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BR112021005137A2 - agentes rnai para inibir a expressão de 17beta-hsd tipo 13 (hsd17b13), suas composições e métodos de uso - Google Patents

agentes rnai para inibir a expressão de 17beta-hsd tipo 13 (hsd17b13), suas composições e métodos de uso Download PDF

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BR112021005137A2
BR112021005137A2 BR112021005137-6A BR112021005137A BR112021005137A2 BR 112021005137 A2 BR112021005137 A2 BR 112021005137A2 BR 112021005137 A BR112021005137 A BR 112021005137A BR 112021005137 A2 BR112021005137 A2 BR 112021005137A2
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BR
Brazil
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hsd17b13
rnai agent
nucleotides
rnai
seq
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BR112021005137-6A
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English (en)
Inventor
Zhen Li
Rui Zhu
Shawn A. Morales
Original Assignee
Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.
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Filing date
Publication date
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Abstract

agentes rnai para inibir a expressão de 17beta-hsd tipo 13 (hsd17b13), suas composições e métodos de uso. a presente divulgação se refere a agentes de rnai, por exemplo, agentes de rnai de fita dupla, capazes de inibir a expressão do gene (hsd17b13 ou 17ß-hsd13) 17ß-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 13. também são divulgadas composições farmacêuticas que incluem agentes de rnai de hsd17b13 e métodos de uso destas. os agentes de rnai de hsd17b13 aqui divulgados podem ser conjugados a ligantes de direcionamento para facilitar a liberação nas células, incluindo hepatócitos. a liberação dos agentes de rnai de hsd17b13 in vivo proporciona inibição da expressão do gene hsd17b13. os agentes de rnai podem ser usados em métodos de tratamento de doenças e distúrbios relacionados a hsd17b13, incluindo doença hepática gordurosa não alcoólica (dhgna), esteato-hepatite não alcoólica (nash), fibrose hepática e doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose.

Description

AGENTES RNAI PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE 17BETA-HSD TIPO 13 (HSD17B13), SUAS COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE USO
REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n°. de série 62/890.220, depositado em 22 de agosto de 2019, do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n°. de série 62/773.707, depositado em 30 de novembro de 2018 e do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n°.
62/733.320, depositado em 19 de setembro de 2018, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados neste documento em sua totalidade a título de referência.
LISTA DE SEQUÊNCIAS
[0002] Este pedido contém uma listagem de sequência que foi submetida em formato ASCII e é incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência. A cópia ASCII é denominada 30667-WO_SEQLIST.txt e tem 75 kb de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente divulgação se refere a agentes RNA interferente (RNAi), por exemplo, agentes RNAi de fita dupla, para inibição da expressão gênica da 17β- hidroxisteroide desidrogenase tipo 13, composições que incluem agentes RNAi para 17β-hidroxisteroide desidrogenase tipo 13 e métodos de uso deles.
HISTÓRICO
[0004] A proteína de gotícula de lipídio hepático 17β- hidroxisteroide desidrogenase tipo 13 (comumente referida como HSD17B13, 17β-HSD13, HSD17β13, 17beta-HSD13, 17beta- HSD tipo 13, ou 17Β-HSD13) é um membro da família 17β- desidrogenase (17β-HSD). A família 17β-HSD compreende 14 enzimas que participam da redução ou oxidação de hormônios sexuais, ácidos graxos e ácidos biliares. A distribuição tecidual, localização subcelular e preferência catalítica diferem entre os vários membros da família. A família 17β- HSD exibe diversas especificidades de substrato, incluindo esteroides, lipídeos e retinoides.
[0005] A proteína 17β-HSD13 é distribuída em uma grande variedade de tecidos no corpo e é codificada pelo gene HSD17B13 (alternativamente chamado de gene 17β-HSD13).
Sabe-se que o maior nível de expressão é encontrado nos hepatócitos no fígado, enquanto baixos níveis podem ser detectados no ovário, medula óssea, rim, cérebro, pulmão, músculo esquelético, bexiga e testículo. A função de 17β- HSD13 não é completamente compreendida, no entanto, alguns dos membros da família 17β-HSD, incluindo 17β-HSD-4, -7, - 10 e -12, mostraram participar do metabolismo de carboidratos e ácidos graxos. Isso sugere que 17β-HSD13 também pode desempenhar um papel nas vias metabólicas dos lipídios. Foi observada superregulação hepática de 17β- HSD13 em pacientes com fígado gorduroso, o que sustenta o papel dessa enzima na patogênese da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA).
[0006] Wen Su et al. identificaram anteriormente 17β- HSD13 como uma proteína associada a gotículas de lipídios (LD) em pacientes com DHGNA, e relataram que 17β-HSD13 estava entre uma das proteínas de LD expressas em grande quantidade, localizadas especificamente na superfície de GLs. (Wen Su et al., Comparative proteomic study reveals 17β-HSD13 as a pathogenic protein in nonalcoholic fatty live disease, 111 PNAS 11437-11442 (2014)). Além disso, foi descoberto que o nível de 17β-HSD13 era regulado positivamente no fígado de pacientes e camundongos com DHGNA. A superexpressão resultou em um aumento no número e tamanho das GLs, enquanto o silenciamento do gene de HSD17B13 atenuou a formação de GL induzida por ácido oleico em hepatócitos em cultura. A superexpressão hepática da proteína 17β-HSD13 em camundongos C57BL/6 mostrou aumentar significativamente a lipogênese e o conteúdo de triglicerídeos (TG) no fígado, produzindo a um fenótipo de fígado gorduroso.
[0007] Evidências adicionais que implicam a expressão do gene HSD17B13 na patogênese da DHGNA e da esteato- hepatite não alcoólica (NASH) foram fornecidas por N.S.
Abul-Husn et. al., A Protein-Truncating HSD17B13 Variant and Protection from Chronic Liver Disease, 378 N. Eng. J.
Med. 1096-1106 (2018). Este grupo conduziu um estudo da associação em todo o genoma, que revelou uma variante de união (rs72613567:TA) em HSD17B13 que estava associada a níveis reduzidos de alanina amino transferase (ALT) e aspartato amino transferase (AST), indicando menos lesão hepática e inflamação em pacientes com fígado gorduroso. A variante da união produz uma perda truncada de proteína de função, sugerindo que HSD17B13 normalmente gera um produto que pode facilitar o dano hepatocelular.
[0008] A DHGNA é um grande problema de saúde em todo o mundo. A DHGNA é um termo genérico que compreende uma continuação de doenças hepáticas que variam em gravidade de lesão e fibrose resultante. Entre elas, a esteatose hepática (fígado gorduroso) sozinha é geralmente referida como NAFL, e NASH é normalmente definida como um processo mais grave com inflamação e dano aos hepatócitos (esteato- hepatite). Em geral, NASH é acompanhada por fibrose, que em muitos casos, progride para cirrose. Pacientes apenas com NAFL apresentam menor risco de desfechos adversos, enquanto a presença de NASH aumenta os riscos de desfechos hepáticos e não hepáticos. Os desfechos hepáticos adversos relacionados à NASH incluem insuficiência hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular. Os desfechos adversos não associados ao fígado em geral estão relacionados ao aumento de doenças cardiovasculares e malignidade.
[0009] Globalmente, estima-se a prevalência de DHGNA em cerca de 25%. Nos Estados Unidos, existe uma projeção de crescimento no número de casos de DHGNA de 83,1 milhões em 2015 (cerca de 25% da população) para 100,9 milhões em
2030. Existe uma expectativa de que a NASH represente uma proporção maior desses casos, passando de 20% para 27% dos adultos com DHGNA. Essa crescente prevalência da doença, sem dúvida, levará a um aumento do ônus econômico e será acompanhada por um número crescente de pacientes com doença hepática em estágio terminal que precisam de transplante de fígado e um aumento drástico no carcinoma hepatocelular. Em comparação com a incidência em outras doenças hepáticas, uma porcentagem maior (cerca de 35–50%) dos casos de carcinoma hepatocelular que surgem na NASH ocorrem antes que os pacientes tenham cirrose e seja feito o rastreamento de rotina do câncer. Em muitos casos, isso resulta em tumores maiores e menos suscetíveis a terapias curativas do que aqueles com outras etiologias.
[0010] A doença hepática alcóolica (DHA) também é prevalente em todo o mundo e se refere a uma doença hepática progressiva causada pelo uso excessivo e prolongado do álcool. Existem vários estágios de doença da DHA e incluem fígado gorduroso alcoólico (esteatose alcoólica), hepatite alcoólica e cirrose.
[0011] Atualmente, não existem agentes farmacológicos aprovados para o tratamento de NASH ou outras doenças e condições que se enquadram na DHGNA ou DHA.
RESUMO
[0012] Há uma necessidade de novos agentes RNA interferente (RNAi) específicos para o gene HSD17B13 (também chamados de agente RNAi, ativador de RNAi ou ativador), p. ex., agentes RNAi de fita dupla, que são capazes de inibir de forma seletiva e eficiente a expressão de um gene HSD17B13. Além disso, existe a necessidade de composições que incluam novos agentes específicos RNAi para HSD17B13 para o tratamento de doenças, como, entre outras, DHGNA, NASH, fibrose hepática e doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose.
[0013] Em geral, a presente divulgação apresenta novos agentes RNAi específicos para o gene HSD17B13, composições que incluem agentes RNAi para HSD17B13 e métodos para inibir a expressão de um gene HSD17B13 in vitro e/ou in vivo que usam os agentes RNAi para HSD17B13 e composições que incluem os agentes RNAi para HSD17B13 descritos neste documento. Os agentes RNAiHSD17B13 descritos neste documento podem diminuir, inibir ou silenciar a expressão de um geneHSD17B13 em um sujeito, p. ex., um humano ou animal.
[0014] Os agentes RNAi HSD17B13 descritos podem ser usados em métodos para tratamento terapêutico (incluindo o tratamento profilático e preventivo) de sintomas e doenças associadas a DHGNA, NASH, fibrose hepática e doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose.
Os métodos divulgados neste documento incluem a administração de um ou mais agentes RNAi HSD17B13 a um sujeito, p. ex., um humano ou animal, usando quaisquer métodos adequados conhecidos na técnica, tais como injeção subcutânea ou administração intravenosa.
[0015] Em um aspecto, a divulgação apresenta agentes RNAi para inibir a expressão de um gene HSD17B13 no qual o agente RNAi inclui uma fita sense (também referida como fita passageira) e uma fita antisense (também referida como fita guia). A fita sense e a fita antisense podem ser parcial, substancial ou totalmente complementares uma à outra. As cadeias sense e antisense do agente RNAi descritas neste documento podem ter, cada uma, 16 a 49 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, independentemente, 17 a 26 nucleotídeos de comprimento. As fitas sense e antisense podem ter o mesmo comprimento ou comprimentos diferentes.
Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, independentemente, 21 a 26 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, independentemente, 21 a 24 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, ambas as fita sense e a fita antisense têm 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas antisense têm, independentemente, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense têm,
independentemente, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 nucleotídeos de comprimento. Os agentes RNAi descritos neste documento, mediante a administração a uma célula que expressa HSD17B13,inibem a expressão de um ou mais genes HSD17B13in vivo ou in vitro.
[0016] Os agentes RNAi para HSD17B13, divulgados neste documento, têm como alvo um gene HSD17B13 humano (ver, p.
ex., SEQ ID N°: 1). Em algumas modalidades, os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento são direcionados para uma porção do gene HSD17B13 com a sequência de qualquer uma das sequências divulgadas na Tabela 1.
[0017] Os exemplos de fitas sense e antisense do agente RNAi HSD17B13 que podem ser incluídos nos agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento são fornecidos nas Tabela 3 e Tabela 4. Os exemplos de duplexes do agente RNAi HSD17B13 são fornecidos na Tabela 5 e as estruturas químicas e diagramas esquemáticos de alguns agentes RNAi HSD17B13 que são apresentados vinculados aos ligantes alvo que incluem N-acetil-galactosamina, são demonstrados nas Figuras 1A a 10D e Figuras 11A a 11E. Os exemplos de sequências de extensão do núcleo do nucleotídeo 19, que consistem ou estão incluídos nas fitas sense e antisense dos agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento, são fornecidos na Tabela 2.
[0018] Em outro aspecto, a divulgação apresenta métodos para a administração de agentes RNAi HSD17B13 para células do fígado em um sujeito, como um mamífero, in vivo.
Também são descritas neste documento composições para uso em tais métodos.
[0019] Um ou mais agentes RNAiHSD17B13 pode ser administrado a células ou tecidos alvo usando qualquer tecnologia de administração de oligonucleotídeos conhecida na técnica. Em algumas modalidades, um agente RNAiHSD17B13 é administrado a células ou tecidos alvo por meio de ligação covalente ou ao conjugar o agente RNAi a um grupo alvo, como um ligante do receptor asialoglicoproteína (ou seja, um ligante que inclui um composto com afinidade ao receptor de asialoglicoproteína, que é abundantemente expresso em hepatócitos no fígado). Em algumas modalidades, um ligante do receptor de asialoglicoproteína inclui, consiste em, ou consiste essencialmente em um aglomerado de galactose ou derivado de galactose. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 está ligado a um grupo alvo ou ligante alvo que compreende o derivado de galactose, N- acetil-galactosamina. Em algumas modalidades, um aglomerado derivado de galactose inclui ou consiste em um trímero de N-acetil-galactosamina ou um tetrâmero de N-acetil- galactosamina.
[0020] Em algumas modalidades, agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento que são conjugados a grupos alvo ou ligantes alvo que incluem N-acetil-galactosamina, são internalizados seletivamente pelas células do fígado, e hepatócitos em particular, por meio de endocitose mediada por receptor ou por outros meios.
[0021] Em algumas modalidades, um grupo alvo está ligado à extremidade 3′ ou 5′ da fita sense de um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento. Em algumas modalidades, um grupo alvo está ligado à extremidade 5′ da fita sense.
[0022] Exemplos de ligantes alvo e grupos alvo úteis para administrar os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento para hepatócitos são divulgados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Internacional N°s. WO 2018/044350 e WO 2017/156012, que são incorporados ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Em algumas modalidades, os agentes RNAi HSD17B13 aqui descritos podem ser ligados a um ou mais ligantes alvo com a estrutura de (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s, cada um conforme definido neste documento na Tabela 6.
[0023] Em algumas modalidades, os agentes RNAi HSD17B13 aqui descritos podem ser ligados a um ligante alvo que compreende três partes de N-acetil-galactosamina na extremidade 5′ da fita sense, onde o ligante alvo tem a estrutura de (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s, cada um conforme definido neste documento na Tabela 6.
[0024] Em algumas modalidades, aqui descritas são composições que incluem um ou mais agentes RNAi HSD17B13 que têm as estruturas duplex divulgadas na Tabela 5.
[0025] Em outro aspecto, a divulgação apresenta métodos para inibir a expressão de um gene HSD17B13, em que os métodos incluem a administração a um sujeito ou a uma célula de um sujeito uma quantidade de um agente RNAi HSD17B13 capaz de inibir a expressão de um gene HSD17B13, na qual o agente RNAi HSD17B13 compreende uma fita sense e uma fita antisense, e na qual a fita antisense inclui a sequência de qualquer uma das sequências de nucleotídeos da fita antisense na Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, são divulgados neste documento métodos de inibição da expressão de um gene HSD17B13, no qual os métodos incluem a administração, a um sujeito ou a uma célula, de uma quantidade de um agente RNAi HSD17B13 capaz de inibir a expressão de um gene HSD17B13, no qual o agente
RNAi HSD17B13 compreende uma fita sense e uma fita antisense, e no qual a fita sense inclui a sequência de qualquer uma das sequências de nucleotídeos da fita sense nas Tabelas 2 ou 4. Em algumas modalidades, são divulgados neste documento, métodos para inibir a expressão de um gene HSD17B13 em uma célula ou um sujeito, no qual os métodos incluem a administração, à célula ou a um sujeito, de um agente RNAi HSD17B13 tendo uma fita sense compreendendo a sequência de qualquer uma das sequências na Tabela 4, e uma fita antisense compreendendo a sequência de qualquer uma das sequências na Tabela 3. As composições para uso em tais métodos também são divulgadas neste documento.
[0026] Em um aspecto adicional, a divulgação apresenta métodos de tratamento (incluindo tratamento preventivo ou profilático) de doenças ou sintomas causados por DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose, nas quais os métodos incluem a administração a um sujeito em necessidade de um agente RNAi HSD17B13 tendo uma fita antisense que inclui a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou
3. Em algumas modalidades, são descritos neste documento métodos de tratamento (incluindo tratamento preventivo) de doenças ou sintomas causados por DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose, nas quais os métodos incluem a administração a um sujeito em necessidade deste, um agente RNAi HSD17B13 tendo uma fita sense compreendendo a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou
4. Também são descritas neste documento composições para uso em tais métodos.
[0027] Em algumas modalidades, as composições para a administração de um agente RNAi HSD17B13 a uma célula do fígado, em particular os hepatócitos, in vivo, são descritos, as composições compreendendo: um agente RNAi HSD17B13 ligado ou conjugado a um grupo alvo. Em algumas modalidades, o grupo alvo é N-acetil-galactosamina.
[0028] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID N°:3). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID N°:3), na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID N°:3), na qual, SEQ ID N°:3 está localizada nas posições 1-21 (5′  3′) da fita antisense.
[0029] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:2), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense. Como uma pessoa versada na técnica entenderia claramente, a inclusão de uma ligação fosforotioato, como mostrado nas sequências de nucleotídeos modificadas aqui divulgadas, substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotídeos (ver, p. ex., Figuras. 11A a 11E mostrando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos (5′  3′) usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg
(SEQ ID N°:2), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense.
[0030] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense. Como uma pessoa versada na técnica entenderia claramente, a inclusão de uma ligação fosforotioato, como mostrado nas sequências de nucleotídeos modificadas aqui divulgadas, substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotídeos (ver, p. ex., Figuras. 11A a 11E mostrando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em,
consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos (5′  3′) usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense.
[0031] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID N°:6). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID N°:6), na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC
(SEQ ID N°:6), na qual, SEQ ID N°:6 está localizada nas posições 1-21 (5′  3′) da fita antisense.
[0032] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense. Como uma pessoa versada na técnica entenderia claramente, a inclusão de uma ligação fosforotioato, como mostrado nas sequências de nucleotídeos modificadas aqui divulgadas, substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotídeos (ver, p. ex., Figuras. 11A a 11E mostrando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente;
Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense.
[0033] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada diferindo em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:7), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense. Como uma pessoa versada na técnica entenderia claramente, a inclusão de uma ligação fosforotioato, como mostrado nas sequências de nucleotídeos modificadas aqui divulgadas, substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotídeos (ver, p. ex., Figuras. 11A a 11E mostrando todas as ligações internucleosídicas). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos (5′  3′) usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc
(SEQ ID N°:7), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual a fita sense é pelo menos substancialmente complementar à fita antisense.
[0034] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID N°:3) e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) CGUAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID N°:8). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID N°:3), na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′)
CGUAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID N°:8), na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0035] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID N°:6) e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada da sequência de nucleotídeos (5′  3′) GCCUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID N°:11), na qual I representa um nucleotídeo inosina (hipoxantina). Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID N°:6), na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em não mais do que 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′) GCCUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID N°:11), na qual I representa um nucleotídeo inosina (hipoxantina) e na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0036] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:2), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) cguaagaaGfUfCfugauagauga (SEQ ID N°:9), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato.
Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:2), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) cguaagaaGfUfCfugauagauga (SEQ ID N°:9) e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3' terminal e na extremidade 5' da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0037] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) cguaagaaGfuCfuGfauagauga (SEQ ID N°:10), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato.
Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) cguaagaaGfuCfuGfauagauga (SEQ ID N°:10), e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0038] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) gccuaggaCfAfUfuuuugiauca (SEQ ID N°:12), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato.
Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) gccuaggaCfAfUfuuuugiauca (SEQ ID N°:12) e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5’ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0039] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID N°:13), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato.
Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID N°:13), e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0040] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:7), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende a sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID N°:13), na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato.
Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:7), e uma fita sense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada (5′  3′) gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID N°:13), e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0041] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID NO:3); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID NO:6); na qual o agente HSD17B13 RNAi inclui ainda uma fita sense que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense; e na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita antisense e na fita sense são nucleotídeos modificados.
[0042] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID NO:3); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID NO:6); na qual o agente RNAi HSD17B13 inclui ainda uma fita sense que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense; na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita antisense e na fita sense são nucleotídeos modificados e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0043] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeo da sequência de nucleotídeos (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID NO:3); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID NO:6); na qual o agente RNAi HSD17B13 inclui ainda uma fita sense que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense; na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita antisense e na fita sense são nucleotídeos modificados e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina e na qual a respectiva sequência da fita antisense está localizada nas posições 1- 21 da fita antisense.
[0044] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense e uma fita sense, na qual a fita antisense e a fita sense consistem em, consistem essencialmente em, ou compreendem uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeo dos pares da sequência de nucleotídeos (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID NO:3) e CGUAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID NO:8); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID NO:6) e GCCUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID NO:11), no qual I representa um nucleotídeo inosina (hipoxantina); no qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos em ambas as fitas antisense e sense são nucleotídeos modificados.
[0045] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense e uma fita sense, na qual a fita antisense e a fita sense consistem em, consistem essencialmente em, ou compreendem uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeo dos pares de sequência de nucleotídeos (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID NO:3) e CGUAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID NO:8); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID NO:6) e GCCUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID NO:11), no qual I representa um nucleotídeo inosina (hipoxantina);
na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita antisense e na fita sense são nucleotídeos modificados e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0046] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada que difere em 0 ou 1 nucleotídeo das seguintes sequências de nucleotídeos (5′  3′): usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:2); usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5); usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:7); na qual a, c, g e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato, e na qual o agente RNAi HSD17B13 inclui ainda a fita sense que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense e na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita sense são nucleotídeos modificados.
[0047] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende uma sequência de nucleotídeos modificada que difere em 0 ou 1 nucleotídeo das seguintes sequências de nucleotídeos (5′  3′): usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:2); usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5); usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:7); na qual o agente RNAi HSD17B13 inclui ainda uma fita sense que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense; na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita sense são nucleotídeos modificados; na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita antisense e na fita sense são nucleotídeos modificados e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5’ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil- galactosamina.
[0048] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense e uma fita sense que consistem em, consistem essencialmente em, ou compreendem sequências de nucleotídeos modificadas que diferem em 0 ou 1 nucleotídeo dos seguintes pares de sequência de nucleotídeos (5′  3′): usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID NO:2) e cguaagaaGfUfCfugauagauga (SEQ ID NO:9); usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID NO:4) e cguaagaaGfuCfuGfauagauga (SEQ ID NO:10); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID NO:5) e gccuaggaCfAfUfuuuugiauca (SEQ ID NO:12); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID NO:5) e gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID NO:13); ou usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID NO:7) e gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID NO:13); na qual a, c, g, i e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente e s representa uma ligação fosforotioato.
[0049] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense e uma fita sense que consistem em, consistem essencialmente em, ou compreendem um dos seguintes pares de sequência de nucleotídeos (5′  3′): usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID NO:2) e cguaagaaGfUfCfugauagauga (SEQ ID NO:9);
usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID NO:4) e cguaagaaGfuCfuGfauagauga (SEQ ID NO:10); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID NO:5) e gccuaggaCfAfUfuuuugiauca (SEQ ID NO:12); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID NO:5) e gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID NO:13); ou usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID NO:7) e gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID NO:13); na qual a, c, g, i e u representam 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s representa uma ligação fosforotioato e na qual a fita sense inclui ainda resíduos abásicos invertidos na extremidade 3’ terminal e na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos, e a fita sense também inclui um ligante alvo que é ligado covalentemente à extremidade 5‘ terminal, na qual o ligante alvo inclui N-acetil-galactosamina.
[0050] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que inclui uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada das sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo consistindo em (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUA (SEQ ID NO:26); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAG (SEQ ID NO:41).
[0051] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que inclui uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada das sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo consistindo em (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUA (SEQ ID NO:26); e UGAUCCAAAAAUGUCCUAG (SEQ ID NO:41); na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0052] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense que inclui uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada das sequências de nucleotídeos selecionadas do grupo consistindo em (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUA (SEQ ID NO:26); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAG (SEQ ID NO:41); na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados e na qual SEQ ID N°:26 ou SEQ ID N°:41, respectivamente está localizada nas posições de nucleotídeos 1-19 (5′  3′) da fita antisense.
[0053] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense e uma fita sense que inclui, cada uma, uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada dos pares de sequência de nucleotídeos selecionados do grupo consistindo em (5′  3′):
UCAUCUAUCAGACUUCUUA (SEQ ID NO:26) e UAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID NO:67); UGAUCCAAAAAUGUCCUAG (SEQ ID NO:41) e CUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID NO:86), no qual I representa um nucleotídeo inosina.
[0054] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma fita antisense e uma fita sense que inclui, cada uma, uma sequência de bases nitrogenadas que difere em 0 ou 1 base nitrogenada dos pares de sequência de nucleotídeos selecionados do grupo consistindo em (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUA (SEQ ID NO:26) e UAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID NO:67); UGAUCCAAAAAUGUCCUAG (SEQ ID NO:41) e CUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID N°:86), no qual I representa um nucleotídeo inosina; e na qual todos ou substancialmente todos os nucleotídeos são nucleotídeos modificados.
[0055] Em algumas modalidades, as composições descritas neste documento compreendendo um ou mais agentes RNAi HSD17B13 são embaladas em um kit, recipiente, embalagem, dispensador, seringas pré-preenchidas ou frascos. Em algumas modalidades, as composições descritas neste documento são administradas por via parenteral, p.
ex., por injeção subcutânea.
[0056] Como usado neste documento, os termos “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” significam um polímero de nucleosídeos ligados, cada um dos quais pode ser modificado de forma independente ou não modificado.
[0057] Como usado neste documento, um “agente RNAi” (também referido como um “gatilho RNAi”) significa uma composição que contém uma molécula de oligonucleotídeo de RNA ou semelhante ao RNA (p. ex., RNA quimicamente modificado) que é capaz de degradar ou inibir (p. ex., degrada ou inibe sob condições apropriadas) a tradução de transcritos de RNA mensageiro (mRNA) de um mRNA alvo de uma sequência específica. Como usado neste documento, os agentes RNAi podem operar por meio do mecanismo de RNA de interferência (ou seja, induzir o RNA de interferência por meio da interação com o maquinário da via do RNA de interferência (complexo de silenciamento induzido por RNA ou RISC) de células de mamíferos), ou por qual(is)quer mecanismo(s) ou via(s) alternativo(s). Embora se acredite que os agentes RNAi, como esse termo é usado aqui, operam principalmente por meio do mecanismo de RNA de interferência, os agentes RNAi divulgados não estão ligados ou limitados a qualquer via ou mecanismo de ação particular. Os agentes RNAi aqui divulgados são compostos por uma fita sense e uma fita antisense e incluem, porém, sem limitação a: RNAs de interferência curtos (ou pequenos) (siRNAs), RNAs de fita dupla (dsRNA), micro RNAs (miRNAs),
RNAs hairpin (de grampo de cabelo curtos) (shRNA) e substratos dicer. A fita antisense dos agentes RNAi aqui descritos é pelo menos parcialmente complementar ao mRNA para o qual está sendo direcionado (ou seja, HSD17B13 mRNA). Os agentes RNAi podem incluir um ou mais nucleotídeos modificados e/ou uma ou mais ligações não fosfodiéster.
[0058] Conforme usado neste documento, os termos “silenciar”, “reduzir”, “inibir”, “regular para baixo” ou “knockdown” quando se referem à expressão de um determinado gene, significam que a expressão do gene, conforme medido pelo nível de RNA transcrito a partir do gene ou do nível de polipeptídeo, proteína ou subunidade de proteína traduzido do mRNA em uma célula, grupo de células, tecido, órgão ou sujeito no qual o gene é transcrito, é reduzida quando a célula, grupo de células, tecido, órgão ou sujeito é tratado com os agentes RNAi aqui descritos em comparação com uma segunda célula, grupo de células, tecido, órgão ou sujeito que não foi ou não foram tratado(s).
[0059] Conforme usado neste documento, os termos “sequência” e “sequência de nucleotídeos” significam uma sucessão ou ordem de bases nitrogenadas ou nucleotídeos, descritos com uma sucessão de letras usando a nomenclatura padrão.
[0060] Como usado neste documento, uma “base”, “base de nucleotídeo” ou “base nitrogenada” é uma pirimidina heterocíclica ou composto de purina que é um componente de um nucleotídeo e inclui as bases de purina primárias, adenina e guanina, e as bases de pirimidina primárias, citosina, timina e uracila. Uma base nitrogenada pode ainda ser modificada para incluir, sem limitação, bases universais, bases hidrofóbicas, bases promíscuas, bases de tamanho expandido e bases fluoradas. (Ver, p. ex., Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008). A síntese de tais bases nitrogenadas modificadas (incluindo compostos de fosforamidita que incluem bases nitrogenadas modificadas) é conhecida na técnica.
[0061] Como usado neste documento, e a menos que indicado de outra forma, o termo “complementar”, quando usado para descrever uma primeira base nitrogenada ou sequência de nucleotídeos (p. ex., fita sense do agente RNAi ou mRNA direcionado) em relação a uma segunda base nitrogenada ou sequência de nucleotídeos (p. ex., fita antisense do agente RNAi ou um oligonucleotídeo antisense de fita simples), significa a capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, incluindo a primeira sequência de nucleotídeos para hibridizar (formar ligações de hidrogênio de pares de bases sob condições fisiológicas de mamíferos (ou de outra forma adequada nas condições in vivo ou in vitro)) e formam uma estrutura duplex ou em dupla hélice sob certas condições padrão com um oligonucleotídeo que inclui a segunda sequência de nucleotídeos. A pessoa de habilidade comum na técnica seria capaz de selecionar o conjunto de condições mais apropriado para um teste de hibridização. As sequências complementares incluem pares de bases Watson-Crick ou pares de bases não- Watson-Crick e incluem nucleotídeos naturais ou modificados ou mimetizadores de nucleotídeos, pelo menos na medida em que os requisitos de hibridização acima sejam atendidos. A identidade ou complementaridade da sequência é independente da modificação. Por exemplo, a e Af, conforme definido neste documento, são complementares a U (ou T) e idênticos a A para fins de determinação de identidade ou complementaridade.
[0062] Como usado neste documento, “perfeitamente complementar” ou “totalmente complementar” significa que em um par hibridizado de bases nitrogenadas ou moléculas de sequência de nucleotídeos, todas (100%) as bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonucleotídeo vão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A sequência contígua pode compreender a totalidade ou parte de uma primeira ou segunda sequência de nucleotídeos.
[0063] Como usado neste documento, “parcialmente complementar” significa que em um par hibridizado de bases nitrogenadas ou moléculas de sequência de nucleotídeos, pelo menos 70%, mas não todas, as bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonucleotídeo vão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A sequência contígua pode compreender a totalidade ou parte de uma primeira ou segunda sequência de nucleotídeos.
[0064] Como usado neste documento, “substancialmente complementar” significa que em um par hibridizado de bases nitrogenadas ou moléculas de sequência de nucleotídeos, pelo menos 85%, mas não todas, as bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonucleotídeo vão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A sequência contígua pode compreender a totalidade ou parte de uma primeira ou segunda sequência de nucleotídeos.
[0065] Como usado neste documento, os termos “complementar”, “totalmente complementar”, “parcialmente complementar” e “substancialmente complementar” são usados em relação à base nitrogenada ou ao nucleotídeo correspondente entre a fita sense e a fita antisense de um agente RNAi, ou entre a fita antisense de um agente RNAi e uma sequência de um mRNA HSD17B13.
[0066] Como usado neste documento, o termo “substancialmente idêntico” ou “identidade substancial”, conforme aplicado a uma sequência de ácido nucleico significa que a sequência de nucleotídeos (ou uma porção de uma sequência de nucleotídeos) tem pelo menos cerca de 85%
de identidade de sequência ou mais, p. ex., pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% de identidade, em comparação com uma sequência de referência. A porcentagem de identidade de sequência é determinada ao comparar duas sequências alinhadas de forma otimizada em uma janela de comparação. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais o mesmo tipo de base de ácido nucleico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. As invenções divulgadas neste documento abrangem sequências de nucleotídeos substancialmente idênticas às divulgadas neste documento.
[0067] Conforme usado neste documento, os termos “tratar”, “tratamento” e semelhantes significam os métodos ou etapas tomadas para fornecer alívio ou alívio do número, gravidade e/ou frequência de um ou mais sintomas de uma doença em um sujeito. Conforme usado neste documento, “tratar” e “tratamento” podem incluir prevenção, manejo, tratamento profilático e/ou inibição ou redução do número, gravidade e/ou frequência de um ou mais sintomas de uma doença em um sujeito.
[0068] Conforme usado neste documento, a frase “introdução em uma célula”, quando se refere a um agente
RNAi, significa administrar funcionalmente o agente RNAi em uma célula. A frase “administração funcional” significa administrar o agente RNAi à célula de forma que permite que o agente RNAi tenha a atividade biológica esperada, por exemplo, inibição específica de sequência da expressão gênica.
[0069] Salvo se indicado de outra forma, o uso do símbolo como usados aqui, significa que qualquer grupo ou grupos podem estar ligados a este que está de acordo com o escopo das invenções descritas neste documento.
[0070] Como usado neste documento, o termo “isômeros” se refere a compostos que têm fórmulas moleculares idênticas, mas que diferem na natureza ou na sequência de ligação de seus átomos ou no arranjo de seus átomos no espaço. Os isômeros que diferem no arranjo de seus átomos no espaço são chamados de “estereoisômeros”. Os estereoisômeros que não são imagens de espelho um do outro são chamados de “diastereoisômeros”, e os estereoisômeros que são imagens de espelho não sobreponíveis são chamados de “enantiômeros” ou, às vezes, isômeros ópticos. Um átomo de carbono ligado a quatro substituintes não idênticos é denominado um “centro quiral”.
[0071] Como usado neste documento, a menos que especificamente identificado em uma estrutura como tendo uma conformação particular, para cada estrutura na qual os centros assimétricos estão presentes e, assim, dão origem a enantiômeros, diastereômeros ou outras configurações estereoisoméricas, cada estrutura divulgada neste documento destina-se a representar todos os possíveis isômeros, incluindo suas formas opticamente puras e racêmicas. Por exemplo, as estruturas divulgadas neste documento destinam- se a cobrir misturas de diastereômeros, bem como estereoisômeros individuais.
[0072] Como usada em uma reivindicação neste documento, a frase “consistindo em” exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. Quando usada em uma reivindicação neste documento, a frase “consistindo essencialmente em” limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada.
[0073] A pessoa de habilidade comum na técnica compreenderia prontamente e observaria que os compostos e composições divulgados neste documento podem ter alguns átomos (por exemplo, átomos de N, O ou S) em um estado protonado ou desprotonado, dependendo do ambiente em que o composto ou composição é colocado. Desta forma, como usada neste documento, as estruturas aqui divulgadas consideram que certos grupos funcionais, tais como, por exemplo, OH, SH ou NH, podem estar protonados ou desprotonados. A divulgação neste documento destina-se a cobrir os compostos e composições divulgados, independentemente de seu estado de protonação com base no ambiente (como o pH), como seria facilmente compreendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Correspondentemente, os compostos aqui descritos com prótons lábeis ou átomos básicos também devem ser entendidos como representando formas de sal do composto correspondente. Os compostos descritos neste documento podem estar na forma de ácido, base livre ou sal. Os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico dos compostos descritos neste documento devem ser entendidos como estando dentro do escopo da invenção.
[0074] Como usado neste documento, o termo “ligado” ou “conjugado”, quando se refere à conexão entre dois compostos ou moléculas, significa que dois compostos ou moléculas são unidos por uma ligação covalente. A menos que indicado, os termos “ligado” e “conjugado”, conforme usados neste documento, podem referir-se à conexão entre um primeiro composto e um segundo composto com ou sem quaisquer átomos ou grupos de átomos intervenientes.
[0075] Como usado neste documento, o termo “incluindo” é usado para significar aqui, e é usado indistintamente com a frase “incluindo, porém sem limitação”. O termo “ou” é usado neste documento para significar e é usado indistintamente com o termo “e/ou”, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0076] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos neste documento têm o mesmo significado que comumente compreendidos por pessoas versadas na técnica à qual pertence essa invenção. Embora os métodos e materiais, similares ou equivalentes aos aqui descritos, possam ser usados na prática ou testados da presente divulgação, os métodos preferidos e materiais estão descritos neste documento. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a serem limitantes.
[0077] Outros objetos, características, aspectos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, figuras anexas e das reivindicações.
RÁPIDA DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0078] FIGURA 1A a 1D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06214 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de ácido livre.
[0079] FIGURA 2A a 2D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06280 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de
(NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de ácido livre.
[0080] FIGURA 3A a 3D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06187 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de ácido livre.
[0081] FIGURA 4A a 4D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06276 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de ácido livre.
[0082] FIGURA 5A a 5D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06277 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de ácido livre.
[0083] FIGURA 6A a 6D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06214 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de sal sódico.
[0084] FIGURA 7A a 7D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06280 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de
(NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de sal sódico.
[0085] FIGURA 8A a 8D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06187 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de sal sódico.
[0086] FIGURA 9A a 9D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06276 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de sal sódico.
[0087] FIGURA 10A a 10D. Representação da estrutura química do agente RNAi HSD17B13 AD06277 conjugado com o ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado de (NAG37)s na extremidade 5’ terminal da fita sense, mostrada na forma de sal sódico.
[0088] FIGURA 11A. Diagrama esquemático das fitas sense e antisense modificadas do agente RNAi HSD17B13 AD06214 (ver Tabelas 3- 5), conjugado a um ligante tridentado de N-acetil-galactosamina com a estrutura de (NAG37)s (ver Tabela 6; Figuras. 1 e 6). As seguintes abreviaturas são usadas nas Figuras 11A a 11E: a, c, g, i e u são nucleotídeos 2′-O-metil modificados; Af, Cf, Gf e Uf são nucleotídeos 2′-fluoro modificados; o é uma ligação fosfodiéster; s é uma ligação fosforotioato; invAb é um resíduo abásico invertido; e (NAG37)s é um ligante alvo de N-acetil-galactosamina tridentado com a estrutura representada na Tabela 6. A Figura 11A divulga SEQ ID N°s: 2 e 14.
[0089] FIGURA 11B. Diagrama esquemático das fitas sense e antisense modificadas do agente RNAi HSD17B13 AD06280 (ver Tabelas 3- 5), conjugado a um ligante tridentado de N-acetil-galactosamina com a estrutura de (NAG37)s (ver Tabela 6). A Figura 11B divulga SEQ ID N°s: 4 e 15.
[0090] FIGURA 11C. Diagrama esquemático das fitas sense e antisense modificadas do agente RNAi HSD17B13 AD06187 (ver Tabelas 3- 5), conjugado a um ligante tridentado de N-acetil-galactosamina com a estrutura de (NAG37)s (ver Tabela 6). A Figura 11C divulga SEQ ID N°s: 5 e 16.
[0091] FIGURA 11D. Diagrama esquemático das fitas sense e antisense modificadas do agente RNAi HSD17B13 AD06276 (ver Tabelas 3- 5), conjugado a um ligante tridentado de N-acetil-galactosamina com a estrutura de (NAG37)s (ver Tabela 6). A Figura 11D divulga SEQ ID N°s: 5 e 17.
[0092] FIGURA 11E. Diagrama esquemático das fitas sense e antisense modificadas do agente RNAi HSD17B13 AD06277 (ver Tabelas 3- 5), conjugado a um ligante tridentado de N-acetil-galactosamina com a estrutura de
(NAG37)s (ver Tabela 6). A Figura 11D divulga SEQ ID N°s: 7 e 17.
DESCRIÇÃO DETALHADA Agentes RNAi
[0093] São descritos aqui agentes RNAi para inibir a expressão de um gene HSD17B13 (referido neste documento como agentes RNAi HSD17B13 ou 17β-HSD13 ou ativadores de RNAi HSD17B13 ou 17β-HSD13 ). Cada agente RNAi HSD17B13 compreende uma fita sense e uma fita antisense. As fitas sense e antisense podem ter, cada uma, 16 a 49 nucleotídeos de comprimento. As fitas sense e antisense podem ter o mesmo comprimento ou podem ter comprimentos diferentes. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, cada uma, independentemente, 17 a 27 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, cada um, independentemente, 19 a 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, cada uma, independentemente, 21 a 26 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, cada uma, independentemente, 21 a 24 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita sense tem cerca de 19 nucleotídeos de comprimento, enquanto a fita antisense tem cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita sense tem cerca de 21 nucleotídeos de comprimento, enquanto a fita antisense tem cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita sense tem 23 nucleotídeos de comprimento, e a fita antisense tem 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense têm, cada uma, independentemente, 21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense do agente RNAi têm, cada uma, independentemente, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 nucleotídeos de comprimento.
Em algumas modalidades, um agente RNAi de fita dupla tem um comprimento de duplex de cerca de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos.
[0094] Os exemplos de sequências de nucleotídeo usados na formação dos agentes RNAi HSD17B13 são fornecidos na Tabelas 2, 3 e 4. Os exemplos de duplexes de agente RNAi, que incluem as sequências de fita sense e antisense nas Tabelas 2, 3 e 4, são mostrados na Tabela 5 e também são descritos nas Figuras 1A a 10D e nas Figuras 11A a 11E.
[0095] Em algumas modalidades, a região de complementaridade perfeita, substancial ou parcial entre a fita sense e a fita antisense tem 16- 26 (p. ex., 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26) nucleotídeos de comprimento e ocorre na ou próxima da extremidade 5′ da fita antisense (p. ex., esta região pode ser separada da extremidade 5′ da fita antisense por 0, 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos que não são perfeita, substancial ou parcialmente complementares).
[0096] Uma fita sense dos agentes RNAi HSD17B13 descritos neste documento incluem pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos que têm pelo menos 85% de identidade com uma sequência de estiramento central (também referido neste documento como um “estiramento central” ou “sequência central”) do mesmo número de nucleotídeos em um mRNA HSD17B13. Em algumas modalidades, uma sequência de estiramento central da fita sense é 100% (perfeitamente) complementar ou pelo menos cerca de 85% (substancialmente) complementar a uma sequência de estiramento central na fita antisense e, assim, a sequência de estiramento central da fita sense é tipicamente perfeitamente idêntica ou pelo menos cerca de 85% idêntica a uma sequência de nucleotídeos do mesmo comprimento (às vezes referida, e.g., como uma sequência alvo) presente no mRNA HSD17B13 alvo. Em algumas modalidades, o estiramento central da fita sense têm, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos de comprimento.
Em algumas modalidades, este estiramento central da fita sense tem 17 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, este estiramento central da fita sense tem 19 nucleotídeos de comprimento.
[0097] Uma fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 descrito neste documento inclui pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos que têm pelo menos 85% de complementaridade com um estiramento central com o mesmo número de nucleotídeos em um mRNA HSD17B13 e a um estiramento central com o mesmo número de nucleotídeos na fita sense correspondente. Em algumas modalidades, uma sequência de estiramento central da fita sense é 100% (perfeitamente) complementar ou pelo menos cerca de 85% (substancialmente) complementar a uma sequência de nucleotídeos (p. ex., sequência alvo) do mesmo comprimento presente no mRNA HSD17B13 alvo. Em algumas modalidades, o estiramento central da fita antisense tem 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, este estiramento central da fita antisense tem 19 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, este estiramento central da fita antisense tem 17 nucleotídeos de comprimento. Uma sequência de estiramento central da fita sense pode ter o mesmo comprimento que uma sequência central antisense correspondente ou pode ter um comprimento diferente.
[0098] As fitas sense e antisense do agente RNAi HSD17B13se anelam para formar um duplex. A fita sense e a fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 podem ser parcial, substancial ou totalmente complementares uma à outra. Dentro da região duplex complementar, a sequência de estiramento central da fita sense é pelo menos 85% complementar ou 100% complementar à sequência de estiramento central da fita antisense. Em algumas modalidades, a sequência de estiramento central da fita sense contém uma sequência de pelo menos 16, pelo menos 17,
pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22 ou pelo menos 23 nucleotídeos que é pelo menos 85% ou 100% complementar a uma sequência correspondente de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos da sequência de estiramento central da fita antisense (ou seja, as sequências de estiramento central da fita sense e antisense do agente RNAi HSD17B13 têm uma região de pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22 ou pelo menos 23 nucleotídeos que são pelo menos 85% de bases pareadas ou 100% de bases pareadas.)
[0099] Em algumas modalidades, a fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 divulgada neste documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências da fita antisense na Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, a fita sense de um agente RNAi HSD17B13 divulgada neste documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências da fita antisense na Tabela 2 ou Tabela 4.
[0100] Em algumas modalidades, a fita sense e/ou a fita antisense podem, opcional e independentemente, conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos adicionais (extensão) na extremidade 3′, na extremidade 5′ ou em ambas as extremidades 3′ e 5′ das sequências de estiramento central.
Os nucleotídeos adicionais da fita antisense, se presentes, podem ou não ser complementares à sequência correspondente no mRNA HSD17B13. Os nucleotídeos adicionais da fita sense, se presentes, podem ou não ser idênticos à sequência correspondente no mRNA HSD17B13. Os nucleotídeos adicionais da fita antisense, se presentes, podem ou não ser complementares aos nucleotídeos adicionais da fita sense correspondente, se presentes.
[0101] Como usada neste documento, uma extensão compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 3’ da sequência de estiramento central da fita sense e/ou da sequência de estiramento central da fita antisense. Os nucleotídeos de extensão em uma fita sense podem ou não ser complementares aos nucleotídeos, tanto os nucleotídeos da sequência central de extensão quanto os nucleotídeos de extensão, na fita antisense correspondente.
Por outro lado, os nucleotídeos de extensão em uma fita antisense podem ou não ser complementares aos nucleotídeos, tanto os nucleotídeos de extensão do núcleo quanto os nucleotídeos de extensão, na fita sense correspondente. Em algumas modalidades, ambas as fitas sense e a fita antisense de um agente RNAi contêm extensões 3′ e 5′. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão 3′ de uma base de fita emparelham com um ou mais nucleotídeos de extensão 5′ da outra fita. Em outras modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão 3′ de uma fita não emparelham com um ou mais nucleotídeos de extensão 5′ da outra fita. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 tem uma fita antisense com uma extensão 3′ e uma fita sense com uma extensão 5′. Em algumas modalidades, o(s) nucleotídeo(s) de extensão não é(são) pareado(s) e forma(m) uma saliência. Como usado neste documento, uma “saliência” refere-se a um estiramento de um ou mais nucleotídeos não pareados localizados em uma extremidade terminal da fita sense ou da fita antisense que não faz parte da porção hibridizada ou duplexada de um agente RNAi divulgado neste documento.
[0102] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 compreende uma fita antisense com uma extensão 3′ de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, um agente RNAi HSD17B13 compreende uma fita antisense com uma extensão 3′ de 1, 2 ou 3 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão da fita antisense compreendem nucleotídeos que são complementares à sequência mRNA HSD17B13 correspondente. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão da fita antisense compreendem nucleotídeos que não são complementares à sequência mRNA HSD17B13 correspondente.
[0103] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 compreende uma fita sense com uma extensão 3′ de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão da fita sense compreendem nucleotídeos adenosina, uracila ou timidina,
dinucleotídeo AT ou nucleotídeos que correspondem a ou são idênticos aos nucleotídeos na sequência mRNA HSD17B13. Em algumas modalidades, a extensão da fita sense 3′ inclui ou consiste em uma das seguintes sequências, porém sem limitação: T, UT, TT, UU, UUT, TTT ou TTTT (cada uma listada 5′ a 3′).
[0104] Uma fita sense pode ter uma extensão 3′ e/ou uma extensão 5′. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 compreende uma fita sense com uma extensão 5′ de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos de extensão da fita sense compreendem nucleotídeos que correspondem a ou são idênticos aos nucleotídeos na sequência mRNA HSD17B13.
Em algumas modalidades, a extensão 5′ da fita sense é uma das seguintes sequências, porém sem limitação: CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, UCA, UAU, U, UU (cada uma listada 5′ a 3′).
[0105] Os exemplos de sequências usados na formação dos agentes RNAi HSD17B13 são fornecidos na Tabelas 2, 3 e
4. Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente RNAi HSD17B13 inclui uma sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 3. Em certas modalidades, uma fita antisense do agente RNAi HSD17B13 compreende ou consiste em qualquer uma das sequências modificadas na Tabela 3. Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente RNAi HSD17B13 inclui a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 1-17, 2-15, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21 ou 2-21, de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 3. Em algumas modalidades, uma fita sense do agente RNAi HSD17B13 inclui a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 4. Em algumas modalidades, uma fita sense do agente RNAi HSD17B13 inclui a sequência de nucleotídeos (do terminal 5′  terminal 3′) 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 2-19, 2-20, 2-21, 3- 20, 3-21 ou 4-21, de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 4. Em certas modalidades, uma fita sense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na Tabela 4.
[0106] Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense dos agentes RNAi descritos neste documento têm o mesmo número de nucleotídeos. Em algumas modalidades, as fitas sense e antisense dos agentes RNAi descritos neste documento têm diferentes números de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a extremidade 5′ da fita sense e a extremidade 3′ da fita antisense de um agente RNAi formam uma extremidade cega. Em algumas modalidades, a extremidade 3′ da fita sense e a extremidade 5′ da fita antisense de um agente RNAi formam uma extremidade cega. Em algumas modalidades, ambas as extremidades de um agente RNAi formam extremidades cegas. Em algumas modalidades, nenhuma das extremidades de um agente RNAi tem extremidade cega. Como usado neste documento, uma "extremidade cega" refere-se a uma extremidade de um agente RNAi de fita dupla na qual os nucleotídeos terminais das duas fitas aneladas são complementares (formam um par de bases complementar).
[0107] Em algumas modalidades, a extremidade 5′ da fita sense e a extremidade 3′ da fita antisense de um agente RNAi formam uma extremidade desgastada. Em algumas modalidades, a extremidade 3′ da fita sense e a extremidade 5′ da fita antisense de um agente RNAi formam uma extremidade desgastada. Em algumas modalidades, ambas as extremidades de um agente RNAi formam extremidades desgastadas. Em algumas modalidades, nenhuma das extremidades de um agente RNAi tem extremidade desgastada.
Como usado neste documento, uma "extremidade desgastada" refere-se a uma extremidade de um agente RNAi de fita dupla na qual os nucleotídeos terminais das duas fitas aneladas forma um par (ou seja, não formam uma saliência), mas não são complementares (ou seja, formam um par não complementar). Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos não pareados no final de uma fita de um agente RNAi de fita dupla formam uma saliência. Os nucleotídeos não pareados podem estar na fita sense ou na fita antisense, criando saliências 3' ou 5'. Em algumas modalidades, o agente RNAi contém: uma extremidade cega e uma extremidade desgastada, uma extremidade cega e uma extremidade saliente 5', uma extremidade cega e uma extremidade saliente 3', uma extremidade desgastada e uma extremidade saliente 5', uma extremidade desgastada e uma extremidade saliente 3', duas extremidades salientes 5', duas extremidades salientes 3', uma extremidade saliente 5' e uma extremidade saliente 3', duas extremidades desgastadas ou duas extremidades cegas. Normalmente, quando presentes, as saliências estão localizadas nas extremidades 3’ terminal da fita sense, da fita antisense ou de ambas as fitas sense e antisense.
[0108] Os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento também podem ser compreendidos por um ou mais nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antisense do agente RNAi HSD17B13 são nucleotídeos modificados. Os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento podem ainda ser compreendidos por uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas, por exemplo, uma ou mais ligações fosforotioato. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 contém um ou mais nucleotídeos modificados e uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado 2′ é combinado com uma ligação internucleosídica modificada.
[0109] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 é preparado ou fornecido como um sal, sal misto ou ácido livre. Em algumas modalidades, um agente RNAi
HSD17B13 é preparado como um sal sódico. Essas formas que são bem conhecidas na técnica estão dentro do escopo das invenções aqui divulgadas.
Nucleotídeos modificados
[0110] Os nucleotídeos modificados, quando usados em vários construtos de oligonucleotídeos, podem preservar a atividade do composto nas células enquanto, ao mesmo tempo, aumentam a estabilidade sérica desses compostos, e também podem minimizar a possibilidade de ativar a atividade do interferon em humanos após a administração do construto de oligonucleotídeo.
[0111] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 contém um ou mais nucleotídeos modificados. Como usado neste documento, um “nucleotídeo modificado” é um nucleotídeo diferente de um ribonucleotídeo (2′-hidroxil nucleotídeo). Em algumas modalidades, pelo menos 50% (p.
ex., pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%) dos nucleotídeos são nucleotídeos modificados. Como usado neste documento, os nucleotídeos modificados podem incluir, porém sem limitação, desoxirribonucleotídeos, minetizadores de nucleotídeos, nucleotídeos abásicos, nucleotídeos 2′-modificados, nucleotídeos invertidos, nucleotídeos compreendendo base nitrogenada modificada, nucleotídeos em ponte, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), mimetizadores 2′,3′-seco nucleotídeos (análogos de base nitrogenada desbloqueada), nucleotídeos bloqueados, nucleotídeos 3′-O-metoxi (2′ internucleosídeo ligado), nucleotídeos 2'-F-Arabino, nucleotídeo 5'-Me, 2'-fluoro, nucleotídeos morfolino, desoxirribonucleotídeos de fosfonato de vinila, nucleotídeos contendo fosfonato de vinila e nucleotídeos contendo fosfonato de ciclopropila. Nucleotídeos modificados 2′ (ou seja, um nucleotídeo com um grupo diferente de um grupo hidroxil na posição 2' do anel de açúcar de cinco membros) inclui, porém sem limitação, 2'-O- metil nucleotídeos, 2'-fluoro nucleotídeos (também aqui referidos como 2 ′-desoxi-2′-fluoro nucleotídeos), 2′- desoxi nucleotídeos, 2′-metoxietil (2′- -2-metoxiletil) nucleotídeos (também referidos como 2′-MOE), 2′-amino nucleotídeos, e 2'-alquil nucleotídeos. Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam uniformemente modificadas. Por outro lado, mais de uma modificação pode ser incorporada em um único agente RNAi HSD17B13 ou mesmo em um único nucleotídeo desse agente. As fitas sense e as fitas antisense do agente RNAi HSD17B13 podem ser sintetizadas e/ou modificadas por métodos conhecidos na técnica. A modificação em um nucleotídeo é independente da modificação em outro nucleotídeo.
[0112] Bases nitrogenadas modificadas incluem bases nitrogenadas sintéticas e naturais, tais como pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, (p. ex., 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracil ou 5-propinilcitosina), 5- metilcitosina (5- me-C), 5-hidroximetil citosina, inosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-alquil (p. ex., 6-metil, 6- etil, 6-isopropil ou 6-n-butil) derivados de adenina e guanina, 2-alquil (p. ex., 2-metil, 2-etil, 2-isopropil ou 2-n-butil) e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina, 2-tiocitosina, 5-halouracil, citosina, 5-propinil uracil, 5-propinilcitosina, 6-azo uracil, 6-azo citosina, 6-azo timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-sulfidril, 8-tioalquil, 8 -hidroxil e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo (p. ex., 5-bromo), 5-trifluorometil e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7- deazaguanina, 7deaza-adenina, 3-deazaguanina e 3-deaza- adenina.
[0113] Em algumas modalidades, a extremidade 5′ e/ou 3′ da fita antisense pode incluir resíduos abásicos (Ab), que também podem ser referidos como um "sítio abásico" ou "nucleotídeo abásico". Um resíduo abásico (Ab) é um nucleotídeo ou nucleosídeo que não possui uma base nitrogenada na posição 1′ da porção açúcar. (Veja, p. ex., Patente US N°. 5.998.203). Em algumas modalidades, um resíduo abásico pode ser colocado internamente em uma sequência de nucleotídeos. Em algumas modalidades, Ab ou
AbAb pode ser adicionado à extremidade 3′ da fita antisense. Em algumas modalidades, a extremidade 5′ da fita sense pode incluir um ou mais resíduos abásicos adicionais (p. ex., (Ab) ou (AbAb)). Em algumas modalidades, UUAb, UAb, ou Ab são adicionados à extremidade 3′ da fita sense.
Em algumas modalidades, um resíduo abásico (desoxirribose) pode ser substituído por um resíduo ribitol (ribose abásica).
[0114] Em algumas modalidades, todos ou substancialmente todos os nucleotídeos de um agente RNAi são nucleotídeos modificados. Como usado neste documento, um agente RNAi no qual substancialmente todos os nucleotídeos presentes são nucleotídeos modificados é um agente de RNAi com quatro ou menos (ou seja, 0, 1, 2, 3 ou 4) nucleotídeos na fita sense e antisense sendo ribonucleotídeos (ou seja, não modificados). Como usado neste documento, uma fita sense na qual substancialmente todos os nucleotídeos presentes são nucleotídeos modificados é uma fita sense com dois ou menos (isto é, 0, 1 ou 2) nucleotídeos na fita sense que são ribonucleotídeos não modificados. Como usado neste documento, uma fita antisense sense na qual substancialmente todos os nucleotídeos presentes são nucleotídeos modificados é uma fita antisense sense tendo dois ou menos (isto é, 0, 1 ou 2) nucleotídeos na fita sense sendo ribonucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos de um agente RNAi é um ribonucleotídeo não modificado.
Ligações internucleosídeas modificadas
[0115] Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos de um agente RNAi HSD17B13 são ligados por ligações não padrão ou estruturais (isto é, ligações internucleosídicas modificadas ou estruturais modificadas). As ligações internucleosídicas ou estruturais modificadas incluem, porém sem limitação, grupos fosforotioato (representados aqui como um “s” minúsculo), fosforotioatos quirais, tiofosfatos, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, alquil fosfonatos (p. ex., metil fosfonatos ou 3′-alquileno fosfonatos), fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos (p. ex., 3′-amino fosforamidato, aminoalquilfosforamidatos ou tionofosforamidatos), tionoalquil-fosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, ligações morfolino, boranofosfatos com ligações 3′-5′ normais, análogos 2′-5′ ligados de boranofosfatos, ou boranofosfatos com polaridade invertida, nos quais os pares adjacentes de unidades de nucleosídeos estão ligados 3′-5′ a 5′-3′ ou 2′-5′ a 5′-2′.
Em algumas modalidades, uma ligação internucleosídica ou estrutural modificada não tem um átomo de fósforo. As ligações internucleosídicas modificadas sem um átomo de fósforo incluem, porém sem limitação, ligações inter- açúcares de cadeia curta alquil ou cicloalquil,
heteroátomos mistos e ligações inter-açúcares alquil ou cicloalquil, ou uma ou mais ligações inter-açúcares heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Em algumas modalidades, as estruturas internucleosídicas modificadas incluem, porém sem limitação, estruturas de siloxano, estruturas de sulfeto, estruturas de sulfóxido, estruturas de sulfona, estruturas de formalcetil e tioformacetil, estruturas de metileno formacetil e tioformacetil, estruturas contendo alceno, estruturas de sulfamato, estruturas de metilenoimidino, metilenohidrazina, estruturas de sulfonato e sulfonamida, estruturas de amida e outras estruturas com componentes mistos de N, O, S e CH2.
[0116] Em algumas modalidades, uma fita sense de um agente RNAi HSD17B13 pode conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações fosforotioato, uma fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 pode conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações fosforotioato, ou ambas as fitas sense e antisense podem conter, independentemente, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações fosforotioato. Em algumas modalidades, uma fita sense de um agente RNAi HSD17B13pode conter 1, 2, 3 ou 4 ligações fosforotioato, uma fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 pode conter 1, 2, 3 ou 4 ligações fosforotioato, ou ambas as fitas sense e antisense podem conter, independentemente, 1, 2, 3 ou 4 ligações fosforotioato.
[0117] Em algumas modalidades, uma fita sense do agente RNAi HSD17B13 contém pelo menos duas ligações internucleosídeas de fosforotioato. Em algumas modalidades, as ligações internucleosídeas de fosforotioato estão entre os nucleotídeos nas posições 1- 3 da extremidade 3' da fita sense. Em algumas modalidades, uma ligação internucleosídica de fosforotioato está na extremidade 5' da sequência de nucleotídeos da fita sense e outra ligação de fosforotioato está na extremidade 3' da sequência de nucleotídeos da fita sense. Em algumas modalidades, duas ligações internucleosídeas de fosforotioato estão localizadas na extremidade 5' da fita sense e outra ligação de fosforotioato está na extremidade 3' da fita sense. Em algumas modalidades, a fita sense não inclui quaisquer ligações internucleosídeas de fosforotioato entre os nucleotídeos, mas contém uma, duas ou três ligações de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 5' e 3' e as extremidades terminais de resíduos abásicos invertidos opcionalmente presentes. Em algumas modalidades, o ligante alvo está ligado à fita sense por meio de uma ligação de fosforotioato.
[0118] Em algumas modalidades, uma fita antisense de agente de RNAi HSD17B13 contém quatro ligações internucleosídeas de fosforotioato. Em algumas modalidades, as quatro ligações internucleosídeas de fosforotioato estão entre os nucleotídeos nas posições 1- 3 da extremidade 5'
da fita antisense e entre os nucleotídeos nas posições 19- 21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25 ou 24-26 da extremidade 5'.
Em algumas modalidades, três ligações internucleosídeas de fosforotioato estão localizadas nas posições 1-4 da extremidade 5' da fita antisense e uma quarta ligação internucleosídica de fosforotioato está localizada entre as posições 20-21 na extremidade 5' da fita antisense. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 contém pelo menos três ou quatro ligações internucleosídicas de fosforotioato na fita antisense.
Resíduos ou partes de capeamento
[0119] Em algumas modalidades, a fita sense pode incluir um ou mais resíduos ou partes de capeamento, às vezes chamados na técnica como "cap", "cap terminal" ou "resíduo de capeamento". Como usado neste documento, um "resíduo de capeamento" é um composto não nucleotídeo ou outra parte que pode ser incorporada em um ou mais terminais de uma sequência de nucleotídeos de um agente RNAi divulgado aqui. Um resíduo de capeamento pode fornecer ao agente RNAi, em alguns casos, certas propriedades benéficas, como, por exemplo, proteção contra a degradação por exonuclease. Em algumas modalidades, resíduos abásicos invertidos (invAb) (também chamados na técnica como "sítios abásicos invertidos") são adicionados como resíduos de capeamento (ver Tabela A). (ver, p. ex., F. Czauderna, Nucleic Acids Res., 2003, 31(11), 2705- 16). Em geral, os resíduos de capeamento são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, resíduos abásicos invertidos, assim como cadeias de carbono, como um C3H7 (propil), C6H13 (hexil) terminal, ou grupos C12H25 (dodecil). Em algumas modalidades, um resíduo de capeamento está presente na extremidade terminal 5', na extremidade terminal 3' ou em ambas as extremidades terminais 5 'e 3' da fita sense. Em algumas modalidades, a extremidade 5' e/ou a extremidade 3' da fita sense pode incluir mais de uma fração desoxirribose abásica invertida como um resíduo de capeamento.
[0120] Em algumas modalidades, um ou mais resíduos abásicos invertidos (invAb) são adicionados à extremidade 3′ da fita sense. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos abásicos invertidos (invAb) são adicionados à extremidade 5′ da fita sense. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos abásicos invertidos ou locais abásicos invertidos são inseridos entre o ligante alvo e a sequência de nucleotídeos da fita sense do agente RNAi. Em algumas modalidades, a inclusão de um ou mais resíduos abásicos invertidos ou sítios abásicos invertidos na ou perto da extremidade terminal ou extremidades terminais da fita sense de um agente RNAi permite a atividade intensificada ou outras propriedades desejadas de um agente RNAi.
[0121] Em algumas modalidades, um ou mais resíduos abásicos invertidos (invAb) são adicionados à extremidade 5′ da fita sense. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos abásicos invertidos ou locais abásicos invertidos podem ser inseridos entre o ligante alvo e a sequência de nucleotídeos da fita sense do agente RNAi. Os resíduos abásicos invertidos podem ser ligados por meio de fosfato, fosforotioato (p. ex., mostrado aqui como (invAb) s)) ou outras ligações internucleosídicas. Em algumas modalidades, a inclusão de um ou mais resíduos abásicos invertidos na ou perto da extremidade terminal ou extremidades terminais da fita sense de um agente RNAi pode permitir a atividade intensificada ou outras propriedades desejadas de um agente RNAi. Em algumas modalidades, um resíduo abásico invertido (desoxirribose) pode ser substituído por um resíduo ribitol invertido (ribose abásica). Em algumas modalidades, a extremidade 3′ da sequência de estiramento central da fita antisense, ou a extremidade 3′ da sequência da fita antisense, pode incluir um resíduo abásico invertido. As estruturas químicas para os resíduos de desoxirribose abásicos invertidos são mostradas na Tabela 6 abaixo, assim como nas estruturas químicas mostradas nas Figuras 1A a 10D.
Agentes RNAi HSD17B13
[0122] Os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento são projetados para direcionar posições específicas em um gene HSD17B13 (SEQ ID N°:1). Como definido neste documento, uma sequência de fita antisense é projetada para ter como alvo um gene HSD17B13 em uma determinada posição no gene quando a base nitrogenada 5′ terminal da fita antisense está alinhada com uma posição que é 21 nucleotídeos a jusante (em direção à extremidade 3′) da posição no gene durante o pareamento de bases no gene. Por exemplo, conforme ilustrado nas Tabelas 1 e 2 neste documento, uma sequência de fita antisense projetada para ter como alvo um gene HSD17B13 na posição 499 requer que, durante o pareamento de bases no gene, a base nitrogenada do terminal 5′ da fita antisense esteja alinhada com a posição 519 do gene HSD17B13.
[0123] Como fornecido neste documento, um agente RNAi HSD17B13 não precisa que uma base nitrogenada na posição 1 (5′  3′) da fita antisense seja complementar ao gene, desde que exista pelo menos 85% de complementariedade (p.
ex., pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de complementariedade) da fita antisense e do gene através de uma sequência de estiramento central de pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos. Por exemplo, para um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento que é projetado para ter como alvo a posição 499 de um gene HSD17B13, a base nitrogenada do terminal 5′ da fita antisense do agente RNAi HSD17B13 deve estar alinhada com a posição 519 do gene; entretanto, a base nitrogenada do terminal 5′ da fita antisense pode ser, mas não é necessário que seja, complementar à posição 519 de um gene HSD17B13, desde que haja pelo menos 85% de complementaridade (p. ex., pelo menos 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de complementaridade) da fita antisense e do gene através de uma sequência de estiramento central de pelo menos 16 nucleotídeos consecutivos. Conforme mostrado, entre outras coisas, pelos vários exemplos aqui divulgados, o local específico de ligação do gene pela fita antisense do agente RNAi HSD17B13 (por exemplo, se o agente RNAi HSD17B13 for projetado para ter como alvo um gene HSD17B13 na posição 499, na posição 791, na posição 513 ou em alguma outra posição) é importante para o nível de inibição alcançado pelo agente RNAi HSD17B13.
[0124] Em algumas modalidades, os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento tem como alvo um gene HSD17B13 ou posições próximas da sequência do gene HSD17B13 demonstrados na Tabela 1. Em algumas modalidades, a fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 divulgado neste documento inclui uma sequência de estiramento central que é total, substancial ou pelo menos parcialmente complementar a um alvo sequência 19-mer HSD17B13 divulgado na Tabela 1.
Tabela 1. Sequências alvo de mRNA de 19-mer HSD17B13 (coletadas de hidroxisteroide 17-beta desidrogenase 13 (HSD17B13) de homo sapiens, variante A do transcrito, GenBank NM_178135.4(SEQ ID N°: 1)) SEQ HSD17B13 19-mer Posições ID NO. Sequências alvo correspondentes Posição do (5′ → 3′) da sequência na gene alvo SEQ ID N°: 1 (conforme referido neste documento) UAAGAAGUCUGAUAGAU 793-811 791 18
GG GAUCACAAAAGCACUUC 515-533 513 19
UU CUAGGACAUUUUUGGAU 501-519 499 20
CA AGGUCAACAUCCUAGGA 490-508 488 21
CA CGGUGCAACUCUAUUCU 1503-1521 1501 22
GG CAACAUCCUAGGACAUU 494-512 492 23
UU AUUAUGGCCUGUAUUGG 761-779 759 24
AG
[0125] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 inclui uma fita antisense na qual a posição 19 da fita antisense (5′3′) é capaz de formar um par de bases com a posição 1 de uma sequência alvo 19-mer divulgada na Tabela
1. Em algumas modalidades, um agente RNAiHSD17B13 inclui uma fita antisense na qual a posição 1 da fita antisense (5′3′) é capaz de formar um par de bases com a posição 19 da sequência alvo 19-mer divulgada na Tabela 1.
[0126] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 inclui uma fita antisense na qual a posição 2 da fita antisense (5′  3′) é capaz de formar um par de bases com a posição 18 da sequência alvo 19-mer divulgada na Tabela
1. Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 inclui uma fita antisense na qual as posições 2 a 18 da fita antisense (5′  3′) são capazes de formar pares de bases com cada uma das respectivas bases complementares localizadas nas posições 2 a 18 da sequência alvo 19-mer divulgada na Tabela 1.
[0127] Para os agentes RNAi aqui divulgados, o nucleotídeo na posição 1 da fita antisense (da extremidade 5′  3′ extremidade) pode ser perfeitamente complementar ao gene HSD17B13, ou pode ser não complementar ao gene HSD17B13. Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 da fita antisense (da 5′ extremidade  3′ extremidade) é um U, A ou dT. Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 da fita antisense (da extremidade 5′  extremidade 3′) forma um par de base A:U ou U:A com a fita sense.
[0128] Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente RNAi HSD17B13inclui a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 2- 18, 2- 19, 2- 20 ou 2- 21 de qualquer uma das sequências da fita antisense nas Tabelas 2 ou 3. Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente RNAi HSD17B13inclui a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 3-21, 2-21, 1-21, 3- 20, 2-20, 1-20, 3-19, 2-19, 2-19, 2-18 ou 1-18 de qualquer uma das sequências da fita antisense nas Tabelas 2 ou 4.
[0129] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 é composto por (i) uma fita antisense que compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 2-18 ou 2-19 de qualquer uma das sequências de fita antisense na Tabela 2 ou da Tabela 3, e (ii) uma fita sense que compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 3-21, 2-21, 1-21, 3-20, 2-20, 1-20, 3-19, 2-19, 2-19, 2-18 ou 1-18 de qualquer uma das sequências de fita sense na Tabela 2 ou na Tabela 4.
[0130] Em algumas modalidades, os agentes RNAi HSD17B13 incluem sequências de nucleotídeos centrais 19-mer mostradas na Tabela 2 a seguir.
Tabela 2. Sequências de base de estiramento central da fita antisense e fita sense do agente RNAi HSD17B13 (N= qualquer base nitrogenada, I=hipoxantina (nucleotídeo inosina))
Sequência de Sequência de Posições P bases da fita bases da fita corresponden osição antisense sense tes da do
EQ (5′ → 3′) EQ (5′ → 3′) sequência gene
ID (Demonstrado ID (Demonstrado identificada alvo
NO como uma NO como uma na
. sequência de . sequência de SEQ ID NO:
nucleotídeos não nucleotídeos não 1 modificados) modificados)
CCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
5 UCUUA 6 AUGG 91
UCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
6 UCUUA 7 AUGA 91
NCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
7 UCUUA 8 AUGN 91
NCAUCUAUCAGACU NAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
8 UCUUN 9 AUGN 91
CCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
5 UCUUA 0 AUIG 91
UCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
6 UCUUA 1 AUIA 91
NCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
7 UCUUA 2 AUIN 91
NCAUCUAUCAGACU NAAGAAGUCUGAUAG 793-811 7
8 UCUUN 3 AUIN 91
CCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAI 793-811 7
5 UCUUA 4 AUGG 91
UCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAI 793-811 7
6 UCUUA 5 AUGA 91
NCAUCUAUCAGACU UAAGAAGUCUGAUAI 793-811 7
7 UCUUA 6 AUGN 91
NCAUCUAUCAGACU NAAGAAGUCUGAUAI 793-811 7
8 UCUUN 7 AUGN 91
AAGAAGUGCUUUUG GAUCACAAAAGCACU 515-533 5
7 UGAUC 8 UCUU 13
UAGAAGUGCUUUUG GAUCACAAAAGCACU 515-533 5
8 UGAUC 9 UCUA 13
NAGAAGUGCUUUUG GAUCACAAAAGCACU 515-533 5
9 UGAUC 0 UCUN 13
NAGAAGUGCUUUUG NAUCACAAAAGCACU 515-533 5
0 UGAUN 1 UCUN 13
UGAUCCAAAAAUGU CUAGGACAUUUUUGG 501-519 4
1 CCUAG 2 AUCA 99
AGAUCCAAAAAUGU CUAGGACAUUUUUGG 501-519 4
2 CCUAG 3 AUCU 99
NGAUCCAAAAAUGU CUAGGACAUUUUUGG 501-519 4
3 CCUAG 4 AUCN 99
NGAUCCAAAAAUGU NUAGGACAUUUUUGG 501-519 4
4 CCUAN 5 AUCN 99
UGAUCCAAAAAUGU CUAGGACAUUUUUGI 501-519 4
1 CCUAG 6 AUCA 99
AGAUCCAAAAAUGU CUAGGACAUUUUUGI 501-519 4
2 CCUAG 7 AUCU 99
NGAUCCAAAAAUGU CUAGGACAUUUUUGI 501-519 4
3 CCUAG 8 AUCN 99
NGAUCCAAAAAUGU NUAGGACAUUUUUGI 501-519 4
4 CCUAN 9 AUCN 99
UGUCCUAGGAUGUU AGGUCAACAUCCUAG 490-508 4
9 GACCU 0 GACA 88
AGUCCUAGGAUGUU AGGUCAACAUCCUAG 490-508 4
0 GACCU 1 GACU 88
NGUCCUAGGAUGUU AGGUCAACAUCCUAG 490-508 4
1 GACCU 2 GACN 88
NGUCCUAGGAUGUU NGGUCAACAUCCUAG 490-508 4
2 GACCN 3 GACN 88
CCAGAAUAGAGUUG CGGUGCAACUCUAUU 1503-1521 1
3 CACCG 4 CUGG 501
UCAGAAUAGAGUUG CGGUGCAACUCUAUU 1503-1521 1
4 CACCG 5 CUGA 501
ACAGAAUAGAGUUG CGGUGCAACUCUAUU 1503-1521 1
5 CACCG 6 CUGU 501
NCAGAAUAGAGUUG CGGUGCAACUCUAUU 1503-1521 1
6 CACCG 7 CUGN 501
NCAGAAUAGAGUUG NGGUGCAACUCUAUU 1503-1521 1
7 CACCN 8 CUGN 501
AAAAUGUCCUAGGA CAACAUCCUAGGACA 494-512 4
8 UGUUG 9 UUUU 92
UAAAUGUCCUAGGA CAACAUCCUAGGACA 494-512 4
9 UGUUG 00 UUUA 92
NAAAUGUCCUAGGA CAACAUCCUAGGACA 494-512 4
0 UGUUG 01 UUUN 92
NAAAUGUCCUAGGA NAACAUCCUAGGACA 494-512 4
1 UGUUN 02 UUUN 92
CUCCAAUACAGGCC AUUAUGGCCUGUAUU 761-779 7
2 AUAAU 03 GGAG 59
UUCCAAUACAGGCC AUUAUGGCCUGUAUU 761-779 7
3 AUAAU 04 GGAA 59
NUCCAAUACAGGCC AUUAUGGCCUGUAUU 761-779 7
4 AUAAU 05 GGAN 59
NUCCAAUACAGGCC NUUAUGGCCUGUAUU 761-779 7
5 AUAAN 06 GGAN 59
[0131] As fitas sense e antisense do agente RNAi HSD17B13 que compreendem ou consistem nas sequências na Tabela 2 podem ser nucleotídeos modificados ou nucleotídeos não modificados. Em algumas modalidades, os agentes RNAi HSD17B13 que têm as sequências da fita sense e da fita antisense que compreendem ou consistem nas sequências na Tabela 2 são todos ou substancialmente todos os nucleotídeos modificados.
[0132] Em algumas modalidades, a fita antisense de um agente RNAi HSD17B13 divulgada neste documento difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências da fita antisense na Tabela 2. Em algumas modalidades, a fita sense do agente de RNAi de HSD17B13 aqui divulgado difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de fita sense na Tabela 2.
[0133] Como usado neste documento, cada N listado em uma sequência divulgada na Tabela 2 pode ser independentemente selecionado a partir de qualquer e todas as bases nitrogenadas (incluindo aquelas encontradas em nucleotídeos modificados e não modificados). Em algumas modalidades, um nucleotídeo N listado em uma sequência divulgada na Tabela 2 tem uma base nitrogenada que é complementar ao nucleotídeo N na posição correspondente na outra fita. Em algumas modalidades, um nucleotídeo N listado em uma sequência divulgada na Tabela 2 tem uma base nitrogenada que não é complementar ao nucleotídeo N na posição correspondente na outra fita. Em algumas modalidades, um nucleotídeo N listado em uma sequência divulgada na Tabela 2 tem uma base nitrogenada que é a mesma que o nucleotídeo N na posição correspondente na outra fita. Em algumas modalidades, um nucleotídeo N listado em uma sequência divulgada na Tabela 2 tem uma base nitrogenada que é diferente do nucleotídeo N na posição correspondente na outra fita.
[0134] Certas fitas antisense modificadas do agente RNAi HSD17B13, assim como as sequências de bases nitrogenadas não modificadas subjacentes, são fornecidas na Tabela 3. Certas fitas sense modificadas do agente RNAi HSD17B13, assim como as sequências de bases nitrogenadas não modificadas subjacentes, são fornecidas na Tabela 4.
Nos agentes RNAi HSD17B13 formados, cada um dos nucleotídeos em cada uma das sequências de base subjacentes listadas nas Tabelas 3 e 4, assim como na Tabela 2 acima, podem ser um nucleotídeo modificado.
[0135] Os agentes RNAi HSD17B13 descritos neste documento são formados pela anelação de uma fita antisense com uma fita sense. Uma fita sense contendo uma sequência listada na Tabela 2 ou na Tabela 4 pode ser hibridizada com qualquer fita antisense contendo uma sequência listada na Tabela 2 ou Tabela 3, desde que as duas sequências tenham uma região de pelo menos 85% de complementaridade sobre uma sequência de nucleotídeos 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 contíguos.
[0136] Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências na Tabela 2 ou Tabela 3.
[0137] Em algumas modalidades, um agente RNAi HSD17B13 compreende ou consiste em um duplex com sequências de bases nitrogenadas da fita sense e da fita sense de qualquer uma das sequências na Tabela 2, Tabela 3 ou Tabela 4.
[0138] Os exemplos de fitas antisense contendo nucleotídeos modificados são fornecidos na Tabela 3. Os exemplos de fitas sense contendo nucleotídeos modificados são fornecidos na Tabela 4.
[0139] Como usadas nas Tabelas 3 e 4, as anotações a seguir são usadas para indicar nucleotídeos modificados ou grupos de ligação: A = adenosina-3′-fosfato; C = citidine-3′-fosfato; G = guanosina-3′-fosfato; U = uridina-3′-fosfato I = inosina-3′-fosfato a = 2′-O-metiladenosina-3′-fosfato as = 2′-O-metiladenosina-3′-fosforotioato c = 2′-O-metilcitidina-3′-fosfato cs = 2′-O-metilcitidina-3′-fosforotioato g = 2′-O-metilguanosina-3′-fosfato gs = 2′-O-metilguanosina-3′-fosforotioato t = 2′-O-metil-5-metiluridina-3′-fosfato ts = 2′-O-metil-5-metiluridina-3′-
fosforotioato u = 2′-O-metiluridina-3′-fosfato us = 2′-O-metiluridina-3′-fosforotioato i = 2′-O-metilinosina-3′-fosfato is = 2′-O-metilinosina-3′-fosforotioato
Af = 2′-fluoroadenosina-3′-fosfato
Afs = 2′-fluoroadenosina-3′-fosforotioato
Cf = 2′-fluorocitidina-3′-fosfato
Cfs = 2′-fluorocitidina-3′-fosforotioato
Gf = 2′-fluoroguanosinea-3′-fosfato
Gfs = 2′-fluoroguanosina-3′-fosforotioato
Tf = 2′-fluoro-5′-metiluridina-3′-fosfato
Tfs = 2′-fluoro-5′-metiluridina-3′-
fosforotioato
Uf = 2′-fluorouridina-3′-fosfato
Ufs = 2′-fluorouridina-3′-fosforotioato
AUNA = 2′,3′-seco-adenosina-3′-fosfato
AUNAs = 2′,3′-seco-adenosina-3′-fosforotioato
CUNA = 2′,3′-seco-citidina-3′-fosfato
CUNAs = 2′,3′-seco-citidina-3′-fosforotioato
GUNA = 2′,3′-seco-guanosina-3′-fosfato
GUNAs = 2′,3′-seco-guanosina-3′-fosforotioato
UUNA = 2′,3′-seco-uridina-3′-fosfato UUNAs = 2′,3′-seco-uridina-3′-fosforotioato a_2N = ver Tabela 6 a_2Ns = ver Tabela 6 (invAb) = desoxirribonucleotídeo abásico invertido, ver Tabela 6 (invAb)s = desoxirribonucleotídeo abásico invertido- 5′- fosforotioato, ver Tabela 6
[0140] Como a pessoa de habilidade comum na técnica compreenderia prontamente, a menos que indicado de outra forma pela sequência (tal como, por exemplo, por uma ligação de fosforotioato “s”), quando presente em um oligonucleotídeo, os monômeros de nucleotídeo são mutuamente ligados por ligações 5’-3'-fosfodiésteres. Como a pessoa de habilidade comum na técnica compreenderia prontamente, a inclusão de uma ligação fosforotioato, como mostrado nas sequências de nucleotídeos modificadas aqui divulgadas, substitui a ligação fosfodiéster tipicamente presente em oligonucleotídeos (ver, p. ex., Figuras 1A a 10D, mostrando as estruturas químicas e as Figuras 11A a 11E, mostrando um esquema de todas as ligações internucleosídicas em certos agentes RNAi HSD17B13). Além disso, a pessoa de habilidade comum na técnica compreenderia prontamente que o nucleotídeo terminal na extremidade 3’ de uma dada sequência de oligonucleotídeos normalmente teria um grupo hidroxil (-OH) na respectiva posição 3’ do monômero fornecido em vez de uma porção de fosfato ex vivo. Além disso, para as modalidades divulgadas neste documento, ao observar a respectiva fita 5’  3’, os resíduos abásicos invertidos são inseridos de modo que a posição 3’ da desoxirribose esteja ligada à extremidade 3’ do monômero precedente na respectiva fita (ver, p. ex., Figuras 1A a 10D e Tabela 6). Além disso, a pessoa de habilidade comum na técnica compreenderia e observaria prontamente, enquanto as estruturas químicas de fosforotioato aqui representadas tipicamente mostram o ânion no átomo de enxofre, as invenções aqui divulgadas abrangem todos os tautômeros de fosforotioato (p. ex., onde o átomo de enxofre tem uma ligação dupla e o ânion está em um átomo de oxigênio). Exceto se expresso de outra forma neste documento, tais entendimentos da pessoa de habilidade comum na técnica são usados ao descrever os agentes RNAi HSD17B13 e as composições dos agentes RNAi HSD17B13 divulgadas aqui.
[0141] Alguns exemplos de ligantes alvo, grupos alvo e grupos de ligação usados com os agentes RNAi HSD17B13 divulgados neste documento são fornecidos abaixo na Tabela
6. Mais especificamente, os grupos alvo e os grupos de ligação (os quais juntos podem formar um grupo alvo) incluem os seguintes, para os quais suas estruturas químicas são fornecidas na Tabela 6: (NAG13), (NAG13)s,
(NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s . Cada fita sense e/ou fita antisense pode ter quaisquer ligantes alvo, grupos alvo ou grupos de ligação listados neste documento, assim como outros grupos, conjugados à extremidade 5′ e/ou 3′ da sequência.
Tabela 3. Sequências de fita antisense do agente RNAi HSD17B13 ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG 08050- AfcCfgUfsc 07 UUGCACCGUC 21
AS AM usGfsusCfcUfaggauGfuUfg UGUCCUAGGAU
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados) 08052- AfcCfuCfsa 08 GUUGACCUCA 22
AS
AM usGfsusCfcUfAUNAggauGfuU UGUCCUAGGAU 08054- fgAfcCfuCfsa 09 GUUGACCUCA 22
AS
AM asAfsasAfuGfuccuaGfgAfu AAAAUGUCCUA 08056- GfuUfgAfsc 10 GGAUGUUGAC 23
AS
AM usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfc UGAUCCAAAAA 08059- CfuAfgGfsa 11 UGUCCUAGGA 24
AS
AM usGfsusCfcUfaggauGfuUfg UGUCCUAGGAU 08178- AfcCfuCfsc 12 GUUGACCUCC 25
AS AM usGfsusCfcUfAUNAggauGfuU UGUCCUAGGAU 08180- fgAfcCfuCfsu 13 GUUGACCUCU 26
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AS
AM usGfsusCfcUfAUNAggauGfuU UGUCCUAGGAU 08181- fgAfcCfuCfsc 14 GUUGACCUCC 25
AS
AM usGfsusCfcUfAUNAGfgAfuGf UGUCCUAGGAU 08182- uUfgAfcCfuCfsc 15 GUUGACCUCC 25
AS
AM usGfsusCfcUfaGUNAgauGfuU UGUCCUAGGAU 08184- fgAfcCfuCfsc 16 GUUGACCUCC 25
AS
AM usGfsusCUNAcUfaggauGfuUf UGUCCUAGGAU 08185- gAfcCfuCfsc 17 GUUGACCUCC 25
AS
AM usGfsusCfCUNAUfaggauGfuU UGUCCUAGGAU 08186- fgAfcCfuCfsc 18 GUUGACCUCC 25
AS
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AM usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfc UGAUCCAAAAA 08188- CfuAfgGfsu 19 UGUCCUAGGU 27
AS
AM usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfc UGAUCCAAAAA 08190- CfuAfgGfsc UGUCCUAGGC
AS
AM usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgU UGAUCCAAAAA 08192- fcCfuAfgGfsc UGUCCUAGGC
AS
AM usGfsasUfcCUNAaaaaaUfgUf UGAUCCAAAAA 08193- cCfuAfgGfsc 22 UGUCCUAGGC
AS
AM usGfsasUfcCfAUNAaaaaUfgU UGAUCCAAAAA 08194- fcCfuAfgGfsc 23 UGUCCUAGGC
AS AM usGfsasUfCUNACfaaaaaUfgU UGAUCCAAAAA
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados) 08195- fcCfuAfgGfsc 24 UGUCCUAGGC
AS
AM asAfsasAfuGfuCfcUfaGUNAg AAAAUGUCCUA 08196- AfuGfuUfgAfsc 25 GGAUGUUGAC 23
AS
AM usAfsgsAfuGfaUfgGfuGfaU UAGAUGAUGGU 08236- fcAfgAfaGfsc 26 GAUCAGAAGC 29
AS
AM usAfscsUfgUfcCfcAfgCfaU UACUGUCCCAG 08238- fuAfuUfcAfsc 27 CAUUAUUCAC 30
AS
AM asAfsgsAfaGfuGfcUfuUfuG AAGAAGUGCUU 08240- fuGfaUfcCfsa 28 UUGUGAUCCA 31
AS AM usGfsusCfaGfaccucUfgUfg UGUCAGACCUC 08242- AfaAfgCfsc 29 UGUGAAAGCC 32
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AS
AM usUfsgsAfuGfucagaCfcUfc UUGAUGUCAGA 08244- UfgUfgAfsc 30 CCUCUGUGAC 33
AS
AM usUfscsCfaAfuAfcAfgGfcC UUCCAAUACAG 08246- faUfaAfuCfsc 31 GCCAUAAUCC 34
AS
AM usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcU UCAUCUAUCAG 08248- fuCfuUfaCfsg ACUUCUUACG
AS
AM usCfsasGfgUfuGfaGfaUfaA UCAGGUUGAGA 08250- faGfcUfgCfsc 33 UAAAGCUGCC 36
AS
AM usCfscsAfgAfaUfaGfaGfuU UCCAGAAUAGA 08252- fgCfaCfcGfsu 34 GUUGCACCGU 37
AS
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AM asAfsgsUfcCfaGfaAfuAfgA AAGUCCAGAAU 08254- fgUfuGfcAfsc 35 AGAGUUGCAC 38
AS
AM usCfsusUfgAfuguagUfgGfg UCUUGAUGUAG 08256- AfgUfcGfsg 36 UGGGAGUCGG 39
AS
AM asCfsasAfgAfuUfaGfuCfuU ACAAGAUUAGU 08258- fgAfuGfuAfsg 37 CUUGAUGUAG 40
AS
AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG 08260- AfcCfgUfsu 38 UUGCACCGUU 41
AS
AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG 08262- AfcCfgCfsu 39 UUGCACCGCU 42
AS AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados) 08264- AfcCfgUfsg 40 UUGCACCGUG 43
AS
AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG 08266- AfcCfgGfsu 41 UUGCACCGGU 44
AS
AM usCfsasGfaAfUUNAagagUfuG UCAGAAUAGAG 08270- fcAfcCfgUfsc 42 UUGCACCGUC 21
AS
AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG 08272- AfcCfgCfsc 43 UUGCACCGCC 45
AS
AM usCfsasGfaAfuagagUfuGfc UCAGAAUAGAG 08274- AfcCfgGfsc 44 UUGCACCGGC 46
AS AM usCfsasGfaAfuAfgagUfuGf UCAGAAUAGAG 08275- cAfcCfgUfsc 45 UUGCACCGUC 21
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AS
AM asGfsusGfaCfuccagGfuAfg AGUGACUCCAG 08303- GfaGfuAfsg 46 GUAGGAGUAG 47
AS
AM asAfsgsAfaCfuUfuAfcCfaG AAGAACUUUAC 08305- fuGfaCfuCfsc 47 CAGUGACUCC 48
AS
AM asAfsgsAfaCfuUfuAfcCfaG AAGAACUUUAC 08307- fuGfaCfuCfsg 48 CAGUGACUCG 49
AS
AM usUfsgsCfaGfuccacCfaCfa UUGCAGUCCAC 08309- AfaCfaCfsg 49 CACAAACACG 50
AS
AM usCfsasGfcAfucgauGfgAfa UCAGCAUCGAU 08311- GfgAfgUfsg 50 GGAAGGAGUG 51
AS
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AM asGfsasGfuUfuCfuUfcUfcA AGAGUUUCUUC 08313- fgCfaUfcGfsa 51 UCAGCAUCGA 52
AS
AM usCfsasGfuAfuUfcAfcGfaA UCAGUAUUCAC 08315- fcAfcAfgGfsg 52 GAACACAGGG 53
AS
AM usCfsasGfuAfuUfcAfcGfaA UCAGUAUUCAC 08317- fcAfcAfgGfsc 53 GAACACAGGC 54
AS
AM usGfsasAfgAfuCfaUfuUfuC UGAAGAUCAUU 08319- fuUfgUfuGfsg 54 UUCUUGUUGG 55
AS AM asAfsgsAfaGfuGfcUfuUfuG AAGAAGUGCUU 08341- fuGfaUfcCfsg UUGUGAUCCG 55 56
AS AM asAfsgsAfaGfuGfcUfuUfuG AAGAAGUGCUU
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados) 08343- fuGfaUfcCfsc 56 UUGUGAUCCC 57
AS AM usAfsgsAfaGfuGfcUfuUfuG UAGAAGUGCUU 08345- fuGfaUfcCfsc UUGUGAUCCC 57 58
AS AM asAfsgsAfaGfUUNAGfcUfuUf AAGAAGUGCUU 08347- uGfuGfaUfcCfsc UUGUGAUCCC 58 57
AS AM asAfsgsAfaGfuGUNAcUfuUfu AAGAAGUGCUU 08348- GfuGfaUfcCfsc UUGUGAUCCC 59 57
AS AM usAfsgsAfaGfugcuuUfuGfu UAGAAGUGCUU 08350- GfaUfcCfsc UUGUGAUCCC 60 58
AS AM usCfsasUfcUfaucagAfcUfu UCAUCUAUCAG 08352- CfuUfaCfsg ACUUCUUACG
ID Fita antisense Sequência da fita modificada EQ de bases EQ antisen (5′ → 3′) ID subjacentes ID se: NO (5′ → 3′) NO . (Demonstrad .
o como uma sequência de nucleotídeos não modificados)
AS AM usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcU UCAUCUAUCAG 08354- fuCfuUfaCfsc ACUUCUUACC 62 59
AS AM usCfsasUfcUfaucagAfcUfu UCAUCUAUCAG 08356- CfuUfaCfsc ACUUCUUACC 63 59
AS AM asAfsgsAfaGfugcuuUfuGfu AAGAAGUGCUU 08366- GfaUfcCfsg UUGUGAUCCG 64 56
AS AM asAfsgsAfaGfugcuuUfuGfu AAGAAGUGCUU 08367- GfaUfcCfsc UUGUGAUCCC 65 57
AS
Tabela 4. Sequências de fita sense do agente RNAi HSD17B13 I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados)
A (NAG37)s(invAb)sgacggugcAfA GACGGUGCAA M0804 6 6 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 9-SS 6 0
A (NAG37)s(invAb)sugaggucaAfC UGAGGUCAAC M0805 6 6 fAfuccuaggacas(invAb) AUCCUAGGACA 1-SS 7 1
A (NAG37)s(invAb)sugaggucaAfC UGAGGUCAAC M0805 6 6 fAfuccuagiacas(invAb) AUCCUAGIACA 3-SS 8 2
A (NAG37)s(invAb)sgucaacauCfC GUCAACAUCC M0805 6 6 fUfaggacauuuus(invAb) UAGGACAUUUU 5-SS 9 3 A (NAG37)s(invAb)sgucaacauCfC GUCAACAUCC
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0805 fUfaggaca_2Nuuuus(invAb) 7 UAGGAC(A2N)UUUU 6 7-SS 0 4
A (NAG37)s(invAb)succuaggaCfA UCCUAGGACA M0805 7 6 fUfuuuuggaucas(invAb) UUUUUGGAUCA 8-SS 1 5
A (NAG37)s(invAb)succuaggaCfA UCCUAGGACA M0806 7 6 fUfuuuugiaucas(invAb) UUUUUGIAUCA 0-SS 2 6
A (NAG37)s(invAb)sggaggucaAfC GGAGGUCAAC M0817 7 6 fAfuccuaggacas(invAb) AUCCUAGGACA 7-SS 3 7
A (NAG37)s(invAb)sagaggucaAfC AGAGGUCAAC M0817 7 6 fAfuccuaggacas(invAb) AUCCUAGGACA 9-SS 4 8 A (NAG37)s(invAb)sggaggucaAfC GGAGGUCAAC
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0818 fAfuccuagiacas(invAb) 7 AUCCUAGIACA 6 3-SS 5 9
A (NAG37)s(invAb)saccuaggaCfA ACCUAGGACA M0818 7 7 fUfuuuugiaucas(invAb) UUUUUGIAUCA 7-SS 6 0
A (NAG37)s(invAb)sgccuaggaCfA GCCUAGGACA M0818 7 7 fUfuuuuggaucas(invAb) UUUUUGGAUCA 9-SS 7 1
A (NAG37)s(invAb)sgccuaggaCfA GCCUAGGACA M0819 fUfuuuugiaucas(invAb) 6 UUUUUGIAUCA 1 1-SS
A (NAG37)s(invAb)sgcuucugaUfC GCUUCUGAUC M0823 7 7 fAfccaucaucuas(invAb) ACCAUCAUCUA 5-SS 9 3 A (NAG37)s(invAb)sgugaauaaUfG GUGAAUAAUG
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0823 fCfugggacaguas(invAb) 8 CUGGGACAGUA 7 7-SS 0 4
A (NAG37)s(invAb)suggaucacAfA UGGAUCACAA M0823 8 7 fAfagcacuucuus(invAb) AAGCACUUCUU 9-SS 1 5
A (NAG37)s(invAb)sggcuuucaCfA GGCUUUCACA M0824 8 7 fGfaggucugacas(invAb) GAGGUCUGACA 1-SS 2 6
A (NAG37)s(invAb)sgucacagaGfG GUCACAGAGG M0824 8 7 fUfcugacaucaas(invAb) UCUGACAUCAA 3-SS 3 7
A (NAG37)s(invAb)sggauuaugGfC GGAUUAUGGC M0824 8 7 fCfuguauuggaas(invAb) CUGUAUUGGAA 5-SS 4 8 A (NAG37)s(invAb)scguaagaaGfU CGUAAGAAGU
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0824 fCfugauagaugas(invAb) 4 CUGAUAGAUGA 7-SS
A (NAG37)s(invAb)sggcagcuuUfA GGCAGCUUUA M0824 8 8 fUfcucaaccugas(invAb) UCUCAACCUGA 9-SS 6 0
A (NAG37)s(invAb)sacggugcaAfC ACGGUGCAAC M0825 8 8 fUfcuauucuggas(invAb) UCUAUUCUGGA 1-SS 7 1
A (NAG37)s(invAb)sgugcaacuCfU GUGCAACUCU M0825 8 8 fAfuucuggacuus(invAb) AUUCUGGACUU 3-SS 8 2
A (NAG37)s(invAb)sccgacuccCfA CCGACUCCCA M0825 8 8 fCfuacaucaagas(invAb) CUACAUCAAGA 5-SS 9 3 A (NAG37)s(invAb)scuacaucaAfG CUACAUCAAG
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0825 fAfcuaaucuugus(invAb) 9 ACUAAUCUUGU 8 7-SS 0 4
A (NAG37)s(invAb)scggugcAfAfC CGGUGCAACU M0825 9 8 fucuauucugauus(invAb) CUAUUCUGAUU 9-SS 1 5
A (NAG37)s(invAb)sagcggugcAfA AGCGGUGCAA M0826 9 8 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 1-SS 2 6
A (NAG37)s(invAb)scacggugcAfA CACGGUGCAA M0826 9 8 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 3-SS 3 7
A (NAG37)s(invAb)saccggugcAfA ACCGGUGCAA M0826 9 8 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 5-SS 4 8 A (NAG37)s(invAb)sgacgguicAfA GACGGUICAA
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0826 fCfucuauucugas(invAb) 9 CUCUAUUCUGA 8 7-SS 5 9
A (NAG37)s(invAb)sgacgiugcAfA GACGIUGCAA M0826 9 9 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 8-SS 6 0
A (NAG37)s(invAb)sgacggugcAfA GACGGUGCAA M0826 9 9 fCfucuauucuias(invAb) CUCUAUUCUIA 9-SS 7 1
A (NAG37)s(invAb)sggcggugcAfA GGCGGUGCAA M0827 9 9 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 1-SS 8 2
A (NAG37)s(invAb)sgccggugcAfA GCCGGUGCAA M0827 9 9 fCfucuauucugas(invAb) CUCUAUUCUGA 3-SS 9 3 A (NAG37)s(invAb)scuacuccuAfC CUACUCCUAC
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0830 fCfuggagucacus(invAb) 0 CUGGAGUCACU 9 2-SS 0 4
A (NAG37)s(invAb)sggagucacUfG GGAGUCACUG M0830 0 9 fGfuaaaguucuus(invAb) GUAAAGUUCUU 4-SS 1 5
A (NAG37)s(invAb)scgagucacUfG CGAGUCACUG M0830 0 9 fGfuaaaguucuus(invAb) GUAAAGUUCUU 6-SS 2 6
A (NAG37)s(invAb)scguguuugUfG CGUGUUUGUG M0830 0 9 fGfuggacugcaas(invAb) GUGGACUGCAA 8-SS 3 7
A (NAG37)s(invAb)scacuccuuCfC CACUCCUUCC M0831 0 9 fAfucgaugcugas(invAb) AUCGAUGCUGA 0-SS 4 8 A (NAG37)s(invAb)sucgaugcuGfA UCGAUGCUGA
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0831 fGfaagaaacucus(invAb) 0 GAAGAAACUCU 9 2-SS 5 9
A (NAG37)s(invAb)scccuguguUfC CCCUGUGUUC M0831 0 0 fGfugaauacugas(invAb) GUGAAUACUGA 4-SS 6 0
A (NAG37)s(invAb)sgccuguguUfC GCCUGUGUUC M0831 0 0 fGfugaauacugas(invAb) GUGAAUACUGA 6-SS 7 1
A (NAG37)s(invAb)sccaacaagAfA CCAACAAGAA M0831 0 0 fAfaugaucuucas(invAb) AAUGAUCUUCA 8-SS 8 2 A (NAG37)s(invAb)scggaucacAfA CGGAUCACAA M0834 fAfagcacuucuus(invAb) 0 AAGCACUUCUU 0 0-SS 9 3 A (NAG37)s(invAb)sgggaucacAfA GGGAUCACAA
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0834 fAfagcacuucuus(invAb) 1 AAGCACUUCUU 0 2-SS 0 4 A (NAG37)s(invAb)sgggaucacAfA GGGAUCACAA M0834 fAfagcacuucuas(invAb) 1 AAGCACUUCUA 0 4-SS 1 5 A (NAG37)s(invAb)sgggaucacAfa GGGAUCACAA M0834 AfaGfcacuucuus(invAb) 1 AAGCACUUCUU 0 6-SS 2 4 A (NAG37)s(invAb)sgggaucacAfa GGGAUCACAA M0834 AfaGfcacuucuas(invAb) 1 AAGCACUUCUA 0 9-SS 3 5 A (NAG37)s(invAb)scguaagaaGfu CGUAAGAAGU M0835 CfuGfauagauias(invAb) 1 CUGAUAGAUIA 0 1-SS 4 6 A (NAG37)s(invAb)sgguaagaaGfu GGUAAGAAGU
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0835 CfuGfauagaugas(invAb) 1 CUGAUAGAUGA 0 3-SS 5 7 A (NAG37)s(invAb)sgguaagaaGfu GGUAAGAAGU M0835 CfuGfauagauias(invAb) 1 CUGAUAGAUIA 0 5-SS 6 8 A (NAG37)s(invAb)sgguaagaaGfu GGUAAGAAGU M0835 CfuGfauaiaugas(invAb) 1 CUGAUAIAUGA 0 7-SS 7 9 A (NAG37)s(invAb)sgccuaggaCfa GCCUAGGACA M0835 UfuUfuugiaucas(invAb) UUUUUGIAUCA 7 1 8-SS A (NAG37)s(invAb)scggaucacAfa CGGAUCACAA M0836 AfaGfcacuucuus(invAb) 1 AAGCACUUCUU 0 5-SS 9 3 A (NAG37)s(invAb)scguaagaaGfu CGUAAGAAGU
I Fita sense modificada (5′ Sequência D da → 3′) E de bases E fita Q subjacentes Q sense I (5′ → 3′) I : D (Demonstra D N do como uma N O sequência de O . nucleotídeos .
não modificados) M0836 CfuGfauagaugas(invAb) 5 CUGAUAGAUGA 8-SS Nucleotídeo (A2N) = 2-aminoadenina
[0142] Os agentes RNAi HSD17B13 descritos neste documento são formados pela anelação de uma fita antisense com uma fita sense. Uma fita sense contendo uma sequência listada na Tabela 2 ou Tabela 4 pode ser hibridizada em qualquer fita antisense contendo uma sequência listada na Tabela 2 ou Tabela 3, desde que as duas sequências tenham uma região de pelo menos 85% de complementaridade em uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos contíguos.
[0143] Em algumas modalidades, a fita antisense do agente de RNAi de HSD17B13 aqui divulgado difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de da fita antisense na Tabela 3. Em algumas modalidades, a fita sense do agente de RNAi de HSD17B13 aqui divulgado difere em 0, 1, 2 ou 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de fita sense na Tabela 4.
[0144] Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências na Tabela 2 ou Tabela 3. Em algumas modalidades, uma fita antisense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 1-17, 2- 17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21 ou 2-21, de qualquer uma das sequências na Tabela 2 ou Tabela 3. Em certas modalidades, uma fita antisense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na Tabela 3.
[0145] Em algumas modalidades, uma fita sense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências na Tabela 2 ou Tabela 4. Em algumas modalidades, uma fita sense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende a sequência de nucleotídeos (da extremidade 5′  extremidade 3′) 1-17, 2-17, 3-17, 4- 17, 1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 1-19, 2-19, 3-19, 4-19, 1-20, 2-20, 3-20, 4-20, 1-21, 2-21, 3-21 ou 4-21, de qualquer uma das sequências na Tabela 2 ou Tabela 4. Em certas modalidades, uma fita sense do agente de RNAi de HSD17B13 compreende ou consiste em uma sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na Tabela 4.
[0146] Para os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui divulgados, o nucleotídeo na posição 1 da fita antisense (da extremidade 5′  extremidade 3′) pode ser perfeitamente complementar a um gene HSD17B13 ou pode ser não complementar a um gene HSD17B13. Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 da fita antisense (da extremidade 5′  extremidade 3′) é um U, A ou dT (ou uma versão modificada desta). Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 da fita antisense (da extremidade 5′  extremidade 3′) forma um par de base A:U ou U:A com a fita sense.
[0147] Uma fita sense contendo uma sequência listada na Tabela 2 ou Tabela 4 pode ser hibridizada em qualquer fita antisense contendo uma sequência listada na Tabela 2 ou Tabela 3, desde que as duas sequências tenham uma região de pelo menos 85% de complementaridade em uma sequência de 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos contíguos. Em algumas modalidades, o agente de RNAi de HSD17B13 tem uma fita sense que consiste na sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na Tabela 4, e uma fita antisense que consiste na sequência modificada de qualquer uma das sequências modificadas na Tabela 3. Certos pareamentos de sequência representativos são exemplificados pelos ID Nº. Duplex na Tabela 5.
[0148] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende ou consiste essencialmente em um duplex representado por qualquer um dos ID Nº. Duplex aqui apresentados. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende as sequências de nucleotídeos de fita sense e de fitas antisense de qualquer um dos duplexes representados por qualquer um dos ID Nº. Duplex aqui apresentados. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende as sequências de nucleotídeos de fita sense e de fita antisense de qualquer um dos duplexes representados por qualquer um dos ID Nº. Duplex aqui apresentados e um grupo de direcionamento e/ou grupo de ligação é ligado de maneira covalente (p. ex., conjugado) à fita sense ou à fita antisense. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 inclui as sequências de nucleotídeos modificadas de fita sense e antisense de qualquer um dos ID Nº. Duplex aqui apresentados. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende as sequências de nucleotídeos modificadas de fita sense e antisense de qualquer um dos ID Nº. Duplex aqui apresentados e um grupo de direcionamento e/ou grupo de ligação, em que o grupo de direcionamento e/ou grupo de ligação é ligado de maneira covalente à fita sense ou à fita antisense.
[0149] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma fita antisense e uma fita sense que têm as sequências de nucleotídeos de qualquer um dos duplexes de fita antisense/fita sense da Tabela 2 ou Tabela
5, e compreende, adicionalmente, um grupo de direcionamento e/ou ligante de direcionamento. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma fita antisense e uma fita sense que têm as sequências de nucleotídeos de qualquer um dos duplexes de fita antisense/fita sense da Tabela 2 ou Tabela 5 e, adicionalmente, compreende um grupo de direcionamento do ligante do receptor de asialoglicoproteína.
[0150] Um grupo de direcionamento, com ou sem um conector, pode ser conectado à extremidade 5′ ou 3′ de qualquer uma das fitas sense e/ou antisense divulgadas nas Tabelas 2, 3 e 4. Um conector, com ou sem um grupo de direcionamento, pode ser conectado à extremidade 5′ ou 3′ de qualquer uma dos das fitas sense e/ou antisense divulgadas nas Tabelas 2, 3 e 4.
[0151] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma fita antisense e uma fita sense que têm as sequências de nucleotídeos de qualquer um dos duplexes de fita antisense/fita sense da Tabela 2 ou Tabela 5 e, adicionalmente, um ligante de direcionamento selecionado a partir do grupo que consiste em: (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37),
(NAG37)s, cada um como definido na Tabela 6. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é (NAG25) ou (NAG25)s como definido na Tabela 6. Em outras modalidades, o ligante de direcionamento é (NAG37) ou (NAG37)s como definido na Tabela 6.
[0152] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma fita antisense e uma fita sense que têm a sequência de nucleotídeos modificada de qualquer uma das sequências de nucleotídeos de fita antisense e/ou fita sense na Tabela 3 ou Tabela 4.
[0153] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende uma fita antisense e uma fita sense que têm uma sequência de nucleotídeos modificada de qualquer uma das sequências de nucleotídeos de fita antisense e/ou fita sense de qualquer um dos duplexes da Tabela 5 e, adicionalmente, compreende um grupo de direcionamento do ligante do receptor de asialoglicoproteína.
[0154] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em qualquer um dos duplexes da Tabela 5.
Tabela 5. Duplexes de agentes de RNAi de HSD17B13 com números de ID de fitas sense e antisense correspondentes ID da fita ID fita ID de Duplex antisense sense AD06078 AM08050-AS AM08049-SS
ID da fita ID fita ID de Duplex antisense sense
AD06079 AM08052-AS AM08051-SS
AD06080 AM08052-AS AM08053-SS
AD06081 AM08054-AS AM08051-SS
AD06082 AM08056-AS AM08055-SS
AD06083 AM08056-AS AM08057-SS
AD06084 AM08059-AS AM08058-SS
AD06085 AM08059-AS AM08060-SS
AD06176 AM08178-AS AM08177-SS
AD06177 AM08180-AS AM08179-SS
AD06178 AM08181-AS AM08177-SS
AD06179 AM08182-AS AM08177-SS
AD06180 AM08181-AS AM08183-SS
AD06181 AM08184-AS AM08177-SS
AD06182 AM08185-AS AM08177-SS
AD06183 AM08186-AS AM08177-SS
AD06184 AM08188-AS AM08187-SS
AD06185 AM08190-AS AM08189-SS
AD06186 AM08190-AS AM08191-SS
AD06187 AM08192-AS AM08191-SS
AD06188 AM08193-AS AM08191-SS
AD06189 AM08194-AS AM08191-SS
AD06190 AM08195-AS AM08189-SS
AD06191 AM08196-AS AM08055-SS
ID da fita ID fita ID de Duplex antisense sense
AD06208 AM08236-AS AM08235-SS
AD06209 AM08238-AS AM08237-SS
AD06210 AM08240-AS AM08239-SS
AD06211 AM08242-AS AM08241-SS
AD06212 AM08244-AS AM08243-SS
AD06213 AM08246-AS AM08245-SS
AD06214 AM08248-AS AM08247-SS
AD06215 AM08250-AS AM08249-SS
AD06216 AM08252-AS AM08251-SS
AD06217 AM08254-AS AM08253-SS
AD06218 AM08256-AS AM08255-SS
AD06219 AM08258-AS AM08257-SS
AD06220 AM08260-AS AM08259-SS
AD06221 AM08262-AS AM08261-SS
AD06222 AM08264-AS AM08263-SS
AD06223 AM08266-AS AM08265-SS
AD06224 AM08050-AS AM08267-SS
AD06225 AM08050-AS AM08268-SS
AD06226 AM08050-AS AM08269-SS
AD06227 AM08270-AS AM08049-SS
AD06228 AM08272-AS AM08271-SS
AD06229 AM08274-AS AM08273-SS
AD06230 AM08275-AS AM08049-SS
ID da fita ID fita ID de Duplex antisense sense
AD06244 AM08303-AS AM08302-SS
AD06245 AM08305-AS AM08304-SS
AD06246 AM08307-AS AM08306-SS
AD06247 AM08309-AS AM08308-SS
AD06248 AM08311-AS AM08310-SS
AD06249 AM08313-AS AM08312-SS
AD06250 AM08315-AS AM08314-SS
AD06251 AM08317-AS AM08316-SS
AD06252 AM08319-AS AM08318-SS
AD06265 AM08341-AS AM08340-SS
AD06266 AM08343-AS AM08342-SS
AD06267 AM08345-AS AM08344-SS
AD06268 AM08347-AS AM08346-SS
AD06269 AM08348-AS AM08346-SS
AD06270 AM08343-AS AM08346-SS
AD06271 AM08350-AS AM08349-SS
AD06272 AM08352-AS AM08351-SS
AD06273 AM08354-AS AM08353-SS
AD06274 AM08356-AS AM08355-SS
AD06275 AM08356-AS AM08357-SS
AD06276 AM08192-AS AM08358-SS
AD06277 AM08190-AS AM08358-SS
AD06278 AM08366-AS AM08365-SS
ID da fita ID fita ID de Duplex antisense sense AD06279 AM08367-AS AM08346-SS AD06280 AM08352-AS AM08368-SS AD06281 AM08356-AS AM08353-SS
[0155] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 é preparado ou fornecido como um sal, sal misto ou ácido livre. Os agentes de RNAi aqui descritos, após liberação em uma célula que expressa um gene HSD17B13, inibem ou atenuam a expressão de um ou mais genes HSD17B13 in vivo e/ou in vitro.
Ligantes ou grupos de direcionamento, grupos de ligação e veículos de liberação
[0156] Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 é conjugado a um ou mais grupos sem nucleotídeo, incluindo, mas sem limitação, um grupo de direcionamento, um grupo de ligação ou ligante de direcionamento, um polímero de liberação ou um veículo de liberação. O grupo sem nucleotídeo pode aumentar o direcionamento, liberação ou conexão do agente de RNAi. Exemplos de grupos de direcionamento e grupos de ligação são fornecidos na Tabela
6. O grupo sem nucleotídeo pode ser ligado de maneira covalente à extremidade 3′ e/ou 5′ da fita sense e/ou da fita antisense. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de HSD17B13 contém um grupo sem nucleotídeo ligado à extremidade 3′ e/ou 5′ da fita sense. Em algumas modalidades, um grupo sem nucleotídeo é ligado à extremidade 5′ de uma fita sense do agente de RNAi de HSD17B13. Um grupo sem nucleotídeo pode ser ligado direta ou indiretamente ao agente de RNAi por meio de um conector/grupo de ligação. Em algumas modalidades, um grupo sem nucleotídeo é ligado ao agente de RNAi por meio de uma ligação ou conector lábil, clivável ou reversível.
[0157] Em algumas modalidades, um grupo sem nucleotídeo acentua as propriedades farmacocinéticas ou de biodistribuição de um agente de RNAi ou conjugado ao qual se conecta para melhorar a distribuição específica da célula ou tecido e a captação celular específica do agente de RNAi ou conjugado. Em algumas modalidades, um grupo sem nucleotídeo acentua a endocitose do agente de RNAi.
[0158] Os grupos de direcionamento ou porções de direcionamento acentuam as propriedades farmacocinéticas ou de biodistribuição de um agente de RNAi ou conjugado ao qual se conectam para melhorar a distribuição específica da célula (incluindo, em alguns casos, específica do órgão) e a captação celular específica (ou específica do órgão) do agente de RNAi ou conjugado. Um grupo de direcionamento pode ser monovalente, divalente, trivalente, tetravalente ou ter uma valência superior para o alvo ao qual está direcionado. Grupos de direcionamento representativos incluem, sem limitação, compostos com afinidade com as moléculas de superfície celular, ligantes de receptor celular, haptenos, anticorpos, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos e imitadores de anticorpos com afinidade com as moléculas de superfície celular.
[0159] Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento é ligado a um agente de RNAi usando um conector, como um conector PEG ou um, dois ou três resíduos abásicos e/ou de ribitol (ribose abásica), que podem, em alguns casos, servir como conectores. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento compreende um agrupamento derivado da galactose.
[0160] Os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui descritos podem ser sintetizados com um grupo reativo, como um grupo amino (também chamado aqui de amina) no terminal 5′ e/ou no terminal 3′. O grupo reativo pode ser usado subsequentemente para fixar uma porção de direcionamento usando métodos típicos da técnica.
[0161] Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento compreende um ligante do receptor de asialoglicoproteína. Como aqui utilizado, um ligante do receptor de asialoglicoproteína é um ligante que contém um composto que tem afinidade para o receptor de asialoglicoproteína. Como aqui observado, o receptor de asialoglicoproteína é altamente expresso em hepatócitos. Em algumas modalidades, um ligante do receptor de asialoglicoproteína inclui ou consiste em um ou mais derivados de galactose. Como aqui utilizado, o termo derivado da galactose inclui tanto a galactose como os derivados da galactose que têm afinidade para o receptor de asialoglicoproteína que é igual ou maior que a da galactose. Os derivados da galactose incluem, mas não estão limitados a: galactose, galactosamina, N- formilgalactosamina, N-acetil-galactosamina, N-propionil- galactosamina, N-n-butanoil-galactosamina e N-iso- butanoilgalactosamina (consultar, por exemplo: S.T. Iobst e K. Drickamer, J.B.C., 1996, 271, 6686). Galactose derivatives, and clusters of galactose derivatives, that are useful for in vivo targeting of oligonucleotides and other molecules to the liver are known in the art (ver, por exemplo, Baenziger e Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945).
[0162] Os derivados da galactose têm sido usados para direcionar moléculas para hepatócitos in vivo por meio de sua ligação ao receptor de asialoglicoproteína expresso na superfície dos hepatócitos. A ligação de ligantes do receptor de asialoglicoproteína ao(s) receptor(es) de asialoglicoproteína facilita o direcionamento específico da célula para hepatócitos e endocitose da molécula em hepatócitos. Os ligantes do receptor de asialoglicoproteína podem ser monoméricos (por exemplo, ter um único derivado de galactose, também chamado de monovalente ou monodentado) ou multimérico (por exemplo, ter múltiplos derivados de galactose). O derivado de galactose ou agrupamento de derivados de galactose pode ser ligado à extremidade 3’ ou 5' da fita sense ou antisense do agente de RNAi usando métodos conhecidos na técnica. A preparação de ligantes de direcionamento, tais como agrupamentos de derivados de galactose, é descrita, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2018/044350 da Arrowhead Pharmaceuticals, Inc., e na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2017/156012 da Arrowhead Pharmaceuticals , Inc., cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0163] Como aqui utilizado, um agrupamento de derivados de galactose compreende uma molécula que tem dois a quatro derivados terminais da galactose. Um derivado terminal de galactose é ligado a uma molécula por meio de seu carbono C-1. Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose é um trímero derivado da galactose (também chamado de derivado de galactose triantenária ou derivado de galactose trivalente). Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose compreende N- acetil-galactosaminas. Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose compreende três N- acetil-galactosaminas. Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose é um tetrâmero derivado de galactose (também chamado de derivado de galactose tetra-antenária ou derivado de galactose tetravalente). Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose compreende quatro N-acetil- galactosaminas.
[0164] Como aqui utilizado, um trímero derivado de galactose contém três derivados de galactose, cada qual ligado a um ponto de ramificação central. Como aqui utilizado, um tetrâmero derivado de galactose contém quatro derivados de galactose, cada qual ligado a um ponto de ramificação central. Os derivados de galactose podem ser ligados ao ponto de ramificação central por meio de carbonos C-1 dos sacarídeos. Em algumas modalidades, os derivados de galactose são ligados ao ponto de ramificação por meio de conectores ou espaçadores. Em algumas modalidades, o conector ou espaçador é um espaçador hidrofílico flexível, como um grupo PEG (consulte, por exemplo, a patente US No. 5.885.968; Biessen et al. J. Med.
Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Em algumas modalidades, o espaçador PEG é um espaçador PEG3. O ponto de ramificação pode ser qualquer molécula pequena que permita a conexão de três derivados de galactose e também permita a conexão do ponto de ramificação ao agente de RNAi. Um exemplo de grupo de ponto de ramificação é uma di-lisina ou di-glutamato. A conexão do ponto de ramificação ao agente de RNAi pode ocorrer por meio de um conector ou espaçador. Em algumas modalidades, o conector ou espaçador compreende um espaçador hidrofílico flexível, como, mas não limitado a,
um espaçador PEG. Em algumas modalidades, o conector compreende um conector rígido, como um grupo cíclico. Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose compreende ou consiste em N-acetil-galactosamina.
Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose é composto por um tetrâmero derivado de galactose, que pode ser, por exemplo, um tetrâmero de N- acetil-galactosamina.
[0165] As modalidades da presente divulgação incluem composições farmacêuticas para a liberação de um agente de RNAi de HSD17B13 em uma célula hepática in vivo. Essas composições farmacêuticas podem incluir, por exemplo, um agente de RNAi de HSD17B13 conjugado com um agrupamento de derivados de galactose. Em algumas modalidades, o agrupamento de derivados de galactose é composto por um trímero derivado de galactose, que pode ser, por exemplo, um trímero de N-acetil-galactosamina ou um tetrâmero derivado de galactose, que pode ser, por exemplo, um tetrâmero de N-acetil-galactosamina.
[0166] Um ligante de direcionamento ou grupo de direcionamento pode ser ligado à extremidade 3′ ou 5′ de uma fita sense ou fita antisense de um agente de RNAi de HSD17B13 aqui divulgado.
[0167] Os ligantes de direcionamento incluem, mas não estão limitados a, (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s,
(NAG27)¸ (NAG27)s, (NAG28)¸ (NAG28)s, (NAG29)¸ (NAG29)s, (NAG30)¸ (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39) e (NAG39)s, como definido na Tabela 6. Outros grupos de direcionamento e ligantes de direcionamento, incluindo ligantes de direcionamento do agrupamento de galactose, são conhecidos na técnica.
[0168] Em algumas modalidades, um grupo de ligação é conjugado ao agente de RNAi. O grupo de ligação facilita a ligação covalente do agente a um grupo de direcionamento, polímero de liberação ou veículo de liberação. O grupo de ligação pode ser ligado à extremidade 3′ e/ou 5′ da fita sense ou da fita antisense do agente de RNAi. Em algumas modalidades, o grupo de ligação é ligado à fita sense do agente de RNAi. Em algumas modalidades, o grupo de ligação é conjugado à extremidade 5′ ou 3′ de uma fita sense do agente de RNAi. Em algumas modalidades, um grupo de ligação é conjugado à extremidade 5′ de uma fita sense do agente de RNAi. Exemplos de grupos de ligação podem incluir, mas não estão limitados a: grupos reativos, como aminas e alcinos primários, grupos alquil, nucleotídeos abásicos, ribitol (ribose abásica) e/ou grupos PEG.
[0169] Em algumas modalidades, um grupo de direcionamento pode ser ligado internamente a um nucleotídeo na fita sense e/ou na fita antisense do agente de RNAi. Em algumas modalidades, o grupo de direcionamento é ligado ao agente de RNAi por meio de um conector.
[0170] Um conector ou grupo de ligação é uma conexão entre dois átomos que liga um grupo químico (como um agente de RNAi) ou segmento de interesse a outro grupo químico (como um grupo de direcionamento ou polímero de liberação) ou segmento de interesse por meio de uma ou mais ligações covalentes. Uma ligação lábil contém uma união lábil. Uma ligação pode incluir, opcionalmente, um espaçador que aumenta a distância entre os dois átomos unidos. Um espaçador pode adicionar ainda flexibilidade e/ou comprimento à ligação. Os espaçadores incluem, mas não estão limitados, a grupos alquil, grupos alquenil, grupos alquinil, grupos aril, grupos aralquil, grupos aralquenil e grupos aralquinil; cada um dos quais pode conter um ou mais heteroátomos, heterociclos, aminoácidos, nucleotídeos e sacarídeos. Os grupos espaçadores são bem conhecidos na técnica e a lista anterior não se destina a limitar o escopo da descrição.
[0171] Em algumas modalidades, quando dois ou mais agentes de RNAi estão incluídos em uma única composição, cada um dos agentes de RNAi pode ser ligado ao mesmo grupo de direcionamento ou dois grupos de direcionamento diferentes (isto é, grupos de direcionamento com estrutura química diferente). Em algumas modalidades, os grupos de direcionamento são ligados ao agente de RNAi de HSD17B13 aqui descrito, sem o uso de um conector adicional. Em algumas modalidades, o próprio grupo de direcionamento é projetado tendo um ligante ou outro local para facilitar a conjugação prontamente presente. Em algumas modalidades, quando dois ou mais agentes de RNAi de HSD17B13 são incluídos em um único, cada um dos agentes de RNAi pode utilizar o mesmo ligante ou diferentes ligantes (isto é, ligantes com diferentes estruturas químicas).
[0172] Qualquer uma das sequências de nucleotídeos do agente de RNAi de HSD17B13 listadas nas Tabelas 2, 3 ou 4, sejam modificadas ou não modificadas, pode conter grupo(s) de direcionamento ou grupo(s) de ligação 3’ e/ou 5'.
Qualquer uma das sequências de agente de RNAi de HSD17B13 listadas na Tabela 3 ou 4, ou são descritas de outra forma aqui, que contêm um grupo de direcionamento ou grupo de ligação 3' ou 5’, pode alternativamente não conter nenhum grupo de direcionamento ou grupo de ligação 3' ou 5' ou pode conter um grupo de direcionamento ou grupo de ligação 3′ ou 5′ diferente, incluindo, mas não se limitando àqueles representados na Tabela 6. Qualquer um dos duplexes do agente de RNAi de HSD17B13 listados na Tabela 5, sejam modificados ou não modificados, pode compreender ainda um grupo de direcionamento ou grupo de ligação, incluindo, mas não limitados, àqueles representados na Tabela 6, e o grupo de direcionamento ou grupo de ligação pode ser ligado ao terminal 3' ou 5' da fita sense ou da fita antisense do duplex do agente de RNAi de HSD17B13.
[0173] Exemplos de grupos de direcionamento e grupos de ligação (que, quando combinados, podem formar ligantes de direcionamento) são fornecidos na Tabela 6. A Tabela 4 fornece várias modalidades de fitas sense do agente de RNAi de HSD17B13 com um grupo de direcionamento ou grupo de ligação conectado à extremidade 5′ ou 3′.
Tabela 6. Estruturas que representam vários nucleotídeos modificados, ligantes de direcionamento ou grupos de direcionamento, resíduos de capeamento e grupos de ligação
O HN O O HO P HN O N O OH O HO P O N OH O O O O P - O O O O O P -
O cPrpTM cPrpu
O O HN HO P O N OH O O O HO P SH O O P -
S cPrpus sp NH2 NH2
N N
N N N N NH2 N N NH2
O O O O O O O O P P O - O -
O S a_2N a_2Ns
N N
N N N N NH2 N N NH2
O O O O O O O O P P O - O -
O S pu_2N pu_2Ns
Quando posicionado internamente no oligonucleotídeo: ligação para a5' extremidade linkage towards end of 5' do oligonucleotídeo oligonucleotide -
O O P O O
O linkage towards ligação para a3'extremidade end of oligonucleotide 3' do oligonucleotídeo (invAb) Quando posicionado internamente no oligonucleotídeo: ligação para a5' extremidade linkage towards end of 5' do oligonucleotídeo oligonucleotide -
S O P O O
O linkage towards 3' end of ligação para a extremidade oligonucleotide 3' do oligonucleotídeo (invAb)s
Quando posicionado na extremidade terminal 3’ do oligonucleotídeo: ligação linkage para 5'a end towards extremidade of 5' do oligonucleotídeo oligonucleotide
HO O (invAb)
O NAG O O H O O N - O P O O H O H O NAG O O N N OH
O O N N 9
O H O H O O N NAG O O H
O (NAG13)
O NAG O O H O O N - O P S O H O H O NAG O O N N OH
O O N N 9
O H O H O O N NAG O O H
O (NAG13)s
O H H O NAG O O N N N O P O - H O O H H N O N NAG O O O O N H
NAG O O (NAG18)
O H H O NAG O O N N N O P O O - H S H H N O N NAG O O O O N H
NAG O O (NAG18)s
O O NAG O NH O P O O - O O N NH NAG O NH O HN O O
NAG O (NAG24)
O O NAG O NH O P O O - S O N NH NAG O NH O HN O O
NAG O (NAG24)s
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 6 O
O (NAG25)
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 6 S
O (NAG25)s
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 8 O
O (NAG26)
H NAG O N O O H NAG O N O N O H O O O H
NAG O N O P O N O - H 8 S
O (NAG26)s
NAG O NH O O O NH NAG O NH O O O O O NH O O NAG O NH O O O P O -
O (NAG27)
NAG O NH O O O NH NAG O NH O O O O O NH O O NAG O NH O O O P O -
S (NAG27)s
O NAG O NH O O O N NAG O NH O HN O NH O O P - O O
NAG O (NAG28)
O NAG O NH O O O N NAG O NH O HN O NH O O P O - S
NAG O (NAG28)s
NAG O O O NH O O NAG O NH O O NH NH O NAG O NH O O -
O P O (NAG29)
NAG O O O NH O O NAG O NH O O NH NH O NAG O NH O O -
S P O (NAG29)s
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - O O NH
NAG O (NAG30)
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - S O NH
NAG O (NAG30)s
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - O O NH
NAG O (NAG31)
NAG O O O HN O N H H O O N NAG O N O P O O - S O NH
NAG O (NAG31)s
H NAG O N O O O O O O N O H O O N NAG O N O P H - O NAG O N O
O O H (NAG32)
H NAG O N O O O O O O N O H O O N NAG O N O P H - S NAG O N O
O O H (NAG32)s
NAG O O O N H O O O O O N N H O O NAG O P - O N H O O NAG
O (NAG33)
NAG O O O N H O O O O O N N H O O NAG O P - S N H O O NAG
O (NAG33)s
H O O N NAG O O O O P O N - O O O NAG O O N HN H O O
NAG O (NAG34)
H O O N NAG O O O O P O N - S O O NAG O O N HN H O O
NAG O (NAG34)s
H NAG O N O O O O O O N O N H O O NAG O N O P H - N O O O O
NAG O H (NAG35)
H NAG O N O O O O O O N O O N H O NAG O N O P H - N O S O O
NAG O H (NAG35)s
H NAG O N O O NH O O P H O O H - O NAG O N N N O N O H O HN O H NAG O N O
O (NAG36)
H NAG O N O O NH O O P H O O H - S NAG O N N N O N O H O HN O H NAG O N O
O (NAG36)s
NAG O NH O O NAG O NH O NH O O O NAG O NH O NH O - O O P
O (NAG37)
NAG O NH O O NAG O NH O NH O O O NAG O NH O NH O - S O P
O (NAG37)s
NAG O O O HN O O P - O O NH NAG O N O O O NH
NAG O (NAG 38)
NAG O O O HN O O P - S O NH NAG O N O O O NH
NAG O (NAG 38)s (NAG39)
(NAG39)s
[0174] Em cada uma das estruturas acima na Tabela 6, NAG compreende uma N-acetil-galactosamina ou outro derivado de galactose, como seria entendido por um versado na técnica, a ser ligado em vista das estruturas acima e da descrição fornecida neste documento. Por exemplo, em algumas modalidades, NAG nas estruturas fornecidas é N- acetil-galactosaminas.
[0175] Cada (NAGx) pode ser ligada a um agente de RNAi de HSD17B13 por meio de um grupo fosfato (como em (NAG25), (NAG30) e (NAG31)), ou um grupo fosforotioato, (como em (NAG25)s, (NAG29)s , (NAG30)s, (NAG31)s ou (NAG37)s), ou outro grupo de ligação.
O O O P O P - -
O S Grupo fosfato Grupo fosforotioato Outros grupos de ligação conhecidos na técnica podem ser usados.
[0176] Em algumas modalidades, o veículo de liberação pode ser usado para liberar um agente de RNAi em uma célula ou tecido. Um veículo de liberação é um composto que melhora a liberação do agente de RNAi em uma célula ou tecido. Um veículo de liberação pode incluir ou consistir em, mas não está limitado a: um polímero, como um polímero anfipático, um polímero ativo de membrana, um peptídeo, um peptídeo de melitina, um peptídeo semelhante à melitina (MLP), um lipídio, um polímero ou peptídeo reversivelmente modificado ou uma poliamina ativa de membrana reversivelmente modificada. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi podem ser combinados com lipídios, nanopartículas, polímeros, lipossomas, micelas, DPCs ou outros sistemas de liberação disponíveis na técnica. Os agentes de RNAi também podem ser quimicamente conjugados a grupos de direcionamento, lipídios (incluindo, mas não se limitando a, derivados de colesterol e colesteril), nanopartículas, polímeros, lipossomas, micelas, DPCs (consulte, por exemplo, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 e WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141, cada um dos quais é aqui incorporado por referência), hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis e microesferas bioadesivas, vetores proteicos ou outros sistemas de liberação adequados para liberação de ácido nucleico ou oligonucleotídeo como conhecido e disponível na técnica.
Composições e formulações farmacêuticas
[0177] Os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui descritos podem ser preparados como composições ou formulações farmacêuticas (também denominadas aqui “medicamentos”). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas incluem pelo menos um agente de RNAi de HSD17B13. Essas composições farmacêuticas são particularmente úteis na inibição da expressão do mRNA alvo em uma célula alvo, um grupo de células, um tecido ou um organismo.
[0178] As composições farmacêuticas podem ser usadas para tratar um indivíduo com uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução do nível do mRNA de HSD17B13 alvo ou inibição da expressão do gene alvo. As composições farmacêuticas podem ser usadas para tratar um indivíduo em risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução do nível do mRNA alvo ou de uma inibição da expressão do gene alvo. Em uma modalidade, o método inclui a administração de um agente de RNAi de HSD17B13 ligado a um ligante de direcionamento, conforme descrito neste documento, a um indivíduo a ser tratado. Em algumas modalidades, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis(incluindo veículos, carreadores, diluentes e/ou polímeros de liberação) são adicionados às composições farmacêuticas que incluem um agente de RNAi de HSD17B13, formando assim uma formulação farmacêutica ou medicamento adequado para liberação in vivo em um indivíduo, incluindo um humano.
[0179] As composições farmacêuticas que incluem um agente de RNAi de HSD17B13 e métodos aqui divulgados diminuem o nível do mRNA alvo em uma célula, grupo de células, grupo de células, tecido, órgão ou indivíduo, incluindo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de HSD17B13 aqui descrito, inibindo assim a expressão de mRNA de HSD17B13 no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi previamente identificado ou diagnosticado como tendo uma regulação positiva patogênica do gene alvo na célula ou tecido alvo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi previamente identificado ou diagnosticado como tendo DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doença hepática alcoólica ou não alcoólica, como cirrose. Em algumas modalidades, o indivíduo tem sofrido de sintomas associados a DHGNA, NASH,
fibrose hepática e/ou doença hepática alcoólica ou não alcoólica, como cirrose.
[0180] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas incluindo um agente de RNAi de HSD17B13 são usadas para tratar ou controlar apresentações clínicas associadas a DHGNA, NASH, fibrose hepática, doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose e/ou superexpressão de HSD17B13 em um indivíduo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente (incluindo profilaticamente) eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas é administrada a um indivíduo com necessidade de tal tratamento. Em algumas modalidades, a administração de qualquer um dos agentes de RNAi de HSD17B13 divulgados pode ser usada para diminuir o número, gravidade e/ou frequência dos sintomas de uma doença em um indivíduo.
[0181] As composições farmacêuticas descritas que incluem um agente de RNAi de HSD17B13 podem ser usadas para tratar pelo menos um sintoma em um indivíduo com uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da redução ou inibição na expressão de mRNA HSD17B13. Em algumas modalidades, é administrada ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais composições farmacêuticas que incluem um agente de RNAi de HSD17B13 tratando, assim, o sintoma.
Em outras modalidades, é administrada ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz de um ou mais agentes de
RNAi de HSD17B13, prevenindo ou inibindo, assim, pelo menos um sintoma.
[0182] A via de administração é o caminho pelo qual um agente de RNAi de HSD17B13 é colocado em contato com o corpo. Em geral, os métodos de administração de medicamentos e oligonucleotídeos e ácidos nucleicos para o tratamento de um mamífero são bem conhecidos na técnica e podem ser aplicados à administração das composições aqui descritas. Os agentes de RNAi de HSD17B13 divulgados neste documento podem ser administrados por meio de qualquer via adequada em uma preparação corretamente adaptada à via em particular. Assim, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas por injeção, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular, intracutânea, subcutânea, intra-articular ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas são administradas por injeção subcutânea.
[0183] As composições farmacêuticas que incluem um agente de RNAi de HSD17B13 aqui descrito podem ser liberadas em uma célula, grupo de células, tecido ou indivíduo usando tecnologias de liberação de oligonucleotídeos conhecidas na técnica. Em geral, qualquer método adequado reconhecido na técnica para liberar uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para uso com as composições aqui descritas. Por exemplo, a liberação pode ser por administração local (por exemplo, injeção direta, implante ou administração tópica), administração sistêmica ou via subcutânea, intravenosa, intraperitoneal ou parenteral, incluindo intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal), administração intramuscular, transdérmica, por vias aéreas (aerossol), nasal, oral, retal ou tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção subcutânea ou intravenosa.
[0184] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas compreendem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas aqui descritas são formuladas para administração a um indivíduo.
[0185] Como aqui utilizada, uma composição farmacêutica ou medicamento inclui uma quantidade farmacologicamente eficaz de pelo menos um dos compostos terapêuticos descritos e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis(excipientes) são substâncias diferentes do Ingrediente Farmacêutico Ativo (API, produto terapêutico, por exemplo, agente de RNAi de HSD17B13), que são intencionalmente incluídas no sistema de liberação do medicamento. Os excipientes não exercem ou não se destinam a exercer um efeito terapêutico na dosagem pretendida. Os excipientes podem atuar para a) auxiliar no processamento do sistema de liberação do medicamento durante a fabricação, b) proteger, apoiar ou melhorar a estabilidade, biodisponibilidade ou aceitabilidade do paciente do API, c) auxiliar na identificação do produto e/ou d) melhorar qualquer outro atributo da segurança geral, eficácia, da liberação do API durante o armazenamento ou uso. Um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ou não ser uma substância inerte.
[0186] Os excipientes incluem, mas não estão limitados a: intensificadores de absorção, antiaderentes, agentes antiespumantes, antioxidantes, aglutinantes, agentes tamponantes, carreadores, agentes de revestimento, cores, intensificadores de liberação, polímeros de liberação, detergentes, dextrano, dextrose, diluentes, desintegrantes, emulsificantes, extensores, enchimentos, sabores, deslizantes, umectantes, lubrificantes, óleos, polímeros, conservantes, solução salina, sais, solventes, açúcares, surfactantes, agentes de suspensão, matrizes de liberação sustentada, adoçantes, agentes espessantes, agentes de tonicidade, veículos, agentes repelentes de água e agentes umectantes.
[0187] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveisestéreis. Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, NJ, EUA) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os veículos adequados devem ser estáveisnas condições de fabricação e armazenamento e devem ser preservados contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido) e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes.
Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol e cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0188] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas ao incorporar o composto ativo na quantidade necessária em um solvente adequado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização por filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas ao incorporar o composto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem a secagem a vácuo e a liofilização, que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente esterilizada por filtração.
[0189] Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas que incluem os agentes de RNAi de HSD17B13 divulgados aqui, adequadas para administração subcutânea, podem ser preparadas em um tampão de fosfato de sódio aquoso (por exemplo, o agente de RNAi de HSD17B13 formulado em 0,5 mM de fosfato de sódio monobásico, 0,5 mM de fosfato de sódio dibásico, em água).
[0190] As formulações adequadas para administração intra-articular podem estar na forma de uma preparação aquosa estéril do medicamento que pode estar na forma microcristalina, por exemplo, na forma de uma suspensão microcristalina aquosa. Formulações lipossomais ou sistemas poliméricos biodegradáveistambém podem ser usadospara apresentar o fármaco para administração intra-articular e oftálmica.
[0191] Também podem ser preparadas formulações adequadas para administração oral dos agentes de RNAi de HSD17B13 aqui divulgados. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui divulgados são administrados oralmente. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui divulgados são formulados em uma cápsula para administração oral.
[0192] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a eliminação rápida do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os versados na técnica. Também podem ser usadas soluções lipossomais como veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. Nº 4.522.811.
[0193] Os agentes de RNAi de HSD17B13 podem ser formulados em composições na forma de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem.
Forma de dosagem unitária refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de dosagem unitária da divulgação é ditada por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico a ser alcançado, e das limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.
[0194] Uma composição farmacêutica pode conter outros componentes adicionais comumente encontrados em composições farmacêuticas. Esses componentes adicionais incluem, mas não estão limitados a: antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais, analgésicos, anti-histamínicos ou agentes anti-inflamatórios (por exemplo, acetaminofeno, AINEs, difenidramina etc.). Também é previsto que células, tecidos ou órgãos isolados que expressam ou compreendem os agentes de RNAi aqui definidos podem ser usadoscomo "composições farmacêuticas". Como aqui utilizado, "quantidade farmacologicamente eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "quantidade eficaz" refere-se àquela quantidade de um agente de RNAi para produzir um resultado farmacológico, terapêutico ou preventivo.
[0195] Em algumas modalidades, os métodos aqui divulgados compreendem ainda a etapa de administração de um segundo agente terapêutico ou tratamento, além de administrar um agente de RNAi divulgado neste documento. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é outro agente de RNAi de HSD17B13 (por exemplo, um agente de RNAi de HSD17B13 que tem como alvo uma sequência diferente dentro do alvo HSD17B13). Em outras modalidades, o segundo agente terapêutico pode ser um medicamento de molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um aptâmero.
[0196] Em algumas modalidades, o(s) agente(s) de RNAi de HSD17B13 descrito(s) é(são) opcionalmente combinado(s) com uma ou mais terapêuticas adicionais. O agente de RNAi de HSD17B13 e agente(s) terapêutico(s) adicional(is) podem ser administrados em uma única composição ou podem ser administrados separadamente. Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais são administrados separadamente em formas de dosagem separadas do agente de RNAi (por exemplo, o agente de RNAi de HSD17B13 é administrado por injeção subcutânea, enquanto o agente terapêutico adicional envolvido no método de regime de dosagem de tratamento é administrado oralmente). Em algumas modalidades, o(s) agente(s) de RNAi de HSD17B13 descrito(s) é(são) administrado(s) a um indivíduo com necessidade por meio de injeção subcutânea, e um ou mais agentes terapêuticos adicionais opcionais são administrados por via oral, que em conjunto fornecem um regime de tratamento para doenças e condições associadas a DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose. Em algumas modalidades, o(s)
agente(s) de RNAi de HSD17B13 descrito(s) é(são) administrado(s) a um indivíduo com necessidade por meio de injeção subcutânea, e um ou mais agentes terapêuticos adicionais opcionais são administrados por via de uma injeção subcutânea separada. Em algumas modalidades, o agente de RNAi de HSD17B13 e um ou mais agentes terapêuticos adicionais são combinados em uma única forma de dosagem (por exemplo, um “coquetel” formulado em uma composição única para injeção subcutânea). Os agentes de RNAi de HSD17B13, com ou sem o um ou mais agentes terapêuticos adicionais, podem ser combinados com um ou mais excipientes para formar composições farmacêuticas.
[0197] Geralmente, uma quantidade eficaz de um agente de RNAi de HSD17B13 estará na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal/dose, por exemplo, de cerca de 1,0 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal/dose. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um composto ativo estará na faixa de cerca de 0,25 a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ingrediente ativo estará na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 4 mg/kg de peso corporal por dose. As doses podem ser semanais, quinzenais, mensais ou em qualquer outro intervalo dependendo da dose do agente de RNAi de HSD17B13 administrada, do nível de atividade do agente de RNAi de HSD17B13 em particular, e do nível de inibição desejado para o indivíduo específico. Os exemplos neste documento mostram níveis adequados de inibição em certas espécies animais. A quantidade administrada dependerá de variáveis, tais como estado geral de saúde do paciente, eficácia biológica relativa do composto aplicado, formulação do medicamento, presença e tipos de excipientes na formulação e via de administração. Também, fica entendido que a dosagem inicial administrada pode ser aumentada além do nível superior para atingir rapidamente o nível sanguíneo ou nível no tecido desejado, ou a dosagem inicial pode ser menor que a ideal.
[0198] Para tratamento da doença ou para formação de um medicamento ou composição para tratamento de uma doença, as composições farmacêuticas aqui descritas, incluindo um agente de RNAi de HSD17B13 podem ser combinadas com um excipiente ou com um segundo agente terapêutico ou tratamento, incluindo, mas não se limitando a: um segundo agente de RNAi ou outro, uma droga de molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, peptídeo e/ou aptâmero.
[0199] Os agentes de RNAi de HSD17B13 descritos, quando adicionados a excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou adjuvantes, podem ser embalados em kits, recipientes, embalagens ou dispensadores. As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser embaladas em seringas ou frascos previamente preenchidos.
Métodos de tratamento e inibição de expressão
[0200] Os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui divulgados podem ser usados para tratar um indivíduo (por exemplo, um humano ou outro mamífero) com uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da administração do agente de RNAi. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi divulgados neste documento podem ser usadospara tratar um indivíduo (por exemplo, um humano) que se beneficiaria da redução e/ou inibição da expressão de mRNA de HSD17B13 e/ou dos níveis da proteína HSD17B13 (alternativamente referido aqui como 17β-HSD13), por exemplo, um indivíduo que foi diagnosticado ou está sofrendo de sintomas relacionados a DHGNA, NASH, fibrose hepática ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose.
[0201] Em algumas modalidades, é administrada ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais agentes de RNAi de HSD17B13. O tratamento de um indivíduo pode incluir tratamento terapêutico e/ou profilático. É administrada ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais agentes de RNAi de HSD17B13 aqui descritos. O indivíduo pode ser um humano, paciente ou um paciente humano. O indivíduo pode ser um adulto, adolescente, criança ou bebê. A administração de uma composição farmacêutica aqui descrita pode ser a um ser humano ou animal.
[0202] Os agentes de RNAi de HSD17B13 aqui divulgados podem ser usados para tratar pelo menos um sintoma de um indivíduo que tem uma doença ou distúrbio relacionado à HSD17B13 ou que tem uma doença ou distúrbio que é mediado pelo menos em parte pela expressão do gene HSD17B13. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi de HSD17B13 são usados para tratar ou controlar uma apresentação clínica de um indivíduo com uma doença ou distúrbio que se beneficiaria ou seria mediado pelo menos em parte pela redução de mRNA de HSD17B13. É administrada ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos agentes de RNAi de HSD17B13 ou composições contendo o agente de RNAi de HSD17B13 aqui descritos. Em uma modalidade, os métodos aqui descritos compreendem a administração de uma composição que compreende um agente de RNAi de HSD17B13 aqui descrito a um indivíduo a ser tratado. Em outras modalidades, é administrada ao indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz de qualquer um ou mais dos agentes de RNAi de HSD17B13 descritos, tratando, assim, o indivíduo ao prevenir ou inibir pelo menos um sintoma.
[0203] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para o tratamento de doenças, distúrbios, condições ou estados patológicos mediados pelo menos em parte pela expressão do gene HSD17B13, em um paciente com necessidade, caracterizado pelos métodos incluírem a administração ao paciente de qualquer um dos agentes de RNAi de HSD17B13 aqui descritos.
[0204] Em algumas modalidades, o nível de expressão gênica e/ou nível de mRNA de um gene HSD17B13 em um indivíduo a quem um agente de RNAi de HSD17B13 descrito é administrado é reduzido em pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de 99% em relação ao indivíduo antes de ser administrado o agente de RNAi de HSD17B13 ou a um indivíduo que não recebe o agente de RNAi de HSD17B13. O nível de expressão gênica e/ou nível de mRNA no indivíduo pode ser reduzido em uma célula, grupo de células e/ou tecido do indivíduo.
[0205] Em algumas modalidades, o nível da proteína HSD17B13 em um indivíduo a quem um agente de RNAi de HSD17B13 descrito foi administrado é reduzido em pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de 99% em relação ao indivíduo antes de ser administrado o agente de RNAi de HSD17B13 ou a um indivíduo que não recebe o agente de RNAi de HSD17B13. O nível de proteína no indivíduo pode ser reduzido em uma célula, grupo de células, tecido, sangue e/ou outro fluido do indivíduo.
[0206] Uma redução nos níveis de mRNA de HSD17B13 e níveis de proteína HSD17B13 pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Como aqui utilizado, uma redução ou diminuição no nível de mRNA de HSD17B13 e/ou nível de proteína são coletivamente referidos aqui como uma redução ou diminuição de HSD17B13 ou inibição ou redução da expressão de HSD17B13. Os exemplos aqui apresentados ilustram métodos conhecidos para avaliar a inibição da expressão do gene HSD17B13. O versado na técnica deve conhecer ainda métodos adequados para avaliar a inibição da expressão do gene HSD17B13 in vivo e/ou in vitro.
[0207] Em algumas modalidades, são divulgados aqui métodos de tratamento (incluindo tratamento profilático ou preventivo) de doenças, distúrbios ou sintomas causados por DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose, em que os métodos incluem a administração a um indivíduo com necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de HSD17B13 que inclui uma fita antisense que é pelo menos parcialmente complementar à porção do mRNA de HSD17B13 com a sequência na Tabela 1. Em algumas modalidades, são divulgados aqui métodos de tratamento (incluindo tratamento profilático ou preventivo) de doenças ou sintomas causados por DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose, em que os métodos incluem a administração a um indivíduo com necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de HSD17B13 que inclui uma fita antisense que compreende a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 3 e uma fita sense que compreende qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 4 que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense. Em algumas modalidades, são divulgados aqui métodos de tratamento (incluindo tratamento profilático ou preventivo) de doenças ou sintomas causadospor DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose, em que os métodos incluem a administração a um indivíduo com necessidade, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de HSD17B13 que inclui um fita sense que compreende a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 4 e uma fita antisense que compreende qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 3 que é pelo menos parcialmente complementar à fita sense.
[0208] Em algumas modalidades, são divulgados aqui métodos para inibir a expressão do gene HSD17B13 em uma célula, em que os métodos incluem a administração à célula de um agente de RNAi de HSD17B13 que inclui uma fita antisense que é pelo menos parcialmente complementar à porção do mRNA de HSD17B13 com a sequência na Tabela 1. Em algumas modalidades, são divulgados aqui métodos de inibição da expressão do gene HSD17B13 em uma célula, em que os métodos incluem a administração a uma célula de um agente de RNAi de HSD17B13 que inclui uma fita antisense que compreende a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 3 e uma fita sense que compreende qualquer das sequências nas Tabelas 2 ou 4 que é pelo menos parcialmente complementar à fita antisense. Em algumas modalidades, são divulgados aqui métodos de inibição da expressão do gene HSD17B13 em uma célula, em que os métodos incluem a administração de um agente de RNAi de HSD17B13 que inclui uma fita sense que compreende qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 4 e uma fita antisense que inclui a sequência de qualquer uma das sequências nas Tabelas 2 ou 3 que é pelo menos parcialmente complementar à fita sense.
[0209] O uso dos agentes de RNAi de HSD17B13 fornece métodos para tratamento terapêutico (incluindo profilático) de doenças/distúrbios associados a DHGNA, NASH, fibrose hepática, doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose e/ou expressão de HSD17B13 acentuada ou elevada. Os agentes de RNAi de HSD17B13 mediam a interferência de RNA para inibir a expressão de um ou mais genes necessários para produção de proteína HSD17B13. Os agentes de RNAi de HSD17B13 também podem ser usados para tratar ou prevenir várias doenças, distúrbios ou condições, incluindo DHGNA, NASH, fibrose hepática e/ou doenças hepáticas alcoólicas ou não alcoólicas, incluindo cirrose.
Além disso, são descritas composições para liberação de agentes de RNAi de HSD17B13 em células hepáticas in vivo.
Células, tecidos, órgãos e organismos não humanos
[0210] São contemplados células, tecidos, órgãos e organismos não humanos que incluem pelo menos um dos agentes de RNAi de HSD17B13 aqui descritos. A célula, tecido, órgão ou organismo não humano é produzido mediante a liberação do agente de RNAi na célula, tecido, órgão ou organismo não humano.
[0211] As modalidades e itens fornecidos acima são agora ilustrados com os seguintes exemplos não limitadores.
EXEMPLOS Exemplo 1. Síntese de agentes de RNAi de HSD17B13.
[0212] Os duplexes do agente de RNAi de HSD17B13 mostrados na Tabela 5 acima foram sintetizados de acordo com os seguintes procedimentos gerais: A. Síntese.
[0213] As fitas sense e antisense dos agentes de RNAi foram sintetizadas de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida usada na síntese de oligonucleotídeos. Essa síntese padrão é geralmente conhecida na técnica. Dependendo da escala, foi usado o MerMade96E® (Bioautomation), MerMade12® (Bioautomation) ou OP Pilot 100 (GE Healthcare). As sínteses foram realizadas em um suporte sólido constituído por vidro de poros controlados (CPG, 500 Å ou 600Å, obtido junto à Prime Synthesis, Aston, PA, EUA). O monômero posicionado na extremidade 3’ da respectiva fita foi ligado ao suporte sólido como ponto de partida para a síntese. Todas as fosforamiditas de RNA e RNA modificado em 2’ foram adquiridas junto à Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI,
EUA) ou Hongene Biotech (Xangai, República Popular da
China). As 2′-O-metil fosforamiditas incluíam o seguinte:
(5′-O-dimetoxitritil-N6-(benzoil)-2′-O-metil-adenosina-3′-
O- (2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino) fosforamidita, 5′-O-
dimetoxi-tritil-N4-(acetil)-2′-O-metil-citidina-3′-O-(2-
cianoetil-N,N-di-isopropil-amino) fosforamidita, (5′-O-
dimetoxitritil-N2-(isobutiril)-2′-O-metil-guanosina-3′-O-
(2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino) fosforamidita e 5′-O-
dimetoxitritil-2′-O-metiluridina-3′-O-(2-cianoetil-N,N-di-
isopropilamino) fosforamidita.
As 2′-desoxi-2′-fluoro-
fosforamiditas transportaram os mesmos grupos de proteção que as 2′-O-metil amiditas. 5′- (4,4′-Dimetoxitritil)-2′,
3′-seco-uridina, 2′-benzoil-3′-[(2-cianoetil)- (N, N-di-
isopropil)]- fosforamidita também foi adquirida junto à
Thermo Fisher Scientific ou Hongene Biotech.
As fosforamiditas de 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-inosina-3'-
O- (2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino) foram adquiridas junto à Glen Research (Virginia) ou Hongene Biotech.
As fosforamiditas abásicas invertidas (3′-O-dimetoxitritil-2′-
desoxirribose-5′-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropilamino)
foram adquiridas junto à ChemGenes (Wilmington, MA, EUA) ou
SAFC (St.
Louis, MO, EUA). 5'-O-dimetoxitritil-N2,N6-
(fenoxiacetato)-2'-O-metil-diaminopurina-3′-O-(2-cianoetil-
N,N-di-isopropilamino) fosforamiditas foram obtidas junto à ChemGenes ou Hongene Biotech.
[0214] Fosforamiditas contendo ligante de direcionamento foram dissolvidas em diclorometano anidro ou acetonitrila anidro (50 mM), enquanto todas as outras amiditas foram dissolvidas em acetonitrila anidra (50 mM) ou dimetilformamida anidra e peneiras moleculares (3Å) foram adicionadas. 5-Benziltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM em acetonitrila) ou 5-Etiltio-1H-tetrazol (ETT, 250 mM em acetonitrila) foi usado como solução ativadora. Os tempos de acoplamento foram de 12 min. (RNA), 15 min. (ligante de direcionamento), 90 s (2′OMe) e 60 s (2′F). Para introduzir ligações de fosforotioato, foi empregada uma solução a 100 mM de 3-fenil 1,2,4-ditiazolina-5-ona (POS, obtida junto à PolyOrg, Inc., Leominster, MA, EUA) em acetonitrila anidra.
A menos que especificamente identificado como um agente de RNAi "nu" sem ligante de direcionamento presente, cada um dos duplexes do agente de RNAi de HSD17B13 sintetizado e testado nos seguintes Exemplos utilizou N-acetil- galactosamina como "NAG" nas estruturas químicas de ligante de direcionamento representadas na Tabela 6. As estruturas químicas de certos duplexes usados nos Exemplos relatados neste documento podem ser encontradas nas Figuras 1A a 10D.
B. Clivagem e desproteção do oligômero ligado ao suporte.
[0215] Após a finalização da síntese em fase sólida, o suporte sólido seco foi tratado com uma solução em volume 1:1 de 40%, em peso, de metilamina em água e solução de hidróxido de amônio a 28% (Aldrich) por 1,5 hora a 30 °C. A solução foi evaporada e o resíduo sólido foi reconstituído em água (consulte abaixo).
C. Purificação.
[0216] Os oligômeros em bruto foram purificados por HPLC de troca aniônica usando uma coluna TSKgel SuperQ-5PW de 13 µm e sistema Shimadzu LC-8. O tampão A era Tris 20 mM, EDTA 5 mM, pH 9,0 e continha 20% de acetonitrila e o tampão B era o mesmo que o tampão A com a adição de cloreto de sódio 1,5 M. Foram registrados traços de UV a 260 nm. As frações apropriadas foram agrupadas e depois executadas em HPLC de exclusão de tamanho usando uma coluna GE Healthcare XK 26/40 embalada com Sephadex G-25 fino com um tampão de corrida de água DI filtrada ou bicarbonato de amônio 100 mM, pH 6,7 e 20% de acetonitrila.
D. Recozimento.
[0217] Fitas complementares foram misturadas pela combinação de soluções equimolares de RNA (senso e antissenso) em 1× solução salina tamponada com fosfato (Corning, Cellgro) para formar os agentes de RNAi. Alguns agentes de RNAi foram liofilizados e armazenados a -15 a - 25 oC. Foi determinada a concentração de duplex medindo a absorbância da solução em um espectrômetro UV-Vis em 1x solução salina tamponada com fosfato. A absorbância da solução a 260 nm foi então multiplicada por um fator de conversão e pelo fator de diluição para determinar a concentração de duplex. O fator de conversão usado era 0,050 mg/(mL∙cm) ou foi calculado a partir de um coeficiente de extinção determinado experimentalmente.
Exemplo 2. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em ratos.
[0218] Para avaliar a atividade in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 que são projetados para atingir diferentes posições no gene HSD17B13, foram usados ratos Sprague Dawley. No dia 1, cada rato recebeu uma única injeção subcutânea de 500 μl/200 g de peso animal, contendo 3,0 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com os grupos de dosagem mencionados na Tabela 7.
Tabela 7. Grupos de dosagem do Exemplo 2 Grupo Agente de RNAi e dose Regime de dosagem 1 Solução salina (sem Injeção única no dia agente de RNAi) 1 2 3,0 mg/kg AD06079 Injeção única no dia 1 3 3,0 mg/kg AD06080 Injeção única no dia 1
4 3,0 mg/kg AD06081 Injeção única no dia 1 5 3,0 mg/kg AD06082 Injeção única no dia 1 6 3,0 mg/kg AD06083 Injeção única no dia 1 7 3,0 mg/kg AD06084 Injeção única no dia 1 8 3,0 mg/kg AD06085 Injeção única no dia 1
[0219] Cada um dos agentes de RNAi incluiu uma sequência modificada e um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentado conjugado à extremidade terminal 5’ da fita sense. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para sequências modificadas e estruturas de ligante de direcionamento). Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 AD06079, AD06080 e AD06081 (Grupos 2, 3 e 4) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 488 do gene; cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 AD06082 e AD06083 (Grupos 5 e 6) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 492 do gene; e cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 AD06084 e AD06085 (Grupos 7 e 8) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 499 do gene.
(Consulte, por exemplo SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0220] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 3 (três) ratos em cada grupo (n=3). Todos os ratos foram sacrificados no dia 15. Os fígados foram colhidos e amostras de aproximadamente 100 mg de fígado foram coletadas e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido para isolamento de RNA. A expressão relativa de cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 foi determinada por qRT-PCR normalizando os níveis de expressão de mRNA de HSD17B13 dos animais de cada Grupo de tratamento respectivo para os animais do Grupo 1 (controle de veículo, sem agente de RNAi) (análise ΔΔCT), cujos resultados são apresentados na Tabela 8 abaixo: Tabela 8. Nível de mRNA de HSD17B13 relativo no dia 15, normalizado para controle do Exemplo 2 Dia 15 Identificação de Relativo Baix Alta grupo mRNA de o variância HSD17B13 Vari (Err ância o) (Err o) Grupo 1 (veículo 1,000 0,057 0,060 salino) Grupo 2 (3,0 mg/kg 0,247 0,064 0,086 AD06079) Grupo 3 (3,0 mg/kg 0,214 0,006 0,006 AD06080) Grupo 4 (3,0 mg/kg 0,155 0,016 0,017 AD06081) Grupo 5 (3,0 mg/kg 0,543 0,090 0,108 AD06082) Grupo 6 (3,0 mg/kg 0,484 0,037 0,040 AD06083) Grupo 7 (3,0 mg/kg 0,179 0,054 0,077 AD06084) Grupo 8 (3,0 mg/kg 0,131 0,034 0,045 AD06085)
[0221] Como mostrado na Tabela 8, acima, no dia 15, cada um dos agentes de RNAi nos Grupos 2 a 8 mostrou uma redução dos níveis de mRNA de HSD17B13 em comparação ao controle de veículo. Por exemplo, uma única administração subcutânea de 3,0 mg/kg de agente de RNAi de HSD17B13
AD06085 mostrou uma redução de aproximadamente 87% (0,131) de mRNA de HSD17B13 no dia 15.
Exemplo 3. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em ratos.
[0222] Para avaliar a atividade in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 adicionais, foram usados ratos Sprague Dawley. No dia 1, cada rato recebeu uma única injeção subcutânea de 500 μl/200 g de peso animal, contendo 3,0 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com os grupos de dosagem mencionados na Tabela 9.
Tabela 9. Grupos de dosagem do Exemplo 3 Grupo Agente de RNAi e Regime de dosagem dose 1 Solução salina Injeção única no dia 1 (sem agente de RNAi) 2 3,0 mg/kg AD06081 Injeção única no dia 1 3 3,0 mg/kg AD06079 Injeção única no dia 1 4 3,0 mg/kg AD06177 Injeção única no dia 1 5 3,0 mg/kg AD06178 Injeção única no dia 1 6 3,0 mg/kg AD06179 Injeção única no dia 1 7 3,0 mg/kg AD06180 Injeção única no dia 1 8 3,0 mg/kg AD06181 Injeção única no dia 1 9 3,0 mg/kg AD06182 Injeção única no dia 1
10 3,0 mg/kg AD06183 Injeção única no dia 1
[0223] Cada um dos agentes de RNAi incluiu uma sequência modificada e um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentado conjugado à extremidade terminal 5’ da fita sense. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para sequências modificadas e estruturas de ligante de direcionamento). Todos os agentes de RNAi de HSD17B13 testados (Grupos 2 a 10) incluíram sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 488 do gene. (Consulte, por exemplo SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0224] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) ratos em cada grupo (n=4). Todos os ratos foram sacrificados no dia 15. Os fígados foram colhidos e amostras de aproximadamente 100 mg de fígado foram coletadas e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido para isolamento de RNA. A expressão relativa de cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 foi determinada por qRT-PCR normalizando os níveis de expressão de mRNA de HSD17B13 dos animais de cada Grupo de tratamento respectivo para os animais do Grupo 1 (controle de veículo, sem agente de
RNAi) (análise ΔΔCT), cujos resultados são apresentados na
Tabela 10 abaixo:
Tabela 10. Nível de mRNA de HSD17B13 relativo no dia
15, normalizado para controle do Exemplo 3
Dia 15
Identificação de Relativo Baix Alta grupo mRNA de o variância
HSD17B13 Vari (Err ância o)
(Err o)
Grupo 1 (veículo salino) 1,000 0,113 0,128
Grupo 2 (3,0 mg/kg
AD06081) 0,248 0,039 0,046
Grupo 3 (3,0 mg/kg
AD06079) 0,196 0,062 0,091
Grupo 4 (3,0 mg/kg
AD06177) 0,317 0,057 0,070
Grupo 5 (3,0 mg/kg
AD06178) 0,316 0,085 0,116
Grupo 6 (3,0 mg/kg
AD06179) 0,308 0,106 0,161
Grupo 7 (3,0 mg/kg 0,326 0,100 0,145
AD06180) Grupo 8 (3,0 mg/kg AD06181) 0,295 0,038 0,043 Grupo 9 (3,0 mg/kg AD06182) 0,800 0,070 0,077 Grupo 10 (3,0 mg/kg AD06183) 0,348 0,018 0,019
[0225] Conforme mostrado na Tabela 10, acima, cada um dos agentes de RNAi nos Grupos 2 a 10 mostrou uma redução dos níveis de mRNA de HSD17B13 em comparação ao controle de veículo no dia 15. O Grupo 9 (AD06182) mostrou apenas aproximadamente 20% (0,800) de redução do mRNA de HSD17B13 no dia 15. No entanto, cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 restantes testados (ou seja, Grupos 2 a 8 e 10) mostrou uma redução entre aproximadamente 65% (Grupo 10, 0,348) e aproximadamente 81% (Grupo 3, 0,196) de mRNA de HSD17B13 no dia 15 após uma única administração subcutânea.
Exemplo 4. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em ratos.
[0226] Para avaliar a atividade in vivo de certos agentes de RNAi de HSD17B13 adicionais, foram usados ratos Sprague Dawley. No dia 1, cada rato recebeu uma única injeção subcutânea de 500 μl/200 g de peso animal, contendo 3,0 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com os grupos de dosagem mencionados na Tabela 11.
Tabela 11. Grupos de dosagem do Exemplo 4 Grupo Agente de RNAi e Regime de dosagem dose 1 Solução salina Injeção única no dia 1 (sem agente de RNAi) 2 3,0 mg/kg AD06085 Injeção única no dia 1 3 3,0 mg/kg AD06184 Injeção única no dia 1 4 3,0 mg/kg AD06185 Injeção única no dia 1 5 3,0 mg/kg AD06186 Injeção única no dia 1 6 3,0 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1 7 3,0 mg/kg AD06188 Injeção única no dia 1 8 3,0 mg/kg AD06189 Injeção única no dia 1 9 3,0 mg/kg AD06190 Injeção única no dia 1 10 3,0 mg/kg AD06082 Injeção única no dia 1 11 3,0 mg/kg AD06191 Injeção única no dia 1
[0227] Cada um dos agentes de RNAi incluiu uma sequência modificada e um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentado conjugado à extremidade terminal 5’ da fita sense. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para sequências modificadas e estruturas de ligante de direcionamento). Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 AD06085, AD06184, AD06185, AD06186, AD06187, AD06188,
AD06189 e AD06190 (Grupos 2 a 9) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 499 do gene; e os agentes de RNAi de HSD17B13 AD06082 e AD06191 incluíam sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 492 do gene. (Consulte, por exemplo SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0228] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) ratos em cada grupo (n=4). Todos os ratos foram sacrificados no dia 15. Os fígados foram colhidos e amostras de aproximadamente 100 mg de fígado foram coletadas e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido para isolamento de RNA. A expressão relativa de cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 foi determinada por qRT-PCR normalizando os níveis de expressão de mRNA de HSD17B13 dos animais de cada Grupo de tratamento respectivo para os animais do Grupo 1 (controle de veículo, sem agente de RNAi) (análise ΔΔCT), cujos resultados são apresentados na Tabela 12 abaixo: Tabela 12. Nível de mRNA de HSD17B13 relativo no dia 15, normalizado para controle do Exemplo 4 Dia 15
Identificação de Relativo Baix Alta grupo mRNA de o variância
HSD17B13 Vari (Err ância o)
(Err o)
Grupo 1 (veículo 1,000 0,151 0,178 salino)
Grupo 2 (3,0 mg/kg 0,211 0,080 0,128
AD06085)
Grupo 3 (3,0 mg/kg 0,153 0,029 0,035
AD06184)
Grupo 4 (3,0 mg/kg 0,113 0,025 0,032
AD06185)
Grupo 5 (3,0 mg/kg 0,133 0,041 0,059
AD06186)
Grupo 6 (3,0 mg/kg 0,099 0,014 0,016
AD06187)
Grupo 7 (3,0 mg/kg 0,682 0,090 0,104
AD06188)
Grupo 8 (3,0 mg/kg 0,142 0,027 0,033
AD06189)
Grupo 9 (3,0 mg/kg 0,477 0,060 0,068
AD06190) Grupo 10 (3,0 0,526 0,053 0,059 mg/kg AD06082) Grupo 11 (3,0 0,774 0,089 0,101 mg/kg AD06191)
[0229] Conforme mostrado na Tabela 12 acima, cada um dos agentes de RNAi nos Grupos 2 a 11 mostrou uma redução dos níveis de mRNA de HSD17B13 em comparação ao controle no dia 15. Mais especificamente, no dia 15, o agente de RNAi de HSD17B13 AD06187 mostrou uma redução de aproximadamente 90% (0,099) do mRNA de HSD17B13 após uma única administração subcutânea e o agente de RNAi de HSD17B13 AD06085 mostrou uma redução de aproximadamente 79% (0,211) do mRNA de HSD17B13.
Exemplo 5. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em macacos Cynomolgus.
[0230] O agente de RNAi de HSD17B13 AD06078 foi avaliado em macacos Cynomolgus. No dia 1 e no dia 22, dois macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) primatas (também aqui referidos como "cynos") receberam uma injeção subcutânea de 0,4 mL/kg (volume de aproximadamente 3 mL, dependendo da massa animal) contendo 4,0 mg/kg de agente de RNAi de HSD17B13 AD06078, formulado em solução salina. O agente de RNAi de HSD17B13 AD06078 incluiu nucleotídeos modificados e um ligante de direcionamento contendo N- acetil-galactosamina tridentado ((NAG37)s) conjugado à extremidade terminal 5’ da fita sense, como mostrado nas Tabelas 3 a 6. O agente de RNAi de HSD17B13 AD06078 incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 1501 do gene.
(Consulte, por exemplo SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0231] Foram feitas biópsias do fígado nos dias -8 (pré-dose), 15, 29 e 43. Na data de cada coleta de biópsia, os cynos foram anestesiados e foram realizadas biópsias hepáticas guiadas por ultrassom para extrair duas ou três amostras de tecido hepático com aproximadamente 1 mm x 2 mm de tamanho. As amostras de biópsia foram então homogeneizadas e os níveis de mRNA de HSD17B13 nos fígados dos cynos foram medidos por RT-qPCR. Os valores resultantes foram então normalizados para as medições de mRNA de HSD17B13 pré-dose (neste caso, no dia -8). Os dados de mRNA resultantes são refletidos nas seguintes Tabelas 13 e 14: Tabela 13. Níveis de mRNA de HSD17B13 normalizados para pré-dose a partir do Exemplo 5 do Cyno No. 1 (cy0595) Dia 15 Dia 43 Expressã E E Expressã E E o de mRNA de rro rro o de mRNA de rro rro HSD17B13 baixo alto HSD17B13 baixo alto relativa relativa 0,570 0,035 0,037 0,576 0,050 0,055 ** As amostras de biópsia do dia 29 para o cyno No. 1 eram menores do que o normal e, com base em uma aparência excessivamente pálida, suspeitou-se que eram tecido adiposo e não tecido hepático. Portanto, a análise do dia 29 foi descartada.
Tabela 14. Níveis de mRNA de HSD17B13 normalizados para pré-dose a partir do Exemplo 5 do Cyno No. 2 (cy0471) Dia 15 Dia 29 Expressã Erro Erro Expressã Erro Erro o de mRNA de baixo alto o de mRNA de baixo alto HSD17B13 HSD17B13 relativa relativa 0,416 0,010 0,010 0,383 0,015 0,015 Dia 43 Expressã Erro Erro o de mRNA de baixo alto HSD17B13 relativa 0,335 0,019 0,020
[0232] Ambos os cynos que receberam as doses de AD06078 mostraram uma redução do mRNA de HSD17B13 específico do fígado em comparação às medições pré- tratamento até o dia 43. No dia 43, por exemplo, o segundo cyno teve uma redução de mRNA de HSD17B13 de aproximadamente 67% (0,335) em comparação com os níveis pré-dose.
Exemplo 6. Modelo de camundongo HSD17B13-SEAP.
[0233] Para avaliar certos agentes de RNAi de HSD17B13 adicionais, foi utilizado um modelo de camundongo HSD17B13- SEAP. Camundongos albinos C57BL/6 fêmeas de seis a oito semanas de idade foram transitoriamente transfectados in vivo com plasmídeo por injeção hidrodinâmica na veia da cauda,administrada pelo menos 29 dias antes da administração de um agente de RNAi de HSD17B13 ou controle.
O plasmídeo contém a sequência de cDNA de HSD17B13 (GenBank NM_178135.4 (SEQ ID NO: 1)) inserida na 3’ UTR do gene repórter SEAP (fosfatase alcalina da placenta humana secretada). Foram injetados 50 µg do plasmídeo contendo a sequência de cDNA de HSD17B13 em solução de Ringer em um volume total de 10% do peso corporal do animal nos camundongos através da veia da cauda para criar camundongos do modelo HSD17B13-SEAP. A solução foi injetada através de uma agulha de calibre 27 em 5 a 7 segundos, conforme descrito anteriormente (Zhang G et al., “High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA.” Human Gene Therapy 1999 Vol. 10, p1735-1737.). A inibição da expressão de HSD17B13 por um agente de RNAi de HSD17B13 resulta na inibição concomitante da expressão de SEAP, que é medida. Antes da administração de um tratamento (entre o dia -7 e o dia 1 pré-dose), os níveis de expressão de SEAP no soro foram medidos pelo Sistema de Ensaio de Gene Repórter Phospha- Light™ SEAP (Invitrogen), e os camundongos foram agrupados de acordo com a média de níveis de SEAP.
[0234] Os camundongos foram anestesiados com isoflurano 2 a 3% e foram coletadas amostras de sangue da área submandibular em tubos de separação de soro (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemanha). O sangue coagulou à temperatura ambiente durante 20 min. Os tubos foram centrifugados a 8.000× g por 3 min. para separar o soro e armazenados a 4 °C. O soro foi coletado e medido pelo Sistema de Ensaio de Gene Repórter Phospha-Light ™ SEAP (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis séricos de SEAP para cada animal podem ser normalizados para o grupo de controle de camundongos injetados com veículo de controle, a fim de contabilizar o declínio não relacionado ao tratamento da expressão de HSD17B13 com este modelo. Para fazer isso, primeiro, o nível de SEAP para cada animal em um ponto de tempo foi dividido pelo nível de expressão pré-tratamento naquele animal (Dia -1) a fim de determinar a razão de expressão “normalizada para pré-tratamento”. A expressão em um ponto de tempo específico foi então normalizada para o grupo de controle dividindo a proporção "normalizada para pré- tratamento" para um animal individual pela proporção média
"normalizada para pré-tratamento" de todos os camundongos no grupo de controle de veículo normal. Alternativamente, os níveis séricos de SEAP para cada animal foram avaliados pela normalização para níveis pré-tratamento somente.
Exemplo 7. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em camundongos HSD17B13-SEAP.
[0235] Foi usado o modelo de camundongo HSD17B13-SEAP descrito no Exemplo 6 acima. No dia 1, cada camundongo recebeu uma única administração subcutânea de 200 μl/20 g de peso animal, contendo 3,0 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com a Tabela 15 abaixo.
Tabela 15. Grupos de dosagem do Exemplo 7 Grupo Agente de RNAi e Regime de dosagem dose 1 Solução salina Injeção única no dia 1 (sem agente de RNAi) 2 3,0 mg/kg AD06078 Injeção única no dia 1 3 3,0 mg/kg AD06081 Injeção única no dia 1 4 3,0 mg/kg AD06084 Injeção única no dia 1 5 3,0 mg/kg AD06085 Injeção única no dia 1
[0236] Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ da fita sense a um ligante de direcionamento que incluiu três grupos N-acetil- galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modificadas conforme estabelecido nas estruturas duplex neste documento. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para modificações específicas e informações da estrutura relacionadas aos agentes de RNAi de HSD17B13). O agente de RNAi de HSD17B13 AD06078 (Grupo 2) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 1501 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06081 (Grupo 3) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 488 do gene; e os agentes de RNAi de HSD17B13 AD06084 e AD06085 incluíram sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 499 do gene. (Consulte SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0237] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) camundongos em cada grupo (n=4). O soro foi coletado no dia -2 (pré-tratamento), dia 8, dia 15, dia 22 e dia 29, e os níveis de expressão de SEAP foram determinados de acordo com o procedimento estabelecido no Exemplo 6, acima. Os dados do experimento são mostrados nas seguintes Tabelas 16 e 17:
Tabela 16. SEAP médio normalizado para pré-tratamento
(dia -2) em camundongos HSD17B13-SEAP do Exemplo 7
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29
Identi S D S D S D S D ficação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/-
) ) ) )
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
1 (veículo ,852 ,189 ,524 ,220 ,481 ,168 ,440 ,118 salino)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
2 (3,0 ,516 ,133 ,264 ,119 ,316 ,198 ,223 ,097 mg/kg
AD06078)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
3 (3,0 ,629 ,098 ,389 ,110 ,487 ,163 ,381 ,075 mg/kg
AD06081)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
4 (3,0 ,213 ,139 ,082 ,017 ,122 ,030 ,129 ,031 mg/kg
AD06084)
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Identi S D S D S D S D ficação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/- ) ) ) ) Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0 5 (3,0 ,168 ,022 ,053 ,013 ,083 ,022 ,083 ,016 mg/kg AD06085) * Como observado no Exemplo 6 acima, a redução gradual de SEAP no grupo de controle de veículo (Grupo 1) ao longo do tempo é devido à perda do gene repórter SEAP nas células dos camundongos devido à replicação celular natural nos animais, e não é o resultado de qualquer composto inibidor.
Tabela 17. SEAP médio normalizado para pré-tratamento (dia -2) e controle de veículo em camundongos HSD17B13-SEAP do Exemplo 7 Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Identific S D S D S D S D ação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/- ) ) ) )
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29
Identific S D S D S D S D ação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/-
) ) ) )
Grupo 1 1 0 1 0 1 0
(veículo ,000 ,221 ,000 ,419 ,000 ,349 1 0 salino) ,000 ,267
Grupo 2 0 0 0 0 0 0
(3,0 mg/kg ,606 ,156 ,504 ,228 ,657 ,412 0 0 AD06078) ,507 ,221
Grupo 3 0 0 0 0 1 0
(3,0 mg/kg ,738 ,115 ,741 ,210 ,012 ,340 0 0 AD06081) ,865 ,169
Grupo 4 0 0 0 0 0 0
(3,0 mg/kg ,250 ,163 ,156 ,033 ,254 ,063 0 0 AD06084) ,293 ,070
Grupo 5 0 0 0 0 0 0
(3,0 mg/kg ,197 ,025 ,101 ,025 ,173 ,047 0 0 AD06085) ,189 ,037
[0238] Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, Grupos 2 a 5) mostrou redução de SEAP em comparação com o controle de veículo (Grupo 1) nos dias 8 e 15. Além disso, os agentes de RNAi de HSD17B13 AD06084 e AD06085, que incluíam ambas as sequências de nucleotídeos projetadas para inibir a expressão na posição 499 do gene HSD17B13, mostraram níveis particularmente elevados de atenuação durante as medições do dia 22. (Compare os Grupos 4 e 5 ao Grupo 1).
Exemplo 8. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em macacos Cynomolgus.
[0239] Os agentes de RNAi de HSD17B13 AD06078, AD06187, AD06278 e AD06280 foram avaliados em macacos Cynomolgus. No dia 1 e no dia 30, três cynos para cada grupo (n=3) receberam uma injeção subcutânea de 0,3 mL/kg (volume de aproximadamente 3 mL, dependendo da massa animal) contendo 3,0 mg/kg do respectivo agente de RNAi de HSD17B13, formulado em solução salina. Os agentes de RNAi de HSD17B13 incluíam nucleotídeos modificados e um ligante de direcionamento contendo N-acetil-galactosamina tridentado ((NAG37)s) conjugado à extremidade terminal 5’ da fita sense, como mostrado nas Tabelas 3 a 6. O agente de RNAi de HSD17B13 AD06078 (Grupo 1) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 1501 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06187 (Grupo 2) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 499 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06278 (Grupo 3) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 513 do gene; e o agente de RNAi de HSD17B13 AD06280 (Grupo 4) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 791 do gene. (Consulte, por exemplo SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0240] Foram feitas biópsias do fígado nos dias -7 (pré-dose), 15, 29 e 43. Na data de cada coleta de biópsia, os cynos foram anestesiados e foi utilizada laparoscopia para extrair duas ou três amostras de tecido hepático com aproximadamente 80 mg a 120 mg cada. As amostras de biópsia foram então homogeneizadas e os níveis de mRNA de HSD17B13 nos fígados dos cynos foram medidos por RT-qPCR. Os valores resultantes foram então normalizados para as medições de mRNA de HSD17B13 pré-dose (neste caso, no dia -7). Os dados de mRNA resultantes são refletidos na Tabela 18 abaixo: Tabela 18. Níveis de mRNA de HSD17B13 normalizados para pré-dose (dia -7) a partir do Exemplo 8 para cada grupo (n=3) Dia 15 Dia 29 Expr E E Expr E E essão de rro rro essão de rro rro mRNA de baixo alto mRNA de baixo alto
HSD17B13 HSD17B13 relativa relativa
Grupo 1,33 0 0 1,35 0 0
1: AD06078 9 ,368 ,507 5 ,364 ,498
Grupo 0,80 0 0 0,54 0 0
2: AD06187 6 ,233 ,328 0 ,217 ,362
Grupo 1,13 0 0 0,80 0 0
3: AD06278 7 ,193 ,233 2 ,120 ,141
Grupo 0,34 0 0 0,23 0 0
4: AD06280 3 ,098 ,137 5 ,077 ,115
Dia 43
Expr E E essão de rro rro mRNA de baixo alto
HSD17B13 relativa
Grupo 0,50 0 0
1: AD06078 6 ,078 ,092
Grupo 0,39 0 0
2: AD06187 6 ,069 ,083
Grupo 1,09 0 0
3: AD06278 1 ,074 ,079
Grupo 0,26 0 0
4: AD06280 5 ,111 ,191 Exemplo 9. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em camundongos HSD17B13-SEAP.
[0241] Foi usado o modelo de camundongo HSD17B13-SEAP descrito no Exemplo 6 acima. No dia 1, cada camundongo recebeu uma única administração subcutânea de 200 μl/20 g de peso animal, contendo 3,0 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com a Tabela 19 abaixo: Tabela 19. Grupos de dosagem do Exemplo 9 G Agente de RNAi e Regime de dosagem rupo dose 1 Solução salina Injeção única no dia 1 (sem agente de RNAi) 2 3,0 mg/kg AD06210 Injeção única no dia 1 3 3,0 mg/kg AD06211 Injeção única no dia 1 4 3,0 mg/kg AD06212 Injeção única no dia 1 5 3,0 mg/kg AD06213 Injeção única no dia 1 6 3,0 mg/kg AD06214 Injeção única no dia 1 7 3,0 mg/kg AD06217 Injeção única no dia 1 8 3,0 mg/kg AD06218 Injeção única no dia 1
[0242] Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ da fita sense a um ligante de direcionamento que incluiu três grupos N-acetil-
galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modificadas conforme estabelecido nas estruturas duplex neste documento. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para modificações específicas e informações da estrutura relacionadas aos agentes de RNAi de HSD17B13). O agente de
RNAi de HSD17B13 AD06210 (Grupo 2) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 513 do gene; o agente de
RNAi de HSD17B13 AD06211 (Grupo 3) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 645 do gene; o agente de
RNAi de HSD17B13 AD06212 (Grupo 4) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 649 do gene; e o agente de
RNAi de HSD17B13 AD06213 (Grupo 5) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 759 do gene; o agente de
RNAi de HSD17B13 AD06214 (Grupo 6) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 791 do gene; o agente de
RNAi de HSD17B13 AD06217 (Grupo 7) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 1505 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06218 (Grupo 8) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 2185 do gene. (Consulte SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0243] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) camundongos em cada grupo (n=4). O soro foi coletado no dia -1 (pré-tratamento), dia 8, dia 15 e dia 22, e os níveis de expressão de SEAP foram determinados de acordo com o procedimento estabelecido no Exemplo 6 acima. Os dados do experimento são mostrados na Tabela 20 abaixo: Tabela 20. SEAP médio normalizado para pré-tratamento (dia -1) em camundongos HSD17B13-SEAP do Exemplo 9 Dia 8 Dia 15 Dia 22 Identificação S D S D S D de grupo EAP esv EAP esv EAP esv médio pd médio pd médio pd (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 0 0 0 0 0 0 (veículo salino) ,965 ,263 ,586 ,283 ,506 ,249 Grupo 2 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06210) ,409 ,132 ,157 ,068 ,210 ,086
Dia 8 Dia 15 Dia 22
Identificação S D S D S D de grupo EAP esv EAP esv EAP esv médio pd médio pd médio pd
(+/-) (+/-) (+/-)
Grupo 3 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06211) ,983 ,638 ,340 ,223 ,397 ,266
Grupo 4 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06212) ,505 ,228 ,241 ,105 ,264 ,100
Grupo 5 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06213) ,533 ,125 ,167 ,070 ,230 ,145
Grupo 6 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06214) ,468 ,063 ,151 ,028 ,171 ,022
Grupo 7 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06217) ,678 ,221 ,325 ,150 ,345 ,186
Grupo 8 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06218) ,903 ,230 ,451 ,143 ,440 ,206
* Como observado no Exemplo 6 acima, a redução gradual de SEAP no grupo de controle de veículo (Grupo 1) ao longo do tempo é devido à perda do gene repórter SEAP nas células dos camundongos devido à replicação celular natural nos animais, e não é o resultado de qualquer composto inibidor.
[0244] Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, Grupos 2 a 8) mostrou redução de SEAP em comparação com o controle de veículo (Grupo 1) nos dias 15 e 22. Além disso, o agente de RNAi de HSD17B13 AD06210 (Grupo 2), que incluiu as sequências de nucleotídeos projetadas para inibir a expressão na posição 513 do gene HSD17B13, e AD06214 (Grupo 6), que incluiu as sequências de nucleotídeos projetadas para inibir a expressão na posição 791 do gene HSD17B13, mostraram níveis particularmente elevados de atenuação comparados aos outros agentes de RNAi testados. Por exemplo, no dia 15, AD06210 (Grupo 2) mostrou uma redução de aproximadamente 84% (0,157), enquanto AD06214 (Grupo 6) mostrou uma redução de aproximadamente 85% (0,151). (Compare, por exemplo, com AD06218 (Grupo 8), que mostrou níveis de atenuação que eram apenas ligeiramente maiores do que o grupo de controle (Grupo 1)). O agente de RNAi de HSD17B13 AD06214 (Grupo 6) também mostrou uma atenuação de aproximadamente 83% (0,171) no dia 22.
Exemplo 10. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em camundongos HSD17B13-SEAP.
[0245] Foi usado o modelo de camundongo HSD17B13-SEAP descrito no Exemplo 6 acima. No dia 1, cada camundongo recebeu uma única administração subcutânea de 200 μl/20 g de peso animal, contendo 3,0 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com a Tabela 21 abaixo.
Tabela 21. Grupos de dosagem do Exemplo 10 Grupo Agente de RNAi e Regime de dosagem dose 1 Solução salina Injeção única no dia 1 (sem agente de RNAi) 2 3,0 mg/kg AD06185 Injeção única no dia 1 3 3,0 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1 4 3,0 mg/kg AD06210 Injeção única no dia 1 5 3,0 mg/kg AD06213 Injeção única no dia 1 6 3,0 mg/kg AD06214 Injeção única no dia 1
[0246] Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 incluiu nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ da fita sense a um ligante de direcionamento que incluiu três grupos N-acetil- galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modificadas conforme estabelecido nas estruturas duplex neste documento. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para modificações específicas e informações da estrutura relacionadas aos agentes de RNAi de HSD17B13). Os agentes de RNAi de HSD17B13 AD06185 (Grupo 2) e AD06187 (Grupo 3) incluíam sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 499 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06210 (Grupo 4) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 513 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06213 (Grupo 5) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 759 do gene; e o agente de RNAi de HSD17B13 AD06214 (Grupo 6) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 791 do gene. (Consulte SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0247] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) camundongos em cada grupo (n=4). O soro foi coletado no dia -1 (pré-tratamento), dia 8, dia 15 e dia 22, e os níveis de expressão de SEAP foram determinados de acordo com o procedimento estabelecido no Exemplo 6 acima. Os dados do experimento são mostrados na Tabela 22 abaixo:
Tabela 22. SEAP médio normalizado para pré-tratamento (dia
-1) em camundongos HSD17B13-SEAP do Exemplo 10
Dia 8 Dia 15 Dia 22
Identificação S D S D S D de grupo EAP esv EAP esv EAP esv médio pd médio pd médio pd
(+/-) (+/-) (+/-)
Grupo 1 0 0 0 0 0 0
(veículo salino) ,735 ,042 ,751 ,063 ,651 ,200
Grupo 2 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06185) ,233 ,045 ,136 ,061 ,111 ,054
Grupo 3 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06187) ,191 ,028 ,097 ,067 ,080 ,039
Grupo 4 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06210) ,256 ,038 ,201 ,062 ,195 ,079
Grupo 5 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06213) ,315 ,054 ,235 ,045 ,163 ,015
Grupo 6 (3,0 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06214) ,417 ,099 ,344 ,050 ,304 ,100
* Como observado no Exemplo 6 acima, a redução gradual de SEAP no grupo de controle de veículo (Grupo 1) ao longo do tempo é devido à perda do gene repórter SEAP nas células dos camundongos devido à replicação celular natural nos animais, e não é o resultado de qualquer composto inibidor.
[0248] Cada um dos agentes de RNAi de HSD17B13 em cada um dos grupos de dosagem (isto é, Grupos 2 a 6) mostrou redução de SEAP em comparação com o controle de veículo (Grupo 1) em todos os pontos no tempo medidos.
Exemplo 11. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em camundongos HSD17B13-SEAP.
[0249] Foi usado o modelo de camundongo HSD17B13-SEAP descrito no Exemplo 6 acima. No dia 1, cada camundongo recebeu uma única administração subcutânea de 200 μl/20 g de peso animal, contendo uma dose de mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com a Tabela 23 abaixo.
Tabela 23. Grupos de dosagem do Exemplo 11 G Agente de RNAi e dose Regime de dosagem rupo 1 Solução salina (sem Injeção única no dia 1 agente de RNAi) 2 0,625 mg/kg AD06280 Injeção única no dia 1 3 1,25 mg/kg AD06280 Injeção única no dia 1 4 2,5 mg/kg AD06280 Injeção única no dia 1 5 5,0 mg/kg AD06280 Injeção única no dia 1
6 0,625 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1 7 1,25 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1 8 2,5 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1 9 5,0 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1
[0250] Ambos os agentes de RNAi de HSD17B13 incluíam nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ da fita sense a um ligante de direcionamento que incluiu três grupos N-acetil- galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modificadas conforme estabelecido nas estruturas duplex neste documento. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para modificações específicas e informações da estrutura relacionadas aos agentes de RNAi de HSD17B13).
[0251] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) camundongos em cada grupo (n=4), exceto no grupo de controle de veículo que tinha apenas 2 (dois) camundongos.
O soro foi coletado no dia -1 (pré-tratamento), dia 8, dia 15, dia 22 e dia 29, e os níveis de expressão de SEAP foram determinados de acordo com o procedimento estabelecido no Exemplo 6, acima. Os dados do experimento são mostrados na Tabela 24 abaixo:
Tabela 24. SEAP médio normalizado para pré-tratamento (dia
-1) e controle em camundongos HSD17B13-SEAP do Exemplo 11
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29
Identi S D S D S D S D ficação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/-
) ) ) )
Grupo 1 0 1 0 1 0 1 0
1 (veículo ,000 ,079 ,000 ,231 ,000 ,284 ,000 ,105 salino)
Grupo 1 0 0 0 0 0 0 0
2 (0,625 ,000 ,186 ,827 ,177 ,767 ,338 ,741 ,271 mg/kg
AD06280)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
3 (1,25 ,889 ,161 ,585 ,102 ,477 ,128 ,406 ,099 mg/kg
AD06280)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
4 (2,5 ,813 ,103 ,579 ,151 ,558 ,283 ,517 ,277 mg/kg
AD06280)
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29
Identi S D S D S D S D ficação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/-
) ) ) )
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
5 (5,0 ,214 ,098 ,109 ,047 ,080 ,024 ,081 ,028 mg/kg
AD06280)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
6 (0,625 ,605 ,132 ,525 ,187 ,520 ,209 ,522 ,182 mg/kg
AD06187)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
7 (1,25 ,656 ,152 ,514 ,176 ,569 ,130 ,600 ,109 mg/kg
AD06187)
Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0
8 (2,5 ,480 ,124 ,223 ,114 ,203 ,123 ,177 ,107 mg/kg
AD06187)
Dia 8 Dia 15 Dia 22 Dia 29 Identi S D S D S D S D ficação de EAP esv EAP esv EAP esv EAP esv grupo médi pd médi pd médi pd médi pd o (+/- o (+/- o (+/- o (+/- ) ) ) ) Grupo 0 0 0 0 0 0 0 0 9 (5,0 ,203 ,056 ,050 ,015 ,045 ,008 ,054 ,014 mg/kg AD06187)
[0252] Ambos os agentes de RNAi de HSD17B13 testados (isto é, AD06280 e AD06187) mostraram redução de SEAP em comparação com o controle de veículo (Grupo 1).
Exemplo 12. Testes in vivo de agentes de RNAi de HSD17B13 em camundongos HSD17B13-SEAP.
[0253] Foi usado o modelo de camundongo HSD17B13-SEAP descrito no Exemplo 6 acima. No dia 1, cada camundongo recebeu uma única administração subcutânea de 200 μl/20 g de peso animal, contendo uma dose de 3 mg/kg (mpk) de um agente de RNAi de HSD17B13 formulado em um tampão salino farmaceuticamente aceitável ou controle de veículo (tampão salino sem agente de RNAi), de acordo com a Tabela 25 abaixo.
Tabela 25. Grupos de dosagem do Exemplo 12
Grupo Agente de RNAi e dose Regime de dosagem 1 Solução salina (sem Injeção única no dia 1 agente de RNAi) 2 3 mg/kg AD06187 Injeção única no dia 1 3 3 mg/kg AD06208 Injeção única no dia 1 4 3 mg/kg AD06209 Injeção única no dia 1 5 3 mg/kg AD06215 Injeção única no dia 1 6 3 mg/kg AD06216 Injeção única no dia 1 7 3 mg/kg AD06219 Injeção única no dia 1
[0254] Todos os agentes de RNAi de HSD17B13 incluíam nucleotídeos modificados que foram conjugados na extremidade terminal 5’ da fita sense a um ligante de direcionamento que incluiu três grupos N-acetil- galactosamina (ligante tridentado) tendo as sequências modificadas conforme estabelecido nas estruturas duplex neste documento. (Consulte as Tabelas 3 a 6 para modificações específicas e informações da estrutura relacionadas aos agentes de RNAi de HSD17B13). Os agentes de RNAi de HSD17B13 AD06187 (Grupo 2) incluíam sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 499 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06208 (Grupo 3) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 92 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06209 (Grupo 4) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 417 do gene; e o agente de RNAi de HSD17B13 AD06215 (Grupo 5) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 1418 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06216 (Grupo 6) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 1502 do gene; o agente de RNAi de HSD17B13 AD06219 (Grupo 7) incluiu sequências de nucleotídeos que foram projetadas para inibir a expressão de um gene HSD17B13 na posição 2195 do gene.
(Consulte SEQ ID NO:1 e a Tabela 2 para o gene HSD17B13 referido).
[0255] As injeções foram realizadas entre a pele e o músculo (ou seja, injeções subcutâneas) na pele solta sobre o pescoço e na área do ombro. Foram testados 4 (quatro) camundongos em cada grupo (n=4). O soro foi coletado no dia -1 (pré-tratamento), dia 8, dia 15 e dia 22, e os níveis de expressão de SEAP foram determinados de acordo com o procedimento estabelecido no Exemplo 6 acima. Os dados do experimento são mostrados na Tabela 26 abaixo:
Tabela 26. SEAP médio normalizado para pré-tratamento (dia -1) e controle em camundongos HSD17B13-SEAP do Exemplo 12 Dia 8 Dia 15 Dia 22 Identificação S D S D S D de grupo EAP esv EAP esv EAP esv médio pd médio pd médio pd (+/-) (+/-) (+/-) Grupo 1 1 0 1 0 1 0 (veículo salino) ,000 ,29 ,000 ,112 ,000 ,207 Grupo 2 (3 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06187) ,288 ,156 ,205 ,131 ,186 ,151 Grupo 3 (3 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06208) ,393 ,048 ,323 ,088 ,268 ,054 Grupo 4 (3 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06209) ,614 ,106 ,481 ,146 ,315 ,06 Grupo 5 (3 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06215) ,790 ,355 ,662 ,281 ,578 ,202 Grupo 6 (3 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06216) ,962 ,556 ,867 ,681 ,612 ,404 Grupo 7 (3 0 0 0 0 0 0 mg/kg AD06219) ,878 ,425 ,848 ,479 ,688 ,352
OUTRAS MODALIDADES
[0256] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada desta,
a descrição anterior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas.
Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (58)

REIVINDICAÇÕES:
1. Agente de RNAi para inibir a expressão de um gene HSD17B13, caracterizado por compreender: uma fita antisense que compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos que diferem em 0 ou 1 nucleotídeos de qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 2 ou Tabela 3; e uma fita sense que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar ao da fita antisense.
2. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fita antisense compreender 2 a 18 nucleotídeos de qualquer uma das sequências fornecidas na Tabela 2 ou Tabela 3.
3. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela fita sense compreender uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos contíguos diferindo em 0 ou 1 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de fita sense fornecidas na Tabela 2 ou Tabela 4, e caracterizado pela fita sense ter uma região de pelo menos 85% de complementaridade nos 17 nucleotídeos contíguos à fita antisense.
4. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por pelo menos um nucleotídeo do agente de RNAi ser um nucleotídeo modificado ou incluir uma ligação internucleosídica modificada.
5. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por todos ou substancialmente todos os nucleotídeos da fita sense e/ou antisense do agente de RNAi serem nucleotídeos modificados.
6. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pelo nucleotídeo modificado ser selecionado a partir do grupo que consiste em: 2′-O-metil nucleotídeo, 2′- fluoro nucleotídeo, 2′-desoxi nucleotídeo, 2′, 3′-seco nucleotídeo mimetizador, nucleotídeo bloqueado, 2'-F- arabino nucleotídeo, 2′-metoxietil nucleotídeo, nucleotídeo abásico, ribitol, nucleotídeo invertido, nucleotídeo 2'-O-metil invertido, nucleotídeo 2'-desoxi invertido, nucleotídeo modificado 2'-amino, nucleotídeo modificado 2'-alquil, nucleotídeo morfolino, desoxirribonucleotídeo vinil fosfonato, desoxirribonucleotídeo ciclopropil fosfonato, e 3′-O- metil nucleotídeo.
7. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por todos ou substancialmente todos os nucleotídeos modificados serem 2’-O-metil nucleotídeos, 2’-fluoro nucleotídeos ou suas combinações.
8. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela fita antisense compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências da fita antisense modificadas fornecidas na Tabela 3.
9. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela fita sense compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências de fita sense modificadas fornecidas na Tabela 4.
10. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fita antisense compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências modificadas fornecidas na Tabela 3, e a fita sense compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das sequências modificadas fornecidas na Tabela 4.
11. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo agente de RNAi ser ligado a um ligante de direcionamento.
12. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo ligante de direcionamento compreender n-acetil-galactosamina.
13. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, caracterizado pelo ligante de direcionamento compreender uma estrutura selecionada a partir do grupo que consiste em: (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s.
14. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo ligante de direcionamento compreender a estrutura de (NAG37) ou (NAG37)s.
15. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo ligante de direcionamento ser ligado à fita sense.
16. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo ligante de direcionamento ser ligado à extremidade terminal 5’ da fita sense.
17. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pela fita sense ter entre 18 e 30 nucleotídeos de comprimento, e a fita antisense ter entre 18 e 30 nucleotídeos de comprimento.
18. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela fita sense e pela fita antisense terem cada uma entre 18 e 27 nucleotídeos de comprimento.
19. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela fita sense e pela fita antisense terem cada uma entre 18 e 24 nucleotídeos de comprimento.
20. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pela fita sense e pela fita antisense terem cada uma 21 nucleotídeos de comprimento.
21. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo agente de RNAi ter duas extremidades cegas.
22. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pela fita sense compreender uma ou duas tampas terminais.
23. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pela fita sense compreender um ou dois resíduos abásicos invertidos.
24. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agente de RNAi compreender uma fita sense e uma fita antisense que formam um duplex que tem a estrutura de qualquer um dos duplexes na Tabela 5.
25. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma fita antisense que consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeos de uma das seguintes sequências de nucleotídeos (5′  3′): UCAUCUAUCAGACUUCUUACG (SEQ ID NO:3); ou UGAUCCAAAAAUGUCCUAGGC (SEQ ID NO:6).
26. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela fita sense consistir em, consistir essencialmente em ou compreender uma sequência de nucleotídeos que difere em 0 ou 1 nucleotídeo de uma das seguintes sequências de nucleotídeos (5′  3′): CGUAAGAAGUCUGAUAGAUGA (SEQ ID NO:8); ou GCCUAGGACAUUUUUGIAUCA (SEQ ID NO:11), caracterizado por I representar um nucleotídeo de inosina (hipoxantina).
27. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado por todos ou substancialmente todos os nucleotídeos serem nucleotídeos modificados.
28. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pela fita sense incluir adicionalmente resíduos abásicos invertidos na extremidade terminal 3’ da sequência de nucleotídeos, na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos ou em ambas.
29. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma fita antisense que compreende, consiste em ou consiste essencialmente em uma sequência de nucleotídeos modificados que difere em 0 ou 1 nucleotídeo de uma das seguintes sequências de nucleotídeos (5′  3′): usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:2); usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID N°:4); usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:5); usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID N°:7); caracterizado por a, c, g e u representarem 2'-O- metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representarem 2'- fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s representar uma ligação fosforotioato; e caracterizado por todos ou substancialmente todos os nucleotídeos na fita sense serem nucleotídeos modificados.
30. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fita sense compreender, consistir em ou consistir essencialmente em uma sequência de nucleotídeos modificados que difere em 0 ou 1 nucleotídeo de uma das seguintes sequências de nucleotídeos (5′  3′): cguaagaaGfUfCfugauagauga (SEQ ID NO:9); cguaagaaGfuCfuGfauagauga (SEQ ID NO:10); gccuaggaCfAfUfuuuugiauca (SEQ ID NO:12); ou gccuaggaCfaUfuUfuugiauca (SEQ ID NO:13); caracterizado por a, c, g, i e u representarem 2'- O-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf representam 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s representar uma ligação fosforotioato; e caracterizado por todos ou substancialmente todos os nucleotídeos no da fita antisense serem nucleotídeos modificados.
31. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 30, caracterizado pela fita sense incluir adicionalmente resíduos abásicos invertidos na extremidade terminal 3’ da sequência de nucleotídeos, na extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos ou em ambas.
32. Agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 31, caracterizado pela fita sense do agente de RNAi ser ligado a um ligante de direcionamento.
33. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo ligante de direcionamento ter afinidade para o receptor de asialoglicoproteína.
34. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo ligante de direcionamento compreender N-acetil-galactosamina.
35. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agente de RNAi ter a estrutura duplex selecionada a partir do grupo que consiste em: AD06214 (SEQ ID NOs: 2 e 16); AD06280 (SEQ ID NOs: 4 e 15); AD06187 (SEQ ID NOs: 5 e 16); AD06276 (SEQ ID NOs: 5 e 17); AD06277 (SEQ ID NOs: 7 e 17).
36. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo agente de RNAi ter a estrutura duplex selecionada a partir do grupo que consiste em: AD06214 (SEQ ID NOs: 2 e 16) e AD06280 (SEQ ID NOs: 4 e 15).
37. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante de direcionamento compreender:
, ou .
38. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fita antisense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) usCfsasUfcUfaUfcAfgAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID
NO:2), e a fita sense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) (NAG37)s(invAb)scguaagaaGfUfCfugauagaugas(invAb) (SEQ ID NO:14); caracterizado por a, c, g e u serem 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf serem 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s ser uma ligação fosforotioato; (invAb) ser um resíduo de desoxirribose abásica invertida; e (NAG37)s ter a seguinte estrutura química: .
39. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fita antisense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) usCfsasUfcUfaucagAfcUfuCfuUfaCfsg (SEQ ID
NO:4), e caracterizado pela fita sense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) (NAG37)s(invAb)scguaagaaGfuCfuGfauagaugas(invAb) (SEQ ID NO:15); caracterizado por a, c, g e u serem 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf serem 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s ser uma ligação fosforotioato; (invAb) ser um resíduo de desoxirribose abásica invertida; e (NAG37)s ter a seguinte estrutura química: .
40. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela fita antisense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID
NO:5) e caracterizado pela fita sense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) (NAG37)s(invAb)sgccuaggaCfAfUfuuuugiaucas(invAb) (SEQ ID NO:16); caracterizado por a, c, g, i e u serem 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf serem 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s ser uma ligação fosforotioato; (invAb) ser um resíduo de desoxirribose abásica invertida; e (NAG37)s ter a seguinte estrutura química: .
41. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela fita antisense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) usGfsasUfcCfaAfaAfaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID
NO:5), e caracterizado pela fita sense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) (NAG37)s(invAb)sgccuaggaCfaUfuUfuugiaucas(invAb) (SEQ ID NO:17); caracterizado por a, c, g, i e u serem 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf serem 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s ser uma ligação fosforotioato; (invAb) ser um resíduo de desoxirribose abásica invertida; e (NAG37)s ter a seguinte estrutura química: .
42. Agente de RNAi, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela fita antisense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) usGfsasUfcCfaaaaaUfgUfcCfuAfgGfsc (SEQ ID
NO:7) e caracterizado pela fita sense consistir na sequência de nucleotídeos modificados de (5′  3′) (NAG37)s(invAb)sgccuaggaCfaUfuUfuugiaucas(invAb) (SEQ ID NO:17); caracterizado por a, c, g, i e u serem 2'-O-metil adenosina, citidina, guanosina, inosina ou uridina, respectivamente; Af, Cf, Gf e Uf serem 2'-fluoro adenosina, citidina, guanosina ou uridina, respectivamente; s ser uma ligação fosforotioato; (invAb) ser um resíduo de desoxirribose abásica invertida; e (NAG37)s ter a seguinte estrutura química: .
43. Uma composição compreendendo o agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pela composição adicional compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável.
44. A composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada por compreender adicionalmente o agente de RNAi para inibir a expressão de HSD17B13.
45. A composição, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
46. Um método para inibição da expressão de um gene HSD17B13 em uma célula, caracterizado pelo método compreender a introdução em uma célula de uma quantidade eficaz de um agente de RNAi de qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou da composição de qualquer uma das reivindicações 43 a 45.
47. O método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pela célula estar dentro de um indivíduo.
48. O método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo indivíduo ser um indivíduo humano.
49. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pela expressão do gene HSD17B13 ser inibida em pelo menos cerca de 30%.
50. Um método para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado a HSD17B13, caracterizado pelo método compreender a administração a um indivíduo humano com necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de qualquer uma das reivindicações 43 a 45.
51. O método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pela doença ser DHGNA, NASH, fibrose hepática, doença hepática gordurosa alcoólica ou cirrose.
52. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizado pelo agente de RNAi ser administrado em uma dose de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo humano.
53. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 52, caracterizado pelo agente de RNAi ser administrado em duas ou mais doses.
54. Uso do agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45 caracterizado pelo tratamento de uma doença, distúrbio ou sintoma que é mediado pelo menos em parte pela expressão do gene HSD17B13.
55. Uso, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo sintoma ser cirrose hepática.
56. Uso do agente de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45 caracterizado pela preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença,
distúrbio ou sintoma que é mediado pelo menos em parte pela expressão do gene HSD17B13.
57. Uso da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pela doença ser DHGNA, NASH, fibrose hepática ou uma doença hepática alcoólica ou não alcoólica, como cirrose.
58. Uso da composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo agente de RNAi ser administrado em uma dose de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo humano.
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