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La présente invention est relative à la préparation
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de la ,y,-prégnène-11 t, 17 , 21-triol-3,20-dione (composé épi-F) L'invention concerne plus spécialement un nouveau procédé de préparation d'un composé épi-F par l'hydroxylation microbiologique
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du composé S de Reichstein, la 4 -prégnène-17oC,2l-diol-3,20- dione, en utilisant le champignon Corineum cardinale 952 (LCI).
Dans les brevets et la littérature, on a déjà décrit diverses méthodes pour convertir le composé 8 de Reichstein en stéroïdes 11-oxygénés et en particulier en composé F et en com-
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posé épi-F, par utilisation de divers organismes. Par exemple, le brevet U.S.A. 2.602.769 décrit l'utilisation de Cunninghamella blakesleana ( ordre des Mucorales ); une publication dans le journal Amér. Chem.
Soc.74, 2381 (1952) décrit un procédé utilisant du streptomyces fradiae ; le brevet U.S.A. 2.658.023 décrit l'utilisation d'un champignon du genre Curvularia (ordre des Moniliales) tandis qu'un champignon du genre Pestalotia est utilisé par le procédé du brevet U.S.A. 2.721.163. L'importance de l'introduction d'oxygène dans la position 11 des stéroïdes est bien connue des chimistes spécialisés dans le domaine des stéroïdes.
En particulier, en convertissant le composé 3 en son dérivé 11-hydroxylé, dans le cas où l'hydroxyle est stéraniquement en position 11 ss, on obtient, de l'hydrocortisone, à savoir le composé F, et, dans le cas où l'hydroxyle entre en position 11 [alpha], on obtient le composé épi-F qui peut être facilement converti en cortisone par des procédés chimiques.
Contrairement aux connaissances résultant des brevets et de la littérature ci-avant, on a trouvé, suivant l'invention, que le composé S peut être converti en composé épi-F avec un rendement quantitatif en utilisant le micro-organisme Coryneum cardinale 952 (LCI).
Ce micro-organisme appartient à la famille des Melanconiaceae, ordre des Mélanconiales, classe des Fungi Imperfecti. Dans des conditions identiques, on a vérifié d'autres espèces du même genre, mais on n'a pas pu déceler dans les bouillons de culture, par chromatographie, une trace quelconque de composé F ou épi-F. D'autre part, le Coryneum cardinale 952 (LCI), tel que signalé ci-avant, réalise la conversion en un rendement de 100 %, et aucune quantité importante de sous-produits n'est trouvée dans les bouillons de culture comme on doit s'y attendre du fait du rendement quantitatif.
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La souche Coryneum cardinale a été déposée au Laboratoire Cryptogamique Italien du Ministère de l'Agriculture et des Forêts à Pavie et a été numérotée n 952.
Le procédé de la présente invention peut être appli- qué à la fois au composé S et aux esters d'acide 21-carboxylique du composé S, tels que le 21-acétate, le 21-propionate, etc ; dans tous les cas, on obtient le composé épi-F en un rendement à peu près quantitatif. La composition du milieu nutritif, la température, etc., doivent être convenablement réglés suivant la nature de l'ester de départ.
La 11 [alpha] -hydroxylation pour convertir le composé F en composé épi-F est généralement mise en oeuvre par des procédés qui sont bien connus des microbiologistes. Le Coryneum cardinale 952. est, par exemple, mis à croître dans un milieu nutritif habituel avec de l'agar-agar contenant des protéines et des hydrates de carbone, comme une liqueur de macération de mais, des extraits de levure, de la peptone? du sucrose, de l'amidon, du glucose et des dextrines.
Le pH du milieu végétatif peut également varier entre de larges limites de 3,5 à 8; cependant, les meilleurs résultats ont été obtenus à un pH de 5 à 6. La température peut être comprise entre 10 et 40 C., mais les meilleures températures pour une production de spores sont comprises entre 24 et 30 C. Après avoir obtenu une sporulation en partant d'une culture de Coryneum cardinale 952 dans le milieu végétatif, par une culture de 2 à 10 jours, le milieu contenant les spores est dilué et lavé de fa- çons répétées avec de l'eau stérile. La suspension de spores obtenue est. ensemencée dans le milieu de fermentation qui a presque la même composition que le milieu végétatif et dans lequel le mycélium végétatif se forme en un temps de 12 à 48 heures.
A cette culture contenant le mycélium végétatif, les inocula sont transférés dans des flacons d'Erlenmeyer contenant un milieu fermenta-
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tif, et ils sontien agités. Après avoir obtenu une bonne croissance, c'est-à-dire, après 6 à 24 heures, le composé S dissous dans un alcool aliphatique inférieur est ajouté au milieu de culture jusqu'à ce qu'on obtienne une concentration de 1 à 5 % du composé S dans le milieu de culture, de préférence 2 %. Le milieu de fermentation est agité jusqu'à conversion totale du composé S en composé épi-F, ce qui exige une durée comprise entre 10 et 24 heures. Le taux de conversion du composé S en composé F est déterminé par une chromatographie sur papier, répétée, chaque heure, par exemple.
La fermentation est arrêtée lorsque la chromatographie montre que le milieu ne comprend plus de composé S mais uniquement du composé épi-F.
Au lieu d'enlever l'inoculum, du milieu végétatif dans lequel les spores ont été cultivés, le milieu de fermentation peut être ensemencé directement avec la suspension de spores, grâce à quoi on obtient encore des rendements élevés de composé épi-F, bien qu'en un temps plus long.
Le composé épi-F est finalement extrait du milieu de fermentation contenant le mycélium, par un solvant non miscible dans l'eau dans lequel le composé épi-F est soluble, comme, par exemple, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le chlorure de méthylène, etc. Les extraits sont concentrés sous le vide jusqu'à siccité et le résidu est cristallisé en partant d'un solvant convenable, comme par exemple dans de l'acétone.
Les exemples suivants illustrent clairement l'invention, bien qu'ils n'en constituent pas une limitation.
EXEMPLE 1.
Une culture de Coryneum cardinale 952 (LCI) est mise à croître dans un milieu d'agar-agar contenant 1 % de peptone et 3 % de glucose pendant 3 jours à 28 C et à un pH de 5 à 5,5. Le milieu de culture est alors dilué avec de l'eau et lavé jusqu'à ce qu'on obtienne une suspension homogène de spores,
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Dans 10 flacons d'Erlenmeyer, contenant chacun 50 ml de milieu de fermentation avec 1 % de liqueur de macération de mais, ? % de sucrose et 0,5 % d'amidon, on ensemence 1 ml de la suspension de spores ci-avant; le mélange est agité dans un agita- teur rotatif à 150 tours par minute à 30 C pendant 24 heures.
Après cette période, on ajoute à chaque flacon une solution de 0,1 gr de composé S dans 5 ml d'alcool méthylique. L'agitation est poursuivie pendant 24 heures à 30 C. Une chromatographie ,montre qu'une conversion se produit aux taux suivants :
Durée (heures) % de conversion
5 20
10 45
15 70
18 81
20 87
22 94
24 . 100
A la fin de la fermentation, le pH du milieu est égal à 6. Après 24 heures, la matière contenue dans les 10 flacons d'Erlenmeyer est combinée et extraite avec du tétrachlorure de carbone. L'extrait est évaporé jusqu'à siccité et le résidu est recristallisé dans de l'acétone. 0,7 gr du composé épi-F sont obtenus avec un point de fusion de 215 -217 C.
Lors d'une concentration d.e l'acétone, on obtient 0,26 gr supplémentaires du compo- sé épi-F, avec un point de fusion de 213-214 C. Par recristalli- sation des deux récoltes combinées dans l'acétone, on obtient 0,92 gr du composé épi-F d'un point de fusion de 219 -220 C.
EXEMPLE. 2.
Un inocul-um de Coryneum cardinale 952 (LCI) est préparé comme décrit à l'exemple 1.
Dans 10 flacons d'Erlenmeyer, contenant chacun 50 ml d'un milieu de fermentation avec 0,2 % d'extrait de levure, 1 % de glucose et 3 % de dextrines, on ensemence 1 ml de la suspension de spores, et ensuite une solution de 0,1 gr de composé S dans
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5 ml d'alcool éthylique, et le mélange est agité dans un agitateur rotatif à 28 C pendant 48 heures, à 200 tours par minute. Une chromatographie montre qu'une conversion se produit aux taux sui-
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#va.aK.i3 :
Durée (Heures) % conversion
4 négligeable
8 2
12 15
16 26
20 38
24 52
28 68
32 80
36 88
40 95
44 99
48 100
A la fin de la fermentation, le pH du milieu est de 5,7 Après 48 heures, les contenus des flacons sont combinés et extraits avec du chloroforme.
Ils sont traités comme à l'exemple ] en obtenant 0,90 gr de composé épi-F d'un point de fusion de
218 -220 C.
EXEMPLE 3 'Un inoculum de Coryneum cardinale 952 (LOI) est pré- paré comme décrit à l'exemple 1. 25 litres d'un milieu de culture contenant..0,8 % de peptone, 3 % de sucrose, 1 % de liqueur de ma- cération de mais dans de l'eau sont chargés dans un réservoir de fermentation de 100 litres. Après stérilisation, le pH du milieu est égal à environ 6. On ajoute 2 % d'inoculum, et le mélange est maintenu à 27 C pendant 24 heures sous agitation à 150 tours par minute, tout en introduisant de l'air stérile.
Une fois que la croissance de mycélium est complète, on ajoute 25 gr de composé S dissous dans 300 ml d'alcool méthyli- que, et la fermentation est réalisée jusqu'à conversion totale, c'est-à-dire pendant environ 30 heures, le pH final étant de 5,4.
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Le mélange est complètement extrait avec du chloroforme, et celui-ci est évaporé jusqu'à siccité. Le résidu est recristallisé dans de l'acétone, grâce à quoi on obtient une première récolte de 18 gr de composé épi-F d'un point de fusion de
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213 --L40 Î,.
Lors d'une concentration de l'acétone, on obtient une seconde récolte de 6 gr d'un point de fusion de 210 -214 C.
Par recristallisation dans de l'acétone, les deux récoltes donnent 23 gr de composé épi-F d'un point de fusion de 219 -220 C.
EXEMPLE 4.
Un inoculum de Coryneum cardinale 952 (LOI) est préparé comme décrit à l'exemple 1.
Dans 10 flacons d'Erlenmeyer, contenant chacun 100 ml d'un milieu de fermentation avec 0,3 % d'extrait de foie, 1 % de sucrose et 0,5 % d'amidon, on ensemence 2 ml de la suspension de spores et ensuite une solution de 0,2 gr de 21-acétate du composé S dans 5 ml d'alcool méthylique, et le mélange est agité dans un agitateur rotatif à 26 C pendant 36 heures à 200 tours par minute.
Après 30 heures, la conversion est déjà pratiquement totale.Le composé épi-F est isolé, comme indiqué dans les exemples précédents, on obtient 1,75 gr d'un point de fusion de 218 - 219 C. 'En utilisant du propionate du composé S comme matière première, avec fermentation pendant 48 heures à-29 C, on obtient un résultat identique.
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