BRPI0619748B1

BRPI0619748B1 - Anticorpo monoclonal, polinucleotídeo, composição, mistura, uso de um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo, método para preparar uma composição farmacêutica, linhagem celular de hibridoma isolado, método de diagnóstico de uma doença ou condição associada a amilóide em um paciente, método para diagnosticar uma predisposição para uma doença ou condição, método para monitorar doença residual mínima, método para prever a responsividade de um paciente e kits de teste

Info

Publication number: BRPI0619748B1
Application number: BRPI0619748-5A
Authority: BR
Inventors: Ruth Greferath; David Hickman; Andreas Muhs; Claude Nicolau; Andrea Pfeifer
Original assignee: Ac Immune Sa
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2020-09-24
Also published as: ZA200804916B; KR20150098683A; RU2008128139A; EP2361638B1; RU2551782C2; PH12011502389A1; AU2006326284B2; ECSP088530A; AR058326A1; TWI579303B; RU2015111675A3; MX2008007477A; IL237169A0; NZ568012A; ES2454253T3; BRPI0619748B8; TW201420602A; KR101591223B1; IL191230A; CY1115014T1

Abstract

anticorpo monoclonal, polinucleotídeio, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia pesada, composição, mistura, métodos para produzir um anticorpo, para preparar uma composição farmacêutica ou uma mistura, de diagnóstico de uma doença ou condição associada a amilóide, para determinar o grau de carga de placa amiloidogênica em um tecido, para diagnosticar uma predisposição para uma doença ou condição, para monitorar doença residual mínima e para prever a responsividade de um paciente, uso de um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura, linhagem celular de hibridoma, e, kits de teste. a presente invenção é relacionada a métodos e composições para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de doenças e distúrbios que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de desordens e anormalidades associadas com proteína amilóide tal como mal de alzheimer. a presente invenção fornece novos métodos e composições compreendendo anticorpos altamente específicos e altamente efetivos tendo a capacidade de se reconhecer e se ligar especificamente a epitopos específicos de uma variedade de proteínas (beta) amilóides. os anticorpos possibilitados pelos ensinamentos da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento de doenças e distúrbios que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade incluindo, mas não limitado a, distúrbios neurológicos tal como mal de alzheimer (ad).

Description

ANTICORPO MONOCLONAL, POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO, MISTURA, USO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL OU UMA PARTE FUNCIONAL DO MESMO, MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA ISOLADO, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO ASSOCIADA A AMILÓIDE EM UM PACIENTE, MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UMA PREDISPOSIÇÃO PARA UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO, MÉTODO PARA MONITORAR DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA, MÉTODO PARA PREVER A RESPONSIVIDADE DE UM PACIENTE E KITS DE TESTE

[0001] A presente invenção é relacionada a métodos e composições para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de desordens e anormalidades associadas com proteína amilóide tal como mal de Alzheimer.

[0002] Amiloidose não é uma entidade única de doença mas ao invés disso um grupo diverso de processos de doença progressiva caracterizados por depósitos de tecido extracelular de uma proteína cerosa tipo amido chamada

[0003] ● amilóide, que se acumula em um ou mais órgãos ou sistemas corporais. Na medida em que os depósitos de amilóide se acumulam, eles começam a interferir na função normal do órgão ou sistema corporal. Existem pelo menos 15 tipos diferentes de amiloidose. As principais formas são amiloidose primária sem antecedente conhecido, amiloidose secundária seguindo alguma outra condição, e amiloidose hereditária.

[0004] ● Amiloidose secundária ocorre em pessoas que têm uma infecção crônica ou doença inflamatória, tal como tuberculose, uma infecção bacteriana chamada febre familiar do Mediterrâneo, infecções ósseas (osteomielite), artrite reumatóide, inflamação do intestino delgado (ileíte granulomatosa), doença de Hodgkin, e leprosia.

[0005] ● Depósitos amilóides tipicamente contêm três componentes. Fibrilas de proteína amilóide, que respondem por cerca de 90% do material amilóide, compreendem um de diversos tipos diferentes de proteínas. Estas proteínas são capazes de se enovelar em assim chamadas fibrilas de folha "beta-pregueada", uma configuração protéica exclusiva que exibe sítios de ligação para vermelho Congo resultando nas propriedades de coloração exclusivas da proteína amilóide. Em adição, depósitos amilóides são intimamente associados com o componente (AP) de amilóide P (pentagonal), uma glicoproteína relacionada a amilóide P de soro normal (SAP), e com glicosaminoglicanas (GAG) sulfatadas, carboidratos complexos de tecido conectivo.

[0006] ● Muitas doenças de envelhecimento são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide e são caracterizadas, em parte, pelo acúmulo de depósitos extracelulares de material amilóide ou tipo amilóide que contribuem para a patogênese, assim como a progressão da doença.

[0007] Estas doenças incluem, mas não são limitadas a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson. Outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide são paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outros, incluindo degeneração macular.

[0008] ● Embora patogênese destas doenças possa ser diversa, seus depósitos característicos frequentemente contêm muitos constituintes moleculares compartilhados. Em um grau significante, isto pode ser atribuível à ativação local de vias pró-inflamatórias com isso levando à deposição concorrente de componentes de complemento ativados, reagentes de fase aguda, moduladores imune, e outros mediadores inflamatórios (McGeer et al., 1994).

[0009] ● Mal de Alzheimer (AD) é uma desordem neurológica primariamente pensada ser causada por placas amilóides, uma acumulação de depósito anormal de proteínas no cérebro. O tipo mais frequente de amilóide encontrado no cérebro de indivíduos afetados é composto primariamente de fibrilas Aβ. Evidência científica demonstra que um aumento na produção e acumulação de proteína beta-amilóide em placas leva a morte de célula nervosa, o que contribui para o desenvolvimento e progressão de AD. Perda de células nervosas em áreas estratégicas do cérebro, por sua vez, causa redução nos neurotransmissores e deficiência de memória. As proteínas responsáveis principalmente pelo acúmulo de placa incluem proteína precursora de amilóide (APP) e duas presenilinas (presenilina I e presenilina II). Clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP), que é constitutivamente expressa e catabolizada na maioria das células, pelas enzimas β e y leva à liberação de um peptídeo Aβ de 39 a 43 aminoácidos. A degradação de APPs provavelmente aumenta sua propensão a se agregar em placas. É especialmente o fragmento Aβ(1-42) que tem uma alta propensão de formar agregados devido a dois resíduos de aminoácidos muito hidrofóbicos em seu término C. Acredita-se portanto que o fragmento Aβ(1-42) seja o principal envolvido e responsável pelo iniciação de formação de placa neurítica em AD e tenha, portanto, um alto potencial patológico. Existe portanto uma necessidade por anticorpos específicos que podem ter como alvo e difundir formação de placa amilóide.

[0010] ● Os sintomas de AD se manifestam lentamente e o primeiro sintoma pode ser apenas leve esquecimento. Neste estágio, indivíduos podem esquecer eventos recentes, atividades, os nomes de pessoas familiares ou coisas e pode não ser capaz de resolver problemas matemáticos simples. Na medida em que a doença progride, sintomas são mais facilmente observados e se tornam sérios o suficiente para fazer com que pessoas com AD ou seus membros familiares procurem ajuda médica. Sintomas de estágio mediano de AD incluem esquecer como fazer tarefas simples tal como se cuidar, e problemas se desenvolvem com fala, compreensão, leitura, ou para escrever. Pacientes em estágio avançado de AD podem se tornar ansiosos ou agressivos, podem se perder de casa e no final das contas necessitam de cuidado total.

[0011] ● Atualmente, o único jeito definitivo de diagnosticar AD é identificar placas e tranças em tecido cerebral em uma autópsia depois de morte do indivíduo. Portanto, médicos podem fazer apenas uma diagnose de "possível" ou "provável" AD enquanto a pessoa ainda está viva. Usando métodos atuais, médicos podem diagnosticar AD corretamente até 90 porcento das vezes usando diversas ferramentas para diagnosticar "provável" AD. Médicos perguntam questões acerca da saúde geral da pessoa, problemas médicos passados, e a história de quaisquer dificuldades que a pessoa tem para realizar atividades diárias. Testes comportamentais de memória, resolução de problemas, atenção, contagem, e linguagem fornecem informação sobre degeneração cognitiva e testes médicos tal como testes de sangue, urina, ou fluido espinhal, e exames cerebrais podem fornecer alguma informação adicional.

[0012] ● O tratamento de AD consiste de tratamentos baseados em medicação e não baseados em medicação. Tratamentos que objetivavam mudar o curso fundamental da doença (atrasando ou revertendo a progressão) foram até agora amplamente mal sucedidos. Remédios que restauram o déficit (defeito), ou mau funcionamento, nos mensageiros químicos das células nervosas (neurotransmissores), em particular os inibidores de colinesterase (ChEls) tal como tacrina e rivastigmina, mostraram melhorar sintomas. ChEls impede a degradação enzimática de neurotransmissores com isso aumentando a quantidade de mensageiros químicos disponíveis para transmitir os sinais nervosos no cérebro.

[0013] ● Para algumas pessoas nos estágios iniciais e medianos da doença, as drogas tacrina (COGNEX®, Morris Plains, NJ), donepezil (ARICEPT®, Tokyo, JP), rivastigmina (EXELON®, East Hanover, NJ), ou galantamina (REMINYL®, New Brunswick, NJ) podem ajudar a prevenir alguns sintomas de se tornarem piores por um tempo limitado. Outra droga, memantina (NAMENDA®, New York, NY), foi aprovada para tratamento de AD moderado a severo. Medicações também são disponíveis para tratar das manifestações psiquiátricas de AD. Também, alguns remédios podem ajudar a controlar sintomas comportamentais de AD tal como insônia, agitação, perambulação, ansiedade, e depressão. Tratar estes sintomas frequentemente deixa pacientes mais confortáveis e tornam seu cuidado mais fácil para profissionais de saúde. Infelizmente, apesar de avanços significantes de tratamento mostrando que esta classe de agentes é consistentemente melhor do que um placebo, a doença continua a progredir, e o efeito médio em funcionamento mental foi apenas modesto. Muitas das drogas usadas em medicação de AD tal como, por exemplo, ChEls também têm efeitos colaterais que incluem disfunção gastrointestinal, toxicidade hepática e perda de peso.

[0014] ● Outras doenças que são baseadas em ou associadas com a acumulação e depósito de proteína tipo amilóide são deficiência cognitiva leve, demência com corpos de Lewy (LBD), esclerose lateral amiotrópica (ALS), miosite com corpos de inclusão (IBM) e degeneração macular, em particular degeneração macular relacionada à idade (AMD).

[0015] ● Deficiência cognitiva leve (MCI) é um termo geral mais comumente definido como uma desordem de memória súbita mas mensurável. Uma pessoa com MCI experimenta problemas de memória maiores do que normalmente esperado com envelhecimento, mas não mostra outros sintomas de demência, tal como discernimento ou raciocínio deficiente. MCI é uma condição que frequentemente reflete um estágio pré-clínico de AD.

[0016] ● Acredita-se que a deposição de β-amilóide dentro do córtex entorrinal (EC) desempenhe um papel chave no desenvolvimento de deficiência cognitiva leve (MCI) nos idosos. Isto está em sintonia com a observação de que os níveis de CSF-A Aβ(1-42) declinam significantemente uma vez AD se torna clinicamente evidente. Em contraste a CSF- Aβ(1-42) níveis de CSF-tau são significantemente aumentados no estágio de MCI, e estes valores continuam a ser elevados posteriormente, indicando que níveis aumentados de CSF-tau podem ajudar a detectar sujeitos com MCI que são previstos desenvolverem AD.

[0017] Demência com corpos de Lewy (LBD) é uma desordem neurodegenerativa que pode ocorrer em pessoas mais velhas do que 65 anos de idade, que tipicamente causa sintomas de deficiência cognitiva (de pensamento) e mudanças comportamentais anormais. Sintomas podem incluir deficiência cognitiva, sinais neurológicos, desordem de sono, e insuficiência autonômica. Deficiência cognitiva é a característica apresentada de LBD na maioria dos casos. Pacientes têm episódios recorrentes de confusão que pioram progressivamente. A flutuação em capacidade cognitiva frequentemente está associada com graus alterados de atenção e vigilância. Deficiência cognitiva e flutuações de pensamento podem variar por minutos, horas, ou dias.

[0018] ● Corpos de Lewy são formados a partir de proteínas de neurofilamento fosforiladas e não fosforiladas; que contêm a proteína sináptica alfa-sinucleína assim como ubiquitina, que está envolvida na eliminação de proteínas danificadas ou anormais. Em adição a corpos de Lewy, neuritos de Lewy, que são corpos de inclusão nos processos celulares das células nervosas, também podem estar presentes. Placas amilóides podem se formar nos cérebros de pacientes afligidos com DLB, entretanto elas tendem a ser menores em número do que visto em pacientes com mal de Alzheimer. Tranças neurofibrilares, a outra marca micropatológica de AD, não são uma característica principal de DLB mas frequentemente estão presentes em adição a placas amilóides.

[0019] ● Esclerose lateral amiotrópica (ALS) é caracterizada por degeneração de neurônios motores superiores e inferiores. Em alguns pacientes com ALS, demência ou afasia podem estar presentes (ALS-D). A demência é mais comumente uma demência frontotemporal (FTD), e muitos destes casos têm inclusões ubiquitina-positivas, tau-negativas em neurônios do giro dentado e camadas superficiais dos lobos frontal e temporal.

[0020] ● Miosite com corpos de inclusão (IBM) é uma doença paralisante normalmente encontrada em pessoas acima de 50, na qual fibras musculares desenvolvem inflamação e começam a atrofiar—mas na qual o cérebro é poupado e pacientes retêm seu intelecto completo. Duas enzimas envolvidas na produção de proteína β-amilóide foram encontradas sendo aumentadas dentro das células musculares de pacientes com esta doença muscular progressiva mais comum de pessoas mais velhas, nas quais β-amilóide também é aumentado.

[0021] Outra doença que é baseada em ou associada com a acumulação e depósito de proteína tipo amilóide é degeneração macular.

[0022] ● Degeneração macular é uma doença ocular comum que causa deterioração da mácula, que é a área central da retina (o tecido da espessura do papel no fundo do olho onde células sensíveis à luz mandam sinais visuais para o cérebro). Visão nítida, clara, 'frontal' é processada pela mácula. Lesão à mácula resulta no desenvolvimento de pontos cegos e visão embaçada ou distorcida. Degeneração macular relacionada à idade (AMD) é uma causa principal de deficiência visual nos Estados Unidos da América e para pessoas acima de 65 anos de idade ela é a principal causa de cegueira legal entre Caucasianos. Aproximadamente 1,8 milhões de Americanos de 40 anos de idade ou mais têm AMD avançada, e outros 7,3 milhões de pessoas com AMD intermediária estão em risco substancial de perda de visão. O governo estima que em 2020 existirão 2,9 milhões de pessoas com AMD avançada. Vítimas de AMD frequentemente são surpreendidas e frustradas por descobrirem quão pouco é conhecido acerca das causas e tratamento desta condição de cegueira.

[0023] ● Existem duas formas de degeneração macular: degeneração macular seca e degeneração macular úmida. A forma seca, na qual as células da mácula lentamente começam a entrar em colapso, é diagnosticada em 85 porcento dos casos de degeneração macular. Ambos os olhos são normalmente afetados por AMD seca, embora um olho possa perder a visão enquanto o outro permanece inafetado. Drusas, que são depósitos amarelos sob a retina, são sinais iniciais comuns de AMD seca. O risco de desenvolver AMD seca avançada ou AMD úmida aumenta à medida que o número ou tamanho das drusas aumenta. É possível que AMD seca avance e cause perda de visão sem se transformar na forma úmida da doença; entretanto, também é possível que AMD seca de estágio inicial se transforme repentinamente na forma úmida.

[0024] A forma úmida, embora ela responda apenas por 15 porcento dos casos, resulta em 90 porcento da cegueira, e é considerada AMD avançada (não existe estágio inicial ou intermediário de AMD úmida). AMD úmida é sempre precedida pela forma seca da doença. À medida que a forma seca piora, algumas pessoas começam a ter crescimento anormal de vasos sanguíneos atrás da mácula. Estes vasos são muito frágeis e irão extravasar fluido e sangue (portanto degeneração macular 'úmida'), causando rápida lesão à mácula.

[0025] A forma úmida de AMD irá inicialmente causar frequentemente visão levemente embaçada. O centro de visão em particular pode então se tornar embaçado e esta região cresce mais na medida em que a doença progride. Nenhum sintoma pode ser observado e apenas um olho é afetado. Em AMD úmida, linhas retas podem parecer trêmulas e perda de visão central pode ocorrer rapidamente.

[0026] ● Diagnose de degeneração macular tipicamente envolve um exame de olho dilatado, teste de acuidade visual, e uma observação do fundo do olho usando um procedimento chamado fundoscopia para ajudar a diagnosticar AMD, e—se AMD úmida é suspeitada—angiografia com fluoresceína também pode ser realizada. Se AMD seca atinge os estágios avançados, não existe tratamento atual para prevenir perda de visão. Entretanto, uma formula específica de alta dose de antioxidantes e zinco pode atrasar ou prevenir AMD intermediária de progredir para o estágio avançado. Macugen® (injeção de pegaptanibe sódico), fotocoagulação a laser e terapia fotodinâmica podem controlar o crescimento anormal de vasos sanguíneos e sangramento na mácula, o que é útil para algumas pessoas que têm AMD úmida; entretanto, visão que já está quase perdida não será restaurada por estas técnicas. Se visão já está quase perdida, existem auxílios de baixa visão que podem ajudar a melhorar a qualidade de vida.

[0027] ● Um dos primeiros sinais de degeneração macular relacionada à idade (AMD) é a acumulação de depósitos extracelulares conhecidos como drusas entre a lâmina basal do epitélio pigmentado de retina (RPE) e membrana de Bruch (BM). Estudos recentes conduzidos por Anderson et al. confirmaram que drusas contêm beta amilóide. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256).

[0028] ● Pesquisa em andamento continua com estudos explorando fatores ambientais, genéticos, e alimentares que podem contribuir para AMD. Novas estratégias de tratamento também estão sendo exploradas, incluindo transplantes de células de retina, drogas que irão prevenir ou retardar o progresso da doença, radioterapia, terapias gênicas, um circuito integrado computacional implantado na retina que pode ajudar a estimular visão e agentes que irão prevenir o crescimento de novos vasos sanguíneos sob a mácula.

[0029] ● Um fator importante a considerar ao desenvolver novas drogas é a facilidade de uso para os pacientes alvo. Liberação de droga oral, -especificamente comprimidos, cápsulas e softgels, respondem por 70% de todas as formas de dosagem consumidas por causa de conveniência de paciente. Desenvolvedores de droga concordam que pacientes preferem liberação oral ao invés de se sujeitar a injeções ou outras, formas mais invasivas de administração medicinal. Formulações resultando em baixos intervalos de dosagem (i.e. uma vez ao dia ou liberação a longo prazo) também são preferíveis. A facilidade de administrar antibióticos em formas de dosagem oral resulta em um aumento de aquiescência de paciente durante tratamento.

[0030] ● O que é necessário são métodos e composições efetivas para a geração de anticorpos altamente específicos e altamente efetivos, o que é um pré-requisito se os anticorpos devem ser fornecidos em uma forma de dosagem oral. Preferivelmente tais anticorpos reconheceriam epítopos específicos em vários antígenos tal como proteína amilóide.

[0031] ● O que também é necessário portanto, são composições e métodos efetivos para enfrentar as complicações associadas com doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular. Em particular o que é necessário são anticorpos especializados e altamente efetivos capazes de agir contra as manifestações fisiológicas da doença tal como a formação de placas associada com agregação de fibras do peptídeo amilóide ou tipo amilóide.

[0032] ● Anticorpos anti-amilóides obtidos pela inoculação de Aβ1-42 misturado com adjuvante completo ou incompleto de Freund provaram ser capazes de reduzir a carga de amilóide em camundongos transgênicos para mal de Alzheimer humano (Schenk et al., 1999).

[0033] ● Inoculação intraperitoneal de Aβ1-16 tetrapalmitoilado reconstituído em lipossomos para camundongos transgênicos NORBA produziu títulos significantes de anticorpos anti-amilóides, que também provaram ser capazes de solubilizar fibras e placas amilóides in vitro e in vivo. (Nicolau et al., 2002).

[0034] ● Um possível mecanismo pelo qual a dissolução de placas e fibras amilóides ocorreu foi primeiro sugerido por Bard et al., (2000), quem antecipou a conclusão, baseado em seus dados, de que os anticorpos opsonizaram as placas, as quais eram subsequentemente destruídas pelos macrófagos da micróglia. De Mattos et al., (2001) indicaram que um MAb dirigido contra o domínio central de 1-amilóide era capaz de se ligar e sequestrar completamente amilóide de plasma. Eles argumentaram que a presença destes mAbs em circulação alterava o equilíbrio de Aβ entre cérebro e plasma, favorecendo a liberação periférica e catabolismo ao invés de deposição dentro do cérebro.

[0035] ● A presente invenção fornece novos métodos e composições compreendendo anticorpos altamente específicos e altamente efetivos tendo a capacidade de reconhecer especificamente e se ligar a epítopos específicos de uma variedade de antígenos β-amilóides. Os anticorpos possibilitados pela instrução da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo Holandês, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular, para citar apenas algumas.

[0036] ● Além disso, a presente invenção fornece novos métodos e composições para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero exibindo uma doença ou condição associada a amilóide compreendendo administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano com necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DE FIGURAS E SEQUÊNCIAS

[0037] Figura 1 Peptídeos derivados das sequências Aβ 1-15, 1-16 e 1-16(Δ14), 22-35, e 29-40

[0038] Figura 2 Ligação de anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 a espécies amilóides em Western blot e Dot blot

[0039] Figura 3 Ligação de anticorpo monoclonal mACl-01-Ab7 C2 a fibras amilóides por microscopia eletrônica de transmissão.

[0040] Figura 4 Resultados de um experimento de igual para igual entre ensaio fluorescente de Th-T e NMR de estado sólido de peptídeo β-amilóide 1-42 marcado com U-13C Tyr10 e Val12

[0041] SEQ ID NO: 1: Peptídeo antigênico Aβ 1-15

[0042] SEQ ID NO: 2: Peptídeo antigênico Aβ 1-16

[0043] SEQ ID NO: 3: Peptídeo antigênico Aβ 1-16 (Δ4)

[0044] SEQ ID NO: 4: Peptídeo antigênico Aβ 22-35

[0045] SEQ ID NO: 5: Peptídeo antigênico Αβ 29-40

[0046] SEQ ID NO: 6: Peptídeo antigênico Aβ 1-17

[0047] SEQ ID NO: 7: Sequência de aminoácidos de Região Variável de Cadeia Leve C2 de Camundongo

[0048] SEQ ID NO: 8: Sequência de aminoácidos de Região Variável de Cadeia Pesada C2 de Camundongo

[0049] SEQ ID NO: 9: Sequência de nucleotídeos de Região Variável de Cadeia Leve C2 de Camundongo

[0050] SEQ ID NO: 10: Sequência de nucleotídeos de Região Variável de Cadeia Leve C2 de Camundongo incluindo sequências sinal

[0051] SEQ ID NO: 11: Sequência de nucleotídeos de Região Variável de Cadeia Pesada C2 de Camundongo

[0052] SEQ ID NO: 12: Sequência de nucleotídeos de Região Variável de Cadeia Pesada C2 de Camundongo incluindo sequências sinal

[0053] SEQ ID NO: 13-20: Variantes de sequência de aminoácidos de região epitópica no peptídeo Aβ

[0054] SEQ ID NO: 21: Sequência de aminoácidos de Cadeia Leve C2 de Camundongo

[0055] SEQ ID NO: 22: Sequência de aminoácidos de Cadeia Pesada C2 de Camundongo

[0056] A presente invenção faz uso de apresentações de antígeno que resultam em exposição estimulada e estabilização de uma conformação preferida de antígeno, o que no final das contas resulta em anticorpos com propriedades únicas.

[0057] ● Em uma forma de realização da invenção é fornecido um anticorpo incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, ou, mais particularmente, um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que foi construído contra uma construção antigênica supramolecular compreendendo um peptídeo antigênico correspondendo à sequência de aminoácidos do peptídeo β-amilóide, particularmente de peptídeo β-amilóide Aβ1-15, Aβ1-16 e Aβ1-16 (Δ4), modificado com uma unidade hidrofóbica tal como, por exemplo, ácido palmítico ou uma unidade hidrofílica tal como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou uma combinação de ambas, caracterizado pelo fato de que dita unidade hidrofóbica e hidrofílica, respectivamente, é covalentemente ligada a cada um dos términos do peptídeo antigênico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tal como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido adequado ou análogo de aminoácido capaz de servir como um dispositivo de conexão para acoplar a unidade hidrofóbica e hidrofílica ao fragmento de peptídeo. Quando um PEG é usado como a unidade hidrofílica, os términos livres de PEG são covalentemente ligados a fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado para funcionar como o elemento de ancoragem, por exemplo, para encaixar a construção antigênica na bicamada de um lipossomo.

[0058] ● Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que reconheceu a conformação nativa de amilóide já que ele se liga especificamente a oligômeros e fibras amilóides, mas não a espécies amilóides não linearizadas.

[0059] ● Em uma forma de realização adicional da invenção, é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a presente invenção e como descrito neste lugar antes, cujo anticorpo ou fragmento se liga a um monômero Aβ com uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1 x 10"6 a pelo menos cerca de 1 x 10"8, particularmente de pelo menos cerca de 1 x 10-6 a pelo menos cerca de 1 x 10-7, mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x 10-7 a pelo menos cerca de 1 x 10-8, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x 10-7 a pelo menos cerca de 4 x 10-'- mas, preferivelmente, mas não mostra qualquer reatividade cruzada significante com proteína precursora de amilóide (APP)

[0060] ● Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a presente invenção e como descrito neste lugar antes, cujo anticorpo ou fragmento se liga a uma fibra, fibrila ou filamento Aβ com uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1 x 10-7 a pelo menos cerca de 1 x 10-9, particularmente de pelo menos cerca de 1 x 107 a pelo menos cerca de 1 x 10-8, mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x 10-8 a pelo menos cerca de 1 x 10-9, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x 10-8 a pelo menos cerca de 5 x 10-8, mas, preferivelmente, mas não mostra qualquer reatividade cruzada significante com proteína precursora de amilóide (APP).

[0061] ● Em outra forma de realização, o anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a presente invenção e como descrito neste lugar antes exibe uma afinidade de ligação para uma fibra, fibrila ou filamento Aβ que é pelo menos 5 vezes, particularmente pelo menos 10 vezes, mais particularmente pelo menos 15 vezes, maior do que a afinidade de ligação com um monômero Aβ.

[0062] ● Os anticorpos de acordo com a invenção são capazes de inibir, in vitro e in vivo, a agregação de peptídeos monoméricos amiloidogênicos, especificamente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, em fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores.

[0063] ● Em uma forma de realização específica da invenção um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação com peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, inibe a agregação dos monômeros Aβ em fibrilas poliméricas moleculares superiores.

[0064] ● Em uma forma de realização adicional da invenção é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação, particularmente mediante co-incubação em uma proporção de concentração molar de até 1:100, mais particularmente em uma proporção de concentração molar de entre 1:30 e 1:100, mas especialmente em uma proporção de concentração molar de 1:100, com peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, inibe a agregação dos monômeros Aβ em fibrilas poliméricas moleculares superiores. Em particular, dita inibição sobe para pelo menos 50%, particularmente para pelo menos 65%, mais particularmente para pelo menos 75%, mesmo mais particularmente para pelo menos 80%, mas especialmente para pelo menos 85%-90%, ou mais se comparado com os respectivos monômeros de peptídeo amilóide incubados em tampão (controle).

[0065] ● Em particular, a co-incubação do anticorpo de acordo com a invenção com peptídeos monoméricos amilóides é realizada por 24 horas a 60 horas, particularmente por 30 horas a 50 horas, mais particularmente por 48 horas em uma temperatura de entre 28°C e 40°C, particularmente de entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 37°C.

[0066] ● Em outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes cujo anticorpo, mediante co-incubação por 48 horas a 37° C em uma proporção de concentração molar de 1:100 com um peptídeo amilóide monomérico, especificamente um peptídeo β-amilóides monomérico tal como, por exemplo, peptídeo Aβ monomérico 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente a peptídeo Aβ1-42 monomérico, é capaz de inibir a agregação dos monômeros amilóides, particularmente a agregação de peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente do peptídeo Aβ1-42 monomérico em fibrilas ou filamentos poliméricas moleculares superiores em pelo menos 85%, particularmente em pelo menos 89% e mais particularmente em pelo menos 95% se comparado com os respectivos monômeros de peptídeo amilóide incubados em tampão (controle).

[0067] ● Em uma forma de realização específica, a invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que exibe alta especificidade para peptídeos Aβ1-42 monoméricos mas mostra essencialmente nenhuma ou apenas reatividade cruzada minoritária para peptídeos Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, e/ou Aβ1-41 monoméricos, particularmente um anticorpo, mas especialmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo é até 100 vezes, particularmente 50 a 100 vezes, mais particularmente 80 a 100 vezes, mas especialmente 100 vezes mais sensível a peptídeo amilóide Aβ1-42 se comparado com Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 e até 1000 vezes, particularmente 500 a 1000 vezes, mais particularmente 800 a 1000 vezes, mas especialmente 1000 vezes mais sensível a peptídeo amilóide Aβ1-42 se comparado com Aβ1-38, e assim capaz de inibir, in vitro e in vivo, a agregação de peptídeos monoméricos amiloidogênicos, mas especialmente de peptídeo amilóide Aβ1-42.

[0068] ● Em outra forma de realização específica da invenção um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que tem uma sensibilidade de ligação para peptídeo amilóide Aβ1-42 e é capaz de detectar fibras Aβ1-42 em uma concentração de até pelo menos 0,001 μg, mas particularmente em um intervalo de concentração de entre 0,5 μg e 0,001 μg, mais particularmente entre 0,1 μg e 0,001 μg, mas especialmente em uma concentração de 0,001 μg.

[0069] ● Em uma forma de realização muito específica da invenção é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo é capaz de detectar fibras Aβ1-42 até uma concentração mínima de 0,001 μg e fibras Aβ1-40 até uma concentração mínima de 0,1 μg e fibras Aβ1-38 até uma concentração mínima de quantidade de 1 μg de fibras.

[0070] ● Ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes a peptídeos monoméricos amiloidogênicos mas, particularmente, à forma amilóide (1-42) leva a inibição da agregação de peptídeos monoméricos amiloidogênicos a fibrilas ou filamentos moleculares superiores. Através da inibição da agregação de peptídeos monoméricos amiloidogênicos os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou retardar a formação de placas amilóides, particularmente a forma amilóide (1-42), que é conhecida por se tornar insolúvel por mudança de conformação secundária e por ser a parte principal de placas amilóides em cérebros de animais ou humanos doentes.

[0071] ● A inibição de agregação potencial do anticorpo de acordo com a invenção pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na arte, particularmente por ultracentrifugação por gradiente de densidade seguido por uma análise de sedimentação SDS-PÁGINA em um gradiente pré-formado e/ou por um ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T).

[0072] ● A presente invenção fornece adicionalmente anticorpos que, mediante co-incubação com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, especificamente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, são capazes de desagregar ditas fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores.

[0073] ● Em outra forma de realização da invenção é fornecido um anticorpo, mas especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação em uma proporção de concentração molar de até 1:100, mais particularmente em uma proporção de concentração molar de entre 1:30 e 1:100, mas especialmente em uma proporção de concentração molar de 1:100, com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, é capaz de desagregar as fibrilas poliméricas pré-formadas ou filamentos em pelo menos 35%, particularmente em pelo menos 40%, mais particularmente em pelo menos 50%, ainda mais particularmente em pelo menos 60%, mas especialmente em pelo menos 70% ou mais.

[0074] ● Em particular, o anticorpo de acordo com a invenção é co-incubado com fibrilas amilóides ou filamentos poliméricos moleculares superiores pré-formados por 12 horas a 36 horas, particularmente por 18 horas a 30 horas, mais particularmente por 24 horas em uma temperatura de entre 28°C e 40°C, particularmente de entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 37°C.

[0075] ● Em uma forma de realização específica a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação por 24 horas a 37° C em uma proporção de concentração molar de 1:100 com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, é capaz de desagregar ditas fibrilas amilóides ou filamentos poliméricos moleculares superiores pré-formados em pelo menos 35%, particularmente em pelo menos 40%, mais particularmente em pelo menos 50%, ainda mais particularmente em pelo menos 60%, mas especialmente em pelo menos 70% ou mais se comparado com as respectivas fibrilas poliméricas amilóides pré-formadas ou filamentos incubados com um veículo de controle (apenas amilóide) (controle).

[0076] ● O potencial de desagregação do anticorpo de acordo com a invenção pode ser determinado por qualquer método adequado conhecido na arte, particularmente por ultracentrifugação por gradiente de densidade seguido por uma análise de sedimentação SDS-PÁGINA em um gradiente pré-formado e/ou por um ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T).

[0077] A presente invenção fornece adicionalmente anticorpos ou partes funcionais destes que são conformacionalmente sensíveis.

[0078] ● Em uma forma de realização adicional da invenção é fornecido um anticorpo, mas especialmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, é capaz de induzir uma transição da conformação folha-B para uma α-hélice e/ou uma conformação espiral aleatória, mas particularmente uma conformação espiral aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiral aleatória em uma dada localização na molécula, especialmente no ambiente de Val12 da proteína Aβ, o que leva a um aumento da conformação espiral aleatória às custas da conformação folha-β e uma solubilização melhorada das fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados. Em particular a diminuição da conformação folha-β sobe para pelo menos 30%, particularmente para pelo menos 35%, e mais particularmente para pelo menos 40% e mais se comparado com as respectivas fibrilas poliméricas amilóides pré-formadas ou filamentos incubados em tampão (controle).

[0079] ● Em particular, o anticorpo de acordo com a invenção é co-incubado com fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados por 12 horas a 36 horas, particularmente por 18 horas a 30 horas, mais particularmente por 24 horas em uma temperatura de entre 28°C e 40°C, particularmente de entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 37°C.

[0080] ● Em particular, a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação por 24 horas a 37° C em uma proporção de concentração molar de 1:100 com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, é capaz de induzir uma transição da conformação folha-β para uma α-hélice e/ou uma conformação espiral aleatória, mas particularmente uma conformação espiral aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiral aleatória em uma dada localização na molécula, especialmente no ambiente de Val12 da proteína Aβ, o que leva a um aumento da conformação espiral aleatória às custas da conformação folha-B, com a última sendo reduzida em pelo menos 30%, particularmente em pelo menos 35%, e mais particularmente em pelo menos 40% e mais se comparado com as respectivas fibrilas poliméricas amilóides pré-formadas ou filamentos incubados em tampão (controle).

[0081] ● O potencial do anticorpo para induzir uma transição conformacional pode ser determinado por qualquer método adequado conhecido na arte, particularmente por espectroscopia 13C NMR de estado sólido mas, em particular, medindo as intensidades integrais das conformações de Val 12 C no peptídeo Aβ, particularmente os peptídeos Aβ 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente no peptídeo Aβ1-42 monomérico.

[0082] ● Através da desagregação de fibrilas ou filamentos poliméricos amiloidogênicos os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou retardar a formação de placas amilóides o que leva a um alívio dos sintomas associados com a doença e um atraso ou reversão de sua progressão.

[0083] ● Por conseguinte, é uma forma de realização adicional da invenção fornecer um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes como descrito neste lugar antes, cujo anticorpo é capaz de diminuir a quantidade total de Aβ no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano sofrendo de uma doença ou condição levando uma concentração aumentada de Aβ no cérebro.

[0084] ● Em outra forma de realização da invenção é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes como descrito neste lugar antes, cujo anticorpo é capaz de interromper placas assim diminuindo a carga de placas no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano sofrendo de uma doença ou condição levando a uma carga de placa aumentada no cérebro. O anticorpo de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes diminui a carga de placas no cérebro em pelo menos 20 %, particularmente em pelo menos 25%, mais particularmente em pelo menos 30%, ainda mais particularmente mais do que 30%.

[0085] ● Em ainda outra forma de realização da invenção é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes como descrito neste lugar antes, cujo anticorpo é capaz de solubilizar placas levando a uma redução da quantidade de placas no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano sofrendo de uma doença ou condição levando a uma aumentada carga de placas no cérebro. O anticorpo de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes reduz a quantidade de placas no cérebro em pelo menos 10 %, particularmente em pelo menos 15%, mais particularmente em pelo menos 20%.

[0086] ● É para ser entendido que o anticorpo de acordo com a invenção pode exibir uma, duas ou mais das propriedades específicas descritas neste lugar antes em várias combinações.

[0087] ● Por exemplo, em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos, mas especialmente anticorpos monoclonais incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujos anticorpos são bifuncionais já que eles exibem tanto uma propriedade de inibição de agregação assim como uma propriedade de desagregação como definido neste lugar antes, particularmente pareado com um alto grau de sensibilidade conformacional.

[0088] ● Em ainda outra forma de realização da invenção é fornecido um anticorpo bifuncional incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, mas especialmente um anticorpo monoclonal bifuncional incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação com peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1_42 monoméricos, inibe a agregação dos monômeros Αβ em fibrilas ou filamentos poliméricos moleculares superiores e, em adição, mediante co-incubação com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré-formados.

[0089] ● Em uma forma de realização específica da invenção a co-incubação do anticorpo bifuncional de acordo com a invenção, mas especialmente do anticorpo monoclonal bifuncional de acordo com a invenção com peptídeos monoméricos amilóides e fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados, respectivamente, ocorre em uma proporção de concentração molar de até 1:100, particularmente em uma proporção de entre 1:30 e 1:100, e mais particularmente em uma proporção de 1:100.

[0090] ● Em particular, a co-incubação do anticorpo de acordo com a invenção com peptídeos monoméricos amilóides é realizada por 24 horas a 60 horas, particularmente por 30 horas a 50 horas, mais particularmente por 48 horas em uma temperatura de entre 28°C e 40°C, particularmente de entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 37°C, ao passo que a co-incubação com fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados é realizada por 12 horas a 36 horas, particularmente por 18 horas a 30 horas, mais particularmente por 24 horas em uma temperatura de entre 28°C e 40°C, particularmente de entre 32°C e 38°C, mais particularmente a 37°C.

[0091] ● Em ainda outra forma de realização específica da invenção o anticorpo bifuncional de acordo com a invenção, particularmente o anticorpo monoclonal bifuncional de acordo com a invenção, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré-formados em pelo menos 10%, particularmente em pelo menos 25%, mais particularmente em pelo menos 35%, ainda mais particularmente em pelo menos 50%, mas especialmente em pelo menos 60 - 70% ou mais.

[0092] ● Em ainda outra forma de realização específica da invenção o anticorpo bifuncional de acordo com a invenção, particularmente o anticorpo monoclonal bifuncional de acordo com a invenção, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, inibe a agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 142, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos em pelo menos 50%, particularmente em pelo menos 65%, mais particularmente em pelo menos 75%, ainda mais particularmente em pelo menos 80%, mas especialmente em pelo menos 85-90%, ou mais se comparado com os respectivos monômeros de peptídeo amilóide incubados em tampão (controle).

[0093] ● Em particular, a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo media inibição de polimerização de peptídeos monoméricos amilóides, especificamente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos e/ou induz solubilização de fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, através de ligação específica e direta do anticorpo às fibras Aβ, o que leva a uma transição de conformação secundária.

[0094] ● A presente invenção fornece adicionalmente um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo se liga diretamente e especificamente a fibras β-amilóides tal como, por exemplo, fibras compreendendo peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente a fibras compreendendo peptídeos Αβ1-42 monoméricos e/ou induz solubilização de fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, direcionando e se ligando especificamente a um epítopo dentro de uma região epitópica da proteína β-amilóide, particularmente uma região epitópica do polipeptídeo Aβ confinado por resíduos de aminoácidos aan-aam com n sendo um número inteiro entre 2 e 16, particularmente entre 5 e 16, mais particularmente entre 8 e 16, ainda mais particularmente entre 10 e 16 e m sendo um número inteiro entre 3 e 25, particularmente entre 3 e 23, particularmente entre 3 e 20, particularmente entre 3 e 17, particularmente entre 6 e 17, mais particularmente entre 9 e 17, ainda mais particularmente entre 11 e 17, caracterizado pelo fato de que n e m não podem ser números idênticos e n deve ser sempre um número menor do que m, com a diferença entre n e m 2.

[0095] Em uma forma de realização específica da invenção, n é um número inteiro entre 13 e 15, mas especialmente 14 e m é um número inteiro entre 22 e 24, mas especialmente 23.

[0096] ● A ligação do anticorpo de acordo com a invenção pode induzir uma transição conformacional em dita proteína, particularmente uma transição da conformação folha-β para uma α-hélice e/ou uma conformação espiral aleatória, mas particularmente uma conformação espiral aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiral aleatória em uma dada localização na molécula, particularmente no ambiente de Val12 da proteína Aβ.

[0097] ● Em uma forma de realização adicional, a invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo incorpora pelo menos uma das propriedades mencionadas neste lugar antes e selecionadas a partir do grupo consistindo de inibição de agregação, desagregação, indução de transição conformacional, reconhecimento de e ligação direta a um epítopo, particularmente um epítopo conformacional descontínuo na região 14-23, particularmente na 14-20, prevenindo ou retardando a formação de placas amilóides, diminuindo a quantidade total de Aβ solúvel no cérebro, diminuindo a carga de placas no cérebro, reduzindo a quantidade de placas no cérebro, retendo ou aumentando capacidade de memória cognitiva, mas especialmente uma combinação de duas ou mais de ditas propriedades.

[0098] ● Em forma de realização específica, a invenção se refere a um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo incorpora pelo menos 2, particularmente pelo menos 3, mais particularmente pelo menos 4, ainda mais particularmente pelo menos 5, 6, 7 ou 8, mas especialmente todas as propriedades mencionadas acima.

[0099] ● Em uma forma de realização específica, a invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que exibe alta especificidade para A1-42 peptídeos monoméricos mas mostra essencialmente nenhuma ou apenas reatividade cruzada minoritária para peptídeos Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, e/ou Aβ1-41 monoméricos, particularmente um anticorpo, mas especialmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo é até 100 vezes, particularmente 50 a 100 vezes, mais particularmente 80 a 100 vezes, mas especialmente 100 vezes mais sensível a peptídeo amilóide Aβ1-42 se comparado com Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 e até 1000 vezes, particularmente 500 a 1000 vezes, mais particularmente 800 a 1000 vezes, mas especialmente 1000 vezes mais sensível a peptídeo amilóide Aβ1-42 se comparado com Aβ1-38, e assim capaz de inibir, in vitro e in vivo, a agregação de peptídeos monoméricos amiloidogênicos, mas especialmente de peptídeo amilóide Aβ1-42.

[0100] ● Em outra forma de realização específica da invenção um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que tem uma alta afinidade de ligação para peptídeo amilóide Aβ1-42 e é capaz de detectar fibras Aβ1-42 em uma concentração de até pelo menos 0,001 μg, mas particularmente em um intervalo de concentração de entre 0,5 μg e 0,001 μg, mais particularmente entre 0,1 μg e 0,001 μg, mas especialmente em uma concentração de 0,001 μg.

[0101] ● Em uma forma de realização muito específica da invenção é fornecido um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo é capaz de detectar fibras Aβ1-42 até uma concentração mínima de 0,001 μg e fibras Aβ1-40 até uma concentração mínima de 0,1 μg e fibras Aβ1-38 até uma concentração mínima de quantidade de 1 μg de fibras.

[0102] ● Em um aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo ou um fragmento deste, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide.

[0103] ● Em uma forma de realização específica, a invenção se refere a um anticorpo incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes cujo anticorpo reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um ou ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido e pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que, em uma forma de realização específica da invenção, o pelo menos um resíduo compreendendo o primeiro sítio de ligação distinto é Leu e os pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, compreendendo o segundo sítio de ligação distinto, são -Phe-Phe- embebidos dentro da seguinte sequência de núcleo:
- Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7

[0104] em que

[0105] Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo His, Asn, Gln, Lys, e Arg;

[0106] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0107] Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Lys, His, Asn, Gln e Arg

[0108] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0109] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0110] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp,

[0111] Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp.

[0112] Em particular, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um ou ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido e pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que, em uma forma de realização específica da invenção, o pelo menos um resíduo constituindo o primeiro sítio de ligação distinto é Leu e os pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, constituindo o segundo sítio de ligação distinto, são -Phe-Phe- embebidos dentro da seguinte sequência de núcleo:
- Xaai - Xaa2 - Xaa3 - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7

[0113] em que

[0114] Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo His, Asn, Gln Lys, e Arg;

[0115] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0116] Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Lys, His, Asn, Gln e Arg

[0117] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0118] Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0119] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp,

[0120] Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp.

[0121] Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste, caracterizado pelo fato de que

[0122] Xaa1 é His ou Arg, mas particularmente His;

[0123] Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;

[0124] Xaa3 é Lys ou Arg, mas particularmente Lys

[0125] Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Val; Xaa6 é Ala ou Val, mas particularmente Ala;

[0126] Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e

[0127] Xaa7 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp.

[0128] Em outro aspecto, a invenção se refere a um anticorpo ou um fragmento deste, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide, caracterizado pelo fato de que dito um ou os pelo menos dois ou os pelo menos três sítios de ligação distintos compreendem cada pelo menos um, particularmente pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo.

[0129] Em particular, o anticorpo ou um fragmento deste de acordo com a invenção e liga a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide, caracterizado pelo fato de que ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos compreendem cada pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos estão localizados próximos um ao outro no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com ditos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, assim formando um epítopo conformacional descontínuo.

[0130] Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste de acordo com a invenção, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide caracterizado pelo fato de que ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um e os pelo menos dois aminoácidos consecutivos, que são separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com os resíduos de aminoácidos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, são -His- e -Lys-Leu-, respectivamente, embebidos dentro da seguinte sequência de núcleo:
- His - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3- Xaa4- Xaa6-Xaa6- - Xaa7 - Xaas -

[0131] em que

[0132] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0133] Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0134] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile

[0135] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile

[0136] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0137] Xaa7, é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp,

[0138] Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp

[0139] e caracterizado pelo fato de que ditos resíduos de aminoácidos Xaa2, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8, não estão envolvidos em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com o sítio de ligação de -His e o de -Lys-Leu.

[0140] Em outra forma de realização, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide caracterizado pelo fato de que ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos representando um primeiro sítio de ligação são -Phe-Phe- e o pelo menos um resíduo de aminoácido é -His- embebido dentro da seguinte sequência de núcleo:
- Xaa1 - His -Xaa3 - Xaa4 - Xaa6 - Xaa6 - Phe - Phe - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 -,

[0141] em que

[0142] Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo His, Asn, Gln, Lys e Arg

[0143] Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln

[0144] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo His, Asn, Gln, Lys e Arg

[0145] Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0146] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu e Ile

[0147] Xaa7, é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu e Ile

[0148] Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp,

[0149] Xaa9 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp, e caracterizado pelo fato de que ditos resíduos de aminoácidos Xaa1, Xaa3, Xaa6, Xaa7,, Xaa8 e Xaa9, não estão envolvidos em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com o sítio de ligação de His e o de -Phe-Phe.

[0150] Em uma forma de realização específica da invenção, os primeiros dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo envolvem -Lys- e -Leu-, e os segundos dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos envolvem -PhePhe- embebidos dentro da seguinte sequência de núcleo:
- Xaa1 - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa4 - Phe - Phe - Xaas - Xaa6 - Xaa7,

[0151] em que

[0152] Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo His, Asn, Gln Lys, e Arg;

[0153] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0154] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0155] Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0156] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp,

[0157] Xaa7, é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp, e caracterizado pelo fato de que ditos resíduos de aminoácidos Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, não estão envolvidos em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com o sítio de ligação de —Lys-Leu e o de —Phe-Phe.

[0158] Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste, caracterizado pelo fato de que

[0159] Xaa1 é His ou Arg, mas particularmente His;

[0160] Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;

[0161] Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Val;

[0162] Xaa6 é Ala ou Val, mas particularmente Ala;

[0163] Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e

[0164] Xaa7 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp.

[0165] Em uma forma de realização adicional da invenção, o anticorpo ou um fragmento deste de acordo com a invenção se liga a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide caracterizado pelo fato de que ditos pelo menos três sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido e pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, cujos resíduos são predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que ditos pelo menos três sítios de ligação distintos estão localizados próximos um ao outro no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com dito pelo menos um resíduo de aminoácido e ditos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, assim formando um epítopo conformacional descontínuo.

[0166] Em uma forma de realização específica da invenção, os primeiros dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo envolvem —Lys-Leu-, e os segundos dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos envolvem —Phe-Phe-, e o terceiro pelo menos um resíduo de aminoácido envolve -His- embebido dentro da seguinte sequência de núcleo:
—His — Xaa2 — Lys — Leu -Xaa4 — Phe — Phe — Xaa5—Xaa6— Xaa7. —

[0167] em que

[0168] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0169] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0170] Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0171] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp,

[0172] Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp, e caracterizado pelo fato de que ditos resíduos de aminoácidos Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7 não estão envolvidos em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com o sítio de ligação de -His, o de -Lys-Leu, e o de -Phe-Phe.

[0173] Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste, em que

[0174] Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;

[0175] Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Val;

[0176] Xaa5 é Ala ou Val, mas particularmente Ala;

[0177] Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e

[0178] Xaa7 é Glu ou Asp, mas particularmente Asp;

[0179] Em uma forma de realização específica da invenção, os primeiros dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo envolvem -Lys-Leu-, e os segundos dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos envolvem -Phe-Phe-, e o terceiro pelo menos um resíduo de aminoácido envolve -Asp- embebido dentro da seguinte sequência de núcleo:
- Xaa1 - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5-Xaa6- Asp.

[0180] em que

[0181] Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo His, Asn, Gln, Lys, e Arg;

[0182] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0183] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0184] Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0185] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp, e caracterizado pelo fato de que ditos resíduos de aminoácidos Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7 não estão envolvidos em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com o sítio de ligação de -Asp, o de -Lys-Leu, e o de -Phe-Phe.

[0186] Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste, em que

[0187] Xaa1 é His ou Arg, mas particularmente His;

[0188] Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;

[0189] Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Val;

[0190] Xaa5 é Ala ou Val, mas particularmente Ala; e

[0191] Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu

[0192] Em uma forma de realização específica adicional da invenção, é fornecido um anticorpo ou um fragmento deste de acordo com a invenção, que se liga a 4 sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide caracterizado pelo fato de que ditos 4 sítios de ligação distintos compreendem um resíduo de aminoácido e dois resíduos de aminoácidos consecutivos, respectivamente, cujos resíduos são predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, caracterizado pelo fato de que ditos 4 sítios de ligação distintos estão localizados próximos um ao outro no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com dito um resíduo de aminoácido e ditos dois resíduos de aminoácidos consecutivos dos 4 sítios de ligação distintos assim formando um epítopo conformacional descontínuo.

[0193] Em particular, os primeiros dos dois resíduos de aminoácidos consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys-Leu-, e os segundos dos pelo menos dois resíduos de aminoácidos consecutivos são -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos amino únicos é -His- e o segundo dos resíduos amino únicos é -Asp- embebido dentro da seguinte sequência de núcleo:
His - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5-Xaa6- Asp.

[0194] caracterizado pelo fato de que

[0195] Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Asn e Gln;

[0196] Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, norleucina, Met, Phe, e Ile;

[0197] Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Ala, Val, Leu, Ser e Ile;

[0198] Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo compreendendo Glu e Asp, e caracterizado pelo fato de que ditos resíduos de aminoácidos Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7 não estão envolvidos em ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor se comparado com o sítio de ligação de -His, -Asp, o de -Lys-Leu, e o de -Phe-Phe.

[0199] ● Em uma forma de realização específica da invenção, os sítios de reconhecimento e ligação como definido neste lugar antes estão formando um epítopo conformacional descontínuo localizado em uma região da proteína β-amilóide entre resíduo de aminoácido 12 a 24, particularmente entre resíduos 14 a 23, mais particularmente entre resíduos de aminoácidos 14 e 20, caracterizado pelo fato de que os três sítios de reconhecimento e ligação distintos compreendendo 1 e 2 resíduos de aminoácidos, respectivamente, estão localizados em posição 16, 17, e em posição 19 e 20, e em posição 14, respectivamente, cujos resíduos estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína β-amilóide e caracterizado pelo fato de que ditos três sítios de reconhecimento e ligação distintos são separados por um resíduo de aminoácido localizado em posição 15 e 18, respectivamente, cujos aminoácidos não estão envolvidos na ligação do antígeno ou, pelo menos, a um grau substancialmente menor.

[0200] ● Em uma forma de realização específica, ditos resíduos de aminoácidos consecutivos, particularmente -Lys-Leu em posição 16 e 17 e -Phe- Phe- em posição 19 e 20, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína β-amilóide, são embebidos na seguinte região de core:
Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp
12 13 14 15 16 17 18 19
20 21 22 23

[0201] ● Em uma forma de realização específica adicional, ditos resíduos de aminoácidos consecutivos, particularmente -Lys- em posição 16, -Leu- em posição 17 e -Phe- Phe- em posição 19 e 20, e -His em posição 14, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína β-amilóide são embebidos na seguinte região de core:
Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp
12 13 14 15 16 17 18 19
20 21 22 23

[0202] Em uma forma de realização específica da invenção, o anticorpo de acordo com a invenção é produzido contra um fragmento de antígeno que não contém dito sítio de ligação distinto.

[0203] Esta mudança na região epitópica pode ter sido causada pelo menos parcialmente pelo uso de uma construção antigênica supramolecular compreendendo um peptídeo antigênico correspondente à sequência de aminoácidos do peptídeo β-amilóide, particularmente de peptídeo β-amilóide Αβ1-16, modificado com uma unidade hidrofílica tal como, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), caracterizado pelo fato de que dita unidade hidrofílica é covalentemente ligada a cada um dos términos do peptídeo antigênico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tal como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido adequado ou análogo de aminoácido capaz de servir como um dispositivo de conexão para acoplar a unidade hidrofílica ao fragmento de peptídeo, como descrito neste lugar abaixo no processo de imunização. Quando um PEG é usado como a unidade hidrofílica, os términos livres de PEG são covalentemente ligados a fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado para funcionar como o elemento de ancoragem, por exemplo, para encaixar a construção antigênica na bicamada de um lipossomo como descrito neste lugar.

[0204] Também o uso de lipídio A como parte do protocolo de imunização pode ter contribuído para uma mudança na região epitópica.

[0205] Em uma forma de realização específica da invenção, é fornecido um anticorpo, que compreende a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) de SEQ ID NO: 7.

[0206] Em outra forma de realização específica, a invenção se refere à Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) de SEQ ID NO: 7.

[0207] Em ainda outra forma de realização específica da invenção, é fornecido um anticorpo, que compreende a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) de SEQ ID NO: 8.

[0208] Em uma forma de realização específica adicional, a invenção se refere à Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) de SEQ ID NO: 8.

[0209] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um anticorpo, que compreende tanto a região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 como a região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 7.

[0210] Também parte da invenção é um anticorpo compreendendo uma Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) e uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) que é homólogo a qualquer dos peptídeos fornecidos em SEQ ID NO: 7 e 8, respectivamente.

[0211] ● Em particular, a invenção se refere a um anticorpo ou um fragmento deste, de acordo com a presente invenção e como descrito neste lugar antes caracterizado pelo fato de que a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) tem uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência dada em SEQ ID NO: 7.

[0212] ● Ademais, a invenção se refere a um anticorpo ou um fragmento deste, de acordo com a presente invenção e como descrito neste lugar antes caracterizado pelo fato de que a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) tem uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência dada em SEQ ID NO: 8.

[0213] ● Ademais, a invenção se refere a um anticorpo ou um fragmento deste, de acordo com a presente invenção e como descrito neste lugar antes caracterizado pelo fato de que a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) e a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) juntas têm uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência dada em SEQ ID NOs: 7 e 8.

[0214] ● Em outra forma de realização específica, a invenção se refere à região variável de cadeia leve que tem uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência dada em SEQ ID NO: 7.

[0215] ● Em uma forma de realização específica adicional, a invenção se refere à região variável de cadeia pesada que tem uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência dada em SEQ ID NO: 8.

[0216] ● Em outra forma de realização da invenção, é fornecido um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando o anticorpo de acordo com a invenção como descrito neste lugar antes.

a) pelo menos a sequência de nucleotídeos da Região Variável de Cadeia Leve de SEQ ID NO: 9
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0217] Em outra forma de realização, a invenção se refere a um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo de acordo com a invenção compreendendo

a) pelo menos a sequência de nucleotídeos da cadeia leve de SEQ ID NO: 10
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0218] Em ainda outra forma de realização, a invenção se refere a um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo de acordo com a invenção compreendendo

a) pelo menos a sequência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11.
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0219] Em ainda outra forma de realização, a invenção se refere a um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo de acordo com a invenção compreendendo

a) pelo menos a sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de SEQ ID NO: 12 ou à sequência complementar
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0220] Também é compreendido pela invenção um polinucleotídeo compreendendo

a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9 codificando a região variável de cadeia leve
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0221] Também é compreendido pela invenção um polinucleotídeo compreendendo

a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10 codificando a cadeia leve.
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0222] Também é compreendido pela invenção um polinucleotídeo compreendendo

a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11 codificando a região variável de cadeia pesada
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0223] Também é compreendido pela invenção um polinucleotídeo compreendendo

a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 codificando a cadeia pesada
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0224] Em uma forma de realização adicional, a invenção se refere a qualquer sequência de nucleotídeos que hibridiza com

a) uma sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção e como dada em SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12, respectivamente,
b) uma sequência de nucleotídeos que difere da sequência de nucleotídeos de (a) em sequência de códon devido à degenerescência do código genético
c) a sequência complementar a (a) e (b) ou
d) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c) compreendendo um trecho contíguo de nucleotídeos selecionado a partir do grupo consistindo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, pelo menos 25 nucleotídeos contíguos, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, pelo menos 35 nucleotídeos contíguos, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, pelo menos 45 nucleotídeos contíguos, e pelo menos 50 nucleotídeos contíguos.

[0225] Em particular, a invenção se refere a qualquer sequência de nucleotídeos que hibridiza em condições convencionais de hibridização, particularmente em condições estringentes de hibridização, com uma sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção e como dada em SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12, respectivamente, particularmente à fita complementar desta.

[0226] Em uma forma de realização adicional, a invenção se refere a qualquer sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção e como dada em SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12, respectivamente, particularmente à fita complementar desta, em condições convencionais de hibridização nas quais 5xSSPE, 1% de SDS, 1x solução de Denhardt é usada como uma solução e/ou temperaturas de hibridização são entre 35°C e 70°C, preferivelmente 65°C. Depois de hibridização, lavagem preferivelmente é realizada primeiro com 2xSSC, 1% de SDS e subsequentemente com 0,2xSSC em temperaturas entre 35°C e 70°C, preferivelmente a 65°C (considerando a definição de SSPE, SSC e solução de Denhardt (veja Sambrook et al. loc. cit.).

[0227] Em particular, a invenção se refere a qualquer sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção e como dada em SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12, respectivamente, particularmente à fita complementar desta, em condições de hibridização estringentes como por exemplo descrito em Sambrook et al, acima, mais particularmente em condições de hibridização estringentes onde hibridização e lavagem ocorrem a 65°C como indicado acima.

[0228] ● Em uma forma de realização específica a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo tem as propriedades características de um anticorpo produzido por uma linhagem celular de hibridoma selecionada a partir do grupo consistindo de FP 12H3, FP 12H3-C2, e FP 12H3-G2 depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente, como DSM ACC2752, DSM ACC 2750 e DSM ACC2751, respectivamente.

[0229] ● Mais particularmente, a invenção se refere a um anticorpo incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3, depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente como DSM ACC2752.

[0230] ● Mais particularmente, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3-C2, depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente como DSM ACC2750.

[0231] ● Mais particularmente, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3-G2, depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente como DSM ACC2751.

[0232] ● Em outra forma de realização específica a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo tem as propriedades características de um anticorpo produzido por linhagem celular de hibridoma ET 7E3 depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2755.

[0233] Mais particularmente, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma ET 7E3, depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2755.

[0234] ● Em outra forma de realização específica a presente invenção fornece um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo tem as propriedades características de um anticorpo produzido por linhagem celular de hibridoma EJ 7H3 depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2756.

[0235] ● Mais particularmente, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma EJ 7H3, depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2756.

[0236] ● Outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos e composições compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes para a prevenção e/ou tratamento terapêutico e/ou alívio dos efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças e condições que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular, por exemplo, imunizando passivamente um humano ou animal com um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes.

[0237] ● Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de usar um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste de acordo com a invenção e composições compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes para diagnosticar e intervenção terapêutica de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular.

[0238] ● Em particular, um objetivo da presente invenção é fornecer um método de usar um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste de acordo com a invenção e composições compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo biespecífico ou bi-efetivo mas especialmente um anticorpo monoclonal biespecífico ou bi-efetivo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes para reduzir e prevenir a ocorrência de desordens neurológicas, incluindo mas não limitado a mal de Alzheimer.

[0239] ● As composições de acordo com a presente invenção compreendem um anticorpo, particularmente um anticorpo biespecífico ou bi-efetivo, de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, particularmente em uma quantidade terapeuticamente efetiva ou, mais particularmente, um anticorpo monoclonal, especialmente um anticorpo monoclonal biespecífico ou bi-efetivo, de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, particularmente em uma quantidade terapeuticamente efetiva e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0240] ● Particularmente, a composição de acordo com a presente invenção compreende um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes cujo anticorpo é capaz de inibir a agregação de peptídeos monoméricos amilóides, especificamente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, em fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0241] ● Em uma forma de realização adicional da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação, particularmente mediante co-incubação em uma proporção de concentração molar de até 1:100, mais particularmente em uma proporção de concentração molar de entre 1:30 e 1:100, mas especialmente em uma proporção de concentração molar de 1:100, com peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 142, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, inibe a agregação dos monômeros Aβ em fibrilas ou filamentos poliméricos moleculares superiores. Em particular, dita inibição sobe para pelo menos 50%, particularmente para pelo menos 65%, mais particularmente para pelo menos 75%, ainda mais particularmente para pelo menos 80%, mas especialmente para pelo menos 85%-90%, ou mais se comparado com os respectivos monômeros de peptídeo amilóide incubados em tampão (controle) e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0242] ● Em particular, a co-incubação do anticorpo de acordo com a invenção com peptídeos monoméricos amilóides é realizada por 48 horas em uma temperatura de 37°C.

[0243] ● O potencial de inibição de agregação do anticorpo de acordo com a invenção pode ser determinado por ultracentrifugação por gradiente de densidade seguido por uma análise de sedimentação SDS-PÁGINA em um gradiente pré-formado e/ou por um ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T).

[0244] ● A presente invenção fornece adicionalmente uma composição compreendendo um anticorpo que é capaz de desagregar fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, especificamente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0245] ● Através da desagregação de fibrilas ou filamentos poliméricos amiloidogênicos os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou retardar a formação de placas amilóides o que leva a um alívio dos sintomas associados com a doença e um atraso ou reversão de sua progressão.

[0246] ● Em outra forma de realização da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação em uma proporção de concentração molar de entre 1:30 e 1:100, particularmente em uma proporção de 1:100, com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Αβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, particularmente mediante co-incubação por 24 horas em uma temperatura de 37°C, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré-formados em pelo menos 35%, particularmente em pelo menos 40%, mais particularmente em pelo menos 50%, ainda mais particularmente em pelo menos 60%, mas especialmente em pelo menos 70% ou mais e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0247] ● O potencial de desagregação do anticorpo de acordo com a invenção pode ser determinado por ultracentrifugação por gradiente de densidade seguido por uma análise de sedimentação SDS-PÁGINA em um gradiente pré-formado e/ou por um ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T).

[0248] ● A presente invenção fornece adicionalmente uma composição compreendendo um anticorpo ou partes funcionais destes cujo anticorpo é conformacionalmente sensível, particularmente em uma quantidade efetiva, mais particularmente em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

[0249] ● Em uma forma de realização adicional da invenção é fornecida composição compreendendo um anticorpo, mas especialmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, particularmente mediante co-incubação por 24 horas em uma temperatura de 37°C, é capaz de induzir uma transição da conformação folha-β para uma α-hélice e/ou uma conformação espiral aleatória, mas particularmente uma conformação espiral aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiral aleatória em uma dada localização na molécula, especialmente no ambiente de Val12 da proteína Aβ, o que leva a um aumento da conformação espiral aleatória às custas da conformação folha-β e uma solubilização melhorada das fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em particular a diminuição da conformação folha-β sobe pelo menos 30%, particularmente para pelo menos 35%, e mais particularmente para pelo menos 40% e mais se comparado com as respectivas fibrilas poliméricas amilóides pré-formadas ou filamentos incubados em tampão (controle).

[0250] ● O potencial de anticorpo para induzir uma transição na estrutura secundária é determinado por espectroscopia 13C NMR de estado sólido mas, em particular, medindo as intensidades integrais das conformações de Val 12 C13 no peptídeo Aβ1-42.

[0251] ● A presente invenção fornece adicionalmente uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, particularmente em uma quantidade terapeuticamente efetiva, cujo anticorpo é bifuncional já que ele exibe tanto uma propriedade de inibição de agregação assim como uma propriedade de desagregação como definido neste lugar antes, preferivelmente pareada com um alto grau de sensibilidade conformacional e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0252] ● Em ainda outra forma de realização da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo, mediante co-incubação com peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, inibe a agregação dos monômeros Aβ em fibrilas poliméricas moleculares superiores e, em adição, mediante co-incubação com fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Αβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Αβ1-42 monoméricos, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré-formados e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0253] ● Em uma forma de realização específica da invenção a co-incubação do anticorpo bifuncional de acordo com a invenção, mas especialmente do anticorpo monoclonal bifuncional de acordo com a invenção com peptídeos monoméricos amilóides e fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados, respectivamente, ocorre em uma proporção de concentração molar de até 1:100, particularmente em uma proporção de entre 1:30 e 1:100, e mais particularmente em uma proporção de 1:100.

[0254] ● Em uma forma de realização específica adicional da invenção co-incubação com peptídeos monoméricos amilóides e fibrilas ou filamentos amilóides poliméricos moleculares superiores pré-formados é feita por 48 horas e 24 horas, respectivamente, em uma temperatura de 37°C.

[0255] ● Em ainda outra forma de realização específica da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo bifuncional de acordo com a invenção, mas especialmente um anticorpo monoclonal bifuncional de acordo com a invenção que é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré-formados em pelo menos 10%, particularmente em pelo menos 25%, mais particularmente em pelo menos 35%, ainda mais particularmente em pelo menos 50%, mas especialmente em pelo menos 60 - 70% ou mais e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0256] ● Em ainda outra forma de realização específica da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo bifuncional de acordo com a invenção, mas especialmente um anticorpo monoclonal bifuncional de acordo com a invenção inibe a agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Αβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Αβ1-42 monoméricos em pelo menos 50%, particularmente em pelo menos 65%, mais particularmente em pelo menos 75%, ainda mais particularmente em pelo menos 80%, mas especialmente em pelo menos 85-90%, ou mais se comparado com os respectivos monômeros de peptídeo amilóide incubados em tampão (controle) e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0257] ● Em particular, a presente invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo media a inibição de polimerização de peptídeos monoméricos amilóides, especificamente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente a peptídeos Aβ1-42 monoméricos e/ou induz solubilização de fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, através de ligação específica e direta do anticorpo às fibras Aβ, o que leva a uma transição de conformação secundária e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0258] ● A presente invenção fornece adicionalmente uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo se liga diretamente e especificamente a fibras β-amilóides tal como, por exemplo, fibras compreendendo peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 1-42, ou 1-43, mas especialmente a fibras compreendendo peptídeos Aβ1-42 monoméricos e/ou induz solubilização de fibrilas amilóides poliméricas moleculares superiores pré-formadas ou filamentos formados pela agregação de peptídeos monoméricos amilóides, particularmente peptídeos β-amilóides monoméricos tal como, por exemplo, peptídeos Aβ monoméricos 1-39; 1-40, 1-41, 142, ou 1-43, mas especialmente peptídeos Aβ1-42 monoméricos, direcionando e se ligando especificamente a uma região epitópica da proteína β-amilóide, particularmente uma região epitópica do polipeptídeo Aβ confinada por resíduos de aminoácidos aan-aam com n sendo um número inteiro entre 2 e 15, particularmente entre 5 e 15, mais particularmente entre 8 e 15, ainda mais particularmente entre 10 e 15 e m sendo um número inteiro entre 3 e 17, particularmente entre 6 e 17, mais particularmente entre 9 e 17, ainda mais particularmente entre 11 e 17, caracterizado pelo fato de que n e m não podem ser números idênticos e n deve ser sempre um número menor do que m, com a diferença entre n e m 2 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0259] A ligação do anticorpo de acordo com a invenção pode induzir uma transição conformacional em dita proteína, particularmente uma transição da conformação folha-β para uma α-hélice e/ou uma conformação espiral aleatória, mas particularmente uma conformação espiral aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiral aleatória em uma dada localização na molécula, especialmente no ambiente de Val12 da proteína Aβ.

[0260] ● Em uma forma de realização adicional, a invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo incorpora pelo menos uma das propriedades mencionadas neste lugar antes, isto é inibição de agregação, desagregação, indução de transição conformacional, reconhecimento de e ligação direta à região epitópica de 4-16 e/ou à de 14 a 23, mas particularmente à de 14 a 20, mas especialmente uma combinação de duas ou mais de ditas propriedades e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0261] ● Em uma forma de realização específica, a invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que exibe alta especificidade para peptídeos Aβ1-42 monoméricos mas mostra essencialmente nenhuma ou apenas reatividade cruzada minoritária para peptídeos Αβ1-38, Αβ1-39, Αβ1-40, e/ou Αβ1-40 monoméricos, particularmente um anticorpo, mas especialmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo é até 100 vezes, particularmente 50 a 100 vezes, mais particularmente 80 a 100 vezes, mas especialmente 100 vezes mais sensível a peptídeo amilóide Aβ1-42 se comparado com Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 e até 1000 vezes, particularmente 500 a 1000 vezes, mais particularmente 800 a 1000 vezes, mas especialmente 1000 vezes mais sensível a peptídeo amilóide Αβ1-42 se comparado com Αβ1-38 e assim capaz de inibir, in vitro e in vivo, a agregação de peptídeos monoméricos amiloidogênicos, mas especialmente de peptídeo amilóide Aβ1-42 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0262] ● Em outra forma de realização específica da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, que tem uma sensibilidade de ligação para peptídeo amilóide Αβ1-42 e é capaz de detectar fibras Αβ1-42 em uma concentração de até pelo menos 0,001 μg, mas particularmente em um intervalo de concentração de entre 0,5 μg e 0,001 μg, mais particularmente entre 0,1 μg e 0,001 μg, mas especialmente em uma concentração de 0,001 μg e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0263] ● Em uma forma de realização muito específica da invenção é fornecida uma composição compreendendo um anticorpo, particularmente um anticorpo bifuncional, mas especialmente um anticorpo monoclonal, particularmente um anticorpo monoclonal bifuncional, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, cujo anticorpo é capaz de detectar fibras Αβ1-42 até uma concentração mínima de 0,001 μg e fibras Aβ1-40 até uma concentração mínima de 0,1 μg e fibras Aβ1-38 até uma concentração mínima de quantidade de 1 μg de fibras e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0264] ● Em uma forma de realização específica a presente invenção se refere a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes cujo anticorpo tem as propriedades características de um anticorpo produzido por uma linhagem celular de hibridoma selecionada a partir do grupo consistindo de FP 12H3, FP 12H3-C2, e FP 12H3-G2 depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente, como DSM ACC2752, DSM ACC2750 e DSM ACC2751, e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0265] ● Mais particularmente, a invenção se refere a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3, depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente como DSM ACC2752 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0266] Mais particularmente, a invenção se refere a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3-C2, depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente como DSM ACC2750 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0267] ● A invenção se refere adicionalmente a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3-G2, depositada em 01 de Dezembro de 2005 e 09 de Dezembro de 2005, respectivamente como DSM ACC2751 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0268] ● Em outra forma de realização específica a presente invenção se refere a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes cujo anticorpo tem as propriedades características de um anticorpo produzido por linhagem celular de hibridoma ET 7E3 depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2755 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0269] ● A invenção se refere adicionalmente a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma ET 7E3, depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2755 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0270] ● Em outra forma de realização específica a presente invenção se refere a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes cujo anticorpo tem as propriedades características de um anticorpo produzido por linhagem celular de hibridoma EJ 7H3 depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2756 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0271] ● A invenção se refere adicionalmente a uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes produzido por linhagem celular de hibridoma EJ 7H3, depositada em 08 de Dezembro de 2005 como DSM ACC2756 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0272] ● O anticorpo, particularmente o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes pode ser administrado em combinação com outras substâncias biologicamente ativas e procedimentos para o tratamento de doenças. As outras substâncias biologicamente ativas podem ser parte da mesma composição já compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção, em forma de uma mistura, caracterizado pelo fato de que o anticorpo e a outra substância biologicamente ativa são misturados em ou com o mesmo solvente e/ou carreador farmaceuticamente aceitável ou podem ser fornecidas separadamente como parte de uma composição separada, que pode ser oferecida separadamente ou junto em forma de um kit de partes.

[0273] ● O anticorpo, particularmente o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes pode ser administrado no mesmo momento com a outra substância ou substâncias biologicamente ativas, intermitentemente ou sequencialmente. Por exemplo, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes pode ser administrado simultaneamente com uma primeira substância biologicamente ativa adicional ou sequencialmente depois ou antes de administração do anticorpo. Se for escolhido um esquema de aplicação onde mais do que uma substância biologicamente ativa adicional é administrada junto com o pelo menos um anticorpo de acordo com a invenção, os compostos ou substâncias podem ser parcialmente administrados simultaneamente, parcialmente sequencialmente em várias combinações.

[0274] ● Outro objetivo da presente invenção é sustentar misturas de anticorpos compreendendo pelo menos um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, uma ou mais substâncias biologicamente ativas adicionais, assim como métodos de usar anticorpos individuais, ou misturas destes incluindo composições compreendendo ditos anticorpos ou misturas de anticorpos para a prevenção e/ou tratamento terapêutico e/ou alívio dos efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular.

[0275] ● As misturas de acordo com a invenção podem compreender, em adição a um anticorpo de acordo com a invenção, uma substância biologicamente ativa tal como, por exemplo, compostos conhecidos usados na medicação de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com proteína amilóide ou tipo amilóide tal como a proteína Aβ envolvida em mal de Alzheimer.

[0276] ● Em outra forma de realização da invenção, a outra substância ou composto biologicamente ativo pode ser um agente terapêutico que pode ser usado no tratamento de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose causada por amilóide β ou pode ser usado na medicação de outras desordens neurológicas.

[0277] ● A outra substância ou composto biologicamente ativo pode exercer seu efeito biológico pelo mesmo mecanismo ou um similar que o anticorpo de acordo com a invenção ou por um mecanismo de ação não relacionado ou por uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou não relacionados.

[0278] ● Geralmente, o outro composto biologicamente ativo pode incluir estimuladores de transmissão de nêutrons, drogas psicoterapêuticas, inibidores de acetilcolinesterase, bloqueadores de canal de cálcio, aminas biogênicas, tranquilizantes de benzodiazepina, estimuladores de síntese de, armazenamento ou liberação de acetilcolina, agonistas de receptor pós-sináptico de acetilcolina, inibidores de monoamina oxidase-A ou -B, antagonistas de receptor de N-metil-D-aspartato glutamato, drogas antiinflamatórias não esteroidais, antioxidantes, e receptor antagonistas de receptor serotonérgico.

[0279] ● Em particular, a mistura de acordo com a invenção pode compreender pelo menos um outro composto biologicamente ativo selecionado a partir do grupo consistindo de compostos contra estresse oxidativo, compostos anti-apoptóticos, quelantes de metal, inibidores de reparo de DNA tal como pirenzepina e metabólitos, 3-amino-1-ácido propanosulfônico (3APS), 1,3- propanodisulfonato (1,3PDS), ativadores de secretase, inibidores de e y -secretase, proteínas tau, neurotransmissor, degradadores de folha-β, moléculas antiinflamatórias, ou inibidores de colinesterase (ChEls) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou galantamina e outras drogas e suplementos nutritivos, junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0280] ● Em uma forma de realização adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender niacina ou memantina junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0281] ● Em ainda outra forma de realização da invenção são fornecidas misturas que compreendem "antipsicóticos atípicos" tal como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos incluindo alucinações, ilusões, desordens de pensamento (manifestadas por incoerência marcada, descarrilamento, tangencialidade), e comportamento bizarro ou desorganizado, assim como anedonia, emoção embotada, apatia, e afastamento social, junto com um anticorpo de acordo com a invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0282] ● Em uma forma de realização específica da invenção, as composições e misturas de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes compreendem o anticorpo e a substância biologicamente ativa, respectivamente, em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

[0283] ● Outros compostos que podem ser adequadamente usados em misturas em combinação com o anticorpo de acordo com a presente invenção são, por exemplo, descritos em WO 2004/058258 (veja especialmente páginas 16 e 17) incluindo alvos de droga terapêutica (página 36-39), ácidos alcanosulfônicos e ácidos alcanolsulfônicos (páginas 39-51), inibidores de colinesterase (páginas 51-56), antagonistas de receptor NMDA (páginas 56-58), estrógenos (páginas 58-59), drogas antiinflamatórias não esteroidais (páginas 60-61), antioxidantes (páginas 61-62), agonistas de receptor ativado por proliferadores de peroxissomo (PPAR) (páginas 63-67), agentes que diminuem colesterol (páginas 68-75); inibidores de amilóide (páginas 75-77), inibidores de formação de amilóide (páginas 77-78), quelantes de metal (páginas 78-79), antipsicóticos e antidepressivos (páginas 80-82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos aumentando a disponibilidade de substâncias biologicamente ativas no cérebro (veja páginas 89-93) e pró-fármacos (páginas 93 e 94), cujo documento é incorporado neste lugar por referência.

[0284] ● Adicionalmente é fornecido um método para produzir um anticorpo, particularmente um método para produzir um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes de acordo com a invenção, cujo método compreende produzir anticorpos mas particularmente anticorpos monoclonais contra uma construção antigênica supramolecular compreendendo um peptídeo antigênico correspondendo à sequência de aminoácidos do peptídeo β-amilóide, particularmente de peptídeo β-amilóide Aβ1-15, Aβ1-16 e Aβ1-16(Δ14), modificado com unidades hidrofóbicas tal como, por exemplo, ácido palmítico ou uma unidade hidrofílica tal como, por exemplo, polietilenoglicol(PEG) ou uma combinação de ambas, caracterizado pelo fato de que dita unidade hidrofóbica e hidrofílica, respectivamente, é covalentemente ligada a cada término através de pelo menos um, particularmente um ou dois, aminoácidos tal como, por exemplo, lisina ou qualquer outro aminoácido adequado ou análogo de aminoácido capaz de servir como um dispositivo de acoplamento ou molécula ligante para o acoplamento de dita unidade hidrofóbica e hidrofílica tal como, por exemplo, ácido glutâmico ou cisteína.

[0285] ● Também é parte da invenção o uso de um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes e/ou uma composição farmacêutica, ou uma mistura compreendendo dito anticorpo, para a preparação de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular.

[0286] ● Em outra forma de realização da presente invenção é fornecido um método para a preparação de uma composição farmacêutica usando um anticorpo de acordo com a invenção e/ou uma parte funcional deste mas especialmente um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou um anticorpo funcionalmente equivalente, para uso para tratar ou aliviar os efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular compreendendo formulando um anticorpo de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável.

[0287] ● Os anticorpos e/ou partes funcionais destes mas especialmente os anticorpos monoclonais e/ou partes funcionais destes ou um anticorpo funcionalmente equivalente e as composições e misturas compreendendo dito anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser usados para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular.

[0288] ● Em uma forma de realização adicional da invenção é fornecido um método para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano sofrendo de uma doença ou condição levando a uma aumentada carga de placas no cérebro compreendendo administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano com necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo e/ou uma parte funcional deste mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes, ou uma composição ou uma mistura compreendendo dito anticorpo.

[0289] Em particular, a carga de placa é reduzida em pelo menos 20 %, particularmente em pelo menos 25%, mais particularmente em pelo menos 30%, ainda mais particularmente em mais do que 30%.

[0290] ● Em uma forma de realização adicional da invenção um método para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano sofrendo de uma doença ou condição levando a uma aumentada carga de placas no cérebro compreendendo administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano com necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo e/ou uma parte funcional deste mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes, ou uma composição ou uma mistura compreendendo dito anticorpo.

[0291] Em particular, a quantidade de placas no cérebro é reduzida em pelo menos 10%, particularmente em pelo menos 15%, mais particularmente em mais do que 15%.

[0292] ● Em ainda outra forma de realização da invenção um método para diminuir a quantidade total de Aβ solúvel no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano sofrendo de uma doença ou condição levando a concentrações aumentadas de Aβ solúvel no cérebro compreendendo administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano com necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo e/ou uma parte funcional deste mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes, ou uma composição ou uma mistura compreendendo dito anticorpo.

[0293] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular, administrando um anticorpo, mas particularmente um anticorpo monoclonal ou uma composição ou mistura compreendendo um tal anticorpo de acordo com a invenção a um animal ou um humano afetado por uma tal desordem compreendendo administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um humano com necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo e/ou uma parte funcional deste mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes, ou uma composição ou uma mistura compreendendo dito anticorpo.

[0294] ● Em uma forma de realização específica a invenção fornece um método para reter ou aumentar capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um humano sofrendo de deficiência de memória administrando a um animal, particularmente um mamífero ou um humano com necessidade de um tal tratamento, um anticorpo, mas particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção ou uma composição ou mistura compreendendo um tal anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes.

[0295] ● Em outra forma de realização da presente invenção é fornecido um método para a preparação de uma composição farmacêutica usando um anticorpo de acordo com a invenção e/ou parte funcional deste mas especialmente um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou um anticorpo funcionalmente equivalente para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular.

[0296] ● Em uma forma de realização específica a invenção fornece um método para a preparação de uma composição farmacêutica usando um anticorpo de acordo com a invenção e/ou uma parte funcional deste mas especialmente um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional deste ou um anticorpo funcionalmente equivalente para reter ou aumentar capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um humano, sofrendo de deficiência de memória administrando a um animal, particularmente um mamífero ou um humano, um anticorpo, mas particularmente um anticorpo monoclonal ou uma composição ou mistura compreendendo um tal anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes.

[0297] ● Estes e outros objetivos, características e vantagens da presente invenção serão perceptíveis depois de uma revisão da seguinte descrição detalhada da forma de realização descrita e das reivindicações anexas.

[0298] ● Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína", como usado neste lugar, são permutáveis e são definidos para significar uma biomolécula composta de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.

[0299] Os termos "um", "uma" e "o" como usados neste lugar são definidos para significar "um ou mais" e incluem o plural a menos que o contexto seja inapropriado.

[0300] ● Os termos "detectar" ou "detectado" como usados neste lugar significam usar técnicas conhecidas para detecção de moléculas biológicas tal como métodos imunoquímicos e histológicos e se referem a determinar qualitativamente ou quantitativamente a presença ou concentração da biomolécula sob investigação.

[0301] ● "Amilóide β, Aβ ou β-amilóide" é um termo reconhecido na arte e se refere a proteínas e peptídeos β-amilóides, precursor de proteína β-amilóide (APP), assim como modificações, fragmentos e quaisquer equivalentes funcionais destas. Em particular, por β-amilóide como usado neste lugar é pretendido qualquer fragmento produzido por clivagem proteolítica de APP mas especialmente aqueles fragmentos que estão envolvidos em ou associados com as patologias amilóides incluindo, mas não limitado a, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41, Aβ1-42 e , Aβ1-43.

[0302] ● A estrutura e sequências dos peptídeos β-amilóides como mencionado acima são bem conhecidos por aqueles versados na arte e métodos de produzir ditos peptídeos ou de extrair eles de cérebro e outros tecidos são descritos, por exemplo, em Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm129, 885-890 (1984). Além disso, peptídeos β-amilóides também são comercialmente disponíveis em várias formas.

[0303] ● "Fibrila Aβ" ou "Filamento Aβ" ou "Fibrilas amilóides" são formas poliméricas de proteína monomérica formando fibras individuais ou empacotadas com diâmetro de fibra constante que são insolúveis em meio aquoso e contêm grandes quantidades de uma estrutura em cruz β em seu core; principalmente com fitas beta perpendiculares ao eixo de fibrila 1.2,3)

[0304] "Aβ monomérico" ou "monômero Aβ" são proteínas β-amilóides completamente solubilizadas sem complexos agregados em meio aquoso.

[0305] ● "Amilóide polimérico solúvel" e "Aβ oligomérico" e "oligômero Aβ" se refere a múltiplos monômeros agregados de peptídeo amilóides, ou de peptídeos tipo amilóide, ou de peptídeos amilóides modificados ou truncados ou de outros derivados de peptídeos amilóides formando estruturas oligoméricas ou poliméricas que são solúveis tanto in vitro em meio aquoso como in vivo no mamífero ou corpo humano mais particularmente no cérebro, mas particularmente para múltiplos monômeros agregados de β-amilóide (Aβ) ou de peptídeos β-amilóides (Aβ) modificados ou truncados ou de derivados destes, que são solúveis no mamífero ou corpo humano mais particularmente no cérebro, respectivamente.

[0306] ● Por "isolada" é pretendida uma molécula biológica livre de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela naturalmente ocorre.

[0307] ● Os termos "anticorpo" ou "anticorpos" como usado neste lugar é um termo reconhecido na arte e é entendido para se referir a moléculas ou fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos, particularmente a moléculas de imunoglobulina e a porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, i.e moléculas que contêm um sítio de ligação que se liga imunoespecificamente a um antígeno. A imunoglobulina de acordo com a invenção pode ser de qualquer tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou classe (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e lgA2) ou subclasses de molécula de imunoglobulina.

[0308] ● "Anticorpos" são pretendidos dentro do escopo da presente invenção para incluir anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia única, biespecíficos ou bi-efetivos, adaptados ao modelo símio, humanos e anticorpos humanizados assim como fragmentos ativos destes. Exemplos de fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos incluem fragmentos Fab e F(ab')2, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer dos anticorpos e fragmentos mencionados acima.

[0309] ● Estes fragmentos ativos podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção por diversas técnicas. Por exemplo, anticorpos monoclonais purificados podem ser clivados com uma enzima, tal como pepsina, e sujeitos a filtração em gel HPLC. A fração apropriada contendo fragmentos Fab pode então ser coletada e concentrada por filtração em membrana e os semelhantes. Para descrição adicional de técnicas gerais para o isolamento de fragmentos ativos de anticorpos, veja por exemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.

[0310] ● Um "anticorpo humanizado" se refere a um tipo de anticorpo manipulado tendo suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina doadora não humana, as partes derivadas de imunoglobulinas remanescentes da molécula sendo derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humana(s). Em adição, resíduos de suporte de arcabouço podem ser alterados para preservar afinidade de ligação. Métodos para obter "anticorpos humanizados" são bem conhecidos por aqueles versados na arte. (veja, e.g., Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).

[0311] ● Um "anticorpo humanizado" também pode ser obtido por uma nova abordagem de engenharia genética que possibilita produção de anticorpos policlonais tipo humanos maduros por afinidade em animais grandes tal como, por exemplo,coelhos(http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).

[0312] ● O termo "anticorpo monoclonal" também é bem reconhecido na arte e se refere a um anticorpo que é produzido em massa no laboratório a partir de um único clone e que reconhece apenas um antígeno. Anticorpos monoclonais tipicamente são feitos fundindo uma célula B produtora de anticorpo normalmente de vida curta a célula de crescimento rápido, tal como uma célula cancerosa (algumas vezes referida como uma célula "imortal"). A célula híbrida resultante, ou hibridoma, se multiplica rapidamente, criando um clone que produz grandes quantidades do anticorpo.

[0313] ● Para o propósito da presente invenção, "anticorpo monoclonal" também é para ser entendido por compreender anticorpos que são produzidos por um clone-mãe que ainda não atingiu monoclonalidade completa.

[0314] ● "Anticorpo funcionalmente equivalente" é entendido dentro do escopo da presente invenção para se referir a um anticorpo que compartilha substancialmente pelo menos uma propriedade funcional principal com um anticorpo mencionado acima e descrito neste lugar compreendendo: especificidade de ligação para a proteína β-amilóide, particularmente para a proteína Αβ1-42, e mais particularmente para a região epitópica 4-16 da proteína Aβ1-42, imunorreatividade in vitro, inibição de agregação dos monômeros Aβ1-42 em fibrilas poliméricas moleculares superiores e/ou desagregação de fibrilas poliméricas Aβ1-42 pré-formadas, e/ou uma propriedade de quebra de folha-β e aliviando os efeitos de doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite com corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e outras, incluindo degeneração macular, quando administrado profilaticamente ou terapeuticamente. Os anticorpos podem ser de qualquer classe tal como IgG, IgM, ou IgA, etc ou qualquer subclasse tal como IgG1 , IgG2a, etc e outras subclasses mencionadas acima neste lugar ou conhecidas na arte, mas particularmente da classe IgG2. demais, os anticorpos podem ser produzidos por qualquer método, tal como apresentação em fago, ou produzidos em qualquer organismo ou linhagem celular, incluindo bactérias, inseto, mamífero ou outro tipo de célula ou linhagem celular que produz anticorpos com características desejadas, tal como anticorpos humanizados. Os anticorpos também podem ser formados combinando uma porção Fab e uma região Fc de espécies diferentes.

[0315] ● O termo “biespecífico" ou "bifuncional" e "bi-efetivo" é usado sinonimamente dentro do escopo deste pedido para caracterizar um anticorpo que exibe tanto uma propriedade de inibição em formação de fibra amilóide ou tipo amilóide assim como uma propriedade de desagregação de fibras amilóides ou tipo amilóides.

[0316] ● O termo "antígeno" se refere a uma entidade ou fragmento desta que pode induzir uma resposta imune em um organismo, particularmente um animal, mais particularmente um mamífero incluindo um humano. O termo inclui imunogenes e regiões responsáveis por antigenicidade ou determinantes antigênicos.

[0317] ● Como usado neste lugar, o termo "solúvel" significa parcialmente ou completamente dissolvido em uma solução aquosa.

[0318] ● Também como usado neste lugar, o termo "imunogênicas" se refere a substâncias que provocam ou estimulam a produção de anticorpos, células T e outras células imunes reativas dirigidas contra um agente imunogênico e contribuem para uma resposta imune em humanos ou animais.

[0319] Uma resposta imune ocorre quando um indivíduo produz anticorpos suficientes, células T e outras células imunes reativas contra composições imunogênicas administradas da presente invenção para moderar ou aliviar a desordem a ser tratada.

[0320] ● "Amilóide polimérico solúvel" se refere a múltiplos monômeros agregados de peptídeo amilóides, ou de peptídeos tipo amilóide, ou de peptídeos amilóides modificados ou truncados ou de outros derivados de peptídeo amilóides formando estruturas oligoméricas ou poliméricas que são solúveis no mamífero ou corpo humano mais particularmente no cérebro, mas particularmente a múltiplos monômeros agregados de β-amilóide (Aβ) ou de peptídeos β-amilóides (Aβ) modificados ou truncados ou de derivados destes, que são solúveis no mamífero ou corpo humano mais particularmente no cérebro.

[0321] ● O termo “hibridoma" é reconhecido na arte e é entendido por aqueles de habitual verso na arte para se referir a uma célula produzida pela fusão de uma célula produtora de anticorpo e uma célula imortal, e.g. uma célula de mieloma múltiplo. Esta célula híbrida é capaz de produzir um fornecimento contínuo de anticorpo. Veja a definição de "anticorpo monoclonal" acima e os Exemplos abaixo para uma descrição mais detalhada do método de fusão.

[0322] ● O termo "carreador" como usado neste lugar significa uma estrutura na qual peptídeo antigênico ou construção supramolecular pode ser incorporado em ou pode ser associado com, com isso apresentando ou expondo peptídeos antigênicos ou parte do peptídeo ao sistema imune de um humano ou animal. Qualquer partícula que pode ser pode ser adequadamente usada em terapia animal ou humana tal como, por exemplo, uma vesícula, uma partícula ou um corpo particulado pode ser usado como um carreador dentro do contexto da presente invenção.

[0323] O termo "carreador" compreende adicionalmente métodos de liberação caracterizados pelo fato de que composições de construção antigênica supramolecular compreendendo o peptídeo antigênico podem ser transportadas para sítios desejados por mecanismos de liberação. Um exemplo de um tal sistema de liberação utiliza metais coloidais tal como ouro coloidal.

[0324] ● Em adição, o termo “carreador" compreende adicionalmente mecanismos de liberação conhecidos por aqueles versados na arte incluindo, mas não limitado a, hemocianina de caramujo Megathura crenulata (KLH), albumina de soro bovino (BSA) e outros adjuvantes.

[0325] ● Na construção antigênica supramolecular de acordo com a presente invenção, o lipossomo pode ter uma função dupla na medida em que ele pode ser usado como um carreador compreendendo a construção supramolecular como descrito neste lugar antes e, no mesmo momento, funcionar como um adjuvante para aumentar ou estimular a resposta imune dentro do animal ou humano alvo a ser tratado com a vacina terapêutica de acordo com a invenção. Também é para ser entendido que as composições de construção antigênica supramolecular da presente invenção podem compreender adicionalmente adjuvantes adicionais tal como, por exemplo, lipídio A, alume, fosfato de cálcio, interleucina 1, e/ou microcápsulas de polissacarídeos e proteínas, mas particularmente um lipídio A detoxificado, tal como monofosforil ou difosforil lipídio A, ou alume, conservantes adicionais, diluentes, emulsificantes, estabilizantes, e outros componentes que são conhecidos e usados em vacinas da arte anterior. Além disso, qualquer sistema adjuvante conhecido na arte pode ser usado na composição da presente invenção. Tais adjuvantes incluem, mas não são limitados a, Adjuvante Incompleto de Freund, Adjuvante Completo de Freund, manana acetilada β-(1,4) ligada polidispersa (Acemannan"), TITERMAX® (adjuvantes de copolímero polioxietileno-polioxipropileno de CytRx Corporation), Adjuvantes de lipídio modificado de Chiron Corporation, adjuvantes de derivado de saponina de Cambridge Biotech, Bordetella pertussis morta, o lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, ânions poliméricos grandes tal como sulfato de dextrana, e géis inorgânicos tal como alume, hidróxido de alumínio, ou fosfato de alumínio.

[0326] ● Proteínas carreadoras que podem ser usadas nas composições de construção antigênica supramolecular da presente invenção incluem, mas não são limitados a, proteína de ligação de maltose "MBP"; albumina de soro bovino "BSA"; hemocianina de caramujo Megathura crenulata "KLH"; ovalbumina; flagelina; tiroglobulina; albumina de soro de qualquer espécie; gama globulina de qualquer espécie; células singênicas; células singênicas tolerando os antígenos; e polímeros de D-e/ou L- aminoácidos.

[0327] ● Ademais, o termo "quantidade terapeuticamente efetiva" se refere à quantidade de anticorpo que, quando administrada a um humano ou animal, provoca uma resposta imune que é suficiente para resultar em um efeito terapêutico em dito humano ou animal. A quantidade efetiva é prontamente determinada por alguém de verso na arte seguindo procedimentos de rotina.

[0328] ● Homologia entre duas sequências é determinada por identidade de sequência. Se duas sequências que estão a ser comparadas uma com a outra diferem em comprimento, identidade de sequência preferivelmente se refere à porcentagem dos resíduos de nucleotídeos da sequência menor que são idênticos com os resíduos de nucleotídeos da sequência maior. Identidade de sequência pode ser determinada convencionalmente com o uso de programas computacionais tal como o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, a fim de encontrar o segmento tendo a maior identidade de sequência entre duas sequências. Ao usar Bestfit ou outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular tem por exemplo 95% de identidade com uma sequência de referência da presente invenção, os parâmetros preferivelmente são ajustados de forma que a porcentagem de identidade é calculada pelo comprimento inteiro da sequência de referência e que lacunas de homologia de até 5% do número total dos nucleotídeos na sequência de referência sejam permitidas. Ao usar Bestfit, os assim chamados parâmetros opcionais preferivelmente são deixados em seus valores pré-ajustados ("padrão"). Os desvios aparecendo na comparação entre uma dada sequência e as sequências descritas acima da invenção podem ser causados por exemplo por adição, deleção, substituição, inserção ou recombinação. Uma tal comparação de sequências preferivelmente também pode ser realizada com o programa "fasta20u66" (versão 2.0u66, Setembro de 1998 por William R. Pearson e a University of Virginia; veja também W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, exemplos anexos e http://workbench.sdsc.edu/). Para este propósito, as configurações "padrão" de parâmetros podem ser usadas.

[0329] ● O termo "hibridiza" como usado se refere a condições de hibridização convencionais, preferivelmente a condições de hibridização nas quais 5xSSPE, 1% de SDS, 1x solução de Denhardt é usada como uma solução e/ou temperaturas de hibridização são entre 35°C e 70°C, preferivelmente 65°C. Depois de hibridização, lavagem preferivelmente é realizada primeiro com 2xSSC, 1% de SDS e subsequentemente com 0,2xSSC em temperaturas entre 35°C e 70°C, preferivelmente a 65°C (considerando a definição de SSPE, SSC e solução de Denhardt veja Sambrook et al. loc. cit.). Condições de hibridização estringentes como por exemplo descrito em Sambrook et al, acima, são particularmente preferidas. Condições de hibridização estringentes particularmente preferidas estão por exemplo presentes se hibridização e lavagem ocorrem a 65°C como indicado acima. Condições de hibridização não estringentes, por exemplo com hibridização e lavagem realizadas a 45°C são menos preferidas e a 35°C ainda menos.

[0330] ● A presente invenção pode ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada de formas de realização específicas incluídas neste lugar. Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a detalhes específicos de certas formas de realização, desta, não é pretendido que tais detalhes sejam considerados como limitações no escopo da invenção.

[0331] ● A presente invenção fornece anticorpos e partes funcionais destes que são anticorpos conformacionalmente sensíveis. Estes anticorpos reconhecem epítopos específicos em uma ampla variedade de antígenos de proteína amilóide. Os anticorpos são úteis para intervenção diagnóstica e terapêutica em doenças e doenças e desordens que são causadas por ou associadas com proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e desordens associadas com proteína amilóide ou tipo amilóide tal como a proteína Aβ envolvida em mal de Alzheimer.

[0332] ● Anticorpos são administrados a indivíduos para os imunizar passivamente contra uma variedade de doenças ou desordens, incluindo mas não limitado a, doenças associadas com proteína amilóide tal como mal de Alzheimer.

[0333] ● Os anticorpos fornecidos neste lugar são anticorpos monoclonais ou policlonais tendo especificidade de ligação para peptídeos antigênicos representativos de várias desordens que são associadas com proteína amilóide tal como, por exemplo, mal de Alzheimer.

[0334] ● Os anticorpos de acordo com a invenção são preparados imunizando um animal, tal como um camundongo, rato, coelho ou qualquer outra espécie animal que pode produzir anticorpos nativos ou humanos, com uma composição de construção antigênica supramolecular.

[0335] As construções antigênicas supramoleculares como descrito neste lugar geralmente compreendem peptídeos modificados para estimular efeito antigênico caracterizado pelo fato de que tais peptídeos são modificados através de peguilação (usando polietilenoglicol ou polietilenoglicol modificado), ou modificados através de outros métodos tal como por ácido palmítico, poliaminoácidos (eg poli-glicina, poli-histidina), polissacarídeos (eg ácido poligalacturônico, ácido poliláctico, poliglicolídeo, quitina, quitosana), polímeros sintéticos (poliamidas, poliuretanos, poliésteres) ou co-polímeros (eg. poli(ácido metacrílico) e N-(2-hidroxi) propil metacrilamida) e os semelhantes.

[0336] ● Modificação por ácido palmítico (palmitoilação), embora fornecendo uma âncora para o peptídeo na bicamada de lipossomo, devido ao comprimento relativo reduzido das unidades de ácido graxo C16:0 faz com que o peptídeo praticamente se projete na superfície de lipossomo. Portanto, as células processando o antígeno terão que absorver o lipossomo inteiro com o peptídeo, o que, na maioria dos casos, resulta em uma resposta imune mais lenta em termos relativos.

[0337] ● Em uma forma de realização da invenção, um peptídeo 1-15 amilóide modificado é usado na preparação de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção. O peptídeo 1-15 amilóide modificado pode ser sintetizado seguindo o método relatado em Nicolau et. al. 2002. A abordagem relatada em Nicolau et al envolve modificar o peptídeo antigênico por um enxerto em resina de uma unidade lipofílica ou hidrofóbica, aos resíduos de aminoácidos terminais de um peptídeo pré-formado resultando em um produto de pureza consideravelmente alta. Em particular, um aminoácido protegido, particularmente um aminoácido protegido Fmoc, é acoplado a uma resina usando química de acoplamento conhecida. O grupo protetor é removido e um segundo resíduo de aminoácido protegido acoplado. Síntese de peptídeo automatizada padrão usando química de proteção conhecida, particularmente química de Fmoc/tBu, e grupos protetores de cadeia lateral padrão são então usados para sintetizar o peptídeo antigênico Aβ1-15 acoplando em aminoácidos 1 a 15 de proteína amilóide Aβ1-42 para produzir o fragmento de peptídeo com uma sequência dada em SEQ ID NO: 1. Em uma etapa final dois aminoácidos protegidos adicionais são acoplados ao fragmento de peptídeo em crescimento. Os grupos MU podem ser então seletivamente clivados e acoplados a ácido palmítico. Depois de lavar a resina, o grupo protetor é removido e a resina simultaneamente clivada, seguido por desproteções de cadeia lateral usando metodologia padrão. O produto final pode ser então obtido em alta pureza e sua identidade confirmada por métodos conhecidos na arte tal como, por exemplo, espectrometria de massa por eletropulverização.

[0338] ● A unidade lipofílica ou hidrofóbica de acordo com a presente invenção pode ser um ácido graxo, um triglicerídeo ou um fosfolipídio caracterizado pelo fato de que o esqueleto de carbono de ácido graxo tem pelo menos 10 átomos de carbono. Particularmente, a unidade lipofílica ou hidrofóbica é um ácido graxo com um esqueleto de carbono de pelo menos aproximadamente 14 átomos de carbono e até aproximadamente 24 átomos de carbono, com cada número individual de átomo de carbono caindo dentro deste intervalo também sendo parte da presente invenção. Mais particularmente, a unidade lipofílica ou hidrofóbica tem um esqueleto de carbono de pelo menos 14 átomos de carbono. Exemplos de unidades hidrofóbicas incluem, mas não são limitados a, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido oléico, ácido linoleico, ácido linolênico e colesterol ou DSPE. Em uma forma de realização específica da presente invenção a unidade lipofílica ou hidrofóbica é ácido palmítico.

[0339] ● Para estimular a resposta imune, outra âncora/espaçador pode ser adequadamente aplicada para reconstituir o peptídeo no lipossomo, e.g. polietilenoglicol (PEG).

[0340] ● PEG é covalentemente acoplado a um resíduo de aminoácido ligado em ambos os términos do peptídeo, em particular resíduo de aminoácido Glu, Cys ou Lys ou qualquer outro resíduo de aminoácido que pode ser adequadamente usado para ligar covalentemente PEG ao peptídeo. Na outra extremidade da cadeia uma unidade hidrofóbica pode ser covalentemente ligada para funcionar como o elemento de ancoragem na bicamada de lipossomo tal como, por exemplo, fosfatidil etanol amina (PEA). Assim, o lipossomo ainda funciona como um adjuvante e o peptídeo sendo suficientemente distante da bicamada pode ser processado sozinho e assim aumenta sua imunogenicidade se comparado com o antígeno palmotoilado.

[0341] ● Em certas formas de realização, as construções antigênicas supramoleculares usadas dentro do escopo da presente invenção compreendem uma sequência de peptídeo, covalentemente acoplado a lisina peguilada- uma em cada término. O comprimento da cadeia de PEG (polietilenoglicol) pode variar de n = 8 a n = 150.000 ou mais, particularmente de n = 10 a n = 80.000, mais particularmente de n = 20 a n = 10.000. Em uma forma de realização específica da invenção o comprimento da cadeia de PEG não é mais do que n = 45, particularmente entre n = 5 e n = 40, mais particularmente entre n = 10 e n = 30, e ainda mais particularmente n = 10.

[0342] ● As construções supramoleculares descritas neste lugar podem ser sintetizadas usando síntese de peptídeo automatizada e química de proteção conhecida, particularmente química de Fmoc/tBu r grupos protetores de cadeia lateral padrão. Tipicamente, peguilação de peptídeos resulta em misturas de regioisômeros.

[0343] Para atingir um acoplamento sítio específico de um conjugado de PEG-lipídio a ambos os términos C e N de Aβ peptídeos parcialmente protegidos podem ser usados. Para estas sequências de peptídeos contendo resíduos Lys ou His internos uma Lys(ivDde) ortogonalmente protegida é adicionada a cada término. Uma Gly adicional pode ser adicionada à extremidade C-terminal para facilitar síntese. O grupo protetor é removido e N-acetilado usando anidrido acético seguido por clivagem seletiva dos grupos ivDde.

[0344] Deve ser favorecida uma resina, particularmente uma resina de 2-clorotritil, que é sensível a ácido e assim possibilita o isolamento de peptídeos protegidos.

[0345] Em uma forma de realização específica da invenção, a reação de acoplamento é realizada na fase de solução. Clivagem seletiva da resina em condições brandas então libera os peptídeos protegidos internamente.

[0346] Acoplamentos de fase de solução foram atingidos com sucesso com os peptídeos derivados de uma sequência de proteína β-amilóide tal como, por exemplo, um Aβ1-16 (SEQ ID NO: 2) para uma molécula de PEG modificada por um ácido graxo - fosfatidilcolina tal como, por exemplo, DSPE. Separação dos produtos mono- e di-acoplados antes de desproteções finais de cadeia lateral pode ser atingida usando cromatografia de troca catiônica. Subsequentes desproteções de cadeia lateral de peptídeo levam ao isolamento dos conjugados desejados com uma pureza aceitável. Purificação pode ser atingida por métodos bem conhecidos na arte tal como, por exemplo, HPLC. etc.

[0347] Esta abordagem para a síntese de antígenos β-amilóides de lipídio-PEG N-e C-terminal usando peptídeos protegidos é aplicável a uma ampla variedade de sequências de peptídeos.

[0348] Antígenos lipossômicos de acordo com a invenção podem então ser preparados como descrito em Nicolau et al., 2002. O peptídeo antigênico Aβ amilóide modificado, particularmente o peptídeo antigênico Aβ1-15, Aβ1-16, Aβ1-16(Δ14), Aβ 22-35 e Aβ29-40 modificado por PEG e palmitoilado pode ser reconstituído em uma construção consistindo de lipossomos, particularmente lipossomos feitos de dimiristoil fosfatidil colina (DMPC), dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPEA), dimiristoil fosfatidil glicerol (DMPG) e colesterol, opcionalmente contendo monofosforil lipídio A.

[0349] ● Em uma forma de realização específica da invenção lipossomos com lipídio A são usados como adjuvantes para preparar a vacina anti-amilóide. Dimiristoilfosfatidil-colina, glicerol e colesterol são misturados, particularmente em uma proporção molar de 0,9:1,0:0,7. Um forte imunomodulador tal como, por exemplo, monofosforil lipídio A é então adicionado em uma concentração adequada, particularmente em uma concentração de entre 30 e 50 mg por mmol, mais particularmente a 40 mg por mmol de fosfolipídios. O peptídeo Aβ antigênico modificado é então adicionado em uma proporção molar de peptídeos para fosfolipídios de entre 1:30 e 1:200, particularmente em uma proporção molar de entre 1:50 e 1:120, mais particularmente de 1:100. Solventes são removidos, por exemplo através de evaporação, e o filme resultante hidratado com solução tampão estéril tal como, por exemplo PBS.

[0350] ● Lipossomos também podem ser preparados pela técnica de injeção por fluxo cruzado como descrito, por exemplo, em Wagner et al (2002) Journal of Liposome Research Vol 12(3), pp 259 - 270. Durante a injeção de soluções de lipídios em um sistema de tampão aquoso, lipídios tendem a formar "precipitados", seguido por auto-organização em vesículas. O tamanho de vesícula obtido depende de fatores tal como concentração de lipídios, taxa de agitação, taxa de injeção, e a escolha de lipídios. O sistema de preparação pode consistir de um módulo de injeção por fluxo cruzado, recipientes para a fase polar (e.g. uma solução tampão de PBS), um recipiente de solução de etanol/lipídio e um dispositivo de pressão, mas particularmente um dispositivo de pressão de nitrogênio. Enquanto a solução aquosa ou polar é bombeada através do módulo de injeção por fluxo cruzado a solução de etanol/lipídio é injetada na fase polar com pressões variadas aplicadas.

[0351] ● O lipossomo ainda funciona como um adjuvante e o peptídeo sendo suficientemente distante da bicamada pode ser processado sozinho e assim aumenta sua imunogenicidade se comparado com o antígeno palmotoilado.

[0352] ● O término livre de PEG é covalentemente acoplado a uma molécula de fosfatidiletanolamina (onde o ácido graxo pode ser: mirístico, palmítico, esteárico, oléico etc. ou uma combinação destes) para funcionar como o elemento de ancoragem. Esta estrutura supramolecular pode ser ancorada por reconstituição em lipossomos consistindo de fosfolipídios e colesterol (fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, colesterol) em proporções molares variadas. Outros fosfolipídios podem ser usados. Lipídio A é usado em uma concentração de aproximadamente 40 pg/pmole de fosfolipídios.

[0353] Em certas formas de realização, as construções antigênicas supramoleculares palmitoiladas ou peguiladas compreendem um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos de β-amilóide. Os peptídeos também podem compreender ou corresponder a peptídeo beta amilóide inteiro e fragmentos ativos destes. Adicionalmente, peptídeos úteis para a presente invenção compreendem adicionalmente Aβ1-16 (SEQ ID NO: 2); Aβ1-16(Δ14); (SEQ ID NO: 3); Aβ1-15 (SEQ ID NO: 1); e fragmentos ativos destes.

[0354] ● Para produzir e preparar anticorpos e para determinar imunogenicidade da construção antigênica Aβ modificada um animal adequado selecionado a partir do grupo consistindo de camundongos, ratos, coelhos, porcos, pássaros, etc, mas particularmente camundongos, especialmente camundongos C57BU6 são imunizados com o peptídeo antigênico. Imunogenicidade da construção antigênica é determinada sondando amostras de soros em intervalos de tempo adequados depois de imunização usando um imunoensaio tal como, por exemplo, um ensaio ELISA.

[0355] ● Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser preparados usando técnicas clássicas de clonagem e fusão celular bem conhecidas na arte. O imunogene (antígeno) de interesse, tipicamente é administrado (e.g. injeção intraperitoneal) a camundongos tipo selvagem ou da mesma raça (e.g. camundongos BALB/c ou especialmente C57BL/6), ratos, coelhos ou outras espécies animais ou camundongos transgênicos que podem produzir anticorpos nativos ou humanos. O imunogene pode ser administrado sozinho, ou misturado com adjuvante, ou expresso a partir de um vetor (vetor de replicon VEE, vacínia), ou como DNA, ou como uma proteína de fusão para induzir uma resposta imune. Proteínas de fusão compreendem o peptídeo contra o qual uma resposta imune é desejada acoplado a proteínas carreadoras, tal como, por exemplo, beta.-galactosidase, glutationa Stransferase, hemocianina de caramujo Megathura crenulata (KLH), e albumina de soro bovino. Nestes casos, os peptídeos servem como haptenos com as proteínas carreadoras. Depois do animal ter sido estimulado, por exemplo, duas ou mais vezes, células de baço são coletadas dos animais imunizados e hibridomas gerados fundindo células de baço sensibilizadas com uma linhagem celular de mieloma, tal como células de mieloma SP2/0 murino (ATCC, Manassas, VA) usando os processos bem conhecidos de Kohler and Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) e Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988)).

[0356] ● Em uma forma de realização específica da invenção a construção antigênica de acordo com a invenção, particularmente uma composição de vacina compreendendo dita construção antigênica em uma forma farmaceuticamente aceitável, é administrada em doses repetidas, em particular em 1 a 15 doses, mais particularmente em 2 a 10 doses, ainda mais particularmente em 3 a 7 doses mas especialmente em 4 a 6 doses, em intervalos de tempo de entre 1 e 10 semanas, particularmente em intervalos de tempo de entre 1 e 6 semanas, mais particularmente em intervalos de tempo de entre 1 e 4 semanas, e ainda mais particularmente em intervalos de tempo de entre 2 e 3 semanas. A resposta imune é monitorada tirando amostras de soros em um momento adequado depois de estimulação, particularmente 3 a 10 dias depois de estimulação, mais particularmente 4 a 8 dias depois de estimulação e mais particularmente 5 a 6 dias depois de estimulação e determinando a imunogenicidade da construção antigênica usando metodologia conhecida, particularmente um dos imunoensaios comumente usados tal como, por exemplo, um ensaio ELISA.

[0357] ● Imunização com a construção antigênica de acordo com a invenção, mas particularmente com uma composição de vacina compreendendo a construção antigênica de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável leva a uma resposta imune significante no animal tratado. Animais, mas especialmente camundongos com títulos terapêuticos são selecionados para uma fusão de células produtoras de anticorpo, particularmente linfócitos B com uma linhagem celular de crescimento contínuo ou imortal, tal como uma linhagem celular de mieloma. As células são induzidas a se fundir pela adição de polietilenoglicol. Títulos terapêuticos são aqueles que dão um resultado positivo em um ensaio ELISA em uma diluição de entre 1:4000 e 1:6000, particularmente de entre 1:4500 e 1:5500, mais particularmente de 1:5000.

[0358] ● As células híbridas resultantes são então clonadas da maneira convencional, e.g. usando diluição limitante, e os clones resultantes, que produzem os anticorpos monoclonais desejados, cultivados.

[0359] ● Os hibridomas assim obtidos são quimicamente selecionados emplacando as células em um meio de seleção contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT).

[0360] ● Hibridomas são subsequentemente triados para a capacidade de produzir anticorpos monoclonais contra doenças ou desordens associadas a amilóide específico. Hibridomas produzindo anticorpos de interesse são clonados, expandidos e armazenados congelados para produção futura. O hibridoma preferido produz um anticorpo monoclonal tendo o isotipo IgG, mais preferivelmente o isotipo IgG2.

[0361] O anticorpo policlonal é preparado imunizando animais, tal como camundongos ou coelhos, ou qualquer outro animal adequado com construção antigênica supramolecular da presente invenção descrita acima. Soro sanguíneo é subsequentemente coletado dos animais, e anticorpos no soro triados para reatividade de ligação contra o antígeno amilóide.

[0362] ● Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser preparados em uma formulação fisiologicamente aceitável e podem compreender um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável usando técnicas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, em particular, o anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes é combinado com um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição terapêutica. Carreadores, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, soluções de salina tamponada com fosfato, água, emulsões tal como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc.

[0363] ● Formulação da composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser realizada de acordo com metodologia padrão conhecida por aqueles versados na arte.

[0364] ● As composições da presente invenção podem ser administradas a um sujeito na forma de um sólido, líquido ou aerosol em uma dose farmaceuticamente efetiva adequada. Exemplos de composições sólidas incluem pílulas, cremes e unidades de dosagem implantáveis. Pílulas podem ser administradas oralmente. Cremes terapêuticos podem ser administrados topicamente. Unidades de dosagem implantáveis podem ser administradas localmente, por exemplo, em um sítio de tumor, ou podem ser implantadas para liberação sistemática da composição terapêutica, por exemplo, subcutaneamente. Exemplos de composições líquidas incluem formulações adaptadas para injeção intramuscularmente, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente, e formulações para administração tópica e intraocular. Exemplos de formulações de aerosol incluem formulações inaladoras para administração aos pulmões.

[0365] ● As composições podem ser administradas por vias de administração padrão. Em geral, a composição pode ser administrada por via tópica, oral, retal, nasal, interdérmica, intraperitoneal, ou parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, ou intramuscular). Em adição, a composição pode ser incorporada em matrizes de liberação a longo prazo tal como polímeros biodegradáveis, os polímeros sendo implantados na vizinhança de onde liberação é desejada, por exemplo, no sítio de um tumor. O método inclui administração de uma única dose, administração de doses repetidas em intervalos de tempo pré-determinados, e administração sustentada por um período de tempo pré-determinado.

[0366] ● Uma matriz de liberação a longo prazo, como usado neste lugar, é uma matriz feita de materiais, normalmente polímeros que são degradáveis por hidrólise enzimática ou de ácido/base ou por dissolução. Uma vez inserida no corpo, a matriz é influenciada por enzimas e fluidos corporais. A matriz de liberação a longo prazo de forma desejável é escolhida por materiais biocompatíveis tal como lipossomos, polilactídeos (ácido polilactídeo), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co-glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), polianidridos, poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídios, polissacarídeos, ácidos nucléicos, poliaminoácidos, aminoácidos tal como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona e silicone. Uma matriz biodegradável preferida é uma matriz de um de qualquer um de polilactídeo, poliglicolídeo, ou polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico).

[0367] ● É bem conhecido por aqueles versados na arte pertinente que a dosagem da composição irá depender de vários fatores tal como, por exemplo, a condição sendo tratada, a composição particular usada, e outros fatores clínicos tal como peso, tamanho, sexo e condição geral de saúde do paciente, área de superfície corporal, o composto ou composição particular a ser administrada, outras drogas sendo administradas concorrentemente, e a via de administração.

[0368] ● A composição pode ser administrada em combinação com outras composições compreendendo uma substância ou composto biologicamente ativo, particularmente pelo menos um composto selecionado a partir do grupo consistindo de compostos contra estresse oxidativo, compostos anti-apoptóticos, quelantes de metal, inibidores de reparo de DNA tal como pirenzepina e metabólitos, 3-amino-1-ácido propanosulfônico (3APS), 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), ativadores de secretase, inibidores de β- e y -secretase, proteínas tau, neurotransmissor, degradadores de folha-β, moléculas antiinflamatórias, "antipsicóticos atípicos" tal como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina ou inibidores de colinesterase (ChEls) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou galantamina e outras drogas e suplementos nutritivos tal como, por exemplo, vitamina B12, cisteína, um precursor de acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo biloba, acetil-L-carnitina, idebenona, propentofilina, ou um derivado de xantina, junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável e procedimentos para o tratamento de doenças.

[0369] ● Matéria proteinácea farmaceuticamente ativa pode estar presente em quantidades entre 1 ng e 10 mg por dose. Geralmente, o regime de administração deve ser no intervalo de entre 0,1 μg e 10 mg do anticorpo de acordo com a invenção , particularmente em um intervalo de 1,0 μg a 1,0 mg, e mais particularmente em um intervalo de entre 1,0 μg e 100 μg, com todos os números individuais caindo dentro destes intervalos também sendo parte da invenção. Se a administração ocorre através de infusão contínua uma dosagem mais apropriada pode ser no intervalo de entre 0,01 μg e 10 mg unidades por quilograma de peso corporal por hora com todos os números individuais caindo dentro destes intervalos também sendo parte da invenção.

[0370] ● Administração será geralmente parenteralmente, eg intravenosamente. Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas e não aquosas estéreis. Solventes não aquosos incluem sem ser limitado a, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tal como etil oleato. Solventes aquosos podem ser escolhidos a partir do grupo consistindo de água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado, ou óleos fixados. Veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutriente, repositores eletrolíticos (tal como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e outros. Conservantes também podem estar presentes tal como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc.

[0371] ● A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente carreadores proteináceos tal como, por exemplo, albumina de soro ou imunoglobulina, particularmente de origem humana. Agentes biologicamente ativos adicionais podem estar presentes na composição farmacêutica da invenção dependente de seu uso pretendido.

[0372] ● Em uma forma de realização adicional a presente invenção fornece métodos e kits para a detecção e diagnose de doenças ou condições associadas a amilóide, para diagnosticar uma predisposição para uma doença ou condição associada a amilóide ou para monitorar doença residual mínima em um paciente ou para prever responsividade de um paciente a um tratamento com um anticorpo ou uma composição de vacina de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes. Estes métodos incluem métodos imunológicos conhecidos comumente usados para detectar ou quantificar substâncias em amostras biológicas ou em uma condição in situ.

[0373] ● Diagnose de uma doença ou condição associada a amilóide ou de uma pré-disposição a uma doença ou condição associada a amilóide em um paciente pode ser atingida detectando a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína amilóide em uma amostra ou in situ, o que inclui colocar a amostra ou uma parte corporal específica ou área corporal suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína amilóide, permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico, detectar a formação do complexo imunológico e correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra ou parte ou área corporal específica, opcionalmente comparando a quantidade de dito complexo imunológico com um valor de controle normal, caracterizado pelo fato de que um aumento na quantidade de dito agregado comparado com um valor de controle normal indica que dito paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma doença ou condição associada a amilóide.

[0374] ● Monitoramento de doença residual mínima em um paciente seguindo tratamento com um anticorpo ou uma composição de vacina de acordo com a invenção pode ser atingido detectando a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína amilóide em uma amostra ou in situ, o que inclui colocar a amostra ou uma parte corporal específica ou área corporal suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína amilóide, permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico, detectar a formação do complexo imunológico e correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra ou parte ou área corporal específica, opcionalmente comparando a quantidade de dito complexo imunológico com um valor de controle normal, caracterizado pelo fato de que um aumento na quantidade de dito agregado comparado com um valor de controle normal indica que dito paciente pode ainda sofrer de uma doença residual mínima.

[0375] Previsão de responsividade de um paciente a um tratamento com uma composição de vacina de acordo com a invenção pode ser atingida detectando a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína amilóide em uma amostra ou in situ, o que inclui colocar a amostra ou uma parte corporal específica ou área corporal suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína amilóide, permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico, detectar a formação do complexo imunológico e correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra ou parte ou área corporal específica, opcionalmente comparando a quantidade de dito complexo imunológico antes e depois de início do tratamento, caracterizado pelo fato de que uma diminuição na quantidade de dito agregado indica que dito paciente tem um alto potencial de ser responsivo ao tratamento.

[0376] Amostras biológicas que podem ser usadas na diagnose de uma doença ou condição associada a amilóide, para diagnosticar uma predisposição para uma doença ou condição associada a amilóide ou para monitorar doença residual mínima em um paciente ou para prever responsividade de um paciente a um tratamento com um anticorpo ou uma composição de vacina de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes são, por exemplo, fluidos tal como soro, plasma, saliva, secreções gástricas, muco, fluido cerebroespinhal, fluido linfático e os semelhantes ou amostras de tecido ou célula obtida de um organismo tal como tecido neural, cerebral, cardíaco ou vascular. Para determinar a presença ou ausência do antígeno amilóide em uma amostra qualquer imunoensaio conhecido por aqueles de habitual verso na arte (Veja Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612)) pode ser usado tal como, por exemplo, ensaios que utilizam métodos de detecção indireta usando reagentes secundários para detecção, ELISA's e ensaios de imunoprecipitação e aglutinação. Uma descrição detalhada destes ensaios é, por exemplo, dada em W096/13590 a Maertens and Stuyver, Zrein et al. (1998) e W096/29605.

[0377] Para diagnose in situ, o anticorpo de qualquer parte ativa e funcional deste pode ser administrado ao organismo a ser diagnosticado por métodos conhecidos na arte tal como, por exemplo, injeção intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial de forma que uma ligação específica entre o anticorpo de acordo com a invenção com uma região epitópica no antígeno amilóide pode ocorrer. O complexo anticorpo/antígeno pode ser detectado através de uma marca acoplada ao anticorpo ou um fragmento funcional deste.

[0378] ● Os imunoensaios usados em aplicações diagnósticas ou em aplicações para diagnosticar uma predisposição para uma doença ou condição associada a amilóide ou para monitorar doença residual mínima em um paciente ou para prever responsividade de um paciente a um tratamento com um anticorpo ou uma composição de vacina de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes. Tipicamente recorrem a antígenos marcados, anticorpos, ou reagentes secundários para detecção. Estas proteínas ou reagentes podem ser marcados com compostos geralmente conhecidos por aqueles versados na arte incluindo enzimas, radioisótopos, e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas incluindo partículas coloridas, tal como ouro coloidal e microesferas de látex. Destes, marcação radioativa pode ser usada para praticamente todos os tipos de ensaios e com mais variações. Marcadores conjugados a enzimas são particularmente úteis quando radioatividade precisa ser evitada ou quando resultados rápidos são necessários. Fluorocromos, embora requerendo equipamento caro para seu uso, fornecem um método muito sensível de detecção. Anticorpos úteis nestes ensaios incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e anticorpos policlonais purificados por afinidade.

[0379] ● Alternativamente, o anticorpo pode ser marcado indiretamente por reação com substâncias marcadas que têm uma afinidade para imunoglobulina, tal como proteína A ou G ou anticorpos secundários. O anticorpo pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada tendo uma afinidade para a segunda substância conjugada ao anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a biotina e o conjugado de anticorpo-biotina detectado usando avidina ou estreptavidina marcada. Similarmente, o anticorpo pode ser conjugado a um hapteno e o conjugado de anticorpo-hapteno detectado usando anticorpo anti-hapteno marcado.

[0380] ● Aqueles de habitual verso na arte saberão destas e outros marcadores adequados que podem ser empregados em conformidade com a presente invenção. A ligação destes marcadores a anticorpos ou fragmentos destes pode ser realizada usando técnicas padrão comumente conhecidas por aqueles de habitual verso na arte. Técnicas típicas são descritas por Kennedy, J. H., et al.,1976 (Clin. Chim. Acta 70:131), e Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 81:1-40). Técnicas de acoplamento mencionadas no último são o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida, e outros, todos os quais são incorporados por referência neste lugar.

[0381] ● Imunoensaios atuais utilizam um método com dois anticorpos para detectar a presença de um analito, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado indiretamente por reatividade com um segundo anticorpo que foi marcado com um marcador detectável. O segundo anticorpo preferivelmente é um que se liga a anticorpos do animal do qual o anticorpo monoclonal é derivado. Em outras palavras, se o anticorpo monoclonal é um anticorpo de camundongo, então o segundo anticorpo marcado é um anticorpo anti-camundongo. Para o anticorpo monoclonal a ser usado no ensaio descrito abaixo, este marcador preferivelmente é uma microesfera revestida com anticorpo, particularmente uma microesfera magnética. Para o anticorpo policlonal a ser empregado no imunoensaio descrito neste lugar, o marcador preferivelmente é uma molécula detectável tal como uma substância radioativa, fluorescente ou uma eletroquimioluminescente.

[0382] Um sistema de anticorpo duplo alternativo, frequentemente referido como sistemas de formatos rápidos porque eles são adaptados a determinações rápidas da presença de um analito, também pode ser empregado dentro do escopo da presente invenção. O sistema requer alta afinidade entre o anticorpo e o analito. De acordo com uma forma de realização da presente invenção, a presença do antígeno amilóide é determinada usando um par de anticorpos, cada específico para antígeno amilóide. Um de ditos pares de anticorpos é referido neste lugar como um "anticorpo detector" e o outro de dito par de anticorpos é referido neste lugar como um "anticorpo de captura". O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser usado ou como um anticorpo de captura ou um anticorpo detector. O anticorpo monoclonal da presente invenção também pode ser usado tanto como anticorpo de captura como detector, juntos em um ensaio único. Uma forma de realização da presente invenção assim usa o método de sanduíche de anticorpo duplo para detectar antígeno amilóide em uma amostra de fluido biológico. Neste método, o analito (antígeno amilóide) é colocado entre o anticorpo detector e o anticorpo de captura, o anticorpo de captura sendo irreversivelmente imobilizado em um suporte sólido. O anticorpo detector pode conter um marcador detectável, a fim de identificar a presença do sanduíche anticorpo-analito e assim a presença do analito.

[0383] Substâncias de fase sólida exemplares incluem, mas não são limitadas a, placas de microtítulo, tubos de teste de poliestireno, microesferas magnéticas, plásticas ou de vidro e lâminas que são bem conhecidas no campo de radioimunoensaio e imunoensaio enzimático. Métodos para acoplar anticorpos a fases sólidas também são bem conhecidos por aqueles versados na arte. Mais recentemente, diversos materiais porosos tal como náilon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos foram empregados como suportes sólidos.

[0384] ● A presente invenção também se refere a um kit diagnóstico para detectar antígeno amilóide em uma amostra biológica compreendendo uma composição como definido acima. Além disso, a presente invenção se refere ao último kit diagnóstico que, em adição a uma composição como definido acima, também compreende um reagente de detecção como definido acima. O termo "kit diagnóstico" se refere em geral a qualquer kit diagnóstico conhecido na arte. Mais especificamente, o último termo se refere a um kit diagnóstico como descrito em Zrein et al. (1998).

[0385] ● É ainda um outro objetivo da presente invenção fornecer novas imunossondas e kits de teste para detecção e diagnose de doenças e condições associadas a amilóide compreendendo anticorpos de acordo com a presente invenção. Para imunossondas, os anticorpos são diretamente ou indiretamente acoplados a uma molécula repórter adequada, e.g., uma enzima ou um radionuclídeo. O kit de teste inclui um recipiente retendo um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e instruções para usar os anticorpos para o propósito de ligar um antígeno amilóide para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico de forma que presença ou ausência do complexo imunológico se correlaciona com presença ou ausência de antígeno amilóide.

EXEMPLOS

[0386] Antígenos usados para produzir Anticorpos monoclonais de camundongo

EXEMPLO 1: Métodos para Fazer Construções Antigênicas Supramoleculares Αβ1-15 Palmitoiladas Síntese de antígeno de peptídeo Aβ1-15 tetra(palmitoil lisina)

[0387] O peptídeo 1-15 amilóide palmitoilado foi sintetizado seguindo um método previamente relatado melhorado (Nicolau et. al. 2002). Esta nova abordagem envolveu enxertamento em resina de ácido palmítico aos resíduos Lys terminais do peptídeo pré-formado ao invés de síntese de fase sólida passo a passo incorporando o aminoácido modificado 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc)-Lys(Pal)-OH. Esta nova abordagem melhora eficiência de acoplamento e gera um produto de pureza consideravelmente maior. Assim, o aminoácido ortogonalmente protegido Fmoc-Lys(Mtt)-OH foi acoplado a uma resina Wang usando química de acoplamento de [2-(1 Hbenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato] (HBTU). O grupo Fmoc foi removido usando 20% de piperidina em DMF e um segundo resíduo de Fmoc-Lys(Mtt)-OH foi acoplado. Síntese de peptídeo automatizada padrão usando química de Fmoc/tBu e grupos protetores de cadeia lateral padrão foi então usada para acoplar nos próximos 15 aminoácidos para produzir uma sequência de peptídeo como dado em SEQ ID NOs: 1. Finalmente, os últimos dois aminoácidos acoplados foram Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Os grupos Mtt foram então seletivamente clivados usando 1% ácido trifluoracético (TFA) em diclorometano para liberar um fragmento de peptídeo e então acoplados a ácido palmítico usando HBTU. Depois de lavagem de resina, o grupo Fmoc foi removido com 20% de piperidina em dimetilformamida (DMF) e finalmente clivagem de resina e desproteções de cadeia lateral simultâneas foram realizadas usando TFA em condições padrão. Trituração a partir de dietil éter frio gerou o produto como um sólido branco. Espectrometria de massa por eletropulverização confirmou a identidade do produto (m/z esperado: 1097,9 ([M]3+); encontrado: 1096,8 ([M-3H]3+), com nenhum outro peptídeo tri-, di- ou mono-palmitoilado detectado.

EXEMPLO 2: Métodos para Fazer Construções Antigênicas Supramoleculares Síntese de antígeno de peptídeo β-amilóide peguilado

[0388] Para estimular a resposta imune, uma outra âncora/espaçador foi aplicada para reconstituir o peptídeo no lipossomo, e.g. polietilenoglicol (PEG). PEG foi covalentemente acoplado ao resíduo de lisina ligado em ambos os términos do peptídeo. Na outra extremidade da cadeia (PEGn=70) fosfatidil etanol amina (PEA) foi covalentemente ligada para funcionar como o elemento de ancoragem na bicamada de lipossomo. Assim, o lipossomo ainda funciona como um adjuvante e o peptídeo sendo suficientemente distante da bicamada pode ser processado sozinho e assim aumenta sua imunogenicidade se comparado com o antígeno palmotoilado.

[0389] ● As construções supramoleculares descritas neste lugar foram sintetizadas singularmente usando proteções de cadeia lateral de aminoácido Fmoc/tBu padrão. Tipicamente, peguilação de peptídeos resulta em misturas de regioisômeros. Neste lugar um método conveniente para o acoplamento sítio específico de um conjugado de PEG-lipídio a ambos os términos C- e N- de Aβ é demonstrado usando parcialmente peptídeos protegidos.

[0390] ● Para aquelas sequências de peptídeos contendo resíduos Lys ou His internos (1-16, 1-16Δ4, 22-35), uma Lys(ivDde) ortogonalmente protegida foi adicionada a cada término. Uma Gly adicional foi adicionada ao C-terminal para facilitar síntese. O grupo Fmoc foi removido com 20 % de piperidina em DMF e N-acetilado usando anidrido acético. Clivagem seletiva dos grupos ivDde foi atingida com 3 % de hidrato de hidrazina em DMF por uma hora. A resina de 2-clorotritil foi favorecida sobre a resina Wang mais amplamente usada uma vez que a anterior provou ser muito mais resistente e hidrazinólise. Além disso, a resina de 2-clorotritil é extremamente sensível a ácido e assim, ao contrário da resina Wang, possibilita o isolamento de peptídeos protegidos. De fato, foi necessário realizar a reação de acoplamento na fase de solução pois acoplamento do peptídeo ligado à resina ao reagente de lipídio peguilado pré-ativado DSPE-PEG-SPA não gerou qualquer produto de acoplamento. Assim clivagem seletiva da resina em condições brandas (ácido acético / trifluoroetanol / diclorometano, 1:1:8, 1 h, rt) gerou os peptídeos protegidos internamente.

[0391] ● Acoplamentos de fase de solução foram atingidos com sucesso com os peptídeos derivados de sequência Aβ1-16 (SEQ ID NO: 2) a DSPE-PEG-SPA em DMSO e base em excesso. As reações foram então dissipadas pela adição de etanolamina em excesso por 2 h e a solução liofilizada.

[0392] Para a sequência 29-40, nenhuma estratégia de proteção especial é requerida.

[0393] ● Purificação por HPLC (coluna C4 de fase reversa semipreparativa) gerou entre 5070% de pureza dos conjugados de PEG-lipídio N e C terminais cujas identidades foram confirmadas por MALDI (ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz). Cada sequência mostrou variação considerável na facilidade da reação de acoplamento e condições foram ajustadas por conseguinte (temperatura, número de equivalentes molares DSPE-PEG-SPA, tempo). Para a separação de DSPE-PEG-SPA em excesso do produto desejado purificação por HPLC é aplicada. Separação dos produtos mono- e di-acoplados antes de desproteções finais de cadeia lateral pode ser atingida usando cromatografia de troca catiônica. Subsequentes desproteções de cadeia lateral de peptídeo e separação do DSPE-PEG-SPA dissipado em excesso levaram ao isolamento dos conjugados desejados com uma pureza aceitável.

[0394] Esta abordagem para a síntese de antígenos β-amilóides com lipídio-PEG N- e C-terminais usando peptídeos protegidos é aplicável a uma ampla variedade de sequências de peptídeos.

EXEMPLO 3: Anticorpos Obtidos por Construções Antigênicas Supramoleculares 3.1 Fabricação de mAbs produzidos contra Construção Antigênica Supramolecular Aβ 1-15 Palmitoilada :

[0395] ● Antígeno palmitoilado (ACI-24, Aβ1-15) foi usado para a imunização em camundongos C57BU6 em intervalos de 2 semanas. 10-12 animais foram imunizados com cada antígeno (vol de injeção: 200μ1 contendo 8 nmoles de peptídeo). Última injeção foi realizada 4 dias antes de sacrifício dos animais. Depois 5 camundongos estimulados com títulos terapêuticos (quando uma diluição 1:5.000 dos soros foi positiva em ELISA) foram selecionados para uma fusão. Células de baço são coletadas dos animais imunizados e hibridomas gerados fundindo células de baço sensibilizadas com uma linhagem celular de mieloma. A fusão dos linfócitos B dos baços dos camundongos foi conduzida com células de linhagem celular de mieloma SP2-0. (ATCC, Manassas, VA) usando os processos bem conhecidos de Kohler and Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) e Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988))

[0396] ● As células são induzidas a se fundir pela adição de polietilenoglicol. As células híbridas resultantes são então cultivadas por 10 ± 14 dias da maneira convencional para permitir crescimento clonal. Seleção clonal inicial foi feita usando diluição limitante. Clones de hibridoma produzindo IgG foram selecionados e testados para sua ligação específica para o peptídeo Aβ1-42 por ELISA e os clones resultantes, que produzem os anticorpos monoclonais desejados, cultivados.

[0397] Os hibridomas assim obtidos são quimicamente selecionados emplacando as células em um meio de seleção contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT).

[0398] ● Hibridomas são subsequentemente triados para a capacidade de produzir anticorpos monoclonais contra doenças ou desordens associadas a amilóide específico. Uma vez que o clone-mãe foi identificado, ele foi subclonado quatro vezes para assegurar monoclonalidade e permitir que o híbrido se estabilize.

[0399] Hibridomas produzindo anticorpos de interesse são clonados, expandidos e armazenados congelados para produção futura.

[0400] ● O anticorpo foi isotipado por um kit de isotipagem monoclonal de camundongo comercialmente disponível e o clone estável foi adaptado a meio livre de soro e colocado em um biorreator para produção de anticorpo.

[0401] O hibridoma preferido produz um anticorpo monoclonal tendo o isotipo IgG, mais preferivelmente o isotipo IgG1.

3.2 Fabricação de mAbs produzidos contra Construções Antigênicas Supramoleculares Peguiladas PEG-Aβ1-16, Aβ4-11, Aβ22-35 e Aβ29-40:

[0402] Antígenos lipossômicos foram preparados como descrito (Nicolau et al., 2002, PNAS, 99, 233237). A sequências PEG-Αβ1-16, Αβ4-11, Αβ22-35 e Αβ29-40 (Figura 1) foram reconstituídas em uma construção consistindo de lipossomos feitos de dimiristoil fosfatidil colina (DMPC), dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPEA), dimiristoil fosfatidil glicerol (DMPG) e colesterol (proporções molares de 0,9: 0,1: 0,1: 0,7) contendo monofosforil lipídio A (40mg/mM de fosfolipídios). Estes antígenos e Aβ1-16 peguilado foram usados para a imunização em camundongos C57BL/6 em intervalos de 2 semanas. 10-12 animais foram imunizados com cada antígeno. Depois de 3 a 6 estímulos, camundongos com títulos terapêuticos (quando uma diluição 1:5.000 dos soros foi positiva em ELISA) foram selecionados para uma fusão. Células de baço são coletadas dos animais imunizados e hibridomas gerados fundindo células de baço sensibilizadas com uma linhagem celular de mieloma. A fusão dos linfócitos B dos baços dos camundongos foi conduzida com células de linhagem celular de mieloma SP2-0. (ATCC, Manassas, VA) usando os processos bem conhecidos de Kohler and Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)) e Harlow and Lane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988))

[0403] ● As células são induzidas a se fundir pela adição de polietilenoglicol. As células híbridas resultantes são então clonadas da maneira convencional, e.g. usando diluição limitante. Clones de hibridoma produzindo IgG foram selecionados e testados para sua ligação específica para o peptídeo Aβ1-42 por ELISA e os clones resultantes, que produzem os anticorpos monoclonais desejados, cultivados.

[0404] Os hibridomas assim obtidos são quimicamente selecionados emplacando as células em um meio de seleção contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT).

[0405] ● Hibridomas são subsequentemente triados para a capacidade de produzir anticorpos monoclonais contra doenças ou desordens associadas a amilóide específico. Hibridomas produzindo anticorpos de interesse são clonados, expandidos e armazenados congelados para produção futura. O hibridoma preferido produz um anticorpo monoclonal tendo o isotipo IgG, mais preferivelmente o isotipo IgG1.

EXEMPLO 4: Determinação de Especificidade para anticorpo mACI-24-Ab4

[0406] ● Para analisar a especificidade do anticorpo mACI-24-Ab4, diferentes concentrações de fibrilas amilóides 1-42, 1-40 e 1-38 pré-formadas foram transferidas em Membrana de Nitrocelulose Hybond ECL (Amersham Biosciences). Depois de bloquear com 10% de leite em pó e 0,7 % de Tween 20, membranas foram incubadas com anticorpo primário a 20 pg/m1 por 2h em RT. Depois de lavagem, membranas foram incubadas com anticorpo IgG anti-camundongo de ovelha conjugado a peroxidase de rábano (Amersham Biosciences) por 1 h em RT, lavadas e incubadas com solução quimioluminescente seguido pela exposição da membrana a filme de raios X.

[0407] ● Para medir ligação do mAb mACI-24-Ab4 a fibras amilóides 1-42, Αβ 1-42, fibras 1-40 e 1-38 foram pré-formadas por sete dias a 37°C e transferida na membrana. 20 μg/ml de anticorpo foi usado para medir capacidade de ligação e o anticorpo ligado foi detectado por anticorpo IgG anti-camundongo de ovelha conjugado a peroxidase de rábano por exposição de 20 minutos.

[0408] ● Como pode ser demonstrado por análise Dot Blot, o anticorpo mACI-24-Ab4 se liga a diferentes fibras Αβ pré-formadas com diferente sensibilidade. O anticorpo exibe a maior sensibilidade de ligação para fibras Αβ1-42 do que para fibras Αβ1-40 ou Αβ1-38. Ele é capaz de detectar pelo menos 0,001 μg de fibras Αβ1-42 enquanto que o limite de detecção do anticorpo para fibras Αβ1-40 é pelo menos 0,1 μg e para as fibras Αβ1-38 1 μg, significando que a sensibilidade é 100 vezes a umas 1000 vezes menor para estes tipos de fibras amilóides. Estes dados demonstram que o anticorpo ACI-24-Ab4 é pelo menos umas 100 vezes mais sensível à forma amilóide (1-42) que é conhecida por se tornar insolúvel por mudança de conformação secundária e ser principal parte de placas amilóides em cérebros de pacientes AD.

EXEMPLO 5: Ligação de anticorpo monoclonal de AC Immune mACI-01-Ab7 C2 a Espécie Amilóide em Western Blot e Dot Blot

[0409] ● Para determinar se a ligação do anticorpo de camundongo mACI-01 -Ab7 C2 é dependente da conformação nativa de Aβ uma comparação da ligação a amilóide linearizado por Western Blot ou amilóide nativo em Dot Blot foi realizada (Figuras 2a e 2b)

[0410] ● Monômeros amilóides foram gerados dissolvendo peptídeo Aβ1-42 em HFIP e o solvente evaporado sob argônio. Filme de peptídeo seco foi armazenado a -80°C até uso. Para preparação de monômeros, o filme de peptídeo foi ressuspenso em DMSO para uma concentração de 2,75μg/μ1 e diluído em PBS para 1μg/μl. Para preparação de oligômeros, filme de peptídeo seco foi ressuspenso em DMSO para 5mM, sonicado e PBS adicionado para atingir 400uM de amilóide seguido pela adição de SDS para uma concentração final de 0,2%. Depois de incubação por 6 horas a 37 °C, o amilóide foi diluído em água para uma concentração final de 100μM e incubado outras 18h a 37°C. Os oligômeros de amilóides foram precipitados com 33% de metanol congelado, 4% de solução de ácido acético por 1h a 4°C, agitados a 16200g por 10 minutos e o grânulo ressuspenso em 5mM de Na2H2PO4, 35mM de NaCl pH 7,4 para uma concentração final de 1μg/μl. Para preparação de fibras, filme de peptídeo foi diluído em 50mM de tampão Tris-HCl para gerar uma concentração de 1mg/m1 de amilóide e incubado a 37°C por 5 dias. Os tubos foram agitados a 10000g por 5 minutos e o grânulo ressuspenso em 0,1M de tampão carbonato pH 9,6 para atingir 1 μg/μl.

[0411] ● 1 ou 5μg de monômeros, oligômeros ou fibras foram diluídos em PBS e em tampão de carregamento e aplicados a uma SDS-PAGE de 12% e o gel transferido para membranas de nitrocelulose. Alternativamente, 3 ou 1μg ou 100 e 1Ong de espécie amilóide foram diluídos em PBS e foram transferidos diretamente na membrana de nitrocelulose e as membranas secas em RT por 1 hora. Depois de bloquear por 30 minutos com solução de Caseína (Vetor), as membranas foram incubadas por 30 minutos com anticorpos mACI-01-Ab7 C2 ou 6E10 (Chemicon) diluídos para 1μg/m1 em solução de Caseína. Depois de 3 lavagens em solução de Caseína, as membranas foram incubadas em RT por 30 minutos com IgG anti-camundongo de cabra marcada com HRP (Dako Cytomation) diluídas em solução de Caseína, lavadas 3 vezes e desenvolvidas com substrato DAB (Dako Cytomation).

[0412] ● O anticorpo monoclonal de camundongo mACI-01-Ab7 C2 ligado especificamente a monômeros, oligômeros e fibras no ensaio de Dot Blot como o anticorpo de controle positivo 6E10. Em contraste, o anticorpo mACI-01-Ab7C2 não detectou espécie amilóide linearizada por Western Blot em contraste ao anticorpo 6E10 que reconheceu claramente todos os peptídeos linearizados. Este resultado demonstra que a ligação de mACl-01-Ab7 C2 a amilóide é dependente da conformação nativa de amilóide.

EXEMPLO 6: Interações de mACI-01Ab7 C2 -Αβ1-42

[0413] As interações entre o mais importante anticorpo de AC immune mACI-01-Ab7 C2 (mC2) com peptídeo amilóide Αβ1-42 foi estudada usando ressonância de plasmônio de superfície. A ligação do anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 a ou monômeros ou fibras Αβ1-42 foram determinadas.

[0414] ● Todos os experimentos SPR foram realizados em um instrumento Biacore X (Biacore AB). Reagentes para imobilização (EDC, NHS e etanolamina), circuitos integrados sensores CM5 e SA assim como tampão de corrida e de amostra HBS-EP foram adquiridos a partir de Biacore AB. Acetato de sódio (10 mM, pH 5,0) foi usado como tampão de acoplamento para aumentar rendimento de acoplamento. Aβ1-42 fibrilar (BAchem) foi preparado adicionando tampão PBS a Aβ1-42 a uma concentração final de 3 mg/ml e deixando os frascos a 37 °C por 7 dias. Aβ1-42 fibrilar foi acoplado a um circuito integrado sensor CM5 contendo uma matriz de carboximetil dextrana ligada à superfície. Aβ1-42 monomérico biotinilado (Bachem) foi acoplado a um circuito integrado sensor SA consistindo de matriz de carboximetil dextrana com estreptavidina covalentemente acoplada. Tipicamente quatro ou cinco concentrações de mAb foram ensaiadas por diluições seriais usando tampão de corrida. Injeções foram realizadas começando da concentração mais baixa e foram passadas tanto por fc 1 como 2 em uma vazão de 30 μL/min por 3 min. Célula de fluxo 2 foi não derivada e respostas foram subtraídas de fc 1 para corrigir para ruído instrumental e mudanças refrativas de volume. Depois de injeção ter terminado, as superfícies foram lavadas imediatamente com tampão de corrida por 5 min. Para remover anticorpo ligado remanescente das fibrilas Aβ1-42, regeneração de superfície foi realizada injetando pulsos de 10 mM NaOH. Análise cinética foi realizada usando algoritmos para integração numérica e análise global usando BlAevaluation 3.0. As curvas obtidas para injeções de analito em diferentes concentrações foram sobrepostas e as linhas de base ajustadas para zero. Para ajuste de curva, todos os dados foram ajustados simultaneamente para um complexo homogêneo 1:1.

[0415] ● Ligação do anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 a amilóide foi determinada como sendo relativamente forte. Como demonstrado em Tabela 2, o anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 ligado especificamente a fibras Aβ1-42 imobilizadas com uma constante de associação média (ka) de 3,8 x 10-4 M/s, uma constante de dissociação (kd) de 1,1 x 0-3 s-i e portanto com a KD média resultante de 3,5 x 10-8 M. Associação do mAC1-01-Ab7 C2 a monômeros Aβ foi similar ou levemente mais rápida com uma ka média de 1,6 x 10-4 M/s mas a dissociação foi mais rápida dando uma KD de 2,5 x 10-7 M.

EXEMPLO 7: Ligação de anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 a Fibras amilóides

[0416] Para analisar o lado de ligação molecular lado do anticorpo em fibras pré-formadas microscopia eletrônica de transmissão (TEM) negativamente contrastada foi realizada (Figuras 3a e 3b).

[0417] O anticorpo, mACI-01-Ab7 C2, foi acoplado com 8 nm ouro coloidal de acordo com 4,5. Para a co-incubação de fibras amilóides 1-42 (Aβ1-42) fibras de 6,65uM foram incubadas por 24h em RT com o anticorpo marcado com ouro com a proporção molar de 1:100. Subsequentemente 5 μΙ de amostra foram incubados na grade (malha 200) de Cu com descarga brilhante fresca coberta com filme de parlódio/C por 45 segundos, lavados 3 vezes com água e 1 vez com 2% de acetato de uranila fresco diluído e filtrado. Amostras foram marcadas em 2% de acetato de uranila por 15-20 seg. Excesso de corante nas grades foi absorvido e consequentemente liofilizado. Três de cada amostra foram preparadas. As grades foram analisadas em microscópio eletrônico de transmissão Hitachi 7000.

[0418] O anticorpo monoclonal, mACI-01-Ab7 C2, se liga diretamente a fibras Aβ1-42. Interessantemente o anticorpo não exibe nenhuma ligação simétrica a eixo de fibras únicas mas se liga a áreas particulares e não todas de ramos laterais da rede de fibras. Parecem ser os alvos de anticorpo regiões específicas dentro dos ramos laterais. Uma explicação potencial é uma estrutura secundária específica que ocorre apenas nestes ramos laterais específicos. Esta hipótese é sustenta por dados de NMR demonstrando que o anticorpo induziu transição em conformação e portanto é provável que sua ligação seja dependente de uma conformação da fibra amilóide compreendendo uma estrutura de folha-β..

EXEMPLO 8: Fracionamento por Ultracentrifugação por gradiente de densidade

[0419] ● As propriedades de anticorpos monoclonais para inibir polimerização de fibra Aβ1-42 e desagregação de fibras Aβ1-42 foram estudadas por ultracentrifugação por gradiente de densidade (Rzepecki et al., 2004) que é baseada no princípio de distribuir entre fibras de peptídeos resultantes de tamanhos diferentes depois de incubação com e sem anticorpos seguido por uma análise de sedimentação SDS-PAGE em um gradiente pré-formado (OptiPrepTm). Análise simultânea de populações de fibras Aβ pré-formadas, propriedades de desagregação e inibição de agregação dos anticorpos co-incubados, e a ligação dos anticorpos às fibras são vantagens óbvias destes métodos.

[0420] ● Os anticorpos monoclonais produzidos contra Aβ1-16 (mACI-01-Ab7 C2), Aβ1-16(δ14) (mACI02-Ab6), Aβ1-15 (mACI-24-Ab4), Aβ22-35 (mACI-11-Ab9), e Aβ29-40 (mACI-12-Ab11) foram todos analisados em ensaios desagregantes ao passo que as propriedades de inibição de agregação foram estudadas apenas para o anticorpo monoclonal mACI-02-Ab6, mACI-24-Ab4, e mACI-01-Ab7 C2.

[0421] ● Para a inibição de agregação de Aβ1-42, monômeros Aβ1-42 foram incubados com mAbs em duas proporções molares diferentes (proporção molar de monômero Aβ1-42 trinta ou cem vezes maior do que mAb) com a concentração final de Aβ de 50 μM. Depois de incubação por 24 h a 37°C, amostras foram colocadas sobre um gradiente descontínuo de Optiprep™ e tubos foram agitados a 259 000 g por 3 h a 4°C. 15 frações foram coletadas (140 μL cada), fração 1 foi a fração menos densa do topo do gradiente e fração 15 é a fração mais densa do fundo do gradiente. O grânulo também foi obtido. As frações coletadas foram analisadas por SDS-PAGE com coloração por prata. A concentração de Aβ1-42 para ensaios de inibição foi cinco vezes menor do que para ensaios de desagregação que diminuem cinética de agregação de amilóide e asseguram medida dentro da fase linear.

[0422] ● Para a desagregação de fibrilas Aβ1-42 pré-formadas por co-incubação com mAbs (em duas proporções molares diferentes 1:30 e 1:100, mAb + Monômero Aβ1-42 com a concentração final de AS de 246 μM), as amostras foram incubadas por 24 horas a 37°C. Depois de 24 h amostras foram fracionadas por ultracentrifugação e separadas por SDS-PAGE como descrito acima e antes (Rzepecki et al., 2004).

8.1 Ensaio de Inibição de agregação de Aβ1-42

[0423] ● Pode ser demonstrado que sem adição de mAb, peptídeo Aβ foi agregado depois de tempo de incubação de 24 h e a maioria da proteína foi encontrada em frações 13-15, demonstrando polimerização completa dos monômeros de peptídeo Aβ. Inibição de agregação bem sucedida e significante deve resultar em fibras menores ou proteína β-amilóide polimérica solúvel (Aβ), que deve ser encontrada em frações com menor densidade (10-13). Exatamente esta mudança em bandas pode ser demonstrada em ensaio de agregação contendo mACl-01-Ab7 C2 que mostrou uma distribuição de peptídeo Aβ por frações 11, 12 e 13.

[0424] ● Isto foi confirmado em um 2nd experimento onde mACI-01 -Ab7 C2 causou de novo uma mudança em bandas para a maioria (banda mais forte) de 14 a 13 e uma solubilização significante das bandas correndo em fração 14 para grânulo. Isto significa, que mACI-01-Ab7 C2 exibe uma forte capacidade de inibir polimerização de monômeros de peptídeo Αβ em fibras e revelou uma ligação específica para as fibras Αβ (em fração 13)

[0425] ● Observações similares foram feitas ao usar anticorpo mACI-24-Ab4 e mACI-02-Ab6. Sem adição de mAb, peptídeo Aβ foi agregado depois de tempo de incubação de 24 h e a maioria da proteína foi encontrada em frações 13 para grânulo, (grânulo, muito pouco em 12), demonstrando polimerização completa dos monômeros de peptídeo Aβ. Inibição de agregação bem sucedida e significante deve resultar em fibras menores ou proteína β-amilóide polimérica solúvel (Aβ), que deve ser encontrada em frações com menor densidade. No ensaio de inibição de agregação, mACI-24-Ab4 causou uma mudança em bandas para a maioria (banda mais forte) de 13 a 11 e 12 e uma solubilização significante das bandas correndo em fração 13 para grânulo ao passo que mACl-02-Ab6 causou uma mudança em bandas de 13 a 10 mas adicionalmente uma inibição completa de formação de fibra maior (fracionada em 13 para grânulo). Estes dados indicam que tanto mACl-24-Ab4 como mACl-02-Ab6 exibem uma forte capacidade de inibir polimerização de monômeros de peptídeo Aβ em fibras e revelou uma ligação específica para as fibras Aβ (em fração 11 e 12).

[0426] ● Em contraste, ensaio de agregação contendo mACI-11-Ab9, em proporção molar 1:30, mostrou agregados maiores dispersos entre frações 12-15 e grânulo. Em presença de mACI-12- Ab11, em proporção molar 1:30, agregados são encontrados em frações 11-15 e grânulo, mas com sinal mais forte em frações 11 e 12. Isto significa, que mACI-01-Ab7 C2 e mACI24-Ab4 exibem a mais forte capacidade de inibir polimerização de monômeros de peptídeo Aβ em fibras. mACI-12-Ab11 teve propriedades de inibição menores significantes do que mACI-01-Ab7 C2, para obter esta fraca atividade inibidora uma proporção molar três vezes maior foi necessária. Ainda, inibição secundária pode ser observada quando comparado a mACI-11-Ab9 que não foi capaz de inibir agregação de fibra de peptídeo Aβ. Todos os mAb revelaram uma ligação específica para as fibras Aβ (para mACI-01-Ab7 C2 em fração 11 + 12; para mACI-11-Ab9 em fração 12 e fraca em 13; para mACI-12-Ab11 em fração 11 e 12).

[0427] ● Em todos os ensaios de inibição, peptídeo foi detectado nas frações de fundo. O mAb não ligado (37 kDa, 95 kDa e maior do que 120 kDa) apareceu na metade superior do gradiente (frações 3-9 e 4-8, respectivamente).

8.2 Ensaio de desagregação de fibras Aβ1-42

[0428] Devido à polimerização incompleta de fibras a distribuição de fibrilas Aβ1-42 demonstra sozinha uma variação mis ampla de frações (11-15). Portanto demonstração de propriedades de desagregação bem sucedidas e significantes dos anticorpos quando co-incubados com as fibras pré-formadas é mais difícil do que na análise de agregação. Apenas mudança na maioria das fibras para frações de menor densidade mas ainda dentro da variação de fração apenas amilóide iria indicar atividade de desagregação; para apenas amilóide a principal banda é fração 12. Adição de mACl-01-Ab7 C2 em proporção molar 1:100 não mostrou nenhuma mudança de fibras amilóides para frações de menor densidade (ainda entre frações 11-15), mas com uma mudança do sinal mais forte dentro da variação de fração de 12 a 11, quando comparado a apenas amilóide. Apesar de circunstâncias não ótimas de formação incompleta de fibras, mACl-01-Ab7 C2 indica atividades de desagregação baixas mas detectáveis.

[0429] Em contraste, a co-incubação de fibrilas Aβ1-42 pré-formadas com mACI-02-Ab6 não demonstrou nenhuma mudança de bandas para fração de menor densidade quando incubada com a mesma proporção molar de peptídeo amilóide:anticorpo tipo mACI-01-Ab7 C2. Apenas quando uma proporção molar três maior de 1:30 foi usada fibras amilóides mudaram de 12-15 (apenas amilóide sem co-incubação de anticorpo) para frações 11-15. Portanto pareceu que mACI-01- Ab7 C2 tem propriedades de desagregação levemente maiores do que mACl-02-Ab6.

[0430] ● A detecção de bandas correspondendo a mAb na metade inferior de fração de gradiente demonstra ligação de mAC1-02-Ab6 e mACI-01-Ab7 C2 a fibrilas Aβ1-42 (fração 11 a 15 para ambos mAb).

[0431] ● A propriedade de desagregação de mACl-01-Ab7 C2 pode ser confirmada em um experimento adicional, onde polimerização completa de fibras pode ser demonstrada pela distribuição de fibrilas Aβ1-42 na ausência de um anticorpo em frações 13 a P (grânulo). Aqui mudanças de fibras para frações de menor densidade indicam atividade de desagregação do anticorpo, quando co-incubado com fibras pré-formadas. Adição de mACI 01 Ab7 C2 em proporção molar 1:100 mostrou uma mudança da maioria de fibras amilóides de 13 a 12 e adicionalmente uma mudança da banda com a densidade mais baixa de 13 para 11. Portanto mACI-01-Ab7 C2 também indica uma forte atividade de desagregação.

[0432] ● A detecção de bandas correspondendo a mAb na metade inferior de fração de gradiente demonstra ligação de mACl-01-Ab7 C2 a fibrilas Aβ1-42 (fração 11 a P) ao passo que bandas correspondendo a mAb em frações 4 a 7 indicam anticorpo não ligado.

[0433] ● Para resumir estes resultados pode ser demonstrado com sucesso que o anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 tendo como alvo peptídeo Aβ-amilóide se liga a fibras pré-formadas e é capaz de inibir agregação in vitro de peptídeos Aβ monoméricos a fibras e desagregar fibras pré-formadas.

[0434] ● Observações similares foram feitas ao usar mACI-24-Ab4. Similar a ensaio de agregação, polimerização completa de fibras pode ser demonstrada pela distribuição de fibrilas Aβ1-42 apenas em frações 12 a P (grânulo). Aqui mudanças de fibras para frações de menor densidade podem indicar atividade de desagregação do anticorpo, quando co-incubado com fibras pré-formadas. Adição de mACI-24-Ab4 em proporção molar 1:100 mostrou uma mudança da maioria de fibras amilóides de 12 a 11. Portanto mACI-24-Ab4 também indica uma forte atividade de desagregação.

EXEMPLO 9: Ensaio Fluorescente para verificar Inibição de Agregação e Desagregação de Filamento Aβ1-42 de Filamentos Aβ1-42 pré-formados por co-incubação com mAb Ensaio Fluorescente BIS-ANS

[0435] ● Para verificar as propriedades de inibição do mAb foi usado o ensaio fluorescente BIS-ANS (LeVine, 2002) que detecta especificamente o monômero ou população não fibrilosa de filamentos Aβ1-42. Antes de medida fluorescente, monômeros Aβ1-42 foram pré-incubados ou com tampão, servido como controle, ou mAb (proporção molar 1:100, mAb vs. peptídeo Aβ1-42) por 14 horas a 37°C. Unidades fluorescentes relativas foram automaticamente registradas e resultados foram expressos como mudanças para o controle em porcentagem.

[0436] ● mACI-02-Ab6 mostrou uma capacidade de inibição leve quando comparado ao controle (125,8 ± 28,5% vs 100 ± 29,5%). mACI-01-Ab7 C2 pareceu ter atividade fraca (108, 0 ± 30,0%) e nenhuma melhora comparada ao controle pode ser observada com o mAb mACI-11 -Ab9 e mACI-12-Ab11 (93,5 ± 21,9% e 73,2 ± 47,7%). Este resultado confirma os dados de ultracentrifugação, nos quais mACI-01-Ab7 C2 exibe maior capacidade de inibição do que mACI-11-Ab9 e mACI-12-Ab11.

EXEMPLO 10: Ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T)

[0437] ● Para medir tanto inibição de agregação assim como propriedades de desagregação do mAb foi usado o ensaio fluorescente de Tioflavina T (Th-T) que se liga especificamente a moléculas fibrilares de Aβ1-42 e subsequentemente a intensidade de emissão fluorescente se correlaciona com a quantidade de filamentos Aβ1-42 presente na solução.

[0438] ● Antes de mensuração fluorescente, monômeros Aβ1-42 foram pré-incubados ou com tampão (controle), ou mAb (proporção molar 1:100, mAb vs. peptídeo Aβ1-42) por 48 horas a 37°C. Unidades fluorescentes relativas foram automaticamente registradas e resultados foram expressos como mudanças para o controle em porcentagem.

[0439] ● mACI-01-Ab7 C2 mostrou uma capacidade de inibição significante quando comparado ao controle (11,03 ± 20,7% vs 100 ± 40,5%). Este resultado confirma os dados de ultracentrifugação, nos quais mACl-01-Ab7 C2 exibe capacidade de inibição.

[0440] ● Para medir as propriedades de desagregação do mAb foi usado o ensaio fluorescente de Tioflavina T (Th-T) que se liga especificamente a moléculas fibrilares de Aβ1-42 e subsequentemente a intensidade de emissão fluorescente se correlaciona com a quantidade de filamentos Aβ1-42 presente na solução. Antes de medida, fibra Aβ foram pré-formadas por 7 dias (a 37°C em PBS, pH 7,1) e então subsequentemente co-incubadas com mAb ou tampão (controle negativo), por 24 horas a 37°C em proporção molar de 1 : 100 (mAb vs. Aβ1-42).

[0441] ● Unidades fluorescentes relativas foram automaticamente registradas por um leitor de placa de microtítulo de ELISA e resultados foram expressos como mudanças para o controle em porcentagem.

[0442] ● Em conformidade com os dados de ultracentrifugação mACI-01-Ab7 C2 também mostrou no teste de desagregação de ThT em dois experimentos independentes as melhores propriedades com 35 ± 11 % e 64,57 ± 13,58% (vs 100.0 ± 15,37%), respectivamente, poder de desagregação sobre o controle.

[0443] mACI-24-Ab4 também mostrou propriedades de desagregação significantes (62,99 ± 10,34% vs 100,0 ± 10,03%; p<0,0001) no ensaio de Th-T.

[0444] ● mACI-11-Ab9 foi de alguma maneira menos ativo com 28 ± 14%, ao passo que ACI-02-Ab6 e ACI12-Ab11 não exibiram propriedades de desagregação significantes (17 ± 12% e 13 ± 11% respectivamente).

[0445] ● Ao resumir ensaios de ultracentrifugação e fluorescentes mACI-01-Ab7 C2, mACI01-Ab6 e mACl-24-Ab4 mostraram capacidades de bi-funcionalidade para inibir agregação de fibras e para encurtar filamentos Aβ1-42 pré-formados em experimento de centrifugação o que pode ser confirmado por ensaio fluorescente. Adicionalmente, experimento de centrifugação demonstrou ligação específica do mAb a fibras amilóides.

[0446] ● mACI-11-Ab9 mostrou capacidade de inibição menor significante em ultracentrifugação, quando comparado a mACl-01-Ab7 C2 mesmo que fosse três vezes mais concentrado, o que pode ser confirmado por ensaio BIS-ANS. Para a análise de desagregação mACl-01-Ab7 C2 demonstrou tanto em análise de centrifugação como ensaio de ThT propriedades para encurtar filamentos Aβ1-42 pré-formados. mACl-02-Ab6, três vezes mais concentrado em experimento de centrifugação, também foi positivo em ambos os ensaios mas muito mais forte em experimento de centrifugação.

[0447] ● A partir dos resultados acima é evidente que mACI-01-Ab7 C2 e mACI-02-Ab6 são os únicos anticorpos mostrando atividade em termos de bifuncionalidade para interagir in com filamentos Aβ1-42, inibição de agregação e desagregação de fibras pré-formadas.

EXEMPLO 11: NMR e Caracterização de Fluorescência da Interação de Anticorpo Monoclonal mACI01-Ab7 C2 com Peptídeo β-Amilóide 1-42 marcado com 13C

[0448] Para avaliar o mecanismo potencial pelo qual o mAb solubiliza fibras pré-formadas ou inibe formação de fibras, um experimento de igual para igual entre ensaio fluorescente de Th-T e NMR de estado sólido de Peptídeo β-Amilóide 1-42 marcado com U-13C Tyr10 e Val12 foi realizado (Figura 4). Portanto o objetivo desta investigação foi seguir a transição de folha-β por espectroscopia NMR de estado sólido no peptídeo β-amilóide e na presença do anticorpo monoclonal e para comparar diretamente este com capacidade de desagregação medida por ensaio fluorescente de Th-T.

[0449] ● Espectroscopia NMR de estado sólido detecta não apenas uma transição na estrutura secundária, mas ela também permite localizar os domínios do peptídeo Aβ1-42 que dominam a transição estrutural. NMR de estado sólido provou sua aplicabilidade ao problema pois ela contribuiu para a determinação de estrutura das fibras Aβ1-42 (Petkova et al., 2004, Petkova et al., 2002). Em particular a correlação da mudança química de 13C e 13Cp com a estrutura secundária (Cornilescu et al., 1999, Luca et al., 2001, Iwadate et al, 1999) é uma ferramenta valiosa para testar mudanças da estrutura secundária dentro de um peptídeo.

[0450] ● A síntese do peptídeo marcado incluindo uma valina pré-marcada com 13C em posição 12 (12Val) e uma tirosina pré-marcada com 13C em posição 10 (10Tyr) foi realizada por um protocolo de síntese de Fmoc. Identidade e pureza do peptídeo foram confirmadas por espectroscopia de massa MALDI. O peptídeo β-amilóide (1-42) marcado foi usado para gerar fibras incubando a solução de peptídeo em tampão PBS por 1 semana a 37°C. O principal problema, a fraca solubilidade do peptídeo β-amilóide em tampão PBS, pode ser resolvido da seguinte maneira: O valor de pH do tampão PBS foi temporariamente aumentado em ínfimas quantidades de amônia para dissolver o peptídeo β-amilóide. O valor original de pH do tampão PBS foi re-obtido incubando a amostra na presença de um banho maior de PBS usando o caráter volátil de amônia.

[0451] ● Para medir o efeito dos anticorpos degradadores de folha-β, soluções de fibras foram incubadas com o anticorpo por 24 horas a 37°C tanto para ensaio NMR como Th-T. Para comparação em tempo real uma alíquota da mesma solução foi usada para ensaio fluorescente de Th-T e a solução remanescente foi liofilizada para as medidas de NMR.

[0452] ● Depois de analisar primeiro as capacidades de desagregação de mACI-01-Ab7 C2 por co-incubação com fibras β-amilóides marcadas com 13C pré-formadas usando ensaio fluorescente de Th-T, pode ser mostrado que o mAb desagregou as fibras em 38%. Então análise de espectros NMR foi realizada.

[0453] ● Para investigar as diferenças entre incubação com PBS (controle) e mAb cada espectro passou por desconvolução usando PeakFit (http://www.systat.com/-products/PeakFit). As linhas foram bem casadas empregando um procedimento de análise misturado Lorentziano/Gaussiano, os resultados dos quais são mostrados em Figura 4. Os resultados são resumidos em Tabela 3 mas a diferença mais óbvia são as intensidades integrais das duas populações que são necessárias para ajustar o pico duplo por volta de 30-33 ppm. O pico em c33 ppm corresponde à conformação de folha beta das fibras enquanto que em 30 ppm é um resultado de conformação espiral aleatória. A amostra incubada em PBS mostrou a maioria das marcas em uma conformação de folha beta (81,7%) (Fig. 2 topo) que é reduzida quando a amostra é incubada com mACI-01-Ab7 C2 (53,5%) (Fig. 4 fundo). A redução na população da conformação de folha beta com respeito à conformação espiral aleatória se determinada por estudo do Cβ Val 12 é da ordem de 35% e portanto está de acordo com aquela medida usando fluorescência.

Tabela 3. Comparação dos parâmetros ajustados para as duas conformações de Val 12 CP. As mudanças químicas ajustadas para as duas conformações são bastante similares mas as intensidades integrais são muito diferentes, refletindo uma redução na conformação de folha beta original em aprox 35% (1-(53,5/81,7)). Isto está muito de acordo com o valor obtido a partir da medida de fluorescência.

[0454] Para resumir estes resultados pode ser demonstrado com sucesso que o anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 tendo como alvo a região 1-16 N-terminal de peptídeo Aβ-amilóide se liga a fibras pré-formadas e é capaz de inibir agregação in vitro de peptídeo Aβ monoméricos a fibras e desagregar fibras pré-formadas, como demonstrado por experimento de ultracentrifugação por gradiente de densidade assim como por ensaio fluorescente de Th-T. Em adição ligando este anticorpo a fibras pré-formadas, uma transição de ambiente de maioria de folha beta para conformação secundária espiral aleatória de Val12 pode ser induzida. Este pode ser o mecanismo potencial pelo qual fibras podem ser solubilizadas por ligação do anticorpo monoclonal mACI-01 -Ab7 C2 também por causa da análise detalhada de pico de Val 12 CP revela redução de componente de folha beta em 35% o que está de acordo com dados de fluorescência (38%).

Exemplo 12: Funcionalidade de mACI-01-Ab7 C2 em Fibras amilóides 12.1 Modificação de Conformação de Fibras Aβ1-42 e Iniciação de Desagregação depois de Ligação do anticorpo mACI-01 -Ab7 C2

[0455] A fim de avaliar o mecanismo pelo qual o anticorpo é capaz de desagregar fibras beta-amilóides (Aβ1-42) pré-formadas uma comparação de igual para igual de ensaio fluorescente de Tioflavina-T (Th-T) foi realizada medindo desagregação e Ressonância Magnética Nuclear (NMR) de estado sólido de peptídeo Aβ1-42 marcado com U-13C Tirosina10 e Valinal2 analisando conformação secundária. O anticorpo solubilizou 35,4 % das fibras Aβ1-42 pré-formadas e simultaneamente induziu uma mudança em conformação secundária de folha beta para espiralada aleatória. A redução na população conformação de folha beta com respeito à espiral aleatória é da ordem de 35% e portanto está de acordo com aquela medida usando ensaio de fluorescência de Th-T. Estes dados indicam que a ligação do anticorpo inicia uma transição da estrutura secundária o que potencialmente causa uma desestabilização do arranjo intermolecular paralelo das folhas beta afetando uma quebra de fibras alongadas em fragmentos menores.

12.2 Afinidade de ligação dependente de Conformação de anticorpo mACI-01-Ab7 C2

[0456] ● Uma vez que é bem conhecido na literatura científica que uma proporção da energia de ligação de anticorpo-antígeno pode ser usada para uma modificação dependente de energia da conformação de um antígeno 6, um experimento de comparação da afinidade de ligação do anticorpo mACI-01-Ab7 C2 com a proteína Aβ1 42 inteira e com um peptídeo menor de nove aminoácidos compreendendo o epítopo de anticorpo foi realizado. Para esta comparação as afinidades do anticorpo mACI-01-Ab7 C2 foram analisadas por ELISA usando peptídeos biotinilados cobrindo a sequência de aminoácidos completa do epítopo de mACI-01-Ab7 C2 (aminoácidos 13-21 da sequência de Aβ1-42, produzido por Mimotopes e adquirido a partir de ANAWA Trading SA) e um peptídeo Aβ1-42 biotinilado completo (Bachem). A análise foi feita de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). O anticorpo se liga com uma afinidade 38,40% maior ao peptídeo compreendendo seu epítopo específico (aminoácidos 13-21 da sequência de Aβ1-42) do que à proteína Aβ1-42 inteira. Portanto é sugerido que a diferença em energia de afinidade de ligação foi usada para a transição que consome energia da conformação secundária da proteína amilóide para apresentar o antígeno em uma posição mais aceitável para a interação de anticorpo. Isto pode explicar porque a afinidade do anticorpo é menor para o nativo (a proteína amilóide inteira) do que para a subunidade isolada.

EXEMPLO 13: Ligação específica de Conformação de mACI-01-Ab7 C2 a diferentes classes de Proteína Amilóide

[0457] ● A fim de avaliar a especificidade de mACI-01-Ab7 C2 a diferentes estágios de proteína amilóide polimerizada, monomérica e amilóide polimérico solúvel, particularmente, proteína β-amilóide (Aβ), e amilóide fibrílico, um ELISA revestido com estes diferentes estágios de proteína beta-amilóide polimérica foi realizado. Monômeros foram preparados de acordo com um método modificado publicado por 7, amilóide polimérico solúvel, particularmente, β-amilóide (Aβ) de acordo com 8, ao passo que fibras foram pré-formadas por incubação de amilóide (Bachem, Switzerland) com uma concentração final de 1 μg/μ1 em Tris/HCI pH 7,4 a 37°C por 5 dias seguido por uma etapa de centrifugação (10.000 rpm por 5 minutos). Então polímeros amilóides foram revestidos em uma placa de ELISA com uma concentração final de 55μg/ml e afinidade de ligação ELISA usando um anticorpo monoclonal anti-IgG de camundongo (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) marcado com fosfato alcalino foi realizada. O anticorpo se liga com afinidade maior a proteína β-amilóide (Aβ) polimérica solúvel (IC50 = 2,53nM) do que a fibras (IC50 = 5,27nM) e com a mais baixa a monômeros (IC50 = 8,3nM). Estes dados indicam que a ligação do anticorpo é influenciada apesar de seu epítopo pela conformação dos diferentes agregados amilóides.

EXEMPLO 14: Mapeamento de epítopo de anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2

[0458] ● Mapeamento de epítopo do anticorpo monoclonal mACl-01-Ab7 C2 foi realizado por ELISA usando três diferentes bibliotecas de peptídeos. Uma biblioteca compreende um total de 33 peptídeos biotinilados cobrindo a sequência de aminoácidos (aa) completa de Aβ1-42 (produzido por Mimotopes e adquirido a partir de ANAWA Trading SA), a segunda biblioteca contém peptídeos biotinilados usando peptídeo 12 (aa12-20 de Aβ) da primeira biblioteca de peptídeos e substituindo cada aminoácido na sequência por uma alanina (veja tabela 41 abaixo), e a terceiro biblioteca contém peptídeos biotinilados 13, 14, ou 15 (aa 13-21, 14-22 ou 15-23 de Aβ) e substituindo em cada caso os últimos aminoácidos por uma alanina ou para uma glicina para aa 21 que já é uma alanina (veja tabela 5 abaixo). Um peptídeo Aβ1-42 biotinilado completo foi usado como controle positivo (Bachem). Mapeamento de epítopo foi feito de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). Resumidamente, placas revestidas com estreptavidina (NUNC) foram bloqueadas com 0,1 % de BSA em PBS durante a noite a 4°C. Depois de lavagem com PBS-0,05% de Tween 20, placas foram revestidas por 1 hora em RT com os peptídeos diferentes da biblioteca, diluídos em 0,1% de BSA, 0,1% de Azida Sódica em PBS para uma concentração final de 10 μM. Depois de lavagem, placas foram incubadas for 1 hora em RT com o anticorpo mACI-01-Ab7 C2 ou um isotipo de anticorpo IgG2b de camundongo de controle, diluídas para 10 μg/ml em 2% de BSA, 0,1% de Azida Sódica em PBS. Placas foram lavadas de novo e incubadas com IgG anti-camundongo de cabra conjugada a fosfatase alcalina por 1h em RT. Depois de lavagem final, placas foram incubadas com substrato de fosfatase (pNPP) e lidas em 405 nm usando um leitor de placa de ELISA.

[0459] ● Foi mostrado que o anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 ligado especificamente a peptídeos 12, 13, 14 e 15 da primeira biblioteca de peptídeos. Estes 4 peptídeos compreendem aa 1220 (VHHQKLVFF), 13-21 (HHQKLVFFA), 14-22 (HQKLVFFAE) e 15-23 (QKLVFFAED) de Aβ1-42 sugerindo que o epítopo fica em região 12-23 de Aβ. Uma segunda biblioteca com substituições de alanina foi usada para determinar os aa críticos para ligação a peptídeo 12-20 (VHHQKLVFF). A ligação do anticorpo mACI-01-Ab7 C2 é perdida completamente quando aa 16, 17, 19 ou 20 são substituídos por uma alanina, indicando que estes aa são absolutamente críticos para ligação do anticorpo a Aβ. A ligação do anticorpo mACl-01-Ab7 C2 é parcialmente perdida quando aa 15 e 18 são substituídos.

[0460] A ligação também foi quase completamente perdida quando aa 14 foi substituído por uma alanina, indicando que aa 14 também é muito importante para ligação.

[0461] ● Finalmente, uma terceira biblioteca foi usada para determinar se aa 21, 22 ou 23 são críticos para ligação ao epítopo. A ligação do anticorpo a aa 15-23 foi reduzida quando aa 23 foi substituído por uma alanina, indicando que aa 23 também é importante para ligação. A ligação foi parcialmente perdida quando aa 21 foi substituído por uma glicina e levemente perdida quando aa 22 foi substituído por uma alanina.
Tabela 4. Resumo de peptídeos usados na segunda biblioteca.
aa que são importantes para ligação são marcados em itálico e sublinhados e aa absolutamente críticos para ligação são marcados em itálico e negrito e sublinhados

Tabela 5. Resumo de peptídeos usados na terceira biblioteca.
aa que são importantes para ligação são marcados em itálico e sublinhados e aa absolutamente críticos para ligação são marcados em itálico e negrito e sublinhados

EXEMPLO 15: Influência de Vacinação Passiva com mACI-01-Ab7 C2 em Carga de Amilóide no Cérebro em Camundongos hAPP transgênicos únicos

[0462] Para verificar a capacidade in vivo do anticorpo monoclonal mACI-01 -Ab7 C2 de se ligar e limpar amilóide solúvel do cérebro, camundongos hAPP de 6 meses de idade 9, com gênero e idade iguais, foram usados para um estudo de imunização passiva com dose diferente. Carga de amilóide solúvel foi analisada no fim do estudo coletando o cérebro dos animais e realizando um ELISA específico para Aβ 1-40 e Aβ 1-42 (TGC, Germany).

[0463] ● 8-13 animais por grupo receberam duas injeções em um intervalo de uma semana de 100, 300 e 1000μg de anticorpo monoclonal em 200μl de PBS ao passo que injeção de PBS apenas serviu como controle. Um dia depois da segunda injeção animais foram sacrificados para análise bioquímica da fração de amilóide solúvel. Para quantificar a quantidade de Aβ 1-40 humano e Aβ 1-42 humano na fração solúvel dos homogenados cerebrais e/ou em fluido cerebroespinhal (CSF), kits comercialmente disponíveis de ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA) foram usados (h Amilóide β40 ou β 42 ELISA de alta sensibilidade, TGC, Switzerland). O ELISA foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, padrões (uma diluição de Aβ 1-40 ou Aβ 1-42 sintético) e amostras foram preparados em uma placa de polipropileno de 96 poços sem capacidade de ligação de proteína (Greiner, Germany). As diluições padrão com concentrações finais de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 e 15,6 pg/ml e as amostras foram preparadas no diluente de amostra, fornecido com o kit de ELISA, para um volume final de 60 μl. Uma vez que níveis de amilóide aumentam com a idade do camundongo e uma vez que a avaliação atual requer que as leituras das amostras estejam dentro da parte linear da curva padrão, as amostras para análise de Aβ 40 foram diluídas 2:3, as amostras para análise de Aβ 42 não foram diluídas.

[0464] ● Amostras, padrões e brancos (50 μΟ foram adicionados à placa de polistirol revestida com anti-Aβ (anticorpo de captura reconhece seletivamente a extremidade C-terminal do antígeno) em adição com um conjugado seletivo de anticorpo anti-Aβ (anticorpo de detecção biotinilado) e incubados durante a noite a 4°C a fim de permitir formação do complexo anticorpo-anticorpo amilóide. No dia seguinte, um conjugado de Estreptavidina-Peroxidase foi adicionado, seguido 30 minutos depois pela adição de uma mistura de TMB/peróxido, resultando na conversão do substrato em um produto colorido e a intensidade de cor foi medida por meio de fotometria com um leitor de ELISA com um filtro de 450 nm. Quantificação do conteúdo de Aβ das amostras foi obtido comparando absorbância com a curva padrão feita com Aβ 1-40 ou Aβ 1-42 sintético. Dados foram expressos como mudanças individuais para valor de controle médio (em porcento para controle).

[0465] ● A quantidade total de Aβ 40 em homogenados cerebrais pode ser reduzida significantemente e aproximadamente não significantemente para Aβ 42 quando camundongos hAPP únicos foram passivamente imunizados por duas injeções i.p. de anticorpo monoclonal ACI-01-Ab7 C2 em uma dose de 300μg (Aβ 40: -27,3 ± 13,9% com p<0,05; Αβ 42: -8,6 ± 22,4 com p=0,56; teste T de Student não pareado), ao passo que 100 e 1.000μg não atingiram significância. Imunização com 100μg levou a um aumento para Aβ 40 e Aβ 42 em homogenados cerebrais (Aβ 40: 32,3 ± 36,8%; Aβ 42: 38,3 ± 51,4%) ao passo que tratamento com 1.000μg provocou a tendência certa de diminuição de carga amilóide e pode ser potencialmente efetivo com um número aumentado de animais por grupo (Aβ 40: -2,2 ± 26,0%; Aβ 42: -9,3 ± 15,9%). Estes dados demonstram que em um protocolo de imunização agudo o anticorpo mACI-01-Ab7 C2 é capaz de diminuir a quantidade total de Aβ solúvel no cérebro deste modelo de AD murino. Interessantemente, parece que a relação de dose é transitória mas mais estudos com grupos maiores devem ser realizados a fim de ganhar dados significantes.

EXEMPLO 16: Influência de Administração Passiva Crônica de mACI-01-Ab7 C2 em Carga de Placa em Camundongos hAPPxPS1 Transgênicos Duplos

[0466] Para verificar a capacidade in vivo do anticorpo monoclonal mACl-01-Ab7 C2 de se ligar e reduzir placas amilóides no cérebro, camundongos hAPPxPS1 transgênicos duplos de 3,5 meses de idade 10, com gênero e idade compatíveis, foram usados para um estudo de imunização passiva crônica de 4 meses. Placas amilóides foram analisadas no fim do estudo por histoquímica do cérebro dos animais por ligação de Tioflavina S.

[0467] ● 15 animais transgênicos receberam 16 injeções semanais de 500μg de anticorpo monoclonal em PBS. 15 animais foram injetados com PBS apenas, servindo como controles. Todas as injeções foram dadas intraperitonealmente. Em sacrifício, camundongos foram anestesiados e lavados transcardialmente com soro fisiológico a 4°C para remover sangue dos vasos cerebrais. Subsequentemente, o cérebro foi removido do crânio e rombencéfalo e prosencéfalo foram separados com um corte no plano coronal/frontal. O prosencéfalo foi dividido igualmente em hemisfério esquerdo e direito usando um corte sagital mediano. Um hemisfério foi pós-fixado durante a noite em 4% de paraformaldeído para histologia. Seções sagitais de vibrátomo (40 μm) foram cortadas para incubações livres de flutuação e armazenadas a 4°C até coloração em PBS com 0,1 % de azida sódica. Cinco seções em diferentes níveis foram coloridas para placas densas com Tioflavina S. Seções de todos os animais usados foram aleatorizadas para coloração e quantificação cega. Imagens foram adquiridas com um microscópio Leica DMR equipado com uma câmera Sony DXC-9100P e analisadas com um computador usando aplicativo computacional Leica Q-Win. Configurações de intensidade de luz e condensador para o microscópio foram mantidas constante ao longo do processo de aquisição de imagem. Todas as imagens adquiridas foram sujeitas às mesmas subrotinas computacionais para minimizar influência de investigador. Limiarização de fatiamento foi aplicada uniformemente ao longo de análise. A área do subiculum foi selecionada para quantificação automática da carga de amilóide na coloração de Tioflavina S.

[0468] ● A carga de placa total e o número de placas na área de subiculum podem ser significantemente reduzidos quando camundongos hAPP/PS1 duplos foram passivamente imunizados por 4 meses como descrito acima. Em carga de placa uma diminuição significante de 31% (mACI-01- Ab7 C2: 1,11 ± 0,21% e controle: 1,61 ± 0,35%; p=0,003, teste U de Mann-Whitney) pode ser atingida ao passo que a imunização passiva reduziu significantemente a quantidade de placas em 19% (mACI-01-Ab7 C2: 8,73 ± 1,36 e controle: 10,78 ± 1,36; p=0,006, teste U de Mann-Whitney), indicando que solubilização de placa ocorreu em um grau levemente menor do que ruptura de placas.

EXEMPLO 17: Influência de Vacinação Passiva com mACI-01-Ab7 C2 em Capacidade de Memória em Camundongos hAPP transgênicos únicos

[0469] ● Para analisar a capacidade in vivo do anticorpo mACl-01-Ab7 C2 de modificar ou aumentar funcionalidade cognitiva, camundongos hAPP únicos de 9 meses de idade, com gênero e sexo compatíveis, foram usados para estudo de imunização passiva. Cognição não especial foi medida no final do período de imunização verificado por nova Tarefa de Reconhecimento de Objetos (ORT).

[0470] ● 12 animais por grupo receberam duas injeções intraperitoneais de 40014 de anticorpo monoclonal em 200111 PBS ao passo que injeção de PBS apenas serviu como controle. Um dia depois da segunda injeção capacidade cognitiva foi estudada em uma nova Tarefa de Reconhecimento de Objetos (ORT)12' 13 Para protocolo de ORT camundongos foram colocados por 10 minutos em uma arena comportamental e defrontado com um novo objeto desconhecido. Tempo de exploração foi registrado. Três horas depois os mesmos animais foram re-colocados na mesma arena para uma 2nd sessão mas defrontado com o objeto velho, previamente explorado, e adicionalmente com um novo. De novo, tempos de exploração para ambos objetos foram registrados e índice de cognição resultante foi calculado como a proporção de tempo de exploração para o objeto novo relacionado ao tempo de exploração total e expresso como mudanças proporcionais para o controle.

[0471] ● Vacinação passiva com mACI-01-Ab7 C2 levou a um aumento significante de capacidades de memória cognitiva em camundongos AD transgênicos únicos (mACI-01-Ab7 C2: 131,6 ± 9,1% e controle:100,0 ± 9,2% com p<0,05; teste t de Student não pareado e n=12 por cada grupo).

Depósitos:

[0472] As linhagens celulares de hibridomas seguintes foram depositadas com o "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ)" em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, sob as provisões do Tratado de Budapeste:

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[0511] W096/1359

[0512] W096/29605

Claims

Anticorpo monoclonal ou partes funcionais do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender as regiões CDR da Região Variável de Cadeia leve (LCVR) e da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) do anticorpo produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3, depositada em 01 de dezembro de 2005 como DSM ACC2750.
Anticorpo monoclonal partes funcionais do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender um fragmento de ligação epítopo do anticorpo produzido por linhagem celular de hibridoma FP 12H3-C2, depositada em 01 de dezembro de 2005 como DSM ACC2750.
Anticorpo monoclonal ou partes funcionais do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as regiões CDR da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) da SEQ ID NO: 7 e as regiões CDR da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 8, em que o anticorpo ou partes funcionais do mesmo são ligadas a β amilóide.
Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo monoclonal tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
Composição caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo monoclonal ou partes funcionais do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma composição farmacêutica.
Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de doenças e distúrbios que são causados por ou associados a proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associado a proteína amilóide ou tipo amilóide tal como a proteína Aβ envolvida no mal de Alzheimer.
Mistura, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo monoclonal ou partes funcionais do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em uma quantidade terapeuticamente eficaz e, opcionalmente, uma substância biologicamente ativa adicional e/ou um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável; em que a substância biologicamente ativa adicional é um composto usado na medicação de doenças e distúrbios que são causados por ou associados a proteínas amilóides ou tipo amilóides incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados a proteína amilóide ou tipo amilóide tal como a proteína Aβ envolvida no mal de Alzheimer.
Mistura, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender em adição ao anticorpo monoclonal ou partes funcionais do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, pelo menos um composto selecionado a partir do grupo consistindo de niacina, memantina, quelantes de metal, pirenzepina e metabólitos, 3-amino-1-ácido propanossulfônico (3APS), 1,3- propanodissulfonato (1,3PDS), proteínas tau, neurotransmissor, ou inibidores de colinesterase (ChEls) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou galantamina e outras drogas e suplementos nutritivos, junto com um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Uso de um anticorpo monoclonal ou uma parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma composição farmacêutica tal como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, ou uma mistura tal como definida em qualquer uma das reivindicações 8 ou 9 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, distúrbios neurológicos tal como mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições caracterizadas perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, degeneração macular.
Uso de anticorpo monoclonal ou uma uma parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma composição farmacêutica tal como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou uma mistura tal como definida em qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para tratar ou aliviar o mal de Alzheimer.
Método para preparar uma composição farmacêutica tal como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou uma mistura tal como definida em qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de usar um anticorpo monoclonal ou parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para uso no tratamento ou alívio dos efeitos de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, distúrbios neurológicos tal como mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições caracterizadas perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e degeneração macular.
Método para preparar uma composição farmacêutica tal como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de usar um anticorpo monoclonal ou parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo formular dito anticorpo em uma forma farmaceuticamente aceitável.
Método, de acordo com reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é compreendido na composição em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na redução da carga de placa no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano com necessidade da mesma.
Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a carga de placa no cérebro é diminuída em pelo menos 20%, particularmente em pelo menos 25%, mais particularmente em pelo menos 30%, ainda mais particularmente em mais do que 30%
Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na redução da quantidade de placas no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano com necessidade da mesma.
Composição, de acordo com reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a quantidade de placas no cérebro é reduzida em pelo menos 10%, particularmente em pelo menos 15%, mais particularmente em pelo menos 20%.
Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na diminuição da quantidade total de Aβ solúvel no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um humano com necessidade da mesma.
Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção, tratamento ou alivío dos efeitos da amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados à formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, distúrbios neurológicos tal como mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições compreendendo uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deficiência cognitiva leve (MCI), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo holandês); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas à proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), miosite de corpos de inclusão (IBM), Diabetes de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos, e degeneração macular.
Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento do mal de Alzheimer.
Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na retenção ou aumento da capacidade de memória cognitiva em um mamífero exibindo uma doença ou condição.
Linhagem celular de hibridoma isolado, caracterizada pelo fato de produzir um anticorpo monoclonal tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
Linhagem celular de hibridoma isolado, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular de hibridoma FP 12H3 ser depositada em 01 de dezembro de 2005 como DSM ACC2752.
Método de diagnóstico de uma doença ou condição associada a amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína amilóide em uma amostra que inclui as etapas de:
- a) colocar a amostra suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo ou parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, cujo anticorpo se liga a um epítopo da proteína amilóide;
- b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico;
- c) detectar a formação do complexo imunológico; e
- d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra.
Método para diagnosticar uma predisposição para uma doença ou condição associada a amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína amilóide em uma amostra que inclui as etapas de:
- a) colocar a amostra suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo ou a parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, cujo anticorpo se liga a um epítopo da proteína amilóide;
- b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico;
- c) detectar a formação do complexo imunológico;
- d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra, e
- e) comparar a quantidade de dito complexo imunológico com um valor de controle normal,
em que um aumento na quantidade do dito agregado comparado com um valor de controle normal indica que dito paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma doença ou condição associada a amilóide.
Método para monitorar doença residual mínima em um paciente seguindo tratamento com um anticorpo ou parte funcional do mesmo como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dito método compreende:
- a) colocar a amostra suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo ou parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, cujo anticorpo se liga a um epítopo da proteína amilóide;
- b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico;
- c) detectar a formação do complexo imunológico;
- d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra, e
- e) comparar a quantidade de dito complexo imunológico com um valor de controle normal,
em que um aumento na quantidade do dito agregado comparado com um valor de controle normal indica que dito paciente ainda sofre de uma doença residual mínima.
Método para prever a responsividade de um paciente sendo tratado com um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender:
- a) colocar a amostra suspeita de conter o antígeno amilóide em contato com um anticorpo ou uma parte funcional do mesmo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, cujo anticorpo se liga a um epítopo da proteína amilóide;
- b) permitir que o anticorpo se ligue ao antígeno amilóide para formar um complexo imunológico;
- c) detectar a formação do complexo imunológico;
- d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno amilóide na amostra, e
- e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico antes e depois de início do tratamento,
em que uma diminuição na quantidade de dito agregado indica que dito paciente tem um alto potencial de ser responsivo ao tratamento.
Kits de teste para detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas a amilóide, caracterizado pelo fato de compreender anticorpos ou partes funcionais dos mesmos tal como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.