BRPI0714824A2 - enumeraÇço de trombàcitos - Google Patents

Abstract

ENUMERAÇçO DE TROMBàCITOS. A presente invenção refere-se a um dispositivo de aquisição de amostra para anumeração volumétrica de trombócitos em uma amostra de sangue que compreende uma cavidade de medição para recebimento de uma amostra de sangue. A cavidade de medição tem uma espessura fixa predeterminada. O dispositivo de aquisição de amostra ainda compreende um reagente , o qual está disposto em uma forma seca sobre uma superfície que define a cavidade de medição. O reagente compreende um agente de hemólise para lise de células sanguíneas vermelhas na amostra de sangue opcionalmente um agente de coloração para coloração seletiva de trombócitos na amostra de sangue. Um sistema compreende o dispositivo de aquisição de amostra e um aparelho de medição. O aparelho de medição compreende um contentor de dispositivo de aquisição de amostra, uma fonte de luz e um sistema de formação de imagem para aquisição de uma imagem digital de uma ampliação da amostra. O aparelho de medição ainda compreende um analisador de imagem disposto para analisar a imagem digital adquirida para determinação do número de trombócitos na amostra de sangue.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENUMERA- ÇÃO DE TROMBÓCITOS". Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um dispositivo de aquisição de amostra, a um método e a sistema para a enumeração volumétrica de trom- bócitos em uma amostra de sangue. Antecedentes da Invenção

Trombócitos, ou plaquetas, são elementos em circulação no sangue derivados do citoplasma de uma célula gigante, o megacariócito. Eles não são exatamente células e não possuem um núcleo. Eles têm pa- péis importantes em hemóstase, retração de coágulo, reparo de vasos san- güíneos lesados e inflamação, e eles estão, em geral, presentes em uma concentração de cerca de 250 χ 109 por litro de sangue. O tempo de sobre- vivência no sangue é usualmente de 8 a 10 dias. Eles são pequenos e em formato de disco, com um diâmetro de cerca de 2 μπι e um volume de cerca de 0,000207 m3 (7 fl). Um trombócito contém substâncias envolvidas em co- agulação sangüínea, substâncias as quais são armazenadas em determina- dos grânulos dentro do trombócito e são liberadas quando de ativação do trombócito, tal como em uma fissura em um vaso sangüíneo. A determinação da contagem de trombócitos freqüentemente é

importante em relação ao tratamento de um paciente. Essa análise pode ser necessária para diagnóstico de uma série de distúrbios. Por exemplo, uma baixa contagem de trombócitos (menos de 50 χ 109 por litro de sangue) é indicativa de trombocitopenia, a qual é uma razão comum para uma predis- posição a sangramento. Baixas concentrações de trombócito podem ser em virtude de produção reduzida causada, por exemplo, por medula óssea lesa- da como um resultado de anemia aplástica, leucemia aguda, mieloma ou citostática, tempo de sobrevivência reduzido dos trombócitos ou uma altera- ção na distribuição de trombócito, tal como agregação de trombócito. Por outro lado, uma concentração aumentada de trombócitos pode ser um resul- tado de distúrbios inflamatórios crônicos (trombocitose), tal como artrite reu- mática ou de produção independente de trombócitos na medula óssea (trombocitemia) e pode levar a coágulos sangüíneos, trombose.

É desejável permitir que os resultados de análise sejam obtidos tão rapidamente quanto possível de forma a minimizar os tempos de espera para os pacientes e permitir que um médico tome uma decisão de tratamen- to e diagnóstico diretamente quando faz um primeiro exame do paciente. Portanto, seria preferível proporcionar um método de análise o qual pode ser realizado rapidamente pelo médico ou um enfermeiro sem a necessidade de enviar um teste para um laboratório.

Atualmente, uma contagem de trombócitos normalmente é obti- da com um contador Coulter automatizado, pelo que os componentes san- güíneos (células e trombócitos) são identificados por meio de condutância elétrica ou impedância. A patente US 4 240 029 divulga um aparelho para contagem de plaquetas e células sangüíneas vermelhas por meio de um transdutor do tipo abertura o qual é capaz de discriminar o tamanho entre as plaquetas e as células sangüíneas vermelhas.

Outro método automatizado para a contagem de plaquetas usa dispersão de luz a laser em um citômetro de fluxo. As plaquetas são identifi- cadas através de seu tamanho relativamente pequeno, conforme indicado pela dispersão de luz medida. Por exemplo, a patente US 5 817 519 divulga uma aplicação desse método.

Outras formas atuais de avaliar a contagem de plaquetas são utilizar anticorpos plaqueta-específicos, tal como divulgado na WO 00/25140 ou através de medição da quantidade de proteína de grânulo plaquetário liberada, por exemplo, trombospondina ou β-tromboglobulina, em uma amos- tra, tal como divulgado em US 6 027 904.

Trombócitos são também, algumas vezes, contados em um mi- croscópio de acordo com o método de Brecher-Cronkite, pelo que uma a- mostra é misturada com uma solução de oxalato de amônio, após o que os trombócitos, os quais são visíveis como pontos de luz com uma borda escu- ra, são contados em um microscópio de contraste de fase. Outra forma co- nhecida de contagem de trombócitos é através do uso do reagente comerci- almente disponível Plaxan® em combinação com uma câmara de contagem, tal como uma câmara Burker. Uma câmara de contagem é proporcionada com uma grade que divide a camada em pequenos volumes bem definidos. A contagem de trombócitos pode, então, ser determinada através de conta- gem do número de trombócitos por caixa na grade. A contagem de trombóci- tos é obtida manualmente por um analista, que precisa ter experiência para realizar a análise de forma a ser capaz de realizar uma análise confiável. Essa análise consome tempo. Ainda, uma vez que ela é realizada manual- mente, os resultados da análise podem variar dependendo da pessoa que faz a análise.

Ainda, há uma necessidade de acelerar e simplificar os métodos automáticos existentes para determinação de uma contagem de trombócitos de modo que tal análise possa ser proporcionada em uma clínica. Sumário da Invenção

É um objetivo da invenção proporcionar uma análise simples para determinação de uma enumeração volumétrica de trombócitos. É um outro objetivo da invenção proporcionar uma análise rápida sem a necessi- dade de aparelhos complicados ou preparações extensivas de amostra.

Esses objetivos são parcial ou totalmente obtidos por um dispo- sitivo, um método e um sistema de aquisição de amostra de acordo com as reivindicações independentes. Modalidades preferidas são evidentes a partir das reivindicações dependentes.

Assim, é proporcionado um dispositivo de aquisição de amostra para enumeração volumétrica de trombócitos em uma amostra de sangue. O dispositivo de aquisição de amostra compreende uma cavidade de medição para recebimento de uma amostra de sangue. A cavidade de medição tem uma espessura fixa predeterminada. O dispositivo de aquisição de amostra ainda compreende um reagente, o qual está disposto em uma forma seca sobre uma superfície que define a cavidade de medição, o referido reagente compreendendo um agente de hemólise para Iise de células sangüíneas vermelhas na amostra de sangue e, opcionalmente, um reagente de colora- ção para coloração seletiva de trombócitos na amostra de sangue.

O dispositivo de aquisição de amostra proporciona uma possibi- Iidade de obter diretamente uma amostra de sangue íntegro na cavidade de medição e fornecê-la para análise. Não há necessidade de preparação da amostra. Na verdade, a amostra de sangue pode ser aspirada na cavidade de medição diretamente picando o dedo de um paciente. Fornecimento da amostra ao dispositivo de aquisição com um reagente permite uma reação dentro do dispositivo de aquisição de amostra, a qual torna a amostra pronta para análise. A reação é iniciada quando a amostra de sangue entra em con- tato com o reagente. Assim, não há necessidade de preparação manual da amostra, o que torna a análise especialmente adequada para ser realizada diretamente em uma sala de exame enquanto o paciente está esperando.

Uma vez que o reagente é fornecido em uma forma seca, o dis- positivo de aquisição de amostra pode ser transportado e armazenado du- rante um longo tempo sem afetar a capacidade de utilização do dispositivo de aquisição de amostra. Assim, o dispositivo de aquisição de amostra com o reagente pode ser fabricado e preparado bem antes de fazer a análise de uma amostra de sangue.

Embora existam muitos métodos capazes de contar diferentes células sangüíneas e mesmos subgrupos de células sangüíneas, o dispositi- vo de aquisição de amostra de acordo com a invenção é especificamente adaptado para realizar a enumeração volumétrica de trombócitos. O reagen- te compreende um agente de hemólise o qual submeterá as células sangüí- neas vermelhas à Iise na amostra de sangue, mas não os trombócitos. Isso destrói as possibilidades de enumerar as células sangüíneas vermelhas na amostra. Por outro lado, a Iise das células sangüíneas vermelhas simplifica a distinção e identificação dos trombócitos dentro da amostra de sangue. Al- gumas células sangüíneas brancas intactas podem também estar presentes, mas elas serão poucas comparadas aos trombócitos e serão facilmente dis- tinguíveis, pelo tamanho e aparência, dos trombócitos.

O agente de coloração opcional proporciona uma marcação dos trombócitos individuais. Isso é uma forma de permitir que os trombócitos se- jam individualmente visualizados ou detectados. Outra forma de permitir que os trombócitos sejam individualmente visualizados ou detectados é utilizan- do uma abordagem de contraste de fase, de preferência com um microscó- pio de contraste de fase. Também é possível usar um agente de coloração em combinação com uma abordagem de contraste de fase. Os trombócitos podem, por exemplo, ser detectados através de exploração da cavidade de medição ou obtenção de uma imagem da cavidade de medição. A contagem de trombócitos pode, assim, ser obtida somando o número de trombócitos individualmente detectados em um volume definido.

A invenção também proporciona um método para enumeração volumétrica de trombócitos em uma amostra de sangue. O método compre- ende aquisição de uma amostra de sangue em uma cavidade de medição de um dispositivo de aquisição de amostra, a referida cavidade de medição con- tendo um reagente compreendendo um agente de hemólise e opcionalmente um agente de coloração para reagir com a amostra, de modo que os trom- bócitos são corados, irradiação da amostra com os trombócitos, aquisição de uma imagem digital de uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição, em que os trombócitos são distinguidos através de coloração sele- tiva do agente de coloração e/ou através de contraste de fase e análise digi- tal da imagem digital para identificação de trombócitos e identificação do número de trombócitos na amostra. A invenção ainda proporciona um sistema para enumeração vo-

lumétrica de trombócitos em uma amostra de sangue. O sistema compreen- de um dispositivo de aquisição de amostra conforme descrito acima. O sis- tema ainda compreende um aparelho de medição compreendendo contentor de dispositivo de aquisição de amostra disposto para receber o dispositivo de aquisição de amostra o qual contém uma amostra de sangue na cavidade de medição e uma fonte de luz disposta para irradiar a amostra de sangue. O aparelho de medição ainda compreende um sistema de ampliação e um meio de aquisição de imagem digital para aquisição de uma imagem digital de uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição, em que trombócitos são distinguidos na imagem digital através de coloração seletiva do agente de coloração e/ou através de contraste de fase. O aparelho de medição também compreende um analisador de imagem disposto para ana- Iisar a imagem digital adquirida para identificação de trombócitos e determi- nação do número de trombócitos na amostra de sangue.

O método e o sistema da invenção proporcionam uma análise muito simples de uma amostra de sangue para determinação de uma conta- gem de trombócitos. A análise não requer um aparelho de medição compli- cado ou etapas avançadas a serem realizadas por um operador. Portanto, ela pode ser realizada em conexão direta ao exame de um paciente, sem a necessidade de um técnico qualificado. O aparelho de medição utiliza as propriedades do dispositivo de aquisição de amostra para fazer uma análise sobre uma amostra de sangue íntegro não diluído que tenha sido diretamen- te adquirida na cavidade de medição. O aparelho de medição está disposto para formar uma imagem de um volume da amostra para fazer uma enume- ração volumétrica dos trombócitos a partir de uma imagem.

A amostra de sangue é deixada ser misturada com o reagente na cavidade de medição. Dentro de uns poucos minutos, a reação da amos- tra de sangue com o reagente terá submetido à hemólise as células sangüí- neas vermelhas e, se um agente de coloração é fornecido, coloração dos trombócitos, de modo que a amostra está pronta para ser apresentada para medição óptica. A amostra de sangue pode ser misturada com o reagente, por exemplo, através de dispersão ou difusão do reagente na amostra de sangue ou através de vibração ou movimento ativo do dispositivo de aquisi- ção de amostra, de modo que uma agitação é causada na cavidade de me- dição.

O dispositivo de aquisição de amostra pode compreender um elemento de corpo tendo duas superfícies planas para definir a referida cavi- dade de medição. As superfícies planas podem estar dispostas em uma dis- tância predeterminada uma da outra para determinar uma espessura de a- mostra para medição óptica. Isso implica no fato de que o dispositivo de a- quisição de amostra proporciona uma espessura bem definida para medição óptica, a qual pode ser usada para determinar precisamente a contagem de trombócitos por unidade volumétrica da amostra de sangue. Um volume de uma amostra analisada será bem definido pela espessura da cavidade de medição e uma área da amostra tendo a imagem formada. Assim, o volume bem definido poderia ser usado para associação do número de trombócitos com o volume da amostra de sangue, de modo que a contagem volumétrica de trombócitos é determinada.

A cavidade de medição tem, de preferência, uma espessura uni-

forme de 50 a 170 micrometros. Uma espessura de pelo menos 50 microme- tros implica no fato de que a cavidade de medição não força a amostra de sangue a ser dispersa em uma monocamada, permitindo que um volume maior de sangue seja analisado sobre uma pequena área seccional trans- versai. Assim, um volume suficientemente grande da amostra de sangue, de forma a proporcionar valores confiáveis de contagem de trombócitos, pode ser analisada usando uma imagem relativamente pequena da amostra de sangue. A espessura é, mais preferivelmente, de pelo menos 80 microme- tros, o que permite que uma área seccional transversal ainda menor seja analisada ou um volume de amostra maior seja analisado. Ainda, a espessu- ra de pelo menos 50 micrometros e, mais preferivelmente, 80 micrometros também simplifica a fabricação da cavidade de medição tendo uma espessu- ra bem definida entre duas superfícies planas.

Para a maioria das amostras dispostas em uma cavidade tendo uma espessura de cerca de 100 micrometros, a contagem de trombócitos ainda será tão alta que haverão desvios em virtude de trombócitos estando dispostos uns por cima dos outros. Contudo, o efeito de tais desvios estará relacionado à contagem de trombócitos e pode, assim, ser manipulado por meio de correção estatística dos resultados pelo menos para valores maio- res da contagem de trombócitos. Essa correção estatística pode ser basea- da em calibrações do aparelho de medição. Se a espessura da cavidade é adicionalmente reduzida, por exemplo, para 50 μιη, essa correção pode ser menos complexa, mas essa pode ser equilibrada contra os efeitos adversos de uma baixa espessura discutido acima. Ainda, a espessura da cavidade de medição é suficientemente

pequena para permitir que o aparelho de medição obtenha uma imagem di- gital, de modo que toda a profundidade da cavidade de medição pode ser analisada simultaneamente. Uma vez que um sistema de ampliação tem de ser usado no aparelho de medição, não é simples obter uma grande profun- didade de campo. Portanto, a espessura da cavidade de medição, de prefe- rência, não excederá a 150 micrometros de forma que toda a espessura seja simultaneamente analisada em uma imagem digital. A profundidade de cam- po pode estar disposta para lidar com uma espessura da cavidade de medi- ção de 170 micrometros.

A imagem digital pode ser adquirida com uma profundidade de campo correspondendo pelo menos à espessura da cavidade de medição. Conforme usado no presente contexto, "profundidade de campo" implica em um comprimento em uma direção ao longo do eixo óptico que tem a imagem formada em um foco suficiente para permitir análise de imagem para identifi- car células posicionadas dentro desse comprimento. Essa "profundidade de campo" pode ser maior do que uma profundidade de campo convencional definida pelos ajustes ópticos.

Uma vez que a imagem digital é adquirida com uma "profundi- dade de campo" correspondendo pelo menos à espessura da cavidade de medição, um foco suficiente é obtido de toda a espessura da amostra, de modo que toda a espessura da cavidade de medição pode ser simultanea- mente analisada na imagem digital da amostra. Escolhendo não focalizar muito nitidamente sobre uma parte específica da amostra, um foco suficiente é obtido de toda a espessura da amostra para permitir identificação do nú- mero de trombócitos na amostra. Isso implica no fato de que um trombócito pode estar um pouco borrado e ainda ser considerado como estando em foco da profundidade de campo.

O reagente, compreendendo um agente de hemólise, e opcio- nalmente um agente de coloração, pode ser introduzido na cavidade de me- dição do dispositivo de aquisição de amostra dissolvido ou suspenso em um líquido. O reagente pode, então, ser transformado em uma forma seca atra- vés de evaporação em temperatura e pressão ambientes ou auxiliado atra- vés de calor ou vácuo ou através de liofilização. Se o reagente tem de ser evaporado em temperatura e pressão ambientes ou através de calor, o rea- gente está, de preferência, dissolvido ou suspenso em um líquido volátil, tal como metanol.

O reagente, incluindo todos os seus componentes, da presente invenção é, de preferência, passível de dissolução e/ou suspensão na amos- tra líquida a ser analisada e, de preferência, se destina a estar em solu- ção/suspensão por toda a análise. Uma vez, conforme estabelecido acima, que o método está disposto para detectar trombócitos em toda a espessura da cavidade de medição e não há necessidade de extrair ou imobilizar os trombócitos a uma superfície de observação, também não há necessidade de imobilizar ou evitar, de qualquer outra maneira, dissolução/suspensão do reagente ou qualquer componente do reagente. Pelo contrário, uso de um reagente passível de dissolução/suspensão, de preferência, um reagente de fácil dissolução/suspensão, facilita a mistura do reagente com a amostra lí- quida e acelera quaisquer reações entre o reagente e a amostra líquida, in- cluindo os trombócitos a serem medidos.

O agente de coloração opcional pode estar disposto para corar seletivamente a membrana, o citoplasma, os grânulos ou qualquer outra par- te dos trombócitos ou uma combinação dos mesmos. Isso implica no fato de que os trombócitos podem ser identificados como pontos coloridos e, portan- to, serem facilmente contados em uma imagem digital.

O agente de coloração opcional pode ser qualquer um no grupo de azul de metileno, azul de metileno de eosina, azul de metileno de eosina azul-celeste, Plaxan®, hematoxilina, verde de metileno, azul de toluidina, vio- leta genciana, análogos de sudano, galocianina e análogos de fuchsina. Contudo, será apreciado que o agente de coloração não está limitado a esse grupo, mas muitas outras substâncias podem ser consideradas. De prefe- rência, o agente de coloração opcional é azul de metileno de eosina ou azul de metileno de eosina azul-celeste.

O agente de hemólise pode ser um sal de amônio quaternário, uma saponina, um ácido biliar, tal como deóxicolato, uma digitoxina, um ve- neno de cobra, um glicopiranosídeo ou um detergente não-iônico do tipo Tri- ton. Contudo, será apreciado que o agente de hemólise não está limitado a esse grupo, mas muitas outras substâncias podem ser consideradas. De preferência, o agente de hemólise é uma saponina.

O dispositivo de aquisição de amostra pode ainda compreender uma entrada de amostra que comunica a cavidade de medição com o exteri- or do dispositivo de aquisição de amostra, a referida entrada estando dispos- ta para adquirir uma amostra de sangue. A entrada de amostra pode estar disposta para extrair uma amostra de sangue através de uma força capilar e a cavidade de medição pode ainda extrair sangue da entrada na cavidade. Como um resultado, a amostra de sangue pode ser facilmente adquirida na cavidade de medição simplesmente mantendo a entrada de amostra em contato com sangue. Então, as forças capilares da entrada de amostra e a cavidade de medição extrairão uma quantidade bem definida de sangue na cavidade de medição. Alternativamente, a amostra de sangue pode ser aspi- rada ou empurrada na cavidade de medição por meio de aplicação de uma força de bombeamento externa ao dispositivo de aquisição de amostra. De acordo com outra alternativa, a amostra de sangue pode ser adquirida em uma pipeta e, então, ser introduzida na cavidade de medição por meio da pipeta.

O dispositivo de aquisição de amostra pode ser descartável, isto é, ele é disposto para ser usado apenas uma vez. O dispositivo de aquisição de amostra proporciona um kit para realização de uma contagem de trombó- citos, uma vez que o dispositivo de aquisição de amostra é capaz de receber uma amostra de sangue e conter todos os reagentes necessários de forma a apresentar a amostra para contagem de células. Isso é particularmente pos- sível uma vez que o dispositivo de aquisição de amostra é adaptado para uso apenas uma vez e pode ser formado sem considerar possibilidades de limpar o dispositivo de aquisição de amostra e reaplicar um reagente. Tam- bém, o dispositivo de aquisição de amostra pode ser moldado em material plástico e, desse modo, ser fabricado em uma baixa taxa de preço. Assim, pode ser ainda de custo eficaz usar um dispositivo de aquisição de amostra descartável.

Se um agente de coloração é usado, a amostra pode ser irradia- da por luz de um comprimento de onda correspondendo a um pico na absor- bância do agente de coloração. Consequentemente, os trombócitos corados os quais contêm uma acumulação de agente de coloração serão detectados através de uma baixa transmitância de luz.

Nesse caso, a irradiação pode ser realizada por meio de uma

fonte de laser. A fonte de laser pode proporcionar luz de um comprimento de onda bem definido que se adapta à absorbância do agente de coloração. Ainda, a fonte de laser proporciona luz colimada, minimizando perturbações da luz errante, de modo que um ponto de baixa transmitância de luz será nitidamente distinguido.

A irradiação pode, alternativamente, ser realizada por meio de um diodo que emite luz. Essa fonte de luz pode ainda proporcionar condi- ções de irradiação suficientes para distinguir apropriadamente trombócitos de outra matéria na amostra. Alternativamente, especialmente se o contraste de fase é utiliza-

do, uma lâmpada de tungstênio-halogênio pode ser usada para irradiar a amostra.

A imagem digital pode ser adquirida usando um poder de ampli- ação de 3-200x, mais preferivelmente 4-20x. Dentro dessas faixas de poder de ampliação, os trombócitos são suficientemente ampliados de forma a se- rem detectados, enquanto que a profundidade de campo pode estar disposta para abranger a espessura da amostra. Um baixo poder de ampliação impli- ca no fato de que uma grande profundidade de campo pode ser obtida. Con- tudo, se um baixo poder de ampliação é usado, os trombócitos podem ser difíceis de detectar. Um menor poder de ampliação pode ser usado através de aumento do número de pixels na imagem adquirida, isto é, melhorando a resolução da imagem digital.

Uma alternativa é usar um microscópio de contraste de fase, utilizando o desvio de fase que resulta de um pouco da luz que ilumina uma amostra de sangue encontrando membranas e outras estruturas, etc. Nesse caso, os trombócitos da amostra de sangue analisada aparecerão como pontos brilhantes claros, com uma periferia escura. A análise compreende identificação de áreas de alta absorbân- cia de luz na imagem digital. A análise pode ainda compreender identificação de pontos pretos ou escuros na imagem digital ou, quando contraste de fase é usado (com ampliação alta o bastante), anéis escuros correspondem à periferia do trombócito.

A análise pode ainda compreender ampliação eletrônica da ima- gem digital ampliada. Enquanto a amostra está sendo ampliada para aquisi- ção de uma imagem digital ampliada da amostra, a imagem digital adquirida em si pode ser eletronicamente ampliada para simplificar a distinção entre objetos, que têm a imagem formada muito proximamente uns dos outros na imagem digital adquirida. Breve Descrição dos Desenhos

A invenção será agora descrita em mais detalhes à guisa de e- xemplo sob referência aos desenhos em anexo. A figura 1 é uma vista esquemática de um dispositivo de aquisi-

ção de amostra de acordo com uma modalidade da invenção.

A figura 2 é uma vista esquemática de um dispositivo de aquisi- ção de amostra de acordo com outra modalidade da invenção.

A figura 3 é uma vista esquemática de um aparelho de medição de acordo com uma modalidade da invenção.

A figura 4 é um fluxograma de um método de acordo com uma modalidade da invenção.

Descrição Detalhada de uma Modalidade Preferida

Fazendo referência agora à figura 1, um dispositivo de aquisição de amostra 10 de acordo com uma modalidade da invenção será descrito. O dispositivo de aquisição de amostra 10 é descartável e tem de ser jogado fora após ter sido usado para análise. Isso implica no fato de que o dispositi- vo de aquisição de amostra 10 não requer manipulação complicada. O dis- positivo de aquisição de amostra 10 é, de preferência, formado de um mate- rial plástico e pode ser fabricado através de moldagem por injeção. Isso tor- na a fabricação do dispositivo de aquisição de amostra 10 simples e barata, pelo que os custos do dispositivo de aquisição de amostra 10 podem ser mantidos baixos.

O dispositivo de aquisição de amostra 10 compreende um ele- mento de corpo 12, o qual tem uma base 14, a qual pode ser tocada por um operador sem causar qualquer interferência nos resultados da análise. A base 14 pode também ter projeções 16 que podem se adaptar a um conten- tor em um aparelho de análise. As projeções 16 podem estar dispostas de modo que o dispositivo de aquisição de amostra 10 esteja corretamente po- sicionado no aparelho de análise.

O dispositivo de aquisição de amostra 10 ainda compreende uma entrada de amostra 18. A entrada de amostra 18 é definida entre pare- des opostas dentro do dispositivo de aquisição de amostra 10, as paredes estando dispostas tão próximas umas das outras que uma força capilar pode ser criada na entrada de amostra 18. A entrada de amostra 18 se comunica com o exterior do dispositivo de aquisição de amostra 10 para permitir que sangue seja extraído no dispositivo de aquisição de amostra 10. O dispositi- vo de aquisição de amostra 10 ainda compreende uma cavidade de medição disposta entre paredes opostas dentro do dispositivo de aquisição de amostra 10. A cavidade de medição 20 está disposta em comunicação com a entrada de amostra 18. As paredes que definem a cavidade de medição 20 estão dispostas mais próximas do que as paredes da entrada de amostra 18, de modo que uma força capilar pode extrair sangue da entrada de amostra 18 na cavidade de medição 20.

As paredes da cavidade de medição 20 estão dispostas a uma distância, umas das outras, de 50-170 micrometros e, mais preferivelmente, 80-150 micrometros. A distância é uniforme sobre toda a cavidade de medi- ção 20. A espessura da cavidade de medição 20 define o volume de sangue que está sendo examinado. Uma vez que o resultado da análise tem de ser comparado com o volume da amostra de sangue que está sendo examina- da, é necessário que a espessura da cavidade de medição 20 seja muito precisa, isto é, apenas variações muito pequenas na espessura são permiti- das dentro da cavidade de medição 20 e entre cavidades de medição 20 de diferentes dispositivos de aquisição de amostra 10. A espessura permite que um volume relativamente grande de amostra seja analisado em uma peque- na área da cavidade. A espessura, teoricamente, permite que trombócitos sejam dispostos uns por cima dos outros dentro da cavidade de medição 20, mas isso pode ser levado em conta para um modelo estatístico.

Uma superfície de uma parede da cavidade de medição 20 é

pelo menos parcialmente revestida com um reagente 22. O reagente 22 po- de ser liofilizado, seco por calor ou seco a vácuo e aplicado à superfície da cavidade de medição 20. Quando uma amostra de sangue é adquirida na cavidade de medição 20, o sangue fará contato com o reagente 22 seco e inicia uma reação entre o reagente 22 e o sangue.

O reagente 22 é aplicado através de inserção do reagente 22 na cavidade de medição 20 usando uma pipeta ou distribuidor. O reagente 22 está diluído em água ou um solvente orgânico quando inserido na cavidade de medição 20. O solvente com o reagente 22 pode encher a cavidade de medição 20. Então, secagem é realizada de modo que o solvente seja eva- porado e o reagente 22 seja preso às superfícies da cavidade de medição 20.

De acordo com um método de fabricação alternativo, o dispositi- vo de aquisição de amostra 10 pode ser formado através de fixação de dois pedaços um ao outro, desse modo, um pedaço forma a parede inferior da cavidade de medição 20 e o outro pedaço forma a parede superior da cavi- dade de medição 20. Isso permite que um reagente 22 seja seco sobre uma superfície aberta antes que os dois pedaços sejam presos um ao outro.

O reagente 22 compreende um agente de hemólise e opcional- mente um agente de coloração. O agente de hemólise pode ser um sal de amônio quaternário, uma saponina, um ácido biliar, tal como deóxicolato, uma digitoxina, um veneno de cobra, um glicopiranosídeo ou um detergente não-iônico do tipo Triton, de preferência uma saponina. O agente de colora- ção, se usado, pode ser azul de metileno, azul de metileno de eosina, azul de metileno de eosina azul-celeste, Plaxan®, hematoxilina, verde de metile- no, azul de toluidina, violeta genciana, um análogo de sudano, galocianina ou um análogo de fuchsina. Quando uma amostra de sangue faz contato com o reagente 22, o agente de hemólise atuará para submeter as células sangüíneas vermelhas à lise, de modo que as células sangüíneas vermelhas sejam misturadas com o plasma sangüíneo. Ainda, o agente de coloração, se usado, pode se acumular nos trombócitos, por exemplo, nas membranas dos mesmos. Se um agente de coloração é usado, o reagente 22 deverá conter quantidades suficientes de agente de coloração para corar, de modo distinguível, todos os trombócitos. Assim, freqüentemente, haverá um ex- cesso de agente de coloração, o qual será intermisturado no plasma sangüí- neo. O excesso de agente de coloração proporcionará um nível de fundo baixo, homogêneo de agente de coloração no plasma sangüíneo. O agente de coloração acumulado nos trombócitos será distinguível acima do nível de fundo de agente de coloração.

O reagente 22 pode também compreender outros constituintes, os quais podem ser ativos, isto é, tomar parte na reação química com a a- mostra de sangue ou não-ativos, isto é, não tomar parte na reação química com a amostra de sangue. Os constituintes ativos podem, por exemplo, es- tar dispostos para catalisar a hemólise ou ação de coloração. Os constituin- tes não-ativos podem, por exemplo, estar dispostos para melhorar a fixação do reagente 22 à superfície de uma parede da cavidade de medição 20. Dentro de uns poucos minutos, a amostra de sangue terá reagi-

do com o reagente 22, de modo que as células sangüíneas vermelhas te- nham sido submetidas à Iise e o agente de coloração, se usado, tenha se acumulado nos trombócitos.

Fazendo referência à figura 2, outra modalidade do dispositivo de aquisição de amostra será descrita. O dispositivo de aquisição de amos- tra 110 compreende uma câmara 120 que forma a cavidade de medição. O dispositivo de aquisição de amostra 110 tem uma entrada 118 na câmara 120 para transporte de sangue para a câmara 120. A câmara 120 está co- nectada a uma bomba (não mostrada) através de um tubo de sucção 121. A bomba pode aplicar uma força de sucção à câmara 120 através do tubo de sucção 121, de modo que sangue pode ser aspirado na câmara 120 através da entrada 118. O dispositivo de aquisição de amostra 110 pode ser desço- nectado da bomba antes que medição seja realizada. Da mesma forma que a cavidade de medição do dispositivo de aquisição de amostra, a câmara 120 tem uma espessura bem definida que define a espessura da amostra a ser examinada. Ainda, um reagente 122 é aplicado às paredes da câmara 120 para reação com a amostra de sangue.

Fazendo referência agora à figura 3, um aparelho 30 para enu- meração volumétrica de trombócitos será descrito. O aparelho 30 compre- ende um contentor de amostra 32 para recebimento de um dispositivo de aquisição de amostra 10 com uma amostra de sangue. O contentor de a- mostra 32 está disposto para receber o dispositivo de aquisição de amostra 10, de modo que a cavidade de medição 20 do dispositivo de aquisição de amostra 10 esteja corretamente posicionada dentro do aparelho 30. O apa- relho 30 compreende uma fonte de luz 34 para iluminação da amostra de sangue dentro do dispositivo de aquisição de amostra 10. A fonte de luz 34 pode ser uma lâmpada incandescente, a qual irradia luz no espectro visível todo.

Se um agente de coloração é usado, o agente de coloração a- cumulado nos trombócitos absorverá luz de comprimentos de onda específi- cos, de modo que os trombócitos surgirão em uma imagem digital da amos- tra. Se uma imagem colorida é adquirida, os trombócitos surgirão como pon- tos especificamente coloridos. Se uma imagem em preto e branco é adquiri- da, os trombócitos surgirão como pontos escuros contra um fundo mais cla- ro.

Se uma abordagem de contraste de fase é utilizada, nenhuma coloração é necessária, embora possa ser prático corar de qualquer forma de modo a facilitar adicionalmente a detecção dos trombócitos e os trombó- citos surgirão como pontos claros com circunferência escura.

A fonte de luz 34 pode, alternativamente, ser um laser ou um diodo que emite luz. Isso pode ser usado para aumentar o contraste na ima- gem, de modo que os trombócitos possam ser detectados mais facilmente. Nesse caso, a fonte de luz 34 está disposta para irradiar radiação eletro- magnética de um comprimento de onda que corresponde a um pico de ab- sorção do agente de coloração. O comprimento de onda deverá ser ainda escolhido de modo que a absorção dos compostos sangüíneos seja relati- vamente baixa. Ainda, as paredes do dispositivo de aquisição de amostra deverão ser essencialmente transparentes ao comprimento de onda. Por exemplo, se azul de metileno é usado como um agente de coloração, a fonte de luz 34 pode estar disposta para irradiar luz tendo um comprimento de on- da de 667 nm.

O aparelho 30 ainda compreende um sistema de formação de imagem 36, o qual está disposto sobre um lado oposto do contentor de a- mostra 32 em relação à fonte de luz 34. Assim, o sistema de formação de imagem 36 está disposto para receber radiação a qual tenha sido transmitida através da amostra de sangue. O sistema de formação de imagem 36 com- preende um sistema de ampliação 38 e um meio de aquisição de imagem 40. O sistema de ampliação 38 está disposto para proporcionar um poder de ampliação de 3-200x, mais preferivelmente 4-20x. Dentro dessas faixas de poder de ampliação, é possível distinguir os trombócitos. Ainda, a profundi- dade de campo do sistema de ampliação 38 pode ainda estar disposta para corresponder pelo menos à espessura da cavidade de medição 20.

O sistema de ampliação 38 compreende uma lente objetiva ou um sistema de lente 42, o qual está disposto próximo ao contentor de amos- tra 32 e uma lente ocular ou sistema de lente 44, o qual está disposto em uma distância da lente objetiva 42. A lente objetiva 42 proporciona uma pri- meira ampliação da amostra, a qual é ainda ampliada pela lente ocular 44. O sistema de ampliação 38 pode compreender outras lentes para realizar uma ampliação e formação de imagem apropriadas da amostra. O sistema de ampliação 38 está disposto de modo que a amostra na cavidade de medição 20, quando colocada no contentor de amostra 32, seja focalizada sobre um plano de imagem do meio de aquisição de imagem 40.

Se um microscópio de contraste de fase estiver compreendido no aparelho de medição da figura 3, um condensador e um anel condensa- dor estarão incluídos entre a fonte de luz 34 e o contentor de amostra 32 e uma placa de fase estará incluída entre a lente objetiva 42 e o meio de aqui- sição de imagem 40.

O meio de aquisição de imagem 40 está disposto para adquirir uma imagem digital da amostra. O meio de aquisição de imagem 40 pode ser qualquer tipo de câmera digital, tal como uma câmera de CCD. O tama- nho de pixel da câmera digital estabelece uma restrição sobre o sistema de formação de imagem 36, de modo que o círculo de confusão no plano da imagem pode não exceder o tamanho de pixel dentro da profundidade de campo. A câmera digital 40 adquirirá uma imagem digital da amostra na ca- vidade de medição 20, em que toda a espessura da amostra está suficien- temente focalizada na imagem digital para contagem dos trombócitos. O sis- tema de formação de imagem 36 definirá uma área da cavidade de medição 20, a qual terá a imagem formada na imagem digital. A área que está tendo a imagem formada junto à espessura da cavidade de medição 20 define o volume da amostra que está tendo a imagem formada. O sistema de forma- ção de imagem 36 é ajustado para se adaptar à formação de imagem de amostras de sangue em dispositivos de aquisição de amostra 10. Não há necessidade de alterar os ajustes do sistema de formação de imagem 36. De preferência, o sistema de formação de imagem 36 está disposto dentro de um alojamento, de modo que o ajuste não é acidentalmente alterado. O aparelho 30 ainda compreende um analisador de imagem 46.

O analisador de imagem 46 está conectado à câmera digital 40 para recebi- mento de imagens digitais adquiridas pela câmera digital 40. O analisador de imagem 46 está disposto para identificar padrões na imagem digital que cor- respondem a um trombócito para contagem do número de trombócitos que estão presentes na imagem digital. Assim, o analisador de imagem 46 pode estar disposto para identificar pontos pretos em um fundo mais claro. O ana- lisador de imagem 46 pode estar disposto para ampliar primeiro eletronica- mente a imagem digital antes de análise da imagem digital. Isso implica no fato de que o analisador de imagem 46 pode ser capaz de distinguir mais facilmente trombócitos que têm a imagem formada mais próximos uns dos outros, mesmo embora a ampliação eletrônica da imagem digital torne a i- magem digital um pouco borrada. O analisador de imagem 46 pode calcular o número de trombóci- tos por volume de sangue dividindo o número de trombócitos que estão sen- do identificados na imagem digital pelo volume da amostra de sangue, a qual é bem definida, conforme descrito acima. A contagem volumétrica de trom- bócitos pode ser apresentada sobre um display do aparelho 30.

O analisador de imagem 46 pode ser concretizado como uma unidade de processamento, a qual compreende códigos para realização da análise de imagem.

Fazendo referência à figura 4, um método para enumeração vo- lumétrica de trombócitos será descrito. O método compreende aquisição de uma amostra de sangue em um dispositivo de aquisição de amostra, etapa 102. Uma amostra não-diluída de sangue íntegro é adquirida no dispositivo de aquisição de amostra. A amostra pode ser adquirida de sangue capilar ou sangue venoso. Uma amostra de sangue capilar pode ser extraída na cavi- dade de medição diretamente do dedo picado de um paciente. A amostra de sangue faz contato com um reagente no dispositivo de aquisição de amos- tra, iniciando uma reação. As células sangüíneas vermelhas serão submeti- das à Iise e um agente de coloração é acumulado nos trombócitos. Dentro de uns poucos minutos de aquisição da amostra de sangue, a amostra está pronta para ser analisada. O dispositivo de aquisição de amostra é colocado em um aparelho de análise, etapa 104. Uma análise pode ser iniciada com- primindo um botão do aparelho de análise. Alternativamente, a análise é au- tomaticamente iniciada pelo aparelho que detecta a presença do dispositivo de aquisição de amostra. A amostra é irradiada, etapa 106, e uma imagem digital de uma

ampliação da amostra é adquirida, etapa 108. A amostra que está sendo irradiada com radiação eletromagnética de um comprimento de onda corres- pondendo a um pico de absorção do agente de coloração. Isso implica no fato de que a imagem digital conterá pontos pretos ou mais escuros nas po- sições dos trombócitos.

A imagem digital adquirida é transferida para um analisador de imagem, o qual desempenha análise de imagem, etapa 110, de forma a con- tar o número de pontos pretos na imagem digital.

O método e o aparelho apresentados aqui podem, por exemplo, estar dispostos para conter aproximadamente 25.000 trombócitos, o que proporciona melhor precisão estatística dos resultados obtidos. Um adulto normal saudável tem uma contagem de trombócitos de cerca de 250 χ 109 trombócitos/litro de sangue. Isso implica no fato de que 25.000 trombócitos são encontrados em amostras tendo um volume de cerca de 0,1 μΙ. Por e- xemplo, se uma área de 1,0 χ 1,0 mm na cavidade de medição tendo uma espessura de 100 μιτι tem a imagem formada, o volume que está tendo a imagem formada é de 0,10 μΙ. Uma parte da imagem adquirida pode ser se- lecionada para análise. Assim, a imagem adquirida pode primeiro ser gros- seiramente analisada, de modo que nenhuma anormalidade seja permitida na parte que está sendo usada para determinação da contagem de trombó- citos. A parte da imagem adquirida selecionada para análise pode ser sele- cionada tendo um tamanho apropriado, de modo que um volume suficiente de amostra de sangue seja analisado.

Deve ser enfatizado que as modalidades preferidas descritas aqui não são, de modo algum, Iimitativas e que muitas modalidades alterna- tivas são possíveis dentro do escopo de proteção definido pelas reivindica- ções em anexo.

Claims (29)

1. Dispositivo de aquisição de amostra para enumeração volu- métrica de trombócitos em uma amostra de sangue, o referido dispositivo de aquisição de amostra compreendendo: uma cavidade de medição para recebimento de uma amostra de sangue, a referida cavidade de medição tendo uma espessura fixa prede- terminada, um reagente, o qual está disposto em uma forma seca sobre uma superfície que define a cavidade de medição, o referido reagente com- preendendo um agente de hemólise para Iise de células sangüíneas verme- lhas na amostra de sangue e o referido reagente ainda compreendendo um agente de coloração para coloração seletiva de trombócitos na referida a- mostra de sangue.

2. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com a reivindi- cação 1, em que o dispositivo de aquisição de amostra compreende um e- Iemento de corpo tendo duas superfícies planas para definir a referida cavi- dade de medição.

3. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com a reivindi- cação 2, em que as superfícies planas estão dispostas em uma distância predeterminada uma da outra para determinar uma espessura de amostra para uma medição óptica.

4. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a cavidade de medição tem uma espessura uniforme de 50 a 170 micrometros, mais preferivelmente 80 a 150 micrometros.

5. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o agente de coloração está disposto para corar seletivamente as membranas dos trombócitos.

6. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o agente de coloração é qualquer um no grupo de azul de metileno, azul de metileno de eosina, azul de metileno de eosina azul-celeste, Plaxan®, hematoxilina, verde de metileno, azul de toluidina, violeta genciana, um análogo de sudano, galocianina ou um análo- go de fuchsina.

7. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o agente de hemólise é um sal de amônio quaternário, uma saponina, um ácido biliar, uma digitoxina, um veneno de cobra, um glicopiranosídeo ou um detergente não-iônico do tipo Triton, de preferência uma saponina.

8. Dispositivo de aquisição de amostra de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ainda compreendendo uma entrada de amostra que comunica a cavidade de medição com o exterior do dispositivo de aquisição de amostra, a referida entrada estando disposta para adquirir uma amostra de sangue.

9. Método para enumeração volumétrica de trombócitos em uma amostra de sangue, o referido método compreendendo: aquisição de uma amostra de sangue em uma cavidade de me- dição de um dispositivo de aquisição de amostra, a referida cavidade de me- dição contendo um reagente compreendendo um agente de hemólise e op- cionalmente um agente de coloração para reagir com a amostra, de modo que os trombócitos sejam corados, irradiação da amostra com os trombócitos, aquisição de uma imagem digital de uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição, em que os trombócitos se distinguem através de coloração sele- tiva do agente de coloração e/ou através de contraste de fase, a referida i- magem digital sendo adquirida em uma profundidade de campo pelo menos correspondente à espessura da cavidade de medição e análise digital da imagem digital para identificação de trombóci- tos e determinação do número de trombócitos na amostra.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a amostra de sangue é misturada com o reagente na cavidade de medição.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que a cavidade de medição tem uma espessura de 50 a 170 micrometros, mais preferivelmente 80 a 150 micrometros.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que um volu- me de uma amostra analisada é bem definido pela espessura da cavidade de medição e uma área da amostra que está tendo a imagem formada.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, em que a amostra é irradiada pela luz de um comprimento de onda cor- respondendo a um pico na absorbância do agente de coloração.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, em que a referida irradiação é realizada por meio de uma fonte de laser.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, em que a referida irradiação é realizada por meio de um diodo que emite luz.

16. método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, em que a imagem digital é adquirida usando um poder de ampliação de 3-200x, mais preferivelmente 4-20x.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, em que a referida análise compreende identificação de áreas de alta ab- sorbância de luz na imagem digital.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a referida análise compreende identificação de pontos pretos na imagem digital.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18, em que a referida análise compreende ampliação eletrônica da imagem digital adquirida.

20. Sistema para enumeração volumétrica de trombócitos em uma amostra de sangue, o referido sistema compreendendo: um dispositivo de aquisição de amostra como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 8 e um aparelho de medição compreendendo: um contentor de dispositivo de aquisição de amostra disposto para receber o dispositivo de aquisição de amostra o qual contém uma a- mostra de sangue na cavidade de medição, uma fonte de luz disposta para irradiar a amostra de sangue, um sistema de formação de imagem compreendendo um siste- ma de ampliação e um meio de aquisição de imagem digital para aquisição de uma imagem digital de uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição, em que trombócitos se distinguem na imagem digital através de coloração seletiva do agente de coloração e/ou através de contraste de fase e um analisador de imagem disposto para analisar a imagem digi- tal adquirida para identificação de trombócitos e determinação do número de trombócitos na amostra de sangue.

21. Sistema de acordo com a reivindicação 20, em que o siste- ma de ampliação está disposto com uma profundidade de campo de pelo menos a espessura da cavidade de medição do dispositivo de aquisição de amostra.

22. Sistema de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que um volume de uma amostra analisada é bem definido pela espessura da cavi- dade de medição e uma área da amostra que está tendo a imagem formada.

23. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em que a fonte de luz está disposta para irradiar luz de um comprimen- to de onda correspondendo a um pico na absorbância do agente de colora- ção.

24. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, em que a referida fonte de luz compreende uma fonte de laser.

25. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, em que a referida fonte de luz compreende um diodo que emite luz.

26. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, em que o sistema de ampliação tem um poder de ampliação de 3- 200x, mais preferivelmente 4-20x.

27. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, em que o analisador de imagem está disposto para identificar áreas de alta absorbância de luz na imagem digital.

28. Sistema de acordo com a reivindicação 27, em que o anali- sador de imagem digital está disposto para identificar pontos pretos na ima- gem digital.

29. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, em que o analisador de imagem está disposto para ampliar eletronica- mente a imagem digital adquirida.