BR112015019640A2

BR112015019640A2 - receptor quimérico de antígeno (car) condicionalmente ativo heterodimérico, célula de mamífero in vitro ou ex vivo geneticamente modificada, ácido nucleico, método de ativação de um linfócito t in vitro ou ex vivo, método de produção de uma célula, e método de modulação da atividade de uma célula hospedeira de linfócitos t

Info

Publication number: BR112015019640A2
Application number: BR112015019640-3A
Authority: BR
Inventors: Chia-Yung WU; James Onuffer; Wendell A. Lim
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2021-08-03
Also published as: US20150368342A1; JP2016508518A; JP6450690B2; HK1218625A1; PT3613439T; HK1253407A1; HRP20192123T1; EP2956175A1; DK3300745T3; US12161672B2; KR20150119134A; EP3300745A1; AU2014216130B2; DK2956175T3; JP6687712B2; ES2758227T9; AU2023204612A1; US20200237824A1; MX2015010522A; HUE047487T2

Abstract

receptor quimérico de antígeno (car) condicionalmente ativo heterodimérico; célula de mamífero; ácido nucleico; vetor de expressão recombinante; método de ativação de um linfócito t; método de produção de uma célula; método de tratamento de um câncer em um indivíduo; e método de modulação da atividade de uma célula hospedeira. a presente invenção fornece um receptor quimérico de antígeno (car) condicionalmente ativo heterodimérico e um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o car. a presente invenção fornece células geneticamente modificadas para produzir o car. um car da presente divulgação pode ser usado em vários métodos, que são também fornecidos.

Description

RECEPTOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENO (CAR) CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO; CÉLULA DE MAMÍFERO; ÁCIDO NUCLEICO; VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE; MÉTODO DE ATIVAÇÃO DE UM LINFÓCITO T; MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA; MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM CÂNCER EM UM INDIVÍDUO; E MÉTODO

DE MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA Referência cruzada

[001] Este pedido reivindica o benefício do Requerimento de Patente Provisória dos EUA nº 61/765,585, depositado em 15 de fevereiro de 2013, que é incorporado na íntegra a este documento para referência. Declaração sobre pesquisa patrocinada pelo governo federal

[002] Esta invenção foi feita com apoio governamental sob as Bolsas nº EY016546 e GM101782 concedidas pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo possui alguns direitos sobre a invenção. Incorporação por referência de Listagem de Sequência fornecida como Arquivo de Texto

[003] Uma Listagem de Sequência é fornecida juntamente a este documento como arquivo de texto, “UCSF- 464WO SeqList_ST25.txt” criado em 13 de fevereiro de 2014, de 153 KB. O conteúdo do arquivo de texto é incorporado na íntegra a este documento por referência. Introdução

[004] Em imunoterapia adotiva com base celular, leucócitos isolados de um paciente podem ser modificados para manifestar proteínas sintéticas que permitam que as células desempenhem novas funções terapêuticas após terem sido subsequentemente transferidas de volta ao paciente. Um exemplo dessas proteínas sintéticas é um receptor quimérico de antígeno (RQA). Um exemplo de um RQA atualmente em uso é uma fusão de um domínio de reconhecimento extracelular (ex: um domínio de ligação ao antígeno), um domínio transmembrana e um ou mais domínios de sinalização intracelular. Após a ligação do antígeno, a porção de sinalização intracelular do RQA pode iniciar uma resposta referente à ativação em um leucócito, como a liberação de moléculas citolíticas para induzir a morte de células tumorais, etc. Contudo, esses RQAs não são capazes de ser farmacologicamente controlados. Há uma necessidade na arte de RQA condicionalmente ativável que possa ser controlado farmacologicamente. Resumo

[005] Esta invenção proporciona um receptor quimérico de antígeno (RQA) condicionalmente ativo e heterodimérico, e um ácido nucleico composto de uma sequência nucleotídica que codifica o RQA. Esta invenção fornece células geneticamente modificadas que produzem o RQA. Um RQA desta invenção pode ser usado em diversos métodos, que também são fornecidos. Descrição breve dos desenhos

[006] As Figuras 1A e 1B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #122.

[007] As Figuras 2A e 2B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #123.

[008] As Figuras 3A e 3B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #125.

[009] A Figura 4 fornece sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #126.

[010] As Figuras 5A e 5B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #168.

[011] As Figuras 6A-C fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #169.

[012] As Figuras 7A e 7B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #170.

[013] As Figuras 8A e 8B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #197.

[014] As Figuras 9A-C fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #206.

[015] As Figuras 10A e 10B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #207.

[016] As Figuras 11A-C fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #199.

[017] A Figura 12 representa produção de IL-2 desencadeada por cinco variantes de RQA ativadoras.

[018] A Figura 13 representa produção de IL-2 por linhas Jurkat de controle.

[019] A Figura 14 representa uma comparação entre construções RQA “122 + 206” e “197 + 206”.

[020] A Figura 15 representa dados de citotoxicidade com o RQA de ativação “197+206.”

[021] A Figura 16 representa os dados de ativação da célula T com o uso de construções de RQA “122 + 199”; “197 + 199”; e “122 + 168.”

[022] A Figura 17 é uma representação esquemática de um exemplar de RQA de ativação.

[023] As Figuras 18A e 18B representam diversos exemplares de RQAs de ativação.

[024] As Figuras 19A-G representam produção de IL-2 desencadeada por 3 variantes de RQA de ativação diferentes que reconhecem mesotelina humana.

[025] As Figuras 20A-C representam produção de IL-2 desencadeada por uma variante de RQA de ativação com um par de dimerização responsivo a giberelina.

[026] As Figuras 21A-D representam exemplar de RQAs de ativação e RQAs convencionais com diversos domínios coestimulantes.

[027] As Figuras 22A e 22B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #270.

[028] As Figuras 23A e 23B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #300.

[029] As Figuras 24A e 24B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #336.

[030] As Figuras 25A e 25B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #337.

[031] As Figuras 26A e 26B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #357.

[032] As Figuras 27A e 27B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #365.

[033] As Figuras 28A e 28B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #366.

[034] As Figuras 29A e 29B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #367.

[035] As Figuras 30A e 30B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #398.

[036] As Figuras 31A e 31B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #399.

[037] As Figuras 32A e 32B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #400.

[038] As Figuras 33A e 33B fornecem sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos domínios da construção #358. Definições

[039] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico”, aqui usados indiferentemente, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Portanto, esse termo inclui, entre outros, DNA ou RNA unifilamentar, bifilamentar ou multifilamentar, DNA genômico, cDNA, híbridos DNA-RNA, ou um polímero composto por bases de purina e pirimidina ou outras bases de nucleotídeos naturais, modificadas química ou bioquimicamente, não naturais ou derivadas.

[040] Os termos "anticorpos" e "imunoglobulina" incluem anticorpos ou imunoglobulinas de qualquer isótipo, fragmentos de anticorpos que retenham ligação específica ao antígeno, incluindo, entre outros, fragmentos Fab, Fv, scFv, e Fd, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia simples, e proteínas de fusão compostas de uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo e uma proteína não-anticorpo.

[041] “Fragmentos de anticorpos” consistem em uma porção de um anticorpo intacto, por exemplo, a região ligada ao antígeno ou uma região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, denominados fragmentos

"Fab", cada um com um único local de ligação ao antígeno, e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar imediatamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com antígeno e ainda é capaz de ligação cruzada com antígeno.

[042] "Fv de cadeia simples" ou fragmentos de anticorpo "sFv" consistem nos domínios VH e VL de anticorpo, onde estes domínios estão presentes numa cadeia polipeptídica simples. Em algumas formas ainda, o polipeptídio Fv inclui ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, que permite que o sFv formem a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma análise de sFv, consulte Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[043] Conforme usado neste documento, o termo "afinidade" se refere à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes, e é expressa como uma constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser de pelo menos 1 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, pelo menos 1000 vezes maior, ou mais, que a afinidade de um anticorpo por sequências de aminoácidos não. A afinidade de um anticorpo a uma proteína alvo pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nanomolares (nM) a cerca de 0,1 nM, de cerca de 100 nM a cerca de 1 picomolar (pM), ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 fentomolar (fM) ou mais. Conforme usado neste documento, o termo "avidez" se refere à resistência de um complexo de dois ou mais agentes a dissociação após a diluição. Os termos "imunorreativo" e "liga-se preferencialmente" são usados indiferentemente neste documento em relação a anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antígeno.

[044] O termo "ligação" se refere a uma associação direta entre duas moléculas, devido a, por exemplo, interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas, e iônicas e/ou de ligações de hidrogénio, incluindo interações como pontes salinas e pontes de água. Ligações não específicas se referem a ligações com afinidade de menos de 10-7 M, aproximadamente, por exemplo, ligações com afinidade de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, etc.

[045] Conforme usado neste documento, o termo "região de dobradiça" se refere a uma região de conector polipeptídio flexível (também denominado "dobradiça" ou "espaçador"), que proporciona flexibilidade estrutural e espaçamento para regiões de flanqueamento de polipeptídio e podem consistir em polipeptídios naturais ou sintéticos. Uma "região de dobradiça" derivada de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG1) é geralmente definida como se estendendo de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana (Burton (1985) Molec Immunol., 22: 161-206). Regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 por meio da colocação do primeiro e último resíduos de cisteína formando ligações de dissulfeto (S-S) de cadeia interpesada nas mesmas posições. A região de dobradiça pode ser de ocorrência natural, ou de ocorrência não natural, incluindo, entre outras, uma região de dobradiça alterada, conforme descrita em U.S. Pat. No. 5,677,425. A região de dobradiça pode incluir a região de dobradiça completa derivada de um anticorpo de uma classe ou subclasse diferente da do domínio CH1. O termo "região de dobradiça" pode também incluir regiões derivadas de CD8 e outros receptores que forneçam uma função similar de flexibilidade e espaçamento para regiões de flanqueamento.

[046] Um polipeptídio "isolado" é um polipeptídio que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que iriam interferir no diagnóstico ou usos terapêuticos para o polipeptídio, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em algumas formas, o polipeptídio será purificado (1) até mais de 90%, mais de 95%, ou mais de 98%, em peso de anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry, por exemplo, mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal pelo uso de um sequenciador de copo rotativo, ou (3) à homogeneidade por eletroforese de gel de dodecil sulfato- poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) sob condições redutoras ou não redutoras, usando-se azul de Coomassie ou impregnação com prata. O polipeptídio isolado inclui o polipeptídio in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídio não estará presente. Em alguns casos, o polipeptídio isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[047] Conforme usado neste documento, o termo "leucócitos" geralmente inclui glóbulos brancos do sangue derivadas de células-tronco hematopoéticas (HSC) produzidas na medula óssea. "Leucócitos" incluem, por exemplo, os linfócitos (células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)) e células derivadas de mielóides (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, dendritos).

[048] "Célula T" inclui todos os tipos de leucócitos que expressam CD3, incluindo linfócitos T auxiliares (células CD4+), linfócitos T citotóxicos (células CD8+), linfócitos T- reguladores (Treg) e linfócitos T gama-delta.

[049] Uma "célula citotóxica" inclui células T CD8+, células exterminadoras naturais (NK), e neutrófilos, que são capazes de mediar respostas de citotoxicidade.

[050] Conforme usado neste documento, o termo "célula-tronco" geralmente inclui células-tronco pluripotentes ou multipotentes. “Células-tronco” incluem, por exemplo, células-tronco embrionárias (ES); células-tronco mesênquimas (MSC); células-tronco pluripotentes induzidas (iPS); e células progenitoras comprometidas (células-tronco hematopoiéticas (HSC); células derivadas da medula óssea, etc.).

[051] Conforme usados neste documento, o termo “tratamento” e semelhantes se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou seu sintoma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento”, conforme usado neste documento, inclui qualquer tratamento de doença em um mamífero, por exemplo, um humano, e inclui: (a) prevenir que a doença ocorra em um organismo que possa estar predisposto à doença, mas no qual a doença ainda não tenha sido diagnosticada; (b) inibir a doença, isso é, parar o seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, isso é, provocar a regressão da doença.

[052] Os termos "indivíduo", "organismo", "hospedeiro" e "paciente", usados indiferentemente neste documento, se referem a um mamífero, incluindo, entre outros, murinae (como ratos, camundongos), lagomorfos (como coelhos), primatas não humanos, seres humanos, caninos, felinos, ungulados (como equinos, bovinos, ovinos, suínos, caprinos), etc.

[053] Uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz" se refere à quantidade de um agente, ou quantidades combinadas de dois agentes, que, quando administrados a um mamífero ou a outro organismo para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar esse tratamento para a doença . A "dose terapeuticamente eficaz" irá variar dependendo do(s) agente(s), da doença e da sua gravidade, e da idade, peso, etc. do organismo a ser tratado.

[054] Antes de descrevermos em detalhes esta invenção, deve-se entender que ela não está limitada às concretizações descritas em particular, já que tais concretizações, podem, obviamente, variar. Também deve-se entender que a terminologia usada neste documento tem como finalidade descrever apenas as concretizações em particular, e não pretendem ser exaustivas, uma vez que o âmbito desta invenção será limitado pelas reivindicações anexas.

[055] Quando uma gama de valores é fornecida, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto determine claramente de outro modo, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente nessa gama especificada, está englobada na invenção. Os limites superior e inferior dessas gamas menores podem ser incluídos independentemente nas gamas menores e também são cobertas pela invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo qualquer um ou ambos desses limites incluídos estão também incluídos na invenção.

[056] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm os significados geralmente entendidos por uma pessoa com conhecimento normal na área a que esta invenção pertence. Embora muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam também ser usados na prática ou teste desta invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos agora. Todas as publicações mencionadas neste documento são aqui incorporadas por referência para revelar e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.

[057] Deve-se observar que, conforme usados neste documentos e nos pedidos anexos, os artigos singulares “um", “uma”, "o” e “a” incluem suas formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um receptor quimérico de antígeno" inclui uma pluralidade de tais receptores quiméricos de antígeno, e referência a "o par de ligação de dimerizador" inclui referência a um ou mais pares de ligação de dimerizador e equivalentes conhecidos pelos especialistas nesta área, e assim por diante. Observa-se também que os pedidos podem ser elaborados para excluir qualquer elemento opcional. Assim, essa declaração tem a intenção de servir como antecedente de base para o uso da terminologia excludente, como “somente”, “apenas” e outras, com relação à recitação dos elementos do pedido, ou uso de uma limitação “negativa”.

[058] Deve-se observar que certas características da invenção, que são, para esclarecimento, descritas no contexto de concretizações separadas, podem também ser proporcionadas em combinação numa única concretização. Por outro lado, várias características da invenção, que são, para objetividade, descritas no contexto de uma única concretização, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Todas as combinações das concretizações da invenção são especificamente abrangidas por esta invenção e são reveladas neste documento como se cada combinação fosse revelada individualmente e explicitamente. Além disso, todas as subcombinações das diversas concretizações e elementos da invenção são especificamente abrangidas por esta invenção e são reveladas neste documento como se cada combinação fosse revelada individualmente e explicitamente.

[059] As publicações discutidas neste documento são fornecidas somente para a invenção antes da data de depósito deste pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que esta invenção não pode anteceder tal publicação por razão de invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação, que podem precisar ser confirmadas independentemente. Descrição detalhada

[060] Esta invenção proporciona um receptor quimérico de antígeno (RQA) condicionalmente ativo e heterodimérico, e um ácido nucleico composto de uma sequência nucleotídica que codifica o RQA. Esta invenção fornece células geneticamente modificadas que produzem o RQA. Um RQA desta invenção pode ser usado em diversos métodos, que também são fornecidos. Receptor quimérico de antígeno condicionalmente ativo e heterodimérico.

[061] Esta invenção fornece um receptor quimérico de antígeno condicionalmente ativo e heterodimérico, que, para simplificar, é referido neste documento como “RQA”

[062] Em algumas concretizações, um RQA desta invenção consiste em: a) um primeiro polipeptídio que consiste em: i) um membro de um par de ligação específico (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno); ii) um primeiro domínio modulador; iii) um primeiro membro de um par de dimerização; e iv) um domínio transmembrana interposto entre o membro de um par de ligação específica (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno) e o primeiro domínio modulador; e b) um segundo polipeptídio que consiste em: i) um domínio transmembrana; ii) um segundo domínio modulador; iii) um segundo membro do par de dimerização; e iv) um domínio de sinalização intracelular. O domínio modulador pode ser um domínio coestimulante.

[063] Em algumas concretizações, um RQA desta invenção consiste em: a) um primeiro polipeptídio que consiste em: i) um membro de um par de ligação específico (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno); ii) um primeiro domínio coestimulante; iii) um primeiro membro de um par de dimerização; e iv) um domínio transmembrana interposto entre o membro de um par de ligação específica (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno) e o primeiro domínio coestimulante; e b) um segundo polipeptídio que consiste em: i) um domínio transmembrana; ii) um segundo domínio coestimulante; iii) um segundo membro do par de dimerização (como o par de ligação ao dimerizador); e iv) um domínio de sinalização intracelular.

[064] Em algumas concretizações, um RQA desta invenção consiste em: a) um primeiro polipeptídio que consiste em: i) um membro de um par de ligação específico (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno); ii) um domínio modulador; iii) um primeiro membro de um par de dimerização (como um par de ligação ao dimerizador); e iv) um domínio transmembrana interposto entre o membro de um par de ligação específica (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno) e o domínio modulador; e b) um segundo polipeptídio que consiste em: i) um segundo membro do par de dimerização (como o par de ligação ao dimerizador); e ii) um domínio de sinalização intracelular. O domínio modulador pode ser um domínio coestimulante.

[065] Em algumas concretizações, um RQA desta invenção consiste em: a) um primeiro polipeptídio que consiste em: i) um membro de um par de ligação específico (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno); ii) um domínio coestimulante; iii) um primeiro membro de um par de dimerização; e iv) um domínio transmembrana interposto entre o membro de um par de ligação específica (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno) e o domínio coestimulante; e b) um segundo polipeptídio que consiste em: i) um segundo membro do par de dimerização (como o par de ligação ao dimerizador); e ii) um domínio de sinalização intracelular.

[066] Um exemplo de um RQA de um organismo é representado esquematicamente na Figura 17. Um RQA desta invenção pode estar presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero, sendo células de mamífero adequadas, entre outras, um células citotóxicas, um linfócito T, uma célula-tronco, uma descendência de uma célula-tronco, uma célula progenitora, uma descendência de uma célula progenitora, e uma célula NK. Quando presente em uma membrana plasmática, um RQA desta invenção é ativado na presença de: 1) um agente dimerizador se liga ao primeiro e segundo elementos do par de ligação ao dimerizador no RQA, ou de outro modo induz a dimerização do primeiro e segundo membros do dímero; e 2) um fator que se liga ao elemento de um par de ligação específica (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno), por exemplo, um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA. O fator que liga o membro do par de ligação específico é um segundo membro do par de ligação específico. O segundo membro do par de ligação específica pode ser um fator solúvel (por exemplo, não ligado a uma célula); um fator presente na superfície de uma célula, como uma célula alvo; um fator apresentado sobre uma superfície sólida; um fator presente em uma bicamada lipídica; e similar. Se o membro de um par de ligação específica é um anticorpo, e o segundo membro do par de ligação específica é um antígeno, o antígeno pode ser solúvel (por exemplo, não ligado a uma célula); um antígeno presente na superfície de uma célula, como uma célula alvo; um antígeno apresentado em uma superfície sólida; um antígeno presente em uma bicamada lipídica; e similar.

[067] Em alguns casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um segundo membro de um par de ligação específica que se liga ao membro do par de ligação específica do RQA (por exemplo, um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA) e um agente dimerizador, aumenta a expressão de pelo menos um ácido nucleico na célula. Por exemplo, em alguns casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA e um agente dimerizador, aumenta a expressão de pelo menos um ácido nucleico na célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com o nível de transcrição do ácido nucleico na ausência do antígeno e/ou o agente dimerizador.

[068] Como exemplo, o segundo polipeptídio de um RQA desta invenção pode incluir um polipeptídio de sinalização intracelular contendo um motivo tirosínico de ativação dos receptores imunológicos (ITAM); nesses casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA e um agente dimerizador, aumenta o fator nuclear da transcrição dependente das células T ativadas (NFAT). A transcrição dependente de NFAT inclui a transcrição induzida por qualquer membro da família NFAT, incluindo, por exemplo, NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4, NFAT5; AP-1; Sp1; NKκB; e semelhantes.

[069] Um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA e um agente dimerizador, pode, em alguns casos, resultar em um aumento da produção de uma ou mais citocinas pela célula. Por exemplo, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA e um agente dimerizador, pode aumentar a produção de uma citocina pela célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a dose de citocina produzida pela célula na ausência do antígeno e/ou o agente dimerizador. As citocinas cuja produção pode ser aumentada incluem, entre outras, um interferon, por exemplo, IL-2, interferon gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), IL-15, IL-12, IL-4, IL-5,

IL-10; uma quimiocina; um fator de crescimento; e semelhantes.

[070] Em alguns casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA e um agente dimerizador, pode resultar em um aumento da transcrição de um ácido nucleico na célula e aumento da produção de uma citocina pela célula.

[071] Em alguns casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um agente dimerizador, resulta em atividade citotóxica pela célula para uma célula alvo que expressa na sua superfície celular um antígeno ao qual o domínio de ligação ao antígeno do primeiro polipeptídio do RQA se liga. Por exemplo, quando a célula eucariótica é uma célula citotóxica (por exemplo, uma célula NK ou um linfócito T citotóxico), um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática da célula, e, quando ativado por um agente dimerizador, aumenta a atividade citotóxica da célula para uma célula alvo que expressa na sua superfície celular um antígeno ao qual o domínio de ligação ao antígeno do primeiro polipeptídio do RQA se liga. Por exemplo, quando a célula eucariótica é uma célula NK ou um linfócito T, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática da célula, e quando ativado por um agente dimerizador, aumenta a atividade citotóxica da célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula na ausência do agente dimerizador.

[072] Em alguns casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do RQA e um agente dimerizador, pode resultar em outros eventos relacionados à ativação do RQA, como a proliferação e expansão (devido a um aumento da divisão celular ou respostas anti-apoptóticas).

[073] Em alguns casos, um RQA desta invenção, quando presente na membrana plasmática de uma célula eucariótica, e quando ativado por um antígeno que se liga ao domínio de ligação do RQA e um agente dimerizador, pode resultar em outros eventos relacionados à ativação do RQA, como a modulação de sinalização intracelular, diferenciação celular ou morte celular.

[074] Um RQA desta invenção pode estar presente em uma membrana de célula eucariótica, na qual o primeiro e o segundo polipeptídios do RQA não estão ligados covalentemente um a outro. Um RQA desta invenção pode estar presente em uma membrana de célula eucariótica como um único heterodímero que não está ligado de forma covalente a qualquer outro polipeptídio na membrana. Alternativamente, um primeiro RQA desta invenção pode estar presente em uma membrana de célula eucariótica como um heterodímero que é ligado de maneira covalente ou não a um segundo RQA desta invenção. Em alguns casos, o primeiro e o segundo RQA estão covalentemente ligados através de uma ponte de dissulfeto formada entre as cisteínas presentes em uma região de dobradiça presente no primeiro polipeptídio do primeiro RQA e no primeiro polipeptídio do segundo RQA.

[075] Em alguns casos, um RQA desta invenção pode estar presente em uma membrana de célula eucariótica, na qual os primeiros polipeptídios do RQA consistem em um fragmento de anticorpo e o segundo polipeptídio do RQA consiste em um domínio de transdução de sinal derivado de um receptor de citocina, tal que, mediante a dimerização, o RQA pode representar um RQA signalobody heterodimérico, por exemplo, um signalobody composto de pelo menos dois polipeptídios independentes. Um "signalobody", como é conhecido na ária, é uma macromolécula quimérica simples composta de um fragmento de anticorpo e um domínio de transdução de sinal derivado de um receptor de citocina. Em certos casos, um RQA de signalobody heterodimérico desta invenção, quando presente na membrana celular de uma célula eucariótica, dimerizado por um dimerizador, e ativado por um antígeno, por exemplo, um antígeno oligomerizado, pode induzir a oligomerização do RQA de signalobody heterodimérico. Tal oligomerização induzida pelo ligante de um RQA de signalobody heterodimérico pode ativar, por exemplo, aumentar, ou perpetuar, por exemplo, manter, transdução de sinal, por exemplo, oligomerização induzida pelo ligante de um RQA de signalobody heterodimérico pode transmitir um sinal para desencadear uma resposta celular. Em alguns casos, uma pluralidade de RQAs signalobody heterodiméricos pode ser utilizada de forma combinatória para induzir uma resposta celular desejada. Membro de um par de ligação específico

[076] Um RQA desta invenção inclui um membro de um par de ligação específico. Pares de ligação específicos incluem, entre outros, pares de ligação antígeno-anticorpo; pares de ligação ligante-receptor; e similares. Assim, um membro de um par de ligação específico adequado para uso em um RQA desta invenção inclui um antígeno; um anticorpo; um ligante; e um receptor de ligante-receptor. Domínio de ligação de antígeno

[077] Um domínio de ligação ao antígeno adequado para uso em um RQA desta invenção pode ser qualquer polipeptídio de ligação ao antígeno, uma ampla variedade dos quais são conhecidos na área. Em alguns casos, o domínio de ligação ao antígeno é uma cadeia simples Fv (scFv). Outros domínios de reconhecimento com base em anticorpos (domínios variáveis de anticorpos camelídeos cAb VHH) e versões humanizadas, IgNAR VH (domínios variáveis de anticorpos de tubarão) e versões humanizadas, sdAb VH (domínios variáveis de anticorpos de domínio simples) e domínios variáveis de anticorpos "camelizados" são adequados para uso . Em alguns casos, os domínios de reconhecimento com base no receptor de células T (TCR), tais como TCR de cadeia simples (scTv, TCR de dois domínios de cadeia simples contendo VV) também são adequados para uso.

[078] Um domínio de ligação ao antígeno adequado para uso em um RQA desta invenção pode ter uma variedade de especificidades de ligação ao antígeno. Em alguns casos, o domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo presente num antígeno que é expresso por (sintetizado por) uma célula cancerosa, ou seja, um antígeno associado à célula cancerosa. O antígeno associado à célula cancerosa pode ser um antígeno associado a, por exemplo, uma célula de câncer de mama, um linfoma de células B, uma célula de linfoma de

Hodgkin, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer de próstata, um mesotelioma, uma célula de câncer de pulmão (por exemplo, uma célula de câncer de pulmão de célula pequena), uma célula de linfoma célula B não Hodgkin (B-NHL), uma célula de câncer de ovário, uma célula câncer da próstata, uma célula de mesotelioma, uma célula de câncer de pulmão (por exemplo, por exemplo, uma célula de câncer de pulmão de célula pequena), uma célula de melanoma, uma célula de leucemia linfocítica crónica, uma célula de leucemia linfocítica aguda, uma célula de neuroblastoma, um glioma, um glioblastoma, um meduloblastoma, uma célula de câncer colo- retal, etc. Um antígeno associado a uma célula cancerosa também pode ser expresso por uma célula não cancerosa.

[079] Exemplos não exaustivos de antígenos aos quais um domínio de ligação ao antígeno de um RQA de um organismo pode se ligar incluem, por exemplo, CD19, CD20, CD38, CD30, Her2/neu, ERBB2, CA125, MUC-1, antígeno de membrana específica da próstata (PSMA), molécula de adesão à superfície CD44, mesotelina, antígeno carcinoembrionário (CEA), receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), EGFRvIII, receptor de fator de crescimento endotelial vascular-2 (VEGFR2), antígeno associado a melanoma de alta massa molecular (HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, e semelhantes. Ligante

[080] Em alguns casos, um membro de um par de ligação específico adequado para uso em um RQA de um organismo é um ligante para um receptor. Ligantes incluem, entre outros, citocinas (por exemplo, IL-13, etc.); fatores de crescimento (por exemplo, heregulina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); e semelhantes); um peptídeo de ligação a integrina (por exemplo, um peptídeo que consiste na sequência Arg-Gli-Asp); e semelhantes.

[081] Se o membro de um par de ligação específico em um RQA de um organismo for um ligante, o RQA pode ser ativado na presença de um agente dimerizador e um segundo membro do par de ligação específico, sendo o segundo membro do par de ligação específico um receptor para o ligante. Por exemplo, quando o ligante é VEGF, o segundo membro do par de ligação específica pode ser um receptor de VEGF, incluindo um receptor VEGF solúvel. Como outro exemplo, quando o ligante é heregulina, o segundo membro do par de ligação específica pode ser Her2. Receptores

[082] Como mencionado acima, em alguns casos, o membro de um par de ligação específico que está incluído em um RQA de um organismo é um receptor, por exemplo, um receptor para um ligante, um correceptor, etc. O receptor pode ser um fragmento de ligação ao ligante de um receptor. Receptores adequados incluem, entre outros, um receptor de fator de crescimento (por exemplo, um receptor de VEGF); um receptor semelhante à lectina de célula exterminadora subfamília K, polipeptídio membro 1 (NKG2D) (receptor para MICA, MICB, e ULB6); um receptor de citocina (por exemplo, um receptor de IL-13; um receptor de IL-2, etc.); Her2; CD27; um polipeptídio receptor natural de citotoxicidade (NCR) (por exemplo, NKP30 (NCR3 / CD337) (receptor para transcrição associada ao HLA-B 3 (BAT3) e B7-H6); etc.); etc. Região de dobradiça

[083] Em alguns casos, o primeiro polipeptídio de um

RQA de um organismo consiste em uma região de dobradiça (também denominada "espaçador" neste documento), onde a região de dobradiça é interposta entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembrana. Em alguns casos, a região de dobradiça é uma região de dobradiça de cadeia pesada de imunoglobulina. Em alguns casos, a região de dobradiça é um polipeptídio de região de dobradiça derivado de um receptor (por exemplo: uma região de dobradiça derivada de CD-8).

[084] A região de dobradiça pode ter um comprimento de cerca de 4 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos, por exemplo, de cerca de 4 aa cerca de 10 aa, de cerca de 10 aa a cerca de 15 aa, de cerca de 15 aa a cerca de 20 aa, de cerca de 20 aa a cerca de 25 aa, de cerca de 25 aa a cerca de 30 aa, de cerca de 30 aa a cerca de 40 aa, ou de cerca de 40 aa a cerca de 50 aa.

[085] Espaçadores adequados podem ser prontamente selecionados e pode ser de qualquer um de um número de comprimentos adequados, tais como de um aminoácido (por exemplo, Gli) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, e podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos.

[086] Espaçadores exemplares incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO:37) e (GGGS)n (SEQ ID NO:38), onde n é um número inteiro maior ou igual a um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, e outros ligantes flexíveis conhecidos na área. Os polímeros de glicina-serina e glicina podem ser utilizados; tanto Gly como Ser são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma ligação neutra entre os componentes. Polímeros de glicina podem ser usados; glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi do que até mesmo alanina, e são muito menos restritos do que resíduos com cadeias laterais mais longas (vide Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Espaçadores exemplares podem ser constituídos de sequências de aminoácidos, incluindo, entre outras, GGSG (SEQ ID NO:39), GGSGG (SEQ ID NO:40), GSGSG (SEQ ID NO:41), GSGGG (SEQ ID NO:42), GGGSG (SEQ ID NO:43), GSSSG (SEQ ID NO:44), e semelhantes.

[087] Em alguns casos, a região de dobradiça no primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo inclui, pelo menos, uma cisteína. Por exemplo, em alguns casos, a região de dobradiça pode incluir a sequência Cis-Pro-Pro-Cis. Caso esteja presente, uma cisteína na região de dobradiça de um primeiro RQA pode estar disponível para formar uma ponte de dissulfeto com uma região de dobradiça em um segundo RQA.

[088] Sequências de aminoácidos na região de dobradiça de imunoglobulina são conhecidas na área; vide, por exemplo, Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:162; and Huck et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 1779. Como exemplos não exaustivos, uma região de dobradiça de imunoglobulina pode incluir uma das seguintes sequências de aminoácidos: DKTHT (SEQ ID NO:45); CPPC (SEQ ID NO:46); CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO:47) (vide, por exemplo, Glaser et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:41494); ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO:48); KSCDKTHTCP (SEQ ID NO:49); KCCVDCP (SEQ ID NO:50); KYGPPCP (SEQ ID NO:51); EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:52) (human

IgG1 hinge); ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:53) (human IgG2 hinge); ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:54) (human IgG3 hinge); SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO:55) (human IgG4 hinge); e semelhantes.

[089] A região de dobradiça pode ser composta de uma sequência de aminoácidos de uma região de dobradiça de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. A região de dobradiça pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos e/ou inserções e/ou deleções em comparação a um tipo selvagem (de ocorrência natural) de região de dobradiça. Por exemplo, His229 de dobradiça de IgG1 humana pode ser substituído por Tir, de modo que a região de dobradiça seja composta da sequência EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO: 52); vide, por exemplo, Yan et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:5891.

[090] A região de dobradiça pode ser composta de uma sequência de aminoácidos derivada de CD8 humano; por exemplo, a região de dobradiça pode incluir a sequência de aminoácidos: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:56), ou uma variação dela. Domínio transmembrana

[091] O primeiro e o segundo polipeptídios de um RQA desta invenção incluem os domínios transmembrana para inserção em uma membrana de célula eucariótica. O domínio transmembrana do primeiro polipeptídio é interposto entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio coestimulante. Quando o primeiro polipeptídio inclui uma região de dobradiça, o domínio transmembrana está interposto entre a região de dobradiça e o domínio coestimulante, de tal modo que o primeiro polipeptídio inclui, em ordem, do terminal amina (N-terminal) ao terminal carboxila (C-terminal): um domínio de ligação ao antígeno; uma região de dobradiça; um domínio transmembrana; um primeiro domínio coestimulante; e um primeiro membro de um par de ligação de dimerizador.

[092] O domínio transmembrana do segundo polipeptídio está no ou próximo ao terminal N do polipeptídio, de modo que o segundo polipeptídio inclua, em ordem, do terminal N ao terminal C: um domínio transmembrana; um segundo domínio coestimulante; um segundo membro do par de ligação do dimerizador; e um domínio de sinalização intracelular.

[093] Qualquer domínio transmembrana (TM) que preveja a inserção de um polipeptídio na membrana celular de uma célula eucariótica (por exemplo, de mamífero) é adequado para uso. Como exemplo não exaustivo, pode ser usada a sequência TM IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO:30). Exemplos não exaustivos adicionais de sequências adequadas incluem: a) CD8 beta derivada: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (SEQ ID NO:57); b) CD4 derivada: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (SEQ ID NO:58); c) CD3 zeta derivada: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (SEQ ID NO:59); d) CD28 derivada: WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:60); e) CD134 (OX40) derivada: VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQ ID NO:61); e f) CD7 derivada: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (SEQ ID NO:62). Ligantes

[094] Em alguns casos, um primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo inclui um ligante entre dois domínios adjacentes quaisquer. Por exemplo, um ligante pode ser disposto entre o domínio transmembrana e o primeiro domínio coestimulante do primeiro polipeptídio. Como outro exemplo, um ligante pode ser disposto entre o primeiro domínio coestimulante e o primeiro membro do par de ligação do dimerizador do primeiro polipeptídio. Como outro exemplo, um ligante pode ser disposto entre o domínio transmembrana e o segundo domínio coestimulante do segundo polipeptídio. Como outro exemplo, um ligante pode ser disposto entre o segundo domínio coestimulante e o segundo membro do par de ligação do dimerizador do segundo polipeptídio. Como outro exemplo, um ligante pode ser disposto entre o segundo membro do par de ligação do dimerizador e o domínio de sinalização intracelular do segundo polipeptídio.

[095] O peptídeo ligante pode ter uma grande variedade de sequências de aminoácidos. Proteínas podem ser ligadas por um peptídeo espaçador, geralmente de natureza flexível, embora outras ligações químicas não sejam excluídas. Um ligante pode ser um peptídeo de cerca de 6 a 40 aminoácidos de comprimento, ou cerca de 6 a 25 aminoácidos de comprimento. Esses ligantes podem ser produzidos usando-se oligonucleotídeos sintéticos de codificação de ligantes para ligar as proteínas. Ligantes peptídeos com um grau de flexibilidade podem ser usados. Os peptídeos de ligação podem ter praticamente qualquer sequência de aminoácidos, tendo em mente que os ligantes adequados terão uma sequência que resulte em um peptídeo geralmente flexível. O uso de pequenos aminoácidos, tais como glicina e alanina, é comum na criação de um peptídeo flexível. A criação dessas sequências é rotineira para especialistas da área.

[096] Ligantes adequados podem ser prontamente selecionados e pode ser de qualquer comprimento adequado, tais como de um aminoácido (por exemplo, Gli) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluindo 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, ou 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, e podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 aminoácidos.

[097] Ligantes flexíveis exemplares incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO:37) e (GGGS)n (SEQ ID NO:38), onde n é um número inteiro maior ou igual a um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, e outros ligantes flexíveis conhecidos na área. Os polímeros de glicina e serina-glicina são de interesse, uma vez que ambos os aminoácidos são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma ligação neutra entre componentes. Polímeros de glicina são de particular interesse, uma vez que glicina acessa significativamente mais espaço phi-psi do que até mesmo alanina, e são muito menos restritos do que resíduos com cadeias laterais mais longas (vide Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Ligantes flexíveis incluem, entre outros, GGSG (SEQ ID NO:39), GGSGG (SEQ ID NO:40), GSGSG (SEQ ID NO:41), GSGGG (SEQ ID NO:42), GGGSG (SEQ ID NO:43), GSSSG (SEQ ID NO:44), e semelhantes. Um especialista na área reconhecerá que o desenho de um peptídeo conjugado a quaisquer elementos descritos acima pode incluir ligantes que sejam completa ou parcialmente flexíveis, de tal modo que possam incluir um ligante flexível, bem como uma ou mais porções que conferem estrutura menos flexível. Domínios moduladores

[098] Domínios moduladores adequados ao uso em um RQA desta invenção incluem domínios coestimulantes.

[099] Em alguns casos, o domínio modulador no primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo tem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que o domínio modulador no segundo polipeptídio do RQA. Por exemplo, em alguns casos, o domínio modulador no primeiro polipeptídio de um RQA inclui uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100 %, idêntica à sequência de aminoácidos do domínio modulador sobre o segundo polipeptídio do RQA. O domínio modulador do primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo pode ter substancialmente o mesmo comprimento que o domínio modulador do segundo polipeptídio de um RQA de um organismo; por exemplo, o primeiro e segundo domínios moduladores podem ter comprimentos diferentes um do outro por menos de 10 aminoácidos, ou menos de 5 aminoácidos. Em alguns casos, o primeiro e segundo domínios moduladores têm o mesmo comprimento.

[0100] Um domínio modulador adequado para inclusão no primeiro e segundo polipeptídios de um RQA de um organismo pode ter um comprimento de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos (aa), por exemplo, um domínio modulador pode ter um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa. Em outros casos, domínio modulador pode ter um comprimento de cerca de 70 aa a 100 aa, de cerca de 100 aa a 200 aa, ou maior que 200 aa.

[0101] Domínios coestimulantes adequados para uso no RQA desta invenção são geralmente polipeptídios derivados de receptores. Em algumas concretizações., domínios coestimulantes homodimerizam. Um domínio coestimulante de um organismo pode ser uma porção intracelular de uma proteína transmembranar (isso é, o domínio coestimulante pode ser derivado de uma proteína transmembranar). Exemplos não exaustivos de polipeptídios coestimulantes adequados incluem, entre outros, 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, CD30, GITR, e HVEM.

[0102] Em alguns casos, o domínio coestimulante no primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo tem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que o domínio coestimulante no segundo polipeptídio do RQA. Por exemplo, em alguns casos, o domínio coestimulante no primeiro polipeptídio de um RQA inclui uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100 %, idêntica à sequência de aminoácidos do domínio coestimulante sobre o segundo polipeptídio do RQA. O domínio coestimulante do primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo pode ter substancialmente o mesmo comprimento que o domínio coestimulante do segundo polipeptídio de um RQA de um organismo; por exemplo, o primeiro e segundo domínios coestimulantes podem ter comprimentos diferentes um do outro por menos de 10 aminoácidos, ou menos de 5 aminoácidos. Em alguns casos, o primeiro e segundo domínios coestimulantes têm o mesmo comprimento.

[0103] Um domínio coestimulante adequado para inclusão no primeiro e segundo polipeptídios de um RQA de um organismo pode ter um comprimento de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 70 aminoácidos (aa), por exemplo, um domínio coestimulante pode ter um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, de cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa. Em outros casos, o domínio coestimulante pode ter um comprimento de cerca de 70 aa a 100 aa, de cerca de 100 aa a 200 aa, ou maior que 200 aa.

[0104] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar 4-1BB (também conhecida como TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDw137; ILA; etc). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:24). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.

[0105] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar CD28 (também conhecida como Tp44). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:63). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.

[0106] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar ICOS (também conhecida como AILIM, CD278 e CVID1). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO:64). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa,

de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.

[0107] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar OX-40 (também conhecida como TNFRSF4, RP5- 902P8.3, ACT35, CD134, OX40, TXGP1L). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:65). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.

[0108] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar BTLA (também conhecida como BTLA1 e CD272). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIY

DNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICV RS (SEQ ID NO:66).

[0109] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar CD27 (também conhecida como S152, T14, TNFRSF7, e Tp55). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:67). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.

[0110] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar CD30 (também conhecida como TNFRSF8, D1S166E, e Ki-1). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos de com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, ou de cerca de 160 aa a cerca de 185 aa da seguinte sequência de aminoácidos:

RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAE ERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIM

KADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEE EGKEDPLPTAASGK (SEQ ID NO:68).

[0111] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar GITR (também conhecida como TNFRSF18, RP5- 902P8.2, AITR, CD357, e GITR-D). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGD LWV (SEQ ID NO:69). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa.

[0112] Em alguns casos, o domínio coestimulante é derivado de uma porção intracelular da proteína transmembranar HVEM (também conhecida como TNFRSF14, RP3- 395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, e TR2). Por exemplo, um domínio coestimulante adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH (SEQ ID NO:70). Em algumas dessas concretizações, o domínio coestimulante de ambos o primeiro e o segundo polipeptídios tem um comprimento de cerca de 30 aa a cerca de 35 aa, de cerca de 35 aa a cerca de 40 aa, de cerca de 40 aa a cerca de 45 aa, desde cerca de 45 aa a cerca de 50 aa, de cerca de 50 aa a cerca de 55 aa, de cerca de 55 aa a cerca de 60 aa, de cerca de 60 aa a cerca de 65 aa, ou de cerca de 65 aa a cerca de 70 aa. Pares de dímeros

[0113] Pares de dímeros adequados ao uso em um RQA de organismo incluem pares de ligação ao dimerizador. Pares de ligação ao dimerizador adequados para uso no RQA desta invenção são, em algumas concretizações, polipeptídios que se ligam a um local diferente da mesma molécula (denominado neste documento “dimerizador”).Na presença de um dimerizador, amos os membros do par de dimerizador se ligam a um local diferente do dimerizador e são, assim, levados à proximidade um do outro. Em algumas concretizações, a ligação ao dimerizador é reversível. Em algumas concretizações, a ligação ao dimerizador é irreversível. Em algumas concretizações, a ligação ao dimerizador é não covalente. Em algumas concretizações, a ligação ao dimerizador é covalente.

[0114] Outros pares de dímeros adequados para uso incluem pares de ligação ao dimerizador que dimerizam após a ligação de um primeiro membro de um par dímero a um agente dimerizador, onde o agente dimerizador induza uma alteração conformacional no primeiro membro do par de dímero, e onde a alteração conformacional permita que o primeiro membro do par de dímero se ligue (covalentemente ou não covalentemente) a um segundo membro do par de dímero.

[0115] Outros pares de dímeros adequados para uso incluem pares de dímeros nos quais a exposição à luz (por exemplo: luz azul) induza a dimerização do par de dímeros.

[0116] Independentemente do mecanismo, o par de dímeros vai dimerizar por exposição a um agente que induza a dimerização, onde o agente seja, em alguns casos, uma molécula pequena, ou, em outros casos, luz. Portanto, para simplificar, a discussão abaixo referente a “pares de ligação de dimerizador” inclui pares de dímero que dimerizam independentemente do mecanismo.

[0117] Exemplos não exaustivos de dímeros adequados (por exemplo, pares de ligação ao dimerizador) incluem, entre outros: a) Proteína de ligação de FK506 (FKBP) e FKBP; b) FKBP e subunidade A catalítica de calcineurina (CnA); c) FKBP e ciclofilina; d) FKBP e proteína associada à rapamicina FKBP (FRB); e) girasse B (GyrB) e GyrB;

f) di-hidrofolato redutase (DHFR) e DHFR; g) DmrB e DmrB; h) PYL e ABI; i) Cry2 e CIB1; e j) GAI e GID1.

[0118] Um primeiro ou um segundo membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação de dimerizador) de um RQA de um organismo pode ter um comprimento de cerca de 50 aminoácidos e cerca de 300 aminoácidos ou mais; por exemplo, um primeiro ou um segundo membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) de um RQA de um organismo pode ter um comprimento de cerca de 50 aa a cerca de 100 aa, de cerca de 100 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 200 aa, de cerca de 200 aa a 250 aa, de cerca de 250 aa a cerca de 300 aa, ou mais de 300 aa.

[0119] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação de dimerizador) de um RQA de um organismo é derivado de FKBP. Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWE EGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO:12).

[0120] Em alguns casos, um membro de um par de ligação ao dimerizador de um RQA de um organismo é derivado de uma subunidade A catalítica de calcineurina (também conhecida como subunidade catalítica PPP3CA; CALN; CALNA; CALNA1; CCN1; CNA1; PPP2B; CAM-PRP; calcineurina A alfa; calcineurina A dependente de calmodulina subunidade alfa isoforma; fotosfatas de proteína 2B, subunidade catalítica, isoforma alfa; etc.). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos (domínio PP2Ac):

LEESVALRIITEGASILRQEKNLLDIDAPVTVCGDIHGQFFDLMKLFEVGGSPANTRYLFL GDYVDRGYFSIECVLYLWALKILYPKTLFLLRGNHECRHLTEYFTFKQECKIKYSERVYDA CMDAFDCLPLAALMNQQFLCVHGGLSPEINTLDDIRKLDRFKEPPAYGPMCDILWSDPLED

FGNEKTQEHFTHNTVRGCSYFYSYPAVCEFLQHNNLLSILRAHEAQDAGYRMYRKSQTTGF PSLITIFSAPNYLDVYNNKAAVLKYENNVMNIRQFNCSPHPYWLPNFM (SEQ ID NO:71).

[0121] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo: um par de ligação ao dimerizador) é derivado de citofilina (também conhecida como citofilina A, PPIA, CIPA, CIPH, PPIase A, etc.). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

[0122] In em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação de dimerizador) é derivado de MTOR (também conhecido como proteína associada a FKBP-rapamicina; proteína de ligação FK506 proteína 1 associada a 12-rapamicina; proteína de ligação FK506 proteína 2 associada a 12-rapamicina; proteína de ligação FK506, proteína 1 associada ao complexo 12-rapamicina; FRAP; FRAP1; FRAP2; RAFT1; e RAPT1). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos (também conhecida como “Frb”: Domínio de Ligação a Rapamicina Fkbp):

MILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSF NQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISK (SEQ ID NO:14).

[0123] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação de dimerizador) é derivado de GyrB (também como subunidade B de DNA girasse). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos de com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 200 aminoácidos (aa), de cerca de 200 aa a cerca de 300 aa, de cerca de 300 aa a cerca de 400 aa, de cerca de 400 aa a cerca de 500 aa, de cerca de 500 aa a cerca de 600 aa, de cerca de 600 aa a cerca de 700 aa, de cerca de 700 aa a cerca de 800 aa, da seguinte sequência de aminoácidos GyrB de Escherichia coli (ou da sequência B da subunidade de DNA gyrase):

MSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEA LAGHCKEIIVTIHADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVS GGLHGVGVSVVNALSQKLELVIQREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSL ETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSIRLRDKRDGKEDHFHYEGGIKAFVEYLNKNKT PIHPNIFYFSTEKDGIGVEVALQWNDGFQENIYCFTNNIPQRDGGTHLAGFRAAMTRTLNA YMDKEGYSKKAKVSATGDDAREGLIAVVSVKVPDPKFSSQTKDKLVSSEVKSAVEQQMNEL LAEYLLENPTDAKIVVGKIIDAARAREAARRAREMTRRKGALDLAGLPGKLADCQERDPAL SELYLVEGDSAGGSAKQGRNRKNQAILPLKGKILNVEKARFDKMLSSQEVATLITALGCGI GRDEYNPDKLRYHSIIIMTDADVDGSHIRTLLLTFFYRQMPEIVERGHVYIAQPPLYKVKK GKQEQYIKDDEAMDQYQISIALDGATLHTNASAPALAGEALEKLVSEYNATQKMINRMERR YPKAMLKELIYQPTLTEADLSDEQTVTRWVNALVSELNDKEQHGSQWKFDVHTNAEQNLFE PIVRVRTHGVDTDYPLDHEFITGGEYRRICTLGEKLRGLLEEDAFIERGERRQPVASFEQA

LDWLVKESRRGLSIQRYKGLGEMNPEQLWETTMDPESRRMLRVTVKDAIAADQLFTTLMGD AVEPRRAFIEENALKAANIDI (SEQ ID NO:73). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador inclui uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para aminoácidos 1-220 da sequência de aminoácidos GirB listada acima de Escherichia coli.

[0124] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação de dimerizador) é derivado de

DHFR (também conhecido como diidrofolato redutase, DHFRP1, e DYR). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSI PEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVY

KEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVY EKND (SEQ ID NO:74).

[0125] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo: um par de ligação ao dimerizador) é derivado do domínio de ligação DmrB (isso é, domínio de homodimerização DmrB). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

MASRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIR GWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO:75).

[0126] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) é derivado de uma proteína PIL (também conhecida como receptora de ácido abscísico e como RCAR). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador de um organismo pode ser derivado de proteínas como as de Arabidopsis thaliana: PYR1, RCAR1(PYL9), PYL1, PYL2, PYL3, PYL4, PYL5, PYL6, PYL7, PYL8 (RCAR3), PYL10, PYL11, PYL12, PYL13. Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:

[0127] PIL10:

MNGDETKKVESEYIKKHHRHELVESQCSSTLVKHIKAPLHLVWSIVRRFDEPQKYKPFISR CVVQGKKLEVGSVREVDLKSGLPATKSTEVLEILDDNEHILGIRIVGGDHRLKNYSSTISL

HSETIDGKTGTLAIESFVVDVPEGNTKEETCFFVEALIQCNLNSLADVTERLQAESMEKKI (SEQ ID NO:76).

[0128] PYL11:

METSQKYHTCGSTLVQTIDAPLSLVWSILRRFDNPQAYKQFVKTCNLSSGDGGEGSVREVT

VVSGLPAEFSRERLDELDDESHVMMISIIGGDHRLVNYRSKTMAFVAADTEEKTVVVESYV VDVPEGNSEEETTSFADTIVGFNLKSLAKLSERVAHLKL (SEQ ID NO:77)

[0129] PIL12:

MKTSQEQHVCGSTVVQTINAPLPLVWSILRRFDNPKTFKHFVKTCKLRSGD

GGEGSVREVTVVSDLPASFSLERLDELDDESHVMVISIIGGDHRLVNYQSKTTVFVAAEEE KTVVVESYVVDVPEGNTEEETTLFADTIVGCNLRSLAKLSEKMMELT (SEQ ID NO:78).

[0130] PIL13:

MESSKQKRCRSSVVETIEAPLPLVWSILRSFDKPQAYQRFVKSCTMRSGGG

GGKGGEGKGSVRDVTLVSGFPADFSTERLEELDDESHVMVVSIIGGNHRLVNYKSKTKVVA SPEDMAKKTVVVESYVVDVPEGTSEEDTIFFVDNIIRYNLTSLAKLTKKMMK (SEQ ID NO:79).

[0131] PIL1:

MANSESSSSPVNEEENSQRISTLHHQTMPSDLTQDEFTQLSQSIAEFHTYQ LGNGRCSSLLAQRIHAPPETVWSVVRRFDRPQIYKHFIKSCNVSEDFEMRVGCTRDVNVIS

GLPANTSRERLDLLDDDRRVTGFSITGGEHRLRNYKSVTTVHRFEKEEEEERIWTVVLESY VVDVPEGNSEEDTRLFADTVIRLNLQKLASITEAMNRNNNNNNSSQVR (SEQ ID NO:80).

[0132] PIL2:

MSSSPAVKGLTDEEQKTLEPVIKTYHQFEPDPTTCTSLITQRIHAPASVVW PLIRRFDNPERYKHFVKRCRLISGDGDVGSVREVTVISGLPASTSTERLEFVDDDHRVLSF

RVVGGEHRLKNYKSVTSVNEFLNQDSGKVYTVVLESYTVDIPEGNTEEDTKMFVDTVVKLN LQKLGVAATSAPMHDDE (SEQ ID NO:81).

[0133] PIL3:

MNLAPIHDPSSSSTTTTSSSTPYGLTKDEFSTLDSIIRTHHTFPRSPNTCT SLIAHRVDAPAHAIWRFVRDFANPNKYKHFIKSCTIRVNGNGIKEIKVGTIREVSVVSGLP

ASTSVEILEVLDEEKRILSFRVLGGEHRLNNYRSVTSVNEFVVLEKDKKKRVYSVVLESYI VDIPQGNTEEDTRMFVDTVVKSNLQNLAVISTASPT (SEQ ID NO:82).

[0134] PIL4:

MLAVHRPSSAVSDGDSVQIPMMIASFQKRFPSLSRDSTAARFHTHEVGPNQ CCSAVIQEISAPISTVWSVVRRFDNPQAYKHFLKSCSVIGGDGDNVGSLRQVHVVSGLPAA

SSTERLDILDDERHVISFSVVGGDHRLSNYRSVTTLHPSPISGTVVVESYVVDVPPGNTKE ETCDFVDVIVRCNLQSLAKIAENTAAESKKKMSL (SEQ ID NO:83).

[0135] PIL5:

MRSPVQLQHGSDATNGFHTLQPHDQTDGPIKRVCLTRGMHVPEHVAMHHTH DVGPDQCCSSVVQMIHAPPESVWALVRRFDNPKVYKNFIRQCRIVQGDGLHVGDLREVMVV

SGLPAVSSTERLEILDEERHVISFSVVGGDHRLKNYRSVTTLHASDDEGTVVVESYIVDVP PGNTEEETLSFVDTIVRCNLQSLARSTNRQ (SEQ ID NO:84).

[0136] PIL6:

MPTSIQFQRSSTAAEAANATVRNYPHHHQKQVQKVSLTRGMADVPEHVELS HTHVVGPSQCFSVVVQDVEAPVSTVWSILSRFEHPQAYKHFVKSCHVVIGDGREVGSVREV

RVVSGLPAAFSLERLEIMDDDRHVISFSVVGGDHRLMNYKSVTTVHESEEDSDGKKRTRVV ESYVVDVPAGNDKEETCSFADTIVRCNLQSLAKLAENTSKFS (SEQ ID NO:85).

[0137] PIL7:

MEMIGGDDTDTEMYGALVTAQSLRLRHLHHCRENQCTSVLVKYIQAPVHLV WSLVRRFDQPQKYKPFISRCTVNGDPEIGCLREVNVKSGLPATTSTERLEQLDDEEHILGI

NIIGGDHRLKNYSSILTVHPEMIDGRSGTMVMESFVVDVPQGNTKDDTCYFVESLIKCNLK SLACVSERLAAQDITNSIATFCNASNGYREKNHTETNL (SEQ ID NO:86).

[0138] PIL8:

MEANGIENLTNPNQEREFIRRHHKHELVDNQCSSTLVKHINAPVHIVWSLV RRFDQPQKYKPFISRCVVKGNMEIGTVREVDVKSGLPATRSTERLELLDDNEHILSIRIVG

GDHRLKNYSSIISLHPETIEGRIGTLVIESFVVDVPEGNTKDETCYFVEALIKCNLKSLAD ISERLAVQDTTESRV (SEQ ID NO:87).

[0139] PIL9:

MMDGVEGGTAMYGGLETVQYVRTHHQHLCRENQCTSALVKHIKAPLHLVWS LVRRFDQPQKYKPFVSRCTVIGDPEIGSLREVNVKSGLPATTSTERLELLDDEEHILGIKI

IGGDHRLKNYSSILTVHPEIIEGRAGTMVIESFVVDVPQGNTKDETCYFVEALIRCNLKSL ADVSERLASQDITQ (SEQ ID NO:88).

[0140] PIR1:

MPSELTPEERSELKNSIAEFHTYQLDPGSCSSLHAQRIHAPPELVWSIVRR FDKPQTYKHFIKSCSVEQNFEMRVGCTRDVIVISGLPANTSTERLDILDDERRVTGFSIIG

GEHRLTNYKSVTTVHRFEKENRIWTVVLESYVVDMPEGNSEDDTRMFADTVVKLNLQKLAT VAEAMARNSGDGSGSQVT (SEQ ID NO:89).

[0141] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) é derivado de uma proteína ABI (também conhecida como insensível a ácido abscísico). Por exemplo, um membro de um par de ligação ao dimerizador de um organismo pode ser derivado de proteínas como as de Arabidopsis thaliana: ABI1 (Também conhecida como INSENSÍVEL A ÁCIDO ABSCÍSICO 1, Proteína fosfatase 2C 56, AtPP2C56, P2C56, e PP2C ABI1) e/ou ABI2(também conhecida como P2C77, Proteína fosfatase 2C 77, AtPP2C77, INSENSÍVEL A ÁCIDO ABSCÍSICO 2, Proteína fosfatase 2C ABI2, e PP2C ABI2). Por exemplo, um membro de par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, de cerca de 160 aa a cerca de 170 aa, de cerca de 170 aa a cerca de 180 aa, de cerca de 180 aa a cerca de 190 aa, ou de cerca de 190 aa a cerca de 200 aa de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:

[0142] ABI1:

MEEVSPAIAGPFRPFSETQMDFTGIRLGKGYCNNQYSNQDSENGDLMVSLPETSSCSVSGS HGSESRKVLISRINSPNLNMKESAAADIVVVDISAGDEINGSDITSEKKMISRTESRSLFE FKSVPLYGFTSICGRRPEMEDAVSTIPRFLQSSSGSMLDGRFDPQSAAHFFGVYDGHGGSQ VANYCRERMHLALAEEIAKEKPMLCDGDTWLEKWKKALFNSFLRVDSEIESVAPETVGSTS VVAVVFPSHIFVANCGDSRAVLCRGKTALPLSVDHKPDREDEAARIEAAGGKVIQWNGARV FGVLAMSRSIGDRYLKPSIIPDPEVTAVKRVKEDDCLILASDGVWDVMTDEEACEMARKRI

LLWHKKNAVAGDASLLADERRKEGKDPAAMSAAEYLSKLAIQRGSKDNISVVVVDLKPRRK LKSKPLN (SEQ ID NO:90).

[0143] ABI2:

MDEVSPAVAVPFRPFTDPHAGLRGYCNGESRVTLPESSCSGDGAMKDSSFEINTRQDSLTS SSSAMAGVDISAGDEINGSDEFDPRSMNQSEKKVLSRTESRSLFEFKCVPLYGVTSICGRR PEMEDSVSTIPRFLQVSSSSLLDGRVTNGFNPHLSAHFFGVYDGHGGSQVANYCRERMHLA LTEEIVKEKPEFCDGDTWQEKWKKALFNSFMRVDSEIETVAHAPETVGSTSVVAVVFPTHI FVANCGDSRAVLCRGKTPLALSVDHKPDRDDEAARIEAAGGKVIRWNGARVFGVLAMSRSI GDRYLKPSVIPDPEVTSVRRVKEDDCLILASDGLWDVMTNEEVCDLARKRILLWHKKNAMA

GEALLPAEKRGEGKDPAAMSAAEYLSKMALQKGSKDNISVVVVDLKGIRKFKSKSLN (SEQ ID NO:91).

[0144] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) é derivado de uma proteína Cri2 (também conhecida como criptocromo 2). Por exemplo, um membro de um dímero de um organismo (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) pode ser derivado de proteínas Cri2 de qualquer organismo (por exemplo, uma planta), tais como, entre outras, aqueles da Arabidopsis thaliana. Por exemplo, um membro de par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, de cerca de 160 aa a cerca de 170 aa, de cerca de 170 aa a cerca de 180 aa, de cerca de 180 aa a cerca de 190 aa, ou de cerca de 190 aa a cerca de 200 aa de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:

[0145] Cri2 (Arabidopsis thaliana)

MKMDKKTIVWFRRDLRIEDNPALAAAAHEGSVFPVFIWCPEEEGQFYPGRASRWWMKQSLA HLSQSLKALGSDLTLIKTHNTISAILDCIRVTGATKVVFNHLYDPVSLVRDHTVKEKLVER GISVQSYNGDLLYEPWEIYCEKGKPFTSFNSYWKKCLDMSIESVMLPPPWRLMPITAAAEA IWACSIEELGLENEAEKPSNALLTRAWSPGWSNADKLLNEFIEKQLIDYAKNSKKVVGNST SLLSPYLHFGEISVRHVFQCARMKQIIWARDKNSEGEESADLFLRGIGLREYSRYICFNFP FTHEQSLLSHLRFFPWDADVDKFKAWRQGRTGYPLVDAGMRELWATGWMHNRIRVIVSSFA VKFLLLPWKWGMKYFWDTLLDADLECDILGWQYISGSIPDGHELDRLDNPALQGAKYDPEG EYIRQWLPELARLPTEWIHHPWDAPLTVLKASGVELGTNYAKPIVDIDTARELLAKAISRT REAQIMIGAAPDEIVADSFEALGANTIKEPGLCPSVSSNDQQVPSAVRYNGSKRVKPEEEE

ERDMKKSRGFDERELFSTAESSSSSSVFFVSQSCSLASEGKNLEGIQDSSDQITTSLGKNG CK (SEQ ID NO:92).

[0146] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) é derivado de uma proteína CIB1 Arabidopsis thaliana (também conhecida como fator de transcrição bHLH63). Por exemplo, um membro de dímero adequado (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, de cerca de 160 aa a cerca de 170 aa, de cerca de 170 aa a cerca de 180 aa, de cerca de 180 aa a cerca de 190 aa, ou de cerca de 190 aa a cerca de 200 aa da seguinte sequência de aminoácidos:

MNGAIGGDLLLNFPDMSVLERQRAHLKYLNPTFDSPLAGFFADSSMITGGE MDSYLSTAGLNLPMMYGETTVEGDSRLSISPETTLGTGNFKKRKFDTETKDCNEKKKKMTM NRDDLVEEGEEEKSKITEQNNGSTKSIKKMKHKAKKEENNFSNDSSKVTKELEKTDYIHVR ARRGQATDSHSIAERVRREKISERMKFLQDLVPGCDKITGKAGMLDEIINYVQSLQRQIEF

LSMKLAIVNPRPDFDMDDIFAKEVASTPMTVVPSPEMVLSGYSHEMVHSGYSSEMVNSGYL HVNPMQQVNTSSDPLSCFNNGEAPSMWDSHVQNLYGNLGV (SEQ ID NO:93).

[0147] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) é derivado de uma proteína GAI Arabidopsis thaliana (também conhecida como Insensível a Ácido Abscísico, e proteína DELLA GAI). Por exemplo, um membro de par de ligação ao dimerizador adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, de cerca de 160 aa a cerca de 170 aa, de cerca de 170 aa a cerca de 180 aa, de cerca de 180 aa a cerca de 190 aa, ou de cerca de 190 aa a cerca de 200 aa da seguinte sequência de aminoácidos:

MKRDHHHHHHQDKKTMMMNEEDDGNGMDELLAVLGYKVRSSEMADVAQKLE QLEVMMSNVQEDDLSQLATETVHYNPAELYTWLDSMLTDLNPPSSNAEYDLKAIPGDAILN QFAIDSASSSNQGGGGDTYTTNKRLKCSNGVVETTTATAESTRHVVLVDSQENGVRLVHAL LACAEAVQKENLTVAEALVKQIGFLAVSQIGAMRKVATYFAEALARRIYRLSPSQSPIDHS LSDTLQMHFYETCPYLKFAHFTANQAILEAFQGKKRVHVIDFSMSQGLQWPALMQALALRP GGPPVFRLTGIGPPAPDNFDYLHEVGCKLAHLAEAIHVEFEYRGFVANTLADLDASMLELR PSEIESVAVNSVFELHKLLGRPGAIDKVLGVVNQIKPEIFTVVEQESNHNSPIFLDRFTES

LHYYSTLFDSLEGVPSGQDKVMSEVYLGKQICNVVACDGPDRVERHETLSQWRNRFGSAGF AAAHIGSNAFKQASMLLALFNGGEGYRVEESDGCLMLGWHTRPLIATSAWKLSTN (SEQ ID NO:94).

[0148] Em alguns casos, um membro de um dímero (por exemplo, um par de ligação ao dimerizador) é derivado de uma proteína GID1 Arabidopsis thaliana (também conhecida como receptora de Giberelina GID1). Por exemplo, um membro de dímero adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, de cerca de 160 aa a cerca de 170 aa, de cerca de 170 aa a cerca de 180 aa, de cerca de 180 aa a cerca de 190 aa, ou de cerca de 190 aa a cerca de 200 aa de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:

[0149] GID1A:

MAASDEVNLIESRTVVPLNTWVLISNFKVAYNILRRPDGTFNRHLAEYLDR KVTANANPVDGVFSFDVLIDRRINLLSRVYRPAYADQEQPPSILDLEKPVDGDIVPVILFF HGGSFAHSSANSAIYDTLCRRLVGLCKCVVVSVNYRRAPENPYPCAYDDGWIALNWVNSRS WLKSKKDSKVHIFLAGDSSGGNIAHNVALRAGESGIDVLGNILLNPMFGGNERTESEKSLD

GKYFVTVRDRDWYWKAFLPEGEDREHPACNPFSPRGKSLEGVSFPKSLVVVAGLDLIRDWQ LAYAEGLKKAGQEVKLMHLEKATVGFYLLPNNNHFHNVMDEISAFVNAEC (SEQ ID NO:95).

[0150] GID1B:

MAGGNEVNLNECKRIVPLNTWVLISNFKLAYKVLRRPDGSFNRDLAEFLDR KVPANSFPLDGVFSFDHVDSTTNLLTRIYQPASLLHQTRHGTLELTKPLSTTEIVPVLIFF HGGSFTHSSANSAIYDTFCRRLVTICGVVVVSVDYRRSPEHRYPCAYDDGWNALNWVKSRV WLQSGKDSNVYVYLAGDSSGGNIAHNVAVRATNEGVKVLGNILLHPMFGGQERTQSEKTLD GKYFVTIQDRDWYWRAYLPEGEDRDHPACNPFGPRGQSLKGVNFPKSLVVVAGLDLVQDWQ

LAYVDGLKKTGLEVNLLYLKQATIGFYFLPNNDHFHCLMEELNKFVHSIEDSQSKSSPVLL TP (SEQ ID NO:96)

[0151] GID1C:

MAGSEEVNLIESKTVVPLNTWVLISNFKLAYNLLRRPDGTFNRHLAEFLDRKVPANANPVN GVFSFDVIIDRQTNLLSRVYRPADAGTSPSITDLQNPVDGEIVPVIVFFHGGSFAHSSANS AIYDTLCRRLVGLCGAVVVSVNYRRAPENRYPCAYDDGWAVLKWVNSSSWLRSKKDSKVRI FLAGDSSGGNIVHNVAVRAVESRIDVLGNILLNPMFGGTERTESEKRLDGKYFVTVRDRDW

YWRAFLPEGEDREHPACSPFGPRSKSLEGLSFPKSLVVVAGLDLIQDWQLKYAEGLKKAGQ EVKLLYLEQATIGFYLLPNNNHFHTVMDEIAAFVNAECQ (SEQ ID NO:97). Dimerizadores

[0152] Dimerizadores ("agentes de dimerização”) que podem fornecer para a dimerização de um primeiro membro de um par de ligação ao dimerizador e um segundo membro de um par de ligação de dimerizador incluem, por exemplo, (onde o dimerizador está entre parênteses após o par de ligação ao dimerizador: a) FKBP e FKBP (rapamicina); b) FKBP e CnA (rapamicina); c) FKBP e ciclofilina (rapamicina): a) FKBP e FRG (rapamicina); e) GirB e GirB (coumermicina); f) DHFR e DHFR (metrotexato); g) DmrB e DmrB (AP20187); h) PIL e ABI (ácido abscísico); i) Cri2 e CIB1 (luz azul); e j) GAI e GID1 (giberelina).

[0153] Conforme observado acima, a rapamicina pode servir como dimerizador. Como alternativa, um derivado de rapamicina ou análogo pode ser usado. Vide, por exemplo, WO96/41865; WO 99/36553; WO 01/14387; e Ye et al (1999)

Science 283: 88-91. Por exemplo, análogos, homólogos, derivados e outros compostos estruturalmente relacionados à rapamicina ("rapalogs") incluem, entre outros, variantes de rapamicina possuindo um ou mais das seguintes modificações em relação à rapamicina: desmetilação, eliminação ou substituição do metoxi em C7, C42 e/ou C29; eliminação, derivatização ou substituição do hidróxi em C13, C43 e/ou C28; redução, eliminação ou derivatização da cetona em C14, C24 e/ou C30; substituição do anel pipecolato de 6 membros com um anel prolil de 5 membros; e troca alternativa no anel ciclohexilo ou substituição do anel de ciclohexilo por um anel ciclopentilo substituto. Informações adicionais são fornecidas em, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 5,525,610; 5,310,903 5,362,718; e 5,527,907. A epimerização seletiva do grupo hidroxila C-28 tem sido descrita; vide, por exemplo, WO 01/14387. Agentes sintéticos de dimerização adicionais adequados para utilização como alternativa para a rapamicina incluem aqueles descritos na Publicação de Patente dos EUA nº 2012/0130076.

[0154] A rapamicina tem a seguinte estrutura: Rapamicina

[0155] Rapalogs adequados incluem, por exemplo:

28- epirapamicina

[0156] Também adequado como um rapalog é o composto com a seguinte fórmula:

[0157] onde n é 1 ou 2; R28 e R43 são independentemente H, ou um radical alifático ou acilo substituído ou não substituído; um de R7a e R7b é H e o outro é um halo, RA, ORA, SRA, -OC(O)RA, -OC(O)NRARB, -NRARB, - B A B A B A B A B’ 7a 7b NR C(OR)R , NR C(O)OR , -NR SO2R , ou NR SO2NR R ; ou R e R , juntos, são H no grupo tetraeno:

[0158] onde RA é H ou um alifático substituído ou não substituído, grupo heteroalifático, arilo, ou heteroarilo e onde RB e RB’ são independentemente H, OH, ou um alifático substituído ou não substituído, grupo heteroalifático, arilo, ou heteroarilo.

[0159] Conforme observado acima, coumermicina pode servir como agente dimerizador. Alternativamente, um análogo à coumermicina pode ser usado. Vide, por exemplo, Farrar et al. (1996) Nature 383:178-181; e U.S. Pat. No. 6,916,846.

[0160] Conforme observado acima, em alguns casos, o agente dimerizador é metotrexato, por exemplo, um dímero de metotrexato não citotóxico homo-bifuncional. Vide, por exemplo, Patente dos EUA, nª 8.236.925. Domínio de sinalização intracelular

[0161] Domínios de sinalização intracelular adequados para uso em um RQA desta invenção incluem qualquer domínio de sinalização desejado que forneça um sinal distinto e detectável (por exemplo, aumento da produção de uma ou mais citocinas pela célula; alterações na transcrição de um gene alvo; mudança na atividade de uma proteína; mudança no comportamento das células, por exemplo, morte celular; a proliferação celular; diferenciação celular; sobrevivência celular; modulação de respostas de sinalização celular, etc.) em resposta à ativação do RQA (isso é, ativado por antígeno e agente de dimerização). Em algumas concretizações, o domínio de sinalização intracelular inclui pelo menos um grupo ITAM (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, etc.), conforme descrito abaixo. Em algumas concretizações, o domínio de sinalização intracelular inclui cadeias de sinalização do tipo DAP10/CD28. Em algumas concretizações, o domínio de sinalização intracelular não é ligado de forma covalente ao RQA ligado à membrana, mas é difuso no citoplasma.

ITAM

[0162] Domínios de sinalização intracelular adequados para uso em um RQA desta invenção incluem grupo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) contendo polipeptídios de sinalização intracelular. Um grupo ITAM é YX1X2L/I, onde X1 e X2 são, independentemente, qualquer aminoácido (SEQ ID NO:130). Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular de um RQA de um organismo inclui 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos ITAM. Em alguns casos, um grupo ITAM é repetido duas vezes em um domínio de sinalização intracelular, e a primeira e segunda ocorrências do grupo ITAM são separadas uma da outra por 6 a 8 aminoácidos, por exemplo, (YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I), onde n é um número inteiro de 6 a 8, e cada um dos 6-8 X3 pode ser qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 131). Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular de um RQA de um organismo inclui 3 grupos ITAM.

[0163] Um domínio de sinalização intracelular adequado pode ser uma porção contendo grupo ITAM derivada de um polipeptídio que contenha um grupo ITAM. Por exemplo, um domínio de sinalização intracelular pode ser um domínio contendo um grupo ITAM de qualquer proteína contendo grupo ITAM. Portanto, um domínio de sinalização intracelular adequado não precisa conter a sequência completa de toda a proteína da qual é derivado. Exemplos de polipeptídios adequados contendo grupo ITAM incluem, entre outros: DAP12; FCER1G (cadeia gama de receptor épsilon I Fc); CD3D (CD3 delta); CD3e (CD3 épsilon); CD3G (CD3 gama); CD3Z (CD3 zeta); e CD79A (cadeia alfa de proteína associada a complexo antígeno-receptor).

[0164] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado de DAP12 (também conhecido como TYROBP; proteína de ligação de quinase tirosina proteína TYRO; KARAP; PLOSL; proteína de ativação de DNAX 12; KAR- proteína associada; proteína de ligação de quinase tirosina proteína TYRO; proteína ligada a quinase tirosina proteína TYRO; proteína associada a receptor de ativação de exterminadora; proteína associada a receptor de ativação de exterminadora, etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos (4 isoformas):

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAV YFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO:98);

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDL

VLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYY K (SEQ ID NO:99);

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVY FLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID

NO:100); ou

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVY FLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO:101), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0165] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos DAP12. Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: ESPYQELQGQRSDVYSDLNTQ (SEQ ID NO:102), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0166] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado de FCER1G (também conhecido como FCRG; cadeia gama I receptor épsilon Fc; cadeia gama de receptor épsilon Fc; gama RI épsilon fc; fcRgamma; fceRI gama; gama de subunidade de receptor de imunoglobulina de alta afinidade; receptor E de imunoglobulina, de alta afinidade, cadeia gama; etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVR

KAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQ ID NO:103), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0167] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos FCER1G. Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: DGVYTGLSTRNQETYETLKHE (SEQ ID NO:104), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0168] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado de cadeia delta CD3 de glicoproteína da superfície de células T (também conhecida como CD3D; CD3- DELTA; T3D; antígeno CD3, subunidade delta; CD3 delta; antígeno CD3d, polipeptídio delta (complexo TiT3); OKT3, cadeia delta; cadeia delta T3 de receptor de células T; cadeia delta CD3 de glicoproteína de superfície de células T; etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos de com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 170 aa, de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos (2 isoformas):

MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTL LSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDV

IATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK (SEQ ID NO:105) ou

MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLG

KRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGN WARNK (SEQ ID NO:106) , onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0169] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos CD3. Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: DQVYQPLRDRDDAQYSHLGGN (SEQ ID NO:107), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0170] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado de uma cadeia épsilon CD3 de glicoproteína da superfície de células T (também conhecida como CD3e, cadeia épsilon T3/Leu-4 de antígeno da superfície de células T , cadeia épsilon CD3 de glicoproteína da superfície de células T, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e,

etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos de com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 205 aa, da seguinte sequência de aminoácidos:

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQ YPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYL

YLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQR GQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO:108), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0171] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos CD3. Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (SEQ ID NO:109), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0172] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado da cadeia gama CD3 de glicoproteína da superfície de células T (também conhecida como CD3G, cadeia gama T3 de receptor de células T, CD3-GAMA, T3G, polipeptídio gama (complexo TiT3), etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos de com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 180 aa, da seguinte sequência de aminoácidos:

MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAK NITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNA

ATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSH LQGNQLRRN (SEQ ID NO:110), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0173] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos CD3. Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: DQLYQPLKDREDDQYSHLQGN (SEQ ID NO:111), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0174] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado da cadeia zeta CD3 de glicoproteína da superfície de células T (também conhecida como CD3GZ cadeia zeta T3 de receptor de células T,CD247,CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos de com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 140 aa, de cerca de 140 aa a cerca de 150 aa, ou de cerca de 150 aa a cerca de 160 aa, de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos (2 isoformas):

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADA

PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:112) ou

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADA

PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:113) , onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0175] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos CD3.

Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos:

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:18); NQLYNELNLGRREEYDVLDKR (SEQ ID NO:114); EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (SEQ ID NO:115); ou DGLYQGLSTATKDTYDALHMQ (SEQ ID NO:116), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0176] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular é derivado de CD79A (também conhecido como cadeia alfa de proteína associada ao complexo receptor de antígeno de células B; antígeno CD79a (alfa associada a imunoglobulina); glicoproteína de membrana MB-1; ig-alfa; proteína associada a imunoglobulina ligada à membrana; proteína associada a IgM da de superfície; etc.). Por exemplo, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98 %, ou 100% da identidade da sequência de aminoácidos com uma extensão contígua de cerca de 100 aminoácidos a cerca de 110 aminoácidos (aa), de cerca de 110 aa a cerca de 115 aa, de cerca de 115 aa a cerca de 120 aa, de cerca de 120 aa a cerca de 130 aa, de cerca de 130 aa a cerca de 150 aa, de cerca de 150 aa a cerca de 200 aa, ou de cerca de 200 aa a cerca de 220 aa, de qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos (2 isoformas):

[0177] MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPAS

LMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGG IYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLL

LFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLE KP (SEQ ID NO:117); ou

[0178] MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPAS

LMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGT

KNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYED ISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO:118) , onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados.

[0179] Da mesma forma, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular pode incluir uma porção contendo grupo ITAM da sequência completa de aminoácidos DA79A. Portanto, um polipeptídio de domínio de sinalização intracelular adequado pode incluir uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para a seguinte sequência de aminoácidos: ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (SEQ ID NO:119), onde os grupos ITAM estão em negrito e sublinhados. DAP10/CD28

[0180] Domínios de sinalização intracelular adequados ao uso em um RQA desta invenção incluem uma cadeia de sinalização do tipo DAP10/CD28.

[0181] Um exemplo de uma cadeia de sinalização

DAP10 é a sequência de aminoácidos: RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:120). Em algumas concretizações, um domínio de sinalização intracelular adequado inclui uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência completa de aminoácidos RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO:120).

[0182] Um exemplo de uma cadeia de sinalização CD28 é a sequência de aminoácidos

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRS (SEQ ID NO:121). Em algumas concretizações, um domínio de sinalização intracelular adequado inclui uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência completa de aminoácidos

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRS (SEQ ID NO:121). ZAP70

[0183] Domínios de sinalização intracelular adequados para uso em um RQA desta invenção incluem um polipeptídio ZAP70, por exemplo, um polipeptídio incluindo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos para uma extensão contígua de cerca de 300 aminoácidos e cerca de 400 aminoácidos, de cerca de 400 aminoácidos a cerca de 500 aminoácidos, ou de cerca de 500 aminoácidos a cerca de 619 aminoácidos da seguinte sequência de aminoácidos:

MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLV HDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQP GVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEA ERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQ LVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPE PARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGV YRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMA GGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKIS DFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKP

YKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSL ASKVEGPPGSTQKAEAACA (SEQ ID NO:36). Sequências adicionais

[0184] O primeiro e/ou segundo polipeptídio de um RQA de um organismo pode incluir ainda um ou mais domínios de polipeptídio adicionais, onde esses domínios incluem, entre outras, uma sequência de sinal; uma identificação de epítopo; um domínio de afinidade; e um polipeptídio que produz um sinal detectável. Sequências de sinal

[0185] Sequências de sinal que são adequadas para uso em um RQA de um organismo, por exemplo, no primeiro polipeptídio de um RQA de um organismo, incluem qualquer sequência de sinal eucariótico, incluindo uma sequência de sinal de ocorrência natural, um sequência de sinal sintético (por exemplo, feita pelo homem), etc. Identificação de epítopo

[0186] Identificações de epítopo adequadas incluem, entre outras, hemaglutinina (HA; por exemplo, YPYDVPDYA (SEQ ID NO:122); FLAG (por exemplo, DYKDDDDK (SEQ

ID NO:123); c-myc (por exemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO:4), e semelhantes. Domínio de afinidade

[0187] Domínios de afinidade incluem sequências de peptídeos que podem interagir com um parceiro de ligação, por exemplo, como um imobilizado em um suporte sólido, úteis para a identificação ou purificação. As sequências de ADN que codificam múltiplos aminoácidos individuais consecutivos, tais como histidina, quando fundidas com a proteína expressa, podem ser usadas para a purificação de etapa única da proteína recombinante por ligação de alta afinidade a uma coluna de resina, tal como sefarose de níquel. Domínios de afinidade exemplificativos incluem His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 124), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:125), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 4), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:123), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:126), hemaglutinina, por exemplo, Identificador de HA (YPYDVPDYA) (SEQ ID NO:122), GST, tioredoxina, domínio de ligação à celulose, RYIRS (SEQ ID NO:127), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:128), domínio de ligação a quitina, S-peptídeo, peptídeo T7, domínio SH2, identificação de RNA de fim C, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO: 129), domínios de ligação de metal, por exemplo, domínios ou ligantes de zinco ou domínios de ligação de cálcio, como aqueles a partir de proteínas de ligação a cálcio, por exemplo, grande subunidade de calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadeia leve da miosina, recoverin, S- modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frequenina, caltractina, calpaína, proteínas S100, parvalbumina, calbindina D9K, calbindina D28K, e calretinina, inteinas, biotina, estreptavidina, MyoD, Id, sequências de zíper leucina, e proteína de ligação a maltose. Polipeptídios produtores de sinal detectáveis

[0188] Proteínas produtoras de sinal detectável adequadas incluem, por exemplo, proteínas fluorescentes; enzimas que catalisam uma reação que gera um sinal detectável como um produto; e semelhantes.

[0189] Proteínas fluorescentes adequados incluem, entre outras, proteína fluorescente verde (GFP) ou as suas variantes, variante fluorescente azul de GFP (BFP), variante fluorescente ciano de GFP (CFP), variante fluorescente amarela de GFP (YFP), GFP reforçada (EGFP), CFP reforçada (ECFP), YFP reforçada (EYFP), GFPS65T, Esmeralda, Topázio (TYFP), Vênus, Citrina, mCitrina, GFPuv, EGFP desestabilizada (dEGFP), ECFP desestabilizada (dECFP), EYFP desestabilizada (dEYFP) , mCFPm, Cerulean, T-Safira, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-monômero, J- Red, dímero2, t-dímero2(12), mRFP1, pociloporina, Renilla GFP, GFP Monstro, paGFP, proteína Kaede e proteína exterminadora, conjugados de ficobiliproteínas e ficobiliproteína incluindo B-ficoeritrina, R-Ficoeritrina e aloficocianina. Outros exemplos de proteínas fluorescentes incluem mMelada, mBanana, mLaranja, dTomate, tdTomate, mTangerina, mMorango, mCereja, mUva1, mFramboesa, mUva2, mAmeixa (Shaner et al (2005) Nat. Methods: 2:905-909), e semelhantes. Qualquer uma da variedade de proteínas fluorescentes e coloridas das espécies Anthozoan, conforme descrito em, por exemplo, Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973, é adequada para uso.

[0190] Enzimas adequadas incluem, entre outras, peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), beta-

galactosidase (GAL), desidrogenase de glicose-6-fosfato, beta-N-acetilglucosaminidase, β-glucuronidase, invertase, Xantina Oxidase, luciferase de vaga-lume, glucose oxidase (GO), e semelhantes. Recombinação de sequências

[0191] Em alguns casos, sequências de polipeptídios de um RQA, por exemplo, domínios do RQA, podem ser rearranjadas ou excluídas em uma célula pelo uso de tecnologia de recombinação específica do local. Em certas concretizações, a resposta relacionada à ativação celular para um RQA em particular pode ser alterada por recombinação específica do local, por exemplo, o primeiro domínio de sinalização intracelular de um RQA induzindo uma primeira resposta relacionada à ativação pode ser trocado por um segundo domínio de sinalização intracelular induzindo uma segunda resposta relacionada à ativação. Em certas concretizações, uma resposta a um dimerizador em particular um RQA pode ser alterada por recombinação específica do local, por exemplo, um primeiro par de ligação ao dimerizador causando a dimerização de um RQA na presença de um primeiro dimerizador pode ser trocado por um segundo par de lifação ao dimerizador causando a dimerização de um RQA na presença de um segundo dimerizador. Como estará claro a um especialista, a recombinação específica do local pode ser usada em uma célula para trocar qualquer domínio ou sequência de um RQA por qualquer outro domínio ou sequência conforme mostrado neste documento. Como também estará claro a um especialista, a recombinação específica do local pode ser usada em uma célula para excluir qualquer domínio ou sequência de um RQA. Essa troca e excisão de sequências de domínios é conhecida na área, vide, por exemplo, troca de domínio em signalobodies como descrito em Tone et al. (2013) Biotechnology and Bioengineering, 3219-3226, cujas informações estão incluídas neste documento por referência. Mecanismos e exigências para realização de recombinação específica do local in vivo também são bem conhecidas na área, vide, por exemplo, Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 e Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA), cujas informações são incluídas neste documento por referência.

ÁCIDOS NUCLEICOS

[0192] Esta invenção proporciona um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção. Um ácido nucleico incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção será em algumas concretizações DNA, incluindo, por exemplo, um vetor de expressão recombinante. Um ácido nucleico incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção será em algumas concretizações RNA, por exemplo, RNA sintetizado in vitro.

[0193] Em alguns casos, um ácido nucleico desta invenção inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro polipeptídio (e não o segundo polipeptídio) de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção. Em alguns casos, um ácido nucleico desta invenção inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica somente o segundo polipeptídio (e não o primeiro polipeptídio) de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção. Em alguns casos, um ácido nucleico desta invenção inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica ambos o primeiro polipeptídio e o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção.

[0194] Em alguns casos, um ácido nucleico de um organismo possibilita a produção de um RQA desta invenção, por exemplo, em uma célula de mamífero. Em outros casos, um ácido nucleico de um organismo possibilita a amplificação de um ácido nucleico de decodificação de RQA.

[0195] Uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA desta invenção pode ser operativamente ligada a um elemento de controle transcricional, por exemplo, um promotor, e potenciador, etc.

[0196] Elementos promotores e potenciadores adequados são conhecidos na área. Para expressão em uma célula bacteriana, promotores adeaudos incluem, entre outros, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P e trc. Para expressão em uma célula eucariótica, promotores adequados incluem, entre outros, elementos promotores e potenciadores de genes de imunoglobulina de cadeia leve ou pesada; promotor precoce imediato de citomegalovírus; promotor de cinase de timidina de vírus herpes simplex; promotores precoces e tardios de SV40; promotor presente em repetições terminais longas de um retrovírus; promotor de metalotioneina-I de camundongo; e vários promotores específicos de tecidos conhecidos na área.

[0197] Promotores reversíveis adequados, incluindo promotores induzíveis reversíveis são conhecidos na área. Tais promotores reversíveis podem ser isolados e derivados de muitos organismos, por exemplo, eucariontes e procariontes. Modificação de promotores reversíveis derivados de um primeiro organismo para uso em um segundo organismo, por exemplo, um primeiro procarionte e um segundo eucarionte, um primeiro eucarionte e um segundo procarionte, etc., é bem conhecida na área. Tais promotores reversíveis, e sistemas baseados nesses promotores reversíveis, mas incluindo também proteínas de controle adicionais, incluem, entre outros, promotores regulados por álcool (por exemplo, desidrogenase de álcool I (alcA) promotor de gene, promotores que respondem às proteínas transativadoras de álcool (AlcR) , etc.), promotores regulados portetraciclina, (por exemplo, sistemas de promotor, incluindo TetActivators TetON, TetOFF, etc.), promotores de regulação de esteroides (por exemplo, sistemas promotores de receptores de glucocorticoides de rato, sistemas promotores de receptor de estrogénio humano, sistemas de promotor de retinoide, sistemas promotores da tiroide , sistemas de promotor da ecdisona, sistemas promotores de mifepristona , etc.), promotores regulados por metal (por exemplo, sistemas promotores de metalotioneína, etc.), promotores regulados relacionados a patogênese (por exemplo, promotores regulados de ácido salicílico, promotores regulados de etileno, promotores regulados de benzotiadiazole, etc. ), promotores regulados de temperatura (por exemplo, promotores indutíveis de choque térmico (por exemplo, HSP-70, HSP-90, o promotor de choque térmico de soja, etc.), promotores regulados de luz, promotores indutíveis sintéticos, e semelhantes.

[0198] Em alguns casos, o locus ou a construção de transgene contendo o promotor adequado é irreversivelmente ligado através da indução de um sistema induzível. Sistemas adequados para a indução de um interruptor irreversível são bem conhecidos na área, por exemplo, a indução de um interruptor irreversível pode fazer uso de uma recombinação mediada por Cre-lox (vide, por exemplo, Fuhrmann-Benzakein, et al., PNAS (2000) 28:e99, cuja invenção é incorporada a este documento por referência). Qualquer combinação adequada de recombinase, endonuclease, ligase, locais de recombinação, etc. conhecida na área pode ser utilizada para a obtenção de um promotor irreversivelmente conversível. Métodos, mecanismos e exigências para a realização de recombinação específica do local, descritos em outros locais que não este documento, encontram utilização na geração de promotores irreversivelmente conversíveis e são bem conhecidas na área, vide, por exemplo, Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 e Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA), cujas informações são incluídas neste documento por referência.

[0199] Em alguns casos, o promotor é um promotor específico de célula CD8, um promotor específico de célula CD4, um promotor específico de neutrófilo, ou um promotor específico de NK. Por exemplo, um promotor de gene CD4 pode ser usado, por exemplo, Salmon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101:3416. Como outro exemplo, o promotor de gene CD8 pode ser usado. Expressão especifica de célula NK pode ser alcançada por meio do uso de um promotor Ncrl (p46), por exemplo, Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1565.

[0200] Em algumas concretizações, por exemplo,

para a expressão em uma célula de levedura, um promotor adequado é um promotor constitutivo, tal como um promotor ADH1, um promotor PGK1, um promotor ENO, um promotor PYK1 e semelhantes; ou um promotor regulável, tal como um promotor GAL1, um promotor GAL10, um promotor de ADH2, um promotor de PHO5, um promotor de CUP1, um promotor de GAL7, um promotor MET25, um promotor MET3, um promotor CYC1, um promotor de HIS3, um promotor de ADH1, um promotor PGK, um promotor GAPDH, um promotor ADC1, um promotor TRP1, um promotor URA3, um promotor LEU2, um promotor ENO, um promotor TP1, e AOX1 (por exemplo, para uso em Pichia). A seleção do vetor e promotor apropriados está bem no nível de conhecimento padrão na área.

[0201] Os promotores adequados para uso em células hospedeiras procarióticas incluem, entre outros, um promotor de polimerase T7 RNA bacteriófago; um promotor trp; um promotor do operão lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor híbrido lac/tac, um promotor híbrido tac/trc, um promotor trp/lac, um promotor T7/lac; um promotor trc; um promotor tac, e semelhantes; um promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tais como um promotor ssaG ou um promotor relacionado (vide, por exemplo, Publicação de Patente dos EUA nº 20040131637), um promotor pagC (Pulkkinen e Miller, J. Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al, PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), um promotor nirB (Harborne et al (1992). Mol Micro. 6:2805-2813), e semelhantes (ver, por exemplo, Dunstan et al (1999) Infect Immun 67:5133-5141; McKelvie et al (2004) Vaccine 22:3243-3255; e Chatfield et al (1992) Biotechnol. 10: 888-892);. um promotor sigma70, por exemplo, um promotor sigma70 de consenso (vide, por exemplo,

GenBank Accession nº AX798980, AX798961, e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor de dps, um promotor de spv, e semelhantes; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (vide, por exemplo, WO96/17951); um promotor actA (vide, por exemplo, Shetron- Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); um promotor rpsM (vide, por exemplo, Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22:367); um promotor tet 9vide, por exemplo, Hillen,W. and Wissmann,A. (1989) In Saenger,W. and Heinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein–Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143–162); um promotor SP6 (vide, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); e semelhantes. Promotores fortes adequados para uso em procariontes como Escherichia coli incluem, entre outros, Trc, Tac, T5, T7, e PLambda. Exemplos não exaustivos de operadores para uso em células hospedeiras bacterianas incluem um operador promotor de lactose (proteína repressora LacI muda de conformação quando em contato com lactose, evitando assim que a proteína repressora LacI se ligue ao operador), um operador do promotor de triptofano (quando complexado com triptofano , proteína do repressor TrpR tem uma conformação que se liga ao operador; na ausência de triptofano, a proteína do repressor TrpR tem uma conformação que não se liga ao operador), e um operador do promotor tac (vide, por exemplo, deBoer et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25).

[0202] Uma sequência de nucleotídeos codificando um RQA de um organismo pode ser apresentada em um vetor de expressão e/ou um vetor de clonagem. Quando um RQA de um organismo inclui dois polipeptídios separados, a sequências de nucleotídeos codificando os dois polipeptídios pode ser clonada no mesmo vetor ou em vetores separados. Um vetor de expressão pode incluir um marcador selecionável, uma origem de replicação, e outras características que proporcionam a replicação e/ou a manutenção do vetor. Vetores de expressão adequada incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores virais, e semelhantes.

[0203] Um grande número de vetores e promotores adequados é conhecido pelos especialistas da área; muitos estão disponíveis comercialmente para a geração de um constructos recombinantes em organismo. Os seguintes vetores são fornecidos como exemplo. Bacteriano: PBS, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., EUA); pTrc99A, pKK223- 3, pKK233-3, pDR540, e pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suécia). Eucarionte: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (Pharmacia).

[0204] Os vetores de expressão geralmente têm locais de restrição convenientes localizados perto da sequência do promotor para proporcionar a inserção de sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas heterólogas. Um marcador selecionável operatório no hospedeiro de expressão pode estar presente. Vetores de expressão adequados incluem, entre outros, vetores virais (por exemplo, vetores virais baseados em vírus vacina; poliovírus; adenovírus (vide, por exemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO

94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adeno-associado (vide, por exemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; e Flotte et al, PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; vírus herpes simplex; vírus da imunodeficiência humana (vide, por exemplo, Miyoshi et al, PNAS. 94:10319 23, 1997; Takahashi et al, J. Virol 73:7812 7816, 1999); um vetor retroviral (por exemplo, Vírus da Leucemia Murina, vírus da necrose do baço, e vetores derivados de retrovírus como o Vírus do Sarcoma de Rous, do Vírus do Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo, e vírus do tumor mamário); e semelhantes.

[0205] Como observado acima, em algumas concretizações, um ácido nucleico incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção será em algumas concretizações RNA, por exemplo, RNA sintetizado in vitro. Métodos para a síntese in vitro de RNA são conhecidos na área; qualquer método conhecido pode ser usado para sintetizar RNA incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção. Métodos para introdução do RNA em uma célula hospedeira são conhecidos na área. Vide, por exemplo, Zhao et al. (2010) Cancer Res. 15:9053. A introdução do ARN incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico, condicionalmente ativo desta invenção em uma célula hospedeira pode ser feita in vitro ou ex vivo ou in vivo. Por exemplo, uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula NK, um linfócito T citotóxico, etc.) pode ser electroporada in vitro ou ex vivo, com RNA que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o primeiro e/ou o segundo polipeptídio de um RQA heterodimérico condicionalmente ativo desta invenção. Células

[0206] Esta invenção fornece uma célula de mamífero que é geneticamente modificada para produzir um RQA heterodimérico condicionalmente ativo desta invenção.

[0207] Células de mamífero adequadas incluem células primárias e linhas celulares imortalizadas. Linhas celulares de mamíferos adequadas incluem as linhas celulares humanas, linhas celulares de primatas não humanos, linhas celulares de roedores (por exemplo, camundongo, rato), e semelhantes. Linhas celulares de mamíferos adequadas incluem, entre outras, células HeLa (por exemplo, American Type Culture Collection (ATCC) nº CCL-2), células CHO (por exemplo, ATCC nºs CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por exemplo, ATCC nº CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por exemplo, ATCC nº CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por exemplo, ATCC nº CCL10), células PC12 (ATCC nº CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC nº CRL1651), células RAT1, células L de camundongo (ATCC nº CCLI.3), células de rim embrionário humano (HEK) (ATCC nº CRL1573), células HLHepG2,

Hut-78, Jurkat, HL-60, linhas celulares NK (por exemplo, NKL, NK92, e YTS), e semelhantes.

[0208] Em alguns casos, a célula não é uma linha celular imortalizada, mas sim uma célula (por exemplo, uma célula primária) obtida a partir de um indivíduo. Por exemplo, em alguns casos, a célula é um leucócito obtido a partir de um indivíduo. Como, por exemplo, a célula é um linfócito T obtido a partir de um indivíduo. Como outro exemplo, a célula é uma célula citotóxica obtida a partir de um indivíduo. Como outro exemplo, a célula é uma célula- tronco ou progenitora obtida a partir de um indivíduo. Métodos para ativação de um leucócito

[0209] Esta invenção fornece métodos para ativar um leucócito in vitro, in vivo ou ex vivo. Os métodos geralmente envolvem o contato de um leucócito (in vitro, in vivo, ou ex vivo) com um agente de dimerizador e um antígeno, sendo o leucócito geneticamente modificado para produzir um RQA heterodimérico condicionalmente ativo desta invenção. Na presença do agente dimerizador e o antígeno, o RQA heterodimérico condicionalmente ativo dimeriza e ativa o leucócito, produzindo assim um leucócito ativo. Leucócitos incluem, por exemplo, um linfócito T citotóxico, uma célula NK, uma célula CD4+ T, uma célula reguladora T (Treg), etc.

[0210] O contato ao leucócito geneticamente modificado (por exemplo, um linfócito T, uma célula NK) com um agente dimerizador e um segundo membro de um par de ligação específico (por exemplo, um antígeno, um ligante, um receptor) pode aumentar a produção de uma citocina pelo leucócito em, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% , pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais do que 10 vezes, em comparação com a quantidade de citocina produzida pelos leucócitos na ausência do segundo membro de um par de ligação específico e/ou o agente dimerizador. Citocinas cuja produção pode ser aumentada incluem, entre outras, IL-2 e IFN-γ.

[0211] O contato ao leucócito geneticamente modificado (por exemplo, um linfócito T, uma célula NK) com um agente dimerizador e um antígeno pode aumentar a produção de uma citocina pelo leucócito em, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% , pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais do que 10 vezes, em comparação com a quantidade de citocina produzida pelos leucócitos na ausência do antígeno e/ou o agente dimerizador. Citocinas cuja produção pode ser aumentada incluem, entre outras, IL-2 e IFN-γ.

[0212] O contato ao leucócito geneticamente modificado (por exemplo, linfócito T) com um agente dimerizador e um segundo membro de um par de ligação específico (por exemplo, um antígeno, um ligante, um receptor) pode aumentar a atividade citotóxica da célula citotóxica em, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% , pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais do que 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula citotóxica na ausência do agente dimerizador.

[0213] O contato ao leucócito geneticamente modificado (por exemplo, linfócito T) com um agente dimerizador e um antígeno pode aumentar a atividade citotóxica da célula citotóxica em, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% , pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais do que 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula citotóxica na ausência do agente dimerizador.

[0214] Em outras concretizações, por exemplo, dependendo do leucócito hospedeiro, o contato a um leucócito geneticamente modificado com um agente de dimerizador e um antígeno pode aumentar ou diminuir a proliferação celular, sobrevivência celular, morte celular, e semelhantes. Métodos para geração de células condicionalmente ativáveis

[0215] Esta invenção fornece um método de geração de uma célula condicionalmente ativável. O método geralmente envolve a modificação genética de uma célula de mamífero com um vetor de expressão, ou um RNA (por exemplo, RNA transcrito in vitro), incluindo sequências de nucleotídeos que codificam um RQA heterodimérico condicionalmente ativo desta invenção. A célula geneticamente modificada é ativável condicionalmente na presença de: a) um antígeno ao qual o primeiro polipeptídio do RQA se liga; e b) um dimerizador (um agente dimerizador). A modificação genética pode ser realizada in vivo, in vitro ou ex vivo. A célula pode ser um leucócito (por exemplo, um linfócito T ou célula NK), uma célula-tronco, uma célula progenitora, etc.

[0216] Em alguns casos, a modificação genética é realizada ex vivo. Por exemplo, um linfócito T, uma célula- tronco ou uma célula NK é obtida a partir de um indivíduo; e a célula obtida a partir do indivíduo é geneticamente modificada para expressar um RQA desta invenção. A célula geneticamente modificada é ativável condicionalmente na presença de: a) um antígeno ao qual o primeiro polipeptídio do RQA se liga; e b) um dimerizador. Em alguns casos, a célula geneticamente modificada é ativada ex vivo. Em outros casos, a célula geneticamente modificada é introduzida em um indivíduo (por exemplo, o indivíduo do qual se obteve a célula); e a célula geneticamente modificada é ativada in vivo, por exemplo, por administração de um dimerizador ao indivíduo. Por exemplo, onde o antígeno esteja presente na superfície de uma célula no indivíduo, não há necessidade de se administrar um antígeno. A célula geneticamente modificada entra em contato com o antígeno presente na superfície de uma célula no indivíduo; e, por administração de um dimerizador ao indivíduo, a célula geneticamente modificada é ativada. Por exemplo, quando a célula geneticamente modificada é um linfócito T, a célula geneticamente modificada pode exibir citotoxicidade para uma célula que apresente um antígeno na sua superfície ao qual o RQA se liga. Métodos de tratamento

[0217] Esta invenção fornece vários métodos de tratamento usando um RQA em um organismo. Métodos de citotoxicidade

[0218] Um RQA desta invenção, quando presente em um linfócito T ou uma célula NK, pode mediar citotoxicina para uma célula alvo. Um RQA desta invenção se liga a um antígeno presente em uma célula alvo, mediando assim a morte de uma célula alvo por um linfócito T ou uma célula NK geneticamente modificada para produzir o RQA. O domínio de ligação do antígeno do RQA se liga a um antígeno presente na superfície de uma célula alvo.

[0219] Células alvo incluem, entre outras, células cancerosas. Assim, esta invenção fornece métodos para matar, ou inibir o crescimento de uma célula cancerosa alvo, com um método que envolve o contato de uma célula efetora imune citotóxica (por exemplo, uma célula T citotóxica, ou uma célula NK) que é geneticamente modificada para produzir um RQA de um organismo, de tal modo que o linfócito T ou célula NK reconheça um antígeno presente na superfície de uma célula cancerosa alvo, e medie a morte da célula alvo.

[0220] Esta invenção oferece um método de tratamento do câncer em um indivíduo que consiste em: i) modificar geneticamente linfócitos T obtidos a partir do indivíduo com um vetor de expressão com sequências de nucleotídeos que codifica o RQA heterodimérico condicionalmente ativo desta invenção, no qual o domínio de ligação ao antígeno do RQA heterodimérica condicionalmente ativo é específico para um epítopo em uma célula cancerosa do indivíduo, e no qual a modificação genética é realizada ex vivo; ii) introduzir os linfócitos T geneticamente modificados no indivíduo; e iii) administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente dimerizador, em que o agente dimerizador induz a dimerização do RQA heterodimérico condicionalmente ativo, em que essa dimerização proporciona a ativação dos linfócitos T geneticamente modificados e a morte da célula cancerosa, tratando assim o câncer.

[0221] Os carcinomas que podem ser tratados com terapia por um método divulgado nesta invenção incluem, entre outros, carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células basais (uma forma de câncer de pele), carcinoma de células escamosas (vários tecidos), carcinoma de bexiga, incluindo carcinoma de células de transição (um neoplasma maligno da bexiga), carcinoma broncogênico, carcinoma de cólon, carcinoma colorretal, carcinoma gástrico, carcinoma pulmonar, incluindo carcinoma de células pequenas e de células não pequenas do pulmão, carcinoma adrenocortical, carcinoma da tiroide, carcinoma pancreático, carcinoma mamário, carcinoma do ovário, carcinoma de próstata, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma de células renais, carcinoma dutal in situ ou carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, carcinoma cervical, carcinoma uterino, carcinoma testicular, carcinoma osteogênico, carcinoma epitelial, e carcinoma nasofaríngeo.

[0222] Os sarcomas que podem ser tratados com terapia por um método desta invenção incluem, entre outros, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, cordoma, sarcoma osteogênico, osteossarcoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma,

linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, e outros sarcomas de tecidos moles.

[0223] Outros tumores sólidos que podem ser tratados com terapia por um método desta invenção incluem, entre outros, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, e retinoblastoma.

[0224] Leucemias que podem ser tratadas com terapia por um método desta invenção incluem, entre outras, a), síndromes de mieloproliferativo crônico (doenças neoplásicas de células-tronco hematopoiéticas multipotenciais); b) leucemias mielogênica aguda (transformação neoplásica de uma célula-tronco hematopoiética multipotencial ou uma célula hematopoiética de potencial de linhagem restrito; c) leucemias linfocítica crônica (LLC, proliferação clonal de linfócitos pequenos imunologicamente imaturos e funcionalmente incompetentes), incluindo a LLC das células-B, LLC de células T leucemia prolinfocítica, e leucemia de células pilosas; e d) leucemias linfoblástica agudas (caracterizadas pela acumulação de linfoblastos). Os linfomas que podem ser tratados utilizando-se um método desta invenção incluem, entre outros, linfomas de células B (por exemplo, linfoma de Burkitt); linfoma de Hodgkin; linfoma não-Hodgkin, e semelhantes.

[0225] Outros cânceres que podem ser tratados de acordo com os métodos desta invenção incluem meningioma atípico (cérebro), carcinoma das células ilhotas (pâncreas), carcinoma medular (tireoide), mesenquimoma (intestino),

carcinoma hepatocelular (fígado), hepatoblastoma (fígado), carcinoma de células claras (rim), e neurofibroma mediastino. Métodos imunomoduladores

[0226] Um método desta invenção também pode ser usado para tratar condições inflamatórias e doença autoimune. Um RQA desta invenção é expresso em uma célula T auxiliar ou um linfócito T regulador para uso em um método de imunomodulação. Métodos imunomoduladores incluem, por exemplo, melhorar uma resposta imune em um mamífero para um agente patogênico; melhorar uma resposta imunológica em um organismo que está imunocomprometido; reduzir uma resposta inflamatória; reduzir uma resposta imunológica em um mamífero a um auto antígeno, por exemplo, para tratar uma doença autoimune; e reduzir uma resposta imunológica em um mamífero a um órgão ou tecido transplantado, para reduzir a rejeição de tecidos ou órgãos.

[0227] Quando o método envolve a redução de uma resposta imunológica para um antígeno, o antígeno usado para ativar o RQA é um autoantígeno. Quando o método envolve a redução de uma resposta imunológica a um órgão ou tecido transplantado, o antígeno usado para ativar o RQA é um antígeno específico para o órgão transplantado. Fórmulas, dosagens, e vias de administração

[0228] Como discutido acima, um método de tratamento desta invenção envolve a administração de uma quantidade eficaz de um agente dimerizador a um indivíduo que precisa do tratamento, e pode também envolver a administração de um antígeno.

[0229] Uma "quantidade eficaz" de um agente dimerizador é, em alguns casos, uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo que precisa dela, aumenta o nível de atividade citotóxica de um linfócito T que expressa um RQA de, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes , pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica do linfócito T na ausência do agente dimerizador.

[0230] Uma "quantidade eficaz" de um agente dimerizador é, em alguns casos, uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo que precisa dela, aumenta o nível de atividade citotóxica de uma célula NK que expressa um RQA de, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 2 vezes , pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais de 10 vezes, em comparação com a atividade citotóxica da célula NK na ausência do agente dimerizador.

[0231] Uma "quantidade eficaz" de um agente dimerizador é, em alguns casos, uma quantidade que, quando administrada em uma ou mais doses a um indivíduo que precisa dela, reduz o número de células cancerosas no indivíduo e/ou reduz a massa do tumor no indivíduo, por, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de

75%, ou mais de 75%, em comparação ao número de células cancerosas e/ou massa do tumor na ausência do agente dimerizador.

[0232] Em algumas concretizações, uma quantidade eficaz de um dimerizador é uma quantidade que, quando administrada sozinha (por exemplo, em monoterapia) ou em combinação (por exemplo, em terapia de combinação), com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, em uma ou mais doses, é eficaz na redução de um ou mais de taxa de crescimento do tumor, número de células cancerosas, e a massa do tumor, por, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, em menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou mais, em comparação à taxa de crescimento do tumores, número de células cancerosas, ou massa do tumores na ausência de tratamento com o dimerizador. Fórmulas

[0233] Nos métodos desta invenção, um dimerizador pode ser administrado ao hospedeiro através de quaisquer meios convenientes capazes de provocar o efeito terapêutico ou o efeito de diagnóstico desejado. Assim, o dimerizador pode ser incorporado a uma variedade de fórmulas para administração terapêutica. Mais particularmente um dimerizador pode ser formulado em composições farmacêuticas por combinação com veículos ou diluentes adequados e farmaceuticamente aceitáveis, e podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos,

pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis.

[0234] Em formas de dosagem farmacêutica, um dimerizador pode ser administrado sob a forma dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ou pode também ser usado sozinho ou em associação adequada, bem como em combinação, com outros compostos farmaceuticamente ativos. Os seguintes métodos e excipientes são meramente exemplificativos e não são de modo algum exaustivos.

[0235] Veículos excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, e suas combinações. Além disso, se desejado, o veículo pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umidificadores ou emulsificantes ou agentes de tamponamento do pH. Os métodos reais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, para especialistas. Vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985. A composição ou fórmula a ser administrada irá, em qualquer caso, conter uma quantidade de dimerizador adequada para alcançar o estado desejado no organismo em tratamento.

[0236] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como veículos, adjuvantes ou diluentes, são prontamente disponíveis ao público. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como ajuste de pH e agentes tamponantes,, agentes de ajuste de tonicidade, estabilizadores, agentes umidificadores e semelhantes, estão prontamente disponíveis ao público.

[0237] Para as preparações orais, um dimerizador pode ser usado sozinho ou em combinação com aditivos apropriados para fazer comprimidos, pós, grânulos ou cápsulas, por exemplo, com aditivos convencionais, como lactose, manitol, amido de milho ou amido de batata; com ligantes, tais como celulose cristalina, derivados de celulose, acácia, amido de milho ou gelatinas; com desintegradores, como amido de milho, amido de batata ou carboximetilcelulose de sódio; com lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio; e, se desejado, com diluentes, agentes tamponantes, agentes umidificadores, conservantes e agentes aromatizantes.

[0238] Um dimerizador pode ser formulado em preparações para injeção por dissolução, suspensão ou emulsificação em um solvente aquoso ou não aquoso, tais como óleos vegetais ou outros semelhantes, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e, se desejado, com aditivos convencionais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizadores e conservantes.

[0239] As composições farmacêuticas incluindo um dimerizador são preparadas por mistura do dimerizador possuindo o grau desejado de pureza com veículos fisiologicamente aceitáveis opcionais, excipientes, estabilizadores, surfactantes, tampões e/ou agentes de tonicidade. Veículos, excipientes e/ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações usadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico, glutationa, cisteína, metionina e ácido cítrico; conservantes (tais como etanol, álcool benzílico, fenol, m-cresol, p-cloro-m-cresol, metil ou propil parabenos, cloreto de benzalcônio, ou suas combinações); aminoácidos, como arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, prolina e suas combinações; monossacáridos, dissacáridos e outros carboidratos; polipeptídios de baixa massa molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como gelatina ou albumina de soro; agentes quelantes como EDTA; açúcares como a trealose, sacarose, lactose, glucose, manose, maltose, galactose, frutose, sorbose, rafinose, glucosamina, N- metilglucosamina, galactosamina e ácido neuraminico; e/ou sulfactantes não iónicos como Tween, Brij Pluronics, Triton- X, ou polietilenoglicol (PEG).

[0240] A composição farmacêutica pode estar em uma forma líquida, uma forma liofilizada ou uma forma líquida reconstituída de uma forma liofilizada, em que a preparação liofilizada deve ser reconstituída com uma solução estéril antes da administração. O procedimento padrão para reconstituição de uma composição liofilizada é adicionar novamente um volume de água pura (normalmente equivalente ao volume removido durante a liofilização); todavia, soluções que incluem agentes antibacterianos podem ser utilizadas para a produção de composições farmacêuticas para administração parentérica; vide também Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.

[0241] O termo "forma de dosagem unitária", como usado neste documento, se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para organismos humanos e animais, contendo cada uma quantidade predeterminada de um dimerizador calculada numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para um determinado dimerizador podem depender do dimerizador em particular usado e do efeito a ser alcançado, e da farmacodinâmica associada a cada dimerizador no hospedeiro.

[0242] Em algumas concretizações, um dimerizador é formulado em uma fórmula de libertação controlada. Preparações de libertação sustentada podem ser feitas utilizando-se métodos bem conhecidos na área. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrófobos contendo o dimerizador no qual as matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L- glutamato, espuma vinílica acetinada não degradável, hidrogéis, polilátidos, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Possível perda da atividade biológica pode ser prevenida pelo uso de aditivos apropriados, pelo controle do teor de humidade de e desenvolvendo de composições de matriz de polímeros específicas. Dosagens

[0243] Uma dosagem adequada pode ser determinada por um médico assistente ou outro profissional qualificado, com base em vários fatores clínicos. Como é bem sabido na área médica, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície do corpo, idade, do dimerizador particular a ser administrado, o sexo do paciente, tempo e via de administração, saúde geral, e outros medicamentos sendo administrados concomitantemente. Um dimerizador pode ser administrado em quantidades entre 1 ng/kg de peso corporal e mg/kg de peso corporal por dose, por exemplo, entre 0,1 mg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, entre 0,5 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal; contudo, doses abaixo ou acima desse intervalo exemplar são previstas, especialmente considerando os fatores acima mencionados. Se o regime for de infusão contínua, também pode estar entre 1 µg e 10 mg por quilograma de peso corporal por minuto.

[0244] Os especialistas avaliarão facilmente que os níveis de dosagem podem variar em função do dimerizador específico, a gravidade dos sintomas e da susceptibilidade do organismos a efeitos colaterais. As dosagens preferidas para um determinado composto são prontamente determináveis por especialistas na área por uma variedade de meios. Vias de administração

[0245] Um dimerizador é administrado a um indivíduo usando-se qualquer modo e via adequados e disponíveis para administração de medicamento, incluindo métodos in vivo e ex vivo, bem como vias sistémicas e localizadas de administração.

[0246] Vias convencionais e farmaceuticamente aceitáveis de administração incluem via intratumoral, peritumoral, intramuscular, intratraqueal, intracraniana, subcutânea, intradérmica, aplicação tópica, intravenosa,

intra-arterial, retal, nasal, oral e outras vias entéricas e parentéricas de administração. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado, ou ajustadas, dependendo do dimerizador e/ou o efeito desejado. Um dimerizador pode ser administrado numa dose única ou em doses múltiplas. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado oralmente. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por inalação. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por via intranasal. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado localmente. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por via intratimoral. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por via peritumoral. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por via intracraniana. Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por via intravenosa.

[0247] O agente pode ser administrado a um hospedeiro utilizando-se quaisquer métodos e vias convencionais disponíveis e adequadas para administração de medicamentos convencionais, incluindo vias sistémicas ou localizadas. Em geral, as vias de administração contempladas por esta invenção incluem, entre outras, entérica, parentérica, ou por inalação.

[0248] Vias parentéricas de administração diferentes da administração por inalação incluem, entre outras, tópica, transdérmica, subcutânea, intramuscular, intra-orbital, intracapsular, intra-espinal, intra-esternal, intratumoral, peritumoral, e intravenosa, ou seja, qualquer via de administração que não seja pelo canal alimentar. A administração parenteral pode ser realizada par uma administração sistêmica ou local de um dimerizador. Quando a administração sistêmica é desejada, esta envolve tipicamente a administração tópica ou mucosal invasiva ou sistemicamente absorvida de preparações farmacêuticas.

[0249] Um dimerizador também pode ser entregue ao organismo por administração entérica. Vias entéricas de administração incluem, entre outras, oral e retal (por exemplo, usando um supositório).

[0250] Por tratamento entende-se, pelo menos, uma melhoria dos sintomas associados à condição patológica que aflige o hospedeiro, sendo o termo melhoria usado num sentido amplo para se referir a, pelo menos, uma redução na magnitude de um parâmetro, por exemplo, sintoma, associado à condição patológica a ser tratada, como câncer. Como tal, o tratamento também inclui situações em que a condição patológica, ou pelo menos sintomas associados a ela, sejam completamente inibidos, por exemplo, impedidos de acontecer, ou parados, por exemplo, erradicados, de modo a que o hospedeiro não sofra da condição patológica, ou, pelo menos, dos sintomas que caracterizam a condição patológica.

[0251] Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado por injeção e/ou administração, por exemplo, em um local em uma artéria cerebral ou diretamente no tecido cerebral. Um dimerizador também pode ser administrado diretamente em um local alvo, por exemplo, por injeção direta, por implantação de um dispositivo de administração de medicamento, como uma bomba osmótica ou partículas de libertação lenta, por administração biolística ao local alvo, etc. Terapia de combinação

[0252] Em algumas concretizações, um dimerizador é administrado como uma terapia adjuvante para uma terapia padrão de câncer. Terapias padrão de câncer incluem cirurgia (por exemplo, remoção cirúrgica de tecido canceroso), terapia de radiação, transplante de medula óssea, tratamento quimioterapêutico, tratamento com anticorpos, tratamento de modificação de resposta biológica, e determinadas combinações dos anteriores.

[0253] A terapia por radiação inclui, entre outros, raios X ou raios gama administrados por uma fonte aplicada externamente como um feixe, ou por implantação de pequenas fontes radioativas.

[0254] Anticorpos adequados para uso no tratamento de câncer incluem, entre outros, anticorpos nus, por exemplo, trastuzumabe (Herceptin), bevacizumabe (Avastin™), cetuximabe (Erbitux™), panitumumabe (Vectibix™), ipilimumabe (Yervoy™), rituximabe (Rituxan), alemtuzumabe (Lemtrada™), ofatumumabe (Arzerra™), Oregovomabe (OvaRex™), Lambrolizumabe (MK-3475), pertuzumabe (Perjeta™), o ranibizumabe (Lucentis™) etc., e anticorpos conjugados, por exemplo, gemtuzumab ozogamicina (Mylortarg™), Brentuximabe 90 vedotin (Adcetris™), Y-ibritumomab tiuxetano rotulado 131 (Zevalin™), I-tositumoma rotulada (Bexxar™), etc. Anticorpos adequados para uso no tratamento do câncer incluem, entre outros, anticorpos criados contra antígenos associados a tumores. Tais antígenos incluem, entre outros, CD20, CD30, CD33, CD52, EpCAM, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, CAIX, PSMA, proteína de ligação a folato, Gangliosídios (por y exemplo, GD2, GD3, GM2, etc.), Le , VEGF, VEGFR, Integrina alfa-V-beta-3, integrina alfa-5-beta-1, EGFR, ERBB2, ERBB3,

MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, etc.

[0255] Modificadores de resposta biológica adequados para uso em conexão com os métodos desta invenção incluem, entre outros, (1) inibidores de atividade de tirosina-quinase (RTK); (2) inibidores de atividade de quinase de serina/treonina; (3) antagonistas de antígenos associados a tumores, tais como anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno do tumor; (4) agonistas do receptor de apoptose; (5) a interleucina-2; (6) interferão-α; (7) o interferão -γ; (8) fatores estimuladores de colônias; (9) inibidores da angiogênese; e (10) antagonistas do fator de necrose tumoral.

[0256] Os agentes quimioterapêuticos são compostos não-peptídicos (isso é, não-proteico) que reduzem a proliferação de células cancerosas, e englobam agentes citotóxicos e citostáticos. Exemplos não exaustivos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, nitrosoureias, anti-metabolitos, antibióticos antitumorais, alcaloides de plantas (vinca), e hormônios esteroides.

[0257] Os agentes que atuam para reduzir a proliferação celular são conhecidos na área e amplamente utilizados. Tais agentes incluem agentes alquilantes, como mostardas de azoto, nitrosoureias, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquila, e triazenos, incluindo, entre outros, mecloretamina, ciclofosfamida (Cytoxan™), melfalano (L- sarcolisina), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU), estreptozocina, clorozotocina, mostarda de uracilo, clormetina, ifosfamida, clorambucila, pipobromano, trietilenomelamina, trietilenetiofosforamina, busulfano,

dacarbazina, e temozolomida.

[0258] Agentes antimetabolitos incluem análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase, incluindo, entre outros, citarabina (CYTOSAR-U), citosina-arabinósido, fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FudR), 6-tioguanina, 6-mercaptopurina (6-MP), pentostatina, 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato, 10-propargil-5,8-didesazafolato (PDDF, CB3717), ácido 5,8- dideazatetrahidrofólico (DDATHF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, e gemcitabina.

[0259] Produtos naturais adequados e seus derivados (por exemplo, alcaloides de vinca, antibióticos antitumorais, enzimas, linfocinas e epipodofilotoxinas), incluem, entre outros, Ara-C, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginase, azatioprina; brequinar; alcaloides, por exemplo, vincristina, vimblastina, vinorelbina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por exemplo, etopósido, tenipósido, etc.; antibióticos, por exemplo, antraciclina, cloridrato de daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidine), idarubicina, doxorubicina, epirubicina e derivados de morfolino, etc.; bisciclopeptídios de fenoxizone, por exemplo, dactinomicina; glicopeptídios básicos, por exemplo, bleomicina; glicósidos de antraquinona, por exemplo, plicamicina (mitramicina); antracenodionas, por exemplo, mitoxantrona; azirinopyrrolo indolediones, por exemplo, mitomicina; imunossupressores macrocíclicos, por exemplo, ciclosporina, FK-506 (tacrolimus, prograf), rapamicina, etc.; e semelhantes.

[0260] Outros agentes citotóxicos anti- proliferativos são navelbene, CPT-11, anastrazole, letrazole,

capecitabina, reloxafine, ciclofosfamida, ifosamide, e droloxafine.

[0261] Agentes que afetam os microtúbulos e que possuem atividade antiproliferativa também são adequados para utilização e incluem, entre outros, alocolchicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por exemplo, NSC 33410), dolstatina (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), o paclitaxel (Taxol®), derivados de Taxol, docetaxel (Taxotere®), tiocolchicina (NSC 361792), tritilo cisterina, sulfato de vimblastina, sulfato de vincristina, epotilonas naturais e sintéticas, incluindo, entre outras, eoptilona A, epotilona B, discodermolida; estramustina, nocodazol, e semelhantes.

[0262] Moduladores hormonais e esteroides (incluindo os análogos sintéticos) que são adequados para utilização incluem, entre outros, adrenocorticosteróides, por exemplo, prednisona, dexametasona, etc.; estrogênios e progestinas, por exemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, estradiol, clomifeno, o tamoxifeno; etc.; e supressores adrenocorticais, por exemplo, aminoglutetimida; 17α- etinilestradiol; dietilestilbestrol, testosterona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, Flutamida (Drogenil), Toremifeno (Fareston), e Zoladex®. Os estrogênios estimulam a proliferação e diferenciação, por conseguinte, compostos que se ligam ao receptor de estrogênio são utilizados para bloquear essa atividade. Os corticosteróides podem inibir a proliferação de células T.

[0263] Outros agentes quimioterapêuticos incluem complexos de metais, por exemplo, cisplatina (cis-DDP), carboplatina, etc.; ureias, por exemplo, hidroxiureia; e hidrazinas, por exemplo N-metil-hidrazina; epidofilotoxina; um inibidor de topoisomerase; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur; etc. Outros agentes anti- proliferativos de interesse incluem imunossupressores, por exemplo, ácido micofenólico, talidomida, desoxispergualina, azasporine, leflunomida, mizoribina, azaspirane (SKF 105685); Iressa® (ZD 1839, 4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metoxi-6- (3-(4-morfolinil)propoxi)quinazolina); etc.

[0264] "Taxanos" incluem o paclitaxel, assim como qualquer derivado de taxano ativo ou pró-droga. "Paclitaxel" (que deve ser entendido neste documento como incluindo análogos, formulações, e derivados como, por exemplo, docetaxel, TAXOLTM, TAXOTERETM (uma formulação de docetaxel), análogos de 10-desacetil de paclitaxel e análogos 3'N-desbenzoil-3'N-t-butoxicarbonila de paclitaxel) pode ser prontamente preparado utilizando-se técnicas conhecidas aos especialistas na área (vide também WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; Pat. dos EUA n° 5.294.637;. 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137;

5.202.448; 5.200.534; 5.229.529; e EP 590.267), ou obtido a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 de Taxus brevifolia, ou T-1912 de Taxus yannanensis).

[0265] Paclitaxel deve ser entendido como se referindo a ,não apenas a forma comumente disponível quimicamente de paclitaxel, mas análogos e derivados (por exemplo, TaxotereTM docetaxel, conforme mencionado acima) e conjugados de paclitaxel (por exemplo, paclitaxel-PEG, paclitaxel-dextrano, ou paclitaxel-xilose).

[0266] Também incluída no termo "taxano" está uma variedade de derivados conhecidos, incluindo ambos os derivados hidrófilos e hidrófobos. Derivados do taxano incluem, entre outros, derivados de galactose e manose descritos no Pedido de Patente Internacional nº WO 99/18113; piperazino e outros derivados descritos em WO 99/14209; derivados do taxano descritos na WO 99/09021, WO 98/22451, e Patente dos EUA nº 5.869.680; 6-tio derivados descritos em WO 98/28288; derivados de sulfenamida descritos na Patente EUA nº 5.821.263; e derivado de taxol descrito na Patente EUA nº

5.415.869. Inclui ainda pró-drogas de paclitaxel, incluindo, entre outras, as descritas em WO 98/58927; WO 98/13059; e Patente dos EUA nº 5.824.701. Organismos adequados para o tratamento

[0267] Uma variedade de organismos são adequados para o tratamento com estem método de combate ao câncer. Organismos adequados incluem qualquer indivíduo, por exemplo, um animal humano ou não humano com câncer, que tenha sido diagnosticado com câncer, que esteja em risco de desenvolver câncer, que tenha tido câncer e esteja em risco de recorrência do câncer, que tenha sido tratado com um agente que não seja um dimerizador para o câncer e não tenha respondido ao tratamento, ou que tenha sido tratado com um agente que não seja um dimerizador para o câncer, mas tenha apresentado recaída após a resposta inicial ao tratamento.

[0268] Organismos adequados para tratamento com um método imunomodulador do organismo incluem indivíduos que têm uma doença auto-imune; indivíduos receptores de órgãos ou tecidos transplantados; e semelhantes; indivíduos imunodeprimidos; e indivíduos que estejam infectados com um agente patogênico. Exemplos

[0269] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a fornecer aos especialistas na área uma apresentação e descrição completas de como preparar e usar esta invenção, e não se destinam a limitar o âmbito do que os inventores consideram como seu invento nem são têm a intenção de declarar que as experiências abaixo são todas ou as únicas realizadas. Esforços têm sido feitos para assegurar a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. Salvo indicação contrária, as partes são partes em peso, massa molecular é a massa molecular média, a temperatura é em graus Celsius, e a pressão é próxima da atmosférica. Abreviaturas convencionais podem ser utilizadas, por exemplo, pb, par(es) de base; kb, quilobase(s); pl, picolitro(s); s ou seg, segundo(s); min, minuto(s); h ou hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, quilobase(s); bp, par(es) de base; nt, nucleotídio(s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c., subcutânea(mente); i.v. intravenosa(mente); e semelhantes. Exemplo 1: Geração do RQA Materiais e métodos

[0270] O CD19 scFv anti-humano foi selecionado como o domínio de reconhecimento de antígeno em RQAs ao longo do processo de otimização da concepção. As Figuras 18A e 18B resumem a estrutura molecular de cada RQA consistente em dois polipeptídios identificados numericamente. Todos os polipeptídios ancorados em membrana são homodímeros ligados a dissulfeto. Os polipeptídios ancorados às membranas são descritos como monômeros para simplicidade gráfica. Geração de construtos de RQA

[0271] A sequência que codifica o CD19 scFv anti-humano foi clonada a partir de um construto. A co- estimulação de 4-1BB humano e as cadeias de sinalização CD3 zeta ITAM foram clonadas a partir de cDNAs fornecidos pela Open Biosystems FKBP- e sequências que codificam FRB foram clonados a partir de plasmídeos fornecidos pela Addgene.

[0272] Técnicas de clonagem molecular padrão (reação em cadeia de polimerase (RCP), digestão de restrição, ligação, etc.) foram aplicadas para gerar plasmídeos de expressão de lentivírus. Condições de cultura de células alvo e efetoras

[0273] Células T CD8+ primárias humanas foram isoladas do sangue do doador anônimo depois de aférese (resíduos Trima de Blood Centers of the Pacific, São Francisco, CA) por seleção negativa, usando-se um Coquetel de Enriquecimento de Células T CD8+ Humanas RosetteSep (STEMCELL Technologies #15063), conforme aprovado pela University Institutional Review Board. As células foram cultivadas em meio de células T humanas, que consistiu em X-VIVO15 (Lonza #04-418Q), 5% de soro AB humano (Valley Biomedical Inc., #HP1022), 10mM N-acetil L-Cisteína (Sigma-Aldrich #A9165) e 100 UI/mL de recombinante humano IL-2 (NCI/BRB Repositórios

Pré-Clínicos). Uma linha de células de Jurkat que expressam a Proteína Fluorescente Verde (PFV) sob ativação NFAT foi mantida em meio RPMI-1640 complementado com soro fetal bovino 10% (FBS), penicilina e estreptomicina. Células alvo K562 de U. Penn foram cultivadas em IMDM complementado com 10% de FBS. Engenharia de efetor e célula alvo com lentivírus

[0274] O lentivírus pseudotipado VSV-G pantrópico foi produzido a partir de células Lenti-X 293T (Clontech Laboratories # 632180) co-transfectadas com um vetor de expressão do transgene pHR'SIN:CSW, plasmídeos de acondicionamento viral pCMVdR8.91 e pMD2.G utilizando Lipofectamina LTX (Life Technologies #15338). O meio de infecção sobrenadante foi recolhido 48 horas após a transfecção e usado diretamente para a transdução.

[0275] Vinte e quatro horas antes da transdução viral, as células T humanas primárias foram ativadas utilizando-se os Ativadores T humanos Dynabeads CD3/CD28 (Life Technologies #111-31D) a uma razão de 1:3 de célula:grânulo. As células Jurkat e K562 foram divididas 1~2 dias de antecedência para assegurar que as culturas estariam na fase de registro no momento da transdução. As células Jurkat e K562 transduzidas foram cultivadas durante pelo menos 7 dias antes de os experimentos serem conduzidos. As células T primárias foram mantidas a ~10^6/mL em meio de células T humanas durante cerca de duas semanas até que as células retornaram a um estado de repouso. Os níveis de expressão de RQA codificados nos construtos lentivirais foram quantificados pela detecção de anticorpos conjugados fluoróforos ou proteínas repórter fluorescentes, usando-se um citômetro de fluxo. Quantificação da produção de IL-2 e atividade de

NFAT

[0276] As células T CD4+ Jurkat que expressam RQAs foram misturadas com células alvo K562 cognatas ou não cognatas de U. Penn a uma razão de 1:2 efetora:alvo. O rapalog A/C Heterodimerizer (Clontech Laboratories #635055) foi diluídos em série em meio e adicionado a misturas de reação. Depois de 20~24 horas de incubação, os sobrenadantes do meio foram recolhidos e analisados com BD OptEIA Human IL- 2 ELISA Set (BD Biosciences # 555190). A citometria de fluxo foi realizada para quantificar a expressão repórter de GFP dependente de NFAT em células Jurkat como um indicador específico para a atividade do RQA. Ensaio sobre a citotoxicidade re-dirigida baseada em citometria do fluxo

[0277] As células alvo K562 cognatas e não cognatas foram manipuladas para expressar proteínas fluorescentes distintas de modo que ambos os tipos de células em uma mistura pudessem ser quantificados simultaneamente por citometria de fluxo. Os tipos de células-alvo foram misturados a uma razão de 1:1 e co-incubados com células T efetoras CD8+ humanas primárias a uma razão de 5:2 efetora:alvo. 100 IU/mL de IL-2 humana e diferentes quantidades de rapalog (Clontech Laboratories #635055) foram adicionados às misturas de reação. Após 24 horas de incubação, as amostras foram centrifugadas a 400g durante 5 minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas em tampão de lavagem (PBS + 0,5% BSA + 0,1% de azida de sódio) e fixadas com um volume igual de BD Cytofix (BD cat #554655)

antes da citometria de fluxo. Razões das células alvo cognatas sobreviventes para células alvo não cognatas foram calculadas para cada amostra para enumerar atividades citotóxicas re-dirigidas das células efetoras Resultados

[0278] A produção de IL-2 induzida pelas várias construções de RQA foi avaliada. Os dados são apresentados na Figura 12.

[0279] Figura 12. Produção de IL-2 desencadeada por cinco variantes de RQA ativadoras. Efetora = células T CD4+ Jurkat humanas concebidas com RQAs. Alvo= linhas de células K562 com ou sem o antígeno CD19 cognato. As quantidades de IL-2 segregadas por células efetoras foram quantificadas por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA).

[0280] Figura 13. Produção de IL-2 por linhas Jurkat de controle no mesmo experimento descrito na Figura

12. O construto "125" codifica um controle convencional atualmente utilizado em ensaios clínicos.

[0281] Figura 14. Comparação entre "122 + 206" e "197 + 206" em um experimento separado em condições idênticas às descritas na Figura 12.

[0282] A Figura 15 demonstra citotoxicidade farmacologicamente titulável conferida pelo RQA de acionamento "197+206" Na presença da molécula pequena rapalog, o RQA medeia eficientemente a citotoxicidade redirecionada para a células alvo cognatas. Em altas doses de rapalog, este RQA de acionamento pode emitir um sinal tão forte quanto o do RQA convencional "125". Efetoras = células T CD8+ primárias humanos concebidas com RQAs ou um vetor de controle. Alvo = derivados fluorescentes de linhas de células K562 que expressam o antígeno CD19 humano cognato ou o antígeno mesotelina humano não-cognato.

[0283] Figura 16 mostra os dados para os RQA construídos com a quinase tirosina citoplasmática Zap70 da passagem do receptor de células T como o domínio de sinalização intracelular.

[0284] A Figura 16 mostra dados a partir de células de Jurkat concebidas com diversas variantes dos RQAs de ativação. As células Jurkat concebidas foram co-incubadas com células alvo K562 com ou sem o antígeno cognato (CD19) e as concentrações indicadas de rapalog. Como um componente do RQA, a quinase Zap70 (primeira e segunda estruturas da esquerda com o número “199”) foi tão eficaz quanto ITAM (terceira estrutura da esquerda com o número “168”) na ativação da função NFAT. A adição do domínio de sinalização 4-1BB aumentou a expressão da superfície da porção de reconhecimento do antígeno do receptor e levou a uma sinalização mais forte por “197+199”. Um RQA não sinalizador (bem para a direita) foi incluído como um controle negativo. Exemplo 2: Mesotelina com RQA como alvo Materiais e métodos

[0285] Um número de construtos receptores de antígenos quiméricos foi feito e testado. Os construtos mostrados neste documento codificam três mesotelinas scFv anti-humanas diferentes como os domínios de reconhecimento de antígeno. As Figuras 19A, 19B e 19C resumem a estrutura molecular de cada RQA de mesotelina anti-humana, com cada RQA consistindo em dois polipeptídios. A porção intercelular de cada RQA de mesotelina anti-humana consiste em dois domínios coestimulantes 4-1BB, um par de ligação ao dimerizador FKBP e FRB, e um domínio de sinalização intracelular ITAM. Os três diferentes domínios de reconhecimento de antígeno mostrados neste documento são HN1 scFv, SS1 scFv, e m912 scFv anti- misotelina. Todos os polipeptídios ancorados em membrana são homodímeros ligados a dissulfeto. Geração de construtos de RQA

[0286] As sequências que codificam a anti- mesotelina foram clonadas a partir de construtos sintetizados por agrupamento de genes por PCR. A co-estimulação de 4-1BB humano e as cadeias de sinalização CD3 zeta ITAM foram clonadas a partir de cDNAs fornecidos pela Open Biosystems Sequências de codificação de HN1 scFv-, SS1 scFv-, e m912 scFv foram sintetizadas por PCR e, em alguns casos, otimizadas por condon. Sequências que codificam FKBP- e FRB foram clonadas a partir de plasmídeos da Addgene.

[0287] Técnicas de clonagem molecular padrão (reação em cadeia de polimerase (RCP), digestão de restrição, ligação, etc.) foram aplicadas para gerar plasmídeos de expressão de lentivírus. Condições de cultura de células alvo e efetoras

[0288] Uma linha de células de Jurkat que expressam GFP sob ativação NFAT foi mantida em meio RPMI-1640 complementado com soro fetal bovino 10% (FBS), penicilina e estreptomicina. Células alvo K562 foram cultivadas em IMDM complementado com 10% de FBS. Engenharia de efetor e célula alvo com lentivírus

[0289] O lentivírus pseudotipado VSV-G pantrópico foi produzido a partir de células Lenti-X 293T (Clontech Laboratories # 632180) co-transfectadas com um vetor de expressão do transgene pHR'SIN:CSW, plasmídeos de acondicionamento viral pCMVdR8.91 e pMD2.G utilizando Lipofectamina LTX (Life Technologies #15338). O meio de infecção sobrenadante foi recolhido 48 horas após a transfecção e usado diretamente para a transdução.

[0290] As células Jurkat e K562 foram divididas 1~2 dias de antecedência para assegurar que as culturas estariam na fase de registro no momento da transdução. As células Jurkat e K562 transduzidas foram cultivadas durante pelo menos 7 dias antes de os experimentos serem conduzidos. Os níveis de expressão de RQA codificados nos construtos lentivirais foram quantificados pela detecção de anticorpos conjugados fluoróforos ou proteínas repórter fluorescentes, usando-se um citômetro de fluxo. Quantificação de produção de IL-2

[0291] As células T CD4+ Jurkat que expressam RQAs foram misturadas com células alvo K562 cognatas ou não cognatas a uma razão de 1:2 efetora:alvo. O rapalog A/C Heterodimerizer (Clontech Laboratories #635055) foi diluídos em série em meio e adicionado a misturas de reação. Depois de 20~24 horas de incubação, os sobrenadantes do meio foram recolhidos e analisados com BD OptEIA Human IL-2 ELISA Set (BD Biosciences # 555190). Resultados

[0292] A produção de IL-2 induzida pelos construtos de RQA anti-mesotelina foi avaliada. Os dados são apresentados na Figura 19D-F.

[0293] Figura 19. Produção de IL-2 acionada por HN1 scFv (Fig. 19D), SS1 scFv (Fig. 19E), e m912 scFv (Fig. 19F) Variantes de RQA de acionamento. Produção de IL-2 por

RQA convencional (Fig. 19G, construto # 358) foi medido e incluído para comparação aos RQAs de acionamento (Fig. 19D). Efetora = células T CD4+ Jurkat humanas concebidas com RQAs. Alvo= linhas de células K562 com ou sem o antígeno mesotelina cognato. As quantidades de IL-2 segregadas por células efetoras foram quantificadas por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Exemplo 3: Ácido giberélico como um dimerizador de RQAs de acionamento Materiais e métodos

[0294] A Figura 20A resume a estrutura molecular do RQA dimerizador de ácido giberélico do organismo. A porção de ligação do antígeno inclui o CD19 scFv. anti-humano. A porção intercelular consiste em dois domínios coestimulantes 4-1BB, um par de ligação ao dimerizador GID1 e GAI, e um domínio de sinalização intracelular ITAM. Todos os polipeptídios ancorados em membrana são homodímeros ligados a dissulfeto. Geração de construtos de RQA

[0295] As sequências que codificam o RQA de dimerizador do ácido giberélico foram clonados a partir de construtos. O anti-CD19 scFv foi clonado a partir de um plasmídeo. A co-estimulação de 4-1BB humano e as cadeias de sinalização CD3 zeta ITAM foram clonadas a partir de cDNAs fornecidos pela Open Biosystems Sequências de codificação GID1- e GAI foram clonadas a partir de plasmídeos Addgene. Técnicas de clonagem molecular padrão (reação em cadeia de polimerase (RCP), digestão de restrição, ligação, etc.) foram aplicadas para gerar plasmídeos de expressão de lentivírus. Condições de cultura de células alvo e efetoras

[0296] Uma linha de células de Jurkat que expressam GFP sob ativação NFAT foi mantida em meio RPMI-1640 complementado com soro fetal bovino 10% (FBS), penicilina e estreptomicina. Células alvo K562 foram cultivadas em IMDM complementado com 10% de FBS. Engenharia de efetor e célula alvo com lentivírus

[0297] O lentivírus pseudotipado VSV-G pantrópico foi produzido a partir de células Lenti-X 293T (Clontech Laboratories # 632180) co-transfectadas com um vetor de expressão do transgene pHR'SIN:CSW, plasmídeos de acondicionamento viral pCMVdR8.91 e pMD2.G utilizando Lipofectamina LTX (Life Technologies #15338). O meio de infecção sobrenadante foi recolhido 48 horas após a transfecção e usado diretamente para a transdução.

[0298] As células Jurkat e K562 foram divididas 1~2 dias de antecedência para assegurar que as culturas estariam na fase de registro no momento da transdução. As células Jurkat e K562 transduzidas foram cultivadas durante pelo menos 7 dias antes de os experimentos serem conduzidos. Os níveis de expressão de RQA codificados nos construtos lentivirais foram quantificados pela detecção de anticorpos conjugados fluoróforos ou proteínas repórter fluorescentes, usando-se um citômetro de fluxo. Quantificação de produção de IL-2

[0299] As células T CD4+ Jurkat que expressam RQAs foram misturadas com células alvo K562 cognatas ou não cognatas a uma razão de 1:2 efetora:alvo. O ácido giberélico 3-acetoximetil éster (ácido giberélico 3-AM) pré-dissolvido em etanol (Toronto Research Chemicals #G377500) foi diluído em meio de crescimento e adicionado a misturas de reação. O ácido giberélico (ácido giberélico-3 AM) foi usado a 10 mM. Depois de 20~24 horas de incubação, os sobrenadantes do meio foram recolhidos e analisados com BD OptEIA Human IL-2 ELISA Set (BD Biosciences # 555190). Resultados

[0300] A produção de IL-2 induzida pelo construto RQA dimerizador de ácido giberélico foi avaliada. Os dados são apresentados na Figura 20.

[0301] Figura 20. Produção de IL-2 desencadeada pela variante de RQA dimerizador de ácido giberélico (Fig. 20B). A produção de IL-2 por RQA convencional (Fig. 20C, construto “125”) foi medida e incluída para comparação aos RQA de acionamento. Efetora = células T CD4+ Jurkat humanas concebidas com RQAs. Alvo= linhas de células K562 com ou sem o antígeno CD19 cognato. As quantidades de IL-2 segregadas por células efetoras foram quantificadas por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Exemplo 4: RQAs de ativação com vários domínios de co-estimulação Materiais e métodos

[0302] Uma série de construtos de receptores de antígenos quiméricos foi feita essencialmente conforme descrito para o Exemplo 1, exceto vários outros domínios coestimulantes que foram trocadis pelos domínios 4-1BB coestimulantes. As Figuras 21A e 21B resumem a estrutura molecular dos RQAs descritos neste documento. Geração de construtos de RQA

[0303] As sequências que codificam o CD19 scFv anti-humano foram clonadas a partir de um plasmídeo. A cadeia de sinalização ITAM zeta CD3 e as sequências de codificação dos domínios coestimulantes humanos CD28 e OX-40 foram clonadas a partir de cDNAs fornecidos pela Open Biosystems. Sequências que codificam FKBP- e FRB- foram clonadas a partir de plasmídeos da Addgene.

[0304] Técnicas de clonagem molecular padrão (reação em cadeia de polimerase (RCP), digestão de restrição, ligação, etc.) foram aplicadas para gerar plasmídeos de expressão de lentivírus. Testes de construtos de RQA

[0305] Células efetoras e alvo são cultivadas e transfectadas de acordo com o Exemplo 1 utilizando o domínio coestimulante de RQA CD28 e OX-40 de ativação contendo construtos descritos (Fig. 21A-B, construtos "365 + 367" e "399+400", respectivamente) e os controles RQA convencionais correspondentes (Fig. 21C-D, construtos "366" e "398", respectivamente). A produção de IL-2, ensaios de atividade NFAT, e ensaios baseados em citometria de fluxo também pode ser realizada com o domínio coestimulante CD28 contendo domínio coestimulante de OX-40 e construto contendo construto conforme descrito para o Exemplo 1. Alternativamente, subunidades de domínio coestimulantes de RQA CD28 e OX-40 de ativação contendo construtos podem ser emparelhadas com subunidades de construtos do Exemplo 1 (por exemplo, "197+367", "365+206", "197+400", "399+206," etc.). Exemplo 5: Avaliação in vivo de RQA de ativação

[0306] Um RQA de ativação pode ser avaliado por sua capacidade de mediar o extermínio in vivo de uma célula tumoral alvo. O extermínio de células tumorais in vivo causado pela injeção de células T que expressam o RQA de ativação é avaliado. Linhas celulares de tumor que foram confirmadas in vitro para expressar o antígeno cognato e podem ser exterminadas por células T CD8+ que expressam o RQA correspondente são utilizadas. As células tumorais manipuladas para expressar a luciferase de vagalume ou de Renilla para permitir imagiologia bio-luminescência para quantificar a carga tumoral in vivo podem ser utilizadas. As células tumorais são injetadas em camundongos imunocomprometidos (por exemplo, camundongos NOD scid gama (NSG) fêmeas de 6~10 semanas) ou por via subcutânea para modelos de tumores subcutâneos ou intravenosa para modelos de tumores sistêmicos. O método de implantação do tumor e o número adequado de células tumorais para implante podem ser baseados nas condições ideais para a linha de células tumorais utilizada. A carga tumoral pode ser monitorada duas vezes por semana por imagem de bioluminescência e por medição de compasso quando aplicável. Assim que a carga tumoral for detectável, as células totais T 0,5~2,5 x 10^7 (1:1 CD4+:CD8+) que expressam o RQA de ativação são injetadas intravenosamente em camundongos para iniciar o tratamento. Um medicamento de pequena molécula dimerizadora (por exemplo, rapalog) é administrado por via intraperitoneal em uma formulação de veículo. Células T que expressam RQA de ativação podem ser injetadas repetidamente durante o experimento para aumentar o efeito anti-tumoral. A interleucina-2 (IL-2) pode ser administrada para potencializar o efeito anti-tumoral.

[0307] Embora esta invenção tenha sido descrita com referência às concretizações específicas deste documento, deve ser entendido pelos especialistas que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem afastamento do verdadeiro espírito e âmbito da invenção.

Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo em particular, com o objetivo, espírito e âmbito desta invenção.

Todas essas modificações devem estar dentro do âmbito dos pedidos em anexo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. RECEPTOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENO (CAR) CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, caracterizado por compreender: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um primeiro membro de um par de ligação específico; ii) um primeiro domínio modulador; iii) um primeiro membro de um par de dimerização; e iv) um domínio transmembrana interposto entre o primeiro membro de um par de ligação específico e o primeiro domínio modulador; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um domínio transmembrana; ii) um segundo domínio modulador; iii) um segundo membro do par de dimerização; e iv) um domínio de sinalização intracelular; ou compreendendo: a) um primeiro polipeptídeo compreendendo: i) um primeiro membro de um par de ligação específico; ii) um domínio modulador; iii) um primeiro membro de um par de dimerização; iv) um domínio transmembrana interposto entre o primeiro membro de um par de ligação específico e o domínio modulador; e b) um segundo polipeptídeo compreendendo: i) um segundo membro do par de dimerização; e ii) um domínio de sinalização intracelular.

2. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro polipeptídeo compreender uma região de dobradiça interposta entre o primeiro membro do par de ligação específico e o domínio transmembrana.

3. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro membro do par de ligação específico ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um ligante ou um receptor.

4. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela região de dobradiça ser uma região de dobradiça de imunoglobulina IgG ou uma dobradiça derivada de CD8.

5. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro e o segundo domínios moduladores serem selecionados a partir de 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, BTLA, OX-40, CD27, CD30, GITR, HVEM, DAP10, DAP12 e CD28.

6. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo domínio de sinalização intracelular ser selecionado a partir de ZAP70 e CD3-zeta.

7. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETEROdimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo domínio de sinalização intracelular compreender um motivo de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM).

8. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro e o segundo membros do par de dimerização formarem um homodímero na presença de uma pequena molécula de dimerização.

9. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro e o segundo membros do par de dimerização formarem um heterodímero na presença de uma pequena molécula de dimerização.

10. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro e segundo membros do par de dimerização serem selecionados a partir de: a) proteína de ligação FK506 (FKBP) e FKBP; b) FKBP e subunidade catalítica calcineurina A (CnA); c) FKBP e ciclofilina; d) FKBP e proteína associada a FKBP-rapamicina (FRB); e) girase B (GyrB) e GyrB; f) di-hidrofolato redutase (DHFR) e DHFR; g) DmrB e DmrB; h) PYL e ABI; i) Cry2 e CIP; j) GAI e GID1.

11. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: i) o primeiro e o segundo domínios moduladores serem derivados de 4-1BB; ii) o primeiro e o segundo membros do par de dimerização serem FKBP e FRB; e ii) o domínio de sinalização compreender um ITAM.

12. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro membro do par de ligação específico ser um Fv de cadeia única.

13. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro membro do par de ligação específico se ligar a um epítopo presente em uma célula, em uma superfície sólida ou uma bicamada lipídica.

14. CAR CONDICIONALMENTE ATIVO HETERODIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela célula ser uma célula de câncer.

15. CÉLULA DE MAMÍFERO, caracterizada por ser geneticamente modificada para produzir o CAR condicionalmente ativo heterodimérico, conforme definido na reivindicação 1.

16. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela célula ser uma célula tronco, uma célula progenitora ou uma célula derivada de uma célula tronco ou uma célula progenitora.

17. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela célula ser um linfócito T ou uma célula NK.

18. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender as sequências de nucleotídeos que codificam o CAR condicionalmente ativo heterodimérico de acordo com a reivindicação 1.

19. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelas sequências de nucleotídeos estarem operativamente ligadas a um promotor específico de linfócitos T ou um promotor específico de célula NK.

20. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo ácido nucleico ser RNA transcrito in vitro.

21. VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender o ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 18.

22. MÉTODO DE ATIVAÇÃO DE UM LINFÓCITO T, o método caracterizado por compreender o contato de linfócitos T com um agente de dimerização e um segundo membro de um par de ligação específico, em que o linfócito T é geneticamente modificado para produzir um CAR condicionalmente ativo heterodimérico, de acordo com a reivindicação 1, e em que, na presença do agente de dimerização e do segundo membro de um par de ligação específico, o CAR condicionalmente ativo heterodimérico dimeriza e ativa o linfócito T, produzindo, assim, um linfócito T ativado.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo segundo membro de um par de ligação específico ser um antígeno.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo referido contato ocorrer in vivo.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo linfócito T ativado medeiar a morte de uma célula alvo.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo linfócito T ativado produzir IL-2 e/ou IFN-γ.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela célula alvo ser uma célula de câncer.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo primeiro membro do par de ligação específica do CAR condicionalmente ativo heterodimérico ser um anticorpo específico para um epítopo em uma célula de câncer.

29. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA, conforme definido na reivindicação 15, o método caracterizado por compreender a modificação genética de uma célula de mamífero com um vetor de expressão compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam o CAR condicionalmente ativo heterodimérico, de acordo com a reivindicação 1, ou a modificação genética de uma célula de mamífero com um RNA compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam o CAR condicionalmente ativo heterodimérico, de acordo com a reivindicação 1.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela referida modificação genética ser realizada ex vivo.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela célula ser um linfócito T, uma célula tronco, uma célula progenitora uma célula derivada de uma célula tronco ou uma célula progenitora.

32. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, o método caracterizado por compreender: i) a modificação genética de linfócitos T obtidos a partir do indivíduo com um vetor de expressão compreendendo sequências de nucleotídeos que codifica o CAR condicionalmente ativo heterodimérico, de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio de ligação ao antígeno do CAR condicionalmente ativo heterodimérico é específico para um epítopo em uma célula de câncer no indivíduo, e em que a referida modificação genética é realizada ex vivo; ii) a introdução dos linfócitos T geneticamente modificadas no indivíduo; e iii) a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um agente de dimerização, em que o agente de dimerização induz a dimerização do CAR condicionalmente ativo heterodimérico, em que a referida dimerização fornece a ativação dos linfócitos T geneticamente modificados e morte da célula de câncer, tratando assim o câncer.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo agente de dimerização ser um rapalog.

34. MÉTODO DE MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, o método caracterizado por compreender o contato da célula hospedeira com um agente de dimerização e um segundo membro de um par de ligação específico, em que o linfócito T é geneticamente modificado para produzir um CAR condicionalmente ativo heterodimérico, de acordo com a reivindicação 1, e em que, na presença do agente de dimerização e do segundo membro de um par de ligação específico, o CAR condicionalmente ativo heterodimérico dimeriza e modula pelo menos uma atividade da célula hospedeira.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pela atividade ser a proliferação, sobrevivência celular, apoptose, expressão de genes ou a ativação imune.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo segundo membro de um par de ligação específico ser um antígeno.