BR112013018046B1 - Conjugado peptídico, composição farmacêutica, métodos in vitro para bloquear sinalização por um ou mais membros de família citocina-yc e para inibir ligação de citocina-yc a subunidade-yc e uso de conjugado peptídico ou de composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEOS ISOLADOS OU PURIFICADOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA BLOQUEAR A SINALIZAÇÃO POR UM OU MAIS MEMBROS DA FAMÍLIA CITOCINA-yc, PARA INIBIR A LIGAÇÃO DE CITOCINAS-yc A SUBUNIDADE-yc E PARA UTILIZAR PEPTÍDEOS OU DERIVADOS DOS MESMOS OU COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USOS DE PEPTÍDEOS ISOLADOS OU PURIFICADOS OU DERIVADOS DOS MESMOS OU COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA As várias modalidades referem-se a antagonistas peptídicos de citocinas da família- yc, Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-7 (IL-7), Interleucina-9 (IL-9), Interleucina-15 (IL-15), e Interleucina-21 (IL-21). As citocinas-yc estão associadas a doenças humanas importantes, tais como a leucemia, doenças autoimunes, doenças de colágeno, diabetes mellitus, doenças de pele, doenças neuronais degenerativas e doença de enxerto-versus-hospedeiro (GvHD). Assim, os inibidores da atividade de citocina-yc são agentes terapêuticos e cosméticos valiosos, bem como ferramentas de pesquisa. As abordagens tradicionais para inibir a atividade de citocina-yc envolvem criar anticorpos neutralizantes contra cada membro da família de citocina-yc individual/subunidade de receptor. No entanto, o sucesso tem sido limitado e, muitas vezes, multiplos membros da família citocina-yc cooperam para causar o estado da doença. Utilização combinatória de anticorpos neutralizantes criados contra cada fator é impraticável e apresenta um risco aumentado de reações imunes (...).

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO PEDIDOS CORRELATOS

[0001] Este Pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisional US 61/433,890, depositado em 18 de janeiro de 2011, e do Pedido Provisional US 61/527,049, depositado em 24 de agosto de 2011, cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] As presentes modalidades se referem a antagonistas peptídicos da família citocinas YC, um grupo de citocinas de mamífero que é produzido principalmente pelas células epiteliais, estromais e imunes e controlam a ativação normal e patológica de uma diversa matriz de linfócitos. As presentes modalidades também se referem aos usos terapêuticos de tais peptídeos para o tratamento de determinadas doenças humanas. As presentes modalidades também se referem às aplicações cosmecêuticas de tais peptídeos. Descrição das doenças alvo, aplicações cosmecêuticas, bem como métodos de administração, produção e comercialização dos peptídeos são revelados.

ANTECEDENTES

[0003] As citocinas constituem um grupo diversificado de fatores solúveis que medeiam várias funções celulares, como, por exemplo, o crescimento, a diferenciação funcional e a promoção ou prevenção da morte celular programada (morte celular por apoptose). As citocinas, ao contrário dos hormônios, não são produzidas por tecidos glandulares especializados, mas podem ser produzidas por uma grande variedade de tipos de células, tais como células epiteliais, estromais ou imune.

[0004] Mais de 100 citocinas foram identificadas até hoje e são consideradas como tendo se desenvolvido por meio de duplicações de genes a partir de um conjunto de genes primordiais (Ver Bazan, J.F. 1990, Immunol. Today 11:350-354). Em apoio a este ponto de vista, é comum um grupo de citocinas de compartilhar um componente no seu sistema de receptores de múltiplas subunidades. A subunidade citocina compartilhada mais bem documentada em células T é a subunidade y comum (subunidade-Yc). A subunidade YC é compartilhada por seis citocinas conhecidas (Interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina-15 (IL-15) e interleucina-21 (IL-21), chamadas coletivamente de “citocinas Yc” ou “citocinas de família-Yc”) e desempenham um papel indispensável na transdução de sinais de ativação celular por todas estas citocinas. Além disso, para cada um das citocinas-Yc existem uma ou duas subunidades dos receptores específicos de citocinas particulares que, quando complexados com a subunidade-Yc, dão origem a um receptor totalmente funcional. (Ver Rochman et al., 2009, Nat Rev Immunol 9:480-90)

[0005] As citocinas da família-Yc são um grupo de citocinas de mamífero que são produzidas principalmente pelas células epiteliais, estromais e imunes e controlam a ativação normal e patológica de uma diversificada gama de linfócitos. Estas citocinas são criticamente necessárias para o desenvolvimento inicial de células T no timo, bem como a sua homeostase na periferia. Por exemplo, na ausência da subunidade YC, as células T, B e NK não se desenvolvem em camundongos. (Ver Sugamura et al., 1996, Annu Rev. Immunol.14:179- 205).

Patologias Associadas às Citocinas-Yc

[0006] Os estudos recentes têm indicado que a desregulação da expressão e disfunção das citocinas-yc podem conduzir a uma ampla variedade de doenças imunológica e hematopoiéticas humanas.

IL-2

[0007] Embora IL-2 fosse historicamente considerada um protótipo do fator de crescimento de célula T, a geração de um camundongo knockout carecendo de expressão de IL-2 revelou que IL-2 não é crítica para o crescimento ou o desenvolvimento de células T in vivo convencionais. Superexpressão de IL-2, no entanto, conduz a uma expansão preferencial de um subconjunto de células T, as células T reguladoras (T-regs). (Ver Antony et al., 2006, J. Immunol 176:5255-66). T-regs suprimem as respostas imunes de outras células e, assim, agem para manter a tolerância periférica (revisado em Sakaguchi et al., 2008, Cell 133:775-87). Um desarranjo da tolerância periférica é pensado a causar doenças autoimunes em humanos. Assim, a função imunossupressora de T-regs é considerada como prevenindo o desenvolvimento de doenças autoimunes (Ver Sakaguchi et al., 2008, Cell 133:775-87). T-regs também foram implicadas no câncer, onde os tumores sólidos e as doenças malignas hematológicas têm sido associados com números elevados de T-regs (ver De Rezende et al., 2010, Arch. Immunol. Ther. Exp. 58:179-190).

IL-4

[0008] IL-4 é uma citocina não redundante envolvida na diferenciação de células T helper dentro do subconjunto Th2 (T-helper tipo 2), que promove a diferenciação de células B prematuras dentro de IgE que produzem células plasmáticas. Os níveis de IgE são elevados na asma alérgica. Assim, a IL-4 está implicada no desenvolvimento de asma alérgica. Anticorpos alvejando IL-4 podem ser utilizados para tratar ou mesmo prevenir o surgimento da asma alérgica. (Ver Le Buanec et al., 2007, Vaccine 25:7206-16).

IL-7

[0009] IL-7 é essencial para o desenvolvimento de células B e o desenvolvimento precoce de células T no timo. Em camundongos, a expressão anormal de IL-7 causa leucemia associada a células T. (Ver Fisher et al., 1993, Leukemia 2:S66-68). No entanto, no ser humano, a desregulação da IL-7 não parece causar leucemia associadas a células T. Em humanos, a superregulação de IL-7, quer isoladamente ou em combinação com outro membro da família de citocina YC, IL-15, tem sido implicada em Leuceumia Linfocítica Granular Grande (LGL).

IL-9

[00010] O papel da IL-9 é ainda bastante descaracterizado em comparação com outros membros da família yc-citocina. Camundongos esgotados do gene de IL-9 parecem normais e não carecem de qualquer subconjunto de células nos compartimentos linfoides e hematopoiéticos. Estudos recentes, contudo, revelam um papel in vivo da IL-9 na produção de células Th17 (T-helper induzida pela interleucina-17) (Ver Littman et al., 2010, Cell 140 (6) :845-58,. e Nowak et al., 2009, J. Exp. Med. 206:1653-1660) .

IL-15

[00011] IL-15 é criticamente envolvida no desenvolvimento de células NK, células NK-T, alguns subconjuntos de linfócitos intraepiteliais (IELs), células yδ-T e fenótipo de memória de células T CD8 (Ver Waldmann, 2007, J. Clin Immunol 27:1-18 e Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15:492839). Superexpressão de IL-15 em camundongos leva ao desenvolvimento de células T-NK e leucemia de células T tipo célula CD 8 (Ver Fehniger et al., 2001, J. Exp. Med. 193:219-31, Sato et al. 2011 Blood imprimindo). Essas leucemias induzidas experimentalmente aparecem semelhante à leucemia LGL (linfócito grande granular) em seres humanos, uma vez que em ambos os casos, as células leucêmicas expressam antígeno CD8.

[00012] Suspeita-se também que os mecanismos autócrinos mediados por IL-15 podem estar envolvidos na transformação leucêmica de linfócitos T CD4. (Ver Azimi et al., 1998, Proc Natl Acad Sci 95:24527; Azimi et al., 1999, J. Immunol 163:4064-72, Azimi et al., 2000, AIDS Res. Hum Retrovírus 16:1717-22, e Azimi et al., 2001, Proc Natl Acad Sci 98:14559-64). Por exemplo, HTLV-I CD4-trópico, o qual provoca leucemia de células T adulta em humanos, induz o crescimento autócrino de células T transformadas com o vírus através da produção de IL-15 e IL- 15Rα (Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:2452-7).

[00013] Além disso, estudos recentes de transformação leucêmica implicam a IL-15 no desenvolvimento patológico da doença celíaca (CD), uma doença autoimune. A IL-15 é conhecida por estimular a diferenciação de células NK, células de linfócito CD8 e intraepitelial intestinal (IEL) para célula killer linfoquina ativada (LAK) pela indução da expressão de enzimas citolíticas (isto é, Granzima e Perforina), assim como interferon-Y. Doença celíaca (denotada CD, daqui por diante) é uma enteropatia imunomediada que é acionada pelo consumo de alimentos contendo glúten em indivíduos que expressam alelos de HLA-DQ específicos. A prevalência da doença é de 1% da população ocidental. O único tratamento atual para CD é a eliminação completa de glúten da dieta do paciente. A patologia do CD é causada principalmente pelo grande dano para a mucosa intestinal, o que é causado por células T CD8 ativadas que se infiltraram na lâmina própria do intestino. Estas células T CD8 parecem ser ativadas por meio de mecanismos que envolvem IL- 15. Uma publicação recente demonstrou que em camundongos a superexpressão ectópica de IL-15 por enterócitos leva ao desenvolvimento de enteropatia, que se assemelham de perto as lesões em pacientes com CD. A neutralização da atividade da IL-15 diminuiu dramaticamente as alterações patológicas. Assim, uma intervenção bloqueando a ativação de células T CD8 por IL-15 parece fornecer uma estratégia alternativa na gestão de CD à dieta sem glúten convencional.

IL-21

[00014] A IL-21 é o membro mais recentemente descoberto da família—Yc. Ao contrário de outros membros da família, IL-21 não parece ter efeitos potentes na promoção do crescimento. Em vez disso, a IL-21 é considerada funcionar mais como um fator de diferenciação do que um fator de controle da proliferação celular (Ver Tagaya, 2010, J. Leuk. Biol. 87:13-15).

Estratégias Atuais para Tratar Distúrbios Mediados por Citocina-Yc

[00015] Uma vez que as citocinas-Yc são consideradas estarem envolvidas em numerosas doenças humanas, vários métodos de tratamento de doenças implicadas a citocinas-Yc pela inibição das atividades da família citocinas-Yc têm sido propostos. Estes métodos incluem a utilização de anticorpos monoclonais específicos de citocinas para neutralizar a atividade da citocina alvo in vivo, a utilização de anticorpos monoclonais alvejando as subunidades dos receptores específicos de citocinas particulares (outras subunidades do que as subunidades-Yc compartilhada) para inibir seletivamente a atividade das citocinas e uso de inibidores químicos que bloqueiam a citocina intracelular via de transdução de sinal a jusante. Embora anticorpos específicos para citocinas sejam frequentemente a primeira escolha na concepção terapêutica, citocinas que compartilham componentes do receptor exibem a sobreposição de funções (Ver Paul, WE, 1989, Cell 57:521-24) e mais de uma citocina pode cooperar para causar uma doença (ver o exemplo descrito abaixo). Assim, aproximações que envolvem a neutralização de uma única citocina pode não ser eficaz no tratamento de citocinas implicadas a doenças humanas.

[00016] Estratégias para modelagem terapêuticas que inibem a função de várias citocinas através de anticorpos que reconhecem um componente do receptor comum têm também sido propostos. No entanto, a natureza de múltiplas subunidades dos sistemas de receptores de citocinas e o fato de que os receptores funcionais para uma única citocina podem assumir diferentes configurações torna essa abordagem difícil. Por exemplo, um receptor de IL-15 funcional pode ser IL-15Rβ/YC ou IL- 15Rα/β/YC. (Ver, Dubois et al. 2002, Immunity 17:537-47.) Um anticorpo contra o receptor de IL-15Rβ (TMβ1), é um inibidor eficaz da função da IL-15, mas apenas quando a molécula de IL-15Rα está ausente do complexo receptor. (Ver Tanaka et al., 1991, J. Immunol. 147:2222-28.) Assim, a eficácia de um anticorpo monoclonal antirreceptor, criado contra uma subunidade compartilhada ou particular, pode ser dependente do contexto e é imprevisível in vivo.

[00017] Embora o uso clínico de anticorpos monoclonais contra fatores biologicamente ativos ou receptores associados com a patogênese de doenças é uma prática estabelecida, há poucas demonstrações de resultados bem sucedidos. Além disso, o estabelecimento de um tratamento com o anticorpo monoclonal clinicamente adequado é um processo demorado e difícil, com a geração bem sucedida de um anticorpo neutralizante em grande parte uma questão de sorte. Por exemplo, devido à importância crítica da subunidade-Yc de sinalização na mediação por citocinas da família-Yc, muitas tentativas para gerar anticorpos policlonais e monoclonais contra a subunidade-Yc foram feitas e existem muitos anticorpos comerciais que reconhecem subunidade-Yc em camundongos e nos seres humanos. Curiosamente, contudo, nenhum destes anticorpos anti-subunidade-Yc bloqueiam a função das citocinas- Yc.

[00018] Outro problema com a utilização terapêutica de anticorpos monoclonais, é que os anticorpos monoclonais são usualmente gerados por imunização de roedores com proteínas humanas, de modo que o anticorpo gerado é uma proteína estranha e, assim, altamente imunogênica. Para contornar este problema, a sequência de aminoácidos do anticorpo monoclonal é molecularmente modificada, de modo que a molécula de anticorpo é reconhecida como uma imunoglobulina humana (um processo denominado humanização), mas este processo exige tempo e despesa.

Alvejamento de JAK3, como Exemplo Alternativo Existente para a Inibição de Múltiplas Citocinas-Yc

[00019] A interação entre a subunidade-Yc e uma citocina-Yc conduz à ativação de uma proteína tirosina quinase intracelular chamada Janus quinase 3 (Jak3). Jak3, por sua vez, fosforila várias moléculas de sinalização, incluindo quinase STAT5, e PI3. A interação da subunidade Yc e Jak3 é muito específica. De fato, não existe qualquer outra molécula de receptor que recruta Jak3 para a transdução de sinal. (Ver O’Shea, 2004, Ann Rheum Dis 63: (suppl.II):ii67-7) Desta forma, a inibição da sinalização de citocina através da subunidade-Yc pode ser alcançada, através do bloqueio da atividade quinase de Jak3. Assim, vários inibidores químicos que visam a atividade quinase de Jak3 foram introduzidos no mercado. (Ver Pesu et al., 2008, Immunol. Rev. 223:132142). Um exemplo é CP690, 550.

[00020] A principal desvantagem destes inibidores de proteína- quinase é a falta de especificidade para quinase Jak3. Estas drogas interceptam a ligação da molécula ATP (adenosina trifosfato) a quinase Jak3, uma reação bioquímica comum para muitas proteínas quinases, e, portanto, tendem a bloquear a ação de várias proteínas quinases intracelulares que não tenham relação com a quinase Jak3, cujas ações são extremamente necessárias para o bem-estar de células normais em vários tecidos. Deste modo, são necessários inibidores mais específicos de sinalização, através da subunidade-Yc.

[00021] Existe, portanto, grande necessidade de uma estratégia alternativa para o tratamento de doenças implicadas a citocinas-Yc.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00022] Uma modalidade se refere a um peptídeo isolado ou purificado, que consiste essencialmente de uma sequência de aminoácido de 19-mero I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) (aqui referida como “BNZ-Y” (BNZ-gama)).

[00023] Outra modalidade se refere a um método para bloquear a sinalização por um ou mais membros da família citocina-Yc, compreendendo o contato de uma célula com um peptídeo isolado ou purificado consistindo essencialmente da sequência de aminoácidos I-K- E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1).

[00024] Outra modalidade se refere a um método para bloquear a sinalização por um ou mais membros da família citocina-Yc, compreendendo o contato de uma célula com um peptídeo isolado ou purificado que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos I- K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), em que a célula é uma célula imune.

[00025] Outra modalidade se refere a um método para bloquear a sinalização por um ou mais membros da família citocina-Yc, compreendendo o contato de uma célula com um peptídeo isolado ou purificado que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos I- K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), em que o membro da família de citocinas-Yc é selecionado entre o grupo consistindo em: IL- 2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ou IL-21.

[00026] Outra modalidade se refere a peptídeos derivados de um peptídeo consistindo da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H- I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), em que o peptídeo derivado tem propriedades físico-químicas semelhantes às do peptídeo consistindo da sequência de aminoácidos da I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), mas o peptídeo derivado tem atividade biológica distinta.

[00027] Outra modalidade se refere a um peptídeo personalizado em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado difere da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) por substituição conservativa de um ou mais aminoácidos.

[00028] Outra modalidade se refere a um peptídeo personalizado, que consiste essencialmente de uma sequência de aminoácidos de 19-mero I- K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1).

[00029] Outra modalidade se refere a um peptídeo personalizado, em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado se difere da sequência de aminoácidos K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) por substituição por outro aminoácido polar para a glutamina (Q) na posição 6.

[00030] Outra modalidade se refere a um peptídeo personalizado em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado se difere das sequências de aminoácidos -K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) por substituição de um ou mais aminoácidos com propriedades bioquímicas semelhantes aos aminoácidos compreendendo a sequência - K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1).

[00031] Outra modalidade se relaciona com derivados peptídicos personalizados da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q- S-I-I-N-T-S, em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado tem propriedades físico-químicas semelhantes, como um peptídeo da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I- N-T-S (SEQ ID NO: 1), mas não tem atividade biológica distinta, em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado compartilhado tem, pelo menos, 50% de homologia com a sequência de aminoácidos I- K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1).

[00032] Outra modalidade se relaciona com a conjugação de um peptídeo que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos I-K- E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) com o N-terminal, C- terminal e/ou aos resíduos laterais de peptídeos/proteínas biológicas existentes para a entrega eficiente e estabilidade biológica melhorada in vivo. Exemplos de tais conjugações são BSA, albumina, a região Fc da IgG, outras proteínas biológicas que funcionam como armação, polietilenoglicol (PEG) com diferentes pesos moleculares ou outras partes semelhantes.

[00033] Outra modalidade se refere a conjugação dos derivados peptídicos personalizados da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R- F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) para o N-terminal, C-terminal e/ou aos resíduos laterais de peptídeos/proteínas biológicas existentes, em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado tem propriedades físico-químicas semelhantes como um peptídeo da sequências de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), mas não tem atividade biológica distinta, em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado compartilha, pelo menos, 50% de homologia a sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S- I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1). Exemplos de tais conjugações são a albumina, a região Fc da IgG, outras proteínas biológicas que funcionam como armação, ou Poli Etileno Glicol (PEG) com diferentes pesos moleculares ou outras partes semelhantes.

[00034] Outra modalidade refere-se a método de inibição da atividade de citocina-Yc compreendendo contatar uma citocina-Yc com um peptídeo que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q- R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1).

[00035] Outra modalidade se refere a anticorpos policlonais e monoclonais criados contra um peptídeo imunogênico que compreende a sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1).

[00036] Outra modalidade se refere a anticorpos policlonais e monoclonais criados contra derivados peptídicos personalizados da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado tem propriedades físico-químicas semelhantes como um peptídeo da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), mas não tem atividade biológica distinta e em que a sequência de aminoácidos do peptídeo personalizado compartilha, pelo menos, 50% de homologia de sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S- I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00037] A FIG. 1A mostra um alinhamento da região D-hélice de membros da família de citocinas Yc-humanas.

[00038] A FIG. 1B mostra os motivos Yc-box e IL-2/IL-15 box, os quais dão origem à sequência consenso em torno da região D-hélice das citocinas-Yc.

[00039] A FIG. 2 mostra uma representação esquematizada das propriedades bioquímicas dos aminoácidos.

[00040] A FIG. 3A mostra inibição da atividade de IL-2, IL-15 e IL-9 por BNZ-Y num ensaio de proliferação de PT-18.

[00041] A FIG. 3B mostra um ensaio de proliferação de células CTTL2 cultivadas na presença de IL-2 ou IL-15 e 0, 0,1, 1 ou 10 uM de BNZ-Y.

[00042] A FIG. 3C mostra a inibição da IL-15 mediada por tirosina- fosforilação de STAT5 por BNZ-Y.

[00043] A FIG. 4A mostra um ensaio de proliferação de células T ex vivo usando sangue periférico HAM/TSP. Proliferação de células T é inibida pela da adição de BNZ-Y.

[00044] A FIG. 4B mostra que a população de células CD4+CD25+ num ensaio proliferação de células T ex vivo utilizando sangue periférico HAM/TSP é diminuída após a adição BNZ-Y à cultura.

[00045] A FIG. 4C mostra que a população de células CD4+Ki67 em um ensaio de proliferação de células T ex vivo utilizando sangue periférico HAM/TSP é reduzida após a adição de BNZ-Y à cultura.

[00046] A FIG. 4D mostra que a percentagem de células vivas por coloração Guava num ensaio de proliferação de células T ex vivo utilizando sangue periférico HAM/TSP não é afetada após a adição BNZ- Y à cultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA Visão Geral

[00047] As citocinas-Yc desempenham papéis importantes no desenvolvimento das células linfoides que constituem o sistema imunológico, em particular células T, B e NK. Além disso, citocinas-Yc têm sido implicadas em várias doenças humanas. Deste modo, fatores que inibem a atividade da citocinas-Yc poderia fornecer ferramentas úteis para elucidar o mecanismo de desenvolvimento de subconjuntos de linfócitos e para tratar desordens imunes e doenças mediadas por citocinas-Yc.

[00048] A depleção de linhagem germinal dos genes que codificam a subunidade-Yc em camundongos ou mutações de subunidade-Yc em humanos é conhecida por causar imunodeficiência combinada severa (SCID), interrompendo a aparência ou função normal de células NK, e células B e T. A importância da subunidade Yc na transdução do sinal das citocinas-Yc, IL-2, -4, -7, -9, -15, -21, é indicada nos estudos que demonstram uma resposta de linfócitos a partir de camundongos e pacientes humanos às citocinas-Yc (revisto em Sugamura et al., 1995 Adv. Immunol. 59:225-277). Isto indica que a interrupção da interação entre a subunidade-Yc e uma citocina-Yc poderia bloquear eficazmente os acontecimentos de sinalização intracelular por parte dos membros da família citocina-Yc. Portanto, os peptídeos antagonistas de acordo com as modalidades presentes são esperados para bloquear eficazmente as alterações patogénicas em seres humanos que sofrem de doenças mediadas pela desregulação dos membros da família citocina-Yc.

[00049] Como alternativa às abordagens mediadas por anticorpos para modular a atividade de cada uma das citocinas-Yc individuais, os requerentes criaram novos compostos de baixo peso molecular, aqui referidos como “Simul-block”, que suprimem a atividade de múltiplas citocinas-Yc. Estes compostos de baixo peso molecular, os quais incluem ambos os produtos químicos e peptídeos, são menos imunogênicos do que os anticorpos. Estas propriedades distinguem Simul-block como uma estratégia mais eficiente para mediar a atividade citocinas-Yc em intervenções clínicas.

Descoberta de Yc-box

[00050] O C-terminal (D-hélice) das citocinas—YC contém o local proposto para interagir com a subunidade YC comum dos receptores de citocinas de múltiplas unidades. (Bernard et al., 2004, J. Biol. Chem. 279:24313-21.) Comparação das propriedades bioquímicas dos aminoácidos de todas as citocinas-Yc identificadas em camundongos e seres humanos revelou que a natureza química dos aminoácidos, por exemplo, hidrofobicidade, hidrofilicidade, natureza básica/ácida são conservadas, se não idênticas, em muitas posições na hélice-D de todo os membros da família citocina-Yc. Em contraste, a sequência de IL-13, a qual está relacionada com a citocina-Yc, IL-4, mas não se liga a subunidade-Yc, não apresenta homologia significativa na região da hélice-D para as citocinas-Yc, sugerindo que a homologia da sequência na região da hélice-D está correlacionada com a ligação à subunidade-Yc. Como mostrado na Figura 1, o alinhamento das sequências de aminoácidos da região D-hélice de membros da família citocina-Yc em seres humanos revela um motivo de homologia de sequência moderada nestas citocinas aqui referidos como “o Yc-box”.

[00051] O Yc-box é composto por 19 aminoácidos, onde das 19 posições, as posições 4, 5 e 13 estão totalmente conservadas como Fenilalanina, Leucina e Asparagina, respectivamente. Menos conservação é observada nas posições 6, 7 e 11 da Yc-box, onde o aminoácido é um de dois ou três aminoácidos relacionados que compartilham propriedades físico-químicas: posição 6 pode ser ocupada pelos aminoácidos polar Glutamato, Asparagina ou Glutamina; aminoácidos apoiares Serina ou Arginina pode ocupar a posição 7; e a posição 11 é ocupada por qualquer um dos aminoácidos apoiares alifáticos Leucina ou Isoleucina. As posições 9 e 16 pode ser ocupada por qualquer um de aminoácidos apoiares isoleucina ou aminoácido polar Lisina. Ver Figura 1B. Algumas diferenças na composição do aminoácido da Yc-box são observadas nas posições 9 e 6, entre as subfamílias de citocinas-Yc. Comparação das citocinas-Yc através de espécies indica que Isoleucina está presente nas posições 6 e 9 da subfamília IL-2/ 15, enquanto que os outros membros da família-YC (por exemplo, IL-4, IL-21) possuir Lisina nestas posições. Não desejando estar limitado por uma teoria particular, a Isoleucina e a Lisina são bioquimicamente diferentes e, portanto, podem conferir diferenças conformacionais específicas entre a subfamília IL-2/15 e outras citocinas-Yc.

[00052] A conservação do motivo Yc-box entre citocinas-Yc é apoiado pelas descobertas de que um resíduo de Asparagina (Asn, Q), localizado na região da hélice-D é essencial para a ligação das citocinas-Yc a subunidade-Yc. (Bernard et al., 2004, J. Biol Chem 279:24.313-21).

Inibidores Peptídicos de Atividade de Citocina-Yc

[00053] A atividade de família-Yc de citocinas podem ser bloqueados por perturbar a interação entre a citocina-Yc e a subunidade-Yc, por exemplo, através da introdução de um inibidor competitivo, que pode interagir com a subunidade-Yc sem estimular a sinalização através dos receptores de citocinas de múltiplas subunidades. Não se ligando por uma teoria particular, o motivo Yc-box conservado, o qual participa na ligação das Yc-famílias de citocinas a subunidade-Yc, apresenta uma base de sequência de aminoácidos de núcleo, que pode ser utilizada para desenhar inibidores peptídicos de sinalização de Yc-citocinas.

[00054] A sequência de aminoácidos de núcleo Yc-box compreende: D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q (SEQ ID NO: 2) (em que X indica qualquer aminoácido). As modalidades descritas aqui se referem aos derivados peptídicos personalizados de sequência de aminoácidos de núcleo Yc-box, os quais podem inibir a atividade de uma ou mais citocinas-yc. Derivados peptídicos personalizados incluem qualquer peptídeo cuja sequência de aminoácidos parcial mostre cerca de 50%, 5060%, 60- 70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,8 % de identidade com a sequência de aminoácidos de núcleo Yc-box. Derivados peptídicos personalizados incluem ainda qualquer peptídeo, em que uma sequência de aminoácidos parcial do derivado de peptídeo compreende aminoácidos com propriedades físico-químicas semelhantes aos aminoácidos de núcleo Yc-box. Por exemplo, aminoácidos com propriedades físico-químicas semelhantes que incluem Fenilalanina, Tirosina, Triptofano e Histidina, os quais são os aminoácidos aromáticos. A Figura 2 mostra uma representação esquematizada de aminoácidos com propriedades físico-químicas semelhantes, os quais podem ser substituídos por aminoácidos que compreendem o núcleo Yc-box. Derivados peptídicos do núcleo Yc-box podem ser de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, ou mais de 50 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, os derivados peptídicos personalizados podem ser conjugados com N- terminais, C-terminais e/ou resíduos laterais de proteínas/peptídeos biológicos existentes.

[00055] Com base na identificação do motivo Yc-box conservado nas citocinas, que se ligam a subunidade-Yc, os requerentes conceberam um novo peptídeo derivado personalizado de 19-mero, o qual é um peptídeo composto artificial combinando a sequência de aminoácidos de Yc-box de IL-2 e IL-15 humana. O peptídeo de 19-mero, aqui referido como BNZ-Y, consiste na sequência de aminoácidos: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I- N—T-S (SEQ ID NO: 1), em que os aminoácidos representados por caracteres em negrito são conservados entre a IL-2 e IL-15 e o aminoácidos sublinhados representam posições em que as propriedades físico-químicas dos aminoácidos são conservadas.

[00056] Os Requerentes constataram que o BNZ-Y de 19-mero suprime a proliferação celular induzida por IL-15 e IL-19, mas não a proliferação celular induzida por IL-2 ou IL-4. Ver a Figura 3A e o Exemplo 2. Os requerentes ainda demonstraram que BNZ-Y inibe a fosforilação mediada por IL-15 da molécula de transdução de sinal da citocina intracelular, STAT-5. Ver Figura 3C e Exemplo 5. Estes resultados demonstram que os derivados peptídicos personalizados do motivo Yc-box conservado podem inibir a atividade de várias citocinas- Yc.

[00057] Diversas modalidades referem-se a peptídeos derivados personalizados da sequência de aminoácidos de 19-mero BNZ-Y, I-K-E-F- L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), os quais podem inibir a atividade de uma ou mais citocinas-Yc. Derivados peptídicos personalizados da sequência de aminoácidos de 19-mero BNZ-Y incluem qualquer peptídeo cuja sequência de aminoácidos parcial mostra cerca de 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,8% de identidade de sequência de aminoácidos: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H- I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1). Derivados peptídicos personalizados incluem ainda qualquer peptídeo, em que uma sequência de aminoácidos parcial do derivado de peptídeo que compreende os aminoácidos com propriedades físico-químicas semelhantes aos aminoácidos da sequência: I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1). Em várias modalidades, os resíduos de aminoácidos dos peptídeos derivados retêm propriedades físico-químicas semelhantes, com as dos resíduos de aminoácidos BNZ-Y, mas apresentam diferente especificidade de inibição biológica para os 6 membros da família citocina-Yc do que do peptídeo original 19 - mer. Derivados peptídicos de BNZ-Y podem ser de 19, 20, 21, 22, 24, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, ou mais do que 50 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, os derivados peptídicos personalizados podem ser conjugados com resíduos N- terminais, C-terminais e/ou aos laterais de proteínas/ peptídeos biológicos existentes.

[00058] Diversas modalidades se referem a derivados peptídicos personalizados dos motivos Yc-box de IL-5, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9, ou IL- 7, as quais estão representadas na Figura 1A. Outras modalidades se referem a peptídeos derivados personalizados. Os quais são peptídeos compósitos artificiais combinando a sequência de aminoácidos de dois ou mais dos motivos Yc-box de IL-5, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 e IL-7-. Várias modalidades se referem a derivados peptídicos personalizados de motivos Yc-box de IL-5, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9, ou IL-7 possuindo uma sequência de aminoácidos parcial, que mostra aproximadamente 50%, 50-60%, 6070%, 70-80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,8% de identidade com as sequências de aminoácidos dos motivos Yc-box de IL-5, IL-2, IL- 21, IL-4, IL-9, ou IL-7. Derivados peptídicos personalizados dos motivos Yc-box de IL-5, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 ou IL-7 ainda incluem qualquer peptídeo em que uma sequência de aminoácidos parcial do referido derivado peptídico compreende os aminoácidos com propriedades físico- químicas semelhantes aos aminoácidos da sequência dos motivos Yc-box de IL-5, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 ou IL-7.

[00059] Várias modalidades se referem aos derivados peptídicos personalizados que inibem a função de um, todos ou membros seletivos das citocinas-Yc. Em algumas modalidades, os derivados peptídicos personalizados seletivamente alvejam os membros individuais da família citocina-Yc. Por exemplo, um derivado de peptídeo personalizado pode inibir seletivamente a função da IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, ou IL-21. Em outras modalidades, um derivado de peptídeo personalizado pode inibir dois ou mais membros da família citocina-Yc. Por exemplo, os derivados peptídicos personalizados das presentes modalidades podem inibir seletivamente a função da IL-2 em combinação com um ou mais de IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21, IL-4, em combinação com um ou mais de IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21, IL-7, em combinação com um ou mais de IL-9, IL-15 e IL-21, IL- 9, em combinação com um ou mais de IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 e IL-21, IL-15, em combinação com um ou mais de IL-2, IL-4, IL-7 , IL-9 e IL-21, ou IL-21, em combinação com um ou mais de IL-2, IL-4, IL-7, IL- 9 e IL-15. Em outras modalidades, os derivados peptídicos personalizados podem compreensivelmente alvejar todos os membros da família citocinas-Yc. Não desejando estar limitado por uma teoria particular, os derivados peptídicos personalizados podem inibir a função de todos ou membros seletivos das citocinas-Yc, diminuindo a ligação da citocina-Yc a subunidade-Yc, por exemplo, como um inibidor competitivo. Tais derivados peptídicos personalizados podem ser utilizados em diversas aplicações, incluindo como um fármaco clínico.

[00060] Os termos “oligopeptídeo”, “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” podem ser utilizados indiferentemente para se referir aos derivados peptídicos personalizados fornecidos, de acordo com as presentes modalidades e podem ser utilizados para designar uma série de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. Os peptídeos, de acordo com as presentes modalidades podem também conter aminoácidos não naturais. Elementos ligadores podem ser unidos aos peptídeos das presentes modalidades através de ligações peptídicas ou por via de ligações químicas. Os peptídeos das presentes modalidades podem ser lineares ou cíclicos, e podem incluir aminoácidos (D), bem como (L). Peptídeos das presentes modalidades podem também conter um ou mais aminoácidos raros (tais como, 4-hidroxiprolina ou hidroxilisina), ácidos orgânicos ou amidas e/ou derivados de aminoácidos comuns, tais como aminoácidos com o carboxilato C-terminal esterificado (por exemplo, benzil, metil ou éster de etil) ou amidado e/ou com modificações do grupo amino N-terminal (por exemplo, acetilação ou alcoxicar- bonilamino), com ou sem qualquer um de uma grande variedade de modificações nas cadeias laterais e/ou substituições (por exemplo, metilação, benzilação, t-butilação, tosilação, alcoxicarbonilamino, e semelhantes). Outros resíduos do que os aminoácidos comuns podem estar presentes incluem, mas os resíduos não estão limitados a penicilamina, cisteína tetrametileno, cisteína pentametileno, ácido mercaptopropiônico, ácido mercaptopentametileno, 2-mercaptobenzeno, 2- mercaptoanilina, 2-mercaptoprolina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido aminoadípico, ácido m-aminometilbenzóico e ácido diaminopropiônico.

[00061] Os peptídeos das presentes modalidades podem ser produzidos e obtidos, através de vários métodos conhecidos dos técnicos versados no assunto. Por exemplo, o peptídeo pode ser produzido por engenharia genética a partir da sequência de nucleotídeos que codifica para o peptídeo da presente modalidade, ou quimicamente sintetizado por meio de síntese em fase sólida de peptídeos e análogos, ou produzido e obtido na sua combinação. Um técnico versado no assunto pode sintetizar os derivados peptídicos personalizados com base na presente descrição do motivo Yc-box conservado e o conhecimento das propriedades bioquímicas de aminoácidos como descrito na Figura 2. Algumas modalidades também se relacionam com os polinucleotídeos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam os peptídeos da presente invenção. “Sequência de nucleotídeos”, “polinucleotídeos”, ou “ácido nucleico” podem ser utilizados alternadamente, e são entendidos como significando tanto um DNA de fita dupla quanto um DNA de fita simples ou de produtos de transcrição do referido DNA (por exemplo, moléculas de RNA). Os polinucleotídeos podem ser administrados a células ou indivíduos e expressados pelas células ou indivíduos, em vez de administrar os próprios peptídeos. Várias modalidades também se relacionam com constructos genéticos compreendendo uma sequência de polinucleotídeos que codifica para os peptídeos da presente invenção. Os constructos genéticos podem também conter elementos reguladores adicionais, tais como promotores e intensificadores e, opcionalmente, marcadores selecionáveis.

Métodos de Tratamento de Doenças Mediadas por Citocina-Yc

[00062] Diversas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas-Yc no tratamento de doenças mediadas por citocina-Yc. Utilização do derivado de peptídeo personalizado, de acordo com as presentes modalidades permite a flexibilidade na concepção do agente terapêutico (modelo personalizado de peptídeo) e permite resultados mais abrangentes, que não poderia ser feito por meio de estratégias convencionais empregando anticorpos anticitocina ou de receptor anticitocina.

[00063] Aqui é descrito um novo método de bloquear a ação de citocinas da família-YC. Tais manipulações podem produzir métodos eficazes de intervenções clínicas no tratamento de doenças relacionadas com a desregulação ou disfunção de citocinas-yc. Exemplos de doenças que podem ser tratadas pela interrupção da interação entre a citocina- yc e a subunidade-yc incluem doenças autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjoegren, doença celíaca granulomatose de Wegener, tireoidite de Hashimoto ou autoimune, doenças do colágeno, incluindo a artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, diabetes mellitus, doenças autoimunes da pele, tais como a psoríase, doenças neuronais degenerativas como a esclerose múltipla, uveíte ou inflamação do olho e oftalmia simpática, doença do enxerto- versus-hospedeiro (GvHD) e miastenia gravis.

[00064] Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas-yc descritos aqui podem ser utilizados no tratamento de doenças associadas a (HTLV-I e HTLV-II) tipo I e II linfotrópica Célula T humana 1, incluindo leucemia de células T adultas (ATL), mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e outras doenças inflamatórias não-neoplásicas associadas com HTLV, como uveíte (HU), artropatia, pneumopatia, dermatite, exocrinopatia e miosite. Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas-yc aqui descritos podem ser utilizados no tratamento de outras doenças virais, como influenza, AIDS, HBV e Herpes ou doenças parasitárias.

[00065] Em várias modalidades, os peptídeos antagonistas-yc podem ser administrados antes, durante e ou após o transplante de vários órgãos, como agente imunossupressor.

[00066] Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas-YC aqui descritos podem ser usados no tratamento de doenças imunomediadas, tais como a asma e outras doenças respiratórias inflamatórias, tais como, mas sem limitação, sinusite, rinite alérgica, bronquite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), rinite alérgica, otite aguda e crônica, fibrose pulmonar. Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas-yc podem ser administrados para tratar ou prevenir reações alérgicas por exposição a alergênicos, substâncias químicas ou outras causas comuns de doença respiratória aguda. Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas-yc podem ser administrados para tratar ou prevenir as respostas inflamatórias causadas por vírus, bactérias, reagentes químicos e reagentes bioquímicos.

[00067] Em várias modalidades, os peptídeos antagonistas-y podem ser administrados para o tratamento de alguns tipos de doenças malignas, tal como leucemia-LGL, linfoma intraepitelial e leucemia na Doença Celíaca Refratária, leucemia/linfoma NK e leucemia/linfoma NK- T.

[00068] Em algumas modalidades, derivados peptídicos personalizados, de acordo com as modalidades aqui descritas, podem ser utilizados para fins cosméticos, tal como o tratamento da acne, perda de cabelo, queimaduras solares e manutenção de unha, incluída pomada como componente antienvelhecimento por causa da natureza anti- inflamatória deles.

[00069] Diversas modalidades se referem a peptídeos antagonistas terapêuticos que inibem a função de todos ou membros seletivos das citocinas-yc. Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas terapêuticos inibem seletivamente os membros da família citocinas-yc individuais (peptídeos personalizados). Em outras modalidades, os peptídeos antagonistas terapêuticos podem inibir de forma abrangente todos os membros da família citocinas-yc (Simul-Block). Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas terapêuticos inibem seletivamente subconjuntos de citocinas-Yc. Não se desejando estar limitado por uma teoria particular, os antagonistas de peptídeos capazes de inibir a função de todos ou membros seletivos das citocinas-Yc, pela diminuição da ligação das citocinas-Yc a subunidade-Yc, por exemplo, como um inibidor competitivo.

[00070] Vários membros da família citocina-Yc, IL-2, IL-7 e IL-15, mas não IL-4 têm sido implicado como estando envolvidos na doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), em um modelo experimental de rato. (Miyagawa et al., 2008, J. Immunol. 181 : 1109-19.) Uma modalidade se refere à utilização de peptídeos antagonistas terapêuticos que inibem seletivamente a atividade IL-2, IL-7, e IL-15 para o tratamento de GvHD em seres humanos, permitindo que a sobrevivência dos tecidos enxertados ou células de medula óssea. Outras modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas terapêuticos que inibem seletivamente uma combinação de IL-2 e IL-7, IL-2 e IL-15, ou IL-7 e IL- 15 para tratar GvHD. Outras modalidades se referem à utilização de uma combinação de peptídeos antagonistas terapêuticas que seletivamente inibem IL-2, IL-7 ou IL-15.

[00071] Algumas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas terapêuticos que inibem seletivamente a função da IL-2 para o tratamento de desordens autoimunes, onde T-regs têm sido implicados como desempenhando um papel. Em algumas modalidades, a inibição mediada pelo peptídeo de T-regs pode melhorar a imunidade anticâncer natural nos seres humanos, proporcionando um novo meio de uma terapia anticâncer.

[00072] Diversas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas terapêuticos que seletivamente inibem a IL-4 para tratar asma.

[00073] Algumas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas terapêuticos que seletivamente inibem a IL-7, quer isoladamente ou em combinação com peptídeos antagonistas terapêuticas que seletivamente inibem um membro da família citocina- Yc, IL-15, como um agente terapêutico para a leucemia LGL. Em algumas modalidades peptídeos antagonistas terapêuticos que inibem seletivamente a atividade IL-7 e IL-15 pode ser utilizado para tratar a leucemia LGL. Várias modalidades se referem à utilização de BNZ-Y para tratar a leucemia LGL. Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas-Yc específicos que seletivamente IL-15 sozinho ou peptídeos antagonistas-Yc específicos que seletivamente a IL-15 e IL-7 são utilizados como agente terapêutico para a leucemia associada aos linfócitos T CD4/CDB, incluindo as causadas pela HTLV-I.

[00074] Diversas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas-Yc que inibem seletivamente a atividade da IL-9, sozinho ou em combinação com os outros membros da família citocina-Yc, tal como um agente terapêutico para as doenças humanas que envolvem o desenvolvimento anormal de células Th17.

[00075] Diversas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas terapêuticos que inibem seletivamente a atividade da IL-15 como um agente terapêutico para o tratamento de CD. Uma publicação recente sugere que a IL-21, em adição à IL-15, pode desempenhar um papel na patogênese de CD. (Ver Bodd et al, 2010, Mucosal Immunol. 3:594-601.) Isto sugere que o tratamento ideal de CD por anticitocina convencional ou anticorpos receptor de citocina irão beneficiar de uma combinação de, pelo menos, dois anticorpos que reconhecem componente que pertencem aos sistemas da IL-15 e IL-21. Em algumas modalidades, os peptídeos antagonistas derivados personalizados que seletivamente inibem a atividade de ambas IL-15 e IL-21 são utilizados como um agente terapêutico para o tratamento de CD.

[00076] Além de ter aplicações terapêuticas, peptídeos antagonistas- Yc têm aplicações em produtos de consumo. Várias modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas-YC em produtos de cuidados da pele, tais como, antienvelhecimento, anti-inflamatório, antiacne, e outras aplicações relacionadas. Algumas modalidades se referem à utilização de peptídeos antagonistas-Yc em produtos para o cabelo, como ingrediente antiqueda de cabelo para tratar queda de cabelo causada por doenças autoimunes.

[00077] Outra modalidade refere-se ao desenvolvimento de compostos químicos (não peptídico, não proteico) que possuem uma estrutura espacial que se assemelha a sequência de aminoácidos de 19- mero I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) e podem encaixar-se na bolsa subunidade-Yc para estruturalmente impedir o acesso de um citocina-Yc a subunidade-Yc para ligação. Algumas modalidades se referem à utilização de compostos químicos estruturalmente semelhantes como inibidores da atividade de citocina- Yc. Tal estratégia de mimetismo molecular para refinar ainda mais o desenvolvimento de compostos sintéticos semelhantes na estrutura para existir peptídeo/proteínas biológica é descrito em Orzaez et al., 2009 Chem. Med. Chem. 4:146-160. Outra modalidade se refere a administração de compostos químicos (não peptídicos, não proteicos) que têm uma estrutura em 3D como assemelhando-se a sequência de aminoácidos de 19-mero I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) para tratar doenças mediada por citocina-Yc.

[00078] Diversas modalidades se relacionam com a administração de um peptídeo de sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S- I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) para tratar doenças mediada por citocina-Yc. Outra modalidade se relaciona com a administração de peptídeos derivados da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I- N-T-S (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácidos do peptídeo derivado tem propriedades físico-químicas semelhantes como um peptídeo da sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I- N-T-S (SEQ ID NO: 1), mas não tem atividade biológica distinta para o tratamento de doenças mediada por citocina-Yc. Outra modalidade se relaciona com a administração de um peptídeo de sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) conjugado com o N-terminais e C-terminais ou com os resíduos laterais de proteínas/peptídeos biológicas existentes em pacientes para tratar doenças mediadas por citocina-Yc.

[00079] Diversas modalidades se referem a administração de anticorpos policlonais e monoclonais criados contra um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q- S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) em pacientes como um imunógeno para tratar doenças mediada por citocina-Yc. Outra modalidade se relaciona com a administração de anticorpos policlonais e monoclonais, que foram criados contra peptídeos derivados da sequência de aminoácidos K-E-F- L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), em que a sequência de aminoácidos do peptídeo derivado tem propriedades físico-químicas semelhantes como um peptídeo da sequência de aminoácidos K-E-F-L-Q- R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1), mas não tem atividade biológica distinta, em pacientes como um imunógeno para tratar doenças mediada por citocina-Yc.

Administração de Peptídeos Antagonistas-Yc

[00080] As presentes modalidades abrangem também a utilização de peptídeos antagonistas-Yc para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença. As presentes modalidades abrangem também uma composição farmacêutica que inclui os peptídeos antagonistas-Yc em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz não tóxica dos peptídeos antagonistas-Yc ou de outras composições das presentes modalidades.

[00081] As presentes modalidades fornecem métodos de utilização de composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de antagonistas para citocinas-Yc em um diluente ou veículo adequado. Um antagonista-Yc das presentes modalidades podem ser formuladas, de acordo com métodos conhecidos utilizados para preparar composições farmaceuticamente úteis. Um antagonista-Yc pode ser combinado em mistura, quer como o único material ativo ou com outros materiais ativos conhecidos, com diluentes farmaceuticamente adequados (por exemplo, fosfato, acetato, Tris-HCl), conservantes (por exemplo, timerosal, álcool benzílico, parabenos), compostos emulsionantes, solubilizantes, adjuvantes e/ou veículos, tais como a albumina de soro bovino. Os veículos adequados e as suas formulações estão descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980 Mack Publishing Co. Adicionalmente, tais composições podem conter um antagonista-Yc complexado com polietilenoglicol (PEG), íons metálicos ou incorporada em compostos poliméricos, tais como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogéis, etc., ou incorporada em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, espectros de eritrócitos ou esferoblastos. Tais composições irão influenciar o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo, ou um antagonista-Yc. Um antagonista-Yc pode ser conjugado com os anticorpos contra os antígenos específicos de células, receptores, ligantes, ou acoplados a ligantes de receptores específicos de tecidos.

[00082] Os métodos de administração de antagonistas-Yc presentes nas modalidades podem ser selecionados conforme adequado, dependendo de fatores, tais como o tipo de doenças, a condição dos indivíduos, e/ou o local a ser alvo. Os antagonistas-Yc podem ser administrados por via tópica, oral, parentérica, retal ou por inalação. O termo “parenteral” inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intracisternal, ou técnicas de infusão. Estas composições incluem tipicamente uma quantidade eficaz de um antagonista-Yc, sozinho ou em combinação com uma quantidade eficaz de qualquer outro material ativo. A quantidade do peptídeo contido nas composições farmacêuticas das presentes modalidades, a forma de dosagem das composições farmacêuticas, a frequência de administração, e semelhantes podem ser selecionadas, conforme apropriado, dependendo de fatores, tais como o tipo de doenças, a condição dos indivíduos, e/ou o local a ser alvo. Tais dosagens e concentrações de fármaco desejadas contidas nas composições podem variar afetadas por vários parâmetros, incluindo a utilização pretendida, o peso corporal e idade do paciente e a via de administração. Estudos piloto serão primeiro conduzido por meio de estudos de animais e o escalonamento para a administração humana será executado de acordo com a prática do estado da técnica aceito.

[00083] Em uma modalidade, as células hospedeiras que tenham sido modificadas geneticamente com um polinucleotídeo que codifica pelo menos um peptídeo antagonista-Yc são administrados a um indivíduo para tratar uma doença de proliferação e/ou para reduzir o crescimento de células malignas. O polinucleotídeo é expresso pelas células do hospedeiro, produzindo, assim, os peptídeos dentro do sujeito. De preferência, as células hospedeiras são alogênicas ou autogênicas ao sujeito.

[00084] Em outro aspecto, os peptídeos antagonistas-Yc podem ser utilizados em combinação com outras terapias, por exemplo, terapias de inibir a proliferação e crescimento de células cancerosas. A frase “terapia de combinação” abrange a administração de peptídeos antagonista-Yc e um agente terapêutico adicional, como parte de um regime de tratamento específico destinado a proporcionar um efeito benéfico a partir da coação destes agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos em combinação é tipicamente realizada durante um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada).

[00085] Uma terapia de combinação pretende abranger a administração destes agentes terapêuticos de uma maneira sequencial, isto é, em que cada agente terapêutico é administrado num tempo diferente, bem como a administração destes agentes terapêuticos, ou, pelo menos, dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea. Substancialmente, a administração simultânea pode ser realizada, por exemplo, por administração ao sujeito de uma única cápsula tendo uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas, individuais para cada um dos agentes terapêuticos. A administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por uma via adequada, incluindo, mas sem limitação a vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares e a absorção direta através de tecidos de membranas mucosas. Aqui os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. A sequência em que os agentes terapêuticos são administrados não é rigorosamente crítica.

[00086] A terapia de combinação também pode abraçar a administração dos agentes terapêuticos, como descrito acima, em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos (tais como, mas não limitado a um segundo e diferente agente terapêutico) e terapias não fármaco (tais como, mas sem limitação a cirurgia ou tratamento com radiação). Quando a terapia de combinação compreende ainda o tratamento de radiação, o tratamento de radiação pode ser conduzido em qualquer momento adequado, desde que um efeito benéfico a partir da coação da combinação dos agentes terapêuticos e tratamentos de radiação seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda alcançado quando o tratamento por radiação é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.

[00087] Em certas modalidades, os peptídeos antagonistas-YC podem ser administrados em combinação com pelo menos um agente antiproliferativo selecionado a partir do grupo que consiste de um agente quimioterapêutico, um agente antimetabólito, e antitumorigênico e um agente antimitótico, e um agente antiviral e agente antineoplásico, um agente imunoterapêutico, e um agente radioterapêutico.

[00088] Em certas modalidades, os peptídeos antagonistas-yc podem ser administrados em combinação com pelo menos um agente anti- inflamatório selecionado do grupo constituído por esteroides, corticosteroides e fármacos anti-inflamatórios não esteroides.

[00089] Também são fornecidos kits para realizar qualquer um dos métodos acima. Os Kits podem incluir um antagonista-yc, de acordo com as presentes modalidades. Em algumas modalidades, o kit pode incluir instruções. As instruções podem ser em forma escrita ou imagem gráfica, ou pode estar em meios gravados, incluindo fita de áudio, CD de áudio, fita de vídeo, DVD, CD-ROM, ou outros semelhantes. Os kits podem compreender embalagens.

Definições

[00090] Tal como aqui utilizado, o termo “paciente” refere-se ao receptor de um tratamento terapêutico e inclui todos os organismos dentro do reino Animalia. Em modalidades preferidas, o animal está dentro da família dos mamíferos, tais como seres humanos, ovinos, suínos, felino, búfalo, canino, caprino, equino, burro, veados e primatas. O animal mais preferido é o humano.

[00091] Tal como aqui utilizado, o termo “tratar” ou variações do mesmo (por exemplo, tratamento, tratando, etc.), se refere a qualquer tratamento de um paciente com diagnóstico de uma condição biológica, tais como CD4, CDB, e leucemia LGL, uma doença autoimune, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjoegren, granulomatose de Wegener, doença celíaca, tireoidite de Hashimoto, doença do colágeno, artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, diabetes mellitus, psoríase, uma doença neuronal degenerativa, esclerose múltipla, uveíte, inflamação do olho, doença do enxerto- versus-hospedeiro (GvHD), miastenia gravis, doenças associadas a (HTLV-I e HTLV-II) linfotrópicas tipo I e II de célula T humana 1, leucemia de células T (ATL), mielopatia associada a HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP), uveíte (HU), artropatia, pneumopatia, dermatite, exocrinopatia, miosite, influenza, AIDS, HBV, Herpes, asma, sinusite, rinite alérgica, bronquite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), rinite aguda, otite aguda e crônica, fibrose pulmonar, leucemia/linfoma NK e leucemia/linfoma NK- T. O termo tratar, como aqui utilizado, inclui: (i) impedir ou atrasar a apresentação de sintomas associados com a condição biológica de interesse num paciente em risco, que ainda tem de apresentar sintomas associados com a condição biológica, (ii) melhorar sintomas associados com a condição biológica de interesse num paciente diagnosticado com a condição biológica, (iii) prevenir, retardar, ou melhorar a apresentação de sintomas associados com complicações, condições ou doenças associadas com o estado biológico de interesse em qualquer paciente em risco ou um paciente diagnosticado com a condição biológica, (iv) abrandar, atrasar ou cessar a progressão da condição biológica, e/ou (v) prevenir, retardar, atrasar, parar ou melhorar os efeitos celulares da inflamação.

[00092] O termo “sintoma(s)”, tal como aqui utilizado, refere-se a sinais ou indicações de que o paciente sofre de uma condição ou doença específica comum.

[00093] O termo “quantidade eficaz”, como aqui utilizado, refere-se à quantidade necessária para provocar a resposta biológica desejada. De acordo com as presentes modalidades, uma quantidade eficaz de um antagonista-Yc é a quantidade necessária para proporcionar um efeito observável em pelo menos um fator biológico para utilização no tratamento de uma condição biológica.

[00094] “Tecnologia de DNA recombinante” ou “recombinante” refere- se à utilização de técnicas e processos para a produção de polipeptídeos específicos a partir de microrganismos (por exemplo, bacterianas, levedura), invertebrados (insetos), células de mamíferos ou organismos (por exemplo, animais transgênicos ou plantas) que foram transformados ou transfectados com sequências de DN clonadas ou sintéticas para permitir a biossíntese de peptídeos heterólogos. Padrão de glicosilação nativo só será atingido com o sistema de expressão de célula de mamífero. Os sistemas de expressão procarióticos não têm a capacidade de glicosilação para adicionar as proteínas sintetizadas. As células de levedura e de inseto proporcionam um padrão de glicosilação único que pode ser diferente do padrão nativo.

[00095] Uma “sequência de nucleotídeos” se refere a um polinucleotídeo na forma de um fragmento separado ou como um componente de um constructo de DNA maior, que foi derivado de DNA ou RNA isolado pelo menos uma vez numa forma substancialmente pura, livre de materiais endógenos contaminantes e numa quantidade ou concentração que permita a identificação, manipulação e recuperação das suas sequências nucleotídicas componentes através de métodos de biologia molecular padrão (como descrito em Current Protocols in Molecular Biology).

[00096] “Vetor de expressão recombinante” refere-se a uma unidade transcricional compreendendo um plasmídeo que contém um conjunto de (1) um elemento genético ou elementos que possuem um papel regulador na expressão do gene, incluindo promotores e intensificadores, (2) uma estrutura ou uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo, de acordo com as presentes modalidades, e (3) a transcrição adequada e sequência de iniciação da tradução e, se desejado, sequências de terminação. Elementos estruturais destinados à utilização em sistema de mamífero e de levedura incluem, preferivelmente, uma sequência sinal que permite a secreção extracelular de polipeptídeos traduzidos por células hospedeiras de levedura ou de mamífero.

[00097] “Sistema de expressão microbiano recombinante” refere-se a uma monocultura substancialmente homogênea de micro-organismos quentes adequados, por exemplo, bactérias, tais como E. coli ou leveduras, tais como S. cerevisiae, que foram integrados estavelmente numa unidade transcricional recombinante no DNA cromossômico ou transportar a unidade transcricional recombinante como um componente de um plasmídeo residual. Geralmente, as células hospedeiras que constituem um sistema de expressão microbiano recombinante são a progênie de uma única célula ancestral transformada. Os sistemas de expressão microbianos recombinantes expressarão polipeptídeos heterólogos após indução dos elementos reguladores ligados a uma sequência nucleotídica estrutural a ser expressa.

[00098] Os exemplos seguintes são apresentados para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Método para avaliar a Atividade Inibitória do Peptídeo Antagonista-Yc

[00099] A capacidade de um peptídeo derivado personalizado preparado, de acordo com as presentes modalidades para inibir a ação de um membro da família citocina-Yc é determinada utilizando ensaios celulares de mamíferos para medir a sua resposta proliferativa ao membro da família citocina-Yc.

[000100] Para cada uma das seis citocina-Yc, linhas de células indicadoras: CTLL-2, uma linhagem celular T CD8 murina disponível a partir da American Type Culture Collection, e PT-18, uma linhagem de mastócitos de murino e seu subclone PT-18β, é transfectada com o gene IL-2Rβ-humano para tornar as células sensíveis à IL-2 e IL-15 (Tagaya et al. , 1996, EMBO J. 15:4928-39), e é usado para determinar quantitativamente a atividade de promoção do crescimento de citocina- Yc (Ver Current protocols in Immunology from Wiley and Sons para um referencial metodológico). As células indicadoras demonstram a resposta dependente da dose semilinear, quando medido por um ensaio colorimétrico WST-1 ao longo de um intervalo de concentrações (Ver Clontech PT3946-1 e manual de utilizador associado, aqui incorporada por referência, para uma descrição detalhada dos reagentes e métodos). Uma vez que as doses adequadas da citocina que produzem o máximo de resposta de 50% e de 95% a partir da linhagem celular indicadora é determinado, várias concentrações (variando de 1 pM a 10 μM) do peptídeo derivado personalizado purificado ou sintetizado é adicionado a cada poço contendo as células de citocinas e indicador. A redução na absorção de luz a 450 nm é utilizada como um indicador de inibição da proliferação estimulada por citocina celular. Tipicamente, as células são estimuladas pelas citocinas, tais que a absorção do poço contendo linhagem celular indicadora e a citocina é entre 2,0 e 3,0, o qual é reduzido para um intervalo de 0,1 a 0,5 por adição de peptídeos inibidores.

EXEMPLO 2 Peptídeo BNZ-Y Especificamente Inibe as Atividades de Promoção de Crescimento de IL-9 e IL-15

[000101] Utilizando células PT-18β como descrito acima, a capacidade do peptídeo BNZ-Y para inibir especificamente a atividade de promoção do crescimento de determinadas citocinas-Yc foi determinada (Figura 3A). IL-3, uma não citocina-Yc que suporta o crescimento de células PT- 18β, foi utilizada como um controle negativo. Resumidamente, as células PT-18β foram incubadas ou com duas diluições diferentes de peptídeo BNZ-Y produzido por células HEK293T (diluição 1:20 ou 1:50 do sobrenadante original de células HEK293T transfectadas com um constructo de expressão BNZ-Y) ou sem peptídeo BNZ-Y na presença de IL-3, IL-9, IL-15 ou IL-4 (1 nM de cada citocina na cultura). Os crescimentos em respostas das células foram determinados 2 dias após a introdução do peptídeo BNZ-Y e da citocina utilizando o ensaio de WST1. A atividade de promoção do crescimento de IL-3 (uma não citocina-Yc), não foi inibida por BNZ-Y. Em contraste, a atividade de IL- 15 e IL-9 foram significativamente diferentes (p <0,01 teste T de Student) reduzido pelo peptídeo BNZ-Y. Proliferação celular estimulada por IL-4, outra citocina-Yc, não foi afetada pela adição de peptídeo BNZ-Y. Resultados para a IL-3, IL-9, IL-15 e IL-4 são mostrados na Figura 3A.

[000102] Num ensaio semelhante, foi utilizada a linhagem celular CTTL2 de murino. Neste ensaio, as células foram cultivadas com 0,5 nM de IL-2 recombinante em meio RPMI 10% de soro de vitelo fetal. Para configurar o ensaio de proliferação, as células foram lavadas a partir de 3 vezes de citocinas. As células foram semeadas a 1 x 10(5) células por poço de uma placa de 96 poços com a concentração final de 50 pM de IL-2 ou IL-15. Concentração variada de peptídeo BNZ-Y (0,1, 1 e 10 ug/ml) foi adicionado a cada poço. As células foram cultivadas durante 20 horas e, nas últimas quatro horas, 3H-timidina foi adicionada às placas. As células foram colhidas utilizando um leitor de placas. Os dados são mostrados na Figura 3B.

EXEMPLO 3 Método para Medir Inibição de Atividade de Citocina-Yc pela Avaliação da Incorporação de 3H-timidina como um Marcador de Proliferação Celular

[000103] A inibição da proliferação induzida por citocina-YC de uma população celular indicadora por peptídeos derivados personalizados antagonistas é medida pelo ensaio de incorporação de 3H-timidina. Resumidamente, timidina radiomarcada (1 microCi) é dada a 20-50.000 células em proliferação na presença de citocinas. A radioatividade incorporada por células é medida por aprisionamento de radioatividade ligada à célula de um filtro de fibra de vidro usando uma máquina colheitadeira convencional (Exemplo, Filtermate Universal Harvester da Perkin-Elmer), apôs o que a radioatividade é medida utilizando um contador b (Exemplo 1450, contador de cintilação microplaca Trilux).

EXEMPLO 4 Método para Medir Inibição de Atividade de Citocina-YC Avaliando a Incorporação de um Corante Rastreador de Célula como um Marcador de Proliferação Celular

[000104] As células indicadoras são incubadas na presença de uma citocina-YC selecionada ou na presença de um citocina-YC selecionada e um peptídeo derivado personalizado selecionado. A população de células é então marcada in vitro utilizando um corante rastreador de células, por exemplo, CMFDA, C2925 da Invitrogen, e o decaimento da fluorescência verde celular a cada divisão celular é controlada por meio de um citômetro de fluxo (por exemplo, Beckton-Dickinson FACScalibur). Tipicamente, em resposta a estimulação de citocina-YC 7-10 diferentes picos que correspondem ao número de divisões de que as células sofreram aparecerão no canal de fluorescência verde. A incubação das células com a citocina-YC selecionada e o peptídeo derivado personalizado antagonista reduz o número de picos a apenas 1 a 3, dependendo do grau de inibição.

EXEMPLO 5 Inibição de Sinalização Intracelular por BNZ-Y e seus Antagonistas Derivados

[000105] Além da estimulação da proliferação celular, a ligação das citocinas-Yc aos seus receptores provoca uma gama diversa de eventos intracelulares. (Rochman et al. 2,009 Nat. Immunol. 9:480-90, Pesu et al. 2005 Immunol. Rev. 203:127-142.) Imediatamente após a citocina se ligar ao seu receptor, uma tirosina quinase denominada Jak3 (Janus 3- quinase) é recrutada para o receptor na membrana plasmática. Esta quinase fosforila os resíduos de tirosina de múltiplas proteínas, incluindo as subunidade-Yc, STAT5 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 5) e subunidades da quinase PI3 (Fosfatidilinositol 3). Entre estes, a fosforilação de STAT5 tem sido implicada em vários estudos como sendo associado à proliferação das células iniciadas pela citocina- Yc. (Revisto em Hennighausen e Robinson, Genes Dev. 2008. 22:711-21.) De acordo com estes dados publicados, com ou sem o peptídeo BNZ-Y inibe a fosforilação da tirosina da molécula STAT5 nas células PT-18β estimulada por IL-15 foi examinada (resultados mostrados na Figura 3C).

[000106] As células PT-18r3 foram estimuladas por IL-15, na presença ou ausência de peptídeo BNZ-Y. Proteínas citoplasmáticas foram extraídas a partir das células, de acordo com um método convencional como descrito em Tagaya et al. 1996 EMBO J. 15:4928-39. As proteínas citoplasmáticas extraídas foram resolvidas utilizando um padrão de SDS-PAGE (Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) e o estado de fosforilação foi confirmado por um anticorpo antifosfo-STAT5 (Cell Signaling Technology, Catálogo #9354, Danvers MA), utilizando o immunoblotting (ver Figura 3C, painel superior). Para confirmar que cada pista representou uma carga total de proteína semelhante, a membrana foi então retirada, e ressondada com um anticorpo anti-STAT5 (Cell Signaling Technology, Catálogo #9358) (ver Figura 3C, painel inferior).

[000107] Estes resultados demonstram que a fosforilação da tirosina de STAT5, um marcador da transdução de sinal, foi induzida pela IL-15 em células-PT1813, e fosforilação de tirosina de STAT5 foi marcadamente reduzido pelo peptídeo BNZ-Y.

EXEMPLO 6 Projeto Racional para Peptídeos BNZ-Y Derivados Antagonistas

[000108] Peptídeos derivados são preparados com base na sequência de núcleo D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q (SEQ ID NO: 2) (onde X denota qualquer aminoácido), substituindo os aminoácidos definidos da sequência de núcleo por aminoácidos possuindo propriedades físico- químicas idênticas, como designado na Figura 2.

EXEMPLO 7 Método de Identificar a Especificidade Inibitória de Peptídeos Derivados Personalizados Antagonistas

[000109] A especificidade inibitória de citocina-Yc de peptídeos derivados personalizados antagonistas é determinada através da análise da capacidade de um peptídeo derivado personalizado para inibir a resposta proliferativa de uma linhagem celular que responde a citocina de cada uma das 6 citocinas-Yc. Por exemplo, uma linhagem celular de camundongo, CTLL-2, é utilizada para determinar se um peptídeo candidato inibe a função da IL-2 e IL-15. Células PT-18(β) são utilizadas para determinar se um peptídeo candidato inibe a função de IL-4 e IL-9. Células PT-18(7α) são utilizadas para determinar se um peptídeo candidato inibe a função da IL-7, e as células PT-18(21α) são utilizados para determinar se um peptídeo candidato inibe a função da IL-21. PT- 18β indica um subclone da célula PT-18 exogenamente que expressam IL-2Rβ humano por transfecção de genes (Ver Tagaya et al. 1996.), TP- 18(7α) indica um subclone que expressa IL-7Rα pelo gene de transfecção e a célula PT-18(21Rα) expressar IL-21Rα humano.

[000110] Outra alternativa é a utilização de outras linhas de células que respondem a uma variedade de citocinas. Um exemplo desta linha de células NK em linhagem celular NK92 humana que está comercialmente disponível pela ATCC (Catálogo # CRL-2407). Esta linhagem celular é uma linhagem celular dependente de IL-2 que responde a outras citocinas, incluindo IL-9, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 (Gong et al. 1994 Leukemia 8:652 -658, Kingemann et al., 1996, Biol Blood Marrow Transplant 2:68,75, Hodge DL et al., 2002 J. Immunol 168:9090-8)

EXEMPLO 8 Preparação de Peptídeos Antagonistas-YC

[000111] Peptídeos antagonista-YC derivados personalizados são sintetizados quimicamente por processos manuais e automatizados.

[000112] Síntese manual: A síntese de fase líquida clássica é empregada, o que envolve o acoplamento do grupo carboxil ou C-terminal de um aminoácido com o grupo amino ou N-terminal de outro. Alternativamente, a síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) é utilizada.

[000113] Síntese automatizada: Muitas empresas comerciais fornecem síntese de peptídeos automatizada a um custo. Estas empresas usam vários sintetizadores de peptídeos comerciais, incluindo sintetizadores fornecidos pelar Applied Biosystems (ABI). Derivados peptídeos de antagonistas-yc personalizados são sintetizados por sintetizadores de peptídeos automatizados.

EXEMPLO 9 Produção Biológica de Peptídeos Antagonistas-Yc Derivados Personalizados Usando Tecnologia Recombinante

[000114] Um peptídeo antagonista-Yc derivado personalizado é sintetizado biologicamente como um pró-peptídeo que é constituído por um peptídeo de marcação apropriado, um peptídeo de sinal, ou um peptídeo derivado de uma proteína humana conhecida que aumenta ou estabiliza a estrutura do peptídeo BNZ-Y e aumenta a sua atividade biológica. Caso desejado, uma sequência de clivagem enzimática apropriada de prosseguir para o N-terminal do peptídeo deve ser concebida para remover o marcador ou qualquer parte do peptídeo da proteína final.

[000115] A sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo derivado personalizado com um códon de terminação na extremidade 3’ é inserida num vetor comercial com uma parte de marcação derivada a partir de tiorredoxina de E. coli e uma sequência de peptídeo especial que é reconhecida e digerida por uma enzima proteolítica adequada (por exemplo, enteroquinase) intervindo entre a parte de marcação e a sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo derivado personalizado e códon de terminação. Um exemplo de um vetor adequado é o plasmídeo pThioHis disponível da Invitrogen, CA. Podem ser utilizados outros vetores de expressão.

EXEMPLO 10 Conjugação do BNZ-Y e Derivado a Proteínas de Transporte para Fins de Imunização e Geração de Anticorpo anti-BNZ-Y

[000116] BNZ-Y e outros peptídeos derivados personalizados são usados para imunizar animais para obter anticorpos policlonais e monoclonais. Os peptídeos são conjugados com o N- ou C-terminal de proteínas transportadoras adequadas (por exemplo, albumina de soro bovino, Hemocianina de Keyhold Limpet (KLH), etc.) por meio de métodos convencionais, utilizando Glutaraldeído ou m-Maleimidobenzoil-N- Hidroxisuccinimida Éster. Os peptídeos conjugados em conjunto com um adjuvante apropriado são então utilizados para imunizar animais, tais como coelhos, roedores ou burros. Os anticorpos resultantes são examinados quanto à especificidade utilizando métodos convencionais. Se os anticorpos resultantes reagem com o peptídeo imunogênico, eles são então testados quanto à capacidade para inibir a atividade da citocina-Yc individual, de acordo com os ensaios de proliferação celular descritos nos Exemplos 1-3. Devido à natureza do compósito dos peptídeos derivados, é possível gerar um único anticorpo que reconhece duas citocinas diferentes, simultaneamente, devido à natureza compósita destes peptídeos.

EXEMPLO 11 Método para Produção em Grande Escala de Peptídeos Antagonistas-Yc Derivados Personalizados

[000117] As proteínas recombinantes são produzidas em grande escala pelo uso de um sistema isento de células, tal como descrito em outro lugar. (Ver Takai et al. 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (3):272- 8.) Resumidamente, os cDNAs que codificam o peptídeo antagonista-Yc e um marcador são subclonados num vetor adequado (Ver Takai et al. 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (3):272-8), o qual é submetido a transcrição in vitro, seguido imediatamente por uma tradução in vitro para produzir o peptídeo marcado. O pró-polipeptídeo é então purificado usando um anticorpo imobilizado que reconhece o epítopo marcado, tratado pela enzima proteolítica e o eluato (o qual geralmente contém o peptídeo derivado personalizado de interesse) é testado quanto à pureza utilizando 18% de Tricina-SDS-PAGE convencional (Invitrogen) e coloração com Comassie convencional. Caso a pureza desejada do peptídeo não seja atendida (> 98%), a mistura é submetida a HPLC convencional (cromatografia líquida de alta eficiência) para posterior purificação.

EXEMPLO 12 Uso de Peptídeo Antagonista-Yc Derivado Personalizado para Bloquear Função de Citocina em HAM/TSP

[000118] Mielopatia associada a HTLV-1 (HAM)/paraparesia espástica tropical (TSP) é uma mielopatia crônica progressiva vista em algumas pessoas infectadas com o Vírus Linfotrópico T Humano Tipo I (HTLV-I). A infiltração de linfócitos na medula espinal está associada com a resposta imune a HTLV-I e resulta na liberação de certas citocinas. Algumas destas citocinas podem também danificar os nervos.

[000119] Os pacientes com HAM/TSP mostram um elevado estado do sistema imunológico que é semelhante ao observado em doenças autoimunes (Oh et al. Neurol Clin 2008. 26:781-785). Este estado elevado é demonstrado pela capacidade de células T do paciente de HAM/TSP se submetem a proliferação espontânea numa cultura ex vivo por cerca de uma semana, na ausência das citocinas adicionadas exogenamente. A proliferação espontânea de células-T em pacientes com HAM/TSP é atribuída, pelo menos em parte, às alças autócrina/paracrina de IL-2, IL-9 e IL-15. Tem sido demonstrado que a adição de anticorpo bloqueador contra a IL-2 ou de receptores de IL-15 pode inibir a proliferação de célula-T espontânea num sistema de cultura ex vivo de HAM/TSP. Estas observações, juntamente com outros dados derivados a partir de estudos ex vivo, proporcionaram o fundamento para tomar dois anticorpos monoclonais (um alfa receptor anti-IL-2 ou anti-Tac e uma cadeia beta de receptor anti-IL-15) na clínica para tratamento de HAM/TSP (Azimi et al. 2.001 Proc. Natl. Acad. Sci. 98:14559-64., Azimi et al., 1999 J. Immunol 163:4064-72). Antagonistas do receptor anticitocina, de acordo com as modalidades aqui descritas, não só seriam valiosos como um agente imunomodulador terapêutico para o tratamento de HAM/TSP, mas a modulação da resposta imune em HAM/TSP por antagonistas de receptor anticitocina, de acordo com as presentes modalidades atua como prova de conceito para a utilização de antagonistas do receptor anticitocina, de acordo com as presentes modalidades no tratamento de outras doenças autoimunes.

[000120] Para demonstrar a eficácia dos peptídeos antagonistas-Yc derivados personalizados, de acordo com as modalidades aqui descritas, foi testada a capacidade do peptídeo BNZ-Y para bloquear a resposta imune para HTLV-I num ensaio de proliferação de célula-T espontânea, utilizando um sistema de cultura ex vivo HAM/TSP. Os ensaios de proliferação foram realizados em amostras de sangue de pacientes com HAM/TSP com e sem a adição de BNZ-Y. Estes testes avaliaram a capacidade de BNZ-Y bloquear a função das citocinas, tais como IL-2 e IL-15, presente na cultura de sangue de paciente HAM/TSP ex vivo e prevenir a proliferação de célula-T espontânea nestas amostras.

[000121] Em um ensaio ex vivo espontâneo de proliferação de células- T, PBMC de paciente de HAM/TSP foi cultivado a 1 x 10(6) células por poço de uma placa de 96 poços, em RPMI-FCS a 10%. Concentrações crescentes de peptídeo BNZ-Y foram adicionadas a cada poço. Como controle, um peptídeo irrelevante foi usado de forma semelhante. As células foram incubadas em um incubador de CO2 a 37°C durante 3, 4, e 6 dias. A quantidade de 1 uCi de 3H-timidina foi adicionada às células. Após um adicional de 6 horas de incubação, as células foram colhidas e a sua taxa de proliferação foi medida. Os dados representativos de um paciente HAM/TSP são mostrados na Figura 4A-D. Tal como indicado na Figura 4, peptídeo BNZ-Y inibe a proliferação espontânea de célula T em cultura HAM/TSP a uma concentração de cerca de 1 ug/ml.

[000122] Outros marcadores imunológicos foram adicionalmente medidos neste ensaio. A percentagem das células CD8 específicas virais foi medida durante a cultura ex vivo usando tetrâmeros de proteínas virais. A população de células CD4+CD25+, um marcador da ativação de células T, bem como corante Ki67, um marcador de proliferação de células T foi monitorado num ensaio de citometria de fluxo.

[000123] Outras formas do conjugado de derivado peptídeo BNZ-Y podem ser utilizadas num ensaio futuro semelhante. Elas incluem a albumina, BSA, PEG que podem ser conjugados com o peptídeo após a síntese química. Outras formas biológicas do peptídeo BNZ-Y conjugado podem incluir regiões de entidades de proteínas conhecidas (incluindo, mas sem limitação a região Fc de IgG humana) que são fundidas com o derivado de peptídeo BNZ-y.

EXEMPLO 13 Método para Tratamento de Leucemia de Célula T Adulta (ATL) em um Paciente Humano por Administração de Peptídeo Antagonista-Yc Derivado Personalizado

[000124] Um paciente humano sofrendo de leucemia de célula T adulta é identificado. Uma dose eficaz, tal como determinada pelo médico, do peptídeo antagonista-yc derivado personalizado, por exemplo, BNZ-y é administrada ao paciente durante um período de tempo determinado pelo médico. O tratamento é determinado para ser eficaz se o paciente entra em remissão.

EXEMPLO 14 Método de tratamento de HAM/TSP em um Paciente Humano pela Administração de Peptídeo Antagonista-Yc Derivado Personalizado

[000125] Um paciente humano que sofre de HAM/TSP é identificado. Uma dose eficaz, tal como determinada pelo médico, de peptídeo antagonista-yc derivado personalizado, por exemplo, BNZ-y é administrado ao paciente durante um período de tempo determinado pelo médico. O tratamento é determinado para ser eficaz se os sintomas do paciente melhoram ou se a progressão da doença foi interrompida ou retardada. REFERÊNCIAS Antony, P.A., Paulos, C.M., Ahmadzadeh, M., Akpinarli, A., Palmer, D.C., Sato, N., Kaiser A., Heinrichs, C.S., Klebanoff, Tagaya, Y., and Restifo, NP., Interleukin-2-dependent mechanisms of tolerance and immunity in vivo. 2006 J. Immunol. 176:5255-66. Azimi, N., Nagai, M., Jacobson, S., Waldmann, T.A., IL-15 plays a major role in the persistence of Tax-specific CD8 cells in HAM/TSP patients, 2001 Proc. Nati.. Acad. Sci. 98:14559-64. Azimi, N., Mariner J., Jacobson S., Waldmann T.A., How does interleukin 15 contribute to the pathogenesis of HTLV type-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis? 2000 AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:1717-22. Azimi, N., Jacobson, S., Leist, T., Waldmann, T.A., Involvement of IL-15 in the pathogenesis of human T lymphotropic virus type-l-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis: implications for therapy with a monoclonal antibody directed to the IL-2/15R beta receptor. 1999 J. Immunol. 163:4064-72. Azimi, N., Brown, K., Bamford, R.N., Tagaya., Y., Siebenlist, U., Waldmann, Human T cell lymphotropic virus type 1 Tax protein transactivates interleukin 15 gene transcription through an NF-kappaB site. 1998 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:2452-7. Bazan, J.F., Hematopoietic receptors and helical cytokines. 1990 Immunol. Today 11:350-354. Bettini, M., and Vignali, D.A., Regulatory T cells and inhibitory cytokines in autoimmunity. 2009 Curr. Opin. Immunol. 21:612-8. 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Claims (8)

1. Conjugado Peptídico, caracterizado por que o conjugado peptídico consiste num peptídeo isolado ou purificado, uma conjugação e um elemento ligante, o peptídeo isolado ou purificado consistindo em uma sequência de aminoácidos de núcleo Yc-box D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K- X-L/I-X-Q (SEQ ID NO: 2), em que o primeiro X denota F, L ou W, o segundo X denota H, T, S ou E e o terceiro X denota V, F, L, M ou C e em que a referida sequência de aminoácidos de núcleo YC-box consiste numa sequência de composto artificial que combina a sequência de aminoácidos de duas ou mais das regiões D-hélice de yc-citocina humana de SEQ ID NOS: 3-8.

2. Conjugado Peptídico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o peptídeo isolado ou purificado consiste na sequência de aminoácidos I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S (SEQ ID NO: 1) (BNZ-y).

3. Conjugado Peptídico, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as conjugações consistem em BSA, albumina, região Fc de IgG ou polietilenoglicol (PEG).

4. Conjugado Peptídico, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizado por que o conjugado peptídico inibe a atividade de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ou IL-21.

5. Método In Vitro Para Bloquear Sinalização Por Um ou Mais Membros de Família Citocina—Yc, caracterizado por que compreende o contato de uma célula com o conjugado peptídico, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4.

6. Método In Vitro Para Inibir Ligação de Citocina-Yc a Subunidade- Yc, caracterizado por que compreende o contato de uma subunidade- yc com o conjugado peptídico, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4.

7. Composição Farmacêutica, caracterizada por que consiste numa quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado peptídico, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4 e um veículo, diluente, excipiente farmaceuticamente aceitável ou uma combinação dos mesmos.

8. Uso de Conjugado Peptídico, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, ou de Composição Farmacêutica, conforme definida na Reivindicação 7, caracterizado por que é para fabricar um medicamento para melhorar ou tratar uma doença mediada por citocina-Yc, em que a doença mediada por citocina YC é selecionada do grupo que consiste em: leucemia CD4, leucemia CD8, leucemia LGL, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjõgren, granulomatose de Wegener, doença celíaca, tireoidite de Hashimoto, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, diabetes mellitus , psoríase, esclerose múltipla, uveíte, inflamação do olho e doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD) ou por que é para fabricar um medicamento para melhorar ou tratar uma mielopatia associada a HTLV-1- (HAM)/doença associada a paraparesia espástica tropical (TSP), em que a doença associada a HAM/TSP é selecionada do grupo que consiste em: Leucemia de células T adultas (ATL), Mielopatia associada a HTLV/Paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e outras doenças inflamatórias não neoplásicas associadas a HTLV, tais como uveíte (HU), artropatia, pneumopatia, dermatite, exocrinopatia e miosite ou por que é para fabricar um medicamento para melhorar ou tratar uma doença respiratória inflamatória, em que a doença respiratória inflamatória é selecionada do grupo que consiste em: asma, sinusite, febre do feno, bronquite, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), rinite alérgica, otite aguda e crônica e fibrose pulmonar ou por que é para fabricar um medicamento tendo uma finalidade cosmética, em que a finalidade cosmética é selecionada a partir do grupo que consiste em: tratamento de acne, tratamento de perda de cabelo, tratamento de queimadura solar, manutenção de unha e redução da aparência de envelhecimento.

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