BRPI0719360B1

BRPI0719360B1 - vacina da doença de lyme canina, e, uso de organismos de uma genoespécie de borrelia

Info

Publication number: BRPI0719360B1
Application number: BRPI0719360A
Authority: BR
Inventors: Rhonda Lafleur; Steven M Callister; Terri L Wasmoen
Original assignee: Intervet Int Bv; Shering Plough Ltd
Priority date: 2006-11-03
Filing date: 2007-11-01
Publication date: 2016-09-06
Also published as: BRPI0719360A2; CN101573135A; EP2077856B1; AU2007318026B2; JP2012211205A; WO2008057396A3; JP2017019873A; US20120141530A1; NZ576564A; CA2668405C; JP5177824B2; WO2008057396A2; KR101192127B1; RU2009120894A; KR20090077018A; RU2460538C2; US8414901B2; WO2008057396A8; IL198485A0; JP2010509217A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA DA DOENÇA DE LYME CANINA, E, USO DE ORGANISMOS DE UMA GENOESPÉCIE DE BORRELIA".

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente é um pedido de patente não provisório que reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório U. S. Ne de série 60/864.258 depositado em 3 de novembro de 2006, cujos conteúdos são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma vacina para doença de Lyme canina. Métodos de fazer e usar a vacina sozinha ou em combinações com outros agentes protetores são também fornecidos.

ANTECEDENTES

Doença de Lyme canina é causada por infecção com espiroquetas das espécies Borrelia (spp.), incluindo primariamente B. burgdorferi sensu stricto (ss) nos Estados Unidos e B. Burgdorferi ss, B. garinii, e B. afzelii na Europa (Baranton et al., Int. J. Sys. Bacteriol. 1992,42:378-383; Hovius et al., J. Clin. Microbiol. 2000, 38:2611-2621). As espiroquetas são transmitidas quando os carrapatos Ixodes spp. infectados obtêm uma refeição de sangue, e a infecção resultante nos caninos resulta em sinais clínicos que variam de sinovite subclínica à artrite aguda e artralgia (Jacobson et al., Semin. Vet. Med. Surg. 1996, 11:172-182; Summers et al, J. Comp. Path. 2005, 133:1 -13). Essencialmente, a incidência de casos de doença de Lyme canina continua aumentando anualmente coincidente com os números aumentados de casos humanos (Haninkova et al., Emerg. Infect. Dis. 2006, 12:604-610).

Os anticorpos produzidos em resposta à infecção com Borrelia spp. têm duas funções distintas, mas antes, ambas as respostas poderiam ser ineficazes na eliminação das espiroquetas sequestradas de um hospedeiro mamífero. Várias explanações foram postuladas para este defeito na resposta imune normal à infecção natural, incluindo variação antigênica (Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112; Tokarz et al., Infect. Immun. 2004, 72:5419-5432), mimetismo do hospedeiro (Barbour et al. Microbiol.

Rev. 1986, 50:381-400), e localização intracelular (Ma et al., Infect. Immun. 1991, 59:671-678). A resposta imune humoral mais comum é a produção de anticorpos de ligação/opsonização não específicos (revestimento) que "marcam" a espiroqueta para ingestão por células fagocitárias. Infelizmente, anticorpos opsonizantes são induzidos por várias proteínas comuns a outros microorganismos (viz. proteínas de 41 kDa compreendendo flagelos bacterianos), tornando seu valor para imunidade mediada por anticorpo induzido por vacinação, na melhor das hipóteses, questionável.

Uma segunda resposta imune comum é a produção de anticorpos borreliacidais (letais). Em contraste com os anticorpos opsonizantes, os anticorpos borreliacidais reconhecem epítopos em apenas algumas proteínas de Borrelia spp. Após ligar ao alvo específico na espiroqueta, os anticorpos borreliacidais mais comumente induzem o complemento para formar um complexo de ataque de membrana que mata o organismo sem a necessidade de descontaminação pelas células fagocitárias.

As bacterinas da doença de Lyme canina presentemente empregadas em vacinas foram desenvolvidas para fornecer proteção induzindo anticorpos borreliacidais de OspA (Hsien-Chu et al., JAVMA 1992, 201:403-411; Ma et al., Vaccine 1996,14:1366-1374; Wikle et al., Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28; Straubinger et al., Vaccine 2001, 20:181-193) que mata as espiroquetas de expressão de OspA nos carrapatos infetados quando os parasitas obtêm uma refeição de sangue (Fikrig et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, 89:5418-5421). Straubinger et al., (Vaccine 2002, 20:181-193) relatou que uma vacina de célula inteira induziu significativamente titulações mais altas de anticorpos borreliacidais que um OspA re-combinante. Embora tais vacinas tenham sido razoavelmente bem-sucedidas, falhas de vacinação foram relatadas (Levy et al. JAVMA 1993, 202:1834-1838; Ma et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Schutzer et al., N. Engl. J. Med. 1997, 337:794-795). É agora entendido que os anticorpos borreliacidais de OspA gerados frequentemente falham em esterilizar carrapatos alimentadores, por- que os anticorpos apenas reconhecem B. burgdorferi ss (Jobe et al., J. Clin. Microbiol. 1994, 32:618-622; Lovrich et al., Infect. Immun. 1995, 63:2113-2119) que estão expressando OspA, e os carrapatos são comumente infeta-dos com espiroquetas de B. burgdorferi ss que não estão expressando OspA (Fikrig et al., Infect. Immun. 1995, 63:1658-1662; Ohnishi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 2001, 98:670-675). Além disso, os carrapatos são comumente também infetados com outro Borrelia spp. patogênico incluindo B. afzelii e B. garinii (Ornstein et al., J. Clin. Microbiol. 2001, 39:1294-1298), enquanto os anticorpos de OspA são genoespécies específicas (Lovrich et al., Infect. Im-mun. 1995, 63:2113-2119). Além disso, a ‘janela de oportunidade’ para proteção por anticorpos borreliacidais de OspA é igualmente limitada quando as espiroquetas estão suscetíveis, porque a expressão de OspA, que medeia a ligação ao intestino do carrapato (Pal et al., J. Clin. Invest. 2000, 106:561-569), é infrarregulada logo após o carrapato infetado começar a alimentar-se (Schwan etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995, 92:2909-2913).

OspC de B. burgdorferi ss. é outro alvo potencial para imunidade mediada por anticorpo borreliacidal (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). Esta proteína parece ter um epítopo que é responsável por induzir anticorpos borreliacidais e é conservada entre o Borrelia spp. patogênico (Lovrich etal., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751). Embora a função específica da proteína de OspC permaneça desconhecida, sugeriu-se que a expressão de OspC seja requerida para infecção de mamíferos, mas não para infecção de carrapatos (Grimm et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sei. 101(9):3142-3147). Em todo caso, as espiroquetas da doença de Lyme expressam OspC logo após o carrapato começar a se alimentar (Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995, 92:2909-2913) e têm que continuar expressando OspC a fim de estabelecer uma infecção em mamíferos (Stewart et al., Infect. Immun. 2006, 74:3547-3553, Tilly et al., Infect. Immun. 2006, 74:3554-3564). Portanto, a "janela de eficácia" dos anticorpos borreliacidais de OspC é significativamente aumentada comparada aos anticorpos borreliacidais de OspA.

Foi mostrado que a proteína de OspC pode induzir anticorpos borreliacidais protetores (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741, Ikushima et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29:15-21), mas alguns estudos de "mapeamento" anteriores localizaram os epítopos para regiões altamente heterogêneas da proteína (Buckles et al., Clin. Vacc. Immunol. 2006,13:1162-1165). Portanto, anticorpos borreliacidais de OspC suscitados contra estas regiões apenas fornecerão imunidade mediada por anticorpo contra um número pequeno de isolados de Borrelia spp. Lovrich et al. (Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751) identificou um epítopo de anticorpos borreliacidais de OspC dentro dos 7 aminoácidos C-terminais (OspC7) da proteína. Mais significativamente, o epítopo é conservado entre a Borrelia spp. patogênica. Porém, isolados de B. burgdorferi ss laboratoriais tradicionais que expressam OspA (isto é, contêm o óperon ospAlospB) não podem ser manipulados no laboratório para também induzir níveis significativos de anticorpos borreliacidais de OspC sem significativamente prejudicar sua capacidade de induzir anticorpos borreliacidais de OspA. Além disso, vacinação com isolados de B. burgdorferi ss laboratoriais tradicionais mortos que expressam OspA não induz anticorpos borreliacidais de OspC (Schwan et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92:2909-2913, Obonyo et al., 1999, J. Clin. Microbiol., 37:2137-2141).

Callister et al., (Patentes U. S. Nos 6.210.676 e 6.464.985, incorporadas por referência aqui) sugeriram empregar um fragmento de polipep-tídeo imunogênico de OspC, sozinho ou em combinação com um polipeptí-deo de OspA, para preparar uma vacina para proteger seres humanos e outros mamíferos contra doença de Lyme. Livey et al. (Patente U. S. N° 6.872.550, incorporada por referência aqui) também propuseram uma vacina para imunizar contra doença de Lyme preparada de uma combinação de proteínas de OspA, OspB, e OspC recombinantes. Porém, até agora, nenhuma vacina de proteína recombinante foi mostrada ser uma melhoria sobre as vacinas que são comercializadas correntemente. Portanto, resta uma necessidade existente há muito na técnica por uma vacina melhorada para proteger mamíferos, e especialmente caninos, da doença de Lyme. A citação de qualquer referência aqui não deveria ser interpreta- da como uma admissão que taf referência esteja disponível como "técnica anterior" ao pedido de patente imediato.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Consequentemente, a presente invenção fornece composições imunogênicas novas que podem ser usadas em vacinas. Em um aspecto da presente invenção, uma vacina protege contra doença de Lyme. Em uma modalidade particular deste tipo, o recipiente da vacina é um canino. Em outra modalidade, o recipiente da vacina é um gato doméstico. Outros mamíferos domésticos podem ser protegidos pelas vacinas e/ou métodos da presente invenção tais como cavalos e/ou bois. A presente invenção também provê vacinas de combinação para suscitar imunidade protetora contra doença de Lyme e outras doenças, por exemplo, outras doenças infecciosas caninas. Métodos de fazer e usar as vacinas da presente invenção são também fornecidos.

Uma vacina da presente invenção compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de organismos de uma primeira ou única cepa (opcionalmente inativada) que expressa antígeno de OspC. A cepa é uma que, quando desenvolvida sob condições de cultura padrão, é morta na presença de anticorpos borreliacidais OspC-específicos (complemento é opcionalmente requerido), incluindo anticorpos borreliacidais contra o epítopo conservado OspC7, suscitado em um animal vacinado por 50772 de B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439). Em uma modalidade particular deste tipo, a primeira ou única cepa de genoespécies de Borrelia constitutivamente expressam o antígeno de OspC. Em uma modalidade mais particular, a primeira cepa é 50772 de B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439).

Uma composição de vacina da presente invenção pode também incluir uma quantidade imunologicamente eficaz de organismos inativados de uma ou mais cepas adicionais (que podem ser coletivamente marcadas aqui como a segunda cepa), de uma genoespécie de Borrelia patogênica. Em uma modalidade particular, a segunda cepa exibe antígenos de OspA e OspB.

Exemplos de segundas cepas apropriadas incluem uma ou mais das seguintes: S-1-10 de B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680), B-31 de B. burgdorferi ss (ATCC No. 35210), B. afzelii (por exemplo, disponível como ATCC No. 51567) e B. garinii (por exemplo, disponível como ATCC Nos. 51383 e 51991), DK7 de B. burgdorferi ss, 61BV3 de B. burgdorferi ss, ZS7 de B. burgdorferi ss, Pka de B. burgdorferi ss, IP1,IP2,IP3 de B. burgdorferi ss, Hll de B. burgdorferi ss, P1F de B. burgdorferi ss, Mil de B. burgdorferi ss, 20006 de B. burgdorferi ss, 212 de B. burgdorferi ss, ESP1 de B. burgdorferi ss, Ne-56 de B, burgdorferi ss, Z136 de B. burgdorferi ss, ia de B. burgdorferi ss, e/ou qualquer combinação das mesmas. A composição de vacina amplamente inclui de cerca de 1 x 104 a cerca de 1 x 1010 organismos por mililitro de cada respectiva cepa. Em uma modalidade particular, a vacina inclui de cerca de 1 x 106 a cerca de 5 x 109 organismos por mililitro de cada respectiva cepa. Em outra modalidade, a vacina inclui de cerca de 1,0 x 103 a cerca de 5 x 108 organismos por mililitro da (ou cada) segunda cepa e de cerca de 5,0 x 108 a cerca de 5 x 109 organismos por mililitro da primeira cepa. A composição de vacina também pode incluir um adjuvante far-maceuticamente aceitável, por exemplo, tal como, compostos de alumínio (por exemplo, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio), óleos metabolizá-veis e não metabolizáveis, polímeros de bloco, complexos estimulantes imunes, vitaminas e minerais, e CARBOPOL® (por exemplo, CARBOPOL 941). Em uma modalidade particular, o adjuvante farmaceuticamente aceitável compreende umas gotículas de óleo de tamanho mícron uniformemente dispersas em emulsão de água (por exemplo, como vendido sob a marca registrada Emulsigen®).

Opcionalmente, a composição de vacina também inclui um estimulante imune farmaceuticamente aceitável, por exemplo, citocinas, fatores de crescimento, quimocinas, sobrenadantes de culturas de células de linfóci-tos, monócitos, ou células de órgãos linfoides, preparações de células e/ou extratos de plantas, bactérias ou parasitas, ou mitógenos. A invenção também provê um método de imunizar um canino, ou outro mamífero, contra Borrelia spp. patogênica, especificamente B. burgdor- feri ss, compreendendo injetar ao canino uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina inventiva acima descrita. Tais vacinas podem incluir de cerca de 1 x 108 a cerca de 3 x 109 organismos de cada respectiva cepa, por exemplo. Vacinas podem ser administradas por uma via tal como: injeção intramuscular, injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intradérmica, administração oral, administração intranasal, e combinações das mesmas. Em uma modalidade particular, após vacinação, o canino imunizado produz anticorpos borreliacidais. A invenção também provê soro obtido de um animal vacinado contendo anticorpos borreliacidais que se ligam a OspC de B. burgdorferi ss. Similarmente, a invenção provê anticorpos purificados que se ligam a OspC. Em uma modalidade particular, o soro contém uma proporção significativa de anticorpos borreliacidais OspC7-específicos. A invenção também provê vacinas de combinação que incluem uma ou mais cepas da genoespécie de Borrelia da presente invenção em combinação com um ou mais outros patógenos e/ou imunógenos caninos, incluindo, por exemplo, imunógenos para suscitar imunidade contra vírus de sinomose canina; adenovírus canino; parvovírus canino; vírus da parainflu-enza canina; coronavírus canino; vírus da influenza canina; e/ou Leptospira serovars, por exemplo, Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira interrogans serovar icterohae-morrhagiae, e/ou Leptospira interrogans serovar pomona. Patógenos caninos adicionais que podem ser adicionados a uma vacina de combinação da presente invenção incluem organismos de Leishmania tais como Leishmania major e Leishmania infantum; Bordetella bronchiseptica] uma espécie de Mycoplasma (por exemplo, Mycoplasma cynos); vírus da raiva; organismos de anaplasma tais como anaplasma phagocytophilum e anaplasma platys; e Ehrlichia canis.

Estes e outros aspectos da presente invenção serão melhores apreciados em referência às Figuras a seguir e à Descrição Detalhada. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 é um western blot de um controle de soro de cachorro normal (NS) ou soros de um cachorro após vacinação (dia de estudo 43) com o produto de teste (TP) ou após desafio (dia de estudo 134) com carra-patos infetados com B. burgdorferí ss (NI). Observe que a presença de anticorpos infecção-específicos contra uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 20 kDa. A figura 2A é um western blot de um controle de soro de cachorro normal (NS) ou soros de coortes separadas de cachorros individuais (numerados 1-15) após vacinação com placebo e desafio de carrapatos infetados com B. burgdorferí ss (dia de estudo 134). A figura 2B é um western blot de um controle de soro de cachorro normal (NS) ou soros de coortes separadas de cachorros individuais (numerados 1-15) após vacinação com o produto de teste. Observe que a presença dos anticorpos de 20 kDa infecção-específicos em 14 (93%) cachorros vacinados com placebo (figura 2A) e 0 (p < 0,0001) cachorros vacinados com o produto de teste (figura 2B). A figura 3A é um exemplo representativo das alterações histopa-tológicas nas juntas de cachorros vacinados com placebo que foram infetados com B. burgdorferí ss. A área dentro do retângulo representa uma infiltração significativa de neutrófilos e células mononucleares características de artrite de Lyme canina. A figura 3B é um exemplo representativo da ausência das alterações histopatológicas nas juntas de cachorros de teste vacinados com produto que foram infetados com B. burgdorferí ss. A área dentro da forma oval é destituída de quaisquer neutrófilos e células mononucleares infiltran-tes. A figura 4 ilustra determinação da reatividade de OspC7 de ELISA usando soros normais (N) de indivíduos sem história anterior (quadro-revisão) de sintomas de Lyme ou relacionados a Lyme (n = 36), soros não-caracterizados de doadores de sangue (BD, n = 100) ou indivíduos que sofrem triagens de colesterol (CS, n = 100), ou soros de voluntários com fatores de sangue ou enfermidades que comumente reagem cruzado com antí-genos de B. burgdorferí ss, incluindo anticorpos antinucleares (ANA, n = 20), fator reumatoide (RF, n = 20), mononucleose (EBV, n = 10), citomegalovírus (CMV, n = 10), sífilis (SYPH, n = 13) ou febre maculosa das montanhas rochosas (RMSF n = 4). A linha sólida denota três desvios-padrão acima do valor de absorvância médio dos soros normais e reativos cruzados potenciais. Valores acima da linha correspondem aos resultados positivos a uma probabilidade de 99% (1% de valor de base). A figura 5 ilustra reatividade de ELISA de OspC7 usando soros de prováveis pacientes de doença de Lyme com eritema migratório (n = 86) representando os pacientes com lesões de Lyme típicas, provavelmente pacientes de Lyme com "lesões atípicas" (n = 22), e possíveis pacientes de Lyme com sintomas constitucionais (n = 49) [sinais clínicos mais prematuros]. A linha sólida denota três desvios-padrão acima do valor de absorvân-cía média dos soros normais e reativos cruzados potenciais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições de vacina que incluem uma quantidade imunologicamente eficaz de organismos de uma ou mais cepas de uma genoespécie de Borrelia que induz uma imunidade bor-reliacidal eficaz mediada por anticorpo no animal recipiente vacinado. Quando os organismos de tais cepas são desenvolvidos sob condições de crescimento de genoespécie de Borrelia padrão, eles são mortos na presença de anticorpos OspC-específicos, por exemplo, um anticorpo ou anticorpos suscitados em um animal vacinado com 50772 de B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439).

Em um aspecto da presente invenção, a janela de eficácia dos anticorpos induzidos por uma vacina da presente invenção é significativamente aumentada comparada somente às vacinas convencionais com base em anticorpos borreliacidais de OspA. Em outro aspecto, uma vacina da presente invenção fornece uma chance melhor de estimular uma resposta de memória imunológica benéfica, por exemplo, devido à expressão de OspC in vivo, e/ou uma proteção adicional e/ou intensificada contra múltiplas cepas patogênicas de Borrelia spp.

Em uma modalidade da presente invenção, quando os organis- mos de tais cepas são desenvolvidos sob condições de crescimento de ge-noespécie de Borrelia padrão, eles constitutivamente expressam antígeno de OspC. Em uma modalidade particular deste tipo, quando os organismos de tais cepas são desenvolvidos sob condições de crescimento de genoespécie de Borrelia padrão, eles são mortos por uma reação específica de complemento. Em ainda outra modalidade, uma proporção significativa dos anticorpos borreliacidais OspC-específicos nos soros induzidos por uma vacina compreendendo organismos de tais cepas é específica para o epítopo conservado OspC7 e, assim, fornece proteção contra múltiplas genoespécies de Borrelia patogênicas (por exemplo B. burgdorferi ss, B. afzelii, e/ou B. garini-/). Em ainda outra modalidade, organismos de tais cepas não exibem nenhum antígeno de OspA ou OspB. Em ainda outra modalidade, organismos de tais cepas têm quaisquer duas ou mais destas propriedades. Em ainda outra modalidade, organismos de tais cepas têm quaisquer três ou mais destas propriedades. Em ainda outra modalidade, organismos de tais cepas têm quaisquer quatro ou mais destas propriedades. Em uma modalidade particular, organismos de tais cepas têm todas estas propriedades. Uma tal cepa particular é 50772 de B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439).

Em uma modalidade alternativa, a vacina inventiva é uma composição que inclui tanto uma primeira cepa como descrita acima como uma quantidade eficaz de organismos de pelo menos uma segunda cepa. A segunda cepa é preferivelmente de uma genoespécie de Borrelia patogênica que induz anticorpos borreliacidais de OspA quando administrados como uma parte da vacina inventiva. Uma ou mais genoespécies de vacina compatíveis adicionais podem também ser nela incluídas. Além disso, as vacinas da presente invenção podem incluir um ou mais outros patógenos e/ou imu-nógenos mamíferos (por exemplo, caninos).

Para apreciar a invenção mais completamente, as definições a seguir são fornecidas. O uso de termos singulares para conveniência na descrição não é de forma alguma intencionado ser limitativo. Desse modo, por exemplo, referência a uma composição compreendendo "um polipeptídeo" inclui refe- rência a um ou mais de tais polipeptídeos. Além disso, referência a um "organismo" inclui referência a uma pluralidade de tais organismos, a menos que do contrário indicado.

Como aqui usado o termo "aproximadamente" é usado alterna-damente com o termo "cerca de" e significa que um valor está dentro de cinquenta porcento do valor indicado, isto é, uma composição contendo "aproximadamente" 1 X 1010 organismos por mililitro contêm de 5 X 109 a 5 X 1010 organismos por mililitro. O termo "genoespécies" foi primeiro usado e definido por G. Ba-ranton et al., 1992, International J. ofSystematic Bacteriology 42: 378-383, e é aqui usado da mesma forma que o termo "espécies" é empregado para descrever a taxonomia de organismos de não-Borrelia. "Condições de crescimento padrão" para cultivar genoespécies de Borrelia requerem crescimento em uma temperatura variando de cerca de 33°C a cerca de 35°C, em meio de BSK {Barbour Stoenner Kelly). Meio de BSK como descrito aqui foi preparado de acordo com Callister et al. [Detec-tion of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry, Seções 11.5.1 - 11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc. Suplemento 26, (2003) por este meio incorporado aqui por referência em sua totalidade], (Meio de BSK está também comercialmente disponível, por exemplo, de Sigma, St. Louis, MO).

Como aqui usado "OspC7" é um epítopo de anticorpo borreliacidal de OspC imunodominante localizado em uma região de 7 aminoácidos (Lovrich et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, incorporado por referência aqui em sua totalidade) dentro dos 50 aminoácidos C-terminais de OspC, como descrito por Callister et al. (Patentes. U. S. Nos. 6.210.676 B1 e 6.464.985 B1, que são incorporadas por referência aqui em suas totalidades) que são absolutamente conservados entre a Borrelia spp. patogênica conhecida. Esta conservação é facilmente confirmada por uma pesquisa de BLAST do segmento de códon codificando o segmento de 7 aminoácidos descrito por Lovrich et al. Uma tal pesquisa, quando conduzida no dia 9 de outubro de 2006, gerou uma lista de resultados de 100 espécies de Borrelia contendo o segmento de codificação do epítopo de 7-mer de OspC acima observado.

Um "anticorpo borreliacidal OspC-específico" é um que é encontrado, por exemplo, no soro de um animal vacinado com 50772 de B. burg-dorferi ss (ATCC No. PTA-439), e é um que seletivamente se liga a qualquer epítopo do antígeno de OspC e mata as espiroquetas dependente ou independente do complemento. Um "anticorpo borreliacidal OspC7-específico" é um que é encontrado, por exemplo, no soro de um animal vacinado com 50772 de B. burgdorferí ss (ATCC No. PTA-439), e é um que seletivamente se liga aos 7 aminoácidos C-terminais de OspC como descrito por Lovrich et aí. [Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005), incorporado por referência aqui em sua totalidade] e mata as espiroquetas (em geral induzindo um complexo de ataque de membrana mediado por complemento). A especificidade dos anticorpos borreliacidais de OspC foi bem-estabelecida. Por e-xemplo, anticorpos borreliacidais de OspC são comumente detectados em soros da doença de Lyme medindo a suscetibilidade de 50772 de B. burg-dorferi ss em um teste de anticorpo borreliacidal. Soros de pacientes humanos com enfermidades estritamente relacionadas apenas raramente (2%) contêm anticorpos reativos cruzados que também matam a cepa 50772 (descrita em detalhes por Callister, et al., 1996, Clinicai and Diagnostic Labo-ratory Immunology 3(4): 399-402). Além disso, um peptídeo ELISA que usa o epítopo borreliacidal de OspC7 precisamente captura os anticorpos borreliacidais nos soros da doença de Lyme, e soros de pacientes com outras enfermidades estritamente relacionadas apenas raramente (< 2%) contêm anticorpos reativos cruzados que também ligam o peptídeo de OspC7 (ilustrado pelas Figuras 4 e 5).

Quando uma "proporção significativa" dos anticorpos borreliacidais OspC-específicos nos soros induzidos por uma vacina for específica para o epítopo conservado OspC7, significa que há uma redução mensurável nos anticorpos borreliacidais OspC-específicos nos soros seguindo a absorção destes soros com OspC7. É preferivelmente definida como pelo menos uma redução de 2 vezes na titulação de anticorpo borreliacidal dos so- ros detectados usando 50772 de B. burgdorferi ss, e mais preferivelmente como uma redução de 2 - 4 vezes, ou maior, na titulação do anticorpo borre-liacidal dos soros seguindo a absorção destes soros com OspC7.

Uma "reação específica de complemento" é uma reação de anticorpo que requer complemento de soro para estar presente a fim de que organismo(s) de Borrelia spp. sejam mortos por um anticorpo borreliacidal.

Para o propósito desta invenção, um organismo de Borrelia burgdorferi ss "inativado" é um organismo que é capaz de suscitar uma resposta imune em um animal, mas não é capaz de infetar o animal. Os isolados de Borrelia burgdorferi ss podem ser inativados por um agente selecionado do grupo que consiste em etilenoimina binária, formalina, beta-propiolactona, timerosal, ou calor. Em uma modalidade particular, isolados de Borrelia burgdorferi ss são inativados por etilenoimina binária.

Os termos "adjuvante" e "estimulante imune" são usados alter-nadamente aqui, e são definidos como uma ou mais substâncias que causam estimulação do sistema imune. Neste contexto, um adjuvante é usado para intensificar uma resposta imune para um ou mais antígenos/isolados de vacina. Um adjuvante pode ser administrado ao animal alvo antes, em combinação com, ou após a administração da vacina. Adjuvantes da presente invenção podem ser obtidos de quaisquer de várias fontes incluindo de fontes naturais, fontes recombinantes, e/ou ser sintetizados quimicamente, etc. Exemplos de compostos químicos usados como adjuvantes incluem, mas não são limitados a compostos de alumínio, óleos metabolizáveis e não-metabolizáveis, polímeros de bloco, ISCOM’s (complexos estimulantes imunes), vitaminas e minerais (incluindo mas não limitados a: vitamina E, vitamina A, selênio, e vitamina B12), Quil A (saponinas), e polímeros de ácido acrílico reticulados com éteres de polialquenila ou divinil glicol por exemplo, CARBOPOL®. Exemplos adicionais de adjuvantes que às vezes foram referidos especificamente como estimulantes imunes, incluem componentes de parede celular bacterianos e fúngicos (por exemplo, lipopolissacarídeos, li-poproteínas, glicoproteínas, muramilpeptídeos, beta-1,3/1,6-glucanos), vários carboidratos complexos derivados de plantas (por exemplo, glicanos, acemanana), várias proteínas e peptídeos derivados de animais (por exemplo, hormônios, citocinas, fatores coestimuladores), e ácidos nucleicos novos derivados de vírus e outras fontes (por exemplo, RNA bifilamentar, CpG). Além disso, qualquer número de combinações das substâncias acima mencionadas pode fornecer um efeito adjuvante e, portanto, pode formar um ad-juvante da presente invenção. Preferiu-se que o adjuvante fosse Emulsi-gen®. 50772 de B. burgdorferí ss (ATCC No. PTA-439) como declarado na patente US No. 6.210.676, e S-1-10 de B. burgdorferí ss (ATCC No. PTA-1680) como declarado na patente US No. 6.316.005, foram depositados junto à American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard Manas-sas (VA) 20110 em 30 de julho de 1999, e 11 de abril de 2000, respectivamente. Os colaboradores dos direitos para a presente invenção individualmente detêm os direitos para estas duas patentes acima mencionadas. É também para ser entendido que esta invenção não é limitada às configurações particulares, etapas de processo, e materiais descritos aqui visto que tais configurações, etapas de processo, e materiais podem variar um pouco. É também para ser entendido que a terminologia empregada aqui é usada para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas e não é intencionada ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações em anexo e equivalentes das mesmas.

CEPAS DE VACINA ADICIONAIS CEPAS DE OspC ADICIONAIS

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de 50772 de B. burgdorferí ss (ATCC No. PTA-439) em uma vacina que protege contra doença de Lyme, ou sozinha, ou em combinação com outras cepas de ge-noespécies de Borrelia. Notavelmente, 50772 de B. burgdorferí ss foi inicialmente rejeitada como um candidato por ser útil em uma vacina porque foi incorretamente relatado que esta cepa não expressou OspC (Anderson et al„ 1996, J. Clin. Microbiol., 34:524-529). A presente invenção também provê critérios únicos e específicos para selecionar/identificar outros tais isolados úteis para vacinas da presente invenção. Em particular, os isolados podem ser selecionados/identificados que são suscetíveis a serem mortos através de anticorpos OspC-específicos, e preferivelmente, a também possuírem um ou mais ou todos os atributos a seguir: (i) a suscetibilidade a serem mortos por anticorpos OspC-específicos através de uma reação específica de complemento, (ii) a capacidade de induzirem anticorpos borreliacidais de OspC em um recipiente vacinado por aquele isolado; (iii) para uma proporção significativa dos anticorpos borreliacidais de OspC assim induzidos para serem específicos para o epítopo conservado dentro dos 7 aminoácidos C-terminais (OspC7); (iv) carecendo da capacidade para expressar OspA e OspB; e/ou (v) a capacidade de expressarem OspC constitutivamente in vitro.

A. SUPRESSÃO DA EXPRESSÃO DE OspA/B E INTENSIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DE OspC ATRAVÉS DE CONDIÇÕES DE CULTURA

Foi mostrado por Obonyo et al. (J. Clin. Microbiol. 1999, 37:2137-2141) que expressão de OspA pode ser infrarregulada, e expressão de OspC pode ser suprarregulada em um período de cinco dias cocultivando uma cepa de Borrelia spp patogênica normal (cepas JMNT e N40 de B. burgdorferí ss) com uma linhagem celular de carrapato (ISE6 de Ixodes sca-pularis). O efeito mais pronunciado foi visto cultivando a 37°C. Desse modo, este método converterá uma ou mais cepas de Borrelia patogênicas convencionais em uma forma útil para uma vacina da presente invenção.

B. SUPRESSÃO DA EXPRESSÃO DE OspA/B E INTENSIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DE OspC ATRAVÉS DE MUTAÇÃO

Em uma outra modalidade, manipulação genética de uma cepa de borrelia spp. que originalmente expressa OspA e OspB é empregada para infrarregular ou excluir os genes que codificam a expressão de OspA e OspB que resulta na suprarregulação da expressão de OspC. Qualquer método conhecido na técnica de manipulação genética é contemplado para ser empregado para este propósito. Por exemplo, um análogo inativado do gene de OspA/OspB é introduzido em uma pluralidade de organismos de uma cepa de Borrelia spp disponível na forma de um plasmídeo de Borrelia spp. compatível preparado com um marcador de seleção antibiótico (vide, por exemplo, Grimm et ah, 2004, Proc. Nat'l Acad. Sei 101(9):3142-3147, que relatam que a expressão de OspC pode ser bloqueada em uma Borrelia spp. inserindo plasmídeos de inativação e complementação de OspC em uma cepa de B31-A3 de B. burgdorferi). Eventos de recombinação entre o plas-mídeo introduzido e o plasmídeo de ocorrência natural carregando Os-pA/OspB resultará em um certo número de organismos de Borrelia spp re-combinantes com sucesso que carregam um plasmídeo de OspA/OspB mu-tado. Seleção pode ser postulada, por exemplo, por meio de uma resistência antibiótica ligada e crescimento na presença do antibiótico correspondente. Organismos de Borrelia spp. com eliminação seletiva da expressão de Os-pA/OspB são contemplados para suprarregular a expressão de OspC.

Em uma outra modalidade opcional, um ou mais organismos de B. burgdorferi ss ou Borrelia spp. adicionais que expressam OspA, OspB, e/ou um ou mais antígenos de Osp adicionais podem ser incluídos na composição de vacina como organismos adicionais.

Preferivelmente, cada respectivo organismo inativado está presente na vacina em uma concentração variando de cerca de 1 x 104 a cerca de 1 x 1010 organismos/mL. Em particular, a vacina é preferivelmente administrada a um canino em uma dose de não menos de 1,0 x 108 organis-mos/mL de S-1-10 de B. burgdorferi ss, e não menos de 5,0 x 108 organis-mos/mL de 50772 de B. burgdorferi ss.

• CEPAS DE OspA ADICIONAIS

Uma segunda cepa, fornecendo o antígeno de OspA, pode ser um isolado de B. burgdorferi de laboratório patogênico convencional ss (Bar-bour et ai., 1985, J. Clin. Microbiol. 52:478-484) tal como B-31 de B. burgdorferi ss (ATCC No. 35210). Um segundo organismo particular é a cepa de S-1-10 de B. burgdorferi ss exemplificada (ATCC No. PTA-1680). Cepas adicionais adequadas para o uso como o segundo organismo para composições de vacina otimizadas para regiões fora da América do Norte incluem, por exemplo, as cepas: B-31 de B. burgdorferi ss (ATCC No. 35210), B. af-zelii (por exemplo, disponível como ATCC No. 51567) e B. garinii (por exem- pio, disponível como ATCC Nos. 51383 e 51991), como também aquelas listadas na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 A composição de vacina pode incluir um adjuvante farmaceuti-camente aceitável. "Adjuvantes" são agentes que não especificamente aumentam uma resposta imune a um antígeno particular, desse modo reduzindo a quantidade de antígeno necessária em qualquer vacina dada, e/ou a frequência de injeção necessária para gerar uma resposta imune adequada ao antígeno de interesse. Adjuvantes adequados para a vacinação de animais incluem, mas não são limitados a, Adjuvante 65 (contendo óleo de a-mendoim, mono-oleato de manida e monoestearato de alumínio); adjuvante completo ou incompleto de Freund; géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, e alume; tensoativos, tais como hexadecilami-na, octadecilamina, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamônio, N,N-dioctadecil-N,N’-bis(2-hidroximetil)propanodiamina, metóxi-hexadecilglicerol, e polióis plurônicos; poliânions, tais como pirano, sulfato de dextrana, poli IC, ácido poliacrílico, e CARBOPOL® (por exemplo, CARBOPOL 941); peptí-deos, tais como dipeptídeo de muramila, dimetilglicina e tuftsina; e emulsões de óleo. Informação relativa a adjuvantes é descrita, por exemplo, na série por P. Tijssen [Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3a Edição, 1987, Elsevier, Nova Iorque, incorporada por referência aqui].

Opcionalmente, a composição de vacina pode também incluir um estimulante imune farmaceuticamente aceitável, tal como componentes de parede celular bacterianos e/ou fúngicos (por exemplo, lipopolissacarí-deos, lipoproteínas, glicoproteínas, muramilpeptídeos), vários carboidratos complexos derivados de plantas (por exemplo, glicanos, acemanana), várias proteínas e peptídeos derivados de animais (por exemplo, hormônios, citoci-nas, fatores coestimuladores), e ácidos nucleicos novos derivados de vírus e/ou outras fontes (por exemplo, RNA de fita dupla, CpG). A composição de vacina é facilmente administrada por qualquer via padrão incluindo vacinação intravenosa, intramuscular, subcutânea, oral, intranasal, intradérmica, e/ou intraperitoneal. O artesão apreciará que a composição de vacina seja preferivelmente formulada apropriadamente para cada tipo de animal recipiente e via de administração.

Desse modo, a presente invenção também provê métodos de imunizar um canino contra B. burgdorferi ss e outra Borrelia spp. Um tal método compreende injetar em um canino uma quantidade imunologicamente eficaz de uma vacina da presente invenção, de forma que o canino produza anticorpos borreliacidais de OspA e OspC apropriados.

Em uma modalidade, a administração subcutânea da presente invenção resulta na produção de concentrações altas de anticorpos borreliacidais de OspA e OspC incluindo anticorpos borreliacidais específicos para OspC7. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma vacina compreendendo uma quantidade específica, mínima de cada cepa de B. burgdorferi ss que seja eficaz contra Borrelia prejudicial spp. Em outra modalidade, uma vacina da presente invenção é eficaz para a prevenção de B. burgdorferi ss e outras infecções Borrelia spp. patogênicas em cachorros.

Em uma modalidade particular, a vacina compreende uma combinação segura e imunologicamente eficaz de duas cepas de B. burgdorferí da presente invenção e um adjuvante farmaceuticamente aceitável. A presente invenção revela que uma vacina compreendendo uma quantidade mínima específica de dois isolados de B. burgdorferí ss protege cachorros de Borrelia spp. seguindo desafio de carrapato. A presente invenção também descreve uma vacina que suscita quantidades mínimas específicas de anticorpos borreliacidais de OspA específicos para B. burgdorferí e de OspC específicos para Borrelia spp. em cachorros vacinados. As vacinas da presente invenção também podem ser administradas com um estimulante e/ou adjuvante imune aceitável.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir servem para fornecer outra avaliação da invenção, mas não são destinados a restringir o escopo eficaz da invenção de forma alguma. EXEMPLO 1 VACINAÇÃO COM OspA RECOMBINANTE A. MATERIAIS E MÉTODOS • ANIMAIS: Hamsters LVG de cinco a 10 semanas de idade foram obtidos de Charles River Breeding Laboratories, Inc. (Wilmington, Massa.). Os hamsters foram alojados três ou quatro por gaiola em uma temperatura ambiente de 21°C e providos com alimento e água adlibitum. • VACINAÇÃO DOS HAMSTERS E COLETÂNEA DO SORO: Hamsters foram vacinados subcutaneamente na parte de trás do pescoço com 0,5 ml de uma vacina de OspA recombinante comercialmente disponível (rOspA), RECOMBITEK® Lyme (Merial Limited, Duluth, GA), e dado um reforço três semanas após a vacinação primária. Em 3, 7, 9, e 15 semanas após a vacinação primária, grupos de cinco hamsters cada foram suavemente anestesiados por inalação de éter contido em um copo de nariz-e-boca e sangrados através de punção intracardíaca. O sangue foi deixado coagular, e o soro foi separado e armazenado a -70°C até o uso. Além disso, soros de hamster de três hamsters não vacinados foram agrupados e usados como um controle de soro normal. Como um controle adicional, 20 hamsters foram vacinados em ambas as coxas traseiras com 0,25 ml de uma vacina da doença de Lyme canina de célula inteira comercialmente disponível (Galaxy, Solvay Animal Health, Inc., Mendota Heights, Minn., agora Schering-Plough Animal Health, Elkhorn, Nebraska) que continha S-1-10 de B. burgdorferi ss. Aos animais foram dados um reforço, e os soros foram colhidos como descrito acima. • PREPARAÇÃO DO MEIO DE BSK: Meio de cultura de Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) foi usado para cultivo in vitro de B. burgdorferi e foi o substrato primário usado no teste de anticorpo borreliacidal e em métodos descritos ao longo do presente pedido de patente. Meio de BSK foi preparado como descrito por Callister et al., [Detection of Borre/Zacidal Antibodies by Flow Cytometry, Seção 11.5.1 -11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc., Suplemento 26, (2003) por este meio incorporada por referência aqui em sua totalidade. Em resumo, o meio de BSK foi preparado pelo método a seguir. MATERIAIS: HEPES (Sigma) Neopeptona (Difco) Citrato de sódio (Sigma) Glicose (Sigma) Bicarbonato de sódio (Sigma) Eastolato de TC (Difco) Ácido pirúvico (Sigma) N-acetil glicosamina (Sigma) Albumina de soro bovino (Sigma) Gelatina (tipo microbiológica; Difco) NaOH a 5N 10x meio de Connaught Medicai Research Laboratories (CMRL) 1066 (MP Biomedicals) ou Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma) com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio Soro de coelho (Life Technologies), inativado por calor 45 min a 56°C. banho de água de 56°C Bomba de pressão positiva Tubulação de filtro Millipore Pré-filtro (124 mm) Filtros 0,2, 0,45 e 0,8 pm (diâmetro de 142 mm) filtros de sino de 0,2 pm Recipientes estéreis de 100 ml Microscópio de campo escuro PREPARAÇÃO DO MEIO DE BSK 1. O seguinte foi combinado em um frasco de 2 litros, com de 2 a 4 horas de mistura. 900 ml de Mini-Q filtro em dobro ou água destilada deionizada: 6.0 g de HEPES 5.0 g de neopeptona 0,7 g de citrato de sódio 5.0 g de glicose 2,2 g de bicarbonato de sódio 2,5 g de eastolato de TC 0,8 g de ácido pirúvico 0,4 g de N-acetil glicosamina 50 g de albumina de soro bovino (fração V) 2. Os componentes foram lentamente misturados usando o ajuste mais lento da placa de agitação porque agitação vigorosa pode resultar em produtos de desarranjo tóxico para B. burgdorferi. 3. Embora os componentes de BSK fossem misturados, a solução de gelatina foi preparada como segue: em um frasco de 500 ml, 200 ml de Milli-Q filtrado em dobro ou água destilada deionizada e 14 g de gelatina foram combinados e aquecidos em um ajuste médio com agitação para dissolver. A solução foi depois autoclavada por 15 min a 121°C, e depois colocada em um banho de água de 56°C. 4. Quando componentes de BSK foram dissolvidos completamente, a solução foi ajustada para pH 7,5 com NaOH a 5N. 5. A solução de gelatina 200 ml, 100 ml de lOx meio de CMRL 1066 e 64 ml de soro de coelho inativado por calor (45 min a 56°C) foram depois combinados com os outros componentes de BSK e completamente misturados.

MEIO DE BSK ESTERILIZADO 6. Usando a bomba de pressão positiva, o meio de BSK foi bombeado através da tubulação de filtro Millipore carregada com um pré-filtro de 124 mm e filtros de 142 mm de diâmetro de poro de 0,2, 0,45 e 0,8 pm empilhados de tamanho de poro menor (fundo) para maior (topo). [O meio de BSK não pode ser esterilizado por autoclave. Pré-filtração foi necessária para remover os particulados grandes antes da esterilização por filtro], 7. O meio de BSK foi depois esterilizado por filtro em um recipiente estéril usando a bomba de pressão positiva e um filtro de sino estéril de 0,2 pm.

ESTERILIDADE CONFIRMADA 8. Uma alíquota de BSK estéril de 1 ml foi assepticamente removida e transferida para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, e incubada durante a noite a 35°C. O BSK esterilizado por filtro restante foi armazenado a 4°C. 9. Seguindo a incubação, o BSK estéril foi examinado usando microscopia de campo escuro para confirmar a esterilidade. 10. O BSK estéril foi depois transferido para recipientes de armazenamento estéreis. O espaço livre foi mantido a um mínimo ao encher os recipientes de armazenamento para reduzir a oxidação do meio de BSK estéril], CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIO DE BARBO U R-ST Ο ΕΝ N ER-KE LLY (BSK) Antes de usar o meio de BSK, é importante ter certeza que BSK suporta o crescimento de números pequenos de Borrelia spp. e que as espi- raquetas viáveis crescem sem se aglutinarem. Um componente altamente variável do meio de BSK é albumina de soro bovino (BSA). O protocolo de controle de qualidade empregado aqui utilizou culturas de teste para incubar e inspecionar as culturas resultantes, como descrito em detalhes por Callis-teretal., 2003, id. • DETECÇÃO DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS DE OspA: Anticorpos borreliacidais de OspA foram detectados usando um procedimento citométrico de fluxo e S-1-10 de B. burgdoríeri ss (Callister et al., Arch. Intem. Med. 1994, 154:1625-1632). Uma cultura fresca das espiro-quetas foi diluída com BSK fresco a uma concentração de aproximadamente 5 x 106 espiroquetas/mL. Concomitantemente, as amostras foram diluídas de soro 1:40 com BSK fresco e esterilizadas através de passagem através de um filtro de microcentrífuga de tamanho de poro de 0,2 micron (pm). Uma alíquota de 200 pl foi depois transferida para um tubo de microcentrífuga estéril de tampa com rosca de 1,5 ml e serialmente diluída em BSK de 1:80 a 1:20.480. As amostras de soro foram inativadas a calor a 56°C por 10 min, e uma alíquota de 100 μΙ da suspensão de espiroqueta (5 x 105 espiroque-tas) e 10 pL de complemento de cobaia estéril (Sigma) foi adicionada. Os ensaios foram completamente misturados e incubados durante 16-24 horas a 35°C.

Seguindo a incubação, 100 pl de cada suspensão de ensaio foram transferidos para um tubo de polipropileno contendo 400 pl de PBS e 1 pg/ml de acridina laranja. Um citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) foi depois usado para detectar a atividade borreliacidal. Espiroquetas foram isoladas através da região GATE (software CelIQuest, Becton Dickinson) e analisadas por 1-2 min com a taxa de fluxo ajustada para baixo. Os anticorpos borreliacidais de OspA foram detectados indiretamente monitorando a intensidade de fluorescência aumentada que ocorre quando a acridina laranja intercala em espiroquetas bo-Ihantes não viáveis. Um deslocamento > 13% na intensidade de fluorescência média comparada a um controle de soro normal foi considerado positivo (Callister et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9:908-912). A presença de B. burgdorferi bolhante, não móvel foi depois confirmada por microscopia de campo escuro. Um controle positivo foi incluído com cada ensaio, e reativi-dade idêntica (+/- uma diluição) de operação para operação foi requerida para minimizar a variabilidade de interensaio. Além disso, as amostras de soro colhidas de cada cachorro foram simultaneamente ensaiadas.

B. RESULTADOS

Vacinação com a vacina de rOspA induziu apenas quantidades mínimas (titulação média < 61) de anticorpos borreliacidais de OspA após 7 semanas que não foram detectadas após 15 semanas (Tabela 2). Em contraste, hamsters vacinados com a vacina canina que continha uma cepa de B. burgdorferi ss típica (Barbour et al., J. Infect. Dis. 1985, 152-478-484) (S-1-10) induziu níveis altos de anticorpos borreliacidais de OspA que teve um pico em 7 semanas (titulação > 2560) e permaneceu elevado pela duração do estudo. TABELA 2. Titulação3 média de anticorposb borreliacidais de OspA após vacinação com vacinas de doença de Lyme canina de rOspA ou GALAXY® (S-1-10). 3 Diluição recíproca. b Detectados usando S-1-10 de B. burgdorferí ss. c ND = Nada detectado. A vacina de OspA recombinante canina, portanto, não suscita titulações significativas de anticorpos borreliacidais de OspA em hamsters. EXEMPLO 2 VACINAÇÃO COM OspC RECOMBINANTE A. MATERIAIS E MÉTODOS •ANIMAIS: Hamsters LVG de cinco a 10 semanas de idade foram obtidos de Charles River Breeding Laboratories, Inc. (Wilmington, Massa.). Hamsters foram alojados três ou quatro por gaiola a uma temperatura ambiente de 21°C e providos com alimento e água ad libitum. • PREPARAÇÃO DE VACINA DE OspC RECOMBINANTE (V) rOspC foi restabelecido de JM109 de E. coli contendo pX3-22 como previamente descrito (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). Brevemente, o E. coli foi cultivado a 37°C em meio de cultura 2xTY contendo ampicilina, e isopropil-3-d-galactopiranosídeo (IPTG) {0,1 mM) foi adicionado durante a fase de crescimento exponencial. As células foram pe-letizadas através de centrifugação, ressuspensas em solução salina tampo-nada com fosfato (PBS), e lisadas por sonicação. Triton X-100 (1% em vol/vol) foi adicionado, e o lisado foi centrifugado a 10.000 x g por 5 min. As células de E. coli sonicadas foram depois peletizadas através de centrifugação, e o sobrenadante foi passado em uma coluna contendo resina SoftLink (Promega) que ligou o OspC por meio de um marcador de purificação biotini-lado no término de amino. O OspC ligado foi depois eluído com um tampão de purificação que também continha biotina a 5 mM (Sigma). • VACINAÇÃO DE HAMSTERS E COLETÂNEA DE SORO: Hamsters foram vacinados subcutaneamente na parte de trás do pescoço com 0,1 ml do adjuvante completo de Freund que continha 75 pg de rOspC e depois dado um reforço de 75 pg de rOspC em 0,1 ml do adjuvante incompleto de Freund três semanas após a vacinação primária. Em 5 semanas após a vacinação primária, os hamsters foram ligeiramente anestesiados por inalação de éter contida em um copo de nariz-e-boca e sangrados através de punção intracardíaca. O sangue foi deixado coagular-se, e o soro foi separado e armazenado a -70°C até o uso. Além disso, soros de hamster de três hamsters normais foram agrupados e usados como um controle de soro normal. • DETECÇÃO DOS ANTICORPOS DE OspC: rOspC foi diluído em 1000 ng/mL de tampão carbonato (Na2C03 a 0,015 M, NaHC03 a 0,035 M, pH 9,6) e 100 μΙ de quantidades foram adicionados aos poços de microtitulação de ligação de amina de fundo achatado individuais (Costar, Cambridge, Massa.). As placas de microtitulação foram incubadas durante a noite a 4°C. Após incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS (pH 7,2) e bloqueadas com PBS contendo 0,05% de TWEEN 20 (Sigma) e 1% de albumina de soro bovino (Sigma) durante 1 hora em temperatura ambiente com agitação. Após bloquear, placas foram lavadas novamente com PBS. Subsequentemente, 100 μΙ de quantidades de soro de hamster serialmente diluído de 1:80 a 1:20, 480 em PBSfiween foram adicionados aos poços individuais, e as placas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente. Seguindo incubação, as placas foram lavadas três vezes com PBS, 100 μΙ de conjugado de peroxidase raiz-forte de IgG anti-hamster (Organon Teknika Cappel) diluído 1:3000 em PBS/Tween foram adicionados a cada poço, e as placas foram reincubadas em temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram depois lavadas 3 vezes com PBS e 100 μΙ de fosfato de o-fenilenodiamina (0,4 mg/ml; Sigma) foram adicionados a cada poço e deixadas incubar em temperatura ambiente durante 30 min. As reações foram interrompidas adicionando 100 μΙ de H2S04 a 1 N e absorbâncias a 490 nm (modelo EL 311; Bio-Tek Inc. Winooski, Vt.) foram imediatamente determinadas. • DETECÇÃO DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS DE OspC: Anticorpos borreliacidais de OspC foram detectados como descrito acima (Exemplo 1), exceto 50772 de B. burgdorferi ss foi usado.

B. RESULTADOS

Vacinação com a vacina de rOspC induziu níveis altos de anticorpos de OspC detectados por ELISA (Tabela 3, infra), mas apenas um nível baixo (titulação 80) de atividade borreliacidal estava presente. A vacinação com rOspC tinha induzido concentrações altas de anticorpos de OspC portanto, mas a resposta foi quase completamente compreendida de anticorpos (por exemplo, opsonização) que não forneceria proteção contra a infecção. Isto foi especialmente significativo quando considerou-se a concentração de 75 pg de proteínas na vacina de 50772 de B. burgdorferi ss foi cal- culada sem responder pela presença de numerosas proteínas de não-OspC adicionais. Os resultados coletivos (Exemplos 1 e 2), portanto, confirmaram os achados anteriores (Straubinger et al. Vaccine 2003, 20:181-193) que Osps recombinante estimulou significativamente menos quantidades de anticorpos borreliacidais que B. burgdorferí ss intacto. TABELA 3. Titulação3 média dos anticorpos detectados por ELISA de OspC ou testeb de anticorpo borreliacidal de OspC após vacinação com rOspC. 3 Diluição recíproca de soro agrupado de 5 hamsters. b Detectado usando 50772 de B. burgdorferí ss c ND = Nenhum detectado. A vacina de OspC recombinante canina, portanto, não suscita titulações significativas de anticorpos borreliacidais de OspC em hamsters. EXEMPLO 3 VACINAÇÃO COM ISOLADO DE S-1-10 DE B. burgdorferí ss A. MATERIAIS E MÉTODOS • ORGANISMO: S-1-10 de B. burgdorferí ss é uma cepa patogênica típica em geral indistinguível de B31 de B. burgdorferí ss (Barbour et al., J. Infect. Dis., 1985, 152:478-484). O isolado foi originalmente restabelecido por Dr. Steven M. Callister, Gundersen Lutheran Medicai Foundation, La Crosse, Wl, do rim de um camundongo de pata branca, Peromyscus leucopus, capturado em fevereiro de 1988 de um sítio perto de La Crosse, Wl, e foi licenciado por Solvay Animal Health para incorporação em uma vacina da doença de Lyme canina. O produto comercial subsequente (GALAXY® Lyme) foi adquirido por Schering Plough Animal Health no dia 17 de abril de 1997. O organismo expressa OspA, OspB, e OspC. Porém, como é típico de isolados infecciosos de B. burgdorferí ss, concentrações significativamente mais altas de OspA e OspB são produzidas quando as espiroquetas forem cultivadas em meio de BSK laboratorial. Foi mostrado que a expressão de OspC pode ser maximizada mediante incubação a 35°C (Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112).

•ANIMAIS

Filhotes de cachorro Bigle de oito semanas de idade (Ridglan Farms, Monte Horeb, Wl) foram alojados juntos, e alimento e água foram disponíveis ad libitum. O experimento foi revisado e aprovado pelo Schering Plough Animal Health Animal Care and Use Commmitee (IACUC). • PREPARAÇÃO DA VACINA DE S-1-10 DE B. burgdorferi ss: Uma cultura fresca de S-1-10 de B. burgdorferi ss que tinha alcançado fase de crescimento logarítmica através de incubação em BSK a 35°C foi inativada adicionando etilenoimina binária (BEI) em uma concentração final de 10 mM e incubando durante um adicional de 48 horas. Após ina-tivação, a BEI foi neutralizada adicionando tiossulfato de sódio estéril e incubando a 35°C durante 6 a 12 horas. As espiroquetas foram depois peletiza-das por centrifugação e ressuspensas em solução salina equilibrada estéril contendo < 30 pg de gentamicina/mL e < 30 unidades de nistatina/mL. As espiroquetas foram depois misturadas com 5% de Emulsigen® (MVP Laboratories, Inc.) e 1% de HEPES de forma que uma dose de 1,0 ml continha > 2,5 x 107 espiroquetas. • VACINAÇÃO E COLETA DE SORO: Os cachorros foram subcutaneamente vacinados no pescoço com uma dose de 1 ml da vacina de S-1-10 e reforçados com uma dose adicional de 1 ml após 21 dias. Sangue total foi colhido imediatamente antes da vacinação de reforço (dia de estudo 21) e nos dias de estudo 28, 35, 47, 83, e 113 por punção venosa da veia jugular. O soro foi separado por centrifugação e armazenado a -20°C até testado. • DETECÇÃO DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS: Anticorpos borreliacidais de OspA e OspC foram detectados por citometria de fluxo empregando S-1-10 e 50772 de B. burgdorferi ss, como descrito acima nos Exemplos 1 e 2.

B. RESULTADOS

Vacinação com S-1-10 de B. burgdorferí ss confiantemente induziu níveis altos de anticorpos borreliacidais de OspA que foram detectáveis no dia de estudo 21, com pico no dia de estudo 28, e permaneceram detectáveis no dia de estudo 113 (Tabela 4, infra). Em contraste, anticorpos borreliacidais de OspC não foram detectados (titulação menor que 1:80). Desse modo, a cepa de B. burgdorferí ss convencional não induziu a produção de anticorpos borreliacidais de OspC apesar de maximizar a expressão de OspC incubando as espiroquetas a 35°C. TABELA 4. Titulações3 médias (n = 8) de anticorpos borreliacidais de OspA ou OspC após vacinação com S-1-10 de B. burgdorferí ss. 3 Diluição recíproca. b Detectado usando S-1-10 de B. burgdorferí ss. c Detectado usando 50772 de B. burgdorferí ss. d ND = Nenhum detectado.

Portanto, uma vacina empregando isolados de S-1-10 de B. burgdorferí ss não suscita uma titulação significativa de anticorpos borreliacidais de OspC. EXEMPLO 4 VACINAÇÃO COM ISOLADO 50772 DE B. burgdorferí ss A. MATERIAIS E MÉTODOS • ORGANISMO: 50772 de B. burgdorferí ss é uma cepa única de ospA-/ospB originalmente relatada por Anderson etal., J. ofClin. Microbiol., 1996, 34:524-529, que falhou em identificá-la como expressando antígeno de OspC. A cepa 50772 é descrita na patente U. S. No. 6.464.985, incorporada aqui por referência em sua totalidade, como expressando antígeno de OspC, e esta cepa é relatada por aquela patente U. S. conforme depositada com o ATCC como No. PTA-439. •ANIMAIS: Filhotes de cachorro Bigle de oito semanas de idade (Ridglan Farms, Monte Horeb, Wl) foram alojados juntos, e alimento e água foram disponíveis ad libitum. O experimento foi revisado e aprovado pelo Schering Plough Animal Health Animal Care and Use Committee (IACUC). • PREPARAÇÃO DA VACINA DE 50772 de B. burgdorferi ss: Vacina de 50772 de B. burgdorferi ss foi preparada como descrito acima no Exemplo 3. • VACINAÇÃO E COLETA DE SORO: Cachorros foram subcutaneamente vacinados no pescoço com uma dose de 1 ml da vacina 50772 e reforçados com uma dose adicional de 1 ml após 21 dias. Sangue total foi colhido imediatamente antes da vacinação de reforço (dia de estudo 21) e nos dias de estudo 28, 35, 47, 83, e 113 por punção venosa da veia jugular. O soro foi separado por centrifugação e armazenado a -20°C até testado. • DETECÇÃO DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS: Anticorpos borreliacidais de OspC foram detectados por citome-tria de fluxo empregando 50772 de B. burgdorferi ss como descrito acima mos Exemplos 1 e 2.

B. RESULTADOS

Vacinação com 50772 de B. burgdorferi ss confiantemente induziu níveis altos de anticorpos borreliacidais de OspC com pico no dia de estudo 35 e permaneceu detectável no dia de estudo 113 (Tabela 5, infra). Desse modo, em contraste com as vacinações com rOspC ou um isolado de B. burgdorferi ss tradicional (S-1-10), vacinação com a cepa única de 50772 de B. burgdorferi ss induziu níveis significativos de anticorpos borreliacidais de OspC. TABELA 5. Titulação3 média (n = 8) de anticorpos13 borreliacidais de OspC após vacinação com 50772 de B. burgdorferi ss.________________ 3 Diluição recíproca. b Detectados usando 50772 de B. burgdorferí ss. c ND = Nenhum detectado.

Portanto, uma vacina compreendendo os isolados de 50772 de B. burgdorferí ss induz concentrações altas de anticorpos borreliacidais de OspC. EXEMPLO 5 PREPARAÇÃO DE UMA VACINA COMPREENDENDO ISOLADOS DE S-1-10 E 50772 DE B. burgdorferí ss A. MATERIAIS E MÉTODOS • CRESCIMENTO: Culturas de matéria-prima congelada de S-1-10 de B. burgdorferí ss e 50772 de B. burgdorferí ss foram cultivadas sob condições padrão, isto é, as culturas de matéria-prima foram desenvolvidas a 33 ± 2°C e 35 ± 2°C, respectivamente, em tubos de cultura com tampa com rosca individuais contendo 5 a 17 ml de meio de BSK (Barbour Stoenner Kelly) [preparado de a-cordo com Callister et al., 1990, J. of Clinicai Microbiology 28: 363-365, por este meio incorporada por referência em sua totalidade aqui] sob uma atmosfera de ar enriquecida com 5% de C02. Após alcançar crescimento loga-rítmico, as culturas foram usadas para inocular 150 a 200 ml de meio de BSK fresco, que foi incubado em seguida até que as culturas alcançassem crescimento logarítmico. As suspensões resultantes foram depois usadas para inocular 5 a 10 litros de BSK fresco contido em jarros de 10 a 20 litros (cultura de produção) antes de uma incubação adicional, como descrito acima. • IN ATIVAÇÃO: As espiroquetas nas culturas de produção foram inativadas adicionando BEI a uma concentração de 10 mM e incubando com agitação lenta durante 24 a 48 horas. Após inativar as espiroquetas, o BEI foi neutralizado adicionando 10,6 ml de 3,015 M de tiossulfato de sódio estéril para cada litro de suspensão de BSK/espiroqueta e incubando com agitação lenta durante 6 a 12 horas. • CONCENTRAÇÃO E MISTURA: Espiroquetas inativadas foram peletizadas por centrifugação e ressuspensas em uma solução de sal equilibrada estéril contendo 30,0 pg/ml de gentamicina e 30 unidades/mL de nistatina. A vacina de teste foi misturada com 5% de Emuisigen® (MVP Laboratories, Inc.) e enchida em frascos de vidro de 2,0 ml assim cada dose (1,0 ml) continha > 2,5 x 107 organis-mos/mL de S-1-10 de B. burgdorferi ss, > 5,0 de x 108 organismos/mL de 50772 de B. burgdorferi ss, 1% de HEPES, 29 pg/ml de gentamicina, e 29 unidades/mL de nistatina. EXEMPLO 6 SEGURANÇA E EFICÁCIA DE UMA VACINA COMPREENDENDO ISOLADOS DE S-1-10 E 50772 DE B. burgdorferi ss A. MATERIAIS E MÉTODOS •ANIMAIS: Filhotes de cachorro Bigle de oito semanas de idade (Ridglan Farms, Mount Horeb, Wl) foram alojados individualmente ou juntos, e alimento e água foram disponíveis ad libitum. O experimento foi revisado e a-provado pelo Schering Plough Animal Health Animal Care and Use Commit-tee (IACUC). • VACINAÇÃO E COLETA DOS SOROS: Cachorros foram subcutaneamente vacinados no pescoço com uma dose da vacina de 1 ml e reforçados com uma dose adicional de 1 ml após 21 dias. Sangue total foi colhido antes da vacinação inicial (dia de estudo -3) e de reforço (dia de estudo 21) e também nos dias de estudo 28, 35, 43, 78, 106, 134, 162, e 197 por punção venosa da veia jugular. O soro foi separado por centrifugação e armazenado a -20°C até testado. • OBSERVAÇÕES DE PÓS-VACINAÇÃO: Após cada vacinação, os locais de injeção foram apalpados diariamente até que nenhuma reação pudesse ser sentida, e as temperaturas retais foram registradas 4-6 horas pós-vacinação e nos dias 1-3 pós-vacinação. • DESAFIO DE CARRAPATO: Três semanas após a segunda vacinação, os cachorros foram raspados no lado direito da cavidade torácica, e carrapatos I. scapularís infe-tados com B. Burgdorferi ss, 10 fêmeas e 10 machos, foram colocados em um copo de borracha que foi prendido à área raspada com fita e envoltura de bandagem. Os carrapatos foram deixados alimentar-se durante 7 dias. • DETECÇÃO DE B. burgdorferi ss NOS CARRAPATOS: As partes da boca dos carrapatos foram removidas através de escalpelo, e os intestinos foram cortados e besuntados sobre as lâminas de vidro e deixados secar durante a noite em temperatura ambiente. Após secagem, as lâminas foram fixadas em acetona por 8-10 min e secadas ao ar. Anticorpo monoclonal de OspA de camundongo espécie-específico H5332 foi diluído 1:40 em PBS (pH 7,2) e revestido com anticorpo de imunoglobuli-na G marcado com isotiocianato de fluoresceína de anticamundongo de cabra diluído 1:500 em PBS. Após incubação, as lâminas foram enxaguadas com PBS, secas ao ar, e examinadas através de microscopia de fluorescência. Cada lâmina foi examinada independentemente por dois microbiologis-tas experientes. •AMOSTRAS DE SANGUE: Sangue total foi colhido em tubos de transporte de separação de soro (ssT) nos dias de estudo 78,106,134, 162, e 197, e o soro foi separado e armazenado a -20°C até testado. • REMOÇÃO DOS ANTICORPOS DE OspA: (r)OspA recombinante foi restabelecido de Escherichia coli ("£. coli') DH5a (expressando proteína de fusão de OspA-glutationa-S-transferase como previamente descrito (Callister et al., J. Infect. Dis. 1993, 167:158-164). Brevemente, o E. coli foi cultivado a 37°C em meio de cultura de 2xTY contendo ampicilina, e isopropil-P-d-galactopiranosídeo ("IPTG") (0,1 mM) foi adicionado durante a fase de crescimento exponencial. As células foram peletizadas através de centrifugação, ressuspensas em solução salina tamponada de fosfato ("PBS"), e lisadas através de sonicação. Triton X-100 (1% em vol/vol) foi adicionado, e o lisado foi centrifugado a 10.000 x g durante 5 minutos (min.). O sobrenadante contendo a proteína de fusão foi depois passado em uma coluna de glutationa-Sefarose 4B (Pharmacia), e o OspA recombinante foi eluído com Tris-CI a 50 mM (pH 8,0) mais glutationa a 5 mM reduzida e ressuspenso em tampão de purificação ( Tris a 50 mM [pH 8], NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 0,1% deTriton X-100). A proteína de fusão de rOspA foi depois ligada à Sefarose 4B mediante ativação de brometo de cianogênio (CNBr). Especificamente, 0,8 g de Sefarose 4B ativada com CNBr (Pharmacia) foi lavado com tampão de acoplamento ( NaHC03 a 0,1 M -NaCI a 0,5 M, pH 8,3), uma quantidade de OspA de 2 mg em tampão de acoplamento foi adicionada ao gel, e a mistura foi suavemente agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. Após o gel ter sido lavado duas vezes com tampão de acoplamento, 4 ml de etano-lamina (pH 9) foram adicionados, e o gel foi incubado durante 2 horas para bloquear os sítios não-ligados. O gel foi lavado três vezes com 50 ml de acetato de sódio a 0,1 M - NaCI a 0,5 M (pH 4,0) e depois equilibrado em PBS. Uma amostra de 1 ml de soro imune diluído dez vezes em PBS foi passada na coluna quatro vezes. • REMOÇÃO DOS ANTICORPOS DE OspC: rOspC foi restabelecido de JM109 de E. coli contendo pX3-22 como previamente descrito (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). Produção da proteína recombinante foi induzida como descrita acima para rOspA. As células sonicadas de E. coli foram depois peletizadas através de centrifugação, e o sobrenadante foi passado em uma coluna contendo resina SoftLink (Promega) que se ligou ao OspC por meio de um marcador de purificação biotinilado no término amino. O OspC ligado foi depois eluído com um tampão de purificação que também continha biotina a 5 mM (Sigma).

Um volume de 1 ml de resina de avidina tetramérica Tetralink (Promega) foi depois lavado, suspenso em 40 ml de PBS, e carregado sobre uma coluna de polipropileno de 10 mm por 70 mm. Uma quantidade de 0,5 mg de rOspC dialisado em um 1 ml de volume de PBS foi passada na coluna e ligação foi confirmada através de ensaio de proteína (Bio-Rad). Um volume de 1 ml de soro imune diluído dez vezes em PBS foi passado na coluna quatro vezes. • REMOÇÃO DOS ANTICORPOS OspC7-ESPECÍFICOS: Uma proteína de fusão contendo os 7 aminoácidos C-terminais de OspC (OspC7) foi restabelecida de JM109 de E. coli contendo pXT7 como previamente descrito (Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751, incorporado por referência aqui em sua totalidade). Produção da proteína recombinante foi induzida como descrito acima para rOspA. As células de E. coli sonicadas foram depois peletizadas através de centrifugação, e o sobrenadante foi passado em uma coluna contendo resina SoftLink (Promega) que se ligou ao 0spC7 por meio de um marcador de purificação biotinilado no término amino. O OspC7 ligado foi depois eluído com um tampão de purificação que também continha biotina a 5 mM (Sigma). Um volume de 1 ml de resina de avidina tetramérica de Tetralink (Promega) foi depois lavado, suspenso em 40 ml de PBS, e carregado sobre uma coluna de polipropileno de 10 mm por 70 mm. Uma quantidade de 0,5 mg de rOspC submetido à diálise em um volume de 1 ml de PBS foi passada na coluna e ligação foi confirmada através de ensaio de proteína (Bio-Rad). Um volume de 1 ml de soro imune diluído dez vezes em PBS foi passado na coluna quatro vezes. • DETECÇÃO DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS: Anticorpos borreliacidais de OspA e OspC foram detectados por citometria de fluxo empregando S-1-10 e 50772 de B. burgdorferi ss como descrito acima nos Exemplos 1 e 2. • BIÓPSIAS DA PELE: Biópsias da pele foram tiradas de locais adjacentes da fixação do carrapato nos dias de estudo 78, 106, 134, 162, e 197 com um dispositivo de punção descartável de 4 mm. As biópsias foram colocadas em tubos separados contendo 9 ml de BSK (Callister et. al, J. Clin. Microbiol. 1990, 28:363-365) suplementados com gelatina (BSK+G), 40-50 microgramas (μ-g)/mL de rifampina, e 8 pg/ml de canamicina. As culturas foram incubadas a 35° ± 2°C durante 3 semanas e semanalmente examinadas através de mi-croscopia de campo escuro para espiroquetas. • SUPRESSÃO IMUNE: Cachorros foram imunossuprimidos por administração diária de dexametasona (0,88 mg/kg (0,4 mg/lb) do peso do corpo) durante 5 dias começando 13 semanas pós-desafio. • OBSERVAÇÕES CLÍNICAS: Cachorros foram observados diariamente para distúrbios dos membros/juntas incluindo firmeza (relutante para colocar peso total nos membros), manqueira (favorecer um membro ao caminhar ou correr), ou co-xeadura (não carregando nenhum peso). Registro foi feito pelos consensos de pelo menos dois observadores, e os cachorros foram examinados pelo Veterinário Assistente para reger qualquer outra lesão externa. • NECROPSIA: Cachorros que tiveram distúrbios dos membros/juntas pelo menos 3 períodos de observação sucessivos foram submetidos à eutanásia e submetidos à necropsia. Amostras de tecido do cotovelo, carpo, joelho, tarso, coração, baço, bexiga, e ambos os rins foram colhidas e processadas para isolamento de B. burgdorferi através de cultura. Tecidos das juntas foram cultivados em tubos individuais contendo 9 ml de BSK+G. Outros tecidos (coração, baço, bexiga urinária, e rins) foram combinados com 9 ml de BSK+G, homogeneizados completamente com um homogeneizador, e uma quantidade de 1 ml foi transferida para um tubo separado contendo 9 ml de BSK+G fresco. As culturas foram incubadas a 35 ± 2°C.

Os cachorros restantes foram submetidos à eutanásia e submetidos à necropsia ao término do estudo. As amostras de tecido destes cachorros foram colhidas da cápsula da junta e tendão do cotovelo, carpo, joelho, e tarso e armazenadas em 10% de formalina tamponada para exame de histopatologia. Além disso, as amostras das cápsulas da junta do cotovelo, carpo, joelho, e tarso foram colocadas em tubos individuais contendo 9 ml de BSK+G ou BSK+G com antibióticos e incubadas a 35 ± 2°C durante 3 semanas. •WESTERN BLOT: Western blot foi executado usando técnicas padrão. B. burgdor-feriss 297 foi fervido em tampão de amostra por 5 min e 150 pg de proteína total foram carregados sobre um gel de 0,1% de SDS-12% de poliacrilamida (4% de gel de empilhamento de poliacrilamida sem pente). As concentrações de proteína foram determinadas com um kit de determinação de proteína, e dois géis foram passados simultaneamente em uma unidade de eletro-forese. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose, e a nitrocelulose foi cortada em tiras e bloqueada com PBS-0,3% de TWEEN 20 por 30 min a 22°C. As tiras foram incubadas durante 1 hora a 22°C com soro de cachorro diluído 1:100 e lavadas três vezes com PBS-0,05% de TWEEN 20. Anti-lgG de cachorro marcado com peroxidase de raiz-forte (Kir-kegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) foi adicionada, e as tiras foram incubadas por 30 min a 22°C antes de desenvolver com o Sistema de Substrato de Peroxidase de Membrana de TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). RESULTADOS •SEGURANÇA DA VACINA: Cachorros permaneceram clinicamente normais seguindo a vacinação, incluindo nenhum aumento na temperatura retal. Cachorros vacinados com a vacina, porém, desenvolveram inchação leve no sítio de injeção que foi solucionada dentro de 8 dias. A reação maior mediu 1 x 1 x 0,5 cm (24 horas pós-vacinação). • SEROLOGIA PÓS-VACINAÇÃO: Vacinação com placebo não induziu anticorpos específicos para B. Burgdorferi ss. Em contraste, a vacinação com a vacina induziu níveis significativos de anticorpos borreliacidais detectados usando isolados de S-1-10 ou 50772 de B. burgdorferi ss. A titulação média dos anticorpos borreliacidais detectados usando S-1-10 tiveram pico uma semana após a vacinação de reforço (dia de estudo 28) e permaneceu detectável no dia de estudo 197 (Tabela 6 abaixo). Similarmente, concentrações altas de anticorpos borreliacidais específicos para isolado 50772 estavam presentes através do dia de estudo 28 e permaneceram elevadas no dia de estudo 43 e detectável no dia de estudo 197 (Tabela 7 abaixo). TABELA 6. Titulações3 médias (n = 15) da atividadeb borreliacidal após vaci- nacão com a vacina. a Diluição recíproca. b Detectado usando teste de anticorpo borreliacidal com S-1-10 de B. burgdorferi ss 0 ND = Nenhum detectado. TABELA 7. Tituções3 médias (n = 15) da atividadeb borreliacidal após vacinação com a vacina.____________________________________________________________________ a Diluição reciproca. b Detectado usando teste de anticorpo borreliacidal com 50772 de B. burgdorferi ss. c ND = Nenhum detectado. d N/A = Nenhum aplicável. • CONFIRMAÇÃO DE ANTICORPOS BORRELIACIDAIS DE OspA E OspC.

Para confirmar que a atividade borreliacidal foi devido aos anticorpos borreliacidais de OspA e OspC, soros imunes de cinco cachorros vacinados foram passados com a vacina em colunas separadas contendo rOs-pA ou rOspC e os efeitos nas atividades borreliacidais foram examinados. A remoção dos anticorpos OspA-específicos ou OspC-específicos adsorvendo os soros significativamente com as proteínas recombinantes (> redução de 4 vezes) diminuiu a atividade borreliacidal detectada usando os isolados de S-1-10 ou 50772 de B. burgdorferi ss, respectivamente. Os achados coletivos confirmaram, portanto, que a vacina induziu níveis significativos de anticorpos borreliacidais de OspA e OspC, e as atividades borreliacidais detectadas pelos S-1-10 ou 50772 de B. burgdorferi ss foram quase completamente específicas para anticorpos borreliacidais de OspA ou OspC, respectivamente. Vide Tabela 8 abaixo. TABELA 8. Efeito de remover anticorpos de OspA ou OspC na atividade borre- liacidal em soros de cachorros (n = 5) vacinados com a vacina. a Diluição recíproca. b Soros colhidos no dia do estudo 43. c Soros colhidos no dia de estudo 28. d ND = Nenhum detectado.

• CONFIRMAÇÃO DE ANTICORPOS BORRELIACIDAIS OspC7-ESPECÍ-FICOS

Para confirmar que os anticorpos borreliacidais de OspC continham uma proporção significativa de anticorpos borreliacidais específicos para OspC7, soros imunes de cinco cachorros vacinados com a vacina foram passados em uma coluna contendo rOspC7, e os efeitos na atividade borreliacidal foram examinados. A remoção ds anticorpos OspC7-específicos adsorvendo os soros com a proteína de OspC7 recombinante (redução de 2 - 4 vezes) significativamente diminuiu a atividade borreliacidal detectada u-sando o isolado 50772 de B. burgdorferi ss. Portanto, os achados confirmaram que a vacina induziu níveis significativos de anticorpos borreliacidais de OspC específico para o epítopo de OspC7 conservado. Vide Tabela 9 abaixo. TABELA 9. Efeito de remover anticorpos de OspC7 sobre a atividade borre-liacidal em soros de cachorros (n = 5) vacinados com a vacina. a Diluição recíproca. b Soros colhidos no dia de estudo 28. c ND = Nenhum detectado. • CAPACIDADE DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS DE OspA E OspC DE ESTERILIZAR CARRAPATOS INFETADOS: O exame dos intestinos dos carrapatos que se alimentaram nos cachorros vacinados ou de controle confirmaram que os anticorpos borrelia-cidais de OspA e OspC induzidos pela vacina tinham esterilizado os carrapatos. B. burgdoríerí ss foram detectados nas besuntadelas de carrapato dos 34 (32%) de 106 carrapatos fêmeas que tinham se alimentado em 13 de 15 cachorros vacinados com placebo (Tabela 10 abaixo). Em contraste, nenhuma espiroqueta (0 de 99) foi detectada nos intestinos dos carrapatos fêmeas que se alimentaram em cachorros vacinados com a vacina (p <0,0001). TABELA 10. Detecção de B. burgdoríerí ss em carrapatos fêmeas removidos de cachorros vacinados ou de controle. * p < 0,0001 • CAPACIDADE DA VACINA DE IMPEDIR O RESTABELECIMENTO DE B. burgdorferí ss DA PELE: Os anticorpos borreliacidais induzidos com vacina também impediram as espiroquetas de colonizar a pele. B. burgdorferí ss foram restabelecidos de 56 (79%) de 71 biópsias colhidas dos cachorros vacinados com placebo em intervalos mensais seguindo desafio de carrapato (Tabela 11 abaixo) e as espiroquetas foram restabelecidas de pelo menos uma biópsia de pele de 14 (93%) dos 15 cachorros. Em contraste, B. burgdorferí ss foram restabelecidos de qualquer biópsia da pele colhida dos cachorros vacinados com a vacina (p < 0,0001). TABELA 11. Isolamento de B. burgdorferí ss da pele de cachorros vacinados ou não-vacinados de controle. P < 0,0001 • CAPACIDADEDA VACINA DE IMPEDIR A EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DA INFECÇÃO: A vacina também impediu o desenvolvimento de anticorpos específicos para doença de Lymes. Uma investigação anterior (Relatório de SPAHC B01-184-01R) confirmou que infecção com B. burgdorferí ss confiantemente induziu anticorpos de cachorro que ligaram a uma proteína de aproximadamente 20 kDa, e a resposta não foi induzida pela vacina (Figura 1). No estudo atual, os anticorpos que se ligaram à proteína de 20 kDa específica para infecção foram facilmente detectados nos soros imunes de 14 (93%) dos 15 cachorros de controle vacinados com placebo (Figura 2A). Além disso, o soro que não continha anticorpos de proteína de 20 kDa foi colhido do cachorro de controle que também falhou em render espiroquetas da pele. Em contraste, anticorpos de proteína de 20 kDa (p < 0,0001) não foram pro- duzidos por quaisquer dos cachorros vacinados com a vacina (Figura 2B).

Além disso, cachorros com doença de Lyme produziram anticorpos borreliacidais de não-OspC que são também detectáveis usando o isolado de 50772 de B. burgdorferi ss (Callister et al., J. Clin. Microbiol. 2000, 38:3670-3674). O alvo específico da resposta é desconhecido, mas os anticorpos fornecem confirmação serodiagnóstica altamente específica da infecção. Cachorros vacinados com a vacina já foram produtores de anticorpos borreliacidais de OspC, mas nenhum cachorro desenvolveu um aumento significativo (> 4 vezes) no nível de anticorpos borreliacidais específicos para 50772 de B. burgdorferi ss após o desafio de carrapato. Portanto, foi altamente improvável que os cachorros vacinados fossem infetados com espiro-quetas. Em contraste, anticorpos borreliacidais não foram produzidos pelos cachorros vacinados com placebo antes do desafio, mas 10 (67%; p = 0,0002) dos 15 cachorros desenvolveram níveis significativos (titulações > 1:640) de anticorpos borreliacidais detectados usando 50772 de B. burgdorferi ss após os carrapatos terem sido deixados se alimentarem (Tabela 12 abaixo). TABELA 12. Titulações8 médias de anticorposb borreliacidais após desafio de carrapato. *p = 0,0002 a Diluição recíproca. b Detectados usando 50772 de B. burgdorferi ss. • CAPACIDADE DA VACINA DE IMPEDIR OS DISTÚRBIOS DE MEM-BROS/JUNTAS: Estudos anteriores (Summers et al., J. Comp. Path. 2005,133:1-13, Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28) demonstraram que infecção com B. Burgdorferi ss apenas raramente causa distúrbios dos membros/juntas (por exemplo, inchação, coxeadura) e as presentes descobertas confirmaram isso. Apenas um cachorro de controle (8%) vacinado com placebo desenvolveu uma anormalidade das juntas. A perna frontal esquerda ficou dura 9 semanas após desafio de carrapato, e as espiroquetas de B. burgdorferi ss foram restabelecidas do cotovelo. Porém, as descobertas não foram significativas porque dois cachorros vacinados com a vacina também desenvolveram dureza em um ou mais membros, mas, em contraste com o cachorro que recebeu placebo, as espiroquetas não foram restabelecidas de qualquer tecido.

Para exacerbar o desenvolvimento dos sintomas claros, os cachorros restantes foram imunossuprimidos. Subsequentemente, três cachorros de controle vacinados com placebo ficaram mancos, e B. burgdorferi ss foram restabelecidos de dois destes cachorros. Em contraste, nenhum cachorro imunossuprimido vacinado com a vacina desenvolveu coxeadura. Desse modo, as descobertas coletivas sugeriram que a vacina impediu o desenvolvimento de artrite de Lyme, embora os resultados não tenham sido significativos (p = 0,0996). Porém, vide os dados adicionais apresentados e debatidos abaixo. • CAPACIDADE DA VACINA DE IMPEDIR ALTERAÇÕES EROSIVAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO DE B. burgdorferi ss: Quando as juntas dos cachorros debatidos acima foram examinadas microscopicamente, porém, as descobertas demonstraram a eficácia da vacina claramente. As cápsulas das juntas dos cachorros restantes (n = 13) vacinados com a vacina estavam normais. Em contraste, um ou mais tecidos das juntas de 6 (p = 0,0034) dos 11 cachorros de controle vacinados com placebo restantes (Tabela 7 acima) tiveram inflamação significativa caracterizada por infiltração de neutrófilos e células mononucleares (Figura 3). Além disso, B. burgdorferi ss não foram restabelecidos de qualquer tecido dos cachorros vacinados com a vacina, mas as espiroquetas foram restabelecidas dos tecidos das juntas de 5 (83%) dos 6 cachorros de controle vacinados com placebo com alterações erosivas. As descobertas coletivas, portanto, confirmaram que a vacina impediu artrite de Lyme canina e também confirmou relatórios anteriores que a síndrome é caracterizada mais frequentemente por sinovite subclínica (Summers et al., J. Comp. Path. 2005, 133:1-13; Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28). EXEMPLO 7 ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS BORRELIACIDAIS DE OCORRÊNCIA NATURAL DIRECIONADOS AO EPÍTOPO DE OspC7 Dados que confirmam que os anticorpos borreliacidaís suscitados em um mamífero contra OspC7 são específicos foram obtidos analisando os soros de indivíduos (seres humanos) com e sem uma história de doença de Lyme ou sintomas relacionados a Lyme, como segue. A. MATERIAIS E MÉTODOS 1. SOROS: Soros normais de indivíduos sem história anterior (quadro-revisão) de doença de Lyme ou sintomas relacionados a Lyme (n = 36), soros não-caracterizados de doadores de sangue (n = 100) ou indivíduos que sofrem de triagens de colesterol (n = 100), ou soros de voluntários com fatores de sangue ou enfermidades que comumente reagem cruzado com antí-genos de B. burgdorferi ss, incluindo anticorpos antinucleares (n = 20), fator reumatoide (n = 20), mononucleose (n = 10), citomegalovirus (n = 10), sífilis (n = 13) ou febre maculosa das montanhas rochosas (n = 4), foram armazenados de amostras armazenadas a -20°C. Os soros de doença de Lyme foram colhidos de pacientes avaliados no Gundersen Lutheran Medicai Center 2003 ou 2004. Soros (n = 86) de pacientes com eritema migratório (EM) que cumpriu o critério de vigilância de CDC (Centers for Disease Control and Prevention. Morb. Mort. Wkly. Rep. 1990, 39:19-21.) foram classificados como provavelmente Lyme, soros (n = 22) de pacientes com exposições a car-rapatos e lesões de pele atípicas foram classificados como Lyme provável (n = 49), e soros de pacientes com exposição a carrapatos e sintomas constitucionais que incluíram dor de cabeça, febre, mialgia, e artralgia foram primariamente classificados como possível Lyme. Os soros foram colhidos durante a visita inicial, armazenados a -20°C, e cegados antes de testar. PEPTÍDEO DE OSPC7. O peptídeo 7-aa OspC7 (AESPKKP; SEQ ID NO: 1) foi sintetizado na University of Wisconsin Biotechnology Cen-ter (Madison, Wl) usando um sintetizador automatizado (Protein Technologies) e o método de Fmoc (Fields, et al., Peptide Res. 1991, 4:95-101). Seguindo a síntese, a extremidade amino-terminal do peptídeo foi manualmente biotinilada por ativação de HBTU e purificada por cromatografia líquida de pressão alta. Composição foi confirmada usando ionização de dessorção a laser assistida por matriz-espectrometria de massa de tempo de voo (MAL-DI-TOF) (massa prognosticada 1095,4; massa observada 1095,8). ELISA DE OspC7. Poços individuais de placas de microtitulação (Immunolon 2 HB, Thermo Labsystems, Franklin, MA) foram revestidos com 100 pl de 4 pg/ml de uma suspensão de estreptavidina (Pierce, Rockland, IL) contida em tampão carbonato (NaHC03 a 90 mM, Na2C03 a 60 mM; pH 9,6) e incubada durante a noite a 4°C. Seguindo incubação, as placas foram lavadas cinco vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS-T; Tris HCI a 13 mM, base de Tris a 3 mM, NaCI a 140 mM, KCI a 2,7 mM; pH 7,4) contendo 0,05% de Tween 20. Após lavar, 200 pl de tampão de bloqueio (NaCI a 15 mM, Tris HCI a 10 mM, 3% de soro bovino fetal, 0,05% de Tween 20) contendo 1 pg/ml de peptídeo de OspC7 biotinilado foram adicionados a cada poço e incubados com rotação (150 rpm) durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com TBS-T e reagidas com 100 pl de quantidades de soros diluídas 1:200 em tampão de bloqueio durante 1 hora em temperatura ambiente. O anticorpo secundário era IgM e IgG anti-humana de cabra conjugada com peroxidase (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Md.) diluída 1/15.000 em tampão de bloqueio. A-pós incubação durante uma hora, o anticorpo secundário ligado foi quantificado pela adição de o-fenilenodiamina e peróxido de hidrogênio em tampão de citrato (Sigma, St., Louis, Mo.) e determinação da OD a 490 nm (Spec-traMax 250; Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.).

B. RESULTADOS

Em estudos anteriores (Jobe et al., Clin. Diagn. Lab. Immuno. 2003, 10:573-578, Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751), um epítopo imunodominante altamente conservado de anticorpos bor- reliacidais de OspC foi localizado na região dentro dos 7 aminoácidos mais próximos do término C (OspC7). Para confirmar os anticorpos induzidos por epítopo específicos para infecção com Borrelia spp., as reatividades de um ELISA que usou OspC7 usando soros de pacientes com doença de Lyme (Figura 5) e soros de sujeitos normais ou pacientes com outras enfermidades provavelmente para produzir anticorpos que poderíam também ligar proteínas de Borrelia spp. (figura 4) foram comparadas. Nas Figuras 4 e 5, a linha na Absorbância 1,25 define três desvios-padrão acima da absorbância média dos soros normais e potencialmente reativos cruzados. Portanto, qualquer resultado que caia acima da linha tem uma probabilidade de 99% que a reatividade seja significativa (verdadeiro positivo). Reatividade significativa foi detectada apenas raramente nos soros normais ou potencialmente reativos cruzados (figura 4). Deve também ser observado que a maior parte dos resultados positivos foi obtida usando soros que poderíam ter vindo de pacientes com doença de Lyme, porque os soros (CS) foram obtidos de um grupo de 100 pacientes sendo vistos no Gundersen Lutheran Medicai Center para uma variedade de doenças. A região é um foco altamente endêmico da doença de Lyme, e as identidades e histórias clínicas dos pacientes foram desconhecidas. Em contraste, soros positivos não foram detectados nas amostras de soro (n = 100) colhidas fortuitamente de doadores de sangue (BD) em Milwaukee, uma região não endêmica de Wisconsin.

Além disso, resultados positivos (maiores que 3 desvios-padrão acima da média dos soros que deveríam ser não reativos - figura 4) foram detectados comumente nos soros dos pacientes com doença de Lyme e os valores de absorbância foram altos (figura 5). As descobertas coletivas, portanto, confirmaram a especificidade alta dos anticorpos direcionados contra o epítopo de OspC7 e a imunodominância da resposta durante a doença de Lyme humana.

Resumindo os dados acima exemplificados, grupos (15 cachorros) de filhotes de 8 semanas de idade foram vacinados e reforçados com uma vacina que continha 5,0 x 108 50772 de B. burgdorferi ss, 2,5 x 107 S-1-10 de B. burgdorferi ss e 5% de Emulsigen® ou um placebo que continha apenas 5% de Emulsigen®. A vacina causou inchação leve no sítio da injeção que solucionou-se rapidamente. Mais significativamente, a vacina induziu concentrações altas de anticorpos borreliacidais de OspA e OspC que tiveram um pico em uma semana após a vacinação de reforço e permaneceram detectáveis pela duração do estudo. Além disso, uma proporção significativa dos anticorpos borreliacidais de OspC é específica para o epítopo altamente conservado dentro de OspC7.

Carrapatos I. scapularis fêmeas infetados com B. burgdorferi ss foram depois deixados alimentar-se nos cachorros vacinados, e um exame dos intestinos dos carrapatos confirmou que os anticorpos borreliacidais de OspA e OspC na refeição de sangue eliminaram B. burgdorferi ss completamente. Especificamente, B. burgdorferi ss foram detectados em 34 (32%) carrapatos colhidos dos cachorros de controle vacinados com placebo e não detectados nos carrapatos (n = 99) que se alimentaram nos cachorros vacinados com a vacina (p < 0,0001). Além disso, os recipientes de vacina permaneceram negativos para doença de Lyme através de vários métodos indiretos e diretos comumente usados para confirmar a infecção. Em contraste, 10 (67%) cachorros de controle produziram anticorpos contra uma proteína de B. burgdorferi ss de 20 kDa "infecção-específica" e 8 (53%) produziram anticorpos borreliacidais "infecção-específicos". Além disso, quatro (27%) cachorros desenvolveram coxeadura persistente, e B. burgdorferi ss foram restabelecidos das juntas de 3 (75%) dos 4 animais mancos. Além disso, infiltrados inflamatórios desenvolveram-se nas cápsulas das juntas de 6 (55%) dos 11 cachorros vacinados com placebo examinados. Mais convincentemente, B. burgdorferi ss foram restabelecidos da pele e juntas de 14 (93%) e 8 (53%) cachorros de controle, respectivamente, enquanto as espi-roquetas não foram restabelecidas de cachorros vacinados com o produto de teste. Desse modo, a vacina inventiva da doença de Lyme causou efeitos colaterais mínimos e proteção completa fornecida contra infecção com B. burgdorferi ss. EXEMPLO 8 DURAÇÃO DA IMUNIDADE DA VACINA COMPREENDENDO ISOLADOS DE B. burgdorferi ss S-1-10 E 50772 A. MATERIAIS E MÉTODOS ANIMAIS: Materiais e métodos são descritos acima no Exemplo 6. VACINAÇÃO E COLETA DE SOROS: Os cachorros foram subcutaneamente vacinados no pescoço com uma dose da vacina de 1 ml e reforçados com uma dose adicional de 1 ml após 21 dias. Sangue total foi colhido antes da vacinação inicial (dia de estudo -4) e de reforço (dia de estudo 21) e também nos dias de estudo 28, 35, 49, 79, 114, 142, 175, 210, 238, 266, 302, 322, 357, e 394 por punção venosa da veia jugular. O soro foi separado por centrifugação e armazenado a -20°C até testado. OBSERVAÇÕES PÓS-VACINAÇÃO: Os cachorros foram observados diariamente. DESAFIO DE CARRAPATO: Um ano após a segunda vacinação, os cachorros foram raspados no lado direito da cavidade torácica, e carrapatos I. scapularis infetados com B. Burgdorferi, 10 fêmeas e 10 machos, foram colocados em um copo de borracha que foi preso à área raspada com fita e envoltura de bandagem. Os carrapatos foram deixados alimentar-se durante 7 dias. DETECÇÃO DE B. burgdorferi ss EM CARRAPATOS: Detecção foi executada da maneira descrita acima no Exemplo 6. AMOSTRAS DE SANGUE: Sangue total foi colhido em tubos de transporte de separação de soro (ssT) nos dias de estudo 43 pós-desafio (PC), 77 PC, 112 PC, 147 PC, 174 PC, e 241 PC, e o soro separado e armazenado a -20°C até testado. DETECÇÃO DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS: Anticorpos borreliacidais de OspA e OspC foram detectados a-través de citometria de fluxo como descrito acima nos Exemplos 1 e 2. BIÓPSIAS DA PELE: Biópsias da pele foram tiradas de locais adjacentes da fixação do carrapato nos dias de estudo 43 pós-desafio (PC), 77 PC, 112 PC, 147 PC, 174 PC, e 241 PC com um dispositivo de punção descartável de 4 mm. As biópsias foram processadas como descrito acima no Exemplo 6. IMUNOSSUPRESSÃO: Cachorros foram imunossuprimidos por administração diária de dexametasona 0,88 mg/Kg (0,4 mg/lb) do peso do corpo) durante 5 dias começando em aproximadamente 20 semanas pós-desafio. OBSERVAÇÕES CLÍNICAS: Observações clínicas foram executadas acima como no Exemplo 6. NECROPSIA: Necropsia foi executada acima como no Exemplo 6. B. RESULTADOS SEROLOGIA PÓS-VACINAÇÃO: Vacinação com um placebo não induziu anticorpos específicos para B. burgdorferi ss. Em contraste, vacinação com a vacina induziu níveis significativos de anticorpos borreliacidais detectados usando isolados de 10 e 50772 de B. burgdorferi ss S-1-. A titulação de anticorpo borreliacidal média contra S-1-10 teve pico uma semana (dia de estudo 28) após a vacinação de reforço, e a resposta permaneceu detectável até o dia de estudo 394 (Tabela 13). Similarmente, concentrações altas de anticorpos borreliacidais específicos para isolados 50772 foram detectados no dia de estudo 28, titulações permaneceram elevadas no dia de estudo 49, e baixos níveis permaneceram detectáveis após 79 dias (Tabela 14). TABELA 13. Titulações3 médias (n = 15) da atividade0 borreliacidal após vacinação com a vacina. a Diluição recíproca. b Detectada usando teste de anticorpo borreliacidal com S-1-10 de B. burg-dorferi ss. c ND = Nenhum detectado. TABELA 14. Titulações3 médias (n = 15) da atividadeb borreliacidal após vacinação com a vacina. 3 Diluição recíproca. b Detectada usando teste de anticorpo borreliacidal com 50772 de B. burg-dorferi ss. c ND = Nenhum detectado. CAPACIDADE DOS ANTICORPOS BORRELIACIDAIS DE OspA E OspC DE ESTERILIZAR CARRAPATOS INFETADOS: O exame dos intestinos dos carrapatos que se alimentaram nos cachorros vacinados ou de controle confirmou que os anticorpos borreliaci-dais de OspA e OspC induzidos pela vacina tinham esterilizado os carrapatos. B. burgdorferi ss foram detectados nas besuntadelas de carrapato de 15 (16%) de 95 carrapatos fêmeas que tinham se alimentado em 12 de 15 cachorros vacinados com placebo (Tabela 15). Em contraste, B. burgdorferi ss foram detectados nas besuntadelas de carrapato de apenas 2 (3%) de 75 carrapatos fêmeas que tinham se alimentado em 2 de 15 cachorros vacinados (p = 0,0003). TABELA 15. Detecção de B. burgdorferi ss em carrapatos fêmeas removidos de cachorros vacinados ou de controle.______________________________ * p = 0,0003 3 Ingurgitados e não-ingurgitados CAPACIDADE DA VACINA DE IMPEDIR O RESTABELECIMENTO DE B. burgdorferi ss DA PELE: Os anticorpos borreliacidais induzidos com vacina também impediram uma infecção sustentada de organismos de B. burgdorferi na pele. B. burgdorferi ss foram restabelecidos de 33 (44%) de 75 biópsias colhidas dos cachorros vacinados com placebo em intervalos mensais seguindo desafio de carrapato (Tabela 16). Em contraste, B. burgdorferi ss foram restabelecidos de apenas 6 (8%) de 75 biópsias colhidas dos cachorros vacinados com a vacina (p < 0,0001). Espiroquetas foram restabelecidas de pelo menos uma biópsia da pele de 10 (67%) dos 15 cachorros de controle, comparado a 6 (40%) dos 15 cachorros vacinados. Porém, isolamentos dos cachorros vacinados foram limitados apenas ao primeiro pós-desafio mensal, enquanto que, 8 (80%) dos 10 cachorros de cultura de controle positivo tiveram culturas de biópsia da pele positivas de B. burgdorferi ao longo dos meses seguindo o estudo. TABELA 16. Isolamento de B. burgdorferí ss da pele de cachorros vacinados ou não vacinados de controle.________________________________________________ 3 Um cachorro novo. b Biópsias Totais que foram positivas, c Número total de cachorros que foram positivos, b Número Total de cachorros que foram positivos após o primeiro mês. * p < 0,05 ** p < 0,0001 CAPACIDADE DA VACINA DE IMPEDIR A EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DE INFECÇÃO: A vacina também impediu o desenvolvimento de anticorpos específicos para doença de Lyme. Cachorros com doença de Lyme produzem anticorpos não-borreliacidais de OspC que são também detectáveis usando o isolado de 50772 de B. burgdorferí ss (como descrito no Exemplo 6). Níveis significativos, aumentados (> aumento de 4 vezes) de anticorpos borre-liacidais contra cepa 50772 foram observados pós-desafio em 5 (33%) dos 15 cachorros de controle vacinados com placebo não comparados a nenhum dos cachorros vacinados com a vacina de teste. TABELA 17. Titulações3 médias de anticorposb borreliacidais após desafio de carrapato. 3 Diluição recíproca. b Detectados usando 50772 de B. burgdorferí ss. c £ 4 vezes titulação aumentada CAPACIDADE DA VACINA DE IMPEDIR DISTÚRBIOS DE MEM-BROS/JUNTAS E ALTERAÇÕES EROSIVAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO DE B. burgdorferí ss: Estudos anteriores demonstraram que infecção com B. burgdor-feri ss apenas raramente causa distúrbios de membros/juntas claros (Exemplo 6), e o modelo de desafio de carrapato foi mostrado ser menos eficaz em cachorros mais velhos. Para exacerbar o desenvolvimento dos sintomas, os cachorros foram imunossuprimidos com dexametasona aproximadamente 3 meses pós-desafio. Quatro cachorros de controle vacinados com placebo ou ficaram mancos ou desenvolveram lesões erosivas no tecido conjunto. Em contraste, nenhum dos cachorros vacinados com uma vacina da presente invenção desenvolveu qualquer sinal clínico de distúrbios dos membros/juntas ou as lesões erosivas frequentemente vistas no tecido das juntas. A presente invenção não é para ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da invenção além daquelas descritas aqui se tornarão evidentes àqueles versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações são destinadas a se enquadrarem ao escopo das reivindicações em anexo. É também para ser entendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. Várias publicações são aqui citadas, cujas descrições são por este meio incorporadas por referência em suas totalidades.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de organismos de uma primeira cepa de B. burgdorferi, em que a primeira cepa é 50772 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439) e uma quantidade imunologicamente eficaz de organismos de uma segunda cepa de B. burgdorferi·, em que a segunda cepa é S-1 -10 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680), em que a dita primeira cepa exibe um antígeno OspC em sua superfície celular; a dita segunda cepa exibe um antígeno OspA em sua superífice celular e em que a composição compreende adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a quantidade imunologicamente eficaz de organismos da dita primeira cepa e dita segunda cepa de Borrelia foi inativada.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os anticorpos borreliacidais de OspC são induzidos em um canino quando o dito canino for imunizado com a dita composição de vacina.

4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que uma proporção significativa dos anticorpos borreliacidais OspC-específicos são específicos para OspC7.

5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os anticorpos borreliacidais de OspC e os anticorpos borreliacidais de OspA são induzidos em um canino quando o dito canino for imunizado com a dita composição de vacina.

6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que anticorpos borreliacidais de OspC e anticorpos borreliacidais de OspA são induzidos em um canino quando o dito canino for imunizado com a dita composição de vacina.

7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a segunda cepa de B. burgdorferi é S-1-10 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680).

8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que uma quantidade imunologicamente eficaz de 50772 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439) e S-1-10 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680) foi inativada.

9. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender de 1 x 104 a 1 x 1010 organismos por mililitro de 50772 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439) e de 1 x 104 a 1 x 1010 organismos por mililitro de S-1-10 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680).

10. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de compreender de 5,0 x 108 a 5 x 109 organismos por mililitro de 50772 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439) e de 1,0 x 108 a 5 x 108 organismos por mililitro de S-1-10 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680).

11. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender um imunoestimulante farmaceuticamente aceitável.

12. Uso de uma quantidade imunologicamente eficaz de 50772 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-439) e S-1-10 B. burgdorferi ss (ATCC No. PTA-1680), caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para imunizar um canino contra uma genoespécie de Borrelia patogênica.