BRPI0617744A2

BRPI0617744A2 - métodos de produção de proteìnas com o uso de compostos antienvelhecimento

Info

Publication number: BRPI0617744A2
Application number: BRPI0617744-1A
Authority: BR
Inventors: Yen-Tuang Luan; Wenge Wang; Paul Thoday; Denis Drapeau; Judy Chou
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-10-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2011-08-02
Also published as: AR058140A1; IL190550A; PE20070796A1; CR9897A; ES2485374T3; US20070110743A1; JP5907928B2; PL1941026T3; DK1941026T3; AU2006306433B2; KR101402634B1; EP1941026A2; PT1941026E; KR20080063365A; HK1120552A1; JP2009512459A; EP1941026B1; RU2491347C2; TW200736397A; NO20081622L

Abstract

<B>MéTODOS DE PRODUçãO DE PROTEìNAS COM O USO DE COMPOSTOS ANTIENVELHECIMENTO<D>. A presente invenção refere-se a métodos de produção de uma proteína em cultura de células que compreende um composto antienvelhecimento, por exemplo, o antioxidante carnosina. De acordo com os ensinamentos da presente invenção, as células desenvolvidas em um meio de cultura de células que compreende um composto antienvelhecimento exibem aumento da viabilidade e da produtividade. Além disso, as culturas de células desenvolvidas na presença de um composto antienvelhecimento exibem diminuição dos níveis de agregados de alto peso molecular no meio de cultura de células.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSDE PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS COM O USO DE COMPOSTOS ANTI-ENVELHECIMENTO".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados"

Este pedido é co-pendente, compartilha pelo menos um inventorem comum, e reivindica priorid1ade para o pedido provisório de patente U.S.número 60/729.573, depositado em 24 de outubro de 2005, cujo conteúdo éaqui incorporado por referência em sua totalidade.

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se, de forma geral à produção deproteínas em culturas de células de mamíferos. Particularmente, a presenteinvenção refere-se ao cultivo de células de mamíferos na presença de umcomposto antienvelhecimento, por exemplo, carnosina, para manter a viabi-lidade e aumentar a produtividade com qualidade superior. O cultivo das cé-lulas produziu muitos produtos protéicos. Esses produtos, por exemplo, anti-corpos monoclonais produzidos por hibridoma, podem ser usados para apli-cações terapêuticas, de pesquisa ou outras aplicações. Células animais, no-tavelmente células de mamíferos, são freqüentemente usadas para a produ-ção de proteínas. Infelizmente, a utilização de células animais faz com que oprocesso de produção seja demorado e dispendioso.

A adição de um agente químico a um meio de cultura de célulaspode aumentar a produtividade celular ao induzir que as células produzamum produto, aumentando dessa forma, o rendimento global. O melhor agen-te a ser usado varia, dependendo de diversos fatores, incluindo o produtoprotéico desejado e o tipo de célula. Fatores similares também afetam aquantidade do agente escolhido adicionado e quando o agente é adicionadoao meio de cultura de células. Exemplos de agentes são ácidos ou sais al-canóicos, derivados de uréia ou dimetilsulfóxido (DMSO). Agentes químicos,por exemplo, butirato de sódio, podem ter efeitos diversos sobre a produçãode proteínas. A adição de um agente pode aumentar a produtividade especí-fica das células, mas também pode ter efeitos citotóxicos e pode inibir ocrescimento e a viabilidade das células.À medida que as células produzem uma proteína, tipicamente, aproteína é secretada no meio de cultura de células. A proteína específica, noentanto, não é a única matéria no meio; agregados de alto peso molecular,espécies ácidas e outros materiais também estão freqüentemente no meio, oque pode tornar o processo de purificação mais trabalhoso e dispendioso.São disponíveis técnicas e métodos para melhorar a qualidade do produto,permitindo a purificação de uma proteína mais eficiente; incluindo, dentreoutros, a alteração das condições do biorreator ou a utilização de uma linha-gem celular diferente. No entanto, permanece a necessidade no campo detécnicas e métodos de produção de proteínas que levem a processos depurificação aprimorados.

Portanto, é necessário um agente químico que seja adicionadoao meio de cultura de células que possa aumentar a expressão de uma pro-teína de interesse, ao mesmo tempo em que mantenha a viabilidade celular.É ainda necessário um agente que aumente a qualidade do produto da pro-teína por diminuição da quantidade de agregados de alto peso molecular ede espécies ácidas no meio de cultura de células.Sumário da Invenção

Em certas modalidades, a presente descrição está relacionada aum processo para o aumento da produção de um produto protéico. Por e-xemplo, em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos decultivo de células hospedeiras que expressam uma proteína de interesse emum meio que compreende um composto antienvelhecimento de tal formaque a produção global da proteína de interesse seja aumentada. Em certasmodalidades, um composto antienvelhecimento como esse compreendecarnosina.

Em certas modalidades, a presente invenção fornece composi-ções que aumentam a produção de uma proteína de interesse. Por exemplo,em certas modalidades, a presente invenção fornece um meio de cultura decélulas que compreende um composto antienvelhecimento que aumenta aprodução de uma proteína de interesse expressa em uma célula hospedeira.Em certas modalidades, um composto antienvelhecimento como esse com-preende carnosina. Em certas modalidades, células hospedeiras manipula-das geneticamente são combinadas com um meio de inóculo para formar ummeio de cultura de células, que se desenvolvem em um biorreator. Duranteum ciclo de produção do produto protéico desejado, as condições do biorrea-5 tor podem ser alteradas e/ou podem ser acrescentados suplementos a fimde aumentar a produtividade e/ou manter a viabilidade. Os suplementos po-dem incluir um meio de alimentação e/ou um ou mais aditivos como, por e-xemplo, na presente especificação, carnosina e/ou outros compostos antien-velhecimento.

Células hospedeiras de mamíferos, por exemplo, células de ová-rio de hamster chinês (CHO), podem apresentar uma redução da viabilidadequase no final de um ciclo de produção em um biorreator. Foi descobertoque a adição de um agente antienvelhecimento como, por exemplo, carnosi-na e análogos desta, a um meio de cultura de células ajuda a manter umnúmero de células viáveis e uma viabilidade celular maiores até que a prote-ína seja coletada.

Além disso, métodos para o aumento da produtividade, por e-xemplo, por alteração da temperatura após a fase de crescimento e/ou du-rante a fase de produção do ciclo de produção, podem ser usados de acordocom a presente invenção. Para dar apenas um exemplo, durante a produçãode um produto protéico, especificamente do anticorpo para o fator de dife-renciação do crescimento-8 (GDF-8), a temperatura foi alterada para menospara ajudar a iniciar e aumentar a produtividade. Em certas modalidades, aadição de um composto antienvelhecimento como, por exemplo, carnosina,ajuda a aumentar a produtividade da cultura de células. Em certas modali-dades, um composto antienvelhecimento pode ser adicionado antes, durantee/ou depois dessa mudança da temperatura.

Também foi descoberto que a adição de um composto antienve-lhecimento como, por exemplo, carnosina, a um meio de cultura de célulasaumenta a qualidade global do produto protéico. Durante a produção da pro-teína, agregados de alto peso molecular, juntamente com outras espéciesindesejadas, estão no meio de cultura de células. A adição de carnosina di-minui a quantidade de agregados de alto peso molecular e aumenta a quali-dade do produto. Em certas modalidades, a adição de um composto antien-velhecimento diferente de carnosina diminui o acúmulo desses agregados dealto peso molecular e melhora a qualidade do produto. Em certas modalida-des, é adicionada carnosina em combinação com um ou mais compostosantienvelhecimento adicionais.

A concentração de composto antienvelhecimento (por exemplo,carnosina) adicionada ao meio de cultura de células pode variar, dependen-do de muitos fatores do processo, incluindo, por exemplo, o tipo de célula, oproduto desejado e as condições do biorreator, dentre outros. Além disso,carnosina pode ser substituída por seus análogos; acetil-carnosina, homo-carnosina, anserina e 3-alanina. Em certas modalidades, carnosina é forne-cida em combinação com um ou mais outros compostos antienvelhecimento.Em certas modalidades, a concentração de agente antienvelhecimento (porexemplo, carnosina) em um meio de cultura de células é de cerca de 5 mM acerca de 100 mM. Em certas modalidades, a concentração é de cerca de 10mM a cerca de 40 mM. Em certas modalidades, a concentração é de cercade 20 mM.

Qualquer procedimento de cultivo e meio de inóculo adequadospodem ser usados para o cultivo das células no processo de produção deproteínas. Pode ser usado meio tanto com soro quanto sem soro. Além dis-so, podem ser usados métodos de cultivo para a cultura de células apropria-dos ao tipo de célula e ao produto protéico específicos. Tais procedimentossão conhecidos e compreendidos por aqueles versados na técnica de culturade células.

Outras características e vantagens da invenção ficarão eviden-tes a partir da descrição e das reivindicações seguintes.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1a. Efeito de carnosina sobre picos ácidos para MYO-29.

Figura 1b. Efeito de carnosina sobre agregados de alto peso mo-lecular.

Figura 1c. Efeito de adições de carnosina em dias diferentes so-bre picos ácidos.

Figura 1d. Efeito de adições de carnosina em dias diferentes so-bre agregados de alto peso molecular.

Figura 2a. Efeito de carnosina sobre a densidade diária de célu-las viáveis.

Figura 2b. Efeito de carnosina sobre a viabilidade celular diária.

Figura 2c. Efeito de carnosina sobre a titulação diária.

Figura 2d. Efeito de carnosina sobre a produtividade celular cu-mulativa específica.

Figura 2e. Efeito de carnosina sobre agregados de alto peso mo-lecular.

Figura 3a. Efeito de diferentes concentrações de carnosina so-bre a densidade de células viáveis.

Figura 3b. Efeito de diferentes concentrações de carnosina so-bre a viabilidade celular diária.

Figura 3c. Efeito de diferentes concentrações de carnosina sobrea titulação diária.

Figura 3d. Efeito de diferentes concentrações de carnosina so-bre a produtividade celular cumulativa específica.

Figura 3e. Efeito de diferentes concentrações de carnosina so-bre agregados de alto peso molecular.

Definições

De acordo com uma convenção antiga, os termos "um" e "uma"significam "um ou mais", quando usados neste pedido, incluindo as reivindi-cações. Embora a invenção tenha sido descrita com certo grau de particula-ridade, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações ficarãoaparentes para aqueles versados na técnica à luz desta especificação. Con-seqüentemente, pretende-se que todas essas alternativas, modificações evariações, que se enquadram dentro do espírito e escopo da invenção, se-jam englobadas pelas reivindicações definidas.

O termo "composto antienvelhecimento", como aqui usado, refe-re-se a qualquer agente ou composto que, quando adicionado a uma culturade células, promova a viabilidade, o crescimento e/ou a expectativa de vidade uma célula que nele se desenvolveu. Em certas modalidades, o uso deum composto antienvelhecimento como esse na cultura de células resultaem um aumento da titulação, aumento da produtividade celular específica,aumento da viabilidade celular, aumento da densidade de células viáveisintegradas, diminuição do acúmulo de agregados de alto peso molecular,e/ou diminuição do acúmulo de espécies ácidas que seriam observados sobcondições de cultivo fora isso idênticas desprovidas do composto antienve-lhecimento. Exemplos não Iimitantes de compostos antienvelhecimento quepodem ser usados de acordo com métodos e composições da presente in-venção incluem camosina, acetil-carnosina, homocarnosina, anserina e 3-alanina. Em certas modalidades, podem ser usados dois ou mais compostosantienvelhecimento de acordo com as composições e os métodos da pre-sente invenção.

A expressão "célula hospedeira" refere-se às células que sãocapazes de ser geneticamente manipuladas e/ou são capazes de crescimen-to e sobrevida em um meio de cultura de células. Tipicamente, as célulaspodem expressar uma grande quantidade de uma proteína endógena ouheteróloga de interesse, e podem tanto reter a proteína quanto secretá-la nomeio de cultura de células.

As células hospedeiras são tipicamente "células de mamíferos",que compreendem exemplos não Iimitantes de células de vertebrados, inclu-indo células de rim de filhote de hamster (BHK), de ovário de hamster chinês(CHO), de rim humano (293), diplóides fetais normais de macaco rhesus (F-RhL-2), e de mieloma de murídeo (por exemplo, SP2/0 e NSO). Aqueles ver-sados na técnica conhecerão outras células hospedeiras que possam serusadas de acordo com os métodos e as composições da presente invenção.

O termo "meio de cultura de células" refere-se a uma soluçãoque contém nutrientes para apoiar a sobrevida celular sob condições nasquais as células podem crescer e produzir uma proteína desejada. A expres-são "meio de inoculação" ou "meio de inóculo" refere-se a uma solução ousubstância que contém nutrientes na qual uma cultura de células é iniciada.Em certas modalidades, um "meio de alimentação" contém nutrientes simila-res ao meio de inoculação, mas é uma solução ou substância com a qual ascélulas são alimentadas após o início da cultura. Em certas modalidades, ummeio de alimentação contém um ou mais componentes que não estão pre-sentes em um meio de inoculação. Em certas modalidades, um meio de ali-mentação é desprovido de um ou mais componentes presentes em um meiode inoculação. Aqueles versados na técnica de cultivo de células saberão,sem experimentação desnecessária, quais componentes constituem os mei-os de inoculação e alimentação. Tipicamente, essas soluções fornecem a-minoácidos essenciais e não essenciais, vitaminas, fontes de energia, lipí-deos e elementos residuais necessários para que uma célula cresça e so-breviva. Em certas modalidades, um meio de inoculação, um meio de ali-mentação ou ambos compreendem um composto antienvelhecimento.

O termo "característica da cultura de células", como aqui usado,refere-se a uma característica observável e/ou mensurável de uma culturade células. Os métodos e as composições da presente invenção são usadosvantajosamente para melhorar uma ou mais características da cultura decélulas. Em certas modalidades, a melhora de uma característica da culturade células compreende o aumento da magnitude de uma característica daícultura de células. Em certas modalidades, a melhora de uma característicada cultura de células compreende a diminuição da magnitude de uma carac-terística da cultura de células. Como exemplos não limitantes, uma caracte-rística da cultura de células pode ser a titulação, a produtividade celular es-pecífica, a viabilidade celular, a densidade de células viáveis integradas, oacúmulo de agregados de alto peso molecular, e/ou o acúmulo de espéciesácidas. Aqueles versados na técnica conhecerão outras características dacultura de células que podem ser melhoradas com o uso dos métodos e dascomposições da presente invenção.

O termo "meio definido", como aqui usado, refere-se a um meiono qual a composição do meio é conhecida e controlada. Meios definidosnão contêm aditivos complexos, tais como soro ou hidrolisados que contêmcomponentes desconhecidos e/ou não controlados.O termo "meio complexo", como aqui usado, refere-se a ummeio que contém pelo menos um componente cuja identidade ou quantidadeé desconhecida ou não controlada.

A expressão "linhagem celular" refere-se, geralmente, às célulashospedeiras primárias que expressam uma proteína de interesse. Em algu-mas modalidades, as células foram transfectadas com DNA exógeno quecodifica uma proteína desejada e/ou que contém seqüências de controle queativam a expressão de seqüências ligadas, sejam elas endógenas ou heteró-logas. Em certas modalidades, as células derivadas dessas células geneti-camente modificadas formam uma linhagem celular e são colocadas em ummeio de cultura de células para crescer e produzir o produto protéico. Emcertas modalidades, uma linhagem celular compreende células hospedeirasprimárias que não foram transfectadas com DNA exógeno e expressam umaproteína endógena de interesse.

A "fase de crescimento" de um meio de cultura de células refere-se ao período quando as células estão passando por divisão rápida e cres-cem exponencialmente, ou quase exponencialmente. Tipicamente, as célu-las são cultivadas em condições otimizadas para o crescimento celular porgeralmente 1-4 dias. As condições da fase de crescimento podem incluiruma temperatura em torno de 35°C a 42°C, geralmente em torno de 37°C. Aduração da fase de crescimento e das condições de cultivo na fase de cres-cimento pode variar, mas é geralmente conhecida por aqueles versados natécnica de cultura de células. Em certas modalidades, um meio de cultura decélulas em uma fase de crescimento é suplementado com um meio de ali-mentação.

A "fase de transição" ocorre durante o período quando o meio decultura de células está sendo alterado das condições consistentes com afase de crescimento para condições consistentes com a fase de produção.Durante a fase de transição, fatores como a temperatura, dentre outros, sãofreqüentemente alterados. Em certas modalidades, um meio de cultura decélulas em uma fase de transição é suplementado com um meio de alimen-tação.A "fase de produção" ocorre após tanto a fase de crescimentoquanto a fase de transição. O crescimento exponencial das células já termi-nou e a produção de proteínas é o objetivo principal. O meio de cultura decélulas pode ser suplementado para iniciar a produção. Em certas modalida-des, um meio de cultura de células em uma fase de produção é suplementa-do com um meio de alimentação. Além disso, a temperatura do meio de cul-tura de células durante a fase de produção pode ser menor, geralmente, doque durante a fase de crescimento, o que tipicamente estimula a produção.A fase de produção continua até que um ponto final desejado seja alcança-do.

A expressão "densidade de células viáveis" refere-se ao númerototal de células que sobrevivem no meio de cultura de células em um volumeem particular, geralmente por microlitro (ml). A expressão "viabilidade celu-lar" refere-se ao número de células que estão vivas, comparado ao númerototal de células, tanto mortas quanto vivas, expresso como uma percenta-gem.

"Densidade de células viáveis integradas", "IVCD": os termos"densidade de células viáveis integradas" ou "IVCD", como aqui usados, re-ferem-se à densidade média de células viáveis ao longo do período da cultu-ra, multiplicada pela quantidade de tempo em que a cultura foi executada.Quando a quantidade de proteína produzida é proporcional ao número decélulas viáveis presentes ao longo do período da cultura, a densidade decélulas viáveis integradas é uma ferramenta útil para se estimar a quantida-de de proteína produzida ao longo do período da cultura.

O termo "agregados de alto peso molecular" refere-se, geral-mente, a proteínas dobradas erroneamente ou a uma associação imprópriade pelo menos dois polipeptídeos. A associação pode surgir por qualquermétodo, incluindo, sem limitação, reticulação covalente, não covalente, dis-sulfeto, ou não redutível. Em certas modalidades, os métodos e as composi-ções da presente invenção são vantajosamente utilizados para reduzir o a-cúmulo de agregados de alto peso molecular.

O termo "antioxidante" refere-se a um composto que pode evitaro dano oxidativo aos lipídeos, proteínas, DNA e outras macromoléculas es-senciais por bloqueio dos radicais livres.

Como aqui usado, o termo "anticorpo" inclui uma proteína quecompreende pelo menos um, e tipicamente dois, domínios VH, ou porçõesdestes, e/ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios VL, ou porçõesdestes. Em certas modalidades, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeiaspesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, em queas cadeias pesadas e leves de imunoglobulina estão interconectadas por,por exemplo, ligações dissulfeto. Os anticorpos, ou uma porção destes, po- dem ser obtidos de qualquer origem, incluindo, sem limitação, roedores, pri-matas (por exemplo, primatas humanos e não humanos), camelídeos, alémde anticorpos produzidos de forma recombinante, por exemplo, anticorposquiméricos, humanizados e/ou gerados in vitro, como aqui descritos commais detalhes.

Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo"fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem, sem limitação,(i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domíniosVL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente quecompreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1;(iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braçode um anticorpo, (v) um fragmento dAb, que consiste em um domínio VH;(vi) um domínio variável de camelídeo ou camelizado; (vii) uma Fv de cadeiaúnica (scFv); (viii) um anticorpo biespecífico; e (ix) um ou mais fragmentos de uma molécula de imunoglobulina fundidos a uma região Fc. Além disso,embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados porgenes separados, eles podem ser unidos com o uso de métodos recombi-nantes por um vinculador sintético que permite que eles sejam feitos comouma cadeia de proteína única na qual as regiões VL e VH se unem para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única(scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-26; Huston etal. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5.879-83). Pretende-se que essesanticorpos de cadeia única também sejam englobados dentro do termo"fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos po-dem ser obtidos com o uso de técnicas convencionais conhecidas para a-queles versados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à funçãoda mesma forma que ocorre com os anticorpos intactos.

O "fragmento de ligação de antígeno" pode, opcionalmente, ain-da incluir uma porção que aumenta uma ou mais características, por exem-plo, estabilidade, função de célula efetora, ou fixação de complemento. Porexemplo, o fragmento de ligação de antígeno pode ainda incluir a porçãopeguilada, albumina ou uma região constante da uma cadeia pesada e/ouleve.

Com exceção dos anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais",entende-se que todos os sítios de ligação a um anticorpo são idênticos. Umanticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo artificial híbrido quepossui dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligaçãodiferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de diver-sos métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou da ligação de fragmentosFab'. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et ai, J. Immunol. 148, 1.547-1.553 (1992).

Estão disponíveis vários métodos conhecidos por aqueles ver-sados na técnica para a obtenção de anticorpos ou fragmentos de ligação deantígeno destes. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzi-dos por geração de hibridomas de acordo com métodos conhecidos. Hibri-domas formados dessa forma são tipicamente rastreados com o uso de mé-todos padronizados como, por exemplo, o ensaio imunoabsorvente ligado àenzima (ELISA) e análise por ressonância por plasmônio de superfície (Bia-core®), para a identificação de um ou mais hibridomas que produzem umanticorpo que se liga especificamente a um antígeno especificado. Qualquerforma do antígeno especificado pode ser usada como imunógeno, por e-xemplo, antígeno recombinante, formas de ocorrência natural, quaisquervariantes ou fragmentos destas, além de peptídeo antigênico destas.

Um método exemplar de produção de anticorpos inclui o rastre-amento de bibliotecas de expressão de proteína, por exemplo, bibliotecas deexibição de fago ou ribossomo. A exibição de fago é descrita, por exemplo,em Ladner et al., Patente U.S. Nq 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1.315-1.317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679;

WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809.

Além do uso de bibliotecas de exibição, o antígeno especificadopode ser usado para imunizar um animal não humano, por exemplo, um roe-dor, por exemplo, um camundongo, hamster ou rato. Em certas modalida-des, o animal não humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imu-noglobulina humana. Por exemplo, é possível projetar cepas de camundon-go deficientes na produção de anticorpos de camundongo com grandesfragmentos de Ioci de Ig humana. Com o uso da tecnologia de hibridoma,podem ser produzidos e selecionados anticorpos monoclonais com especifi-cidade de antígeno, derivados dos genes com a especificidade desejada.Vide, por exemplo, XENOMOUSE®, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, U.S. 2003- 0070185, WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de1996, e Pedido PCT N2 PCT/US96/05928, depositado em 29 de abril de1996.

Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal é obtido doanimal não humano, e depois modificado, por exemplo, o anticorpo humani-zado, desimunizado, quimérico, pode ser produzido com o uso de tecnologi-as de DNA recombinante conhecidas na técnica. Foram descritas várias a-bordagens para a produção de anticorpos quiméricos. Vide, por exemplo,Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81: 6.851, 1985; Takeda et al.,Nature 314: 452, 1985, Cabilly et al., Patente U.S. N9 4.816.567; Boss et al.,Patente U.S. N- 4.816.397; Tanaguchi et al., Publicação de Patente Euro-péia EP171496; Publicação de Patente Européia 0173494, Patente do ReinoUnido GB 2177096B. Anticorpos humanizados também podem ser produzi-dos, por exemplo, com o uso de camundongos transgênicos que expressamgenes da cadeia pesada e leve humana, mas que são incapazes de expres-sar os genes endógenos da cadeia pesada e leve da imunoglobulina de ca-mundongo. Winter descreve um método exemplar de enxerto de CDR (regi-ão determinante de complementaridade) que pode ser usado para a prepa-ração dos anticorpos humanizados aqui descritos (Patente U.S. No5.225.539). Todas as CDRs de um anticorpo humano em particular podemser substituídas por pelo menos uma porção de uma CDR não humana, ouapenas algumas das CDRs podem ser substituídas por CDRs não humanas.Só é necessário substituir o número de CDRs necessário para a ligação doanticorpo humanizado a um antígeno predeterminado.

Anticorpos humanizados ou fragmentos destes podem ser gera-dos por substituição das seqüências do domínio variável Fv que não estejamenvolvidas diretamente na ligação de antígeno com seqüências equivalentesde domínios variáveis Fv humanos. Métodos exemplares para a geração deanticorpos humanizados ou fragmentos destes são fornecidos por Morrison(1985) Science 229: 1.202-1.207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214;e pelas Patentes U.S. Nos 5.585.089, U.S. 5.693.761, U.S. 5.693.762, U.S.5.859.205 e U.S. 6.407.213. Esses métodos incluem o isolamento, a mani-pulação e a expressão das seqüências de ácidos nucléicos que codificamtodos ou parte dos domínios variáveis Fv de imunoglobulina de pelo menosuma entre uma cadeia pesada ou leve. Esses ácidos nucléicos podem serobtidos por um hibridoma que produz um anticorpo contra um alvo prede-terminado, como descrito acima, bem como de outras fontes. Um DNA re-combinante que codifica uma molécula de anticorpo humanizado pode entãoser clonado em um vetor de expressão apropriado.

Em certas modalidades, um anticorpo humanizado é otimizadopela introdução de substituições conservadoras, substituições de seqüênciade consenso, substituições de linhagem germinativa e/ou retromutações.Essas moléculas de imunoglobulina alteradas podem ser feitas por qualqueruma das várias tecnologias conhecidas na técnica (por exemplo, Teng et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7.308-7.312, 1983; Kozbor et al., Immuno-Iogy Today, 4: 7.279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), epodem ser feitas de acordo com as técnicas da Publicação PCT WO92/06193 ou EP 0239400.

Um anticorpo ou fragmento deste também pode ser modificadopor eliminação específica de epitopos de célula T humana ou "desimuniza-ção" pelos métodos apresentados em WO 98/52976 e WO 00/34317. Resu-midamente, os domínios variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpopodem ser analisados quanto aos peptídeos que se ligam ao MHC da Clas-se II; esses peptídeos representam epitopos de célula T potenciais (comodefinido em WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de potenciaisepitopos de célula T, pode ser aplicada uma abordagem de modelagem emcomputador denominada "encadeamento de peptídeos" e, além disso, umabase de dados de peptídeos de ligação do MHC humano da Classe Il podeser pesquisada em busca de motivos presentes nas seqüências de VH e VL,como descrito em WO 98/52976 e WO 00/34317. Esses motivos se ligam aqualquer um dos 18 alótipos DR principais do MHC da Classe Il e, assim,constituem potenciais epitopos de célula T. Os epitopos potenciais de célulaT detectados podem ser eliminados por substituição de pequenos númerosde resíduos de aminoácidos nos domínios variáveis ou, de preferência, porsubstituições simples de aminoácido. Tipicamente, são feitas substituiçõesconservadoras. Freqüentemente, mas não exclusivamente, pode ser usadoum aminoácido comum em uma posição em seqüências de anticorpos dalinhagem germinativa humana. Seqüências da linhagem germinativa huma-na, por exemplo, são descritas em Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242;Chothia, D. etal. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; e Tomlinson et ai (1995)EMBO J. 14: 4.628-4.638. O diretório V BASE fornece um diretório abran-gente de seqüências da região variável de imunoglobulina humana (compi-lado por Tomlinson, I.A. et ai "MRC Centre for Protein Engineering", Cam-bridge, UK). Essas seqüências podem ser usadas como uma fonte de se-qüência humana, por exemplo, para regiões estruturais e CDRs. Regiõesestruturais humanas de consenso também podem ser usadas, por exemplo,como descrito na Patente U.S. 6.300.064.

Em certas modalidades, um anticorpo contém uma região cons-tante ou Fc de imunoglobulina alterada. Por exemplo, um anticorpo produzi-do de acordo com os ensinamentos aqui apresentados pode se ligar maisfortemente ou com mais especificidade às moléculas efetoras como, por e-xemplo, complemento e/ou receptores Fc, que podem controlar várias fun-ções imunológicas do anticorpo, por exemplo, atividade de célula efetora,lise, atividade mediada por complemento, depuração do anticorpo, e meia-vida do anticorpo. Receptores Fc típicos que se ligam a uma região Fc deum anticorpo (por exemplo, um anticorpo IgG) incluem, sem limitação, recep-tores das subclasses FcyRí, FcyRII e FcyRIII e FcRn, incluindo variantes alé-Iicas e, alternativamente, formas unidas desses receptores. Receptores Fcsão revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92, 1991;Capei et al., Immunomethods 4: 25-34,1994; e em Haas et ai, J. Lab. Clin.Med. 126: 330-41, 1995.

O termo "biorreator" refere-se a um vaso no qual um meio decultura de células pode estar contido e cujas condições internas podem sercontroladas durante o período de cultivo, por exemplo, pH e temperatura.

Uma "cultura em batelada alimentada" refere-se a um método decultivo de células no qual inicialmente as células são inoculadas em um bior-reator com um meio de inóculo. O meio de cultura de células é então suple-mentado em um ou mais pontos ao longo do ciclo de produção com um meiode alimentação contendo componentes nutricionais e/ou outros suplemen-tos.

Uma "cultura em batelada" refere-se a um método de cultivo decélulas em que as células são inoculadas em um biorreator com todos osnutrientes e suplementos necessários para todo o ciclo de produção. Nãosão feitas adições de nutrientes ao meio de cultura de células por toda a du-ração da produção.

Uma "cultura de perfusão" refere-se a um método de cultivo decélulas que é diferente de um método de cultura em batelada ou em batela-da alimentada, no qual a cultura não é terminada, ou não é necessariamenteterminada, antes do isolamento e/ou purificação da proteína expressa deinteresse, e no qual novos nutrientes e outros componentes são periódica oucontinuamente adicionados à cultura, durante o qual a proteína expressa éperiódica ou continuamente coletada. A composição dos nutrientes adicio-nados pode ser alterada durante a evolução da cultura de células, depen-dendo das necessidades das células, das necessidades para uma produçãoótima de proteínas, e/ou de qualquer um dentre diversos outros fatores co-nhecidos por aqueles versados na técnica.

O termo "expressão" refere-se à transcrição e à tradução queocorrem dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressão está rela-cionado, geralmente, à quantidade de proteína que está sendo produzidapela célula hospedeira.

Os termos "proteína" ou "produto protéico" referem-se a uma oumais cadeias de aminoácidos. Como aqui usado, o termo "proteína" é sinô-nimo de "polipeptídeo" e, como geralmente é compreendido na técnica, refe-re-se a pelo menos uma cadeia de aminoácidos ligada através de ligaçõespeptídicas seqüenciais. Em certas modalidades, uma "proteína de interesse"é uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucléico exógena quefoi transformada em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, uma"proteína de interesse" é uma proteína codificada por uma molécula de ácidonucléico que é endógena à célula hospedeira. Em certas modalidades, aexpressão dessa proteína endógena de interesse é alterada por transfecçãode uma célula hospedeira com uma molécula exógena de ácido nucléico quepode conter, por exemplo, uma ou mais seqüências reguladoras e/ou quecodifica uma proteína que aumenta a expressão da proteína de interesse.Os métodos e as composições da presente invenção podem ser usados pa-ra a produção de qualquer proteína de interesse, incluindo, sem limitação,proteínas que possuam propriedades terapêuticas, farmacêuticas, diagnósti-cas, agrícolas e/ou qualquer uma dentre diversas outras propriedades quesão úteis em aplicações comerciais, experimentais e/ou outras aplicações.Em certas modalidades, as proteínas produzidas com a utilização dos méto-dos e/ou das composições da presente invenção podem ser processadase/ou modificadas. Por exemplo, uma proteína a ser produzida de acordo coma presente invenção pode ser glicosilada.

"Produtividade celular específica" e similares referem-se à taxade expressão de produto específica como, por exemplo, por célula. A produ-tividade celular específica é geralmente medida em microgramas de proteínaproduzidos por 106 células por dia, ou em picogramas de proteína produzi-dos por 106 células por dia.

O termo "titulação", como aqui usado, refere-se à quantidadetotal de proteína expressa de forma recombinante produzida por uma culturade células em certa quantidade de volume de meio. A titulação é tipicamenteexpressa em unidades de miligramas ou microgramas de proteína por milili-tro de meio.

Aqueles versados na técnica reconhecerão que os métodos aquidescritos podem ser usados para o cultivo de muitas das células de mamífe-ros sabidamente conhecidas usadas e cultivadas rotineiramente na técnica,ou seja, os métodos aqui descritos não se limitam ao uso apenas com a pre-sente invenção.

Descrição Detalhada de Certas Modalidades da Invenção

Foi descoberto que o uso de um composto antienvelhecimentocomo, por exemplo, carnosina, modifica a viabilidade e a produtividade deuma cultura de células. Por exemplo, a adição de carnosina mantém a viabi-lidade celular, e aumenta a produtividade de células, e melhora a qualidadedo produto protéico desejado. A carnosina é um antioxidante e um compostoantienvelhecimento que também é um dipeptídeo de ocorrência natural pre-sente em níveis elevados (até 20 mM) nos tecidos musculares e nervososem animais. Sendo um antioxidante, a carnosina também é um limpador deradical livre e um inibidor da glicação. Geralmente, a carnosina transformaespécies reativas em espécies não reativas, protegendo, desse modo, prote-ínas, DNA e outras macromoléculas essenciais. Como composto antienve-lhecimento, a carnosina pode prolongar a expectativa de vida de fibroblastosdiplóides humanos e fibroblastos diplóides fetais pulmonares humanos (li-nhagens celulares primárias) em uma concentração de 20 mM em meios decultura. A presente invenção engloba o achado surpreendente de que é van-tajosa a utilização de um composto antienvelhecimento (incluindo, sem limi-tação, carnosina) na cultura de células para a produção de uma proteína deinteresse. Em certas modalidades, o uso de um composto antienvelhecimen-to como esse na cultura de células para a produção de uma proteína de inte-resse resulta no aprimoramento de uma ou mais características da culturade células, incluindo, sem limitação, o aumento da titulação, o aumento daprodutividade celular específica, o aumento da viabilidade celular, o aumentoda densidade de células viáveis integradas, a diminuição do acúmulo de a -gregados de alto peso molecular, e/ou a diminuição do acúmulo de espéciesácidas.

Foi demonstrado que a carnosina é citotóxica para células trans-formadas e neoplásicas humanas ou de roedores em Meio Essencial Mínimo(MEM, Sigma), que possui níveis de glicose mais baixos, mas não em Meiode Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma), que contém 1 mM depiruvato (Holliday et ai, Biochemistry (Moscou), 65: 843-848, 846). Além dis-so, soro fetal dialisado de bezerro com compostos de baixo peso molecularremovidos aumentou os efeitos citotóxicos da carnosina. Id. Foi determinadotambém que 1 mM de oxaloacetato e 1 mM de α-cetoglutarato tinham efeitoscomparáveis ao piruvato, nenhum dos quais sendo um componente dosmeios de inóculo ou de alimentação usados com os exemplos de carnosina.ld. O piruvato de sódio, no entanto, é um componente original no meio deinóculo em uma concentração de 0,5 mM, não para as adições de carnosina,mas sim para melhor simular as condições in vivo em um sistema de biorrea-tor, e como uma fonte de energia alternativa potencial. O meio de inóculotambém não possui soro, o que implicaria em que a carnosina tivesse efeitoscitotóxicos. De acordo com a referência, a adição de carnosina a um meio decultura de células teria efeitos citotóxicos similares aos observados no meioMEM em Holliday. Pela utilização dos métodos e/ou das composições dapresente invenção, essa citotoxicidade é reduzida ou eliminada, e a viabili-dade celular e a produção de proteínas são aumentadas.

Em certas modalidades, a carnosina é fornecida em um meio decultura de células em uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de100 mM. Em certas modalidades, a carnosina é fornecida em um meio decultura de células em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 40mM, por exemplo, em uma concentração de cerca de 20 mM. Em certasmodalidades, a carnosina é fornecida em um meio de cultura de células emuma concentração de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, ou mais. Em certas modalidades, essas concentrações decarnosina são obtidas na cultura de células por adição de carnosina váriasvezes durante o processo de cultura de células, por exemplo, em um oumais meios de alimentação. A concentração de carnosina utilizada dependedo meio de cultura de células e da linhagem celular usados, dentre outros fatores, incluindo os efeitos desejados sobre a linhagem celular ou produtodesejado. Análogos de carnosina, por exemplo, acetil-carnosina, homo-carnosina, anserina e 3-alanina, também podem ser usados em um meio decultura de células para um efeito similar. Um ou mais desses análogos po-dem ser fornecidos em um meio de cultura de células. Em certas modalida- des, esses análogos são fornecidos em um meio de cultura de células des-provido de carnosina. Em certas modalidades, esses análogos são forneci-dos em um meio de cultura de células em combinação com carnosina. Emcertas modalidades, esses análogos são fornecidos em uma concentraçãode cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mM, oumais.

Em certas modalidades, a fim de produzir uma proteína de inte-resse, inicialmente as células hospedeiras são transfectadas ou transforma- das com DNA exógeno que codifica uma proteína para gerar células trans-formadas, o que produz constitutivamente o produto protéico desejado. Emcertas modalidades, uma molécula de ácido nucléico introduzida na célulacodifica a proteína desejada a ser expressa de acordo com a presente in-venção. Em certas modalidades, uma molécula de ácido nucléico contém uma seqüência reguladora ou codifica um produto gênico que induz ou au-menta a expressão da proteína desejada pela célula. Como exemplo nãolimitante, um produto gênico desse tipo pode ser um fator de transcrição queaumenta a expressão da proteína de interesse.

Em certas modalidades, um ácido nucléico que dirige a expres-são de uma proteína é introduzido estavelmente na célula hospedeira. Emcertas modalidades, um ácido nucléico que dirige a expressão de uma prote-ína é introduzido transitoriamente na célula hospedeira. Aqueles versados natécnica serão capazes de escolher se a introdução do ácido nucléico deveser feita estável ou transitoriamente na célula com base nas necessidadesexperimentais, comerciais, ou em outras necessidades.

Um gene que codifica uma proteína de interesse pode opcional-mente ser ligado a um ou mais elementos reguladores de controle genético.Em algumas modalidades, um elemento de controle genético dirige a ex-pressão constitutiva da proteína. Em algumas modalidades, pode ser usadoum elemento de controle genético que permite a expressão indutível de umgene que codifica a proteína de interesse. O uso de elemento de controlegenético indutível (por exemplo, um promotor indutível) permite a modulaçãoda produção da proteína na célula. Exemplos não Iimitantes de elementos decontrole genético indutíveis potencialmente úteis para uso em células euca-rióticas incluem elementos regulados por hormônios (vide, por exemplo, Ma-der, S. e White, J.H., Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A. 90: 5.603-5.607, 1993),elementos regulados por Iigante sintético (vide, por exemplo, Spencer, D.M.et al., Science 262: 1.019-1.024, 1993) e elementos regulados por radiaçãoionizante (vide, por exemplo, Manome,Y. et al, Biochemistry 32: 10.607-10.613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 10.149-10.153, 1992). Outros sistemas reguladores com especificidade celular ououtros sistemas reguladores conhecidos na técnica podem ser usados deacordo com os métodos e as composições aqui descritos.

Qualquer célula hospedeira suscetível à cultura de células e àexpressão de proteínas pode ser utilizada de acordo com a presente inven-ção. As células hospedeiras são geralmente células de mamíferos, mais par-ticularmente células animais como, por exemplo, células de ovário de hams-ter chinês (CHO). Outros exemplos não Iimitantes de células de mamíferosque podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem linha-gem de mieloma de camundongo BALB/c (NSO/I, ECACC N°: 85110503);retinoblastos humanos (PÊR.C6 (CruCell, Leiden, Países Baixos)); linhagemde rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651);linhagem embriológica de rim humano (células 293 ou 293 subclonadas parao crescimento em cultura de suspensão, Graham et ai., J. Gen Virol., 36: 59(1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); célulasde ovário de hamster chinês +/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. NatLAcad. Sei. U.S.A., 77: 4.216 (1980)); células de sertoli de camundongos(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco(CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76,ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de ratobúfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138,ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor ma-mário de camundongos (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Matheret ai., Armais N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; célulasFS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Qualquer proteína que seja passível de expressão em uma célu-la hospedeira pode ser produzida de acordo com os métodos e as composi-ções da presente invenção. A proteína pode ser expressa a partir de um ge-ne que seja endógeno à célula hospedeira, ou a partir de um gene heterólo-go que é introduzido na célula hospedeira. A proteína pode ser aquela queocorre na natureza, ou pode, alternativamente, ter uma seqüência que foiprojetada ou selecionada pela mão do homem. Uma proteína a ser produzi-da pode ser montada a partir de vários fragmentos de proteína que ocorremindividualmente na natureza. Adicional ou alternativamente, a proteína proje-tada pode incluir um ou mais fragmentos que não são de ocorrência natural.

Em certas modalidades, os métodos e as composições da pre-sente invenção são empregados para expressar uma enzima, um receptor,anticorpo, hormônio, fator regulador, antígeno, agente de ligação etc. farma-cêutica ou comercialmente relevantes. No exemplo presente, as células ma-nipuladas geneticamente produzem um anticorpo contra o fator de diferenci-ação do crescimento-8 (GDF-8). Modalidades ilustrativas não Iimitantes sãodenominadas Myo29, Myo28 e Myo22. Essas modalidades exemplares sãofornecidas na forma de isótopos de IgG humana. Os exemplos não Iimitantesdescritos utilizam My029 coberto pela patente N2 WO 2004/037861 intitula-da "Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Thereof", que é aquiincorporada por referência. Aqueles versados na técnica conhecerão outrasproteínas úteis e/ou desejáveis que podem ser expressas de acordo com osmétodos e as composições da presente invenção.

As linhagens celulares podem ser cultivadas com o uso dé di-versas técnicas para a produção do produto protéico desejado. A cultura decélulas pode ser feita em pequena ou grande escala, dependendo da finali-dade do meio de cultura de células ou do uso do produto. Por exemplo, ascélulas podem crescer em um biorreator. Em certas modalidades, o volumedo biorreator é de pelo menos 1 litro e pode ser de 10, 100, 250, 500, 1.000,2.500, 5.000, 8.000, 10.000, 12.000 litros ou mais, ou qualquer volume entreesses. Além disso, os biorreatores que podem ser usados incluem, sem limi-tação, um biorreator de tanque agitado, um reator de leito fluidificado, umbiorreator de fibra oca, ou frscos rotativos "roller bottle". Os sistemas tam-bém podem operar em modo em batelada, em batelada alimentada, ou con-tínuo/perfusão. O biorreator e o modo pelo qual se controla e monitora omeio de cultura de células serão conhecidos por aqueles versados na técni-ca de cultura de células. No exemplo presente, o sistema utilizado é um bior-reator de tanque agitado e operado em modo de batelada alimentada.

O biorreator é geralmente semeado com um meio de inóculo euma linhagem celular escolhida, por exemplo, uma linhagem celular MYO-29, que pode ser transfectada para expressar e produzir estavelmente oproduto protéico desejado. Pode ser usado um meio disponível comercial-mente como, por exemplo, Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), F10 deHam (Sigma) ou Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma)como o meio de base. Esses meios de base podem então ser suplementa-dos com aminoácidos, vitaminas, elementos residuais e/ou outros compo-nentes para a produção dos meios de inóculo ou de alimentação usados du-rante o ciclo de produção. Em certas modalidades, um meio de base é alte-rado para permitir o crescimento robusto das células, para aumentar a viabi-lidade celular, para aumentar a produtividade celular, para aumentar a den-sidade de células viáveis integradas, e/ou para melhorar a qualidade da pro-teína produzida na presença de carnosina. Por exemplo, um meio de basepode ser suplementado com piruvato, oxaloacetato e/ou a-cetoglutarato.Aqueles versados na técnica serão capazes de alterar um meio de base pa-ra uso com os métodos e as composições da presente invenção, sem expe-rimentação desnecessária.

Em certas modalidades, as células são cultivadas em qualquerum dentre os vários meios quimicamente definidos que contêm um compos-to antienvelhecimento, em que os componentes dos meios são conhecidos econtrolados. Por exemplo, meios definidos tipicamente não contêm aditivoscomplexos como, por exemplo, soro ou hidrolisados. Em certas modalida-des, as células são cultivadas em qualquer um dentre os vários meios com-plexos que contêm um composto antienvelhecimento, nos quais nem todosos componentes do meio são conhecidos e/ou controlados. Em certas moda-lidades, um composto antienvelhecimento como esse compreende carnosi-na.

As condições do biorreator são controladas tipicamente, com opH ajustado entre cerca de 6,5 a cerca de 7,5. O pH é ajustado com a utili-zação de um ácido, geralmente CO2, ou uma base, por exemplo, bicarbona-to de sódio. O oxigênio dissolvido é controlado entre cerca de 5 e 90% desaturação do ar, e a temperatura é mantida entre 30°C a 42°C, durante afase de crescimento. Aqueles versados na técnica de cultivo de células po-dem modificar as condições do biorreator com base na linhagem celular enos métodos empregados para se obter os resultados desejados, sem expe-rimentação desnecessária.

As composições e os métodos da presente invenção podem serusados com qualquer método ou sistema de cultura de células que sejacompatível com a expressão de proteínas. Por exemplo, as células que ex-pressam uma proteína de interesse podem crescer em culturas em bateladaou em batelada alimentada, em que a cultura é terminada após expressãosuficiente da proteína, quando então a proteína expressa é coletada e, op-cionalmente, purificada. Alternativamente, as células que expressam umaproteína de interesse podem crescer em culturas de perfusão, em que a cul-tura não é terminada, e novos nutrientes e outros componentes são periódi-ca ou continuamente adicionados à cultura, e durante esse período a proteí-na expressa é periódica ou continuamente coletada.

Após as células serem semeadas, elas atravessam uma fase decrescimento, durante a qual o número de células geralmente aumenta expo-nencialmente. Durante a fase de crescimento, a temperatura ou as faixas detemperaturas da cultura de células serão selecionadas com base primaria-mente nas temperaturas ou faixas de temperaturas nas quais a cultura decélulas permanece viável, nas quais um nível elevado de proteína é produzi-do, nas quais a produção ou o acúmulo de produtos metabólicos indesejá-veis é minimizado, e/ou qualquer combinação destes ou de outros fatoresconsiderados importantes pelo profissional. Como exemplo não limitante,células CHO crescem bem e produzem níveis elevados de proteína em a -proximadamente 37°C. Em geral, a maioria das células de mamíferos crescebem e/ou pode produzir níveis elevados de proteína dentro de uma faixa decerca de 25°C a 42°C, embora os métodos ensinados pela presente especi-ficação não sejam limitados por essas temperaturas. Certas células de ma-míferos crescem bem e/ou podem produzir níveis elevados de proteína den-tro da faixa de cerca de 35°C a 40°C. Em certas modalidades, a cultura decélulas cresce em uma temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45°C, em uma oumais vezes durante a fase de crescimento. Aqueles versados na técnica se-rão capazes de selecionar a temperatura ou a faixa de temperaturas apro-priada na qual as células crescem, dependendo das necessidades das célu-las e das necessidades de produção do profissional.

Após a fase de crescimento, ocorre uma fase de transição du-rante a qual as células se adaptam a quaisquer mudanças que ocorram nasvizinhanças como, por exemplo, uma mudança de temperatura. As mudan-ças que ocorrem são tipicamente parâmetros para a fase de produção. Nosexemplos presentes, no 4- dia, a temperatura diminuiu de cerca de 37°Cpara cerca de 31 °C. A mudança de temperatura, no entanto, pode ocorremais de uma vez, e não precisa ser necessariamente uma diminuição. Alémdisso, a fase de transição e a mudança de temperatura podem ocorrer emqualquer dia durante o ciclo de produção. Embora a maioria dos métodos deprodução inclua processos multifases, a carnosina também pode ser utiliza-da em um processo de fase única.

Quando se muda a temperatura da cultura, a mudança de tem-peratura pode ser relativamente gradual. Por exemplo, pode demorar váriashoras ou dias até o término da mudança de temperatura. Alternativamente, amudança de temperatura pode ser relativamente abrupta. A temperatura po-de ser aumentada ou diminuída de forma constante durante o processo decultura. Alternativamente, a temperatura pode ser aumentada ou diminuídaem quantidades distintas em vários momentos durante o processo de cultu-ra. As temperaturas ou faixas de temperaturas subseqüentes podem sermenores ou maiores do que as temperaturas ou faixas de temperaturas ini-ciais ou prévias. Aqueles versados na técnica entenderão que múltiplas mu-danças distintas de temperatura são englobadas nessas modalidades. Porexemplo, a temperatura pode ser mudada uma vez (para uma temperaturaou faixa de temperaturas tanto maior quanto menor), e as células mantidasnessa temperatura ou nessa faixa de temperaturas por certo período detempo, quando então a temperatura pode ser mudada novamente para umanova temperatura ou faixa de temperaturas, que pode ser maior ou menor doque a temperatura ou faixa de temperaturas da temperatura ou faixa de tem-peraturas prévia. A temperatura da cultura após cada mudança distinta podeser constante ou pode ser mantida dentro de certa faixa de temperaturas.

Finalmente, há a fase de produção, em que o número de célulasnão aumenta substancialmente, mas, em vez disso, as células produzem oproduto protéico desejado. Aqueles versados na técnica entenderão, no en-tanto, que, em certas modalidades, as células podem continuar a crescer eaumentar em número durante a fase de produção. Durante essa fase, o am-biente do biorreator é controlado em condições nas quais as células têmmaior probabilidade de serem produtivas. Por exemplo, a temperatura é ge-ralmente mantida em uma temperatura diferente daquela da fase de cresci-mento, que conduza à produção de um produto protéico, por exemplo, 31 °C.

Por todo o ciclo de produção, as células podem ser alimentadas com ummeio de alimentação que contém nutrientes e suplementos que as célulaspossam precisar. Por exemplo, em certos casos, pode ser benéfico ou ne-cessário suplementar a cultura de células durante a fase de produção sub-seqüente com nutrientes ou com outros componentes do meio que foramesgotados ou metabolizados pelas células. Como exemplos não limitantes,pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura de células com hor-mônios e/ou com outros fatores de crescimento, íons específicos (por exem-plo, sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleo-sídeos ou nucleotídeos, elementos residuais (compostos inorgânicos nor-malmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos,lipídeos ou glicose, ou outra fonte de energia. Todos esses componentessuplementares podem ser adicionados à cultura de células de uma vez, oupodem ser fornecidos à cultura de células em uma série de adições. Em cer-tas modalidades, é fornecido um composto antienvelhecimento em um meiode alimentação em uma ou mais vezes durante a fase de produção.

De acordo com certas modalidades, o uso de um composto anti-envelhecimento, por exemplo, carnosina, no meio de cultura de células du-rante a fase de produção, seja ela fornecida em um meio de inoculação ouem um meio de alimentação, aumenta a viabilidade celular e/ou a produçãode proteínas específicas, melhorando, dessa forma, o rendimento global daproteína produzida.

Aspectos de um processo de produção de proteína são determi-nados por aqueles versados na técnica de cultura de células. Os parâmetroscomo, por exemplo, densidade da semeadura, duração da cultura de produ-çao, condições de operação durante a coleta, dentre outros, incluindo osmencionados acima, são funções da linhagem celular e do meio de culturade células. Portanto, os parâmetros podem ser determinados, sem experi-mentação desnecessária, por aqueles versados na técnica de cultura de cé-lulas.

Como ocorre com a temperatura ou a faixa de temperaturas du-rante a fase de crescimento, a temperatura ou a faixa de temperaturas dacultura de células durante a fase de produção será selecionada com baseprimariamente na temperatura ou faixa de temperaturas na qual a cultura decélulas permanece viável, na qual um nível elevado de proteína é produzido,na qual a produção ou o acúmulo de produtos metabólicos indesejáveis éminimizado, e/ou qualquer combinação destes ou de outros fatores conside-rados importantes pelo profissional. Em geral, a maioria das células de ma-míferos permanece viável e produz níveis elevados de proteína dentro deuma faixa de cerca de 25°C a 42°C, embora os métodos ensinados pelapresente especificação não sejam limitados a essas temperaturas. Em cer-tas modalidades, as células de mamíferos permanecem viáveis e produzemníveis elevados de proteína dentro de uma faixa de cerca de 25°C a 35°C.Em certas modalidades, a cultura de células cresce em uma temperatura de20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, ou 45°C em uma ou mais vezes durante a fase de produ-ção. Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar temperaturasou faixas de temperaturas apropriadas nas quais as células cresçam durantea fase de produção, dependendo das necessidades específicas das célulase das necessidades de produção específicas do profissional. As células po-dem crescer por qualquer quantidade de tempo, dependendo das necessi-dades do profissional e das necessidades das próprias células.

Em certas modalidades, as culturas em batelada ou em bateladaalimentada são terminadas após a cultura alcançar uma ou mais condiçõesde cultivo relevantes, como determinado pelas necessidades do profissional.Em certas modalidades, as culturas em batelada ou em batelada alimentadasão terminadas após a proteína expressa alcançar uma titulação suficiente-mente elevada, após a densidade celular alcançar um nível suficientementeelevado, após a proteína expressa alcançar uma densidade celular suficien-temente elevada, e/ou para evitar a produção indesejável ou o acúmulo deprodutos metabólicos indesejáveis (por exemplo, Iactato e/ou amônio). Aque-les versados na técnica conhecerão outras condições de cultivo relevantesque podem ser usadas para determinar quando uma cultura em batelada ouem batelada alimentada deve ser terminada, com base em considerações experimentais, comerciais e/ou outras considerações.

Em certas modalidades, após um ciclo de produção, o produtoprotéico é recuperado do meio de cultura de células e a seguir isolado com ouso de técnicas tradicionais de separação. Por exemplo, a proteína pode serinicialmente separada por centrifugação, retendo o sobrenadante que con- tém a proteína. Adicional ou alternativamente, o produto protéico pode serligado à superfície da célula hospedeira. Nessas modalidades, o meio é re-movido e as células hospedeiras que expressam a proteína são Iisadas co-mo uma primeira etapa no processo de purificação. A Iise de células hospe-deiras de mamíferos pode ser obtida por vários meios conhecidos por aque- Ies versados na técnica, incluindo ruptura física por glóbulos de vidro e ex-posição a condições de pH elevado.

Com a utilização de métodos convencionais de purificação deproteínas, a proteína pode ser adicionalmente isolada. Métodos para isolar epurificar o produto protéico desejado são conhecidos na técnica de cultura de células. Os métodos específicos dependem da linhagem celular usada edo produto desejado.

O composto antienvelhecimento, por exemplo, carnosina, podeser adicionado ao meio de cultura em um momento ótimo para o processode cultura de células específico. Para os atuais exemplos, a adição de car- nosina ocorre após a fase de crescimento estar substancialmente completae durante a fase de transição. Durante a adição, o meio de cultura de célulasestá se adaptando à nova temperatura resultante da mudança de temperatu-ra. A fase de transição é geralmente quando os agentes são adicionadospara ajudar a iniciar a fase de produção. A carnosina, no entanto, pode ser adicionada em qualquer ponto durante o ciclo de produção, gerando ótimosresultados, inclusive na fase de crescimento e na fase de produção. A car-nosina também pode ser adicionada em combinação com outros componen-tes, por exemplo, com um meio de alimentação. Em certas modalidades, éfornecido um composto antienvelhecimento em um meio de inoculação queestá presente na cultura de células durante todo o processo de cultura decélulas. Em certas modalidades, são fornecidos dois ou mais compostos an-tienvelhecimento no meio de cultura de células. Em certas modalidades, sãofornecidos dois ou mais compostos antienvelhecimento em um meio de ino-culação, e eles estão presentes na cultura de células durante todo o proces-so de cultura de células. Em certas modalidades, são fornecidos dois oumais compostos antienvelhecimento, em que um composto antienvelheci-mento é fornecido em um meio de inoculação, e ele está presente na culturade células durante todo o processo de cultura de células, enquanto outrocomposto antienvelhecimento é fornecido após a cultura de células ter co-meçado.

Em certas modalidades, a concentração de um composto anti-envelhecimento presente na cultura de células é diferente para os diferentestipos de células e produtos. Em certas modalidades, a concentração de car-nosina presente é diferente nos diferentes tipos de células e produtos. Ge-ralmente, a concentração é suficiente para aumentar a produtividade e aqualidade, sem efeitos tóxicos. Para os atuais exemplos, a faixa inclui, semlimitação, 5 mM a 100 mM. Será observado que a concentração de carnosi-na usada poderá variar, dependendo do meio de cultura de células. A con-centração de carnosina apropriada para uma linhagem celular em particularpode ter que ser determinada com experimentos em pequena escala de roti-na como, por exemplo, um biorreator de 2 litros, com o uso de métodos con-vencionais. Aqueles versados na técnica serão capazes de determinar aconcentração de carnosina vantajosa ou ótima ou de outro composto antien-velhecimento sem experimentação desnecessária, com o uso de técnicas decultura de células e de métodos diagnósticos que são conhecidos na técnica.

Uma vantagem decorrente da adição de carnosina ou de outrocomposto antienvelhecimento, em vez de agentes químicos, é o efeito sobrea viabilidade. Tipicamente, o crescimento celular cessa, e o número de célu-las viáveis diminui com a adição de um agente químico como, por exemplo,butirato de sódio (Kim etal. Biotechnol. Bioeng., 71: 184-193,184). Exemplosabaixo, no entanto, demonstram que a adição de carnosina a um meio decultura de células resulta em maior viabilidade no momento da coleta do queé observada em uma cultura de células desenvolvida na ausência de umcomposto antienvelhecimento como, por exemplo, carnosina. Além disso,essas culturas de células que contêm carnosina exibem um aumento daprodutividade específica. Com os efeitos positivos sobre a viabilidade celulare sobre a produtividade específica, o rendimento global é maior.

Outra vantagem é que um composto antienvelhecimento como,por exemplo, carnosina, diminui a quantidade de agregados de alto pesomolecular e/ou o número de espécies ácidas. A diminuição da quantidade deagregados de alto peso molecular e de espécies ácidas simplifica a purifica-ção do produto protéico. Ao se permitir que a proteína seja isolada mais efi-cientemente, reduz-se o custo para a produção do produto protéico. Em cer-tas modalidades, é usado um composto antienvelhecimento diferente decarnosina para diminuir a quantidade de agregados de alto peso moleculare/ou de espécies ácidas. Em certas modalidades, são usados dois ou maiscompostos antienvelhecimento para diminuir a quantidade de agregados dealto peso molecular e/ou de espécies ácidas.

Em certas modalidades, as células são desenvolvidas de acordocom qualquer um dos métodos de cultura de células descritos nos Pedidosde Patente U.S. Nos de Série 11/213.308, 11/213.317 e 11/213.633, cada umdos quais foi depositado em 25 de agosto de 2005, e cada um dos quais éaqui incorporado por referência em sua totalidade. Por exemplo, em certasmodalidades, as células podem ter crescido em um meio de cultura no quala concentração cumulativa de aminoácidos é maior do que cerca de 70 mM.Em certas modalidades, as células podem ter crescido em um meio de cultu-ra no qual a proporção molar de glutamina cumulativa para asparagina cu-mulativa é menor do que cerca de 2. Em certas modalidades, as células po-dem ter crescido em um meio de cultura no qual a proporção molar de glu-tamina cumulativa para os aminoácidos totais cumulativos é menor do quecerca de 0,2. Em certas modalidades, as células podem ter crescido em ummeio de cultura no qual a proporção molar de íons inorgânicos cumulativospara aminoácidos totais cumulativos é entre cerca de 0,4 a 1. Em certas mo-dalidades, as células podem ter crescido em um meio de cultura no qual aconcentração de glutamina combinada cumulativa e de asparagina cumulati-va é entre cerca de 16 e 36 mM. Em certas modalidades, as células podemter crescido em um meio de cultura que contém duas, três, quatro ou todasas cinco condições de meio precedentes. O uso de tais meios permite níveiselevados de produção de proteínas e reduz o acúmulo de certos fatores in-desejáveis, tais como amônio e/ou lactato.

Em algumas modalidades, as células se desenvolvem sob umaou mais das condições descritas no Pedido Provisório de Patente U.S. N0 deSérie 60/830.658, depositado em 13 de julho de 2006 e aqui incorporado porreferência em sua totalidade. Por exemplo, em algumas modalidades, ascélulas se desenvolvem em um meio de cultura que contém manganês emuma concentração entre aproximadamente 10 e 600 nM. Em algumas moda-lidades, as células se desenvolvem em um meio de cultura que contémmanganês em uma concentração entre aproximadamente 20 e 100 nM. Emalgumas modalidades, células se desenvolvem em um meio de cultura quecontém manganês em uma concentração de aproximadamente 40 nM. Ouso desses meios no desenvolvimento de glicoproteínas resulta na produçãode uma glicoproteína com um padrão de glicosilação aperfeiçoado (por e-xemplo, um número maior de resíduos de açúcar ligados de forma covalenteem uma ou mais cadeias de oligossacarídeos).

Em certas modalidades da invenção, as proteínas produzidas deacordo com um ou mais métodos da presente invenção terão atividade far-macológica e serão úteis na preparação de substâncias farmacêuticas. Asproteínas produzidas de acordo com um ou mais métodos da presente in-venção podem ser administradas a um indivíduo, ou podem inicialmente serformuladas para liberação por qualquer via disponível, incluindo, sem Iimita-ção, a via parenteral (por exemplo, intravenosa), intradérmica, subcutânea,oral, nasal, brônquica, oftálmica, transdérmica (tópica), transmucosa, retal evaginal. As composições farmacêuticas da invenção tipicamente incluemuma proteína purificada expressa por uma linhagem de célula de mamífero,um agente de liberação (ou seja, um polímero catiônico, um transportadormolecular de peptídeo, tensoativo etc., como descrito acima) em combina-ção com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui usado, o termo"veículo farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos ede retardo da absorção, e similares, compatíveis com a administração far-macêutica. Também podem ser incorporados compostos ativos suplementa-res nas composições.

Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatívelcom sua via de administração desejada. Estas formulações serão conheci-das por aqueles versados na técnica. Em certas modalidades, uma proteínaproduzida de acordo com a presente invenção é formulada na forma orale/ou parenteral. Em certas modalidades, para facilitar a administração e uni-formizar a dosagem, essas formas orais e/ou parenterais são formuladascomo forma de dosagem unitária, em que cada unidade contém uma quanti-dade predeterminada de proteína ativa calculada para a produção do efeitoterapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico necessá-rio. Aqueles versados na técnica conhecerão formulações de dosagem unitá-ria adequadas às proteínas produzidas de acordo com a presente invenção.

Certas modalidades e aspectos foram discutidos em detalhe a-cima. A presente descrição é adicionalmente ilustrada pelos exemplos nãolimitantes a seguir. Aqueles versados na técnica entenderão, no entanto, quevárias modificações dessas modalidades então incluídas no escopo das rei-vindicações em anexo. Deve-se observar que a adição de carnosina e/ou deoutros compostos antienvelhecimento é igualmente aplicável a outras cultu-ras de células de mamíferos e produtos protéicos. São as reivindicações eseus equivalentes que definem o escopo da presente invenção, a qual não ée não deve ser limitada pela descrição de certas modalidades.EXEMPLOS

Exemplo 1

Experimentos de Carnosina em Escala de Placas

Uma linhagem celular MYO-29 foi cultivada em um meio de pro-dução sem soro em um biorreator com um volume de trabalho de 1 litro, eteve sua temperatura alterada de 37°C para 310C no 49 dia. O pH do biorrea-tor foi mantido em 7,00, e o oxigênio dissolvido foi ajustado em 30% de satu-ração do ar. Foi então recolhido meio de cultura de células do biorreator no49 dia, 7- dia, e 10Q dia, e ele foi colocado em placas de cultura com um vo-lume de trabalho de 8 ml e em uma incubadora a 31 °C, onde as culturas daplaca foram cultivadas até o 129 dia. As células foram suplementadas comum meio de alimentação no 5e e no 7e dias. No 59 dia, 10% (v/v) de meio dealimentação foram adicionados às culturas de células, e, no 79 dia, 5% (v/v)de meio de alimentação foram adicionados às culturas de células. Foramacrescentados 10 mM de carnosina no 49 dia, 7Q dia e 109 dia, respectiva-mente, às placas, e o meio de cultura de células foi coletado no 12a dia.

A Figura 1a mostra o efeito das adições de carnosina sobre aquantidade de picos ácidos na cultura no 7- dia. A Figura 1 b mostra o efeitoda carnosina sobre os agregados de alto peso molecular no 7- dia de cultu-ra. A Figura 1c ilustra o efeito de adições de carnosina no 49 dia, versus 7-dia, versus 109 dia sobre os picos ácidos. A Figura 1d mostra os mesmosresultados do experimento, mas para agregados de alto peso molecular. Nogeral, carnosina teve um efeito positivo por diminuição tanto dos picos áci-dos quanto dos agregados de alto peso molecular em placas cultivadas.

Exemplo 2

Efeitos da Adição de Carnosina ao Meio de Cultura de Células

Cinco biorreatores foram inoculados com 0,9 χ 106 células/mlcom um volume de trabalho de 1 litro de uma linhagem celular MYO-29 emum meio de inoculação sem soro. Todos os biorreatores foram alimentadoscom 5% (v/v) de um meio de alimentação nos 39, 59, 79 e 129 dias de um ci-clo de 14 dias. Uma alimentação no 109 dia de 5% (v/v) do meio de alimen-tação foi acrescentada a dois dos biorreatores, controle e em um contendocarnosina. As condições dos biorreatores foram mantidas em uma tempera-tura de 37°C, um pH de 7,00, e um nível de oxigênio dissolvido de 30% desaturação do ar. A taxa de agitação foi de 200 rpm, e o gás vaporizado tinhauma combinação de ar e dióxido de carbono 7%.

Todas as células foram cultivadas por 4 dias, e, ao final desseperíodo, 20 mM de carnosina foram adicionados a dois dos biorreatores; oscontroles não tiveram adição de carnosina, e a temperatura foi alterada para310°C em todos os biorreatores, também no 4°C dia. Foi feita a coleta nos bior-reatores no 14°C dia do ciclo de produção. Foram coletadas amostras ao Ion-go do ciclo para monitorar o progresso do meio de cultura de células. Oscontroles se comportaram da forma esperada.

A Figura 2a mostra a densidade diária de células viáveis. A Figu-ra 2b mostra que a viabilidade celular diária dos biorreatores com carnosinafoi maior com a coleta, comparada com a dos dois biorreatores sem ela. AFigura 2c mostra a titulação diária dos biorreatores e mostra também que osdois biorreatores com carnosina presentes tiveram uma titulação maior nomomento da coleta. As culturas com carnosina tiveram melhor produtividadecelular específica cumulativa mostrada na Figura 2d. A Figura 2e mostra aquantidade de agregados de alto peso molecular e mostra uma diminuiçãode agregados de alto peso molecular nos biorreatores com a presença decarnosina.

Exemplo 3

Efeito de Diferentes Concentrações de Adições de Carnosina

Quatro biorreatores foram inoculados com 0,4 χ 106 células/mlcom um volume de trabalho de 1 litro de uma linhagem celular MYO-29 emum meio de inoculação sem soro. Todos os biorreatores foram alimentadoscom 5% (v/v) de um meio de alimentação no 7- dia do ciclo de 14 dias. Ascondições do biorreator foram mantidas em uma temperatura de 37°C, umpH de 7,00, e um nível de oxigênio dissolvido de 30% de saturação do ar. Ataxa de agitação foi de 200 rpm, e o gás vaporizado tinha uma combinaçãode ar e dióxido de carbono 7%.

Todas as células foram cultivadas por quatro dias, e, depoisdesse período, a temperatura foi alterada em todos os biorreatores para31°C. Também no 45 dia, 20 mM de carnosina foram adicionados a um bior-reator, um segundo teve a adição de 40 mM de carnosina, e os controlesnão receberam carnosina. Foi feita a coleta de todos os biorreatores no 12Qdia do ciclo de produção. Foram coletadas amostras ao longo do ciclo paramonitorar o progresso do meio de cultura de células. Os controles geralmen-te se comportaram como esperado, exceto um controle que teve viabilidadesdiárias ligeiramente menores do que as observadas previamente.

A Figura 3a mostra a densidade diária de células viáveis; os dife-rentes biorreatores são bem similares, com exceção do biorreator com 40mM de carnosina. A Figura 3b mostra que a viabilidade celular diária dosbiorreatores com carnosina teve uma viabilidade maior com a coleta, compa-rada com a dos dois biorreatores de controle sem ela. A Figura 3c mostra atitulação diária; os biorreatores com as adições de carnosina e um dos con-troles foram similares. O biorreator com 40 mM de carnosina teve uma pro-dutividade celular específica cumulativa maior (Figura 3d). A Figura 3e mos-tra a quantidade de agregados de alto peso molecular; no geral, há uma di-minuição dos agregados de alto peso molecular com as adições de carnosi-na, comparados com os controles.

Embora tenham sido aqui descritas algumas modalidades daespecificação, a descrição acima é meramente ilustrativa. Ocorrerão modifi-cações adicionais das modalidades aqui apresentadas para aqueles versa-dos na técnica de cultivo de células, e todas essas modificações são consi-deradas como incluídas no escopo das modalidades, como definidas pelasreivindicações em anexo.

Claims

1. Método de produção de uma proteína em cultura de célulasque compreende as etapas de:- cultivo de células de mamíferos que contêm um gene que codi-fica uma proteína de interesse, cujo gene é expresso sob condições de cul-tura de células, em um meio de cultura de células que compreende um com-posto antienvelhecimentò; e- manutenção da cultura sob condições e por um período sufici-ente para permitir a expressão da proteína;- em que a cultura de células exibe uma característica aprimora-da da cultura de células que difere de uma característica correspondente dacultura de células que seria observada sob condições de outra forma idênti-cas, em um meio de outra forma idêntico desprovido do composto antienve-lhecimentò;- em que a característica aprimorada da cultura é selecionada dogrupo que consiste em: aumento da titulação, aumento da produtividade ce-lular específica, aumento da viabilidade celular, aumento da densidade decélulas viáveis integradas, diminuição do acúmulo de agregados de alto pe-so molecular, diminuição do acúmulo de espécies ácidas, e combinaçõesdos mesmos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o compostoantienvelhecimentò é selecionado do grupo que consiste em carnosina, ace-til-carnosina, homocarnosina, anserina e 3-alanina, e combinações das mes-maa.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o compostoantienvelhecimentò compreende carnosina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que ocomposto antienvelhecimentò está presente no meio de cultura de célulasem uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, em que a cultura de células é ainda fornecida com componentes suple-mentares.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que os compo-nentes suplementares são fornecidos em um meio de alimentação.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que oscomponentes suplementares são selecionados do grupo que consiste emhormônios e/ou outros fatores do crescimento, íons específicos (por exem-plo, sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleo-sídeos ou nucleotídeos, elementos residuais (compostos inorgânicos nor-malmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos,lipídeos, glicose ou outra fonte de energia, e combinações destes.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, 6 ou 7, em que òscomponentes suplementares incluem um composto antienvelhecimento.

9. Método para a produção de uma proteína que compreendeetapas de:- cultivo de células de mamíferos que contêm um gene que codi-fica uma proteína de interesse em um meio de cultura de células, cujo geneé expresso sob condições de cultura de células, em uma primeira temperatu-ra ou faixa de temperaturas que conduz ao crescimento celular durante afase de crescimento;- mudança da temperatura ou da faixa de temperaturas do meiode cultura de células para uma segunda temperatura ou faixa de temperatu-ras que conduz à produção de proteínas;- cultivo das células hospedeiras no meio de cultura de célulasna segunda temperatura ou faixa de temperaturas através de uma fase detransição e em uma fase de produção;- em que é adicionado um composto antienvelhecimento à cultu-ra de células e de tal forma que a cultura de células exiba uma característicaaprimorada da cultura de células que difere de uma característica corres-pondente da cultura de células que seria observada sob condições de outraforma idênticas, em um meio de outra forma idêntico desprovido do compos-to antienvelhecimento;em que a característica aprimorada da cultura de células é sele-cionada do grupo que consiste em: aumento da titulação, aumento da produ-tividade celular específica, aumento da viabilidade celular, aumento da den-sidade de células viáveis integradas, diminuição do acúmulo de agregadosde alto peso molecular, diminuição do acúmulo de espécies ácidas, e combi-nações das mesmas.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o compos-to antienvelhecimento é adicionado ao meio de cultura de células no começodo processo de cultura de células.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que ocomposto antienvelhecimento é adicionado ao meio de cultura de célulasdurante a fase de crescimento.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, 10 ou 11, em que ocomposto antienvelhecimento é adicionado ao meio de cultura de célulasdurante a fase de transição.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a -12, em que o composto de antienvelhecimento é adicionado ao meio de cul-tura de células durante a fase de produção.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-13, em que o composto antienvelhecimento é selecionado do grupo queconsiste em carnosina, acetil-carnosina, homocarnosina, anserina, 3-alanina,e combinações das mesmas.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o compos-to antienvelhecimento compreende carnosina.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-15, em que o composto antienvelhecimento está presente no meio de culturade células em uma concentração entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a culturade células é ainda fornecida com componentes suplementares.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que os com-ponentes suplementares são fornecidos em um meio de alimentação.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que oscomponentes suplementares são selecionados do grupo que consiste emhormônios e/ou outros fatores do crescimento, íons específicos (por exem-pio, sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleo-sídeos ou nucleotídeos, elementos residuais (compostos inorgânicos nor-malmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos,lipídeos, glicose ou outra fonte de energia, e combinações dos mesmos.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, 18, ou 19, em queos componentes suplementares incluem um composto antienvelhecimento.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que a proteína produzida é heteróloga às células de mamí-feros.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, em que as células de mamíferos são células CHO.

23. Proteína produzida de acordo com o método como definidoem qualquer uma das reivindicações precedentes.

24. Proteína de acordo com a reivindicação 23, em que a proteí-na é um anticorpo.

25. Proteína de acordo com a reivindicação 24, em que o anti-corpo é um anticorpo anti-GDF-8 selecionado do grupo que consiste em:Myo29, Myo28, Myo22, e combinações dos mesmos.

26. Método para a preparação de uma proteína de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 22, que compreende ainda a etapa deisolamento da proteína do meio de cultura de células.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que a proteínaé ainda purificada ou processada para formulação.

28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em que aproteína é formulada em uma composição farmacêutica.

29. Método para a produção de uma proteína que compreende:- o cultivo de uma célula de mamífero transformada com um ge-ne que codifica uma proteína de interesse em um meio de cultura de células;- a adição ao referido meio de cultura de células de uma quanti-dade eficaz de um composto antienvelhecimento;- a manutenção do referido meio de cultura de células até que areferida proteína de interesse se acumule; e- o isolamento da referida proteína de interesse, em que a pro-dução da referida proteína de interesse seja aumentada, a viabilidade celularseja mantida, e os agregados de alto peso molecular sejam diminuídos,comparada com a produção da referida proteína de interesse na ausência doreferido composto antienvelhecimento em condições de outra forma idênti-cas.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a referidacélula hospedeira é uma célula de mamífero.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que a referidacélula de mamífero é uma célula CHO.

32. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a referidaproteína de interesse é um anticorpo.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o referidoanticorpo é um isótopo de IgG.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o referidoanticorpo é um anticorpo humano recombinante.

35. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o referidoanticorpo é especificamente reativo com o fator de diferenciação do cresci-mento-8 (GDF-8) ou um epitopo do mesmo.

36. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o referidozanticorpo recombinante se liga especificamente a BMP-11.

37. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referidocomposto antienvelhecimento é carnosina ou um análogo de carnosina.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o referidoanálogo de carnosina é selecionado do grupo que consiste em acetil-carnosina, homocarnosina, anserina e 3-alanina.

39. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referidocomposto antienvelhecimento está em uma concentração entre cerca de 5mM a cerca de 100 mM.

40. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referidocomposto antienvelhecimento está em uma concentração entre cerca de 10mM a cerca de 40 mM. .

41. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referidocomposto antienvelhecimento está em uma concentração de aproximada-mente 20 mM.

42. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o referidocomposto antienvelhecimento é adicionado em combinação com um meio dealimentação.

43. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a referidaviabilidade celular no momento da coleta é mantida.

44. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a produ-ção da referida proteína de interesse é aumentada.

45. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a produti-vidade celular específica da referida proteína de interesse é aumentada.

46. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a quali-dade da referida proteína de interesse é aumentada por uma diminuição deagregados de alto peso molecular.

47. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a quali-dade da referida proteína de interesse é aumentada por uma diminuição deespécies ácidas.

48. Método para a produção de uma proteína que compreende:- o cultivo de uma linhagem celular em um meio de cultura decélulas em uma temperatura que conduz ao crescimento celular duranteuma fase de crescimento;- alteração da referida temperatura do referido meio de culturade células pelo menos uma vez até uma temperatura que conduz à produ-ção de proteínas;- o cultivo das referidas células hospedeiras no referido meio decultura de células na referida temperatura que conduz à produção de proteí-nas através de uma fase de transição e em uma fase de produção;- a adição do referido composto antienvelhecimento ao referidomeio de cultura de células durante a referida fase de transição em uma con-centração em que a produção da referida proteína de interesse é aumenta-da, a viabilidade celular é mantida, e agregados de alto peso molecular sãodiminuídos, comparada com a produção da referida proteína de interesse naausência do referido composto antienvelhecimento em condições de outraforma idênticas.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o referidocomposto antienvelhecimento está em uma concentração entre cerca de 5mM a cerca de 100 mM.

50. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o referidocomposto antienvelhecimento está em uma concentração entre cerca de 10mM a cerca de 40 mM.

51. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o referidocomposto antienvelhecimento está em uma concentração de cerca de 20mM.