BR112016014293B1

BR112016014293B1 - Região de fragmento cristalizável canino, anticorpo caninizado, e,composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112016014293B1
Application number: BR112016014293-4A
Authority: BR
Inventors: Mohamad Morsey; Yuanzheng Zhang; Ian Tarpey
Original assignee: Intervet International B.V
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2023-11-21
Also published as: JP2017501168A; WO2015091914A2; BR112016014277A2; JP2022180448A; CN113402609B; AU2014368449B2; RU2019111899A; AU2014368450A1; RU2761663C2; CN105829344A; US20190002562A1; CA3185195A1; EP4566623A2; US11248047B2; AU2020210142A1; US20200354450A1; EP3083693A2; CN106029697A; JP2020031653A; CA2932567C

Abstract

REGIÃO DE FRAGMENTO CRISTALIZÁVEL CANINO OU UM ANTICORPO CANINO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção descreve anticorpos caninizados com propriedades específicas. A presente invenção também descreve anticorpos de murino caninizados contra PD-1 canino que têm uma alta afinidade de ligação para PD-1 canino. A invenção descreve ainda o uso dos anticorpos caninizados da presente invenção no tratamento de câncer em cães.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Serial No. 62/030.812, depositado em 30 de julho de 2014, Pedido Provisório U.S. Serial No. 61/918.847, depositado em 20 de dezembro de 2013, e Pedido Provisório U.S. Serial No. 61/918.946, depositado em 20 de dezembro de 2014, os conteúdos de todos os quais são por meio deste incorporados por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a anticorpos caninizados com propriedades específicas. A presente invenção também refere-se a anticorpos caninizados contra PD-1 canino que têm sequências específicas e uma alta afinidade de ligação para PD-1 canino. A invenção refere-se ainda ao uso dos anticorpos da presente invenção no tratamento de cães, incluindo tratamento contra o câncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Os anticorpos caninos (também aludidos como imunoglobulina G ou IgG) são proteínas tetraméricas grandes de cerca de 150 Kd. Cada proteína de IgG é composta de duas cadeias leves idênticas de cerca de 25 Kd cada, e duas cadeias pesadas idênticas de cerca de 50 Kd cada. Existem quatro subclasses de cadeia pesada de IgG conhecidas de IgG canino e elas são aludidas como IgGA, IgGB, IgGC, e IgGD. Existem dois tipos de cadeias leves; cadeias capa e lambda. Cada uma das cadeias leves capa ou lambda é composta de um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). Cada uma das duas cadeias pesadas consiste de um domínio variável (VH) e três domínios constantes aludidos como CH-1, CH-2, e CH-3. O domínio CH-1 está conectado ao domínio CH-2 via uma sequência de aminoácido aludida como a “articulação” ou alternativamente como a “região de articulação”. Em seres humanos, a IgG existe em uma de quatro subclasses aludidas como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. A subclasse de IgG é determinada amplamente pela sequência da região de articulação, que difere entre as quatro subclasses de IgG. As duas cadeias pesadas são ligadas uma à outra pelas ligações de dissulfeto e cada cadeia pesada é ligada a uma das cadeias leves também através de uma ligação de dissulfeto.

[004] A digestão de anticorpos IgG com a enzima papaína rompe a molécula de anticorpo na região de articulação e resulta na formação de três fragmentos. Dois destes fragmentos são idênticos e cada um consiste da cadeia leve mantida junta com os domínios VH e CH1 da cadeia pesada. Estes fragmentos são chamados de fragmentos “Fab” e eles contêm os sítios de ligação de antígeno do anticorpo. O terceiro fragmento que resulta da digestão com papaína é chamada de “Fc” e o mesmo contém o resto das duas cadeias pesadas mantidas juntas pelas ligações de dissulfeto. O Fc assim contém um dímero consistindo do domínio CH2 e CH3 de cada uma das duas cadeias pesadas. Enquanto que o Fab permite que o anticorpo se ligue ao seu epítopo cognato, o Fc permite que o anticorpo medeie funções efetoras imunes tais como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose dependente de anticorpo (ADCP) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[005] É bem conhecido na técnica que anticorpos IgG mediam funções efetoras tais como ADCC e ADCP através da ligação da sua porção Fc a uma família de proteínas conhecida como receptores Fcy, ao passo que CDC é mediada através da ligação do Fc ao primeiro componente de complemento, C1q. Também é bem conhecido na técnica que subclasses de IgG diferentes diferem na sua capacidade para mediar estas funções efetoras. Por exemplo, a IgG1 humana demonstra forte ADCC e CDC, ao passo que a IgG4 demonstra um fraca a nenhuma ADCC e CDC. Além disso, os métodos para a identificação de qual das subclasses de IgG demonstram ou carecem de funções efetoras são bem conhecidos na técnica.

[006] Os métodos que contam com o uso de anticorpos monoclonais para propósitos terapêuticos requerem o planejamento de anticorpos ou fragmentos de anticorpo específicos para a finalidade para se obter a resposta terapêutica desejada. Por exemplo, alguns métodos terapêuticos para câncer requerem que os anticorpos terapêuticos tenham funções efetoras realçadas, enquanto que outras requerem que as funções efetoras sejam significantemente reduzidas ou totalmente eliminadas. O realce ou eliminação das funções efetoras podem ser obtidos através da introdução de uma ou mais mutações de aminoácido (substituições) na porção Fc do anticorpo de modo a realçar ou reduzir a ligação aos receptores de Fcy e o primeiro componente de complemento. Existem numerosos relatos na técnica anterior descrevendo substituições de aminoácido que podem ser introduzidas dentro de uma molécula de anticorpo de modo a modular as suas funções efetoras. Por exemplo, Shields et al., [J. of Biol. Chem., 276 (9): 6591-6604 (2001)] descrevem que uma substituição de asparagina para alanina (N297A), que resulta em um anticorpo não glicosilado, significantemente reduziu a ligação do anticorpo a vários receptores de Fcy. Adicionalmente, Shields et al., descreveram que uma substituição de ácido aspártico para alanina (D265A) também significantemente reduziu a ligação do anticorpo aos receptores de Fcy. Cada uma das substituições de N297A e D265A também foram mostradas danificar significantemente a CDC. Existem outros relatos similares identificando substituições potenciais para reduzir ou eliminar a função efetora nos anticorpos [por exemplo, Sazinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 105: 20167-20172 (2008), Alegre et al., Transplantation, 57: 1537-1543 (1994), Hutchins et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 11980-11984 (1994), McEarchem et al., Blood, 109: 1185-1192 (2007)].

[007] Um receptor imunoinibidor que é primariamente expressado nas células T e B ativadas, Receptor de Morte de Célula Programada 1, também aludido como Receptor de Morte Programada 1 (PD-1), é um membro da superfamília da imunoglobulina relacionada com CD28 e CTLA- 4. PD-1 e membros semelhantes da família são glicoproteínas de transmembrana tipo I contendo um domínio extracelular de Ig tipo Variável (tipo V) que liga seus ligantes e uma cauda citoplásmica que liga moléculas de sinalização. A cauda citoplásmica de PD-1 contém dois motivos de sinalização com base em tirosina, um ITIM (motivo de inibição com base na tirosina imunorreceptora) e um ITSM (motivo de comutação com base na tirosina imunorreceptora).

[008] PD-1 atenua as respostas de célula T quando ligado ao Ligante de Morte de Célula Programada 1, também aludido como Ligante de Morte Programada 1 (PD-L1), e/ou Ligante de Morte de Célula Programada 2, também aludido como Ligante de Morte Programada 2 (PD-L2). A ligação de cada um destes ligantes ao PD-1 negativamente regula a sinalização do receptor de antígeno. Bloquear a ligação de PD-L1 ao PD-1 realça a imunidade de célula T CD8+ específica de tumor, enquanto ajuda a depuração de células de tumor pelo sistema imune. A estrutura tridimensional do PD-1 de murino, assim como a co-estrutura cristalina de PD-1 de camundongo com PD-L1 humano foram relatadas [Zhang et al., Immunity 20: 337-347 (2004); Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-3016 (2008)].

[009] PD-L1 e PD-L2 são ligantes de transmembrana tipo I que contêm os domínios iguais tanto a IgV quanto a IgC na região extracelular junto com regiões citoplásmicas curtas sem nenhum dos motivos de sinalização conhecidos. Tanto PD-L1 quanto PD-L2 são constitutivamente expressados ou podem ser induzidos em uma variedade de tipos de célula, incluindo tecidos não hematopoiéticos assim como vários tipos de tumor. PD- L1 não é apenas expressado em células B, T, mielóides e dendríticas (DCs), mas também nas células periféricas, tais como células endoteliais microvasculares e órgãos não linfóides por exemplo, coração ou pulmão. Ao contrário, PD-L2 é apenas descoberto nos macrófagos e DCs. O padrão de expressão de ligantes PD-1 sugere que PD-1 desempenha um papel na manutenção da tolerância periférica e pode servir ainda para regular respostas de célula T e B auto-reativas na periferia.

[0010] Em qualquer caso, está agora abundantemente evidente que PD-1 desempenha um papel crítico em pelo menos certos cânceres humanos, presumivelmente pela mediação da evasão imune. Consequentemente, PD-L1 foi mostrado ser expresso em vários tumores de camundongo e humanos e é indutível pelo IFN-y na maioria das linhagens de célula de tumor negativas em PD-L1 [Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002); Strome et al., Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003)]. Além disso, a expressão de PD-1 nos linfócitos infiltrantes de tumor e/ou PD-L1 nas células de tumor foi identificada em várias biópsias de tumor humano primário. Tais tecidos de tumor incluem cânceres do pulmão, fígado, ovário, cerviz, pele, cólon, glioma, bexiga, mama, rim, esôfago, estômago, célula escamosa oral, célula urotelial, e pâncreas, assim como tumores da cabeça e pescoço [Brown et al., J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong et al., Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterle et al., Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome et al., Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003); Thompson et al., Cancer Res. 66: 3381-5 (2006); Thompson et al., Clin. Cancer Res. 13: 1757-1761 (2007); Nomi et al., Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157. (2007)]. Mais claramente, a expressão de ligante de PD nas células de tumor foi correlacionada com prognóstico insuficiente de pacientes humanos com câncer através de tipos múltiplos de tumor [revisado em Okazaki e Honjo, Int. Immunol. 19: 813-824 (2007)].

[0011] Além disso, Nomi et al. [Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007)] demonstraram a eficácia terapêutica de bloquear a ligação de PD-L1 para PD-1 em um modelo de murino de câncer pancreático agressivo através da administração de Anticorpo direcionado a PD-1 ou PD-L1. Estes anticorpos eficazmente promoveram a infiltração de célula T CD8+ reativa em tumor dentro do tumor resultando na supra-regulagem de efetores antitumor incluindo IFN-y, granzima B, e perforina. Similarmente, o uso de anticorpos para bloquear a ligação de PD-L1 e PD-1 significantemente inibiu o crescimento de tumor em um modelo de carcinoma de célula escamosa de camundongo [Tsushima et al., Oral Oncol. 42: 268-274 (2006)].

[0012] Em outros estudos, a transfecção de uma linhagem de mastocitoma de murino com PD-L1 levou à lise diminuída das células de tumor quando co-cultivadas com um clone de CTL específico de tumor. A lise foi restaurada quando anticorpo monoclonal anti-PD-L1 foi adicionado [Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]. In vivo, bloquear a interação de PD1/PD-L1 foi mostrado aumentar a eficácia da terapia de transferência de célula T adotiva em um modelo de camundongo de tumor [Strome et al., Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)]. Evidência adicional para o papel de PD-1 no tratamento contra o câncer se origina de experimentos realizados com camundongos knockout em PD-1 em que as células de mieloma que expressam PD-L1 cresceram apenas em animais do tipo selvagem (resultando no crescimento de tumor e na morte do animal associada), mas não em camundongos deficientes em PD-1 [Iwai Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]. Mais recentemente, anticorpos contra PD-1 (incluindo anticorpos monoclonais de murino humanizados contra PD-1 humano) mostraram sucesso pelo menos inicial na terapia contra o câncer em seres humanos [ver por exemplo, US 8.354.509 B2, US 8.008.449 B2, e US 7.595.048 B2].

[0013] Os anticorpos anti-PD-1 também podem ser úteis na infecção viral crônica. As Células T CD8+ de memória geradas depois de uma infecção viral aguda são altamente funcionais e constituem um componente importante de imunidade protetiva. Ao contrário, as infecções crônicas são frequentemente caracterizadas por graus variáveis de deterioração funcional (exaustão) das respostas de célula T específicas de sítio, e este defeito é uma razão principal para a incapacidade do hospedeiro para eliminar o patógeno persistente. Embora as células T efetoras funcionais sejam inicialmente geradas durante os estágios iniciais de infecção, elas gradualmente perdem função durante o curso de uma infecção crônica. Barber et al. [Nature 439: 682-687 (2006)] mostraram que camundongos infectados com uma cepa de laboratório de LCMV desenvolveram infecção crônica resultando em níveis altos de vírus no sangue e outros tecidos. Estes camundongos inicialmente desenvolveram uma resposta de célula T robusta, mas eventualmente sucumbiram à infecção na exaustão da célula T. Barber et al. Descobriram que o declínio na quantidade e função das células T efetoras nos camundongos cronicamente infectados pode ser revertido pela injeção de um anticorpo que bloqueou a interação entre PD-1 e PD-L1.

[0014] A citação de qualquer referência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível como “técnica anterior” em relação ao presente pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] A presente invenção fornece uma região de fragmento cristalizável canino (região cFc) de um anticorpo em que o cFc foi geneticamente modificado para aumentar, diminuir, ou eliminar uma ou mais funções efetoras. Em um aspecto da presente invenção, o cFc geneticamente modificado diminui ou elimina uma ou mais funções efetoras. Em um outro aspecto da invenção o cFc geneticamente modificado aumenta uma ou mais funções efetoras.

[0016] Em certas modalidades, a região cFc geneticamente modificada é uma região Fc de IgGB canina geneticamente modificada. Em uma outra tal modalidade, a região cFc geneticamente modificada é uma região Fc de IgGC canina geneticamente modificada. Em uma modalidade particular a função efetora é a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) que é aumentada, diminuída, ou eliminada. Em uma outra modalidade a função efetora é a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) que é aumentada, diminuída, ou eliminada. Já em uma outra modalidade, a região cFc foi geneticamente modificada para aumentar, diminuir, ou eliminar tanto a ADCC quanto a CDC.

[0017] A presente invenção fornece ainda armações caninas e/ou cadeias pesadas de tamanho natural que compreendem as regiões cFc geneticamente modificadas. Consequentemente, a presente invenção fornece cadeias pesadas de tamanho natural de anticorpos em que as cadeia pesadas de tamanho natural compreendem as regiões cFc geneticamente modificadas da presente invenção. Tais cadeias pesadas de tamanho natural também podem ser combinadas com as cadeias leves (capa ou lambda) de canino correspondentes para formar um anticorpo completo. Em modalidades particulares deste tipo, o anticorpo resultante se liga a um antígeno canino particular com especificidade. Em certas de tais modalidades o antígeno canino é PD-1 canino. Já em outras modalidades o antígeno canino é PD-L1 canino. Ainda em outras modalidades, o antígeno canino é a cadeia alfa do receptor de IL-4. Já em outras modalidades o antígeno canino é a proteína da linfopoietina estrômica tímica canina (cTSLP) [ver, a U.S. 7.718.772 B2, os conteúdos da qual são por meio deste incorporados por referência em suas totalidades].

[0018] Em certas modalidades, a região cFc geneticamente modificada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 (ou SEQ ID NO: 132) em que um a sete dos seguintes resíduos de aminoácido são trocados por um outro resíduo de aminoácido nas posições indicadas: P4, D31, N63, G64, T65, A93, ou P95. O aminoácido substituindo no lugar de P4, D31, N63, G64, T65, A93, e/ou P95 são individualmente selecionados de um dos outros 19 aminoácidos padrão que ocorrem naturalmente, como listado na Tabela 1 abaixo. A presente invenção fornece ainda variantes das regiões cFc geneticamente modificadas que compreendem uma sequência de aminoácido que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido de tais regiões cFc geneticamente modificadas e retêm pelo menos 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, ou mais do aumento, diminuição, ou eliminação da ADCC e/ou da CDC visto que as regiões cFc geneticamente modificadas compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 (ou SEQ ID NO: 132) em que um ou mais dos seguintes resíduos de aminoácido foram trocados: isto é, em P4, D31, N63, G64, T65, A93, ou P95.

[0019] Em outras modalidades dois a cinco dos seguintes resíduos de aminoácido são trocados por um outro resíduo de aminoácido nas posições indicadas: P4, D31, N63, G64, T65, A93, ou P95. Em modalidades particulares deste tipo, a região cFc geneticamente modificada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 ou SEQ ID NO: 132 com as seguintes substituições: P4A, D31A, N63A, A93G, e P95A. Em modalidades relacionadas, a região cFc geneticamente modificada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 ou SEQ ID NO: 132 com as seguintes substituições: P4A, D31A, N63A, e P95A. Em outras modalidades, a região cFc geneticamente modificada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 ou SEQ ID NO: 132 com substituições em D31 e N63. Em modalidades particulares deste tipo, o resíduo de ácido aspártico na posição 31 é trocado com um resíduo de ácido glutâmico, um resíduo de asparagina, ou um resíduo de alanina, ao passo que o resíduo de asparagina na posição 63 é trocado com um resíduo de glutamina, um resíduo de histidina, ou um resíduo de alanina. Em uma modalidade mais particular deste tipo, a região cFc geneticamente modificada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 ou SEQ ID NO: 132 com as seguintes substituições: D31A e N63A. Em modalidades particulares, a região cFc geneticamente modificada é codificada pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 129 ou SEQ ID NO: 131 compreende mudanças de nucleotídeo que correspondem às sequências de aminoácido que elas codificam.

[0020] Em uma outra modalidade, a região cFc geneticamente modificada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 ou SEQ ID NO: 132 com a substituição em A93. Em uma modalidade particular deste tipo, a substituição é A93G. Em uma modalidade relacionada a substituição é A93S. Como mostrado abaixo no Exemplo 4, a substituição de A93G leva a um realce na ligação de C1q de complemento, que é indicativo de atividade de CDC crescente.

[0021] Em modalidades relacionadas a região cFc geneticamente modificada compreende adicionalmente uma região de articulação que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 109. Em outras modalidades a região Fc geneticamente modificada compreende adicionalmente uma região de articulação que compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 110. Ainda em outras modalidades a região Fc geneticamente modificada compreende adicionalmente uma região de articulação que compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 111. Já em outras modalidades a região Fc geneticamente modificada compreende adicionalmente uma região de articulação geneticamente modificada que compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 112.

[0022] Em modalidades alternativas, a presente invenção fornece uma região Fc de IgGD canina com uma região de articulação geneticamente modificada de um anticorpo IgGD canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGA canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGB canino, ou uma região de articulação de um anticorpo IgGC canino. Além disso, a presente invenção fornece cadeias pesadas de tamanho natural de anticorpos em que as cadeias pesadas de tamanho natural compreendem a região Fc de IgGD canina da presente invenção com uma região de articulação geneticamente modificada de um anticorpo IgGD canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGA canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGB canino, ou uma região de articulação de um anticorpo IgGC canino. Tais cadeias pesadas de tamanho natural também podem ser combinadas com cadeias leves (capa ou lambda) caninas correspondentes para formar um anticorpo completo.

[0023] Consequentemente, a presente invenção fornece uma região Fc de IgGD canina que compreende adicionalmente uma região de articulação geneticamente modificada de um anticorpo IgGD canino. Em modalidades particulares deste tipo a região Fc de IgGD canina e a região de articulação geneticamente modificada compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácido que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, que compreende um resíduo de prolina na posição 10 (P10). Em uma modalidade mais particular a região Fc de IgGD canina e a região de articulação geneticamente modificada são codificadas pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5. Em outras modalidades, a região Fc de IgGD canina compreende adicionalmente uma região de articulação de um anticorpo IgGA canino. Em modalidades particulares deste tipo a região Fc de IgGD canina e a região de articulação compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácido que seja 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade mais particular a região Fc de IgGD canina e a região de articulação são codificadas pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 7. Ainda em outras modalidades, a região Fc de IgGD canina compreende adicionalmente uma região de articulação de um anticorpo IgGB canino. Em modalidades particulares deste tipo a região Fc de IgGD canina e a região de articulação compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácido que seja 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade mais particular a região Fc de IgGD canina e a região de articulação são codificadas pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 9. Já em outras modalidades, a região Fc de IgGD canina compreende adicionalmente uma região de articulação de um anticorpo IgGC canino. Em modalidades particulares deste tipo a região cFc de IgGD canina e a região de articulação compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácido que seja 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade mais particular a região cFc de IgGD canina e a região de articulação são codificadas pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11. A presente invenção fornece ainda anticorpos caninizados que compreendem estas regiões Fc de IgGD canina e as regiões de articulação. Em uma modalidade particular o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo liga o Receptor de Morte Programada 1 canino (PD-1 canino) com especificidade.

[0024] A presente invenção portanto fornece anticorpos caninizados anti-PD-1 canino com especificidade e/ou que têm uma alta afinidade de ligação para PD-1 canino. Em modalidades particulares, os anticorpos caninizados anti-PD-1 canino também têm a capacidade para bloquear a ligação de PD-1 canino ao PD-L1 canino. Em modalidades específicas os anticorpos caninizados anti-PD-1 canino têm uma alta afinidade de ligação ao PD-1 canino, assim como têm a capacidade para bloquear também a ligação de PD-1 canino ao PD-L2 canino. Os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que especificamente ligam PD-1 canino podem compreender uma cadeia pesada de IgG canina da presente invenção e uma cadeia leve capa ou lambda canina. Em modalidades particulares os anticorpos caninizados anti-PD-1 caninos são anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 caninos. A presente invenção também refere-se ao uso de tais anticorpos caninizados no tratamento de doença tal como câncer e/ou aquelas devido às infecções.

[0025] Em modalidades particulares o anticorpo anti-PD-1 canino caninizado compreende uma região cFc geneticamente modificada da presente invenção. Em modalidades alternativas o anticorpo anti-PD-1 canino caninizado compreende a região Fc de IgGD canina com uma região de articulação geneticamente modificada de um anticorpo IgGD canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGA canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGB canino, ou uma região de articulação de um anticorpo IgGC canino. A presente invenção fornece ainda tais anticorpos caninizados anti-PD-1 canino compreendendo as armações caninas da presente invenção em combinação com CDRs obtidas de anticorpos de camundongo anti-PD-1 canino, isto é, três CDRs de cadeia leve: CDR leve 1 (CDRL1), CDR leve 2 (CDRL2), e CDR leve 3 (CDRL3) e três CDRs de cadeia pesada CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRH2) e CDR pesada 3 (CDRH3).

[0026] Em modalidades particulares, os anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 canino compreendem a região cFc geneticamente modificada de IgGB ou IgGC da presente invenção ou alternativamente, a região Fc de IgGD canina, junto com uma região de articulação geneticamente modificada de um anticorpo IgGD canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGA canino, uma região de articulação de um anticorpo IgGB canino, ou uma região de articulação de um anticorpo IgGC canino em combinação com CDRs obtidas de anticorpos de camundongo anti- PD-1 canino. Além disso, a presente invenção não apenas fornece anticorpos de camundongo anti-PD-1 canino caninizados com CDRs específicas como aqui detalhado, mas fornece ainda anticorpos de camundongo anti-PD-1 canino caninizados compreendendo variantes conservativamente modificadas destas CDRs assim como variantes que compreendem (por exemplo, compartilham) a mesma estrutura canônica.

[0027] Consequentemente em modalidades particulares o anticorpo anti-PD-1 canino caninizado compreende adicionalmente regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) em que as CDRs têm as estruturas canônicas de: H1-1, H2-1, e H3-6, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada, isto é, A CDR1 da cadeia pesada tem a estrutura canônica classe 1, a CDR2 da cadeia pesada tem a estrutura canônica classe 1, e a CDR3 da cadeia pesada tem a estrutura canônica classe 6. Em modalidades ainda mais particulares, as CDRs para as cadeias leves correspondentes têm as estruturas canônicas de: L1-3, L2-1, e L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve. Em outras modalidades o anticorpo anti-PD-1 canino caninizado compreende adicionalmente regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) em que as CDRs têm as estruturas canônicas de: H1-1, H2-1, e H3-11, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada. Em modalidades ainda mais particulares deste tipo, as CDRs para as cadeias leves correspondentes têm as estruturas canônicas de: L1-2A, L2-1, e L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve. Ainda em outras modalidades o anticorpo anti-PD-1 canino caninizado compreende adicionalmente regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) em que as CDRs têm as estruturas canônicas de: H1-1, H2-2A, e H3-11, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada. Em modalidades ainda mais particulares deste tipo, as CDRs para as cadeias leves correspondentes têm as estruturas canônicas de: L1-2A, L2-1, e L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve. Já em outras modalidades o anticorpo anti-PD-1 canino caninizado compreende adicionalmente regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) em que as CDRs têm as estruturas canônicas de: H1-1, H2-2A, e H3-13, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia pesada. Em modalidades ainda mais particulares deste tipo, as CDRs para as cadeias leves correspondentes têm as estruturas canônicas de: L1-4, L2-1, e L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve.

[0028] Em modalidades mais particulares, o anticorpo caninizado da presente invenção ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreendem uma ou mais da região determinadora de complementaridade 1 de cadeia pesada (VH CDR1) com uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ou SEQ ID NO: 30. Em uma outra modalidade, a região determinadora de complementaridade 2 de cadeia pesada (VH CDR2) compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 35. Ainda em uma outra modalidade a região determinadora de complementaridade 3 de cadeia pesada (VH CDR3) compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 146. Em uma modalidade particular deste tipo, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem tanto uma VH CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ou SEQ ID NO: 30 quanto uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 35. Em uma outra tal modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem tanto uma VH CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ou SEQ ID NO: 30 quanto uma VH CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 146. Ainda em uma outra tal modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem tanto uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 35 quanto uma VH CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 146. Ainda em uma outra tal modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem uma VH CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ou SEQ ID NO: 30, uma VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 35, e uma VH CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 146.

[0029] Em modalidades particulares, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno também compreendem uma região determinadora de complementaridade 1 de cadeia leve (VL CDR1) compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15. Em modalidades relacionadas com a região determinadora de complementaridade 2 de cadeia leve (VL CDR2) compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21. Ainda em uma outra modalidade a região determinadora de complementaridade 3 de cadeia leve (VL CDR3) compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26. Em uma modalidade particular deste tipo, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem tanto uma VL CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15 quanto uma VL CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21.

[0030] Em uma outra tal modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem tanto uma VL CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15 quanto uma VL CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26. Ainda em uma outra tal modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem tanto uma VL CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21 quanto uma VL CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26. Ainda em outra tal modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno compreendem uma VL CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15, uma VL CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ou SEQ ID NO: 21, e uma VL CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26.

[0031] A presente invenção fornece ainda anticorpos caninizados que compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 40 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 42 , SEQ ID NO: 44 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 64, ou SEQ ID NO: 66 ou que é 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 66, ou fragmentos de ligação de antígeno destes anticorpos caninizados.

[0032] Em modalidades particulares, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreende (i) P, A, G, ou S na posição 239, (ii) A, G, ou S na posição 266, (iii) A, G, ou S na posição 298, (iv) G, P, ou A na posição 299, (v) T, A, G, ou S na posição 300, (vi) A, G, ou S na posição 328, e (vii) P, A, G, ou S na posição 330. Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 237, (ii) A, G, ou S na posição 264, (iii) A, G, ou S na posição 296, (iv) G, P, ou A na posição 297, (v) T, A, G, ou S na posição 298, (vi) A, G, ou S na posição 326, e (vii) P, A, G, ou S na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 244, (ii) A, G, ou S na posição 271, (iii) A, G, ou S na posição 303, (iv) G, P, ou A na posição 304, (v) T, A, G, ou S na posição 305, (vi) A, G, ou S na posição 333, e (vii) P, A, G, ou S na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 242, (ii) A, G, ou S na posição 269, (iii) A, G, ou S na posição 301, (iv) G, P, ou A na posição 302, (v) T, A, G, ou S na posição 303, (vi) A, G, ou S na posição 331, e (vii) P, A, G, ou S na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) P, A, G, ou S na posição 246, (ii) A, G, ou S na posição 273, (iii) A, G, ou S na posição 305, (iv) G, P, ou A na posição 306, (v) T, A, G, ou S na posição 307, (vi) A, G, ou S na posição 335, e (vii) P, A, G, ou S na posição 337.

[0033] Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 239, (ii) A na posição 266, (iii) A na posição 298, (iv) G, P, ou A na posição 299, (v) T, A, G, ou S na posição 300, (vi) A, G, ou S na posição 328, e (vii) P, A, G, ou S na posição 330. Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 237, (ii) A na posição 264, (iii) A na posição 296, (iv) G, P, ou A na posição 297, (v) T, A, G, ou S na posição 298, (vi) A, G, ou S na posição 326, e (vii) P, A, G, ou S na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 244, (ii) A na posição 271, (iii) A na posição 303, (iv) G, P, ou A na posição 304, (v) T, A, G, ou S na posição 305, (vi) A, G, ou S na posição 333, e (vii) P, A, G, ou S na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 242, (ii) A na posição 269, (iii) A na posição 301, (iv) G, P, ou A na posição 302, (v) T, A, G, ou S na posição 303, (vi) A, G, ou S na posição 331, e (vii) P, A, G, ou S na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) P, A, G, ou S na posição 246, (ii) A na posição 273, (iii) A na posição 305, (iv) G, P, ou A na posição 306, (v) T, A, G, ou S na posição 307, (vi) A, G, ou S na posição 335, e (vii) P, A, G, ou S na posição 337.

[0034] Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) A na posição 239, (ii) A na posição 266, (iii) A na posição 298, (iv) P na posição 299, (v) A na posição 300, (vi) G, na posição 328, e (vii) A, na posição 330. Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) A na posição 237, (ii) A na posição 264, (iii) A na posição 296, (iv) P na posição 297, (v) A na posição 298, (vi) G na posição 326, e (vii) A na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) A na posição 244, (ii) A na posição 271, (iii) A na posição 303, (iv) P na posição 304, (v) A na posição 305, (vi) G na posição 333, e (vii) A na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) A na posição 242, (ii) A na posição 269, (iii) A na posição 301, (iv) P na posição 302, (v) A na posição 303, (vi) G na posição 331, e (vii) A na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) A na posição 246, (ii) A na posição 273, (iii) A na posição 305, (iv) P na posição 306, (v) A na posição 307, (vi) G na posição 335, e (vii) A na posição 337.

[0035] Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) P na posição 239, (ii) A, G, ou S na posição 266, (iii) A, G, ou S na posição 298, (iv) G na posição 299, (v) T na posição 300, (vi) A na posição 328, e (vii) P na posição 330. Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) P na posição 237, (ii) A, G, ou S na posição 264, (iii) A, G, ou S na posição 296, (iv) G na posição 297, (v) T na posição 298, (vi) A na posição 326, e (vii) P na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) P na posição 244, (ii) A, G, ou S na posição 271, (iii) A, G, ou S na posição 303, (iv) G na posição 304, (v) T na posição 305, (vi) A na posição 333, e (vii) P na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) P na posição 242, (ii) A, G, ou S na posição 269, (iii) A, G, ou S na posição 301, (iv) G na posição 302, (v) T na posição 303, (vi) A na posição 331, e (vii) P na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) P na posição 246, (ii) A, G, ou S na posição 273, (iii) A, G, ou S na posição 305, (iv) G na posição 306, (v) T na posição 307, (vi) A na posição 335, e (vii) P na posição 337.

[0036] Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) P na posição 239, (ii) A na posição 266, (iii) A na posição 298, (iv) G na posição 299, (v) T na posição 300, (vi) A na posição 328, e (vii) P na posição 330. Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) P na posição 237, (ii) A na posição 264, (iii) A na posição 296, (iv) G na posição 297, (v) T na posição 298, (vi) A na posição 326, e (vii) P na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) P na posição 244, (ii) A na posição 271, (iii) A na posição 303, (iv) G na posição 304, (v) T na posição 305, (vi) A na posição 333, e (vii) P na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) P na posição 242, (ii) A na posição 269, (iii) A na posição 301, (iv) G na posição 302, (v) T na posição 303, (vi) A na posição 331, e (vii) P na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) P na posição 246, (ii) A na posição 273, (iii) A na posição 305, (iv) G na posição 306, (v) T na posição 307, (vi) A na posição 335, e (vii) P na posição 337.

[0037] Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 239, (ii) A, G, ou S na posição 266, (iii) A, G, ou S na posição 298, (iv) G na posição 299, (v) T na posição 300, (vi) A, G, ou S na posição 328, e (vii) P, A, G, ou S na posição 330. Em outras tais modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 237, (ii) A, G, ou S na posição 264, (iii) A, G, ou S na posição 296, (iv) G na posição 297, (v) T na posição 298, (vi) A, G, ou S na posição 326, e (vii) P, A, G, ou S na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 244, (ii) A, G, ou S na posição 271, (iii) A, G, ou S na posição 303, (iv) G na posição 304, (v) T na posição 305, (vi) A, G, ou S na posição 333, e (vii) P, A, G, ou S na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 242, (ii) A, G, ou S na posição 269, (iii) A, G, ou S na posição 301, (iv) G na posição 302, (v) T na posição 303, (vi) A, G, ou S na posição 331, e (vii) P, A, G, ou S na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) P, A, G, ou S na posição 246, (ii) A, G, ou S na posição 273, (iii) A, G, ou S na posição 305, (iv) G na posição 306, (v) T na posição 307, (vi) A, G, ou S na posição 335, e (vii) P, A, G, ou S na posição 337.

[0038] Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 239, (ii) A na posição 266, (iii) A na posição 298, (iv) G na posição 299, (v) T na posição 300, (vi) A, G, ou S na posição 328, e (vii) P, A, G, ou S na posição 330. Em outras tais modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 237, (ii) A na posição 264, (iii) A na posição 296, (iv) G na posição 297, (v) T na posição 298, (vi) A, G, ou S na posição 326, e (vii) P, A, G, ou S na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 244, (ii) A na posição 271, (iii) A na posição 303, (iv) G na posição 304, (v) T na posição 305, (vi) A, G, ou S na posição 333, e (vii) P, A, G, ou S na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) P, A, G, ou S na posição 242, (ii) A na posição 269, (iii) A na posição 301, (iv) G na posição 302, (v) T na posição 303, (vi) A, G, ou S na posição 331, e (vii) P, A, G, ou S na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) P, A, G, ou S na posição 246, (ii) A na posição 273, (iii) A na posição 305, (iv) G na posição 306, (v) T na posição 307, (vi) A, G, ou S na posição 335, e (vii) P, A, G, ou S na posição 337.

[0039] Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64) que compreendem (i) A na posição 239, (ii) A na posição 266, (iii) A na posição 298, (iv) G na posição 299, (v) T na posição 300, (vi) G na posição 328, e (vii) A na posição 330. Em outras tais modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66) que compreendem (i) A na posição 237, (ii) A na posição 264, (iii) A na posição 296, (iv) G na posição 297, (v) T na posição 298, (vi) G na posição 326, e (vii) A na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60) que compreendem (i) A na posição 244, (ii) A na posição 271, (iii) A na posição 303, (iv) G na posição 304, (v) T na posição 305, (vi) G na posição 333, e (vii) A na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idênticas às SEQ ID NOs: 46 ou 62) que compreendem (i) A na posição 242, (ii) A na posição 269, (iii) A na posição 301, (iv) G na posição 302, (v) T na posição 303, (vi) G na posição 331, e (vii) A na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 (ou 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 48) que compreende (i) A na posição 246, (ii) A na posição 273, (iii) A na posição 305, (iv) G na posição 306, (v) T na posição 307, (vi) G na posição 335, e (vii) A na posição 337.

[0040] Além disso, a presente invenção fornece anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreendem adicionalmente uma cadeia leve canina compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 102, ou SEQ ID NO: 108.

[0041] Consequentemente, a presente invenção fornece ainda um anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreendem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 68 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 72. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 70 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 72. Em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 78. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 76 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 78. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 80 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 84. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 82 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 84. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 86 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 90. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 88 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 90. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 92 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 96. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 96. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 98 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 102. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 100 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 102. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 104 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 108. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 106 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 108.

[0042] A presente invenção fornece ainda um anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que compreendem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 40 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 72. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 42 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 72. Em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 44 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 78. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 78. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 84. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 50 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 84. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 52 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 90. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 54 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 90. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 56 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 96. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 58 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 96.

[0043] Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 60 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 102. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 62 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 102. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 108. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 66 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 108.

[0044] A presente invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da presente invenção incluindo as CDRs, regiões cFc, as regiões cFc com as regiões de articulação, e as cadeias pesadas, e as cadeias leves dos anticorpos caninizados da presente invenção. A presente invenção fornece ainda vetores de expressão que compreendem um ou mais dos ácidos nucleicos da presente invenção. A presente invenção fornece ainda células hospedeiras que compreendem um ou mais vetores de expressão da presente invenção e métodos para expressar as CDRs, e/ou regiões cFc, e/ou as regiões cFc com as regiões de articulação, e/ou as cadeia pesadas, e/ou as cadeias leves dos anticorpos caninizados da presente invenção usando tais células hospedeiras. A presente invenção também fornece células hospedeiras que foram geneticamente engenheiradas para expressar as CDRs, e/ou regiões cFc, e/ou as regiões cFc com as regiões de articulação, e/ou as cadeias pesadas, e/ou as cadeias leves dos anticorpos caninizados da presente invenção na ausência de tais vetores. Em modalidades particulares, estes ácidos nucleicos, vetores de expressão, polipeptídeos, ou células hospedeiras da invenção são úteis nos métodos de fabricar um anticorpo.

[0045] Em modalidades particulares, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em modalidades relacionadas, o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são conectados por um ligador flexível para formar um anticorpo de cadeia única.

[0046] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é um fragmento Fab.

[0047] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é um fragmento Fab’. Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é um fragmento (Fab’)2. Ainda em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é um diacorpo. Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo de domínio. Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo de domínio único camelizado.

[0048] Em modalidades particulares, um anticorpo de murino anti- PD-1 canino caninizado ou fragmento de ligação de antígeno aumenta a resposta imune do indivíduo canino que é tratado.

[0049] Em certas modalidades quando ligado ao PD-1 canino, o anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo se liga a pelo menos um resíduo de aminoácido dentro de uma ou mais sequências de aminoácido das seguintes: SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, da SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, e/ou SEQ ID NO: 145.

[0050] Além disso, a presente invenção fornece anticorpos caninizados ao PD-1 canino, que compreendem variantes das CDRs da presente invenção que têm as estruturas canônicas correspondentes aqui fornecidas e/ou que se ligam à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 144. Em modalidades particulares deste tipo, a constante de dissociação (Kd) para a ligação do anticorpo caninizado-PD-1 canino é de 1 X 10-5 a 1 X 10-12 M. Em modalidades mais particulares os anticorpos caninizados ao PD-1 canino, compreendem variantes das CDRs da presente invenção que têm as estruturas canônicas correspondentes aqui fornecidas e se ligam à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 145. A presente invenção portanto inclui anticorpos caninizados e fragmentos de ligação de antígeno do mesmo que ligam PD-1 canino com especificidade, que quando eles são ligados ao PD-1 canino, o anticorpo se liga a pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 144. Em modalidades particulares deste tipo, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno do mesmo ligam PD-1 canino e bloqueiam a ligação de PD-1 canino ao Ligante de Morte Programada 1 (PD-L1) canino.

[0051] Consequentemente, em modalidades particulares quando ligado ao PD-1 canino, o anticorpo caninizado (incluindo os anticorpos com uma ou mais CDRs variantes, por exemplo, uma variante incluindo uma variante conservativamente modificada e/ou uma variante que compreendem uma classe de estrutura canônica definida) se liga a pelo menos um resíduo de aminoácido dentro de uma ou mais sequências de aminoácido das seguintes: SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, da SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, e/ou SEQ ID NO: 145. Em modalidades ainda mais particulares quando ligado ao PD-1 canino, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo se ligam a um ou mais resíduos de aminoácido dos seguintes resíduos de arginina: R62, R69, R72, R75, e R90 da SEQ ID NO: 114. Em modalidades específicas quando ligado ao PD-1 canino, os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 145. Em modalidades mais específicas quando ligado ao PD-1 canino, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo se ligam a um ou mais resíduos de aminoácido dos seguintes resíduos de arginina: R62, R69, R72, e R75 da SEQ ID NO: 114. Em modalidades ainda mais específicas quando ligado ao PD-1 canino, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo se ligam a R75 da SEQ ID NO: 114.

[0052] A presente invenção fornece ainda anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que se ligam a PD-1 canino com uma constante de dissociação (Kd) que é mais baixa (por exemplo, 1 X 10-13 M, ou mais baixa) do que 1 X 10-12 M. Em modalidades particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma constante de dissociação de 1 X 10-5 M a 1 X 10-12 M. Em modalidades mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma constante de dissociação de 1 X 10-7 M a 1 X 10-11 M. Em modalidades ainda mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma constante de dissociação de 1 X 10-8 M a 1 X 10-11 M. Em modalidades ainda mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma constante de dissociação de 1 X 10-8M a 1 X 10-10M.

[0053] A presente invenção também fornece anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que se ligam a PD-1 canino com uma taxa de associação (kon) que é maior do que 1 X 107 M-1s-1. Em modalidades particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma taxa de associação de 1 X 102 M-1s-1 a 1 X 107 M-1s-1. Em modalidades mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma taxa de associação de 1 X 103 M-1s-1 a 1 X 106 M-1s-1. Em modalidades ainda mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD- 1 canino com uma taxa de associação de 1 X 103 M-1s-1 a 1 X 105 M-1s-1. Em modalidades ainda mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma taxa de associação de 1 X 104 M-1s-1a 1 X 105M-1s-1.

[0054] A presente invenção fornece ainda anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que se ligam a PD-1 canino com uma taxa de dissociação (koff) mais baixa do que 1 X 10-7 s-1. Em modalidades particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma taxa de dissociação de 1 X 10-3 s-1 a 1 X 10-8 s-1. Em modalidades mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD- 1 canino com uma taxa de dissociação de 1 X 10-4 s-1 a 1 X 10-7 s-1. Em modalidades ainda mais particulares os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a PD-1 canino com uma taxa de dissociação de 1 X 10-5 s-1 a 1 X 10-7 s-1.

[0055] Em modalidades relacionadas, os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos estimulam respostas de memória específicas de antígeno a um tumor ou patógeno. Em modalidades particulares, os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos estimulam uma resposta de um anticorpo in vivo. Em outras modalidades particulares, os anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos estimulam uma resposta imune em um indivíduo animal. Em modalidades mais específicas o indivíduo animal é um canino. Em uma modalidade relacionada, o indivíduo animal é um felino.

[0056] Consequentemente, qualquer um dos anticorpos caninizados da presente invenção pode exibir um, dois, três, quatro, cinco, ou todas estas propriedades, isto é, as constantes de dissociação anteriormente mencionadas com PD-1 canino, as taxas de associação anteriormente mencionadas para a ligação com PD-1 canino, as taxas de dissociação anteriormente mencionadas para a dissociação do complexo de ligação de anticorpo caninizado-PD-1 canino, estimulando uma resposta de memória específica de antígeno a um tumor ou patógeno, estimulando uma resposta de um anticorpo in vivo, e/ou estimulando uma resposta imune em um indivíduo animal.

[0057] Em modalidades mais particulares os anticorpos caninizados e fragmentos de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção ligam PD- 1 canino e também bloqueiam a ligação de PD-1 canino ao PD-L1. Em modalidades ainda mais particulares os anticorpos caninizados e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos da presente invenção ligam PD-1 canino, bloqueiam a ligação de PD-1 canino ao PD-L1, e também bloqueiam a ligação de PD-1 canino ao PD-L2.

[0058] A presente invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam os anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 canino ou porções do mesmo da presente invenção. Em modalidades relacionadas tais anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno podem ser usados para a preparação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo canino. Alternativamente, ou em conjunção, a presente invenção fornece o uso de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo da presente invenção para o uso em diagnóstico. Ainda em modalidades adicionais, um kit é fornecido compreendendo qualquer um dos anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno aqui descrevedos.

[0059] A presente invenção inclui ainda composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-antígeno canino ou fragmento de ligação do mesmo (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 canino ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo) junto com um carregador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção também fornece um método para aumentar a atividade de uma célula imune, compreendendo a administração a um indivíduo (por exemplo, um canino) em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades o método é usado para o tratamento de câncer. Em outras modalidades, o método é usado no tratamento de uma infecção ou doença infecciosa. Ainda em outras modalidades, um anticorpo caninizado da presente invenção ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é usado como um adjuvante de vacina. Ainda em uma outra modalidade, um anticorpo anti-TSLP caninizado é administrado a um canino para tratar dermatite atópica.

[0060] Estes e outros aspectos da presente invenção serão melhor avaliados por referência à seguinte Descrição Breve dos Desenhos e à Descrição Detalhada.

BEVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0061] A Figura 1 mostra a reatividade de anticorpos monoclonais (mAbs) caninizados contra domínio ariants lar de PD-1 canino, como uma função da OD 650/490 versus o log mAb (nM). Vários mAbs caninizados foram testados quanto à sua ligação ao domínio ariants lar de PD-1 canino pelo ELISA. Os arian mAbs testados foram designados como: 2H9 VH4 IgGB/VL3, 3B6 VH3 IgGB/ VL3, 2H9 VH4 IgGB (YZZ1062)/VL3, e 2H9 VH4 IgGB (YZZ1068)/VL3.

[0062] A Figura 2 mostra a reatividade de mAbs caninizados contra PD-1 canino expressado na superfície ariants. Vários mAbs de camundongo foram testados quanto à sua ligação ao PD-1 canino expressado nas células CHO pelo CELISA como uma função de OD 450/540 versus o log mAb (nM). Os ariants testados foram designados como: 3B6 VH3/VL4, 3B6 VH3/VL1, 3B6 VH3/VL3, 3B6 VH3/VL2, 3B6 VH1/VL1, e Quimera 3B6 m-c.

[0063] A Figura 3 mostra o bloqueio de ligante com mAbs caninizados contra PD-1 canino. Vários mAbs caninizados foram testados quanto à sua capacidade para inibir a ligação de PD-1 expressado nas células CHO ao PD-L1 como uma função de OD 450/540 versus o log mAb (nM). Os ariants testados foram designados como: 3B6 VH3/VL4, 3B6 VH3/VL1, 3B6 VH3/VL3, 3B6 VH3/VL2, 3B6 VH1/VL1, e Quimera 3B6 m-c.

[0064] A Figura 4 mostra a secreção de citocina induzida pelos mAbs caninizados contra PD-1 canino. Vários mAbs caninizados e suas ariants foram testados quanto à sua capacidade para induzir a secreção de citocina a partir de PBMC de cães saudáveis.

[0065] As Figuras 5A e 5B mostram a ligação de mAbs caninizados e suas ariants (começando a 1 μg/ml) para FcyRI. Vários mAbs foram testados quanto à sua capacidade para se ligar a FcRI. Os anticorpos são designados como: can 2H9 ADCC (1062) VH4/VL3, can 2H9 ADCC mut 1 VH4/VL3, can 2H9 ADCC mut 2 VH4/VL3, can 2H9 IgGD VH4/VL3, can 2H9 VH4/VL3, e can 3B6 VH4/VL4 na Figura 5A; e can 2H9 ADCC (1059) VH4/VL3, can 2H9 ADCC (1060) VH4/VL3, can 2H9 ADCC (1061) VH4/VL3, can 2H9 IgGB ADCC (1068) VH4/VL3, can 2H9 VH4/VL3, e can 3B6 VH4/VL4 na Figura 5B.

[0066] A Figura 6A e 6B mostram a ligação de mAbs caninizados e suas variantes (começando a 1 μg/ml) a C1Q. Vários mAbs foram testados quanto à sua capacidade para se ligar a C1Q. Os anticorpos são designados como: can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1062) /VL3, can 2H9 VH4 IgGB ADCC (mut 1)/VL3, can 2H9 VH4 IgGB ADCC (mut 2)/VL3, can 2H9 VH4 IgGD/VL3, can 2H9 VH4/VL3, e can 3B6 VH4/VL4 IgGB na Figura 6A; e can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1059) /VL3, can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1060)/VL3, can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1061)/VL3, can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1068)/VL3, can 2H9 VH4/VL3 IgGB, e can 3B6 VH4/VL4 IgGB na Figura 6B.

[0067] A Figura 7A mostra a caracterização da interface entre PD-1 canino e o anticorpo caninizado 2G9. As posições de aminoácido são com respeito à sequência de aminoácido PD-1 sem a sequência de sinal, isto é, a SEQ ID NO: 114. A determinação foi realizada pela reticulação química, espectrometria de massa MALDI de Massa Alta e espectrometria de massa nLC-Orbitrap.

[0068] A Figura 7B mostra a caracterização da interface entre PD-1 canino e o anticorpo caninizado 3B6. As posições de aminoácido são com respeito à sequência de aminoácido de PD-1 sem a sequência de sinal, isto é, a SEQ ID NO: 114. A determinação foi realizada pela reticulação química, espectrometria de massa MALDI de Massa Alta e espectrometria de massa nLC-Orbitrap.

DESCRIÇÃO DETALHADA Abreviações

[0069] Por toda a descrição detalhada e exemplos da invenção as seguintes abreviações serão usadas: ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpo CDC Citotoxicidade dependente de complemento CDR Região determinadora de complementaridade nas regiões variáveis da imunoglobulina, definidas para anticorpos humanos usando o sistema de numeração de Kabat CHO Ovário do hamster chinês EC50 Concentração resultando em 50 % de eficácia ou ligação ELISA Ensaio imunossorvente ligado à enzima FR Região de armação de anticorpo: as regiões variáveis da imunoglobulina excluindo as regiões CDR. HRP Peroxidase de rábano IFN Interferon IC50 concentração resultando em 50 % de inibição IgG Kabat Imunoglobulina G Um sistema de alinhamento e numeração de imunoglobulina para anticorpos humanos fundado por Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] mAb Anticorpo monoclonal (também Mab ou MAb) MES Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico MOA Mecanismo de ação NHS Soro humano normal PCR Reação da cadeia da polimerase PK Farmacocinéticas SEB Enterotoxina B de Staphylococcus TT Toxóide do tétano Região V O segmento de cadeias IgG humanas que é variável na sequência entre anticorpos diferentes. O mesmo se estende até o resíduo de Kabat 109 na cadeia leve e 113 na cadeia pesada. VH Região variável da cadeia pesada da imunoglobulina VK Região variável da cadeia leve capa da imunoglobulina

DEFINIÇÕES

[0070] De modo que a invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificamente definidos em outro lugar neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence.

[0071] Como aqui usado, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares de palavras tais como “um,” “uma,” e “o/a,” incluem as suas referências plurais correspondentes a menos que o contexto claramente dite de outro modo.

[0072] “Ativação” como o mesmo se aplica às células ou aos receptores refere-se à ativação ou tratamento de uma célula ou receptor com um ligante, a menos que de outro modo indicado pelo contexto ou explicitamente. “Ligante” abrange ligantes naturais ou sintéticos, por exemplo, citocinas, variantes de citocina, análogos, muteínas, e compostos de ligação derivados de anticorpos. “Ligante” também abrange moléculas pequenas, por exemplo, miméticos de peptídeo de citocinas e miméticos de peptídeo de anticorpos. “Ativação” pode se referir à ativação de célula como regulada pelos mecanismos internos assim como pelos fatores externos ou ambientais.

[0073] “Atividade” de uma molécula pode descrever ou se referir à ligação da molécula a um ligante ou a um receptor, à atividade catalítica; à capacidade para estimular a expressão de gene ou sinalização, diferenciação, ou maturação celulares; à atividade antigênica, à modulação de atividades de outras moléculas, e os semelhantes. “Atividade” de uma molécula também pode se referir à atividade na modulação ou manutenção das interações de célula para célula, por exemplo, adesão, ou atividade na manutenção de uma estrutura de uma célula, por exemplo, membranas celulares ou citoesqueleto. “Atividade” também pode significar atividade específica, por exemplo, [atividade catalítica]/[mg de proteína], ou [atividade imunológica]/[mg de proteína], concentração em um compartimento biológico, ou os semelhantes. “Atividade” pode se referir à modulação de componentes dos sistemas imunes inato ou adaptativo.

[0074] “Administração” e “tratamento,” como os mesmos se aplicam a um animal, por exemplo, um indivíduo, célula, tecido, órgão, ou fluído biológico experimentais caninos, referem-se ao contato de um agente farmacêutico, terapêutico, agente de diagnóstico, ou composição exógenos para o animal por exemplo, um indivíduo, célula, tecido, órgão, ou fluído biológico caninos. O tratamento de uma célula abrange o contato de um reagente com a célula, assim como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula.

[0075] “Administração” e “tratamento” também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composto de ligação, ou por uma outra célula.

[0076] O termo “indivíduo” inclui qualquer organismo, preferivelmente um animal, mais preferivelmente um mamífero (por exemplo, canino, felino, ou ser humano) e mais preferivelmente um canino.

[0077] Como aqui usado, o termo “felino” refere-se a qualquer membro da família Felidae. Os membros desta família incluem membros selvagens, de zoológico, e domésticos, tais como qualquer membro das subfamílias Felinae, por exemplo, gatos, leões, tigres, pumas, jaguares, leopardos, leopardos das neves, panteras, leões da montanha Norte Americanos, chitas, gato selvagem, linces, caracais ou qualquer cruzamento dos mesmos. Os gatos também incluem gatos domésticos, gatos de estimação de puro sangue e/ou mestiços, gatos de apresentação, gatos de laboratório, gatos clonados, e gatos selvagens ou feras.

[0078] Como aqui usado, uma “substituição de um resíduo de aminoácido” com um outro resíduo de aminoácido em uma sequência de aminoácido de um anticorpo por exemplo, é equivalente a “trocar um resíduo de aminoácido” com um outro resíduo de aminoácido e denota que um resíduo de aminoácido particular em uma posição específica na sequência de aminoácido foi trocado por (ou substituído por) um aminoácido diferente. Por exemplo, uma tal substituição (troca) é indicada como P4A de uma região Fc de uma sequência de aminoácido IgGB ou IgGC, caso em que, o resíduo de prolina na posição de aminoácido 4 da sequência de aminoácido da região Fc de uma IgGB ou a região Fc de uma IgGC foi substituído (trocado) no lugar de um resíduo de alanina.

[0079] Consequentemente, tais substituições podem ser particularmente planejadas isto é, intencionalmente trocar uma alanina com uma serina em uma posição específica na sequência de aminoácido por exemplo, pela tecnologia de DNA recombinante. Alternativamente, um resíduo de aminoácido particular ou fileira de resíduos de aminoácido de um anticorpo podem ser trocados por um ou mais resíduos de aminoácido através de mais processos de seleção natural por exemplo, com base na capacidade do anticorpo produzido por uma célula para se ligar a uma dada região neste antígeno, por exemplo, um contendo um epítopo ou uma porção do mesmo, e/ou ao anticorpo para compreender uma CDR particular que retém a mesma estrutura canônica como a CDR é trocada. Tais substituições/trocas podem levar às CDRs “variantes” e/ou anticorpos.

[0080] “Tratar” ou “tratando” significam administrar um agente terapêutico, tal como uma composição contendo qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção, interna ou externamente a um indivíduo ou paciente caninos tendo um ou mais sintomas de doença, ou sendo suspeitos de ter uma doença, para a qual o agente tem atividade terapêutica.

[0081] Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar e/ou melhorar um ou mais sintomas de doença no indivíduo ou população tratados, seja pela indução da regressão ou inibição da progressão de tal(is) sintoma(s) em qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também aludido como a “quantidade terapeuticamente eficaz”) pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, e peso do indivíduo (por exemplo, canino), e a capacidade da composição farmacêutica para evocar uma resposta desejada no indivíduo. Se um sintoma de doença foi aliviado ou melhorado pode ser avaliado em qualquer medição clínica tipicamente usada pelos veterinários ou outros provedores de cuidado de saúde habilitados para avaliar a situação de severidade ou progressão deste sintoma. Embora uma modalidade da presente invenção (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) possa não ser eficaz no alívio do(s) sintoma(s) de doença alvo(s) em todos os indivíduos, a mesma deve aliviar o(s) sintoma(s) de doença alvo(s) em uma quantidade estatisticamente significante de indivíduos como determinado em qualquer teste estatístico conhecido na técnica tal como o teste t de Student, O teste qui2, o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste Kruskal-Wallis (teste H), o teste de Jonckheere-Terpstra e o teste de Wilcoxon.

[0082] “Tratamento,” como o mesmo se aplica a um ser humano, indivíduo veterinário (por exemplo, canino) ou de pesquisa, refere-se ao tratamento terapêutico, assim como aplicações de pesquisa e diagnóstico. “Tratamento” como o mesmo se aplica a um ser humano, veterinário (por exemplo, canino), ou indivíduo, ou célula, tecido, ou órgão, de pesquisa abrange o contato dos anticorpos caninizados ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção com um canino ou outro indivíduo animal, uma célula, tecido, compartimento fisiológico, ou fluido fisiológico.

[0083] PD-1 canino foi descoberto compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114 [Pedido Provisório U.S. no. 61/918.946, depositado em 20 de dezembro de 2013, os conteúdos do qual são por meio deste aqui incorporado em suas totalidades]. Em uma modalidade específica PD-1 canino é codificado por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 113.

[0084] PD-L1 canino foi descoberto compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 120 [Pedido Provisório U.S. no. 61/918.946, depositado em 20 de dezembro de 2013, supra]. Em uma modalidade específica PD-L1 canino é codificado por uma sequência de nucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 119.

[0085] O termo “resposta imune” refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células que apresentam antígeno, células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta no dano seletivo para, destruição de, ou eliminação do corpo mamífero (por exemplo, corpo canino) de células cancerosas, células ou tecidos infectados com patógenos, ou patógenos invasores. Anticorpos Anti-Antígeno Canino Caninizado

[0086] Como aqui usado, o termo “canino” inclui todos os cães domésticos, Canis lupus familiaris ou Canis familiaris, a menos que de outro modo indicado.

[0087] Como aqui usado, um anticorpo é dito ligar-se especificamente a um polipeptídeo compreendendo uma dada sequência de antígeno (neste caso uma porção da sequência de aminoácido de um antígeno canino, por exemplo, PD-1 canino) se o mesmo se liga a polipeptídeos compreendendo esta porção da sequência de aminoácido de antígeno canino, por exemplo, PD-1 canino, mas não se liga a outras proteínas caninas que careçam desta porção da sequência de antígeno canino, por exemplo, PD-1 canino. Por exemplo, um anticorpo que especificamente se liga a um polipeptídeo compreendendo PD-1 canino pode se ligar a uma forma rotulada com FLAG® de PD-1 canino, mas não se ligará a outras proteínas caninas rotuladas com FLAG® com especificidade. Um anticorpo, ou composto de ligação derivados do sítio de ligação de antígeno de um anticorpo, se liga ao seu antígeno canino, ou uma variante ou muteína do mesmo, “com especificidade” quando o mesmo tem uma afinidade para este antígeno canino ou uma variante ou muteína do mesmo que seja pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes maior, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a sua afinidade para qualquer outro antígeno canino testado.

[0088] Como aqui usado, o termo “anticorpo” refere-se a qualquer forma de anticorpo que exiba a atividade biológica desejada. Assim, o mesmo é usado no sentido mais amplo e especificamente abrange, mas não é limitado aos, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos caninizados, anticorpos totalmente canino, anticorpos quiméricos e anticorpo de domínio único camelizados. “Anticorpos parentais” são anticorpos obtidos pela exposição de um sistema imune para um antígeno antes da modificação dos anticorpos para um uso pretendido, tais como caninização de um anticorpo para o uso como um anticorpo terapêutico canino.

[0089] Como aqui usado, a menos que de outro modo indicado, “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação de antígeno” referem-se aos fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, isto é fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade para ligar especificamente ao antígeno ligado pelo anticorpo de tamanho natural, por exemplo fragmentos que retêm uma ou mais regiões de CDR. Os exemplos de fragmentos de ligação de antígeno incluem, mas são não são limitados a, fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; anticorpos de moléculas de cadeia única, por exemplo, sc-Fv; nanocorpos e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[0090] Um “fragmento Fab” é compreendido de uma cadeia leve e as regiões CH1 e variável de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com uma outra molécula de cadeia pesada. Um “fragmento Fab” pode ser o produto de clivagem pela papaína de um anticorpo.

[0091] Uma região de “fragmento cristalizável” (“Fc”) contém dois fragmentos de cadeia pesada (isto é, dois polipeptídeos idênticos) compreendendo os domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações de dissulfeto e pelas interações hidrofóbicas dos domínios CH3. Na presente invenção, a sequência de aminoácido para cada um dos quatro fragmentos Fc de IgG canina está fundamentada na fronteira identificada dos domínios CH1 e CH2 como determinado por Tang et al. [Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259-270 (2001)].

[0092] Um “fragmento Fab’” contém uma cadeia leve e uma porção ou fragmento de uma cadeia pesada que contenha o domínio VH e o domínio CH1 e também a região entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeia pode ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab’ para formar uma molécula de F(ab’)2.

[0093] Um “fragmento F(ab’)2” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeia seja formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab’)2 assim é composto de dois fragmentos Fab’ que são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas. Um “fragmento F(ab’)2” pode ser o produto pela clivagem com pepsina de um anticorpo.

[0094] A “região Fv” compreende as regiões variáveis tanto da cadeia pesada quanto da leve, mas carece das regiões constantes.

[0095] O termo “Fv de cadeia única” ou anticorpo “scFv” refere-se aos fragmentos de anticorpo compreende os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo de Fv compreende adicionalmente um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. [Ver, Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113 Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994); WO 88/01649; e U.S. 4.946.778 e U.S. 5.260.203].

[0096] Como aqui usado, o termo “estrutura canônica” refere-se à conformação local que pode ser adotada em cada uma das regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo dentro da armação que elas residem. Para cada região hipervariável, existe um pequeno número de estruturas canônicas (geralmente denotadas por números inteiros simples tais como 1 ou 2, etc.), que podem ser prognosticadas com enorme precisão a partir das sequências de aminoácido da região hipervariável correspondente (particularmente dentro do contexto da sequência de aminoácido da sua armação, como fornecido abaixo para os domínios variáveis de murino anti- PD-1 canino caninizados correspondentes). Estas estruturas canônicas podem ser determinativas com respeito a se uma modificação da sequência de aminoácido de uma dada CDR resultará na retenção ou perda da capacidade para se ligar ao seu parceiro de ligação de antígeno [Ver, Chothia e Lesk, Canonical Structures for the hypervariable regiões of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987); Chothia et al., Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions, Nature, 34: 877-883(1989); e Al- Lazikani et al., Standard Conformations for the canonical structures of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997)].

[0097] Um “anticorpo de domínio” é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH são covalentemente unidas com um ligador de peptídeo para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente pode alvejar o mesmo ou antígenos diferentes.

[0098] Um “anticorpo bivalente” compreende dois sítios de ligação de antígeno. Em alguns casos, os dois sítios de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. Entretanto, os anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos (ver abaixo).

[0099] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos de domínio único camelizados. [Ver, por exemplo, Muyldermans et al., Trends Biochem. Sci. 26: 230 (2001); Reichmann et al., J. Immunol. Methods 231: 25 (1999); WO 94/04678; WO 94/25591; U.S. 6.005.079]. Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos de domínio único compreendendo dois domínios VH com modificações tais que os anticorpos de domínio único sejam formados.

[00100] Como aqui usado, o termo “diacorpos” refere-se a fragmentos pequenos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, fragmentos estes que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectados a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL ou VL-VH). Usando-se um ligador que seja muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. [Ver, EP 0 404 097 B1; WO 93/11161; e Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 64446448 (1993)]. Para uma revisão de variantes de anticorpo engenheiradas [geralmente ver Holliger e Hudson Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136 (2005)].

[00101] Tipicamente, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção retêm pelo menos 10 % da sua atividade de ligação de PD-1 canino (quando comparados com o anticorpo precursor) quando esta atividade é expressada em uma base molar. Preferivelmente, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção retêm pelo menos 20 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 100 % ou mais da afinidade de ligação do antígeno canino (por exemplo PD-1) como o anticorpo precursor. Também é intencionado que um anticorpo caninizado ou fragmento de ligação de antígeno da invenção possa incluir substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas (aludidas como “variantes conservativas” ou “variantes conservadas funcionais” do anticorpo) que não alteram substancialmente a sua atividade biológica.

[00102] “Anticorpo isolado” refere-se à situação de purificação e em tal contexto significa que a molécula é substancialmente livre de outras moléculas biológicas tais como ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, carboidratos, ou outro material tal como fragmentos celulares e meios de crescimento. Geralmente, o termo “isolado” não é intencionado a se referir a uma ausência completa de tal material ou a uma ausência de água, tampões, ou sais, a menos que estejam presentes em quantidades que substancialmente interfiram com o uso experimental ou terapêutico do composto de ligação como aqui descrito.

[00103] Como aqui usado, um “anticorpo quimérico” é um anticorpo tendo o domínio variável de um primeiro anticorpo e o domínio constante de um segundo anticorpo, onde o primeiro e segundo anticorpos são de espécies diferentes. [U.S. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]. Tipicamente os domínios variáveis são obtidos de um anticorpo de um animal experimental (o “anticorpo precursor”), tal como um roedor, e as sequências de domínio constante são obtidas dos anticorpos do animal objeto, por exemplo, canino de modo que o anticorpo quimérico resultante será menos provável de evocar uma resposta imune adversa em um indivíduo canino, do que o anticorpo precursor (por exemplo, roedor).

[00104] Como aqui usado, o termo “anticorpo caninizado” refere-se às formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos tanto caninos quanto não caninos (por exemplo, de murino). No geral, o anticorpo caninizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um e tipicamente, dois domínios variáveis em que todo ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não canina (por exemplo, compreende 6 CDRs de murino anti-PD-1 canino como exemplificado abaixo), e todas ou substancialmente todas das armações caninas.

[00105] O termo “anticorpo totalmente canino” refere-se a um anticorpo que compreendem apenas sequências de proteína da imunoglobulina canina. Um anticorpo totalmente canino pode conter cadeias de carboidrato de murino se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo, ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, “anticorpo de camundongo” refere-se a um anticorpo que compreendem apenas sequências da imunoglobulina de camundongo. Alternativamente, um anticorpo totalmente canino pode conter cadeias de carboidrato de rato se produzido em um rato, em uma célula de rato, ou em um hibridoma derivado de uma célula de rato. Similarmente, “anticorpo de rato” refere-se a um anticorpo que compreendem apenas sequências da imunoglobulina de rato.

[00106] As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação de anticorpo. Assim, no geral, um anticorpo intacto tem dois sítios de ligação. Exceto nos anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são, no geral, os mesmos.

[00107] Tipicamente, os domínios variáveis de cadeias tanto pesadas quanto leves compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinadoras de complementaridade (CDRs), localizadas dentro de regiões de matriz relativamente conservadas (FR). As CDRs são usualmente flanqueadas pelas regiões de armação, possibilitando a ligação a um epítopo específico. No geral, do terminal N para o terminal C, os domínios variáveis tanto de cadeia leve quanto pesada compreendem FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos para cada domínio para anticorpos humanos é, geralmente, de acordo com as definições de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5a ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32: 1-75 (1978); Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977); Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ou Chothia, et al., Nature 342: 878-883 (1989)].

[00108] Como aqui usado, o termo “região hipervariável” refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma “região determinadora de complementaridade” ou “CDR” (isto é CDRL1, CDRL2 e CDRL3 no domínio variável de cadeia leve e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 no domínio variável de cadeia pesada). [Ver Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), definindo as regiões de CDR de um anticorpo humano pela sequência; ver também Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) definindo as regiões de CDR de um anticorpo pela estrutura]. Como aqui usado, o termo resíduos de “armação” ou “FR” refere- se a aqueles resíduos de domínio variável outro que não os resíduos da região hipervariável aqui definidos como resíduos de CDR.

[00109] Como aqui usado o termo “armação canina” refere-se à sequência de aminoácido da cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo canino outro que não os resíduos da região hipervariável aqui definidos como resíduos da CDR. Em ambas as cadeias, as sequências de aminoácido das CDRs caninas nativas são trocadas com as CDRs estranhas correspondentes (por exemplo, aqueles de um anticorpo de camundongo). Opcionalmente as cadeias pesada e/ou leve do anticorpo canino podem conter alguns resíduos não CDR estranhos, por exemplo, de modo a preservar a conformação das CDRs estranhas dentro do anticorpo canino, e/ou para modificar a função Fc, como exemplificado abaixo.

[00110] Como aqui usado, um “anticorpo anti-PD-1 canino” refere-se a um anticorpo que foi incitado contra PD-1 canino (em um mamífero tal como um camundongo ou coelho) e que especificamente se liga ao PD-1 canino. Um anticorpo que “especificamente se liga a PD-1 canino,” ou um anticorpo que “especificamente se liga a um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 114”, é um anticorpo que exibe preferencialmente ligação ao PD-1 canino quando comparado a outros antígenos, por exemplo, liga PD-1 canino “com especificidade”. A ligação não requer especificidade de ligação absoluta. Um anticorpo anti-PD-1 canino é considerado “específico” para PD-1 canino se a sua ligação é determinativa da presença de PD-1 canino em uma amostra, ou se o mesmo é capaz de alterar a atividade de PD-1 canino sem interferir indevidamente com a atividade de outras moléculas em uma amostra canina, por exemplo, sem produzir resultados indesejados tais como falsos positivos em um contexto de diagnóstico ou efeitos colaterais em um contexto terapêutico. O grau de especificidade necessário para um anticorpo anti-PD-1 canino pode depender do uso pretendido do anticorpo, e em qualquer taxa é definido pela sua adequabilidade para o uso para um propósito pretendido.

[00111] Consequentemente a presente invenção fornece anticorpos caninizados anti-PD-1 canino ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo (incluindo na forma isolada) que liga PD-1 canino (por exemplo, com especificidade) e usos de tais anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Em modalidades específicas, as CDRs de murino anti-PD-1 canino de anticorpos de murino anti-PD-1 canino são fornecidas que foram mostrados tanto ligar PD-1 canino quanto bloquear a ligação de PD-1 canino a pelo menos um de seus ligantes, por exemplo, PD-L1 canino. Estas CDRs podem ser inseridas dentro de uma armação canina modificada da presente invenção para fabricar um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado, como aqui exemplificado.

[00112] Mais especificamente, um “anticorpo anti-PD-1 de murino caninizado” da presente invenção refere-se a um anticorpo que compreende as três CDRs de cadeia pesada e as três CDRs de cadeia leve de um anticorpo de murino anti-PD-1 canino junto com uma armação canina ou uma armação canina modificada. Uma armação canina modificada compreende uma ou mais mudanças de aminoácidos como aqui exemplificado que otimizem ainda a eficácia do anticorpo caninizado, por exemplo, para aumentar, reduzir, ou eliminar funções efetoras de anticorpo, para aumentar a sua ligação ao antígeno canino, por exemplo, PD-1 canino, e/ou aumentar a sua capacidade para bloquear a ligação do antígeno canino, por exemplo, PD-1 canino, ao seu parceiro de ligação natural, (por exemplo, PD-L1 canino no caso onde o antígeno é PD-1 canino).

[00113] “Homologia” refere-se à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeo ou entre duas sequências de polipeptídeo quando elas são otimamente alinhadas. Quando uma posição em ambas das duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade de monômero de aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nesta posição. A porcentagem de homologia é o número de posições homólogas compartilhadas pelas duas sequências dividido pelo número total de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições nas duas sequências são emparelhadas ou homólogas quando as sequências são otimamente alinhadas então as duas sequências são 60 % homólogas. Geralmente, a comparação é feita quando duas sequências são alinhadas para dar homologia percentual máxima.

[00114] “Molécula de ácido nucleico isolada” significa um DNA ou RNA de origem genômica, mRNA, cDNA, ou sintética ou alguma combinação das mesmas que não estejam associados com todo ou uma porção de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, ou estão ligados a um polinucleotídeo ao qual os mesmos não são ligados na natureza. Para o propósito desta descreveção, deve ser entendido que “uma molécula de ácido nucleico compreende” uma sequência de nucleotídeo particular não abrange cromossomas intactos. As moléculas de ácido nucleico isoladas “compreendendo” sequências de ácido nucleico específicas podem incluir, além das sequências especificadas, sequências codificadoras para até dez ou mesmo até vinte ou mais outras proteínas ou porções ou fragmentos das mesmas, ou podem incluir sequências reguladoras operavelmente ligadas que controlam a expressão da região codificadora das sequências de ácido nucleico citadas, e/ou podem incluir sequências de vetor.

[00115] A frase “sequências de controle” refere-se às sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificadora operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem uma sequência promotora, opcionalmente uma operadora, e um sítio de ligação de ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas usar promotores, sinais de poliadenilação, e realçadores.

[00116] Um ácido nucleico é “operavelmente ligado” quando o mesmo é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretor é operavelmente ligado ao DNA por um polipeptídeo se o mesmo for expressado como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou realçador são operavelmente ligados a uma sequência codificadora se os mesmos afetam a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossoma é operavelmente ligado a uma sequência codificadora se o mesmo é posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, “operavelmente ligado” significa que as sequências de DNA que são ligadas são contíguas, e, no caso de um secretor líder, contígua e na fase de leitura. Entretanto, os realçadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada pela ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou ligadores de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[00117] Como aqui usadas, as expressões “célula,” “linhagem de célula,” e “cultura de célula” são usadas intercambiavelmente e todas de tais designações incluem a progênie. Assim, as palavras “transformantes” e “células transformadas” incluem as célula individuais primárias e culturas derivadas das mesmas sem consideração quanto ao número de transferências. Também é entendido que nem toda a progênie terá teor de DNA precisamente idêntico, devido às mutações deliberadas ou acidentais. As progênies mutantes que tem a mesma função ou atividade biológica como triadas na célula originalmente transformada são incluídas. Onde designações distintas são intencionadas, as mesmas estarão evidentes a partir do contexto.

[00118] Como aqui usado, “sequência da linha germinativa” refere-se a uma sequência de sequências de DNA da imunoglobulina não rearranjada. Qualquer fonte adequada de sequências de imunoglobulina não rearranjadas pode ser usada. as sequências da linha germinativa humana pode ser obtida, por exemplo, das bases de dados de linha germinativa JOINSOLVER® no sítio da web para o National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health. As sequências da linha germinativa de camundongo podem ser obtidas, por exemplo, como descrito em Giudicelli et al. [Nucleic Acids Res. 33: D256- D261 (2005)]. Propriedades dos Anticorpos Caninizados

[00119] No canino, existem quatro cadeias pesadas de IgG aludidas como A, B, C, e D. Estas cadeia pesadas representam quatro subclasses diferentes de IgG de cão, que são aludidas como IgGA, IgGB, IgGC e IgGD. O DNA e sequências de aminoácido destas quatro cadeias pesadas foram primeiro identificados por Tang et al. [Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259270 (2001)]. As sequências de aminoácido e DNA para estas cadeias pesadas também estão disponíveis das bases de dados do GenBank. Por exemplo, a sequência de aminoácido da cadeia pesada de IgGA tem o número de acesso AAL35301.1, a de IgGB tem o número de acesso AAL35302.1, a de IgGC tem o número de acesso AAL35303.1, e a de IgGD tem o número de acesso (AAL35304.1). os anticorpos caninos também contêm dois tipos de cadeias leves, capa e lambda. O DNA e a sequência de aminoácido destas cadeias leves podem ser obtidos das bases de dados do GenBank. Por exemplo a sequência de aminoácido da cadeia leve capa tem o número de acesso ABY 57289.1 e a da cadeia leve lambda tem o número de acesso ABY 55569,1. Na presente invenção, a sequência de aminoácido para cada um dos quatro fragmentos Fc da IgG canina está fundamentada na fronteira identificada dos domínios CH1 e CH2 como determinado por Tang et al, supra.

[00120] O desenvolvimento de um anticorpo monoclonal terapêutico é um processo complexo que acarreta a coordenação de um conjunto complexo de atividades para gerar o anticorpo desejado. Estes incluem a otimização da especificidade, afinidade, atividade funcional, nível de expressão do anticorpo em linhagens de célula engenheiradas, estabilidade de longa duração, eliminação ou realce de funções efetoras e desenvolvimento de métodos de fabricação e purificação comercialmente viável. Considerando os objetivos da presente invenção e ao lado da capacidade para ativar as células dos sistemas imunes, um anticorpo monoclonal caninizado ou canino contra PD-1 canino otimamente tem três atributos adicionais: 1. falta de funções efetoras tais como citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), 2. meia-vida in vivo relativamente longa; e 3. ser facilmente purificado em uma escala grande usando tecnologias padrão industriais tais como aquelas com base na cromatografia com proteína A.

[00121] Nenhuma das subclasses de IgG canina que ocorrem naturalmente satisfazem todos estes critérios. Por exemplo, IgGB pode ser purificado usando proteína A, mas tem um nível alto de atividade de ADCC. IgGC também tem atividade de ADCC considerável. Por outro lado, IgGA se liga fracamente à proteína A, mas demonstra atividade de ADCC indesejável. Além disso, nem IgGC nem IgGD podem ser purificados em colunas de proteína A, embora IgGD não demonstre nenhuma atividade de ADCC. Adicionalmente IgGC tem meia-vida sérica curta visto que a mesma não se liga ao receptor de FcRn canino. A presente invenção supera esta dificuldade pelo fornecimento de anticorpos de IgG canina modificados específicos para antígenos caninos, por exemplo, PD-1 canino; tais anticorpos carecem das funções efetoras tais como ADCC e CDC, demonstram meia-vida relativamente longa, e podem ser facilmente purificados usando cromatografia com proteína A padrão industrial.

[00122] Até agora, IgGs caninas geneticamente modificadas que careceram das funções efetoras tanto de ADCC quanto de CDC e além disso, puderam ser purificadas pela cromatografia com proteína A não foram anteriormente descritas. Como aqui descrevedo, uma única substituição em uma posição na IgG canina que é análoga àquela da IgG de ser humano e camundongo, tal como N297A ou D265A, não elimina completamente as funções efetoras tanto de ADCC quanto de CDC no anticorpo canino correspondente. Por exemplo, embora cada uma das substituições N297 e D265 nos anticorpos de ser humano ou murino resultasse na anulação da ligação ao receptor Fcy e C1q, nenhuma das duas substituições sozinhas anulou completamente a ligação de anticorpos caninos ao C1q. Ao invés, como ainda descrevedo abaixo, de modo a eliminar tanto ADCC quanto CDC nos anticorpos caninos das subclasses IgGB ou IgGC, mostrou ser necessário fazer uma substituição dupla no Fc do anticorpo canino combinando tanto uma substituição de asparagina para alanina quanto uma de ácido aspártico para alanina. Além disso, de modo completamente inesperado, uma substituição que foi mostrada reduzir as funções efetoras nos anticorpos humanos de fato resultou em um aumento na ligação da IgG canina correspondente ao FcR e C1q.

[00123] De modo a gerar variantes de IgGB e IgGC caninas que carecem das funções efetoras, cadeias pesadas de IgGB canina modificada ou IgGC canina modificada podem ser geradas. Um total de sete resíduos de aminoácido que estão presentes em ambas destas regiões de fragmento cristalizável caninas (cFcs) foram identificados para tal substituição possível, Estes sete resíduos de aminoácido são: P4, D31, N63, G64, T65, A93, e P95 tanto para a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 quanto para Fc de IgGB canina; e a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 132 para a Fc de IgGC canina. Consequentemente, a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 difere daquela da SEQ ID NO: 130 por ter os resíduos de aminoácido nas posições: 4, 31, 63, 64, 65, 93, e 95, que são prolina (P), ácido aspártico (D), asparagina (N), glicina (G), treonina (T), alanina (A), e prolina (P), respectivamente, na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 como “X” (ou “Xaa” no código de três letras) para todas as sete posições, significando que estas sete posições de aminoácido podem ser qualquer um dos vinte aminoácidos naturais (ver a lista na coluna 1 da Tabela 1 abaixo). Similarmente, a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 difere daquela da SEQ ID NO: 132 por ter os resíduos de aminoácido nas posições 4, 31, 63, 64, 65, 93, e 95 sendo listados como “X” (ou “Xaa” no código de três letras) para todas as sete posições, significando que estas sete posições de aminoácido podem ser qualquer um dos vinte aminoácidos naturais. A sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 é codificada pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, ao passo que a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 é codificada pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3.

[00124] Em uma modalidade, a cFc compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 com as seguintes substituições P4(A, G, ou S), D31(A, G, ou S) N63(A, G, ou S), G64(A ou P), T65(A, G, ou S), A93(G ou S), e P95(A, G, ou S); em que P4 (A, G, ou S) significa que o resíduo de prolina na posição 4 é trocado por um resíduo de alanina, glicina, ou serina, e similarmente G64(P ou A) significa que o resíduo de glicina na posição 64 é trocado por uma prolina ou um resíduo de alanina, etc.). Em uma modalidade particular, o cFc compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130 com as seguintes substituições: P4A, D31A, N63A, G64P, T65A, A93G, e P95A.

[00125] Em uma modalidade relacionada, o cFc compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, que contém 7 aminoácidos designados como Xaa, com os seguintes resíduos de aminoácido: A4, A31, A63, G64, T65, G93, e A95, isto é, a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 132 com as seguintes cinco (5) mudanças de resíduo de aminoácido: P4A, D31A, N63A, A93G, e P95A e os dois resíduos de aminoácido remanescentes dos sete, G64 e T65, sendo retidos da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 132.

[00126] As sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, e SEQ ID NO: 66 todas contêm “X” (ou “Xaa” no código de três letras) nas sete posições de aminoácido, significando que estas sete posições de aminoácido podem ser qualquer um dos vinte aminoácidos naturais listados na coluna 1 da Tabela 1 abaixo. Notavelmente a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, e SEQ ID NO: 66 compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou aquela da SEQ ID NO: 4 dentro das suas respectivas sequências. Os exemplos específicos dos resíduos de aminoácido em uma ou mais destas sete posições das sequências de aminoácido são delineadas acima e abaixo, e são portanto incluídas dentro do gênero das sequências de aminoácido individuais das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, e SEQ ID NO: 66, assim como dentro dos anticorpos caninizados que compreendem estas sequências.

[00127] A Tabela 10 fornecida abaixo, especificamente correlaciona as sete posições de aminoácido que podem ser trocadas, como aqui descrevedo, da cIgGB Fc (SEQ ID NO: 130 e SEQ ID NO: 2) e da cIgGC Fc (SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 4) com aquelas das cadeias pesadas caninas de tamanho natural que compreendem estas sequências de aminoácido cFc, isto é, a SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, e SEQ ID NO: 66. Consequentemente, a posição real nas sequências IgGB ou IgGC de tamanho natural pode ser facilmente coordenada com aquela do cFc que a mesma compreende através do uso da Tabela 10 abaixo.

[00128] Em modalidades particulares, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 40, 52, 56, ou 64 compreende (i) P, A, G, ou S na posição 239, (ii) D, A, G, ou S na posição 266, (iii) N, A, G, ou S na posição 298, (iv) G, P, ou A na posição 299, (v) T, A, G, ou S na posição 300, (vi) A, G, ou S na posição 328, e (vii) P, A, G, ou S na posição 330. Em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 42, 54, 58, ou 66 compreende (i) P, A, G, ou S na posição 237, (ii) D, A, G, ou S na posição 264, (iii) N, A, G, ou S na posição 296, (iv) G, P, ou A na posição 297, (v) T, A, G, ou S na posição 298, (vi) A, G, ou S na posição 326, e (vii) P, A, G, ou S na posição 328. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 44, 50, ou 60 compreende (i) P, A, G, ou S na posição 244, (ii) D, A, G, ou S na posição 271, (iii) N, A, G, ou S na posição 303, (iv) G, P, ou A na posição 304, (v) T, A, G, ou S na posição 305, (vi) A, G, ou S na posição 333, e (vii) P, A, G, ou S na posição 335. Ainda em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 46 ou 62 compreende (i) P, A, G, ou S na posição 242, (ii) D, A, G, ou S na posição 269, (iii) N, A, G, ou S na posição 301, (iv) G, P, ou A na posição 302, (v) T, A, G, ou S na posição 303, (vi) A, G, ou S na posição 331, e (vii) P, A, G, ou S na posição 333. Já em outras modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 48 compreende (i) P, A, G, ou S na posição 246, (ii) D, A, G, ou S na posição 273, (iii) N, A, G, ou S na posição 305, (iv) G, P, ou A na posição 306, (v) T, A, G, ou S na posição 307, (vi) A, G, ou S na posição 335, e (vii) P, A, G, ou S na posição 337.

[00129] A presente invenção também fornece IgGDs caninas modificadas que compreendem uma região de articulação da IgGA, IgGB, ou IgGC no lugar da sua região de articulação de IgGD natural. Alternativamente, a região de articulação de IgGD pode ser geneticamente modificada trocando-se um resíduo de serina com um resíduo de prolina como mostrado na Tabela 5. Tais modificações podem levar a uma IgGD canino carecendo da troca de ramificação fab. As IgGDs caninas modificadas podem ser construídas usando métodos padrão da tecnologia de DNA recombinante [por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)]. De modo a construir estas variantes, os ácidos nucleicos codificando a sequência de aminoácido de IgGD canina podem ser modificados de modo que os mesmos codifiquem as IgGDs modificadas. As sequências de ácido nucleico modificadas são depois clonadas dentro dos plasmídeos de expressão para a expressão de proteína. Os ácidos nucleicos codificando os Fcs de IgGD canina com a região de articulação substituída são exemplificados pelas sequências de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 7, 9, e 11 que codificam as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 8, 10, e 12. Um ácido nucleico codificando um Fc de IgGD canina com uma região de articulação de IgGD modificada compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5 que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6.

[00130] A presente invenção fornece ainda cadeias pesadas caninas de tamanho natural que podem ser emparelhadas com cadeias leves correspondentes para fabricar um anticorpo caninizado. Consequentemente, a presente invenção fornece ainda anticorpos antigênicos de murino caninizados anticanino (incluindo anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 canino isolados) e métodos de uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo no tratamento de doença por exemplo, no tratamento de câncer em caninos.

[00131] Além disso, a presente invenção fornece anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 canino ou fragmentos de ligação de antígeno que se ligam a PD-1 canino e bloqueiam a ligação de PD-1 canino ao PD-L1 canino. Em certas modalidades os anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 canino compreendem um Fc de IgGB canina modificado, Fc de IgGC canina modificado, ou uma troca de ramificação fab que carece de IgGD canina modificada como aqui descrito.

[00132] O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que ligam o antígeno canino, por exemplo, PD-1 canino podem compreender uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis das regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) do anticorpo de murino anticanino como aqui descrito. A uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis CDRs podem ser independentemente selecionadas das sequências de CDR daquelas fornecidas abaixo. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que ligam PD-1 canino compreendem uma cadeia leve capa de anticorpo canino compreendendo uma CDR-1, CDR-2 e/ou CDR-3 de cadeia leve de murino e uma IgG de cadeia pesada de anticorpo canino compreendendo uma CDR-1, CDR-2 e/ou CDR-3 de cadeia pesada de murino. Consequentemente, a presente invenção fornece ainda cadeias pesadas caninas de tamanho natural que depois podem ser emparelhadas por exemplo, com as cadeias leves correspondentes para fabricar um anticorpo caninizado [ver a Tabela 2 abaixo, em que as sequências de sete conjuntos de CDRs de murino anti-PD-1 canino, por exemplo, 1B5, 2G9, 2H9, 3B6, 4D12, 5G5, e 7C9 são fornecidas].

[00133] Em outras modalidades, a invenção fornece anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo que ligam PD-1 com especificidade e têm cadeias leves capa de anticorpo canino compreendendo de uma a seis CDRs diferentes compreendendo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, e/ou 26 e IgG de cadeia pesada de anticorpo canino compreende de um a seis CDRs diferentes compreendendo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com as sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, e/ou 146, enquanto ainda exibem as propriedades de ligação e funcionais desejadas. Em uma outra modalidade o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da presente invenção compreendem uma armação canina compreendendo uma combinação de sequência de cadeia pesada de IgG com uma cadeia leve capa tendo uma ou mais das sequências de aminoácido de CDR mencionadas acima com 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas, enquanto ainda exibem as propriedades de ligação e funcionais desejadas.

[00134] A identidade de sequência refere-se ao grau ao qual os aminoácidos de dois polipeptídeos são os mesmos nas posições equivalentes quando as duas sequências são otimamente alinhadas. Como aqui usada uma sequência de aminoácido é 100 % “idêntica” a uma segunda sequência de aminoácido quando os resíduos de aminoácido de ambas as sequências são idênticos. Consequentemente, uma sequência de aminoácido é 50 % “idêntica” a uma segunda sequência de aminoácido quando 50 % dos resíduos de aminoácido das duas sequências de aminoácido são idênticos. A comparação de sequência é realizada em um bloco contíguo de resíduos de aminoácido compreendidos por uma dada proteína, por exemplo, uma proteína, ou uma porção do polipeptídeo que é comparado. Em uma modalidade particular, deleções ou inserções selecionados que de outro modo alterariam a correspondência entre as duas sequências de aminoácido são levadas em conta.

[00135] Similaridade de sequência inclui resíduos idênticos e não idênticos, aminoácidos bioquimicamente relacionados. Os aminoácidos bioquimicamente relacionados que compartilham propriedades similares e podem ser intercambiáveis são debatidos.

[00136] “Variantes conservativamente modificadas” ou “substituição conservativa” refere-se às substituições de aminoácidos em uma proteína com outros aminoácidos tendo características similares (por exemplo carga, tamanho de cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação e rigidez da cadeia principal, etc.), tal que as mudanças possam ser frequentemente feitas sem alterar a atividade biológica da proteína. Aqueles de habilidade nesta técnica reconhecem que, no geral, substituições de aminoácido únicas em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica [ver, por exemplo, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Ed.; 1987)]. Além disso, as substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente similares são menos prováveis de romper a atividade biológica. As substituições conservativas exemplares são apresentadas na Tabela 3 diretamente abaixo.TABELA 1 Substituições de Aminoácido Conservativas Exemplares

[00137] As variantes conservativas de função dos anticorpos da invenção também são consideradas pela presente invenção. “Variantes conservativas de função,” como aqui usado, refere-se aos anticorpos ou fragmentos em que um ou mais resíduos de aminoácido foram trocados sem alterar uma propriedade desejada, tal como uma afinidade e/ou especificidade de antígeno. Tais variantes incluem, mas não são limitadas à substituição de um aminoácido com um tendo propriedades similares, tais como as substituições de aminoácido conservativas da Tabela I acima.

Ácidos nucleicos

[00138] A presente invenção compreende adicionalmente os ácidos nucleicos codificando as cadeias de imunoglobulina de anticorpos de murino anti-PD-1 canino caninizados e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos aqui descrevedos (ver os Exemplos abaixo).

[00139] Também incluídos na presente invenção são os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de imunoglobulina compreendendo sequências de aminoácido que são pelo menos cerca de 70 % idênticas, preferivelmente pelo menos cerca de 80 % idênticas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % idênticas e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % idênticas (por exemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %) às sequências de aminoácido das CDRs e/ou cFcs caninos e/ou anticorpos aqui fornecidos quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para dar o emparelhamento maior entre as respectivas sequências no comprimento inteiro das respectivas sequências de referência. A presente invenção fornece ainda ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de imunoglobulina compreendendo sequências de aminoácido que são pelo menos cerca de 70 % similares, preferivelmente pelo menos cerca de 80 % similares, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % similares e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % similares (por exemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %) a qualquer uma das sequências de aminoácido de referência quando a comparação é realizada com um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para dar o maior emparelhamento entre as respectivas sequências no comprimento inteiro das respectivas sequências de referência.

[00140] Como aqui usado, a identidade percentual de sequência de nucleotídeo e aminoácido pode ser determinada usando C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) e o algoritmo Clustal W com os parâmetros default de alinhamento, e parâmetros de default para identidade. Estes programas comercialmente disponíveis também podem ser usados para determinar a similaridade de sequência usando os mesmos parâmetros de default ou análogos. Alternativamente, uma pesquisa Advanced Blast sob as condições de filtro de default pode ser usada, por exemplo, usando o programa pileup da GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Madison, Wisconsin) usando os parâmetros de default.

[00141] As seguintes referências dizem respeito a algoritmos BLAST frequentemente usados para a análise de sequência: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish, W., et al., Nature Genet. 3: 266-272 (1993); Madden, T. L., et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141(1996); Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997); Zhang, J., et al., Genome Res. 7: 649-656 (1997); Wootton, J. C., et al., Comput. Chem. 17: 149-163 (1993); Hancock, J. M. et al., Comput. Appl. Biosci. 10: 67-70 (1994); ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O., et al., “A model of evolutionary change in proteins.” em Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, (1978); Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R. M., et al., “Matrices for detecting distant relationships.” in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3.” (1978), M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358 (1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S. F., J. Mol. Biol. 219: 555-565 (1991); States, D. J., et al., Methods 3: 66-70 (1991); Henikoff, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992); Altschul, S. F., et al., J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993); ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990); Karlin, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 (1993); Dembo, A., et al., Ann. Prob. 22: 2022-2039 (1994); e Altschul, S. F. “Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.” em Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), pp. 1-14, Plenum, Nova Iorque (1997).

[00142] Esta presente invenção também fornece vetores de expressão compreendendo ácidos nucleicos (incluindo os ácidos nucleicos isolados) da invenção, em que o ácido nucleico é operavelmente ligado às sequências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor. Também são fornecidas células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão da presente invenção e métodos para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo aqui descrevedos compreendendo cultivar uma célula hospedeira que abriga um vetor de expressão codificando o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno no meio de cultura, e isolando o antígeno ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da célula hospedeira ou meio de cultura.

[00143] Um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado pode ser, por exemplo, produzido recombinantemente pelos métodos que são conhecidos no campo. As linhagens de célula de mamífero disponíveis como hospedeiros para a expressão dos anticorpos ou fragmentos aqui descrevedos são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de célula imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluem, inter alia, células do ovário do hamster chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células renais de hamster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células3T3, células HEK-293 e várias outras linhagens de célula. As células hospedeiras de mamífero incluem células de ser humano, camundongo, rato, cão, macaco, porco, cabra, bovino, cavalo e hamster. As linhagens de célula de preferência particular são selecionadas através da determinação de que as linhagens de célula têm altos níveis de expressão. Outras linhagens de célula que podem ser usadas são linhagens de célula de inseto, tais como células Sf9, células anfíbias, células bacterianas, células vegetais e células fúngicas. Quando vetores de expressão recombinantes codificando a cadeia pesada ou porção de ligação de antígeno ou fragmento da mesma, a cadeia leve e/ou fragmento de ligação de antígeno da mesma são introduzido dentro das células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas.

[00144] Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrão. Além disso, a expressão dos anticorpos da invenção (ou outras porções do mesmo) a partir das linhagens de célula de produção pode ser realçada usando-se várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão de gene da glutamina sintetase (o sistema GS) é um método comum para realçar a expressão sob certas condições. O sistema GS é debatido no todo ou parte em conexão com as Patentes Européias Nos. 0 216 846, 0 256 055, e 0 323 997 e Pedido de Patente Europeu No. 89303964.4.

[00145] No geral, as glicoproteínas produzidas em uma linhagem de célula ou animal transgênico particulares terão um padrão de glicosilação que é característico para as glicoproteínas produzidas na linhagem de célula ou animal transgênico. Portanto, o padrão de glicosilação particular de um anticorpo dependerá da linhagem de célula ou animal transgênico particulares usados para produzir o anticorpo. Entretanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucleico aqui fornecidas, ou compreendendo as sequências de aminoácido aqui fornecidas, compreendendo a presente invenção, independente do padrão de glicosilação que os anticorpos podem ter. Similarmente, em modalidades particulares, anticorpos com um padrão de glicosilação compreendendo apenas N-glicanos não fucosilados podem ser vantajosos, por que estes anticorpos foram mostrados tipicamente exibir eficácia mais potente do que as suas contrapartes fucosiladas tanto in vitro quanto in vivo [Ver por exemplo, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 34663473 (2003); Patentes U.S. Nos. 6.946.292 e 7.214.775].

[00146] A presente invenção inclui ainda fragmentos de anticorpo dos anticorpos de murino anti-PD-1 canino caninizados aqui descrevedos. Os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos F(ab)2, que podem ser produzidos pela clivagem enzimática de uma IgG, por exemplo, pela pepsina. Os fragmentos Fab podem ser produzidos, por exemplo, pela redução de F(ab)2 com ditiotreitol ou mercaptoetilamina. Um fragmento Fab é uma cadeia VL-CL anexada a uma cadeia VH-CH1 por uma ponte de dissulfeto. Um fragmento F(ab)2 é dois fragmentos Fab que, por sua vez, são anexados por duas pontes de dissulfeto. A porção Fab de uma molécula F(ab)2 inclui uma porção da região Fc entre as quais pontes de dissulfeto estão localizadas. Um fragmento FV é uma região VL ou VH.

[00147] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante canina, tal como a região constante de cadeia pesada canina de IgGA, IgGB, IgGC e IgGD ou uma variante da mesma. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma região constante de cadeia leve, por exemplo, uma região constante de cadeia leve canina, tal como região de cadeia leve canina lambda ou capa ou variante das mesmas. Por via de exemplo, e não de limitação, a região constante de cadeia pesada canina pode ser de IgGB e a região constante de cadeia leve canina pode ser de capa.

Engenheiramento de Anticorpo

[00148] Anticorpos de murino caninizados anti-PD-1 canino da presente invenção podem ser engenheirados para incluir modificações na armação canina de um anticorpo monoclonal precursor (isto é, canino), por exemplo para melhorar as propriedades do anticorpo, como detalhado abaixo.

[00149] Os anticorpos bloqueadores cruzados caninizados e fragmentos de ligação de antígenos dos mesmos aqui debatidos podem ser identificados com base na sua capacidade para competir cruzado com qualquer um de IB5, 3B6, 4D12, 7C9, 2H9, 5G5, e/ou 2G9 nos ensaios de ligação padrão (por exemplo, BIACore®, ELISA, como exemplificado abaixo, ou citometria de fluxo). Por exemplo, ensaios de ELISA padrão podem ser usados em que uma proteína de PD-1 canino recombinante é imobilizada na placa, um dos anticorpos é fluorescentemente rotulado e a capacidade de anticorpos não rotulados para competir com a ligação do anticorpo rotulado é avaliada. Adicional ou alternativamente, a análise BIAcore® pode ser usada para avaliar a capacidade dos anticorpos para competir cruzado. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação, por exemplo, de IB5, 3B6, 4D12, 7C9, 2H9, 5G5, e/ou 2G9, ao PD-1 canino demonstra que o anticorpo de teste pode competir com IB5, 3B6, 4D12, 7C9, 2H9, 5G5, e/ou 2G9 quanto à ligação ao PD-1 canino e assim, pode, em alguns casos, se ligar ao mesmo epítopo no PD-1 canino como IB5, 3B6, 4D12, 7C9, 2H9, 5G5, e/ou 2G9. Como estabelecido acima, anticorpos e fragmentos que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer um dos anticorpos anti-PD-1 canino ou fragmentos da presente invenção também formam parte da presente invenção. Composições Farmacêuticas e Administração

[00150] Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis de um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo eles podem ser misturados com um carregador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. [Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)].

[00151] As formulações de terapêuticas e agentes de diagnóstico podem ser preparadas misturando-se com carregadores, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis na forma, por exemplo, de pós liofilizáveis, pastas fluidas, soluções ou suspensões aquosas [ver, por exemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nova Iorque, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, Nova Iorque, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner e Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, NY]. Em uma modalidade, anticorpos anti- PD-1 da presente invenção são diluídos a uma concentração apropriada em uma solução de acetato de sódio pH 5 a 6, e NaCl ou sacarose são adicionados para tonicidade. Os agentes adicionais, tais como polissorbato 20 ou polissorbato 80, podem ser adicionados para realçar a estabilidade.

[00152] A toxicidade e eficácia terapêutica das composições de anticorpo, administradas sozinhas ou em combinação com um outro agente, podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão nas culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50 % da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A razão de dose entre efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico (LD50/ED50). Em aspectos particulares, os anticorpos que exibem altos índices terapêuticos são desejáveis. Os dados obtidas destes ensaios de cultura de célula e estudos de animal podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para o uso em caninos. A dosagem de tais compostos reside preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração.

[00153] O modo de administração pode variar. As vias adequadas de administração incluem oral, retal, transmucósica, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutânea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inalação, insuflação, tópica, cutânea, transdérmica, ou intraarterial.

[00154] Em modalidades particulares, o anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo podem ser administrados por uma via invasiva tal como pela injeção. Em outras modalidades da invenção, um anticorpo de murino anti-PD-1 canino ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou composição farmacêutica do mesmo, são administrados intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraarterial, intratumoralmente, ou por inalação, liberação por aerossol. A administração pelas vias não invasivas (por exemplo, oralmente; por exemplo, em uma pílula, cápsula ou tablete) também está dentro do escopo da presente invenção.

[00155] As composições farmacêuticas aqui descrevedas também podem ser administradas por infusão. Os exemplos de formas de implantes e módulos bem conhecidos de administrar composições farmacêuticas incluem: Patente U.S. No. 4.487.603, que descreve uma bomba de microinfusão implantável para dispensar medicação em uma taxa controlada; Patente U.S. No. 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão de medicamento para liberar medicação em uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. No. 4.447.224, que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a liberação de droga contínua; Patente U.S. No. 4.439.196, que descreve um sistema osmótico de liberação de droga tendo compartimentos de câmara múltipla. Muitos outros de tais implantes, sistemas de liberação, e módulos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00156] Alternadamente, pode-se administrar um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado em um local ao invés de na maneira sistêmica, por exemplo, via injeção do anticorpo diretamente em uma junta artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizadas por imunopatologia, frequentemente em um depósito ou formulação de liberação prolongada. Além disso, pode-se administrar o anticorpo em um sistema de liberação de droga alvejado, por exemplo, em um lipossoma revestido com um anticorpo específico de tecido, alvejando, por exemplo, junta artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizadas por imunopatologia. Os lipossomas serão alvejados para e absorvidos seletivamente pelo tecido afligido.

[00157] O regime de administração depende de vários fatores, incluindo o a taxa de metabolização no soro ou tecido do anticorpo terapêutico, o nível de sintomas, a imunogenicidade do anticorpo terapêutico, e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Preferivelmente, o regime de administração libera anticorpo terapêutico suficiente para efetuar a melhora no estado de doença alvo, enquanto simultaneamente minimiza os efeitos colaterais indesejados. Consequentemente, a quantidade de produto biológico liberado depende em parte do anticorpo terapêutico particular e da severidade da condição que é tratada. A orientação na seleção das doses apropriadas de anticorpos terapêutico está disponível [ver, por exemplo, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK (1996); Kresina (ed.) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nova Iorque, NY (1991); Bach (ed.) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nova Iorque, NY (1993); Baert, et al. New Engl. J. Med. 348:601-608 (2003); Milgrom et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon et al. New Engl. J. Med. 344: 783-792 (2001); Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med. 342: 613-619 (2000); Ghosh et al. New Engl. J. Med. 348: 24-32 (2003); Lipsky et al. New Engl. J. Med. 343: 1594-1602 (2000)].

[00158] A determinação da dose apropriada é feita pelo veterinário, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica afetar o tratamento. Geralmente, as dose começam com uma quantidade um pouco menor do que a dose ótima e é aumentada em incrementos pequenos depois disso até que o efeito desejado ou ótimo seja obtido em relação a qualquer um dos efeitos colaterais negativos. Medidas de diagnóstico importantes incluem aquelas do sintomas, por exemplo, da inflamação ou nível de citocinas inflamatórias produzidas.

[00159] Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos aqui descrevedos podem ser fornecidos pela infusão contínua, ou por doses administradas, por exemplo, diariamente, 1 a 7 vezes por semana, semanal, bissemanal, mensal, bimensal, trimestral, semianual, anualmente, etc. As doses podem ser fornecidas, por exemplo, intravenosa, subcutânea, tópica, oral, nasal, retal, intramuscular, intracerebral, intraespinhalmente, ou por inalação. Uma dose semanal total é geralmente de pelo menos 0,05 μg/kg de peso corporal, mais geralmente pelo menos 0,2 μg/kg, 0,5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg ou mais [ver, por exemplo, Yang, et al. New Engl. J. Med. 349: 427-434 (2003); Herold, et al. New Engl. J. Med. 346: 1692-1698 (2002); Liu, et al. J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456 (1999); Portielji, et al. Cancer Immunol. Immunother. 52: 133-144 (2003)]. As doses também podem ser fornecidas para se alcançar uma concentração alvo predeterminada de um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado no soro do indivíduo, tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/ml ou mais. Em outras modalidades, um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado da presente invenção é administrado subcutânea ou intravenosamente, em uma base semanal, bissemanalmente, “a cada 4 semanas,” mensal, bimensal, ou trimestralmente a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 2500 mg/indivíduo.

[00160] Como aqui usado, “inibir” ou “tratar” ou “tratamento” incluem uma prorrogação do desenvolvimento dos sintomas associados com um distúrbio e/ou uma redução na severidade dos sintomas de tais distúrbios. Os termos incluem ainda melhorar sintomas não controlados ou indesejados existentes, prevenir sintomas adicionais, e melhorar ou prevenir as causas subjacente de tais sintomas. Assim, os termos denotam que um resultado benéfico foi conferido em um indivíduo vertebrado com um distúrbio, doença ou sintoma, ou com o potencial para desenvolver um tal distúrbio, doença ou sintoma.

[00161] Como aqui usado, os termos “quantidade terapeuticamente eficaz”, “dose terapeuticamente eficaz” e “quantidade eficaz” se referem a uma quantidade de um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção que, quando administrado sozinho ou em combinação com um agente terapêutico adicional a uma célula, tecido, ou indivíduo, é eficaz para causar uma melhora mensurável em um ou mais sintomas de uma doença ou condição ou a progressão de tal doença ou condição. Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se ainda àquela quantidade do composto de ligação suficiente para resultar em melhora pelo menos parcial dos sintomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhora da condição médica relevante, ou um aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção ou melhora de tais condições. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual administrado sozinho, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a aquele ingrediente sozinho. Quando aplicado a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se às quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrado em combinação, em série ou simultaneamente. Uma quantidade eficaz de um produto terapêutico resultará em uma melhora de uma medida ou parâmetro de diagnóstico em pelo menos 10 %; usualmente em pelo menos 20 %; preferivelmente pelo menos cerca de 30 %; mais preferivelmente pelo menos 40 %, e o mais preferivelmente em pelo menos 50 %. Uma quantidade eficaz também pode resultar em uma melhora em uma medida individual em casos onde medidas subjetivas são usadas para avaliar a severidade da doença. Outras Terapias de Combinação

[00162] Como anteriormente descrito, um anticorpo de murino anti- PD-1 canino caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo podem ser coadministrados com um ou mais outros agentes terapêuticos (tais como um agente quimioterapêutico). O anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separadamente do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou concorrentemente com o agente ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas. Kits

[00163] Além disso são fornecidos kits compreendendo um ou mais componentes que incluem, mas não são limitados a, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, como aqui debatidos, que especificamente ligam PD-1 (por exemplo, um anticorpo de murino anti-PD-1 canino caninizado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo) em associação com um ou mais componentes adicionais incluindo, mas não limitados a um carregador farmaceuticamente aceitáveis e/ou um agente quimioterapêutico, como aqui debatido. A composição de ligação e/ou o agente quimioterapêutico podem ser formulados como uma composição pura ou em combinação com um carregador farmaceuticamente aceitável, em uma composição farmacêutica.

[00164] Em uma modalidade, o kit inclui uma composição de ligação da presente invenção (por exemplo, um de murino caninizado anti-PD-1 canino ou uma composição farmacêutica do mesmo em um recipiente (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico) e uma composição farmacêutica do mesmo e/ou um agente quimioterapêutico em um outro recipiente (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico).

[00165] Se o kit inclui uma composição farmacêutica para a administração parenteral a um indivíduo, o kit também pode incluir um dispositivo para realizar tal administração. Por exemplo, o kit pode incluir uma ou mais agulhas hipodérmicas ou outros dispositivos de injeção como debatido acima. O kit também pode incluir um inserto de embalagem incluindo informação concernente às composições farmacêuticas e formas de dosagem no kit. Geralmente, tal informação ajuda os proprietários de animais de estimação e veterinários no uso das composições farmacêuticas e formas dosagem incluídas de modo eficaz e com segurança. Por exemplo, as seguintes informações com respeito a uma combinação da invenção podem ser fornecidas no inserto: farmacocinéticas, farmacodinâmicas, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, advertências, precauções, reações adversas, dosagem excessiva, dosagem e administração apropriadas, como fornecido, condições de armazenagem apropriadas, referências, informação do fabricante/distribuidor e informação de patente.

[00166] Como uma questão de conveniência, um anticorpo ou agente de ligação específica aqui descrevedos podem ser fornecido em um kit, isto é, uma combinação embalada dos reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar os ensaios de diagnóstico ou detecção. Onde o anticorpo é rotulado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofatores requeridos pela enzima (por exemplo, um substrato precursor que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectáveis). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão bloqueador ou tampão de lise) e os semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas amplamente para fornecer concentrações na solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que na dissolução fornecerão uma solução reagente tendo a concentração apropriada.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PD-1 E PD-L1 CANINOS PD-1 e PD-L1 caninos:

[00167] Pedido Provisório U.S. no. 61/918.946, depositado em 20 de dezembro de 2013, por meio deste incorporado por referência nas suas totalidades, fornece: a sequência de nucleotídeo de tamanho natural para PD-1 canino (cPD-1) da SEQ ID NO: 113 [SEQ ID NO: 133 inclui a sequência de sinal]; a sequência de aminoácido traduzida correspondente da SEQ ID NO: 114 [SEQ ID NO: 134 inclui a sequência de sinal]; a sequência de nucleotídeo codificando o domínio extracelular (ECD) de PD-1 canino, SEQ ID NO: 115; a sequência de aminoácido da ECD de PD-1 canino, SEQ ID NO: 116; a sequência de nucleotídeo da ECD de PD-1 canino mais um ligador GT e a parte Fc do gene Fc da IgG1 humana, da SEQ ID NO: 117; e a sequência de aminoácido da ECD de PD-1 canino mais um ligador GT e a parte Fc do gene Fc da IgG1 humana, SEQ ID NO: 118 [SEQ ID NO: 137 inclui a sequência de sinal].

[00168] O Pedido Provisório U.S. no. 61/918.946 fornece ainda: a sequência de nucleotídeo de tamanho natural para PD-L1 canino (cPD-L1) da SEQ ID NO: 119 [SEQ ID NO: 135 inclui a sequência de sinal]; a sequência de aminoácido traduzida correspondente da SEQ ID NO: 120 [SEQ ID NO: 136 inclui a sequência de sinal]; a sequência de nucleotídeo codificando o domínio extracelular (ECD) de PD-L1 canino, SEQ ID NO: 121; a sequência de aminoácido da ECD de PD-L1 canino, SEQ ID NO: 122; a sequência de nucleotídeo da ECD de PD-L1 canino mais um ligador GT e a parte Fc do gene Fc da IgG1 humana, SEQ ID NO: 123; e a sequência de aminoácido da ECD de PD-L1 canino mais um ligador GT e a parte Fc do gene Fc da IgG1 humana, SEQ ID NO: 124.

EXEMPLO 2 ANTICORPOS DE MURINO ANTI-PD-1 CANINOS Geração de anticorpos monoclonais anti-PD1 canino:

[00169] Um total de três camundongos Balb/c foram imunizados múltiplas vezes (com 10 μg de cada vez) em um período de 17 dias. O antígeno imunizador foi a proteína de fusão ECD-Fc de PD-1 canino. A seguir da imunização, o soro foi coletado de cada camundongo e testado quanto à reatividade com a proteína rotulada com ECD-HIS de PD-1 canino. As células do baço do camundongo com o título de ECD-HIS anti-PD-1 sérico mais alto foram fundidas à linhagem de célula P3X63Ag8.653 de mieloma. Aproximadamente 2 semanas a seguir da fusão, o sobrenadante das células de hibridoma putativas foi testado pelo ELISA quanto à sua reatividade à proteína rotulada com ECD-HIS de PD-1. Os hibridomas que produzem sinais positivos fortes no ELISA foram subclonados pele diluição limitante e testado mais uma vez quanto à reatividade com a proteína rotulada com ECD-HIS de PD-1 canino.

Confirmação da reatividade de anticorpos monoclonais contra PD-1 canino:

[00170] A reatividade dos anticorpos secretados pelos hibridomas ao ECD de PD-1 canino foi confirmada pelo ELISA. As células de hibridoma foram cultivadas usando biorreatores CELLine (Integra-biosciences) durante 10 a 30 dias. As células foram inicialmente mantidas em DMEM suplementado com 4 mM de L-glutamina e 10 % de soro fetal bovino (FBS) com IgG Ultra Baixo da Gibco. As células de hibridoma foram semeadas em câmaras de célula do biorreator CELLine com uma densidade de célula de aproximadamente 2 x 106 células/ml em 15 ml do mesmo meio com a concentração de FBS aumentada para 20 %. A câmara externa foi enchida com 1 L de meio nutriente (DMEM com 4 mM de L-glutamina e 2 % de FBS padrão). As células de hibridoma na câmara de célula foram expandidas até aproximadamente 2,5 x 107 células/ml em 3 a 7 dias. Depois, 10 ml de suspensão de célula foram colhidos da câmara de célula e trocados com meios frescos para permitir a re-expansão das células e colheitas subsequentes. Este procedimento foi repetido como necessário para se obter quantidades adequadas de mAb de cada clone de hibridoma. As suspensões de célula colhidas foram centrifugadas e os sobrenadantes foram filtrados através das membranas de filtração de 0,2 mícron. Para a purificação de anticorpo, cada sobrenadante do clone foi purificado usando uma coluna de 5 ml de fluxo rápido de Proteína G Sepharose 4 (GE Healthcare) pelo fluxo por gravidade. Depois de lavar com tampão Tris-EDTA (TE) pH 8,0, os anticorpos ligados foram eluídos usando tampão de glicina 0,1 M, pH 2,7, seguido pela neutralização de pH usando Tris 1 M, pH 8,0. Os anticorpos foram concentrados e o tampão trocado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) usando unidades de filtração centrífuga Centriprep YM-10,10 kDa NMWL (Millipore). As concentrações de anticorpo foram quantificadas usando espectrofotometria.

[00171] mAbs anti-PD-1 canino purificados foram testados quanto à reatividade com o domínio ECD rotulado com HIS de PD-1 canino pelo ELISA como segue: a proteína ECD de PD-1 canino rotulada com HIS é diluída a 10 μg/ml em tampão de revestimento (Carbonato/Bicarbonato pH 9,0) e dispensada a 100 μl/poço em placas de ELISA de fundo chato de 96 poços (NUNC). As placas são incubadas a 4 °C durante a noite. As placas são depois lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,05 % de Tween-20 (PBST). Em seguida, 200 μl de tampão de bloqueio (5 % de leite desnatado em PBST) são adicionados a cada poço e as placas são incubadas a 37 °C por 60 minutos. As placas são depois lavadas três vezes com PBST. Em seguida, 100 μl de mAbs de teste diluídos no tampão de bloqueio são adicionados aos primeiros poços das colunas apropriadas. Os mAbs de teste são depois diluídos duas vezes para a posição de placa apropriada. A seguir da incubação das placas a 37 °C por 60 minutos, as placas são lavadas três vezes com PBST. Em seguida, 100 μl por poço de uma diluição 1:2.000 de uma IgG de cabra anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano (KPL) são adicionados às placas, que são depois incubados a 37 °C por 60 minutos. Depois as placas são lavadas três vezes com PBST, e 100 μl/poço de substrato de 3,3’,5,5’ tetrametil benzidina, (TMB) (de KPL) é adicionado às placas. A reação de cor é deixada desenvolver por 5 a 20 minutos a 37 °C antes de medir a absorbância a 650 nm.

Células CHO que expressam proteína de PD-1 canino:

[00172] O gene de PD-1 canino de tamanho natural foi clonado no plasmídeo p96793. Neste plasmídeo a expressão da proteína PD-1 é dirigida por um promotor hCMV. As células CHO DXB11 (dhfr-) foram mantidas em MEM-alfa (Gibco) suplementado com 10 % de soro bovino fetal. A transfecção de células CHO com plasmídeo p96793 foi realizada em frascos de 75 cm2 contendo aproximadamente 6 x 106 células pela liberação de gene mediada por lipossoma usando Lipofectamina (Invitrogen). Depois de 48 horas, as células foram passadas em meio MEM-alpha sem nucleosídeos, suplementado com 10 % de FBS e 400 μg/ml de higromicina B (meio seletivo). A clonagem limitada pela diluição foi realizada na reunião de células dhfr+, resistentes à higromicina. Os clones foram avaliados quanto à expressão de PD-1 canino pelo ensaio de imunofluorescência. Em resumo, as monocamadas de célula foram fixadas em placas de 96 poços com 80 % de acetona. As monocamadas de célula fixas e secas foram depois incubadas por 1 hora com um anticorpo de cabra anti-PD-1 humano policlonal (R&D Systems). As placas foram lavadas com PBS, depois incubadas por 1 hora com um anticorpo IgG de coelho anticabra rotulado com fluoresceína (KPL). As placas foram lavadas com PBS. Os clones exibindo fluorescência foram expandidas e os estoques de célula foram estabelecidos.

Reatividade de mAbs de camundongo contra proteínas de PD-1 canino expressadas nas células CHO:

[00173] A reatividade de mAbs de camundongo anti-PD-1 canino com PD-1 canino nas células CHO foi determinada por um ensaio com base em célula usando células CHO que expressam PD-1. Em resumo, as células CHO que expressam PD-1 canino foram cultivadas de 80 a 100 % de confluência em 50 μl de meio (DMEM/HAM’s F12, 10 % de FBS). Em seguida, 50 μl de meio contendo várias concentrações de mAbs purificados foram adicionados durante 1 hora a 37 °C. A seguir de três lavagens com PBS-Tween, 100 μl de peroxidase de rábano de cabra anticamundongo (HRP) diluídos 1:1000 em meio de cultura foi adicionado durante uma hora a 37 °C. Depois de três lavagens adicionais com PBS-Tween, mAbs ligados foram visualizados com um substrato de peroxidase (TMB). O aumento da absorbância devido à atividade de peroxidase a 450 nm foi medida em uma leitora de microplaca.

Caracterização de anticorpos de camundongo anti-PD-1 canino:

[00174] Como detalhado acima, assim como no Pedido Provisório U.S. no. 61/918.946, depositado em 20 de dezembro de 2013, por meio deste incorporado por referência em suas totalidades, os anticorpos de camundongo anti-PD-1 canino foram caracterizados por vários parâmetros incluindo: a sua reatividade com a ECD de PD-1 canino pelo ELISA, a sua reatividade com PD-1 expressado na superfície de células CHO, a sua capacidade para bloquear a ligação de PD-1 com PD-L1, e a sua capacidade para se ligar às células PBMC de cães saudáveis e cães com câncer. As sequências de aminoácido das CDRs dos sete anticorpos de camundongo anti-PD-1 canino selecionados (indicados como IB5, 2G9, 2H9, 3B6, 4D12, 5G5, e 7C9, respectivamente) tiveram homologia substancial como demonstrado na Tabela 2 abaixo.TABELA 2

EXEMPLO 3 CANINIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS CANINIZADOS

[00175] De modo a produzir anticorpos caninizados foi necessário identificar a sequência de DNA codificando as cadeias pesada e leves da IgG canina. As sequências de nucleotídeo e aminoácido da cadeia pesada canina podem ser obtidas das bases de gene e proteína NCBI. Existem quatro subclasses de IgG conhecidas de IgG canina: IgGA, IgGB, IgGC, e IgGD e dois tipos de cadeias leves: capa e lambda. A Tabela 7 lista as SEQ ID NOs de aminoácido e nucleotídeo dos fragmentos Fc caninos não modificados.

[00176] Sem estar ligado em nenhum método específico, o processo de produzir variantes de anticorpos monoclonais anti-PD-1 com vários conteúdos de sequências de canino e camundongo envolvidos no seguinte esquema geral: i) Determinar a sequência de nucleotídeo das cadeias VH e VL de mAbs de camundongo; ii) Identificar as CDRs de cadeias H e L de mAbs de camundongo; iii) Identificar uma cadeia H e L adequadas de IgG canina; iv) Determinar a sequência de nucleotídeo das cadeias H e L da IgG canina; v) Substituir a sequência de nucleotídeo codificando as CDRs de cadeias H e L caninas endógenas com as sequências de nucleotídeo codificando as respectivas CDRs de camundongo. Também, opcionalmente substituir alguns resíduos da armação canina com resíduos selecionados das regiões de armação de camundongo; vi) Sintetizar o nucleotídeo da etapa (v) e inserí-lo dentro de um plasmídeo de expressão adequado; Transfectar os plasmídeos dentro de células apropriadas, por exemplo, células HEK 293; vii) Purificar o anticorpo expressado do sobrenadante da HEK 293; e viii) Testar o anticorpo purificado quanto à ligação ao PD-1 canino.

[00177] Um conjunto de experimentos foi conduzido seguindo as etapas acima que resultaram em um conjunto de anticorpos caninizados variantes com vários conteúdos de sequências caninas e de camundongo.

Reatividade de mAbs caninizados contra proteínas de PD-1 canino expressadas nas células CHO:

[00178] A reatividade de mAbs anti-PD-1 canino caninizados com PD- 1 canino nas células CHO foi determinada por um ensaio com base em célula usando células CHO que expressam PD-1 canino. Em resumo, as células CHO que expressam PD-1 canino foram cultivadas de 80 a 100 % de confluência em 50 μl de meio (DMEM/HAM’s F12, 10 % de FBS). Em seguida, 50 μl de meio contendo várias concentrações de mAbs purificados foram adicionados por 1 hora a 37 °C. A seguir de três lavagens com PBS- Tween, 100 μl de anticorpo de cabra anti-cão rotulado com peroxidase de rábano diluído 1:1000 em meio de cultura foram adicionados por uma hora a 37 °C. Depois de três lavagens adicionais com PBS-Tween, os mAbs ligados foram visualizados com um substrato de perioxidase (TMB). O aumento da absorbância devido à atividade da peroxidase a 450 nm foi medido em uma leitora de microplaca.

Estudos de ligação de mAbs de camundongo anti-PD-1 canino e mAbs de camundongo caninizado anti-PD-1 canino com PD-1 canino

[00179] Aproximadamente 70 unidades de ressonância (RU) do antígeno de PD-1 canino foram imobilizadas diretamente pela ligação de amina. As medições de afinidade foram feitas via tecnologia com base na ressonância de plásmon de superfície livre de rótulo (por exemplo, Biacore® T200) com um tempo de associação de 300 segundos, um tempo de dissociação de 1200 segundos, e nas concentrações de 50, 100, 200 (x2) 400, e 800 nanomolar (nM). Um modelo de ajuste de ligação 1:1 foi usado. O antígeno (PD-1 canino) foi imobilizado no chip sensor através da ligação de amina e os quatro anticorpos como indicados na Tabela 5 abaixo, foram usados como análitos que fluíram através da superfície de antígeno. Os resultados demonstraram que as afinidades de ligação dos anticorpos anti-PD- 1 canino da presente invenção para o antígeno de PD-1 canino foram fortes, tendo constantes de dissociação nanomolares e mesmo subnanomolares (Kd). Além disso, o anticorpo monoclonal de camundongo anti-PD-1 canino e o anticorpo monoclonal de camundongo caninizado anti-PD-1 canino correspondente do mesmo clone produziram valores de Kd visivelmente similares (ver a Tabela 14 abaixo).TABELA 14 Deteminações de Constante de Ligação

Bloqueio de ligante , pelos mAbs anti-PD1 canino caninizados:

[00180] Para anticorpos caninizados que reagem com PD-1 canino (cPD-1), um ensaio de ELISA com base em célula (CELISA) foi usado que está fundamentado na linhagem de célula CHO expressando PD-1 canino. Em resumo, células CHO cPD-1 foram colocadas em placas de 96 poços a 4 x 104 células por poço e as células foram incubadas a 37 °C por 18 a 24 horas até que elas fossem de 95 a 100 % confluentes. O meio de cultura de célula foi aspirado, as placas foram lavadas 3x com PBS mais 0,05 % de Tween® 20 e 1x meio CHO. Diluições em série de 3 vezes de mAbs anti-cPD1 caninizados foram feitas em meio de CHO, partindo a 30 μg/ml, e 50 μL/poço de cada diluição de anticorpo foi adicionado à placa. As placas foram depois incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 30 min, com agitação. PD-L1 humano-Fc foi adicionado a 4 μg/ml em meio de CHO, 50 μL/poço sem remover ou lavar os mAbs anti-PD1 incubados, depois incubados a 37 °C, 5 % de CO2 por 45 min, com agitação. As placas foram lavadas com 6x com PBS mais 0,05 % Tween® 20. 100 μl/poço de Fc-HRP anti-ser humano (Calbiochem) (1:2500) em meio CHO foram adicionados e incubados a 37 °C/5 % de CO2 por 30 a 60 min. (Fc-HRP anti-ser humano não liga Fc canino). As placas foram lavadas com 5x PBS mais 0,05 % de Tween® 20. 100 μl/poço de TMB substrato de micropoço foram adicionados e depois incubados na temperatura ambiente por 10 minutos. A reação foi interrompida com 100 μl/poço de ácido fosfórico 1,5 M. Medido de A450 a A620 na leitora de ELISA.

Liberação de citocina de PBMC de cão:

[00181] As PBMCs foram preparadas a partir de amostras de sangue EDTA obtidas de cães saudáveis e cães com câncer, usando separação Ficoll. As células foram lavadas 3 vezes, e recolocadas em suspensão em meio de cultura de tecido completo a uma concentração de 2,5 x 105 células por poço em poços em triplicata em placas de 96 poços. As células foram ativadas com concanavalina A a 1 μg/ml. Os anticorpos de teste foram adicionados em várias concentrações e as culturas foram incubadas por 96 horas. Os controles incluíram células incubadas com conA e nenhum anticorpo, ou conA e anticorpos igualados por isótipo irrelevantes. Depois de 96 horas em cultura, os sobrenadantes foram coletados e ensaiados quanto à liberação de IFNy, usando um kit de ELISA de IFN-y canino comercial (R & D Systems) [ ver, a Figura 4].

EXEMPLO 4 IgGs CANINAS GENETICAMENTE MODIFICADAS

[00182] De modo a gerar variantes de IgG canina que careçam das funções efetoras, várias cadeias pesadas de IgGB canina mutantes foram geradas. Estas variantes podem incluir uma das seguintes substituições únicas ou combinadas na sequência de aminoácido da cadeia pesada da porção Fc: P4A, D31A, N63A, G64P, T65A, A93G, e P95A. As cadeias pesadas variantes (isto é, contendo tais substituições de aminoácido) foram clonadas em plasmídeos de expressão e transfectadas em células HEK 293 junto com um plasmídeo contendo o gene codificando uma cadeia leve. Anticorpos intactos expressados e purificados a partir das células HEK 293 foram avaliados quanto à ligação ao FcyRI e C1q para avaliar o seu potencial para a mediação de funções efetoras imunes. A Tabela 3 lista exemplos dos plasmídeos codificando as cadeias pesadas caninizadas geneticamente modificadas, as cadeias pesadas caninizada; e as modificações genéticas nestas cadeias pesadas. As cadeias pesadas variantes foram usadas para a avaliação das funções efetoras nos mAbs geneticamente modificados. Todas as cadeias pesadas compreenderam as CDRs do anticorpo de murino anti-PD- 1 canino 2H9.TABELA 3

Ligação FcRI:

[00183] Ligação a FcRyI é uma medida da capacidade de um anticorpo para mediar ADCC. De modo a avaliar esta propriedade para os anticorpos caninizados um ensaio para medir a ligação de anticorpos caninizados para FcRI foi conduzido como segue: As placas de 96 poços revestidas com 100 μl por poço de 2,5 μg/ml de PD-1 HIS. Incubar de 2 a 7 °C durante a noite. Equilibrar as placas até a temperatura ambiente por 15 minutos. Lavar as placas 3X com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,05 % de Tween® 20 (PBST) e depois bloquear os poços usando 200 μL/poço de NFDM a 5 % (Leite em pó Desnatado). Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar 3X com PBST. Fazer diluição 2 vezes de anticorpos partindo a 1 μg/ml em 5 % de NFDM. Adicionar 100 μL/poço de anticorpos diluídos. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar 6X com PBST. Adicionar 100 μL/poço de proteína CD64 humana recombinante (R&D systems) diluído a 1 μg/ml. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar 6X com PBST. Adicionar 100 μL/poço de anticorpo anti-CD64 biotinilado (R&D systems) diluído a 1:3000. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar 6X com PBST. Adicionar 100 μL/poço de anticorpo Estreptavidina-HRP (R&D systems) diluído a 1:7500. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar 6X com PBST. Adicionar 100 μL/poço de substrato TMB. Incubar por 10 minutos de 15 a 30 °C. Ler as placas usando leitora de placa de ELISA de 450 a 540 nm. Resultados: A Figura 5A mostra que mAbs caninizados designados can2H9 ADCC mut-1 VH4/VL3 que tem a modificação genética de D31A ou o mAb designado can2H9 ADCC mut-2 VH4/VL3 que tem a modificação genética de N63A demonstram uma redução quase completa na ligação ao FcyRI. Por outro lado, o mab designado can2H9 ADCC (1062) VH4/VL3 que contém as modificações genéticas D31A mais N63A combinadas carece de ligação detectável ao FcyRI. Na Figura 5A, can2H9 IgGD VH4/VL3 é um anticorpo caninizado que contém o Fc da IgGD canina e can3B6 VH4/VL4 IgGB é um anticorpo caninizado que não se liga ao antígeno de revestimento (PD-1 HIS), e o mAb caninizado designado can2H9 VH4/VL3 é um anticorpo que contém Fc de IgGB não modificado. A Figura 5B mostra que o mAb caninizado designado can2H9 ADCC(1059) VH4/VL3 que contém a modificação genética de P4A e o mAb designado can2H9 ADCC (1061) VH4/VL3 que contém a modificação genética de P95A demonstra redução considerável na ligação ao FcyRI, ao passo que o mAb designado can2H9 ADCC(1060) VH4/VL3 que contém a modificação genética de A93G demonstra uma redução leve na ligação ao FcyRI. Por outro lado, o mAb designado can2H9 IgGB ADCC (1068) VH4/VL3 que contém cinco modificações genéticas (D31A, N63A, P4A, A93G, P95A) é completamente deficiente na ligação ao FcyRI.

Ligação de C1q:

[00184] A ligação ao primeiro componente do complemento, C1q, é uma medida da capacidade de um anticorpo para mediar CDC. De modo a avaliar esta propriedade para os anticorpos caninizados um ensaio para medir a ligação de anticorpos caninizados ao C1q foi conduzido como segue: Revestir placas de 96 poços com 2,5 μg/ml de PD-1 HIS. Incubar de 2 a 7 °C durante a noite. Equilibrar na temperatura ambiente por 15 minutos. Lavar com PBST 3X. Bloquear com 200 μL/poço com BSA a 5 %. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar com PBST 3X. Fazer uma diluição 2 vezes de anticorpos partindo a 1 μg/ml em BSA a 5 %. Adicionar 100 μL/poço de anticorpos diluídos. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar com PBST 6X. Adicionar 100 μL/poço de proteína C1q diluída a 4 μg/ml. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar com PBST 6X. Adicionar 100 μL/poço de anticorpo Anti-C1q de cabra diluído a 1:3000. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar com PBST 6X. Adicionar 100 μL/poço de anticorpo HRP de burro anti-cabra diluído 1:10000. Incubar por 60 minutos de 36 a 38 °C. Lavar com PBST 6X. Adicionar 100 μL/poço de substrato TMB. Incubar por 10 minutos de 15 a 30 °C. Ler na leitora de placa de ELISA de 450 a 540 nm. Resultados: A Figura 6A mostra que o mAb caninizado designado can2H9VH4 IgGB ADCC (mut-1)/VL3, que tem a modificação genética de D31A ou o mAb designado can2H9 VH4 IgGB ADCC (mut-2)/VL3 que tem a modificação genética N63A demonstram redução considerável na ligação ao C1q. Por outro lado, o mAb designado can2H9 VH4 IgGB ADCC (1062)/VL3 que contém as modificações genéticas D31A mais N63A combinadas carece de ligação detectável ao C1q.

[00185] Na Figura 6A, can2H9 VH4 IgGD/VL3 é um anticorpo caninizado que contém o Fc da IgGD canina e can3B6 VH4/VL4 IgGB é um anticorpo caninizado que não se liga ao antígeno de revestimento (PD-1 HIS), e o mAb caninizado designado can2H9 VH4/VL3 IgGB é um anticorpo que contém Fc de IgGB não mutado. A Figura 6B mostra que o mAb caninizado designado can2H9 VH4 IgGB ADCC(1059)/VL3 que contém a substituição P4A e o mAb designado can2H9 VH4 IgGB ADCC (1061)/VL3 que contém a substituição P95A demonstram redução considerável na ligação ao C1q, ao passo que o mAb designado can2H9 VH4 IgGB ADCC(1060)/VL3 que contém a substituição A93G demonstra um realce na ligação ao C1q. Por outro lado, o mAb designado can2H9 VH4 IgGB ADCC (1068) /VL3 que contém cinco substituições (D31A, N63A, P4A, A93G, P95A), é completamente deficiente na ligação ao C1q. Na Figura 6B, o mAb designado can3B6 VH4/VL4 IgGB é um anticorpo caninizado que não se liga ao antígeno de revestimento (PD-1 HIS), e o mAb caninizado designado can2H9 VH4/VL3 IgGB é um anticorpo que contém Fc de IgGB não mutado. TABELA 4 cFc MODIFICADO OU cFc NATIVO COM SEQUÊNCIAS DE ARTICULAÇÃO TABELA 5 SEQUÊNCIAS DA REGIÃO DE ARTICULAÇÃO TABELA 6 SEQUÊNCIAS DE PD-1 CANINO/PD-L1 TABELA 7 SEQUÊNCIAS cFc NATIVAS TABELA 8 SEQUÊNCIAS DE CDR DE AMINOÁCIDO TABELA 9 CADEIAS PESADAS CANINIZADAS SUBSTITUÍDAS INDIVIDUAIS TABELA 10 CORRELAÇÃO DE POSIÇÕES de RESÍDUO DE AMINOÁCIDO DE cFc NATIVO E SUBSTITUÍDO COM AQUELE DAS CADEIAS PESADAS SUBSTITUÍDAS CORRESPONDENTES # TABELA 11 CADEIAS PESADAS E LEVES CANINIZADAS NÃO SUBSTITUÍDAS INDIVIDUAIS

EXEMPLO 5 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS ANTI-PD-1 CANINOS Introdução

[00186] A interação de anticorpos com seus antígenos de proteína cognatos é mediada através da ligação de aminoácidos específicos (parátopos) dos anticorpos com aminoácidos específicos (epítopos) de antígenos alvo. Um epítopo é um determinante antígênico que causa uma reação específica em uma imunoglobulina. O mesmo consiste de um grupo de aminoácidos na superfície do antígeno.

[00187] Uma proteína de interesse pode conter vários epítopos que são reconhecidos por anticorpos diferentes. Os epítopos reconhecidos pelos anticorpos são classificados como epítopos lineares ou conformacionais. Os epítopos lineares são formados por um trecho de sequência contínua de aminoácidos em uma proteína, enquanto que os epítopos conformacionais são compostos de aminoácidos que são descontínuos (por exemplo, afastados) na sequência de aminoácido primário, mas são juntados na dobra de proteína tridimensional.

[00188] O mapeamento de epítopo refere-se ao processo de identificar as sequências de aminoácido (isto é, epítopos) que são reconhecidos pelos anticorpos nos seus antígenos alvo. A identificação de epítopos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais (mAbs) nos antígenos alvos tem aplicações importantes. Por exemplo, o mesmo pode ajudar no desenvolvimento de novos produtos terapêuticos, de diagnósticos, e vacinas. O mapeamento de epítopo também pode ajudar na seleção de mAbs terapêuticos otimizados e ajudar a elucidar seus mecanismos de ação. A informação de epítopo também pode elucidar epítopos cancerosos únicos e definir os efeitos protetivos ou patogênicos das vacinas.

[00189] O mapeamento de epítopo pode ser realizado usando anticorpos policlonais ou monoclonais e vários métodos são utilizados para a identificação de epítopo dependendo da natureza suspeita do epítopo (isto é, linear versus conformacional). Mapear epítopos linear é mais direto e relativamente fácil para realizar. Para este propósito, serviços comerciais para o mapeamento de epítopo linear frequentemente utilizam a varredura de peptídeo. Neste caso, um conjunto de sobreposição de sequências de peptídeo curtas da proteína alvo é quimicamente sintetizado e testado quanto à sua capacidade para ligar anticorpos de interesse. A estratégia é rápida, de alto rendimento, e relativamente barata para realizar. Por outro lado, o mapeamento de epítopo descontínuo é mais tecnicamente desafiador e requer técnicas mais especializadas tais como co-cristalografia de raio X de um anticorpo monoclonal junto com a sua proteína alvo, troca de Hidrogênio- Deutério (H/D), e/ou Espectroscopia de massa ligada com digestão enzimática.

Mapeamento de epítopos de PD-1 usando um MicroArranjo ProImmune®:

[00190] De modo a identificar os aminoácidos que formam os epítopos para mAbs anti-PD1, um total de 28 peptídeos que têm 15 aminoácidos de comprimento e sobreposição em 10 aminoácidos foram quimicamente sintetizados. Esta biblioteca de peptídeos sobrepostos foi planejada para abranger a proteína de PD-1 canino de tamanho natural. A determinação da ligação de peptídeo-anticorpo foi realizada pela ligação de amostras de anticorpo ao microarranjo de peptídeo ProArray Ultra®, seguido pela incubação com um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado. Todos os peptídeos são sintetizados separadamente, e depois ligados à superfície da lâmina ProArray Ultra® ao lado de controles de IgG de murino ProImmune®. Este processo optimizado garante que os peptídeos sejam apresentados no arranjo em uma maneira tal como para imitar intimamente as propriedades da região de proteína correspondente, contornando a variação físico-química inerente dos próprios peptídeos livres e fabricando uma plataforma compatível, combinada de arranjo de peptídeo e proteína. Os análitos de teste (peptídeos) são dispensados na lâmina ProArray Ultra® em manchas separadas e gal-files apropriados permitem o alinhamento exato das características de arranjo resultante de volta para o análito depositado. As lâminas ProArray Ultra® foram bloqueadas usando um tampão de bloqueio validado para reduzir a ligação não específica dos mAbs. Elas foram depois incubadas com as amostras de mAb, seguido pela incubação com um anticorpo secundário específico fluorescentemente rotulado. Depois de várias etapas de lavagem, os arranjos ProArray Ultra® foram secos e escaneados usando um sistema de escaneamento de microarranjo de fluorescência de alta resolução. Depois de escanear as lâminas ProArray Ultra® fluorescentemente rotuladas, o escaner registrou uma imagem que foi avaliada usando software de análise de imagem - permitindo a interpretação e quantificação dos níveis de intensidades fluorescentes associadas com cada mancha fluorescente na lâmina de microarranjo escaneada. Os resultados deste experimento indicaram que alguns dos peptídeos PD-1 caninos foram reconhecidos por alguns dos mAbs avaliados. A identidade dos mAbs e a sequência de aminoácido reconhecida por estes mAbs são listadas na Tabela 12. Este estudo indica que o mAb 2H9 reconhece um epítopo localizado no domínio extracelular de PD- 1 canino compreendido da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 138 e que o mAb 1A1 reconhece um epítopo compreendendo a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 138 e a sequência de aminoácido de sobreposição representada pela sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 139.

Mapeamento de epítopo5 de PD-1 usando espectroscopia de massa:

[00191] De modo a identificar epítopos potencialmente descontínuos reconhecidos pelo anti-PD-1 canino um método com base na reticulação química e detecção pela espectrometria de massa foi usado (CovalX® Instrument Incorporated). A aplicação desta tecnologia para mapeamento de epítopo de PD-1 canino resultou na identificação de pelo menos porções de epítopos reconhecidos pelos mAbs indicados que são listados na Tabela 13. Como pode ser observado a partir da Tabela 13, o mAb 3B6 reconhece pelo menos uma porção de um epítopo localizado no domínio extracelular de PD-1 canino dentro da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 140 e que o mAb 2G9 reconhece pelo menos uma porção de um epítopo dentro da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 141. Por outro lado, mAb 1E4 e mAb 1B5 reconhecem pelo menos uma porção de um epítopo dentro da sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 142 e sequência de ácido representada pela SEQ ID NO: 143, respectivamente.

[00192] Como representada na Figura 9A uma determinação realizada pela reticulação química, espectrometria de massa High-Mass MALDI e espectrometria de massa nLC-Orbitrap mostra que o epítopo no PD-1 canino reconhecido pelo anticorpo caninizado 2G9 compreende R62, R69, R72, e R75 da SEQ ID NO: 114. A determinação análoga quanto o epítopo no PD-1 canino reconhecido pelo anticorpo caninizado 3B6 compreende R75 e R90 da SEQ ID NO: 114. Consequentemente, R75 parece ser um resíduo de aminoácido particularmente importante em um ou mais epítopos de PD-1 canino. De maneira interessante, depois de realizar estas análises, a sequência de aminoácido para as CDRs de 1A1 foi descoberta ser idêntica àquela de 2G9. A compatibilidade entre a região no PD-1 que 2G9 liga com aquela descoberta para 1A1, que foram obtidas por estas duas metodologias muito diferentes, indica que esta região contém resíduos de aminoácido compreendidos por um epítopo PD-1 que é reconhecido pelos anticorpos anti- PD-1 canino (ver, as Tabelas 12 e 13 abaixo).

[00193] Além disso, a região da sequência de aminoácido de PD-1 que é reconhecida pelos anticorpos bloqueadores da presente invenção testados está dentro do domínio extracelular de PD-1 canino. A região reconhecida é compreendida pelo seguinte peptídeo (ver, as Tabelas 12 e 13 abaixo). NQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVM*RLPNGRDFHMSIVAARLNDS (SEQ ID NO: 144)

[00194] Dentro deste peptídeo, está um peptídeo curto que está em negrito. Este peptídeo mais curto foi reconhecido com o ProImmune® MicroArray (ver, a Tabela 12). DRIEPGRDRRFRVM*RLPNGR (SEQ ID NO: 145)

[00195] Notavelmente, R62, R69, R72, e R75 da SEQ ID NO: 114 são todos compreendidos tanto pelo peptídeo mais longo (SEQ ID NO: 144) quanto pelo peptídeo mais curto (SEQ ID NO: 145), ao passo que R90 da SEQ ID NO: 114 está no peptídeo mais longo. Estes cinco resíduos de arginina parecem ser resíduos de aminoácido importantes em um ou mais epítopos de PD-1 canino. Como indicado nas Tabelas 6 a 8, o resíduo de metionina marcado com asterisco (*)também foi relatado como sendo um resíduo de treonina. TABELA 12 EPÍTOPOS DE PD-1 RECONHECIDOS PELOS MAABS ANTI-PD-1 CANINO USANDO MICROARRANJO PROIMMUNE® TABELA 13 EPÍTOPOS DE PD-1 RECONHECIDOS PELOS MAABS ANTI-PD-1 CANINOS USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSA

[00196] Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência para o mesmo grau como se cada publicação, entrada de base de dados (por exemplo, sequências do Genbank ou entradas GeneID), pedido de patente, ou patente individuais, fosse específica e individualmente indicados ser incorporados por referência. Esta declaração de incorporação por referência é pretendida pelos Requerentes, de acordo com 37 C.F.R. §1,57(b)(1), para se referir a todas as publicações, entradas de base de dados (por exemplo sequências do Genbank ou entradas de GeneID), pedido de patente, ou patente individuais, cada uma das quais é claramente identificada em conformidade com 37 C.F.R. §1,57(b)(2), mesmo se tal citação não esteja imediatamente adjacente a uma declaração dedicada de incorporação por referência. A inclusão de declarações dedicadas de incorporação por referência, se alguma, dentro do relatório descritivo não torna de nenhum modo enfraquecida esta declaração geral de incorporação por referência. A citação das referências aqui não é intencionada como uma admissão de que a referência seja técnica anterior pertinente, nem constitui a mesma qualquer admissão como para os conteúdos ou data destas publicações ou documentos.

[00197] A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção além daquelas aqui descritas tornar-se-ão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente e das figuras anexas. Tais modificações são intencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas.

[00198] O relatório descritivo escrito precedente é considerado ser suficiente para permitir que uma pessoa habilitada na técnica pratique a invenção. Várias modificações da invenção além daquelas mostradas e aqui descritas tornar-se-ão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente e caem dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Região de fragmento cristalizável canino (região cFc), caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130, que compreende as substituições dos resíduos de aminoácido P4A, D31A, N63A, A93G e P95A.

2. Anticorpo caninizado, caracterizado pelo fato de compreender a região cFc definida na reivindicação 1.

3. Anticorpo caninizado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região determinadora de complementaridade 1 de cadeia pesada (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; uma região determinadora de complementaridade 2 de cadeia pesada (VH CDR2) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31; uma região determinadora de complementaridade 3 de cadeia pesada (VH CDR3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36; uma região determinadora de complementaridade 1 de cadeia leve (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; uma região determinadora de complementaridade 2 de cadeia leve (VL CDR2) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; e uma região determinadora de complementaridade 3 de cadeia leve (VL CDR3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

4. Região de fragmento cristalizável canino (região cFc), caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 130, que compreende as substituições dos resíduos de aminoácido D31A e N63A.

5. Anticorpo caninizado, caracterizado pelo fato de compreender a região cFc definida na reivindicação 4.

6. Anticorpo caninizado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região determinadora de complementaridade 1 de cadeia pesada (VH CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; uma região determinadora de complementaridade 2 de cadeia pesada (VH CDR2) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31; uma região determinadora de complementaridade 3 de cadeia pesada (VH CDR3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36; uma região determinadora de complementaridade 1 de cadeia leve (VL CDR1) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; uma região determinadora de complementaridade 2 de cadeia leve (VL CDR2) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; e uma região determinadora de complementaridade 3 de cadeia leve (VL CDR3) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

7. Anticorpo caninizado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a Região cFc compreende adicionalmente uma região de articulação que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112.

8. Anticorpo caninizado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que quando ligado ao PD-1 canino, o dito anticorpo se liga a pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da SEQ ID NO: 144; em que o anticorpo e o fragmento de ligação de antígeno do mesmo liga PD-1 canino e bloqueia a ligação de PD-1 canino ao Ligante de Morte Programada 1 (PD-L1) canino.

9. Anticorpo caninizado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a pelo menos um resíduo de aminoácido dentro de uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 e SEQ ID NO: 145.

10. Anticorpo caninizado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga a um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em R62, R69, R72, R75, e R90 da SEQ ID NO: 114.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo caninizado como definido na reivindicação 8 e um carregador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.