BRPI0708383A2 - antìgeno vacinal quimérico contra o vìrus da influenza aviário e composição de vacina capaz de produzir uma resposta imune protetora contra vìrus da influenza aviária em aves e em mamìferos - Google Patents

Abstract

ANTìGENO VACINAL QUIMERICO CONTRA O VìRUS DA INFLUENZA AVIáRIA E COMPOSIçãO DE VACINA CAPAZ DE PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE PROTETORA CONTRA O VìRUS DA INFLUENZA AVIARIA EM AVES E EM MAMìFEROS A presente invenção descreve antígenos vacinais quiméricos contra o vírus da influenza aviária (IA). Os referidos antígenos vacinais são baseados em subunidades virais que estão acopladas a moléculas protéicas estimuladoras do sistema imune, tanto celular como humoral. Os antigenos quiméricos podem ser produzidos em sistemas de expressão que garantem um correto dobramento tridimensional das moléculas quiméricas que constituem a base da presente invenção. As composições vacinais que contêm os referidos antígenos quiméricos induzem uma resposta imune potente e temporã tanto nas aves quanto nos mamíferos vacinados, estimulando altos títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação e uma potente resposta celular específica contra o antígeno viral. Os antigenos quiméricos, assim como as composições vacinais resultantes são aplicáveis à esfera da saúde humana e animal, como vacinas para uso preventivo.

Description

"ANTÍGENO VACINAL QUIMÉRICO CONTRA O VÍRUS DAINFLUENZA AVIARIA E COMPOSIÇÃO DE VACINA CAPAZ DEPRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE PROTETORA CONTRA O VÍRUSDA INFLUENZA AVIARIA EM AVES E EM MAMÍFEROS"

Campo da técnica

A presente invenção se refere ao campo da medicina humana eveterinária, particularmente com novos antígenos quiméricos quecompreendem subunidades virais do vírus da GA, acoplados a moléculasprotéicas estimuladoras do sistema imune celular e humoral, e desenvolvemtanto em aves quanto em mamíferos uma resposta imune potente e rápidacontra o referido vírus.

Estado da técnica Anterior

A gripe aviária (GA) é uma doença respiratória distribuídamundialmente. Esta doença altamente contagiosa pode afetar frangos, perus,patos, gansos, galinhas d'angola, bem como uma ampla variedade de pássarosou aves silvestres. Existe a possibilidade de que todas as espécies aviáriassejam suscetíveis á infecção, sendo as espécies aquáticas migratórias, oprincipal reservatório natural do vírus que causa esta doença.

A infecção pelos vírus da gripe aviária nas aves de criaçãodomésticas provoca duas formas de doença que se distinguem segundo seunível alto ou baixo de virulência. A forma "patogênica baixa" pode passardespercebida e em geral só produz sintomas leves (tais como penas arrepiadase uma diminuição da produção de ovos). No entanto, a forma altamentepatogênica se propaga mais rapidamente entre as aves de criação. Esta formapode causar doenças que atacam múltiplos órgãos internos e tem uma taxa demortalidade que pode atingir até o 90-100% em um período de 48 horas.

O vírus responsável da GA pertence à famíliaOrtomixoviridae. Os vírus influenza são divididos nos tipos A, B e C combase em suas diferenças antigênicas. Seu material genético é ácidoribonucléico (RNA) de polaridade negativa, segmentado. Os vírus influenzaAeB têm 8 segmentos, enquanto o vírus influenza C só tem 7 segmentos. Ofato de que o genoma viral seja segmentado favorece a recombinaçãogenética, dando lugar a um vírus com características diferentes do original(Capua; Alexander (2004) Avian influenza: recent developments. AvianPathol. 33: 393-404).

O envoltório viral contém duas glicoproteínas, a hemaglutinina(HA) e a neuraminidase (NA). A proteína HA é a proteína de união aoreceptor celular, favorece a fusão do envoltório do vírus com a membranacelular, importante para a penetração do vírus na célula alvo. Esta proteínainduz uma resposta de anticorpos neutralizantes. As mutações na proteína HAprovocam variações antigênicas de maior ou menor grau. A proteína NA cortao ácido siálico das células do hospedeiro, favorecendo a liberação do vírusdas células, degrada o muco e facilita o acesso do vírus ao tecido. A NA dovírus influenza A também experimenta mudanças antigênicas.

Normalmente, os vírus da gripe aviária não infectam a outrasespécies fora as aves e os porcos. O primeiro caso de infecção humana por umvírus de gripe aviária foi documentado em Hong Kong, em 1997, quando acepa H5N1 ocasionou uma doença respiratória severa em 18 indivíduos, dosquais seis faleceram. A infecção dos indivíduos coincidiu com uma epidemiade gripe aviária altamente patogênica na população avícola de Hong Kong,produzida pela mesma cepa. Em fevereiro de 2003 se produziu uma novaalerta em Hong Kong, quando um surto de gripe aviária H5N1 ocasionou umamorte entre membros de uma família que tinha viajado recentemente ao sul daChina. Outro menor da família faleceu durante a dita visita, mas sedesconhece a causa de sua morte.

Recentemente, outras duas cepas virais da GA causaramdoença em humanos. Em Hong Kong, em 1999 produziram dois casos levesda H9N2 em meninos e em meados de dezembro de 2003 se reportou outrocaso. O subtipo H9N2 em aves comumente não é altamente patogênico. Noentanto, um surto de vírus influenza aviária H9N2 altamente patogênico, quese iniciou na Holanda em fevereiro de 2003, causou dois meses depois, amorte de um veterinário e doença leve em outras 83 pessoas.

Desde 1997 até esta data, os surtos de gripe aviária capazes deinfectar o ser humano foram mais freqüentes, e se disseminaram por umgrande número de países de Ásia e Europa. Até o momento, a cepa H5N1 foio principal causador de gripe em seres humanos. Até outubro do 2005 tinhamse reportado ao torno de 200 pessoas infectadas pelo H5N1, com uma taxa demortalidade de aproximadamente 55%. Treze países da Ásia e Europa foramafetados, e mais de 120 milhões de aves morreram ou colocadas emquarentena. Por regra geral, cada surto da GA, conduz ao sacrifício decentenas de milhares de aves e à adoção de medidas de controle sanitário,tudo o que se traduz em grandes perdas econômicas.

Durante um surto de gripe aviária entre aves de criação, existeo risco de que sejam contaminadas pessoas que têm contato com avesinfectadas ou com superfícies que estão contaminadas com secreções eexcreções das referidas aves. A disseminação da infecção entre as avesaumenta as oportunidades de infecção direta dos humanos. Se mais pessoasadquirem a infecção, com o passar do tempo também aumenta o risco de queas pessoas, se estão infectadas conjuntamente por cepas de gripe aviária e deinfluenza humana, também poderiam servir de "recipientes de mistura" para osurgimento de um novo subtipo. Este novo subtipo, com suficientes genes dovírus influenza humana, poderia se transmitir facilmente de pessoa a pessoa, ese transformaria assim em uma cepa pandêmica plenamente transmissível,como a variante de HlNl que em 1918 gerou uma pandemia conhecida como"gripe espanhola", na qual morreram entre 25 e 50 milhões de pessoas.

Uma prioridade imediata é deter a disseminação adicional deepidemias entre as populações de aves. Esta estratégia é efetiva para reduziras oportunidades de exposição humana ao vírus. A vacinação das pessoas comalto risco de exposição a aves infectadas, utilizando as vacinas efetivas contraas cepas de vírus da influenza atualmente em circulação, podem reduzir aprobabilidade de co-infecção humana por cepas de gripe aviária e humana, eassim reduzir o risco de que se produza intercâmbio genético entre ambascepas virais.

Na atualidade, tanto para a prevenção da doença em humanosquanto em aves, os processos para produzir vacinas contra a gripe se baseiamna propagação do vírus em embriões de frango. Posteriormente, os vírusproduzidos por esta via são quimicamente inativados e semipurificados. Noentanto, a referida tecnologia é incapaz de responder a uma possível crisepandêmica. Mediante este procedimento, o desenvolvimento e produção deuma vacina toma vários meses. Depois de identificar uma cepa potencial,requer sua reabsorção com uma cepa altamente produtora para obter aspropriedades de crescimento adequadas. Mais importante ainda é que as cepasH5 responsáveis pelas recentes epizootias, encontram-se associadas anumerosos casos de infecção em humanos e resultam letais nos embriões defrango que são usados para a produção de vacinas. A produção destas vacinasimplica, adicionalmente, a manipulação de cepas patogênicas. Por esta causafaz-se necessário o trabalho sob condições de contenção BL3 com oconseqüente encarecimento do processo e as dificuldades para produzir umaumento em caso de crise.

Demonstrou-se que pessoas com alergias severas ao ovopodem sofrer reações imediatas de hipersensibilidade, devido às proteínas deovo residuais nas preparações vacinais contra a influenza. Em 1976 a vacinacontra a influenza suína foi associada a um incremento na freqüência dasíndrome de Guillain-Barre (Schonberger et al. (1979) Syndrome followingvaccination in the national influenza immunization program, United States,1976-1977. Am. J. Epidemiol. 110:105-23). Até o momento, não se observouum incremento na ocorrência desta doença com os subseqüentes preparadosvacinais a partir de outras cepas.

A produção de vírus baseada em cultivos celulares emergiucomo uma alternativa atrativa para substituir os sistemas de produção emembriões de frango. A referida estratégia implica a produção do vírusinfluenza em cultivos celulares, seguida de um passo de inativação viral epurificação. Este procedimento tem como vantagens que: 1) os cultivoscelulares são fáceis de manipular e podem ser aumentados em um curtoperíodo de tempo, 2) as vacinas de influenza produzidas nestes sistemasforam avaliadas em ensaios clínicos Fase I e Fase II, e demonstrou que sãoseguras e ao menos tão efetivas quanto as produzidas em embriões de frangos(Brands et al. (1999) Influvac: a safe Madin Darby Canine Kidney (MDCK)cell culture based influenza vaccine. Dev Biol Stand,. 98:93-100; Percheson etal. (1999) A Phase I, randomized controlled clinicai trial to study thereactogenicity and immunogenicity of a new split influenza vaccine derivedfrom a non-tumorigenic cell line. Dev Biol Stand. 98:127-32; Alymova et al.(1998) Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza B virusvaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs. J Virol.72:4472-7). Esta estratégia no entanto, ainda tem como limitação requerem devírus reabsorvidos que permitam altos rendimentos. O processo tambémpoderia introduzir mutações específicas da linha celular nos genes virais, oque em princípio, poderia conduzir à seleção de variantes caracterizadas pormudanças antigênicas e estruturais na proteína HÁ, resultando potencialmenteem vacinas menos eficazes (Meiklejohn et al. (1987) Antigen drift andefficacy of influenza virus vaccines. JInfect Dis. 138:618-24; Robertson et al.(1985) Alterations in the hemagglutinin associated with adaptation ofinfluenza B virus to growth in eggs. Virology 143: 166-74; Schild et al.(1983). Evidence for host-cell selection of influenza virus antigenic variants.Nature 303: 706- 9). Entre as limitações adicionais se incluem: 1) a produçãoe manipulação de vírus patogênicos demandam instalações de alta contenção;2) os sistemas de produção baseados em cultivos celulares geralmente sãocaros e tecnicamente exigentes.

A proteção contra o vírus influenza é o resultado da respostaimune contra a proteína HA, da qual existem 15 diferentes tipos, e em menormedida contra a proteína NA, da qual existem 9 subtipos reportados (Suarez;Schultz (2000) Immunology of avian influenza virus: a review. Oev. Comp.Immunol. 24: 269- 283; Swayne; Halvorson. (2003) Influenza. In: Saif5 Y.M.,Barnes, HJ., Fadly, A.M., Glisson, J. R., McDougald, L.R., Swayne, D.E.(Eds.), Diseases of Poultry, 11a ed. Iowa State University Press, Ames, IA,pp. 135-160). As respostas imunes contra as proteínas internas, tais como anucleoproteína ou a proteína da matriz, são insuficientes para garantirproteção no terreno. Praticamente a proteção é prevista pelo subtipoespecifico de HA incluindo na vacina.

Produziram-se vacinas contra a GA, mediante a inserção dogene que codifica para a HA em vetores virais vivos, e o posterior uso destesvetores recombinantes para imunizar a massa aviária. O emprego da vacinabaseada em vetores virais recombinantes vivos tem várias vantagens: 1) Sãovacinas vivas capazes de uma resposta tanto humoral quanto celular, 2)podem ser administrados em aves jovens e induzem uma proteção rápida. Porexemplo, uma vacina recombinante baseada no vírus de Fowlpox pode-seadministrar em aves de 1 dia de idade e induzir proteção contra a doença deMarek uma semana depois (Arriola et al. (1999) Experiências de campo em eluso de vacunos contra influenza aviar. In; Proceedings Curso deEnfermedades Respiratórias de Ias Aves, Asociación Nacional deEspecialistas em Ciências Avícolas: 3-13). Este tipo de vacina facilita adiferenciação entre aves vacinadas e infectadas, pois não induz anticorposcontra os antígenos como a nucleoproteína ou a matriz, que são comuns paraos vírus de IA. No entanto, estas vacinas têm como limitante poderemresponder pobremente e induzir uma imunidade protetora parcial em aves quejá possuem anticorpos contra o vetor viral recombinante, os que são capazesde neutralizar sua função vacinai (Lyschow et al. (2001) Protection ofchickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virusvaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressingthe hemagglutinin (H5) gene. Vaccine 19: 4249-4259; Swayne et al. (2000)Failure of a recombinant fowl poxvirus vaccine containing an avian influenzahemagglutinin gene to provide consistent protection against influenza inchickens preimmunized with a fowl pox vaccine. Avian Dis. 44: 132-137).Quando os vetores virais recombinantes são empregados em aves jovens,então o efeito dos anticorpos maternos pode variar, em dependência do tipode vetor viral empregado, e dos níveis de anticorpos maternos transferidos.Outra limitação no emprego de vetores vivos recombinantes é que a casta dehospedeiros está restringido (por exemplo, o vírus da laringotraqueíteinfecciosa não responde em perus), e em conseqüência estas vacinas estãorestringidas a espécies nas quais a eficácia foi demonstrada.

A geração de candidatos vacinais efetivos contra a influenzarequer de mudanças significativas que garantam uma rápida resposta ante umapossível pandemia. O emprego de vacinas de subunidades, baseadasfundamentalmente no emprego da HA recombinante, constitui umaalternativa muito atraente se for levado em conta que esta estratégia nãoenvolve a manipulação do vírus patogênico, e em conseqüência, não requertrabalho em condições de contenção. Os anticorpos contra a HA são capazesde neutralizar o vírus e constituem a base da imunidade natural frente ainfecções com influenza (Clements (1992) "Influenza Vaccines", in Vaccines:New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, pp. 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA). A HA está presente noenvoltório do vírus em forma trimérica. Cada monômero existe como duascadeias HAl e HA2, unidas por uma simples ponte dissulfeto. HA éproduzida na célula hospedeira como um polipeptídeo precursor glicosilado,com uma massa molecular de aproximadamente 85 kDa, o qual ésubseqüentemente dividido em HAl e HA2. As variações antigênicas namolécula de HA são responsáveis pela ocorrência de surtos de influenza e dolimitado controle da infecção pós-imunização. Até a presente data sedescreveram métodos onde se empregam os sistemas de expressão baseadosem baculovírus para a produção de HA recombinante, como potencial vacinade subunidades contra a gripe (Smith et al. US 5.858.368; Smith et al. US6.245.532). A HA produzida em células de insetos foi avaliada, tanto emhumanos (em ensaios clínicos Fase I e Fase II) quanto em aves de criação,demonstrando em ambos casos sua segurança. Este tipo de vacina, no entanto,não resultou em muito êxito, devido fundamentalmente aos baixos títulos deanticorpos neutralizantes que é capaz de induzir. A HA sozinha, comoantígeno vacinai, possui uma antigenicidade muito baixa que se reflete embaixos títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação e em uma respostacelular consideravelmente reduzida. Por causa de sua baixa antigenicidade, aindução de uma resposta imune eficaz com este antígeno requer aadministração de altas doses, e freqüentemente, múltiplas re-administrações.Estes inconvenientes fazem com que, para suprir a demanda de uma vacinaefetiva contra a GA, requeiram-se volumes de produção muito elevados comos conseqüentes custos associados a qualquer sistema de produção baseadoem cultivos celulares. Em adição a estas limitações, é necessário levar emconta a complexidade técnica e os custos adicionais que derivam danecessidade de administrar múltiplas doses de uma vacina determinada naindústria avícola, onde o número de animais a imunizar em uma simplesunidade pode atingir as dezenas de milhares.

Portanto, um importante problema na prevenção da GA é quenão existem, até a data, vacinas por subunidades que sejam capazes deproduzir uma resposta imune rápida e potente depois da vacinação, e que aomesmo tempo permitam uma relação custo/beneficio favorável.Explicação da invenção

A presente invenção resolve o problema antes mencionado, aoproporcionar antígenos quiméricos de interesse vacinai contra o vírus da GA,caracterizados por conter o segmento extracelular da HA do envoltório dovírus da GA e o segmento extracelular de molécula CD154, o que propicia odesenvolvimento de uma rápida resposta que protege mamíferos e aves dainfecção pelo vírus da IA. A obtenção dos ditos antígenos vacinais não requera propagação em ovos, o que dá como produto uma vacina mais pura, commenores reações imunes adversas. Além disso, não requer inativação viral ouextração dos componentes da membrana do vírus, evita a desnaturalizaçãodos epitopos antigênicos e outras desvantagens relativas à segurança emhumanos, pelos resíduos de reativos químicos na vacina. Além disso, umavacina de influenza produzida em ausência de ovo evita a heterogeneidadeque ocorre durante a adaptação e passe por ovos. Isto resulta em uma vacinaque se ajusta melhor às cepas epidêmicas de influenza, o que implica umamaior eficácia.

Em uma materialização da invenção, emprega-se uma variantesecretável da HA a qual lhe dividiu o domínio transmembranário e o domíniocitoplasmático. A variante secretável da HA está preferivelmente unida a umaseqüência estimuladora do sistema imune (adjuvante molecular) que garante aobtenção de altos títulos de anticorpos neutralizantes contra o vírus deinfluenza.

Em uma realização preferida o antígeno vacinai quimérico secaracteriza por conter, essencialmente, as seqüências aminoácidas dosegmento extracelular da molécula CD154 de origem aviária, suína ouhumana, identificadas na Listagem de seqüências com a identificação deseqüência (Id. Sec.) Não. 6, Id. Sec. No. 8 e Id. Sec. No. 4, respectivamente.

Em uma materialização da invenção, o antígeno vacinaiquimérico se caracteriza por conter, essencialmente, as seqüênciasaminoácidas do segmento extracelular da HA dos subtipos virais H5 (Id. Sec.No. 2), H7 (Id. Sec. No. 9) e H9 (Id. Sec. No. 10).

No contexto desta invenção o termo "essencialmente" se referea que a seqüência aminoácida que faz parte do antígeno quimérico tenha umelevado grau de homologia com as seqüências enumeradas, mas que, pela altavariabilidade deste antígeno, qualquer seqüência aminoácida proveniente daHA do vírus da GA possa fazer parte dos antígenos quiméricos objeto dapresente invenção. Os ditos antígenos quiméricos incluem, mas não selimitam ao subtipo A prevalente (H5N1), ao subtipo H9N1, a isolados dosubtipo viral H7, ao tipo B que infeta humanos, assim como os vírus deinfluenza que infetam outras espécies de mamíferos e aves.

Para o propósito da presente invenção, os antígenosquiméricos se obtêm por via recombinante, sintética ou mediante conjugaçãoquímica. As seqüências codificantes para a HA poderão ser geradas medianteas técnicas convencionais de reverso-transcrição e subseqüente reação emcadeia da polimerase (RCP). No entanto, em uma realização da presenteinvenção, as seqüências codificantes para a HA são totalmente sintéticas oque garante dispor da seqüência de interesse em um período de tempoconsideravelmente curto, sem necessidade de trabalhar sob as condições decontenção requeridas para o trabalho com o vírus patogênico. O emprego deseqüências sintéticas permite, além disso, a otimização do uso de códons, deacordo com o sistema de expressão que se deseja utilizar. De forma similar, odesenho de genes de HA sintéticos permite a incorporação de mutaçõespontuais que se traduzam em mudanças na estrutura primária da proteína, como fim de incrementar sua antigenicidade.

Em uma realização preferida, o antígeno quimérico é umheterodímero composto pelas subunidades HAl e HA2, em cujo extremo C-terminal está fusionado um peptídeo de seis histidinas que facilita apurificação da proteína recombinante com um nível de pureza superior ao98%. A continuação, no extremo C-terminal da fila de histidina, fusiona-seum peptídeo espaçador composto por quatro unidades repetidas de Gly4Ser(4G4S). No extremo C-terminal do peptídeo espaçador estará fusionado odomino extracelular da molécula CD154 como adjuvante molecular. Opeptídeo 4G4S localizado entre as duas moléculas de HA e CD154, busca dara liberdade estética suficiente a ambas moléculas para atingir a corretaconformação tridimensional.

A molécula quimérica HA-CDl54 objeto desta invenção podeser um trímero constituído pela união não covalente de três polipeptídeos HA-CD154. No entanto, em dependência do sistema de expressão empregado,cada um dos monômeros HA-CD154 poderá se dividir em duas moléculas(HAl e HA2/CD154) gerando moléculas heterodiméricas, as quais se podemunir para conformar trímeros dos heterodímeros HA1-HA2/CD154. Atrimerização nestas moléculas é determinada pela seqüência aminoácidacorrespondente ao domínio extracelular da molécula de CD 154. A estruturatrimérica do antígeno vacinai objeto desta invenção é de grande importânciapara a interação da molécula quimérica com o receptor CD40 na superfíciedas células apresentadoras de antígeno do sistema imune. Uma vez liberadona corrente sangüínea, o antígeno vacinai desta invenção interageespecificamente com os receptores CD40 na superfície das célulasapresentadoras de antígeno do sistema imune. Depois da interação com osreceptores CD40, a molécula quimérica HA-CD154 é internalizada pelascélulas dendríticas do sistema imune. A molécula quimérica é entãoprocessada e apresentada no contexto do sistema de sistema maior dehistocompatibilidade (em inglês "Major Histocompatibility Complex",abreviado MHC) classe I. De forma simultânea, ocorre uma indução dossinais de estimulação secundários (CD80 e CD86) e do receptor de quimocinaCCR-7 na célula dendrítica, o que conduz a sua migração aos nóduloslinfáticos regionais. Estes eventos induzem níveis incrementados de linfócitosT citotóxicos específicos contra a HA.

A proteína quimérica HLA-CDl 54 é capaz também de interagirespecificamente com as células Β. A interação inicial da HA com a moléculade IgM na superfície da célula B facilita a interação da porção de CD 154 damolécula quimérica com os receptores CD40 na superfície da célula Bantígeno-específica. Esta estimulação na célula B induz a internalização damolécula quimérica, seu processamento e sua exposição no contexto do MHCclasse II. Estes eventos conduzem à ativação dos linfócitos T CD4+ e àsubseqüente ativação de uma resposta T auxiliadora tipo dois que induz amudança de classe das imunoglobulinas nas células B, sua maturação eproliferação.

Em uma realização preferida da invenção, o antígeno vacinaiquimérico é obtido a partir do leite de mamíferos geneticamente modificados.

O antígeno vacinai objeto desta invenção será preferencialmente produzido noleite de mamíferos durante o processo de lactação. Com este fim, a produçãopode se realizar no leite de animais transgênicos, nos quais a seqüênciacodificante para a proteína de interesse é inserida sob o controle depromotores específicos da glândula mamária, ou mediante a transformaçãodireta do epitélio glandular mamário de animais não transgênicos mediante oemprego de vetores adenovirais. Em outra realização preferida, os antígenosquiméricos baseados na HÁ fusionada no domínio extracelular da moléculaCD154 se produzem no meio de cultivo de fermentos geneticamentemodificados, ou em cultivos de células de mamíferos transduzidos com umvetor adenoviral contendo o gene em questão.

São também objeto da presente invenção, as composiçõesvacinais capazes de produzir uma resposta imune protetora contra o vírus daGA em aves e em mamíferos, que contêm os antígenos quiméricosanteriormente descritos. Em uma realização particular da invenção as ditascomposições vacinais produzem uma resposta imune protetora contra o vírusda GA em aves, em porcos e em humanos. A composição vacinai pode seradministrada nos animais incluindo no homem, de forma preventiva, por rotasistêmica ou mucosal. Mediante a vacinação com as ditas composições seevitam as grandes perdas humanas, materiais e econômicas que sãoproduzidas depois da infecção pelo vírus da GA.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Expressão dos antígenos HA e HACDp no leite decabras transduzidas com os vetores adenovirais AdHA e AdHACDp,respectivamente. As proteínas presentes nas amostras de soro de leite,correspondentes ao dia 5 pós-transdução adenoviral, se separaram medianteSDS-PAGE a 7,5% em condições redutoras (·) ou não redutoras (A). Aimunoidentificação dos antígenos HA e HACDp foi realizada mediante"Western-blot" com um soro de frango hiperimune contra uma cepa H5N3.

Figura 2. Análise de expressão de clones transformantes de P.pastoris que mostram um fenótipo Muts. "Western Blot" das proteínas deinteresse presentes no sobrenadante de cultivo. Faixa 1: HA; Faixa 2:HACDh; Faixa 3: MP36 não transformada; Faixa 4: Padrão de pesomolecular.

Figura 3. Comparação da resposta imune em frangosvacinados com as variantes HA e HACDp. (A) Tomaram-se 8 gruposexperimentais com 10 frangos cada um, os grupos receberam uma única dosesubcutânea de 1, 3, 6 ou 12 μg de HA ou HACDp. No dia 28 pós-vacinaçãodeterminou-se os títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação. Osresultados são mostrados como a média aritmética +/- o desvio padrão emcada um dos grupos. (B) Cinética de anticorpos inibidores da hemaglutinaçãoem frangos vacinados com 6 μg de HA e HACDp. Os dados são mostradoscomo a média aritmética de todos os animais do grupo em cada amostragem.

Figura 4. Cinética de anticorpos inibidores da hemaglutinação.As vacinas foram administradas nas semanas indicadas pelas setas. A linhadescontínua indica um título de 1:80.

Exposição detalhada de modos de realização / Exemplos

Exemplo 1: Obtenção dos segmentos genéticos que codificam para osdomínios extracelulares da hemaglutinina do vírus A/VietNam/1203/2004 e do CD154 humano, suíno e de frango.

Sintetizou-se a seqüência nucleotídica codificante para a HAdo vírus de GA altamente patogênico A/Viet Nam/1203/2004 do subtipoH5N1, tomada da base de dados do Centro Nacional de Informação emBiotecnologia de Estados Unidos (em inglês "National Center forBiotechnology Information", abreviado NCBI), número de acesso AY818135.A síntese foi realizada empregando um uso de códons otimizado para aexpressão em Capra hircus, seqüência identificada na Listagem deSeqüências como Id. Sec. No. 1. O gene sintético codifica para a seqüênciaaminoácida da HA desde o aminoácido 1 até 537, eliminando assim a regiãotransmembranária e a citoplasmática da proteína (Id. Sec. No. 2). O genesintético foi construído incorporando sítios de restrição Kpn I e Xho I para oextremo 5' da seqüência codificante. Com o objetivo de aumentar a eficiênciana iniciação da tradução, justo antes do códon de início se incorporou umaseqüência consenso de Kozak. No extremo 3' do fragmento codificante paraHA se incluiu na seguinte ordem: um sítio Nhe I, o fragmento codificantepara um segmento de 6 histidinas, um sítio de restrição EcoR I, o códon deparada e um sítio de restrição EcoR V.

Além disso, sintetizaram os genes codificantes para osdomínios extracelulares das moléculas de CD154 humano, suíno e de frango.A síntese foi realizada de acordo com as referências AJ243435 (para Gallusgallus), AB040443 (para Sus scrofa) e X67878 (para Homo sapiens), da basede dados do NCBI. Para a síntese das seqüências de CD154 de Gallus gallus(Id. Sec. No. 5) e de Sus scrofa (Id. Sec. No. 7) empregou-se um uso decódons otimizado para a expressão em Capra hircus. Na seqüênciacodificante para o CD154 humano não se variou o uso de códons (Id. Sec. No.3). Com o objetivo de conferir liberdade estérica, nas três moléculas deCDl 54, incluiu-se um segmento que codifica para um peptídeo composto porquatro unidades repetidas de Gly-Gly-Gly-Gly-Ser no extremo amino-terminal das três moléculas. No extremo 5' do fragmento codificante para osdomínios extracelulares das moléculas de CD154 se incluiu um sítio EcoR Ino extremo 3' (justamente depois do códon de parada) incorporou-se um sítiode corte Sal I. Os polipeptídeos resultantes das seqüências nucleotídicassintéticas aparecem identificados na Listagem de Seqüências como Id. Sec.No. 6 (para Gallus gallus), Id. Sec. No. 8 (para Sus scrofa) e Id. Sec. No. 4(para Homo sapiens).

Exemplo 2: Construção do cassete de expressão da hemaglutinina.

O gene artificial da HA digeriu Kpn I / EcoR V e se inseriu novetor de expressão pAEC-SPT (Herrera et al. (2000) Biochem Biophys. Res.Commun. 279:548-551) previamente digerido com as mesmas enzimas. Ovetor resultante foi denominado pHA. O vetor pHA foi digerido com asendonucleases de restrição EcoR I (que corta depois da fila de histidinajustamente antes do códon de parada da HA) com a endonuclease Sal I (quecorta no lugar múltiplo de clonagem do vetor pHA para o 3' da HA). Osgenes de CD154 foram extraídos dos vetores plasmídicos supridos pelacompanhia GeneArt com as endonucleases Eco RIe Sal I e foram clonadosno vetor pHA. Destas clonagens geraram três vetores de expressão em célulasde mamíferos: pHA-CDp (contém o domínio de CD154 de frango), pHA-CDh (contém o domínio de CD154 de humano), pHA-CDc (contém odomínio de CD154 de porco). Em todos os casos os genes quiméricos da HAficaram sob o controle do promotor imediato rápido de citomegalovírus(pCMV).

Exemplo 3: Construção dos vetores adenovirais (ΔΕ1ΔΕ3) contendo ogene da HA.

Os vetores adenovirais com replicação defectiva foramconstruídos baseados no sistema AdEasy (Tong-Chuan H et al. (1998) Asimplified system for generating recombinant adenoviruses. PNAS USA, 95:2509- 2514), como vetor de transferência se empregou o plasmídeopAdTrack-CMV. O sistema baseado em AdEasy constitui uma alternativarápida e simples de construção de adenovírus recombinantes. As seqüênciascodificantes tanto para a HA quanto a HÁ fusionada aos domíniosextracelulares das variantes humana, suína e de frango da molécula CD154foram extraídas com as endonucleases Xho I e Sal I e clonadas no sítio Xho Ido vetor pAdTrack-CMV. Os vetores resultantes (ptrack-HA, ptrack-HACDp, ptrack-HACDh, ptrack-HACDc) foram linearizados com aendonuclease Pme I e co-eletroporados com o vetor pAdEasy na cepabacteriana BJ5183. Os genomas virais recombinantes foram então digeridoscom a endonuclease Pac I e transfectados na linha celular HEK-293 para aobtenção dos vírions infectivos. Geraram-se 4 vetores virais: Ad-HA, Ad-HACDp, Ad-HACDh e Ad- HACDc. Todos os vetores foram amplificados nalinha celular HEK-293 até um título de 5x1012 unidades formadoras decolônias (UFC) /ml. O vírus produzido foi purificado empregando-se oconjunto de purificação mediante dupla centrifugação em CsCI, se dialisoucontra buffer de armazenamento (10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 4%sacarose) e se conservou a -70°C para seu uso posterior.

Exemplo 4: Transdução direta do epitélio glandular mamário de cabras:produção das variantes de hemaglutinina no leite.

Empregaram-se cabras que se encontravam no terceiro mês delactação e estavam produzindo uma média de 1,3 litros de leite diário. No dia0, os animais receberam uma dose de 10 mg de Diazepan, por viaintramuscular, para diminuir o estresse durante o tratamento. Os animaisforam ordenhados extensivamente para eliminar a maior quantidade possívelde leite nas cisternas, as glândulas mamárias foram enxugadas duas vezesmediante a infusão de solução salina a 37°C e posterior ordenha. Todas asinfusões foram realizadas diretamente através do canal da mama para a qualse empregou um cateter acoplado a bomba peristáltica. As infusões foramrealizadas lentamente enquanto de forma simultânea se lhes deram massagensnos úberes infundidos.

Em cabras, o úbere pode se separar em duas metadesindependentes. A cada glândula mamária foi infundida uma solução de PBSsuplementada com 30 mM de EGTA, contendo uma carga viral de IO9UFC/ml. O volume infundido em cada metade de úbere foi variáveldependendo da capacidade do úbere (como média, 600 minha por meioúbere). Depois da infusão massagearam o úbere para facilitar que a solução sedistribuísse homogeneamente e atingisse a totalidade de dutos e alvéolos. Asolução infundida foi removida no dia seguinte mediante ordenha. Asglândulas mamárias foram enxugadas novamente mediante a infusão PBScom o objetivo de eliminar a maior quantidade possível de vetoresadenovirais remanescentes na cisterna e nos dutos mamários.

Começou-se a coletar o leite a partir dos animais infundidospor ordenha manual a partir das 48 horas pós-infusão. Realizaram-se duasordenhas diárias, uma na manhã e outra ao final da tarde. A maior parte doleite coletado foi armazenado a -70°C para a posterior purificação da proteína,enquanto pequenas amostras foram usadas para detectar e quantificar oconteúdo das variantes de HA em cada um dos lotes.

A detecção das variantes de HA no leite foi levada a cabocomo segue. As amostras de 150 μΐ de leite foram adicionados quatrovolumes de buffer de separação (10 mM Tris-HCI, 10 mM CaCl2), depois deincubar 30 minutos no gelo, as amostras foram centrifugadas a 4°C durante 30minutos a 15 OOOg. A fração do soro foi recobrada e as proteínas contidas em10 μl foram separadas mediante eletroforese em gel de poliacrilamida (eminglês "Sodium Dodecyl Sulphate- Polyaerylamide Gel Eletrophoresis",abreviado SDS-PAGE) a 7%. As proteínas foram transferidas para um filtrode nitrocelulose e a presença de HA foi detectada mediante o emprego de umsoro hiperimune de frango. Como anticorpo secundário foi empregado umanticorpo anti-frango em rato conjugado com peroxidase de rabanete (eminglês "Horseradish peroxidase", abreviado HRP). As bandas imunorreativasforam visualizadas mediante o sistema quimioluminescente (em inglês"Enhanced Chemiluminiscence", abreviado ECL) de Amersham PharmaciaBiotech (Fig. 1). A variantes de HA foram produzidas majoritariamente emforma de uma cadeia polipeptídica (HAO e HAO-CD154), embora também sepôde observar a presença do domínio HAl em ambas moléculas.

A quantificação das variantes de HA foi realizada medianteum ELISA contra a H5 desenvolvido no CIGB. Nos animais infundidos comvetores adenovirais do tipo ΔΕ1ΔΕ3, as variantes de HA foram detectadas atéo dia 11 pós-infusão com uma média de expressão de 0.94 g/L, 0.86 g/L, 0.78g/L, 0.87 g/L das proteínas HA, HACDp, HACDh e HACDc,respectivamente, durante os primeiros 7 dias de coleta.Exemplo 5: Construção dos vetores de expressão em Pichiapastoris.

O vetor de expressão em P. pastoris pPSIO foi digeridoenzimaticamente com a endonuclease de restrição Nae I, e submetido a umtratamento com fosfatase alcalina para a desfosforilação dos extremos e ainserção dos genes que codificam para HA, HACDp, HACDh e HACDc.

As seqüências codificantes para as proteínas HA, HACDp,HACDh e HACDc, foram extraídas mediante digestão com as endonucleaseBcl I (cujo lugar de corte se encontra imediatamente depois do peptídeo desecreção da HA) e Sma I (cujo lugar de corte se encontra no extremo 3' daseqüência de interesse). As bandas resultantes foram tratadas com apolimerase Klenow, para obter extremos cegos unidos ao vetor pPSIO. Dasclonagens resultantes foram obtidos os vetores pPS-HA, pPS-HACDp, pPS-HACDh e pPS-HACDc. Em todos os casos, as seqüências codificantes paraas diferentes variantes de HA ficaram sob o controle de um promotor deálcool oxidase (AOXl) e fusionadas a um peptídeo de secreção de Suc2 deSaccharomyces eerevisiae.

Previamente à transformação, os plasmídeos foramlinearizados com a enzima de restrição Sph I. A cepa MP36 de P. pastoris foitransformada mediante eletroporação com os vetores de expressão pPS-HA,pPS-HACDp, pPS-HACDh e pPS-HACDc. A referida cepa é um mutanteauxotrófico his3, o qual depois da transformação adquire um fenótipo HiS+.

Os clones transformantes identificados mediante Dot Blotforam analisados por Southern Blot para determinar em quais tinha ocorrido aintegração mediante substituição do gene AOXl de P. pastoris pelo cassete deexpressão do plasmídeo recombinante, o qual corresponde com um fenótipoMuts (baixa utilização do metanol) e His+. A substituição genética de AOXlocorre por entrecruzamentos das regiões do promotor de AOXl e 3ΆΟΧ1entre o vetor e o genoma. Como resultado destes entrecruzamentos ocorre adeleção da região codificadora do gene AOXl. As cepas recombinantes comfenótipo Muts baseiam a produção do álcool oxidase (AOX) no gene AOX2 esua taxa de crescimento em metanol é baixa.

Os genes que codificam para as diferentes variantes de HAestão sob a regulação do promotor AOX1, o qual é indutível por metanol. P.pastoris secreta somente baixos níveis de proteínas próprias e seu meio decultivo não precisa de suplementos protéicos, portanto, pode-se esperar queuma proteína heteróloga que é secretada, constitua a maioria do total deproteínas no meio (até mais de 80%). A produção dos antígenosrecombinantes foi realizada em fermentadores de 5L mediante a adição demetanol ao cultivo e mantendo o pH do cultivo em 8.0. Como se mostra naFigura 2, a maior parte da HA produzida em P. pastoris foi glicosilada, e foisecretada ao meio de cultivo.Exemplo 6: Purificação dos antígenos HA, HACDp, HACDh e HACDc.

Para a purificação dos antígenos HA, HACDp, HACDh eHACDc, a partir do leite de cabras, realizou-se uma operação dedesengorduramento mediante centrifugação do leite a 10 000 rpm a 4°Cdurante 30 minutos. O leite livre de gordura foi diluído 1:5 (v/v) em BufferTris-HCl pH 8.0, CaCl2 10 mM. Depois de 1 hora a 4°C, precipitaram-se ascaseínas mediante centrifugação a 10 000 rpm durante 30 minutos. Os sorosdo leite contendo cada um dos antígenos foram clarificados mediantefiltragem seriada em filtros de 5 μΜ, 0.8 μΜ e 0.2 μΜ. Os soros clarificadosforam diafiltrados contra Buffer Fosfato (50 MM NaH2PO4 pH 8.0, 150 nMNaCl, 10 MM imidazol) e foram aplicados em uma coluna de Ni-NTASefarose. Realizou-se uma operação de lavagem a 50 MM de imidazol e asproteínas recombinantes foram eluídas a 200 mM de imidazol em BufferFosfato.

Para a purificação dos antígenos HA, HACDp, HACDh eHACDc, produzidos em P. pastoris, uma vez concluída a fermentação, ascélulas foram separadas do meio de cultivo mediante centrifugação. O meiocontendo os antígenos recombinantes foi clarificado mediante filtragemseriada em filtros de 5 μΜ, 0,8 μΜ e 0,2 μΜ. O resto da purificação foirealizada de forma similar ao procedimento seguido para purificar a partir doleite.

Exemplo 7: Ensaio de imunogenicidade em frangos das composiçõesvacinais baseadas nos antígenos vacinais HA e HACDp.

Imunização: Os antígenos HA e HACDp usados neste ensaioforam purificados mediante métodos não desnaturalizantes até mais de 98%de pureza, como se pôde determinar mediante análise por densitometria deuma SDS-PAGE. A identidade das proteínas foi confirmada mediante análisesde aminoácidos por espectrometria de massa, e por "Western blot" usando umsoro hiperimune contra H5. Ambos antígenos foram formulados em adjuvanteoleoso Montanide ISA 720. Para a imunização, empregaram-se frangos de 3semanas de idade. De acordo com a dose empregada, foram feitos 8 grupos,de 10 frangos cada um. Quatro dos grupos receberam a formulação baseadano antígeno HA, enquanto os outros quatro grupos receberam a formulaçãobaseada em HACDp. Os animais foram imunizados mediante a administraçãopor via subcutânea de 1 μg, 3 μg, 6 μg, ou 12 μg de antígeno, de acordo com ogrupo, em 200 μΐ da formulação final. Para a imunização foi empregada umaagulha 18G acoplada a uma seringa de 1 ml. A este ensaio foi incorporado umgrupo placebo que não recebeu antígeno. As amostras de sangue para aanálise de resposta sorológica foram tomadas no dia 28 depois da vacinação.

Inibição da hemaglutinação e ELISA: Para os ensaios deinibição da hemaglutinação, os soros foram serialmente diluídos (diluiçãoinicial 1:2) em placas de microtitulação de fundo em U. A cada um dos poçosforam adicionados 4 unidades hemaglutinadoras do antígeno viral ArVietNam/1203/2004 (como foi determinado previamente mediante titulaçãocontra uma suspensão em Buffer Fosfato Salino (em inglês "Phosphate BufferSaline", abreviado PBS) de eritrócitos de frango a 0,5%). A mistura foiincubada a temperatura ambiente durante 1 hora e, passado este tempo, a cadaum dos poços foi adicionado um volume similar de eritrócitos de frango a0,5% em PBS. Os títulos de inibição da hemaglutinação foram lidos depois de30 minutos. Os anticorpos específicos contra a H5 foram determinadosmediante ELISA. As placas foram recobertas com 0,5 μg/poço da proteínaHA, produzida e purificada a partir de cultivos celulares infectados com ovetor AdHA. Os títulos obtidos por ELISA foram expressos como a mais altadiluição que rendeu uma densidade óptica superior ao dobro da média, mais odesvio padrão, das amostras negativas diluídas de forma similar.

Ensaio de expressão de citoquinas: Coletou-se de formaasséptica o baço de frangos imunizados com 6 μg de HA ou HACDp que seencontravam no dia 30 pós-vacinação. Os baços foram cortados em pequenosfragmentos e passados através de um filtro de aço com tamanho de poro de120 μΜ, para obter uma suspensão celular homogênea. As células foramcoletadas mediante centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos erecolocadas em suspensão em PB S. A suspensão celular foi aplicadalentamente sobre uma coluna de Histopaque 1083 (Sigma) em uma relação1:1 (v/v) e foi realizada uma centrifugação a 1000 rpm durante 30 minutos.Coletaram-se as células mononucleares no anel da interfase, foram lavadas 3vezes com PBS e foram ajustadas a uma concentração de 1 χ IO7 células pormililitro de meio RPMI 1640. As células foram semeadas em placas de 24poços a razão de 5 χ IO6 células por poço. Para levar a cabo o ensaio delinfoproliferação, as células foram estimuladas mediante a adição da proteínaHA até uma concentração de 1 μg/ml durante 18 horas a 410C em 5% de CO2.Como controle negativo foram empregadas células do baço de frangosinjetados com placebo. Como controle positivo foram empregadas células dobaço incubadas com Concanavalina A (Con A). Os cultivos foram coletados18 horas depois e o ácido ribonucléico (RNA) total foi extraído para avaliar aindução dos genes de citoquinas. O RNA total foi extraído empregando Tri-Reagent (Sigma). As mostras de RNA foram recolocadas em suspensão naágua e foram quantificadas mediante espectrometria a 260 nm.

Com o objetivo de determinar os níveis relativos de RNAmensageiro de interleucina 12 (IL-12), interferon gama (IFN-y) egliceraldeído-fosfodesidrogenase (GAPDH), realizou-se uma ensaio detranscrição reversa e reação em cadeia da polimerase (TR-RCP) triplicado,como descreveu Svetic e colaboradores no 1991 (Svetic, A. et al. (1991).Cytokine gene expression after in vivo primary immunization with goatantibody to mouse IgD antibody. J. Immunol. 147:2391-2397). O RNA foiretrotranscrito triplicado empregando o jogo de reativos ReverseTranscription System (Promega), de acordo com as especificações dofabricante. Em um estudo prévio se realizou um perfil da quantidade de DNAamplificado em cada ciclo da RCP para cada um dos três genes a analisar. Onúmero de ciclos a usar foram selecionados dentro da região exponencial dacurva de amplificação. O número ótimo de ciclos foi 35 para a IL-12 e para oIFN-γ, enquanto para GAPDH foi de 28. Tanto as células controle positivo(incubadas com Con A) quanto as células controle negativo (derivadas de umgrupo placebo e não estimuladas) foram incluídas em cada ensaio. O geneconstitutivo GAPDH foi amplificado em cada reação da RCP e empregadopara garantir quantidades similares de DNA complementar inicial em cadareação antes de avaliar os genes de interesse.

Depois da RCPl 15 μΐ da mistura final foram analisadasmediante eletroforese em gel de agarose a 2% e checados mediante análise dedensitometria. A intensidade das bandas foi determinada empregando oprograma computacional de análise de imagens Kodak 1D. Os resultados sãoreportados como a média do valor de intensidade de pixéis por banda deinteresse, e como a expressão relativa do gene calculada como a porcentagemdesse valor com respeito à intensidade obtida para o gene constitutivoGAPDH.

Os resultados obtidos em frangos indicam que a formulaçãooleosa contendo os antígenos vacinais HA e HACDp induzem uma resposta,tanto humoral quanto celular, nos animais vacinados. Em ambos casos aresposta imune foi dependente da dose empregada (Fig. 3A). A cinética dedesenvolvimento de anticorpos inibidores da hemaglutinação nos animaisvacinados com 6 μg de HA ou HACDp mostrou que na semana 4 pós-vacinação, o antígeno quimérico é capaz de induzir uma resposta deanticorpos inibidores da hemaglutinação aproximadamente 10 vezes maior àdesenvolvida nos animais vacinados com o antígeno HA (Fig 3B). Tambémnos animais vacinados com o antígeno quimérico HACDp se observou umaexpressão marcadamente superior de IFN-γ e IL-12, quando as célulasmononucleares de sangue periférico foram expostas ao antígeno HA (Tabela1). Este resultado demonstra que a fusão de CD154 ao HA também é capaz deinduzir uma resposta potente a nível celular, específica contra a molécula deHA.

Tabela 1: Resposta imune mediada por células

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Os níveis relativos de produção in vitro de IFN-γ e IL-12 sãomostrados como a média aritmética de todos os animais do grupo.

Exemplo 8: Ensaio de imunogenicidade em humanos das composiçõesvacinais baseadas nos antígenos HA e HACDh.

A segurança, reatogenicidade e imunogenicidade dascomposições vacinais que contêm as proteínas HA e HACDh foram avaliadasem ensaios clínicos em humanos. Ambas proteínas foram obtidas com umgrau de pureza superior a 98,5 % e foram formuladas absorvidas ao hidróxidode alumínio. Como critério de seleção, empregaram-se pessoas sãs do sexomasculino, entre 25 e 40 anos de idade, que não tivessem recebido nenhumavacinação nos últimos 6 meses e que não mostrassem nenhum sintoma degripe. Formaram-se 6 grupos experimentais de 8 pessoas cada um com base àdose (25 μg, 50 μg ou 100 μg) e ao tipo de antígeno a receber (HA ouHACDh). Cada voluntário foi imunizado na semana 0 e recebeu uma segundaimunização na semana 4. A administração foi realizada mediante a injeçãointramuscular de 0,5 ml da composição.

Foram tomadas amostras de sangue no momento da vacinaçãoe durante os três meses seguintes com intervalos de duas semanas. Para adeterminação dos níveis de anticorpos inibidores da hemaglutinação, asmostras de soro foram tratadas com a enzima de destruição de receptores deVibrio cholera, e posteriormente foram aquecidas a 65°C para inativar osinibidores não específicos. Os anticorpos inibidores da hemaglutinação doantígeno viral A/Viet Nam/1203/2004 foram determinados mediante o ensaiopadrão de microtitulação empregando eritrócitos de frango a 0,5%.

Os níveis de imunoglobulinas IgG específicas contra aproteína H5 do vírus A/Viet Nam/1203/2004 foram avaliados medianteELISA. As placas foram recobertas com a proteína HA produzida em cultivoscelulares. A seguir realizou-se diluições seriadas de cada um dos soros.Depois de lavar extensivamente, a cada poço foi adicionado um anticorpoanti-IgG humano produzido em coelho e conjugado com HRP. O revelado foirealizado com o substrato 3,3', 5,5'-Tetrametilo benzidina. O título do ELISAfoi expresso como a mais alta diluição a qual a densidade ótica do poçocontendo antígeno foi ao menos o dobro do poço correspondente semantígeno.

A células mononucleares de sangue periférico (em inglês"Peripheral Blood Mononuclear Cells", abreviado PBMC) foram isoladasmediante separação em um gradiente de Ficoll Isopaque (ICN BiomedicalsInc., Aurora, OH) e foram criopreservadas para os ensaios imunológicos.Depois de descongeladas, as PBMC foram submetidas a um ensaio tipoELISPOT de IFN-γ (Ebioscience) de acordo com às instruções do fabricante.Rapidamente, as placas foram recobertas durante toda a noite com o anticorpode captura. Depois de duas operações de lavagem, as placas foram bloqueadascom RPMI-1640 durante uma hora. Em cada um dos poços foi adicionado oantígeno HA e foram semeadas 5 χ IO5 células. O cultivo foi incubado a 37°Ce 5% de CO2 durante 48 horas. As células decantaram e as placas foramincubadas com um anticorpo anti-interferón conjugado com biotina durante 2horas. Depois de duas operações de lavagens, foi adicionado a cada poçoavidina conjugada com HRP. O revelado foi realizado empregando umasolução de 3-amino-9-etil como substrato. Os resultados mostraram que asvacinas contendo os antígenos recombinantes HA e HACDh não produziramreações locais adversas.

A resposta imune humoral e celular aumentouproporcionalmente com a dose de proteína administrada, tanto nos voluntáriosimunizados com HA quanto nos imunizados com a proteína quiméricaHACDh. No entanto, a comparação entre as variantes HA e HACDhdemonstrou, que a proteína quimérica é capaz de induzir uma respostahumoral 4,2 vezes superior à dose equivalente de HA (Fig. 4), e uma respostacelular 5,2 vezes maior que a resposta produzida pela dose equivalente deHA.

Exemplo 9: Ensaio de imunogenicidade em porcos das composiçõesvacinais baseadas nos antígenos HA e HACDc.

Empregaram-se porcos da raça Landrace entre 18 e 20 kg depeso. Os animais foram distribuídos em 6 grupos experimentais, de acordocom o antígeno e a dose a avaliar. Empregaram-se 8 porcos por cada grupoexperimental, e se criou um grupo placebo. Tanto para HA quanto paraHACDc foram avaliados dose de 20 μg, 40 μg e 80 μg. Ambos antígenosvacinais foram formulados em uma emulsão de adjuvante oleoso e foraminoculados mediante injeção de 2 mL por via intramuscular (IM) na linha dopescoço. O placebo constituído por adjuvante e solução salina fosfatada (v/v),foram inoculados de forma similar.

Tomaram-se amostras de sangue no momento da vacinação e acada 7 dias durante os três meses seguintes. Os anticorpos inibidores dahemaglutinação foram determinados mediante o tratamento prévio dasamostras de soro com a enzima de destruição de receptores de V. cholera parainativar os inibidores não específicos. Os títulos de anticorpos inibidores dahemaglutinação foram determinados mediante o ensaio regular demicrotitulação empregando eritrócitos de frango a 0,5%. A resposta imune aonível celular foi avaliada mediante a estimação relativa dos níveis de RNA doIFN-γ e IL-12, em PBMC estimuladas com o antígeno HA.Nenhuma das duas composições vacinais provocou respostasadversas, já que não se observou alteração dos parâmetros clínicos normais.Os resultados mostraram que as vacinas contendo os antígenos recombinantesHA e HACDc produziram muito poucas reações adversas, de caráter local.

Em ambos grupos, observou-se uma dependência da dose, tanto nos títulos deanticorpos inibidores da hemaglutinação, quanto a resposta celular expressacomo a capacidade das células para proliferar e produzir citoquinas empresença do antígeno HA. Observou-se uma marcada potenciação da respostaimune, tanto a nível humoral quanto celular, nos grupos imunizados com oantígeno quimérico HACDc. A referida proteína foi capaz de induzir títulosde anticorpos inibidores da hemaglutinação 2,5 vezes superiores aosdesenvolvidos frente à dose correspondente de HA. A capacidade de respostacelular, a nível de expressão de IFN-γ e IL-12, também foi de 4,5 e 6 vezesmaior, respectivamente, nos animais imunizados com o antígeno quiméricoHACDc, em comparação com aqueles porcos imunizados com uma doseequivalentes de HA.

Exemplo 10: Expressão de antígenos quiméricos baseados nahemaglutinina a partir de subtipos diferentes do vírus de gripe aviaria.

Sintetizaram-se as seqüências nucleotídicas codificantes paraos domínios extracelulares das HA dos vírus de gripe aviáriaA/Netherlands/33/03(H7N7) (Seqüência IDE No. 9) e A/Hong Kong/1073/99(H9N2) (Seqüência IDE No. 10). Ambos genes foram desenhados com umuso de códons otimizados para a expressão em Capra hircus e flanqueadopelos lugares de restrição Xho I (no 5') e EcoR I (no 3')- Ambos genes foramclonados diretamente no vetor de transferência adenoviral ρAdtrack contendoo domínio extracelular da molécula de CD 154 suína. Os clonesrecombinantes resultantes foram transfectados na linha celular HEK-293T epassadas 72 horas pôde-se detectar a expressão das moléculas quiméricas nomeio de cultivo. Ambas proteínas de fusão foram expressas majoritariamenteem forma trimérica e puderam purificar a partir do meio de cultivo medianteuma simples operação de cromatografia de afinidade a íons metálicos.

Os vetores de transferência adenoviral contendo as variantesquiméricas das HA dos vírus A/Netherlands/33/03 (H7N7) e A/HongKong/1073/99 (H9N2) foram integrados mediante recombinação homólogacom o genoma adenoviral contido no vetor plasmídico pAdEasy a partir dosquais foram gerados e amplificados vetores adenovirais contendo ambasproteínas de interesse.

As HA dos isolados anteriormente mencionados, fusionadas aodomínio extracelular de CDl 54, foram produzidas a altas concentrações noleite de cabras. Esta estratégia permitiu dispor de vários gramas das variantesquiméricas de HA em um prazo inferior a 55 dias a partir do momento em quese dispôs dos genes sintéticos. Depois de purificar ambos antígenosquiméricos, realizou-se um ensaio de imunogenicidade em porcosempregando uma dose fixa de 20 μg por animal, em uma formulação oleosaadministrada por via intramuscular no músculo do pescoço. Em nenhum dosanimais vacinados se observaram reações adversas. A análise sorológicademonstrou que ambas proteínas foram capazes de induzir uma forte respostaimune humoral, atingindo títulos de anticorpos inibidores das hemaglutinaçãosuperiores a 1:800 dentro dos primeiros 28 dias pós-vacinação.LISTAGEM DE SEQUENCIAS

<110> CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY

<120> ANTÍGENO VACINAL QUIMÉRICO CONTRA O VÍRUS DA IA E SUA COMPOSIÇÃO

<130> Influenza aviária<140><141>

<150> CU 2006- 0051

<151> 2006-02-28<160> 10

<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 1670<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência Artificial: Seqüência sintética que codificaa hemaglutinina do virus Viet Nam/1203;2004 fundida a uma extremidade de6 histidinas e flanqueada por vários sítios de restrição.

<400> 1

ggtaccctcg agccaccatg gagaagatcg tgctgctgtt cgccatcgtg tccctggtga 60agagtgatca gatctgtatc ggctaccacg ccaacaactc caccgagcag gtggacacca 120tcatggaaaa gaacgtgacc gtgacccacg cccaggacat cctggagaag aagcacaacg 180gcaagctgtg tgacctggac ggcgtgaagc ccctgatcct gagggactgc tccgtggccg 240gctggctgct gggcaacccc atgtgtgacg agttcatcaa cgtgcccgag tggtcctaca 300tcgtggagaa ggccaacccc gtgaacgacc tgtgctaccc cggcgacttc aacgactacg 360aggagctgaa gcacctgctg tccaggatca accacttcga gaagatccag atcatcccca 420agtccagctg gtcctcccac gaggcctccc tgggcgtgtc ctccgcctgc ccctaccagg 480gcaagtcctc cttcttcaga aacgttgtgt ggctgattaa gaagaacagc acctacccca 540ccatcaagag gtcctacaac aacaccaacc aggaggacct gctggttctg tggggcatcc 600accaccccaa cgacgccgcc gagcagacca agctgtacca gaaccccacc acctacatct 660ctgtgggcac ctccaccctg aaccagaggc tggtgcccag gatcgccacg cgttccaagg 720tgaacggcca gagcggccga atggagtttt tctggaccat cctgaagcca aacgacgcca 780tcaacttcga gtccaacggc aacttcatcg cccccgagta cgcctacaag atcgtgaaga 840agggcgactc caccatcatg aagtccgagc tggagtacgg caactgtaac accaagtgcc 900agaccccaat gggcgccatc aacagctcca tgcccttcca caacatccac cccctgacca 960tcggcgagtg ccccaagtac gtgaagtcca acaggctggt gctggccacc ggcctgagga 1020actcccccca gagggagagg aggaggaaga agaggggcct gttcggcgcc atcgccggct 1080tcatcgaggg cggctggcag ggcatggtgg acggctggta cggctaccac cacagcaacg 1140agcagggctc cggctacgcc gccgacaagg agtccaccca gaaggccatc gacggcgtca 1200ccaacaaggt gaactccatc atcgacaaga tgaacaccca gttcgaggct gtgggcaggg 1260agttcaacaa cctggagagg agaatcgaga acctgaacaa gaagatggag gacggcttcc 1320tggatgtgtg gacctacaac gccgagctgc tggtgctgat ggagaacgag aggaccctgg 1380acttccacga ctccaacgtg aagaacctgt acgacaaggt gaggctgcag ctgagggaca 1440acgccaagga gctgggcaac ggctgcttcg agttctacca caagtgtgac aacgagtgta 1500tggagtctgt gaggaacggc acctacgact acccccagta ctccgaggag gccaggctga 1560agagggagga gatctctggc gtgaagctgg agtccatcgg catctaccag atcctgtcca 1620tctactccgc tagccatcac catcaccacc atatgaattc ttgagatatc 1670

<210> 2<211> 548<212> PRT

<213> Vírus de Influenza A<220>

<221> PEPTÍDEO<222> (1) .. (548)

<223> Seqüência de aminoácidos (iniciando pelo códon de partida "ATG"[nucleotídeo 18] de Seq ID. No 1).<400> 2

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val20 25 30Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr 2 Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe145 150 155 160Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Ala Ser His His His His His530 535 540

His Met Asn Ser545

<210> 3<211> 693<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Seqüência sintética que codificao domínio extracelular da molécula CD154 de Homo sapiens contendo umPEPTÍDEO espaçador em sua extremidade N-terminal<400> 3

gaattctggc ggcggctccg gagggggagg gagcggcgga gggggctcca agatagaaga 60tgaaaggaat cttcatgaag attttgtatt catgaaaacg atacagagat gcaacacagg 120agaaagatcc ttatccttac tgaactgtga ggagattaaa agccagtttg aaggctttgt 180gaaggatata atgttaaaca aagaggagac gaagaaagaa aacagctttg aaatgcaaaa 240aggtgatcag aatcctcaaa ttgcggcaca tgtcataagt gaggccagca gtaaaacaac 300atctgtgtta cagtgggctg aaaaaggata ctacaccatg agcaacaact tggtaaccct 360ggaaaatggg aaacagctga ccgttaaaag acaaggactc tattatatct atgcccaagt 420caccttctgt tccaatcggg aagcttcgag tcaagctcca tttatagcca gcctctgcct 480aaagtccccc ggtagattcg agagaatctt actcagagct gcaaataccc acagttccgc 540caaaccttgc gggcaacaat ccattcactt gggaggagta tttgaattgc aaccaggtgc 600ttcggtgttt gtcaatgtga ctgatccaag ccaagtgagc catggcactg gcttcacgtc 660ctttggctta ctcaaactct gacccgggtc gac 693

<210> 4<211> 225<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<221> PEPTÍDEO<222> (1)..(225)

<223> Seqüência de aminoácidos (iniciando pelo códon "TCT" [nucleotídeo5] de Seq ID. No 3).

<400> 4 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys1 5 10 15 Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr 20 25 30 Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys 35 40 45 Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu 50 55 60 Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly65 70 75 80Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser 85 90 95 Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met 100 105 110 Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys 115 120 125 Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn 130 135 140 Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys145 150 155 160Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His 165 170 175 Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val 180 185 190 Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro 195 200 205 Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys 210 215 220 Leu225<210><211><212><213><220><223>

726DNA

Seqüência Artificial

Seqüência sintética que codificade Gallus gallus contendo oterminal.

Descrição da Seqüência Artificial:o domínio extracelular da molécula CD154PEPTÍDEO espaçador em sua extremidade N-

<400> 5

gaattctggc ggcggctccg gagggggagg gagcggcgga gggggctcca agatggagga 60ctgaacgagg actacatctt cctgaggaag gtgcagaagt gccagaccgg 120aagagcaccc tgctggactg tgagaaggtg ctcaagggct tccaggacct 180gacaggaccg ccagcgagga gctgcccaag ttcgagatgc acaggggcca 24 0cgagcacccc cacctgaaga gcaggaacga gaccagcgtc gccgaggaga agaggcagcc 300catcgccacc cacctggccg gcgtgaagag caacaccact gtgagggtgc tgaagtggat 360tacgccccca cctccagctt catcagctac cacgagggca agctgaaggt 420ggcctgtact acatctacag ccaggtgtcc ttctgtacca aggccgctgc 480ttcaccctgt acatctacct gtacctgccc atggaggagg acaggctgct 540ctggacaccc acagcaccag caccgccctg tgtgagctgc agagcatcag 600gtgttcgagc tgaggcaggg cgacatggtg ttcgtgaacg tgaccgacag 660caccgccgtg aacgtgaacc ccggcaacac ctacttcggc atgttcaagc tgtgacccgg 720gtcgac 726

<210> 6

236PRT

Gallus gallus

ggtgctgtcccgaggaccaggcagtgcaag

gaccacctccggagaaggcccagcgcccccgatgaagggcggagggcggc

<211><212><213><220><221><222><223>de Seq<4 00>

PEPTIDEO(1)..(236)

Seqüência de aminoácidos(iniciando pelo códon "TCT"ID. No 5).

[nucleotídeo 5]

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys1 5 10 15 Met Glu Glu Val Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr Ile Phe Leu Arg Lys 20 25 30 Val Gln Lys Cys Gln Thr Gly Glu Asp Gln Lys Ser Thr Leu Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Lys Val Leu Lys Gly Phe Gln Asp Leu Gln Cys Lys Asp Arg 50 55 60 Thr Ala Ser Glu Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His Arg Gly His Glu65 70 75 80His Pro His Leu Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Val Ala Glu Glu Lys 85 90 95 Arg Gln Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Val Lys Ser Asn Thr Thr 100 105 110 Val Arg Val Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 115 120 125 Phe Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Val Glu Lys Ala Gly Leu 130 135 140 Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Cys Thr Lys Ala Ala Ala Ser145 150 155 160Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro Met Glu Glu Asp 165 170 175 Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr Ser Thr Ala Leu 180 185 190 Cys Glu Leu Gln Ser Ile Arg Glu Gly Gly Val Phe Glu Leu Arg Gln 195 200 205 Gly Asp Met Val Phe Val Asn Val Thr Asp Ser Thr Ala Val Asn Val 210 215 220 Asn Pro Gly Asn Thr Tyr Phe Gly Met Phe Lys Leu 225 230 235<210> 7<211> 693<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da seqüência artificial: Seqüência sintética que codificao domínioespaçador<400> 7gaattctggccgagaggaaccgagggcagcgaagggcatcgggcgaccagcagcgtgctgggagaacggcgaccttctgcgaggagcccccaagccctgtcagcgtgttccttcggcctg<210> 8<211> 225<212> PRT<213> Sus<220><221> PEPTÍDEO<222> (1)..(225)

<223> Seqüência de aminoácidos(iniciando pelo códon "TCT" [nucleotideo 5]de Seq ID. No 7).<400> 8

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys1 5 10 15 Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Ile Lys Thr 20 25 30 Ile Gln Arg Cys Lys Gln Gly Glu Gly Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys 35 40 45 Glu Glu Ile Arg Ser Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys Gly Ile Met Gln 50 55 60 Ser Lys Glu Val Lys Lys Lys Glu Lys Ser Phe Glu Met His Lys Gly65 70 75 80Asp Gln Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser 85 90 95 Lys Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu 100 105 110 Ser Thr Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Arg Gln Leu Ala Val Lys 115 120 125 Arg Gln Gly Ile Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn 130 135 140 Arg Asp Ala Ala Gly Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Arg145 150 155 160Ser Pro Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His 165 170 175 Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val 180 185 190 Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro 195 200 205 Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys 210 215 220

Leu225

<210> 9

extracelular de CD154 de Sus scrofa contendo o PEPTÍDEOem sua extremidade N-terminal.

ggcggctccg gagggggagg gagcggcgga gggggctcca agatcgagga 60ctgcacgagg acttcgtgtt catcaagacc atccagaggt gtaagcaggg 120ctgagcctcc tgaactgtga ggagatcagg agccagttcg aggacctggt 180atgcagagca aggaggtgaa gaagaaggaa aaaagcttcg agatgcacaa 240gacccccaga tcgccgccca cgtgattagc gaggccagca gcaagaccgc 300cagtgggccc ccaagggcta ctacaccctg agcaccaacc tggtgaccct 360aggcagctgg ccgtgaagag gcagggcatc tactacatct acgcccaggt 420tccaacaggg acgccgctgg ccaggcccct ttcatcgcca gcctgtgcct 480agcggcagcg agcgcatcct gctgagggcc gccaacaccc acagcagcag 540ggccagcaga gcatccacct gggcggcgtg ttcgagctgc agcctggcgc 600gtgaacgtga ccgaccccag ccaggtgtcc cacggcaccg gcttcaccag 660ctgaagctgt gacccgggtc gac 693

scrofa<211> 536<212> PRT

<213> Virus de Influenza Ά<220>

<221> PEPTÍDEO<222> (1)..(536)

<223> Seqüência dos domínios extracelulares de hemaglutinina do virus deinfluenza aviária A/Netherlands/33/03(H7N7).

<400> 9

Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Val Ala Ile Ile Pro Thr

1 5 10 15

Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr20 25 30

Lys Val Asn 35 Thr Leu Thr Glu Arg 40 Gly Val Glu Val Val 45 Asn Ala ThrGlu Thr 50 Val Glu Arg Thr Asn 55 Val Pro Arg Ile Cys 60 Ser Lys Gly LysArg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly65 70 75 80Pro Pro Gln Cys Asp 85 Gln Phe Leu Glu Phe 90 Ser Ala Asp Leu Ile 95 IleGlu Arg Arg Glu 100 Gly Ser Asp Val Cys 105 Tyr Pro Gly Lys Phe 110 Val AsnGlu Glu Ala 115 Leu Arg Gln Ile Leu 120 Arg Glu Ser Gly Gly 125 Ile Asp LysGlu Thr Met Gly Phe Thr Tyr Ser Gly Ile Arg Thr Asn Gly Ala Thr 130 135 140 Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp145 150 155 160Leu Leu Ser Asn Thr 165 Asp Asn Ala Ala Phe 170 Pro Gln Met Thr Lys 175 SerTyr Lys Asn Thr 180 Arg Lys Asp Pro Ala 185 Leu Ile Ile Trp Gly 190 Ile HisHis Ser Gly 195 Ser Thr Thr Glu Gln 200 Thr Lys Leu Tyr Gly 205 Ser Gly AsnLys Leu 210 Ile Thr Val Gly Ser 215 Ser Asn Tyr Gln Gln 220 Ser Phe Val Pro

Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp225 230 235 240

Phe His Trp Leu Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe

245 250 255

Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys

260 265 270

Ser Met Gly Ile Gln Ser Glu Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly

275 280 285

Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln

290 295 300

Asn Ile Asn Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln305 310 315 320

Glu Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro

325 330 335

LysArg Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu

340 345 350

Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln

355 360 365

Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser

370 375 380

Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr385 390 395 400

Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Thr Glu Val Glu Lys

405 410 415

Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val420 425 430

Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr

435 440 445

Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys

450 455 460

Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu465 470 475 480

Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn

485 490 495

Thr Tyr Asp His Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Gln Asn Arg Ile

500 505 510

Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Ala Ser His

515 520 525

His His His His His Met Asn Ser

530 535

<210> 10<211> 537<212> PRT

<213> Virus de Influenza A<220>

<221> PEPTÍDEO<222> (1)..(537)

<223> Seqüência dos domínios extracelulares de hemaglutinina do vírus deinfluenza aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).<4 00> 10

Met Glu Thr Ile Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Ser

15 10 15

Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly His Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu

20 25 30

Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Thr Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys

35 40 45

Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu

50 55 60

Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr65 70 75 80

Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr

85 90 95

Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asn

100 105 110

Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Phe Ser Ser Ala Ser Ser

115 120 125

Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Thr Trp Asn Val Thr Tyr

130 135 140

Thr Gly Thr Ser Arg Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg145 150 155 160

Trp Leu Thr Gln Lys Ser Gly Phe Tyr Pro Val Gln Asp Ala Gln Tyr

165 170 175

Thr Asn Asn Arg Gly Lys Ser Ile Leu Phe Val Trp Gly Ile His His

180 185 190

Pro Pro Thr Tyr Thr Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Ile Arg Asn Asp Thr

195 200 205

Thr Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Leu Asn Arg Thr Phe Lys Pro Val

210 215 220

Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr225 230 235 240

Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Val Arg Ser Asn

245 250 255

Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Val Leu Ser Gly Gly Ser

260 265 270

His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Gly Gly Asn Cys Val Val

275 280 285

Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Ser Thr Leu Pro Phe His290 295 300Asn Ile Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Thr Cys Pro Lys Tyr Val Arg Val305 310 315 320

Asn Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Arg Ser

325 330 335

Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp

340 345 350

Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln

355 360 365

Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp

370 375 380

Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln385 390 395 400

Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn405 410 415

Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Val Trp Ala Tyr

420 425 430

Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu

435 440 445

His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu

450 455 460

Gly Ser Asn Ala Met Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His465 470 475 480

Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn

485 490 495

Arg Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu

500 505 510

Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ala Ser

515 520 525

His His His His His His Met Asn Ser530 535

Claims (12)

1. Antígeno vacinai quimérico contra o vírus da influenzaaviária (IA), caracterizado pelo fato de que contém o segmento extracelular daHA da envoltura do vírus da IA e o segmento extracelular da moléculaCD154.

2. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que contém essencialmente as seqüênciasaminoácidas do segmento extracelular da molécula CDl54 de origem aviar(Id. Sec. No. 6), suíno (Id. Sec. No. 8) ou humano (Id. Sec. No. 4).

3. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que contém essencialmente as seqüênciasaminoácidas do segmento extracelular da HA dos subtipos virais H5 (Id. Sec.No. 2), H7 (Id. Sec. No. 9) e H9 (Id. Sec. No. 10).

4. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que é obtido por via recombinante, sintética oumediante conjugação química.

5. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir do leite de mamíferosgeneticamente modificados.

6. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-5, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir do leite de mamíferos nãotransgênicos mediante a transformação genética direta da glândula mamária.

7. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-6, caracterizado pelo fato de que a transformação genética direta da glândulamamária se realiza mediante o emprego de vetores adenovirais.

8. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-5, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir do leite de mamíferostransgênicos.

9. Antígeno vacinai quimérico de acordo com a reivindicação-4, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir de fermentos modificadosgeneticamente.

10. Composição de vacina capaz de produzir uma respostaimune protetora contra o vírus da influenza aviária (LA.) em aves e emmamíferos, caracterizada pelo fato de que contém os antígenos quiméricosdescritos nas reivindicações 1 a 9.

11. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que é capaz de produzir uma resposta imuneprotetora contra o vírus da IA em aves, em porcos e em humanos.

12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que pode ser administrada aos animais, de formapreventiva, por rota sistêmica ou mucosal.