décrites pour effectuer une 6(3-hydroxylation paraissent avoir l'inconvénient d'aboutir à un mélange de produits ou, si on obtient un seul produit, d'engendrer alors ce dernier avec un faible rendement.
Un mélange de produits de polarité similaire, comme celui qui se forme en hydroxylant des stéroïdes, est par nature difficile à séparer et requiert de longues et fastidieuses extractions et techniques opératoires en vue d'obtenir des substan ces pures.
On a découvert que l'on obtient, en rendement sensiblement quantitatif, un dérivé du prégnane 6(3-hydroxylé de forme générale
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dans laquelle la liaison 1,2 est simple ou double, X représente HZ (H,OH) ou O, Y représente H ou OR, R représentant H ou un radical acyle, et Z re présente H ou OH, en soumettant un dérivé du pré- gnane de formule générale
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dans laquelle la liaison 1,2 est simple ou double;
à l'action d'une culture d'une espèce de micro-orga nisme du genre Chaetomium ou d'enzymes d'une telle culture, et en isolant le dérivé ainsi formé. Ce micro-organisme a en effet un comportement unique en ce sens qu'une position seulement du noyau stéroïde est attaquée, et que la transformation du composé de départ en l'analogue correspondant 6a-hydroxylé est pratiquement complète. Comme c'est généralement le cas dans les transformations microbiologiques, certaines espèces d'un genre, pour une raison ou l'autre, se prêtent mieux à une réaction particulière.
Pour le genre Chaetomium, .on a trouvé que les espèces <I>C.</I> funicolum (QM 33C), C. cochli- odes, <I>C.</I> mollipilium, et C.
succineum sont approxi mativement égales entre elles dans leur activité et, en groupe, elles sont supérieures à certaines autres es pèces du genre Chaetomium. Ainsi, en cultivant et en mettant incuber une des espèces précitées de Chaetomium et en mettant l'organisme en développe ment au contact de la matière de départ, on obtient après 24 à 72 heures essentiellement une transfor mation à<B>100</B> 9/o, et l'on isole avec facilité le produit 6(3-hydroxylé correspondant. Par exemple, en met tant du 21-acétate de 1,4-prégnadiène-ll(3,17a,
21- triol-3,20-dione en contact avec une espèce de Chae- tomium comme le C. funicolum (QM 33C) ou un extrait enzymatique de celle-ci, conformément à des procédés analogues décrits dans la littérature, on obtient de la 1,4-prégnadiène-6(3,ll(3,17a,21-tétrol- 3,20-dione.
On a constaté qu'au cas où la matière de départ possède un groupe 21-ester, il se produit parfois une saponification. Toutefois, le 21-ol libre est aisément séparé de son ester par des différences de solubilité. Lorsqu'on désire un ester, il s'avère commode de réestérifier tout 21-hydroxyle libre pouvant être pré sent.
En plus des 1,4-prégnadiènes mentionnés dans les exemples qui suivent, le présent procédé micro biologique est applicable à d'autres stéroïdes corres pondant à la formule générale qui précède. Par exemple, en partant de cortisone, d'hydrocortisone, de la substance S de Reichstein, ou de progestérone, on obtient respectivement la 6(3-hydroxy-cortisone, la 6S-hydroxy-hydrocortisone, la 4-prégnène-6(3-17a,21- triol-3,20-dione, la 6p-hydroxy-progestérone, etc. On prépare également ces produits avec un rendement essentiellement quantitatif et on les sépare aisément du mélange de réaction.
Les composés obtenus par le procédé selon l'in vention sont utiles comme composés intermédiaires pour la transformation en des corticoïdes physiologi quement actifs, dont des exemples sont les 1,4,6-pré- natriènes. Par exemple, on peut traiter un composé tel que le 21-acétate de 1,4-prégnadiène-6(3,17a,21- triol-3,11,20-trione par un agent sulfonant comme le chlorure de p-toluène-sulfonyle, ce qui donne le 6(i-p-toluènesulfonate correspondant.
Lorsqu'on traite cet ester par une base à point d'ébullition élevé, la diéthylaniline, par exemple, on obtient une substance thérapeutiquement active, qui. est le 21-acétate de 1,4,6-prégnatriène-17a,21-diol-,11,20-trione. Les composés obtenus par le présent procédé, qui sont dépourvus d'une fonction oxygène en C-11 ou en C-21, sont aisément convertis en l'analogue oxy géné en introduisant la fonction oxygénée suivant l'une quelconque des méthodes décrites dans la litté rature.
Par exemple, on peut introduire une fonction oxygénée sur l'atome C-11 par un micro-organisme du genre Curvularia ou Rhizopus, etc., tandis que la fonction oxygénée sur l'atome C-21 peut être intro duite microbiologiquement en moyen de l'espèce Ophiobolus herbotrichus, ou chimiquement par halo- génation, acyloxylation et, si on le désire, par sapo nification.
En plus de leur utilité comme composés intermé diaires pour la préparation de corticoïdes thérapeu- tiquement actifs, les composés obtenus par mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont thérapeuti- quement utiles comme tels. Ces composés agissent comme inhibiteurs de l'hypophyse et sont générale ment utilisables en thérapie corticoïde dans le traite ment de certaines maladies inflammatoires. Ils peu vent être administrés par voie orale sous forme de comprimés, de gélules, etc., ou par voie parentérale en solution ou en suspension dans des véhicules non toxiques.
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<I>Exemple <SEP> 1</I>
<tb> <I>!,4-prég <SEP> nadiène-6(3,17a,21-triol-3,11,20-trione</I>
<tb> Dans <SEP> chacun <SEP> de <SEP> 10 <SEP> flacons <SEP> Erlenmeyer <SEP> de
<tb> 300 <SEP> ce <SEP> on <SEP> place <SEP> 100 <SEP> ce <SEP> d'un <SEP> milieu <SEP> de <SEP> culture
<tb> ayant <SEP> la <SEP> composition <SEP> suivante
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> <SEP> Difco <SEP> <SEP> <B>.... <SEP> ...</B> <SEP> 3 <SEP> à <SEP> l0 <SEP> g
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> ou <SEP> eau <SEP> de <SEP> distribution
<tb> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> litre Chaque flacon est inoculé avec des spores d'un milieu de culture d'agar de Chaetomium f u- nicolum (QM No 33C) ou avec 1 à 101)/o d'ino- culum submergé qui a été cultivé pendant 24 à 48 heures.
On met incuber le mélange en secou ant les flacons sur un appareil rotatif à secousses, pendant 24 à 48 heures à 281) C, à raison d'envi ron 250 tours à la minute. A chacun des flacons (qui montrent alors une croissance prolifique) on ajoute aseptiquement 50 mg de 1,4-prégna- diène-17a,21-diol-3,11,20-trione dans 2<I>ce</I> d'éthanol. On met alors incuber le mélange de fermentation et on le secoue pendant 24 à 72 heures à 280 C, temps au bout duquel il se pro duit une conversion complète.
On extrait à fond le mélange avec du chloroforme et la faible frac tion du produit qui est retenue dans le mycelium est extraite en faisant bouillir le mycelium dans du chloroforme pendant quelques minutes. On combine les extraits chloroformiques et on les évapore en un résidu donnant approximativement 5 mg de matière brute. On triture le résidu avec du méthanol, ce qui donne un solide cristallin que l'on purifie par cristallisation à partir d'acé tone, obtenant ainsi la 1,4-prégnadiène-6(3,17a, 21-triol-3,11,20-trione.
Le produit de cet exemple peut être estérifié comme suit <I>la)</I> 21-acétate <I>de</I> 1,4-prégnadiène-6(3,17a,21- triol-3,11,20-trione On verse une solution de 25 mg du composé de l'exemple 1, se trouvant dans 2 cm3 de pyri- dine anhydre, sur 6 mg d'anhydride acétique dans une atmosphère anhydre. On agite le mélange pendant 30 minutes et on le verse ensuite dans de l'acide sulfurique dilué et de la glace. Le pré cipité résultant est séparé par filtration, puis sé ché et cristallisé à partir de méthanol, donnant ainsi le 21-acétate susmentionné.
<I>lb)</I> 60,21-diacétate <I>de 1,4</I> prégnadiène-6f),17a,21- triol-3,11,20-trione En portant la quantité d'anhydride acétique à 100 mg dans l'estérification décrite ci-dessus, on obtient le diacétate que l'on purifie par cris tallisation à partir d'un mélange acétone-hexane.
De plus, le 21-acétate de 1,4-prégnadiène- 6(3,17a,21-triol-3,11,20-trione peut encore être estérifié en 6(3-benzoate-21-acétate de 1,4-pré- gnadiène-6(1,17a,21-triol-3,11,20-trione, au moy en de chlorure de benzoyle en présence de pyri- dine anhydre, et ce dernier composé peut four nir le 21-acétate de 1,4,6-prégnatriène-17a,21- diol-3,11,20-trione par chauffage en présence de diéthylaniline.
<I>Exemple 2</I> 1,4-prégnadiène-6(3,11(3,17a,21-tétrol-3,20-dione On suit essentiellement le mode opératoire de l'exemple 1 et on utilise comme matière de dé part la 1,4-prégnadiène-11(3,17a,21-triol-3,20- dione. On développe une culture de Chaetomium cochliodes (QM 624) comme décrit dans l'exem ple 1, dans un milieu ayant la composition sui vante
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<SEP> Edamine <SEP> .................... <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs <SEP> <B>......</B> <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> (ou <SEP> cerelose) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> <B><I>10-509</I></B>
<tb> Eau <SEP> pour <SEP> compléter <SEP> à <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> litre Après achèvement de la fermentation on extrait le mélange avec du chlorure de méthylène et on évapore la couche organique jusqu'à obtention d'un résidu.
On fait digérer le résidu avec un peu de méthanol et on le fait cristalliser à partir d'un mélange chlorure de méthylène-hexane, ce qui donne la 1,4-prégnadiène-6(3,11(3,17a,21-tétrol- 3,20-dione. Le produit de cet exemple peut être estérifié comme suit <I>2a)</I> 21-acétate <I>de</I> 1,4-prégnadiène-6(3,11,(317a,21- tétrol-3,20-dione On traite une solution de 50 mg du produit de l'exemple 2 dans 3-4 cm3 de pyridine anhydre avec 11-12 mg d'anhydride acétique, et on opère comme sous la).
Le 21-acétate ainsi obtenu est purifié par cristallisation à partir d'acétone.
<I>2b)</I> 6(3,21-diacétate <I>de</I> 1,4-prégnadiène- 6(3,11(3,17a,21-tétrol-3,20-dione En portant la quantité d'anhydride acétique à<B>100</B> mg dans l'estérification décrite ci-dessus, on obtient le diacétate que l'on purifie par cris- tallisation à partir d'un mélange chlorure de mé- thylène-hexane.
De plus, le 21-acétate de 1,4-prégnadiène- 6(3,11(3,17a,21-tétrol-3,20-dione peut encore être estérifié en 6-p-toluène sulfonate-21-acétate de 1,4-prégnadiène-6(3,1 l p,17a,21-tétrol-3,20-dione, au moyen de chlorure de p-toluène sulfonyle en présence de pyridine, et ce dernier composé peut fournir le 21-acétate de 1,4,6-prégnatriène- 11(3,17a,21-triol-3,
20-dione par chauffage en pré sence de 2,4,6-collidine.
<I>Exemple 3</I> 1,4-prégnadiène-6(3,17a,21-triol-3,20-dione En suivant le mode opératoire de l'exemple 1 et en utilisant de la 1,4-prégnadiène-17a,21-diol- 3,20-dione comme matière de départ, on obtient le composé de cet exemple que l'on purifie par cristallisation à partir d'acétone.
<I>Exemple 4</I> 1,4-prégnadièné-6(3,l7a-diol-3,20-dione En substituant gramme pour gramme de la 1,4-prégnadiène-17a-ol-3,20-dione dans le mode opératoire de l'exemple 1, on obtient la 1,4-pré- gnadiène-6(3,17a-diol-3,20-dione.
Comme variante, on peut employer du Chae- tomium succineum (QM 1044) comme culture.