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KR101964044B1 - 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼 - Google Patents

재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼 Download PDF

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KR101964044B1
KR101964044B1 KR1020180029823A KR20180029823A KR101964044B1 KR 101964044 B1 KR101964044 B1 KR 101964044B1 KR 1020180029823 A KR1020180029823 A KR 1020180029823A KR 20180029823 A KR20180029823 A KR 20180029823A KR 101964044 B1 KR101964044 B1 KR 101964044B1
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KR
South Korea
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influenza
recombinant
vaccine
gene
type
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Active
Application number
KR1020180029823A
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English (en)
Inventor
윤현주
한은영
Original Assignee
인제대학교 산학협력단
(주)지뉴인텍
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Filing date
Publication date
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Priority to US16/980,838 priority patent/US11672854B2/en
Priority to CN201980025316.7A priority patent/CN111971393A/zh
Priority to EP19766645.6A priority patent/EP3766979A4/en
Priority to PCT/KR2019/000651 priority patent/WO2019177256A1/ko
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Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에 대한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스를 이용한 약독화된 생백신(live attenuated vaccine) 플랫폼으로 인플루엔자 바이러스처럼 호흡기로 감염되어 백신작용을 나타내므로 접종이 용이하며, 두 가지 타입을 하나로 융합한 다가형 백신으로, 한 가지 백신을 여러 개 혼합하여 사용하는 백신에 비하여 바이러스를 혼합할 필요가 없는 신규성이 높은 백신이다. 두 가지 인플루엔자 항원 유전자를 하나의 유전자로 융합한 유전자를 재조합 바이러스에 넣은 백신은 최초로서, 인플루엔자의 HA 유전자 전체를 사용하지 않고, 전체 HA 유전자의 절반 정도인 구조적으로 독립된 HA1 유전자를 사용함으로써, 여러 타입의 HA 유전자를 하나로 융합할 수 있었다. 재조합 바이러스를 생쥐에 코 흡입 방법으로 접종하였을 때, 두 번의 접종으로 백신 효과가 유도되는 효과적인 백신임을 확인하였고, 본 발명의 백신 플랫폼은 인간 인플루엔자 감염 백신 개발에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼{Multi-valent live-attenuated influenza vaccine platform using recombinant adenovirus}
본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에 대한 것으로, 상세하게는 H5형과 H7형 고병원성 조류독감 바이러스를 동시에 방어할 수 있는 백신 후보 물질을 개발하고, 이 백신 후보 물질을 인체에 무해한 아데노바이러스에 연결하여 제작한 재조합 아데노바이러스를 이용한 조류독감 바이러스(AI virus) 생백신에 관한 것이다.
인플루엔자 또는 플루는 인플루엔자 바이러스에 감염되어 나타나는 호흡기 질환으로, 감염시 오한, 발열, 인후염, 근육통, 두통, 기침 등의 증세를 보여주며, 심한 경우 전격성 폐렴과 같은 치명적인 합병증 유발하는 질환이다. 인간이나 조류 플루는 인플루엔자 A 바이러스에 의하여 발병하며, 야생조류나 여행자를 통하여 단시간에 전세계적으로 전염이 전파되어 전세계적인 플루 전염병(pandemic outbreak)의 원인이 되기도 한다. 조류인플루엔자(AI)는 인플루엔자 A 바이러스의 일종으로 엔빌롭이 있는 부정형의 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 A 바이러스는 Orthomyxoviridae 패밀리에 속하는 엔빌롭이 있는 부정형의 바이러스로, 유전자가 8개의 게놈 조각 RNA(segmented RNA genome)으로 구성된 바이러스이다. 이 바이러스는 돌연변이나 게놈 조각의 재조합 또는 혼합 등의 방법으로 다양한 타입으로 변형되어 매년 새로운 타입의 플루 전염병을 유발하며, 10년 정도의 주기로 전세계적인 플루 전염병을 일으키기도 한다. 인플루엔자 바이러스는 인간, 조류, 돼지 등의 다양한 숙주 세포에 감염되어 증식하여 바이러스입자를 다량 생산하는데, 이러한 특성 때문에 인플루엔자 바이러스는 종종 종간에 유전자 교환을 통하여 전염 숙주를 변경한 새로운 타입의 인플루엔자 바이러스가 출현하기도 한다.
인플루엔자 바이러스는 그 타입이 매우 다양하여 전염병이 발생할 때마다 새로운 타입의 바이러스가 나타난다. 인플루엔자 바이러스에는 A, B, C 3가지 타입이 알려져 있으나, 대부분의 인간 또는 조류 플루 전염병은 인플루엔자 A 바이러스에 의하여 발생한다. 인플루엔자 A 바이러스는 엔빌롭의 HA와 NA 단백질의 항원성에 따라 다양한 H형과 N형으로 구분되는데, H5N1형과 H7N9형이 대표적인 고병원성 AI 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 게놈의 복제 과정 동안 나타나는 유전자 돌연변이나 다른 타입의 바이러스와 게놈 조각의 재조합 또는 혼합 등으로 타입의 전환이 매우 활발한 바이러스이며, 그러한 과정을 통하여 새로운 플루 전염병 발병이 나타나고 있다. 또한, 인플루엔자 바이러스는 인간, 조류, 돼지 등의 다양한 동물에 감염되어 종간의 유전자 교환 가능하기 때문에, AI 바이러스가 인간에 전염되면, 타입의 전환을 통하여 AI 바이러스가 인간 인플루엔자 바이러스로 전환될 가능성도 매우 높다. 예를 들어, 2009년에 발생한 신종 플루의 경우는 인플루엔자 A 바이러스가 인간, 조류, 돼지 숙주세포에 감염되면서 게놈 조각의 재조합을 통하여 얻어진 신형 인플루엔자 바이러스인 것이다. 그런 점에서 현재 유행중인 아시아형 H5N1형과 H7N9형의 조류 인플루엔자 바이러스의 인간 감염이 증가되면 새로운 인간 인플루엔자 바이러스의 출현이 가능한 것이다.
AI 바이러스는 전파속도, 폐사율, 인간전염 등에 따라 고병원성(HPAI)과 저병원성(LPAI)으로 구분하는데, 현재 아시아 지역에서 유행하는 H5N1형과 H7N9형은 대표적인 HPAI이다. 이들 HPAI는 감염된 개체의 사망을 초래하며, 전염의 속도가 빠르기 때문에, 가축전염병예방법에서 제1종 가축전염병으로 분류되며, 인간 감염을 막기 위하여 고단위 전염 억제 수단 적용하는 질병이다. AI 바이러스는 조류가 분비한 바이러스 입자를 인간이 눈코입을 통한 접촉이나 공기 중의 바이러스 입자를 흡입함으로써 인간에게 전염될 수 있다. AI 바이러스의 인간감염은 치명적인 인간 인플루엔자 바이러스로 진화되어 새로운 인간 플루 전염병(pandemic)의 원인이 될 수 있다. HPAI 바이러스는 전염의 속도가 빠르기 때문에 인체감염의 위험을 막기 위하여 가금류 살처분과 같은 고단위 예방조처가 가해지고, 닭고기 소비나 수출입 통제와 같은 조처가 내려지기 때문에, 가금류 산업에 치명적인 전염병이다. 국내에서는 2003년 이후 국내에도 여러 번의 조류인플루엔자(AI)가 발생하고 있으며, 2016년에는 고병원성 조류인플루엔자(AI)가 유행하여 지금까지 대규모의 가금류 살처분이 이루어지고 있다. H5N1형과 H7N9형은 아시아계통 HPAI 바이러스이며, 아주 넓은 숙주범위를 보이기 때문에 인간 감염이 가능하다. 이들 바이러스의 인간 감염은 중국에서는 반복적으로 보고되었으며, 한국에서도 가금류나 철새를 통하여 인간에 전염될 가능성이 상존한다. AI 바이러스 전염병은 2003년 이후 국내 전염이 보고되었고, 2016년 이후 고병원성 조류인플루엔자가 유행하여 현재까지 국내 가금류 산업에 치명적인 영향을 미치고 있다. 2016년 겨울에 발생한 조류인플루엔자로 3개월 동안 닭 5000만 마리 살처분하였으며, 달걀가격 폭등 및 달걀 수입 등으로 경제적 손실만 1조 5천억원 이상 발생하였다.
효과적이고 안전한 가금류 백신의 개발은 농가의 경제적인 손실 뿐아니라 인간 전염의 우려를 막아줄 수 있는 가장 확실한 방법이다. 특히, AI 전염병은 어떤 형의 인플루엔자 바이러스 때문에 발생할지 예측하기 어려운 측면이 있기 때문에 다양한 형의 HPAI 전염을 막을 수 있는 다가형 백신 개발이 필요하다. 또한, AI 전염병 백신은 질병 발생시 즉시 대응할 수 있어야 하므로, 백신 생산이 단기간에 대량으로 이루어져야 하며, 면역 효과가 높고, 호흡기 접종처럼 투여가 용이한 생백신 개발이 필요하다. 또한, HPAI가 유행하지 않은 지역에서도 예방적으로 사용할 수 있으며, 여러 가지의 HPAI 바이러스를 예방할 수 있는 효율적인 다가형 백신이 요구된다. 다가형 백신으로는 현재 여러 타입의 바이러스를 별도로 배양하여 얻은 바이러스를 혼합하여 사용하는데, 이 경우 백신 내의 바이러스 타입 구성의 불균형 및 특정한 타입에 의한 면역 반응 편중 현상 등의 문제점이 존재한다. 이러한 단점을 해소하고 면역반응성이 높으며 접종이 용이한 AI 백신을 개발하기 위하여 하나의 바이러스입자에서 다양한 타입의 인플루엔자 항원을 생산하는 재조합 바이러스 활용한 HPAI 백신 개발이 시급하다.
한국등록특허 제10-1370464호(2014.02.25 등록)
본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주 및 상기 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에 대한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스를 이용한 약독화된 생백신(live attenuated vaccine) 플랫폼으로 인플루엔자 바이러스처럼 호흡기로 감염되어 백신작용을 나타내므로 접종이 용이하며, 두 가지 타입을 하나로 융합한 다가형 백신으로, 한 가지 백신을 여러 개 혼합하여 사용하는 백신에 비하여 바이러스를 혼합할 필요가 없는 신규성이 높은 백신이다. 두 가지 인플루엔자 항원 유전자를 하나의 유전자로 융합한 유전자를 재조합 바이러스에 넣은 백신은 최초로서, 인플루엔자의 HA 유전자 전체를 사용하지 않고, 전체 HA 유전자의 절반 정도인 구조적으로 독립된 HA1 유전자를 사용함으로써, 여러 타입의 HA 유전자를 하나로 융합할 수 있었다. 재조합 바이러스를 생쥐에 코 흡입 방법으로 접종하였을 때, 두 번의 접종으로 백신 효과가 유도되는 효과적인 백신임을 확인하였고, 본 발명의 백신 플랫폼은 인간 인플루엔자 감염 백신 개발에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합 단백질의 구조(A)와 그 아미노산 서열(B)을 나타낸다. 아미노터미날부터 H5형 HA1(1-334)-linker(335-349)-H7형 HA1(350-572) 순서로 연결되었으며, 573-581에는 Flag tag 펩타이드, 및 582-587에는 His tag 펩타이드가 연결되어 있다.
도 2는 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합단백질을 발현할 수 있는 아데노바이러스 제작용 셔틀벡터(pAd5-AI#4212)의 구조를 나타낸다. 제작된 융합단백질 유전자는 pShuttle-CMV 셔틀벡터의 CMV promoter와 SV40 polyA site 사이에 유전자를 전사할 수 있는 방향으로 삽입되었다.
도 3은 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합단백질의 발현 결과를 나타낸다. lane 1: 대조군 GFP 발현 재조합 아데노바이러스에 감염된 세포 배양액, lane 2: 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스(pAd5-AI#4212 adenovirus)에 감염된 세포 배양액.
도 4는 코 흡입을 통한 다가형 재조합 아데노바이러스 생백신을 접종한 생쥐 혈액의 항HA 항체 생산 결과를 나타낸다. 1: 대조군인 GFP 발현 재조합 아데노바이러스 흡입 생쥐 혈청, 2: H5형과 H7형 HA1 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스 흡입 생쥐 혈청.
이에 본 발명자들은 H5형과 H7형의 HPAI에 대한 재조합 아데노바이러스 백신을 제조하기 위하여 H5형과 H7형의 HA 유전자를 하나의 유전자로 융합한 유전자를 백신제조에 사용하였다. 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질은 이 바이러스가 숙주세포에 감염될 때 수용체로 작용하는 단백질로 HA1 부분과 HA2 부분으로 구성되어 있다. HA 단백질에서 이 두 부분은 서로 분리되어도 그 구조에 변형이 없는 독립적인 구조를 유지하고 있으며, HA1 부분만으로도 숙주세포의 수용체에 결합할 수 있다는 점을 이용하여, 축소된 H5형과 H7형의 HA1 유전자 두 개를 하나의 유전자로 합친 융합유전자를 제조하였다. H5형과 H7형의 HA1 유전자 두 개를 하나의 유전자로 연결하게 되면, 전체적인 유전자의 크기가 과도하게 크지 않아 융합된 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제작할 수 있으며, 이 재조합 바이러스를 다가형 인플루엔자 생백신으로 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 리보솜 결합부위, 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자, 링커, 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자 및 태그 유전자를 순서대로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자는 서열번호 2로 표시되고, 상기 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자는 서열번호 3으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 리보솜 결합부위는 단백질의 해독을 도와주는 RBS/Kozak(aaggaggccgccacc) 일 수 있고, 상기 링커는 발현 목적의 두 유전자를 연결하는 역할로서, glycine/serine linker peptide 일 수 있으며, 상기 태그 유전자는 발현 목적 단백질의 정제를 쉽게 하기 위한 역할로서, Flag tag(DYKDDDDKG) 및 His tag(HHHHHH) 유전자 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "혈구응집원(hemagglutinin, HA)"은 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질 중 하나로서 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 인플루엔자 바이러스의 표면 항원단백질이다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 바람직하게는 상기 재조합 균주는 아데노바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 제공한다.
바람직하게는, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "융합 단백질"은, 한 개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 것을 의미하며, 목적 유전자를 포함하는 한 개 이상의 유전자가 재조합 방법에 의해 융합되어 하나의 폴리펩타이드로 번역되어 만들어진 융합 단백질을 의미한다. 본 발명에서 상기 융합단백질은 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열이 서로 융합되어 있으며, 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열 사이에 화학물질 또는 효소가 특이적으로 인지하여 절단할 수 있는 아미노산 절단 서열(화학물질 또는 효소 특이적 절단서열)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 아데노바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 발현할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 닭, 오리, 칠면조, 페럿 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 인간 인플루엔자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "생독 백신" 또는 "생백신(live attenuated vaccine)"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한, "약독화된(attenuation)" 이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 진피내, 근육내, 복막내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 인플루엔자 바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 조류 인플루엔자로 감염된 닭 또는 돼지를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, "예방"이란 백신 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, "치료"란 백신 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> H5형과 H7형 HA1 융합단백질 (H5/H7 fusion protein) 유전자의 제작
H5형 HA1 유전자의 염기서열을 확보하기 위하여 Gene Bank Database에서 1996년에 중국 광동 지역의 거위로부터 분리된 인플루엔자 A 바이러스 (A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1))의 HA 단백질의 아미노산 서열(NC_007362.1)로부터 HA1 지역에 해당하는 아미노터미날 1번에서 346번까지의 아미노산 서열을 선택하였다. 이 아미노산 서열에는 HA 단백질의 리더 펩타이드(Leader peptide) 부분과 HA1 지역에 해당하는 부분의 단백질 암호화 지역이 포함되어 있다. 이 지역에는 HA 단백질의 수용체 결합 부위와 에스터라제(esterase) 부분을 포함하고 있으나, 융합 펩타이드(fusion peptide), HA2 부분, 막 통과 지역은 제외되었다. H7형 HA1 유전자의 염기서열을 확보하기 위하여 Gene Bank Database에서 1999년 이탈리아 닭에서 분리된 인플루엔자 A 바이러스 (A/Chicken/Italy/1067/99(H7N1))의 HA 단백질의 아미노산 서열(AJ584647.1)로부터 HA1 지역에 해당하는 아미노터미날 17번에서 339번까지의 아미노산 서열을 선택하였다. 이 지역에는 HA 단백질의 수용체 결합 부위와 에스터라제(esterase) 부분을 포함하고 있으나, 리더 펩타이드(Leader peptide) 부분, 융합 펩타이드(fusion peptide), HA2 부분, 막 통과 지역은 제외되었다. 이들 두 HA1 단백질을 글리신/세린 링커 펩타이드(glycine/serine linker peptide)로 H5형 HA1(1-334)-linker(335-349)-H7형 HA1(350-572) 순서로 연결하여 하나의 단백질로 발현되도록 연결하였다. 이렇게 연결한 펩타이드에 진핵세포나 대장균에서 효과적으로 해독되도록 이렇게 연결된 펩타이드 아미노산의 카복시터미날쪽에 발현된 단백질의 확인 및 분리과정에 사용할 수 있도록 Flag tag(DYKDDDDKG)과 His tag(HHHHHH)으로 작용하는 펩타이드를 결합시켜 총 587개의 아미노산으로 구성된 단백질을 설계하였다(도 1 및 서열번호 1).
이와 같이 제작된 단백질을 동물세포에서 발현하는 재조합 바이러스를 제작하기 위하여, 이 단백질의 아미노산 서열에 해당하는 코돈 염기서열을 동물세포에서 가장 잘 읽을 수 있는 형태로 코돈을 최적화하여 결정하였다. 최종적으로 전체 염기서열 앞 부분에 단백질의 해독을 도와주는 리보좀 결합부위인 RBS/Kozak 염기서열을 추가하여 융합 단백질을 발현하는 유전자를 합성하였다(RBS KOZAK/HA1(H5) (1-346; 서열번호 2)/GS linker(15)/HAI(H7)(17-339; 서열번호 3)/FLAG/His6tga)(서열번호 4). 유전자의 합성은 코스모진텍의 유전자합성 서비스를 이용하여 제작하였다.
< 실시예 2> H5형과 H7형 HA1 융합 단백질의 발현
상기와 같이 제작된 유전자로부터 융합단백질의 생산을 확인하기 위하여, 이 합성된 유전자를 진핵세포 발현벡터에 삽입하고, 이 발현벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자를 제작하였다. 제작된 융합단백질 유전자는 먼저 재조합 아데노바이러스 제작에 필요한 pShuttle-CMV 셔틀벡터의 CMV promoter와 SV40 polyA site 사이에 유전자를 전사할 수 있는 방향으로 삽입한 pAd5-AI#4212 clone을 얻었다(도 2).
상기 pAd5-AI#4212 DNA를 ㈜지뉴인텍에 의뢰히여 이 플라스미드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자를 제작하여 동물세포에서 융합단백질이 생산되는 지를 조사하였다. 이를 위하여, 2×105 HEK293A cell을 밤새 배양한 다음, MOU가 10,000이 되도록 pAd5-AI#4212 재조합 아데노바이러스 입자 2×109 pfu를 배양액에 섞어주어 세포에 감염시킨 다음 소태아혈청이 포함된 배지에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 소태아혈청이 없는 배지로 교환한 다음 24시간 배양한 후 배양액을 모았다. 이러한 방법으로 총 3번에 걸쳐 감염된 세포의 배양액을 모아 융합단백질을 회수하였다. 수거한 융합단백질이 포함된 배양액을 20배 농축한 다음, Flag tag을 이용한 western blotting 방법으로 윰합단백질의 생산 여부를 조사하였다. 대조군으로는 융합단백질 대신에 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 재조합아데노바이러스를 사용하였다. 농축된 배양액을 SDS-PAGE로 분리한 다음, NC Membrane에 단백질을 옮긴 후, mouse anti-Flag 항체와 반응시킨 후, 이차 항체인 Rat-anti-mouse IgG1-HRP(eBioscience)와 반응시켰다. 반응이 끝나면 PBS로 세척한 다음, WEST-QueenTM kit(iNtRON)으로 반응시킨 후, 형광이미지분석기(Fusion-SL4)를 이용하여 Flag tag 항체와 반응하는 단백질의 존재유무와 그 크기를 측정하였다(도 3). 그 결과 대조군으로 사용된 GFP 발현 재조합 아데노바이러스에 감염된 세포 배양액에서는 Flag tag 항체와 반응하는 단백질이 확인되지 않았으나, 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스(pAd5-AI#4212 adenovirus)에 감염된 세포 배양액에서는 50kDa와 100kDa 크기의 단백질이 Flag tag 항체와 반응하는 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 제작된 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합단백질을 발현 구조물이 성공적으로 융합된 단백질을 생산하는 것으로 보여주는 것이다.
< 실시예 3> 생쥐에서 H5형과 H7형 HA1 융합단백질의 발현 재조합 아데노바이러스의 항체 생산 유도 효과
5주령 Female BALB/c 4마리에 H5형과 H7형 HA1 융합단백질을 발현하는 pAd5-AI#4212 재조합 아데노바이러스 입자를 코 흡입(intranasal instillation) 방법으로 접종하였다. 대조군으로 4마리의 생쥐에는 융합단백질 대신에 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 재조합아데노바이러스를 코 흡입 방법으로 접종하였다. 코 흡입은 5×108 pfu 재조합 아데노바이러스 입자를 인산염완충용액 30μl에 희석한 후, 양쪽 코구멍을 이용하여 5㎕씩 번갈아 가며 흡입시켰다. 1차 접종이 종결되면 3주간 사육한 후, 다시 한번 같은 방법으로 바이러스를 접종하였으며, 접종 1주일 후 생쥐의 안구에서 혈액을 채취하여 항혈청을 만들었다.
융합단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 코 흡입으로 두 번 접종하여 얻은 혈청 내의 융합단백질에 대한 항체생성 유무는 Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)를 이용하여 확인하였다. 먼저 ELISA plate에 세포배양에서 얻은 H5형과 H7형 HA1 융합단백질 배양액을 넣고 4도에서 밤새 반응하여 융합단백질을 코팅하였다. 다음 날 융합단백질 재조합 아데노바이러스로 접종한 생쥐의 혈청을 500배 희석하여 넣어주고, 실온에서 2시간 반응한 다음, HRP가 결합된 anti-mouse IgG/M 이차항체(Merck Millipore AP130P)로 반응한 후, 항원항체반응을 ELISA leader(ThermoFisher MULTISKAN GO)로 450nm에서 측정하였다. 그 결과 H5형과 H7형 HA1 융합단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 흡입한 생쥐의 혈청에서는 융합단백질과 반응하는 항체가 형성되었음을 확인하였다(도 4).
이러한 결과들은 H5형과 H7형 HA1 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스는 정상적인 아데노바이러스처럼 호흡기 점막조직에서 감염되어 생쥐의 면역체계에 인플루엔자 바이러스에 감염되었을 때와 유사한 방식으로 항체반응이 유도되었음을 보여주는 것이다. 즉, 인플루엔자 바이러스의 HA 융합단백질 유전자를 가진 재조합 아데노바이러스는 동물의 호흡기에서 효과적으로 감염되어 효과적으로 삽입된 인플루엔자 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 생백신으로 사용될 수 있음을 제시하는 것이다. 이러한 형태의 융합단백질을 이용한 인플루엔자 백신은 2가지 이상의 인플루엔자 항원을 면역체계에 동시에 제시하는 다가형 백신으로 한 번의 접종으로 여러 인플루엔자 타입을 방어할 수 있는 백신 제조 방법으로 그동안 전혀 시도되지 않은 새로운 인플루엔자 백신 제조 방법이다. 이러한 백신은 여러 타입의 인플루엔자 바이러스를 혼합하여 사용하는 다가 백신에 비하여 여러 가지 장점을 제공한다. 본 발명과 같은 하나의 재조합 바이러스입자에 여러 항원이 결합된 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에서는 각각의 단가형 백신 바이러스를 생산하고 혼합하는 과정이 필요없기 때문에, 신속하게 조류인플루엔자 전염에 대응할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 재조합아데노바이러스는 살아있는 바이러스이기 때문에 AI 바이러스 감염 때처럼 인플루엔자 바이러스에 대해 강력한 면역반응을 유도하며, 약독화된 생백신이므로 인플루엔자 바이러스 감염처럼 호흡기 흡입으로 간편하게 투여할 수 있으며, 대량 예방 접종이 가능하여 가금류 접종에 적합한 백신제조법이다. 더불어, 재조합 아데노바이러스는 비교적 무해한 바이러스로서 백신제조에 고병원성 인플루엔자 바이러스를 사용하지 않기 때문에, 제조 과정의 생물학적 안전 위험도가 낮아 생산 기간의 단축 및 생산 원가의 절감에 더 기여할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Inje university industry-academic cooperation foundation Geneuin-Tech Co., Ltd. <120> Multi-valent live-attenuated influenza vaccine platform using recombinant adenovirus <130> ADP-2018-0053 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Thr Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr His Gly Arg Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Thr 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu 355 360 365 Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu 370 375 380 Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn 385 390 395 400 Val Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln 405 410 415 Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe 420 425 430 Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp 435 440 445 Val Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile 450 455 460 Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys Glu Thr Met Gly Phe Thr Tyr 465 470 475 480 Ser Gly Ile Arg Thr Asn Gly Ala Thr Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly 485 490 495 Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn 500 505 510 Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Asp 515 520 525 Pro Ala Leu Ile Ile Trp Gly Ile His His Ser Gly Ser Thr Thr Glu 530 535 540 Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Leu Ile Thr Val Gly Ser 545 550 555 560 Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro Ser Pro Glu Ala Arg Pro Gln 565 570 575 Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp Phe His Trp Leu Met Leu Asn 580 585 590 Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro 595 600 605 Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys Ser Met Gly Ile Gln Ser Gly 610 615 620 Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly 625 630 635 640 Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile Asn Ser Arg Ala Val 645 650 655 Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Glu Ser Leu Leu Leu Ala Thr 660 665 670 Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Gly Arg Asp Tyr Lys Asp 675 680 685 Asp Asp Asp Lys Gly His His His His His His 690 695 <210> 2 <211> 1038 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza virus H5 type HA1 <400> 2 atggagaaga ttgtcctcct tctcgcaatc gtgtcactgg ttaagagtga tcaaatctgt 60 atcggttacc acgcaaataa ctcaactgag caagtcgata caattatgga gaaaaatgtg 120 acagtcaccc atgctcaaga cattctcgag aagactcaca acggcaagct gtgcgatctc 180 aacggcgtta aaccattgat attgagggat tgttccgtag cgggatggtt gctcggtaat 240 ccgatgtgcg atgaattcat caatgtccct gagtggagtt acatagtgga aaaggcctca 300 ccggcaaacg atctctgcta tcccggcgac ttcaatgatt atgaagaatt gaagcatttg 360 ctctccagga cgaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc ccaaaagctc ttggagcaac 420 cacgacgcaa gcagtggggt cagctcagct tgtccttacc acggacgctc ctccttcttt 480 cgcaatgtag tatggctgat taagaaaaat agcgcgtacc caaccatcaa aagaagttat 540 aataacacga atcaggagga tcttttggtg ctttggggga ttcatcatcc caatgacgcg 600 gccgaacaga ccaagttgta ccaaaacccc accacctaca tcagcgtcgg cacctctact 660 ctgaatcaac gcttggtccc tgaaatagca accagaccaa aggtaaatgg ccaatcaggt 720 cgcatggaat ttttctggac gatcctcaag cctaacgacg cgataaattt cgaatctaac 780 ggcaatttca tagcccccga atacgcttac aagattgtca aaaaaggcga tagcgcaatc 840 atgaagtccg aactggagta tggtaactgc aatactaagt gccaaacccc gatgggagcc 900 ataaatagta gcatgccgtt tcataatatt catccgctga caattggtga gtgtccaaag 960 tacgttaaat ccaatcgcct cgtgttggcg acaggcttgc ggaacacacc tcagcgggag 1020 cggcggagaa aaaagcgc 1038 <210> 3 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza virus H7 type HA1 <400> 3 aacgcggata agatttgctt gggccaccat gccgtgtcca atgggactaa ggtaaacaca 60 ttgaccgaaa ggggcgttga ggttgtaaat gcgaccgaga ctgtagaaag gacgaatgtc 120 ccgcggatat gctctaaggg caaaaggacg gttgacctgg gtcaatgcgg tttgcttggt 180 acgatcacag ggccgcccca atgtgatcaa ttcctggagt tttctgccga ccttataatc 240 gaacgcaggg agggttccga tgtctgttat ccaggtaaat ttgtcaatga ggaggctctc 300 aggcaaatac tccgcgagtc cggaggaata gacaaggaaa ctatgggatt tacatattct 360 ggcattcgaa ccaacggagc tacatccgca tgtcgccggt ccggtagctc attttacgct 420 gagatgaaat ggctcttgag caacacagac aatgccgcgt ttccccaaat gacgaagtcc 480 tacaaaaaca ctagaaaaga tcctgcgctc attatctggg gcattcatca tagcggttca 540 accaccgaac agacgaaact ttatggcagc ggaaataaac tgatcaccgt cggctcatca 600 aattatcagc agtcttttgt gccatcccca gaggcaagac cacaggtgaa cggccaatct 660 gggcgaatcg attttcattg gcttatgctg aaccctaacg acactgtcac tttttctttc 720 aatggagctt ttatagcacc agacagagcc agcttcctca gaggcaaatc tatgggcata 780 cagtctggtg tgcaggtaga cgccaattgt gagggagatt gttatcactc agggggtaca 840 atcatctcaa atctgccttt tcagaatata aatagccggg cagttggcaa gtgcccaaga 900 tacgttaagc aggaaagtct cttgctggca acaggcatga aaaacgtccc agagatcccg 960 aaaggcaga 969 <210> 4 <211> 2115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza virus fusion gene <400> 4 aaggaggccg ccaccatgga gaagattgtc ctccttctcg caatcgtgtc actggttaag 60 agtgatcaaa tctgtatcgg ttaccacgca aataactcaa ctgagcaagt cgatacaatt 120 atggagaaaa atgtgacagt cacccatgct caagacattc tcgagaagac tcacaacggc 180 aagctgtgcg atctcaacgg cgttaaacca ttgatattga gggattgttc cgtagcggga 240 tggttgctcg gtaatccgat gtgcgatgaa ttcatcaatg tccctgagtg gagttacata 300 gtggaaaagg cctcaccggc aaacgatctc tgctatcccg gcgacttcaa tgattatgaa 360 gaattgaagc atttgctctc caggacgaac catttcgaaa agatccagat catccccaaa 420 agctcttgga gcaaccacga cgcaagcagt ggggtcagct cagcttgtcc ttaccacgga 480 cgctcctcct tctttcgcaa tgtagtatgg ctgattaaga aaaatagcgc gtacccaacc 540 atcaaaagaa gttataataa cacgaatcag gaggatcttt tggtgctttg ggggattcat 600 catcccaatg acgcggccga acagaccaag ttgtaccaaa accccaccac ctacatcagc 660 gtcggcacct ctactctgaa tcaacgcttg gtccctgaaa tagcaaccag accaaaggta 720 aatggccaat caggtcgcat ggaatttttc tggacgatcc tcaagcctaa cgacgcgata 780 aatttcgaat ctaacggcaa tttcatagcc cccgaatacg cttacaagat tgtcaaaaaa 840 ggcgatagcg caatcatgaa gtccgaactg gagtatggta actgcaatac taagtgccaa 900 accccgatgg gagccataaa tagtagcatg ccgtttcata atattcatcc gctgacaatt 960 ggtgagtgtc caaagtacgt taaatccaat cgcctcgtgt tggcgacagg cttgcggaac 1020 acacctcagc gggagcggcg gagaaaaaag cgcggaggtg gcggttcagg cggaggaggt 1080 tccgggggag gcggctctaa cgcggataag atttgcttgg gccaccatgc cgtgtccaat 1140 gggactaagg taaacacatt gaccgaaagg ggcgttgagg ttgtaaatgc gaccgagact 1200 gtagaaagga cgaatgtccc gcggatatgc tctaagggca aaaggacggt tgacctgggt 1260 caatgcggtt tgcttggtac gatcacaggg ccgccccaat gtgatcaatt cctggagttt 1320 tctgccgacc ttataatcga acgcagggag ggttccgatg tctgttatcc aggtaaattt 1380 gtcaatgagg aggctctcag gcaaatactc cgcgagtccg gaggaataga caaggaaact 1440 atgggattta catattctgg cattcgaacc aacggagcta catccgcatg tcgccggtcc 1500 ggtagctcat tttacgctga gatgaaatgg ctcttgagca acacagacaa tgccgcgttt 1560 ccccaaatga cgaagtccta caaaaacact agaaaagatc ctgcgctcat tatctggggc 1620 attcatcata gcggttcaac caccgaacag acgaaacttt atggcagcgg aaataaactg 1680 atcaccgtcg gctcatcaaa ttatcagcag tcttttgtgc catccccaga ggcaagacca 1740 caggtgaacg gccaatctgg gcgaatcgat tttcattggc ttatgctgaa ccctaacgac 1800 actgtcactt tttctttcaa tggagctttt atagcaccag acagagccag cttcctcaga 1860 ggcaaatcta tgggcataca gtctggtgtg caggtagacg ccaattgtga gggagattgt 1920 tatcactcag ggggtacaat catctcaaat ctgccttttc agaatataaa tagccgggca 1980 gttggcaagt gcccaagata cgttaagcag gaaagtctct tgctggcaac aggcatgaaa 2040 aacgtcccag agatcccgaa aggcagagac tataaggatg acgacgataa aggacatcat 2100 caccatcatc actga 2115

Claims (15)

  1. 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 리보솜 결합부위, 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자, 링커, 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자 및 태그 유전자를 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자는 서열번호 2로 표시되고, 상기 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 균주는 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  7. 제5항에 따른 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 융합단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및
    상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법.
  12. 제9항의 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자.
  13. 제12항에 따른 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 인간 인플루엔자인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  15. 제13항에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법.
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