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Cette invention concerne un nouveau procédé de production de la riboflavine, et plus particulièrement la production de la riboflavine par le développement du micro-organisme Asbhya gossypii sur un nouveau typ3 de milieu de nutritif.
Le champignon Asbhya gossypii est un organisme bien connu, que l'on a déjà employé pour obtenir la riboflavine. Mais le procédé antérieur qui employait ce micro-organisme n'a donné que des rendements d'environ 300
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à 400 gaas/ ct3 . On a constaté que, si l'on utilise des milieux nutritifs nouveaux pour développer l'Asbhya gossypii dans les procédés déjà connus employant cet organisme, on peut obtenir des rendements très supérieurs aux
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renâements¯précédentso En particulier le nouveau procédé de l'invention permet d'obtenir couramment" des rendements 4 à 5 fois plus élevés que les ren- dements antérieurs. Chose surprenante, ces rendements élevés sont obtenus . sur des milieux ne comprenant pas les-composants criticables que l'on jugeait habituellement nécessaires jusqu'ici.
En d'autres termes, non seulement le procédé nouveau de cette invention fournit des rendements fortement accrus, mais encore il emploie un milieu de fermentation avantageusement simplifié.
Dans les procédés précédents qui développaient l'Asbhya gossypii sur des milieux liquides, le milieu nutritif comprenait toujours une source de protéine, qui était habituellement entièrement ou en partie d'origine animale, et une source d'hydrates de carbone. On a trouvé que l'on peut employer un milieu simplifié, à peu près exempt d'hydrates de carbone, peur
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développer l'Asbhya gossypii et obtenir des render#ntsélevés de riboflavine.
On a constaté également que, si on le désire, le milieu exempt d'hydrate s de carbone peut également être à peu près exempt de substances protéinées d' origine animale. Il est souvent désavantageux d'employer dans les milieux de
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fermentation des substances protéinées d'origj"lp animale +elles que les pettones, l'extrait de boeuf et les déchets d'abattoir arche que ces produits sont généralement plus onéreux que les matil:J.L<::;
' jjrouéinées d'origine végétale, et parce que leur emploi .ans le milieu de fermentation donne frêqueia- ment des résultats non constants du fait de la co position variable de ces substances protéinéesanimale Se
Les principes nutritifs contenus dans les milieux nutritifs du nouveau procédé de cette invention comprennent une substance protéinée
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et un lipide assimilables (métabolisables)o On peut citer parmi les sources de protéines satisfaisantes la liqueur de macération de mais, la farine de graine de soja, la farine de graine de coton, la farine de graine de lin,
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la liqueur de déchets d'abattoirs, et des préparations de pEptones. Le lipide peut d- 113me trie d'origine animale ou végétale ou être composé par un mélange.
Le lipide préféré est l'huile de lard qui est évidemment d'origine animale. Mais on peut également employer avec des résultats excellents des lipides tels que l'huile de mais, l'huile de graine de soja, l'huile de coco, l'huile d'olive et autresglycérides des acides gras.
Le concentration de produits nutritifs dans les nouveaux milieux employés dans le nouveau procédé de cette invention peut varier largement. Les produits nutritifs peuvent représenter par exemple 0,5 à 10 % du milieu nutritif. La concentration nutritive du milieu doit être assez élevée pour permettre un bon développement de l'Asbhya gossypii, sinon on obtient des rendements relativement faibles en riboflavine. Mais d'-autre part, si la concentration nutritive est trop forte, la viscosité du milieu devient mauvaise, et il est plus difficile d'isoler le ,produit.
La concentration nu-
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tritive optinum varie quelque peu avec la cOI....-ositim "..acte des produits nu- tritifs. Si par exemple la substance protéinée est exclusivement d'origine végétale, la concentration optimum totale des produits nutritifs est habituellement de 4 à 6 % en poids; mais si la source de protéine comprend à la fois des substances d'origine animale et végétale, la concentration totale optimum des produits nutritifs est la plupart du temps comprise entre 5 % et 8 % en poids.
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Les matières protéinées utilisées dans les nouveaux milieux de culture de cette invention, peuvent représenter 20 à 80 % en poids de l'ensemble des produits nutritifs, la vapeur optimum étant fonction de la source particulière de protéines employéeso Avec des matières protéinées végétales, on obtient habituellement les meilleurs résultats dans des milieux dans lesquels la matière protéinée représente 40 % à 60 % de 1'ensenble des produits nutritifs. Dans des milieux dens lesquels la matière protéinée est un mélange de protéines d'origine animale et d'origine végétale, on obtient les meilleurs résultats lorsque cette ma:tière protéinée représente 60 % à 70 % de l'ensemble des produits nutritifs.
Etant donné que les principaux produits nutritifs des nouveaux milieux comprennent une matière protéinée et un lipide, ce qui précède montre que le lipide assimilable peut constituer de même environ 20 % à 80% en poids de l'ensemble des produits nutritifs.
En plus de la source de protéines et le lipide, les milieux utilisés dans le nouveau procédé de cette invention peuvent contenir de petites quantités d'autres substances qui sont connues pour stimuler la croissance de l'Asbhya gossypii dans certaines conditions. On peut citer parmi ces substances des vitamines, des sels minéraux tels que le carbonate de calcium et le phosphate de monopotassium, et certains éléments à l'état de traces tels que le manganèse, le fer, le cuivre et le zinc. Quand on emploie la liqueur de macération de mais, dans les nouveaux milieux de cette invention, elle présente l'avantage de contenir suffisamment de vitamines et de substances minérales, grâce à quoi d'autres additions ne sont plus nécessaires.
Mais si l'on emploie un milieu ne contenant que des sources de protéines autres que la liqueur de macération de mais, on constate qu'il est généralement avantageux de compléter le' milieu par des vitamines telles que la biotine, et la thiamine, et par des substances minérales telles que celles indiquées plus hauto
Les opérations de fermentation du nouveau procédé de cette invention sont à peu près identiques à celles qu'on utilise dans les procédés antérieurs de production de la riboflavine. Par exemple, le brevet n 2,445.128 du 13 juillet 1948 des Etats-Unis d'Amérique, décrit un procédé de fermentation que l'on peut employer d'une façon très satisfaisante dans le nouveau procédé de cette invention.
Le procédé habituel consiste à préparer un milieu nutritif stérile, à inoculer ce milieu à l'aide d'Asbhya gosypii, à entretenir le milieu inoculé à une température comprise entre 20 et 40 G environ et de préférence à une température d'environ 26 C, jusqu'à ce que la concentration deriboflavine atteigne le niveau désiré, puis à extraite la riboflavine du milieu par 1!..un quelconque des procédés bien connus qui conviennent dans ce but.
On peut conduire la fermentation à un pH quelconque voisin de la neutralité,par exemple entre 6,0 et 8,0 La zone préférable du pH est comprise entre 6,5 et 7,5 environ. En règle générale, le réglage du pH présente très peu de difficultés. Si le réglage est fait avant le début de la fermentation., il est habituellement nécessaire de le régler de nouveau. Le champignon Asbhya gossypii a besoin d'oxygène pour se développer de façon satisfaisante et produire de la riboflavine. Il faut donc aérer le milieu pendant la fermentation. Si la fermentation est effectuée dans des flacons agitateurs ou autres récipients analogues, il est bon généralement que la surface du milieu exposée à l'atmosphère et exprimée en cn2, soit au moins égale au volume du milieu exprimé en cm3.
Quand la fermentation s'effectue dans des réservoirs qui sont aérés de la façon habituelle, il est bon en. général que le débit d'air exprimé en 1/min. soit au moins égal au quart du volume du milieu exprimé en litres. Des débits d'air plus élevés sont avantageux et l'on constatera dans ae nombreux cas qu'il est désirable que le débit d'air en 1/min. soit égal au volume du milieu en litres Dans de nombreux cas, l'aération est suffisante pour maintenir le milieu dans un état d'agitation suffisant. Mais il faut dans certaines circonstan-
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ces adopter un brassage mécanique pour entretenir une dispersion satisfai- sante du champignon dansle milieu.
Lorsque la fermentation s'est poursuivie pendant un certain temps, on constate que la production de riboflavire à atteint une valeur tele, qu'il n'est pas avantageux de prolonger davantage la fermentation.
Cette péricde de fermentation est très variable, et peut descendre jusqu'à
60 h ou au contraire atteindre 160 ho En règle générale, on obtient les meilleurs résultats en arrêtant la fermentation entre 90 et 130 h environ.
On peut extraire la riboflavine de la bière de fermentation par l'un. quelconque des procédés bien connuso Un excellent procédé consis- te à ajouter un agent réducteur pour réduire la riboflavine à sa forme insoluble et extraire le précipité ainsi obtenue On peut ensuite oxyder la substance réduite en l'exposant à l'atmosphère ou bien par tout autre pro- cédé convenable pour la faire passer à la forme soluble.
On illustrera plus particulièrement l'invention par les exem- ples particuliers suivants, dans lesquels toutes les proportions sont des proportions pondérales sauf indication contraire.,
EXEMPLE I.
On prépare un milieu d'inoculation en plaçant une cuillerée d' une boue d'Asbhya gossypii (culture N Y1056 du Northern Regional Research
Laboratory) dans un flacon contenant 25 cm3 d'un milieu comprenant dans de l'eau ordinaire 2,5 % de liqueur de macération de mais, 2 % de cérélose, et 0,5 % de peptone, le pH étant réglé à 6,7 avec NaOH. On laisse incuber le flacon contenant le milieu d'inculation sur un. agitateur à. mouvement alternatif pendent 48 h.
On prépare tous les milieux de fermentation en mélangeant la matière protéinée; on utilise divers hydrates de carbone en vue de comparaisons, et enfin on ajoute de l'eau. On règle le pH à 6,7 avec une solu- tion décinormale de soude caustique, on ajoute le lipide assimilable, puis on chauffe à 120 C pendant 20 min. pour stériliser.,
Les fermentations sont effectuées dans des flacons de 250 cm3 dont chacun contient 25 cm3 de milieu de fermentation. On inocule aseptiquement les flacons stériles, contenant 25 cm3 de milieu avec 1 cm3 de milieu d'inoculation et on les laisse incuber à 25,5 - 26 ,5 C pendant 5 jours sur un agitateur rotatif tournant à environ 180 t/min.
Dans une série de douze essais de deux flacons chacun, effectués avec un milieu de culture comprenant 1 % de liqueur d'abattoir, 2 % de liqueur de macération de mais (en poids par volume) et 2 % par volume d'huile de lard, le-reste étant de l'eau ordinaire, on a obtenuune production moyenne de 5 jours qui était de 949 gammas/cm3 de riboflavine.
Le rendement minimum de ces essais a été de 790 gammas/cm3 et le rendement maximum de 1160 gammas/cm3 Dans des essais comparatifs effectués avec un milieu identique sauf qu'on avait ajouté 0,5% de cérélose (en poids/vo- lume) le rendement maximum de riboflavine n'a été que de 890 gammas/cm3 et le rendement minimum de 605 gammas/cm3, le rendement moyen étant de 728 garmas/ cm3 En d'autres termes, l'emploi d'un milieu à peu près exempt d'hydrates de carbone a donné une augmentation d'environ 30 % du rendement.
EXEMPLE 2.
A l'aide d'une boue de sporulation d'Asbhya gossypii (culture N Y1056 du Northem Régional Research Laboratory) on prépare plusieurs suspensions que 1'on applique sur des plaquettes d'agar-agaro Au bout de 4 à 7 jours d'incubation, on enlève les colonies les plus vivement pigmentées, et on les développe par des dilutions et transferts successifs, jusqu'à ce qu'on obtienne un type de culture isolé produisant de façon constante une souche vivement pigmentée. A l'aide d'une boue de sporulation de cette souche on prépare des supensions que l'on soumet au rayonnement du
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mélange ultra-violet.
On applique ensuite les suspensions sur des plaquettes d' agar-agar. On cultive les colonies les plus vivement pigmentées en procédant'à des dilutions et transferts successifs, jusqu'à, ce qu'on ait isolé une nouvelle souche mutative capable de produire régulièrement des colonies vivement pigmentées.
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Cette "mutation" qui sera appelée ici la race A 37, donne par le nouveau procédé de cette invention des rendements qui sont encore supérieurs à ceux de la souche d'origine Y1056.
Suivant le procédé de l'exemple I, on prépare un milieu d' inoculation à partir de la race A 37, et l'on s'en sert pour inoculer une série de flacons de 250 cm3 dont chacun contient 25 cm3 d'un milieu compre-
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natit'2 % (en poids/volume) de liqueur de macération de mais et z d'huile de lard en volume,le reste étant l'eau ordinaire. Dans le premier essaie effectué avec ce milieu de culture simple, la production moyenne de ribo-
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flavine en 5 jours a été de 580 gammas/on0. Les essais ultérieurs donnèrent des rendements atteignant 1460 gammas/ c3..
On a obtenu également dans des récipients de fermentation de 300 litres, des rendements qui sont comparables à ceux qu'on a obtenus dans les flacons à agitateurs. Le tableau 1 ci-après donne les résultats et autres renseignements concernant 5 fermentations effectuées -avec la race A 37 et un milieu de 'culture 'comprenant 2 % d'huile de lard en volume ét la proportion indiquée (poids/volume) de liqueur de macération de mais le reste étant de l'eau ordinaire
TABLEAU 1
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Débit d' air¯e Liqueur de :
Riboflavine eu3 hue (en vol/vol, z macération ' .. -- ---.. , .,- - A mino) o de mais o 32 . 40 e 64 : 88 1 2: : poids/volo : a e : -------------------- -""-4-C¯-------------- 8T""P'1 '1"''' .1......4.11. o ,3. : 2 . 57 e 150 r 435 : 460 t 580 z,52 . 2 e 104 1 208 : 500 : 660 : 7oa os52 z 3 . 204 : 460 : 740 840 : 890 os70 . 3 e 192 : 405 :780 910 : 900 0 ,70 4 t 70 : 320 e g60 : 1100 :1030 --4 -"I¯--"'-------"'----------------¯." -....¯V""'<I-
On voit que le nouveau procédé de l'invention utilisé avec des milieux de culture extrêmement simples, peut donner des rendements supérieurs à ceux qu'on peut obtenir par les procédés antérieurs, qui utilisent des milieux de fermentation complexes contenant des hydrates de carbone. Il faut signaler également que les milieux utilisés dans cet exem- ple ne contiennent pas de substances protéinées.
Dans les fermentations des procédés antérieurs utilisant l'Asbhya gossypii, on estime généralement que
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la présence de prol6làes - animales est nécessaire si l'on veut obtenir le résultat satisfaisant.
EXEMPLE3
On prépare un milieu d'inoculation à l'aide de la race A 37 comme dans l'exemple 2, et l'on procède aux fermentations dans des flacons de 250 cm3 contenant 25 cm3 de milieu de fermentation inoculé avec 1 % d' une culture d'inoculation vieille de 48 h. Dans ces essais, le milieu de fermentation comprenait de l'eau ordinaire, de la liqueur de macération de mais, un lipide assimilable, et une peptone liquidée On a utilisé trois peptones liquides différentes -. peptones N 159,N 343 et N 366 de Wilson & CO Le tableau ci-après indique la composition' de ces peptones.
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TABLEAU 11i
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NI> 159 lY "/6"/ No 366
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<tb>
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> (%) <SEP> 56,5 <SEP> 59,0 <SEP> 56,5
<tb>
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Azote G5) 9 ,5 8,0 8 ,4
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<tb>
<tb> Ester <SEP> soluble <SEP> de <SEP> pé-
<tb>
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trole (1 ) 0,3 6,0 1
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<tb>
<tb> Azote <SEP> aminé <SEP> (en <SEP> % <SEP>
<tb> d'azote <SEP> total) <SEP> 21,0 <SEP> 21,0 <SEP> 21,0
<tb>
Le tableau suivant donne les résultats d'une série de fermen- tatiuns d'essai effectuées dans des milieux comprenant 2 % d'huile de lard
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en volume, le pourcentage indiqué de peptone Na 343 de Wilson & Co (en volume) est le pourcentage indiqué de liqueur de iracération de mais et d'eau: TABLEAU III.
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Peptone OE) Riboflavine, en Ô jc3 et en 5 ¯¯¯ Jours z 14,94 3$ Ià.Il
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<tb>
<tb> CI <SEP> 9?- <SEP> 930 <SEP> 1020
<tb> 0,5 <SEP> 925 <SEP> 1100
<tb> 130 <SEP> 1130 <SEP> 1310
<tb> 2,0 <SEP> 1370 <SEP> 1200
<tb> 3,0 <SEP> 1475 <SEP> 1090
<tb>
Dans des essais comparatifs dans lesquels 1% de liqueur c abattoir emplaçait le peptone employé plus haut, la production de ribe .--:-ne en 15
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jours a atteint 995 /cr0.i dans un milieu contenant 2% de liqueur de macération de mais, et 1300 /c5 dans un milieu comprenant 3 %' de cette lui- queuro
Le tableau représente les résultats d'une série d'essais utilisant un milieu comprenant 2 % de liqueur de macération de mais, la quantité indiquée d'un lipide assimilable spécifié et la quantité indiquée de peptone et d'eau ordinaire TABLEAU IV.
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Raboflavine eu ² ;' cL1.3 et en 5 jours
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P6p-Gone N0 159 NID ,366 NI> 3., Liqueur d'abattoir Huile de lard - 2% 0 ,25 125C) 1390 1330
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<tb>
<tb> o <SEP> ,5 <SEP> 1590 <SEP> 1420
<tb> 1,0 <SEP> 1590 <SEP> 1380 <SEP> 1290 <SEP> 1300
<tb> 2,0 <SEP> 1550 <SEP> 1070
<tb> 3,0 <SEP> 1420 <SEP> 830
<tb> @
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 3%
<tb>
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eaeovo-e-aow --.
www-.ew.oaw-------.--
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<tb>
<tb> 1,0 <SEP> 1580 <SEP> 11\ <SEP> 1520 <SEP> 1570 <SEP> 1330
<tb>
<tb>
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-------------'-""'1 =L 1 '111--------- --4 .1l'1"li-----------Huile de mais
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<tb>
<tb> 0 <SEP> 1070
<tb> 0,25 <SEP> 1340 <SEP> 1160 <SEP> 1200
<tb> 0,50 <SEP> 1500 <SEP> 1230
<tb> 1,0 <SEP> 1700 <SEP> 1100 <SEP> 1590
<tb> 2 <SEP> ,0 <SEP> 1060 <SEP> 1680
<tb> 3,0 <SEP> 1550 <SEP> 1480
<tb>
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w-.a-----..v "'"JIIIT¯¯¯¯¯¯----....¯-- .1>1..4
On a effectué une série d'essais analogues) sauf que dans ces essais on employait 3% de liqueur de mais. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau V.
TABLEAU V
Riboflavine,en 8 /cm3 en 5 jours.
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<tb>
<tb>
Peptone% <SEP> N 159 <SEP> N <SEP> 366 <SEP> N <SEP> 343
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> 2 <SEP> % <SEP>
<tb> 0,25 <SEP> 1400 <SEP> 1400 <SEP> 1360
<tb> o <SEP> ,50 <SEP> 1460 <SEP> 1400 <SEP> 1500
<tb> 1,0 <SEP> 1670 <SEP> 1580 <SEP> 1480
<tb> 2,0 <SEP> 1720 <SEP> 1210 <SEP> 1550
<tb>
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J 9' 1621J ¯¯¯¯¯¯ ô 1J.F.0 c .t,JS"
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<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> : <SEP> 3 <SEP> % <SEP> ¯¯¯a. <SEP>
<tb>
0,25 <SEP> 1450 <SEP> 1400 <SEP> 1360
<tb> 0 <SEP> ,50 <SEP> 1450 <SEP> 1500 <SEP> 1300
<tb> 1,0 <SEP> 1600 <SEP> 1550 <SEP> 1420
<tb> 2,0 <SEP> 2280 <SEP> 1480 <SEP> 1880
<tb>
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3 ,o 1300 16oxo 1800
Le tableau VI donne les résultats d'une série d'essais ayant pour but de comparer les rendements possibles quand on emploie divers lipi-
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tes assimilables. Le milieu de fermentation de ces essais compreanait de 1' eau- ordinaire, 3 % de liqueur de mais en volume, 2 % de peptone liquide en
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volume, et:.le pourcentage voluwétriqle indiqué du lipide spécifiéo TABLEAU VI.
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Lipide z Huile de lard 17g0 ml. l7ga
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<tb>
<tb> Huile <SEP> de <SEP> mais <SEP> raffinée <SEP> 1640 <SEP> 1840
<tb> Huile <SEP> brute <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1580 <SEP> 1780
<tb>
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Les essais rapportés ci-dessus montrent que le nouveau procédé de cette invention permet d'obtenir des rendements de riboflavine supérieurs à tous ceux qui ont été signalés précédemment pour les procédés employant l'Asbhya gossypiil Les rendements indiqués ci-dessus sont bien caractéristiques et n'ont pas été choisis pour montrer des valeurs maxima. En fait, le procédé nouveau de l'invention donne souvent des rendements dépassant
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2000 gammasf c3
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This invention relates to a novel method of producing riboflavin, and more particularly to producing riboflavin by growing the microorganism Asbhya gossypii on a novel type of nutrient medium.
The fungus Asbhya gossypii is a well-known organism, which has already been used to obtain riboflavin. But the earlier process which employed this microorganism only gave yields of about 300
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at 400 gaas / ct3. It has been found that, if new nutrient media are used to grow Asbhya gossypii in the already known methods employing this organism, yields much higher than those can be obtained.
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In particular, the new process of the invention currently makes it possible to obtain yields 4 to 5 times higher than the previous yields. Surprisingly, these high yields are obtained on media not comprising the- objectionable components that were usually considered necessary until now.
In other words, not only does the novel process of this invention provide greatly increased yields, it also employs an advantageously simplified fermentation medium.
In previous methods which developed Asbhya gossypii on liquid media, the nutrient medium always included a source of protein, which was usually wholly or partly of animal origin, and a source of carbohydrates. It has been found that one can employ a simplified medium, substantially free of carbohydrates, without
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grow Asbhya gossypii and achieve high # nts of riboflavin.
It has also been found that, if desired, the carbohydrate-free medium can also be substantially free of proteinaceous substances of animal origin. It is often disadvantageous to employ in
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fermentation of protein substances of animal origj "lp + them as pettones, beef extract and slaughterhouse waste arche these products are generally more expensive than matil: J.L <::;
'jjrouéines of vegetable origin, and because their use in the fermentation medium frequently gives inconsistent results owing to the variable co-position of these animal protein substances.
The nutrients contained in the nutrient media of the novel process of this invention comprise a proteinaceous substance
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and an assimilable (metabolizable) lipid o Among the satisfactory sources of protein, mention may be made of corn maceration liquor, soybean flour, cottonseed flour, flaxseed flour,
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slaughterhouse waste liquor; and pEptone preparations. The lipid may be of animal or vegetable origin or be composed of a mixture.
The preferred lipid is bacon oil which is obviously of animal origin. But lipids such as corn oil, soybean oil, coconut oil, olive oil and other fatty acid glycerides can also be used with excellent results.
The concentration of nutrients in the new media employed in the new process of this invention can vary widely. The nutritive products can represent for example 0.5 to 10% of the nutritive medium. The nutrient concentration of the medium must be high enough to allow good development of Asbhya gossypii, otherwise relatively low yields of riboflavin are obtained. But on the other hand, if the nutrient concentration is too high, the viscosity of the medium becomes bad, and it is more difficult to isolate the product.
Concentration nu-
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tritive optinum varies somewhat with the cOI ....- ositim "..act of the nutrients. If, for example, the protein substance is exclusively of vegetable origin, the optimum total concentration of nutrients is usually 4 to 6. % by weight; but if the protein source includes both animal and vegetable substances, the optimum total concentration of nutrients is mostly between 5% and 8% by weight.
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The protein materials used in the new culture media of this invention can represent 20 to 80% by weight of all the nutrients, the optimum vapor depending on the particular source of protein employed. With vegetable protein materials, one obtains Usually best results in media where the proteinaceous material makes up 40% to 60% of the overall nutrient. In dense media in which the protein material is a mixture of proteins of animal and plant origin, the best results are obtained when this protein material represents 60% to 70% of all the nutritional products.
Since the main nutrient products of the new media comprise a protein material and a lipid, the above shows that the assimilable lipid can likewise constitute about 20% to 80% by weight of all the nutritional products.
In addition to the protein source and the lipid, the media used in the new method of this invention may contain small amounts of other substances which are known to stimulate the growth of Asbhya gossypii under certain conditions. Among these substances, mention may be made of vitamins, mineral salts such as calcium carbonate and monopotassium phosphate, and certain trace elements such as manganese, iron, copper and zinc. When the corn maceration liquor is employed in the new media of this invention, it has the advantage of containing sufficient vitamins and minerals, whereby further additions are no longer necessary.
But if a medium containing only protein sources other than corn maceration liquor is employed, it is generally found advantageous to supplement the medium with vitamins such as biotin, and thiamine, and by mineral substances such as those indicated above
The fermentation operations of the new process of this invention are approximately the same as those used in the prior processes for the production of riboflavin. For example, U.S. Patent No. 2,445,128 of July 13, 1948, discloses a fermentation process which can be employed very satisfactorily in the novel process of this invention.
The usual process consists in preparing a sterile nutrient medium, in inoculating this medium with Asbhya gosypii, in maintaining the inoculated medium at a temperature of between 20 and 40 G approximately and preferably at a temperature of approximately 26 C , until the concentration ofiboflavin reaches the desired level, then extracting the riboflavin from the medium by any of the well-known methods suitable for this purpose.
The fermentation can be carried out at any pH close to neutral, for example between 6.0 and 8.0. The preferable pH range is between approximately 6.5 and 7.5. Usually, pH adjustment presents very little difficulty. If the setting is made before the start of fermentation, it will usually need to be readjusted. The fungus Asbhya gossypii needs oxygen in order to develop satisfactorily and produce riboflavin. It is therefore necessary to aerate the medium during fermentation. If the fermentation is carried out in shaker flasks or other similar containers, it is generally good that the surface area of the medium exposed to the atmosphere and expressed in cn2 is at least equal to the volume of the medium expressed in cm3.
When the fermentation takes place in tanks which are aerated in the usual way, it is good. general that the air flow expressed in 1 / min. or at least equal to a quarter of the volume of the medium expressed in liters. Higher air flow rates are advantageous and it will be found in many cases that it is desirable that the air flow rate in 1 / min. or equal to the volume of the medium in liters. In many cases, aeration is sufficient to maintain the medium in a sufficient state of agitation. But it is necessary in certain circumstances
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These adopt mechanical mixing to maintain a satisfactory dispersion of the fungus in the medium.
When the fermentation has continued for some time, it is found that the production of riboflavire has reached a tele value, that it is not advantageous to prolong the fermentation further.
This fermentation breakdown is very variable, and can go down to
60 h or on the contrary reach 160 h As a general rule, the best results are obtained by stopping the fermentation between 90 and 130 h approximately.
One can extract riboflavin from fermentation beer by one. Any of the well known methods An excellent method is to add a reducing agent to reduce riboflavin to its insoluble form and extract the precipitate thus obtained. The reduced substance can then be oxidized by exposure to the atmosphere or by some other means. suitable method for converting it to the soluble form.
The invention will be more particularly illustrated by the following specific examples, in which all the proportions are proportions by weight unless otherwise indicated.
EXAMPLE I.
An inoculation medium is prepared by placing a spoonful of Asbhya gossypii slurry (culture N Y1056 from Northern Regional Research
Laboratory) in a flask containing 25 cm3 of a medium comprising in ordinary water 2.5% corn maceration liquor, 2% cerelose, and 0.5% peptone, the pH being adjusted to 6, 7 with NaOH. The vial containing the inculation medium is incubated on a. agitator at. reciprocating movement for 48 hours.
All fermentation media are prepared by mixing the protein material; various carbohydrates are used for comparison, and finally water is added. The pH is adjusted to 6.7 with a decinormal solution of caustic soda, the assimilable lipid is added, then the mixture is heated at 120 ° C. for 20 min. to sterilize.,
Fermentations are carried out in 250 cm3 flasks, each of which contains 25 cm3 of fermentation medium. The sterile vials, containing 25 cm3 of medium were aseptically inoculated with 1 cm3 of inoculation medium and allowed to incubate at 25.5-26.5 C for 5 days on a rotary shaker rotating at about 180 rpm.
In a series of twelve tests of two flasks each, carried out with a culture medium comprising 1% slaughterhouse liquor, 2% corn maceration liquor (by weight by volume) and 2% by volume of bacon oil with the remainder being plain water, an average 5 day production was obtained which was 949 gammas / cm3 of riboflavin.
The minimum yield of these tests was 790 gammas / cm3 and the maximum yield 1160 gammas / cm3 In comparative tests carried out with identical medium except that 0.5% cerelose (w / v ) the maximum yield of riboflavin was only 890 gammas / cm3 and the minimum yield 605 gammas / cm3, the average yield being 728 garmas / cm3 In other words, the use of a medium to little nearly free of carbohydrates gave about a 30% increase in yield.
EXAMPLE 2.
Using an Asbhya gossypii sporulation slurry (culture N Y1056 from the Northem Regional Research Laboratory), several suspensions are prepared which are applied to agar-agaro plates. After 4 to 7 days of incubation, the most strongly pigmented colonies are removed and developed by successive dilutions and transfers, until an isolated type of culture is obtained which consistently produces a strongly pigmented strain. With the help of a sporulation sludge of this strain, suspensions are prepared which are subjected to radiation from the
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ultraviolet blend.
The suspensions are then applied to agar plates. The most brightly pigmented colonies are cultivated by performing successive dilutions and transfers until a new mutative strain has been isolated which is capable of regularly producing highly pigmented colonies.
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This "mutation" which will be referred to herein as race A 37, gives by the new process of this invention yields which are even higher than those of the original strain Y1056.
Following the method of Example I, an inoculation medium is prepared from race A 37, and is used to inoculate a series of 250 cm3 flasks, each of which contains 25 cm3 of medium. understand
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natit'2% (w / v) of corn maceration liquor and lard oil by volume, the remainder being ordinary water. In the first test carried out with this simple culture medium, the average production of ribo-
EMI4.3
flavin in 5 days was 580 gammas / on0. Subsequent trials gave yields of up to 1460 gammas / c3.
Yields were also obtained in 300 liter fermentation vessels which are comparable to those obtained in shaker flasks. Table 1 below gives the results and other information concerning 5 fermentations carried out - with race A 37 and a 'culture' medium comprising 2% bacon oil by volume and the indicated proportion (weight / volume) of liquor maceration of corn, the rest being plain water
TABLE 1
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Liquor air flow of:
Riboflavin eu3 hue (in vol / vol, z maceration '.. - --- ..,., - - A mino) o maize o 32. 40 e 64: 88 1 2:: weight / volume: ae: -------------------- - "" - 4-C¯ ------- ------- 8T "" P'1 '1 "' '' .1 ...... 4.11. O, 3.: 2. 57 e 150 r 435: 460 t 580 z, 52. 2 e 104 1 208: 500: 660: 7oa os52 z 3. 204: 460: 740 840: 890 os70. 3 e 192: 405: 780 910: 900 0, 70 4 t 70: 320 e g60: 1100: 1030 - 4 - "I¯ -" '------- "' ---------------- ¯." -.... ¯V "" '<I-
It can be seen that the new process of the invention, used with extremely simple culture media, can give higher yields than those which can be obtained by the previous processes, which use complex fermentation media containing carbohydrates. It should also be noted that the media used in this example do not contain protein substances.
In prior process fermentations using Asbhya gossypii, it is generally believed that
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the presence of animal proteins is necessary if the satisfactory result is to be obtained.
EXAMPLE 3
An inoculation medium is prepared using race A 37 as in Example 2, and fermentations are carried out in 250 cm3 flasks containing 25 cm3 of fermentation medium inoculated with 1% of a. 48 h old inoculation culture. In these tests, the fermentation medium included plain water, corn maceration liquor, assimilable lipid, and liquid peptone. Three different liquid peptones were used. Wilson & CO peptones N 159, N 343 and N 366 The table below indicates the composition of these peptones.
<Desc / Clms Page number 5>
TABLE 11i
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NI> 159 lY "/ 6" / No 366
EMI5.2
<tb>
<tb> Solid <SEP> materials <SEP> (%) <SEP> 56.5 <SEP> 59.0 <SEP> 56.5
<tb>
EMI5.3
Nitrogen G5) 9, 5 8.0 8, 4
EMI5.4
<tb>
<tb> Soluble <SEP> ester <SEP> of <SEP> p-
<tb>
EMI5.5
trole (1) 0.3 6.0 1
EMI5.6
<tb>
<tb> Amino <SEP> nitrogen <SEP> (in <SEP>% <SEP>
<tb> nitrogen <SEP> total) <SEP> 21.0 <SEP> 21.0 <SEP> 21.0
<tb>
The following table gives the results of a series of test fermentation carried out in media comprising 2% bacon oil.
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by volume, the indicated percentage of Na 343 peptone from Wilson & Co (by volume) is the indicated percentage of corn irradiation liquor and water: TABLE III.
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Peptone OE) Riboflavin, in Ô jc3 and in 5 ¯¯¯ Days z 14.94 $ 3 there.
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<tb>
<tb> CI <SEP> 9? - <SEP> 930 <SEP> 1020
<tb> 0.5 <SEP> 925 <SEP> 1100
<tb> 130 <SEP> 1130 <SEP> 1310
<tb> 2.0 <SEP> 1370 <SEP> 1200
<tb> 3.0 <SEP> 1475 <SEP> 1090
<tb>
In comparative trials in which 1% slaughterhouse liquor replaced the peptone used above, the production of ribe .--: - ne in 15
EMI5.10
days reached 995 / cr0.i in a medium containing 2% corn maceration liquor, and 1300 / c5 in a medium comprising 3% 'of this me- queuro
The table represents the results of a series of tests using a medium comprising 2% corn maceration liquor, the indicated amount of a specified assimilable lipid and the indicated amount of peptone and ordinary water. TABLE IV.
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Raboflavin eu ²; ' cL1.3 and in 5 days
EMI5.12
P6p-Gone N0 159 NID, 366 NI> 3., Slaughterhouse liqueur Bacon oil - 2% 0.25 125C) 1390 1330
EMI5.13
<tb>
<tb> o <SEP>, 5 <SEP> 1590 <SEP> 1420
<tb> 1.0 <SEP> 1590 <SEP> 1380 <SEP> 1290 <SEP> 1300
<tb> 2.0 <SEP> 1550 <SEP> 1070
<tb> 3.0 <SEP> 1420 <SEP> 830
<tb> @
<tb> Bacon <SEP> oil <SEP> 3%
<tb>
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eaeovo-e-aow -.
www-.ew.oaw -------.--
EMI5.15
<tb>
<tb> 1.0 <SEP> 1580 <SEP> 11 \ <SEP> 1520 <SEP> 1570 <SEP> 1330
<tb>
<tb>
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-------------'- "" '1 = L 1' 111 --------- --4 .1l'1 "li -------- --- Corn oil
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<tb>
<tb> 0 <SEP> 1070
<tb> 0.25 <SEP> 1340 <SEP> 1160 <SEP> 1200
<tb> 0.50 <SEP> 1500 <SEP> 1230
<tb> 1.0 <SEP> 1700 <SEP> 1100 <SEP> 1590
<tb> 2 <SEP>, 0 <SEP> 1060 <SEP> 1680
<tb> 3.0 <SEP> 1550 <SEP> 1480
<tb>
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w-.a ----- .. v "'" JIIIT¯¯¯¯¯¯ ----.... ¯-- .1> 1..4
A series of similar tests were carried out except that in these tests 3% corn liquor was used. The results obtained are given in Table V.
TABLE V
Riboflavin, in 8 / cm3 in 5 days.
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<tb>
<tb>
Peptone% <SEP> N 159 <SEP> N <SEP> 366 <SEP> N <SEP> 343
<tb> Oil <SEP> from <SEP> bacon <SEP> 2 <SEP>% <SEP>
<tb> 0.25 <SEP> 1400 <SEP> 1400 <SEP> 1360
<tb> o <SEP>, 50 <SEP> 1460 <SEP> 1400 <SEP> 1500
<tb> 1.0 <SEP> 1670 <SEP> 1580 <SEP> 1480
<tb> 2.0 <SEP> 1720 <SEP> 1210 <SEP> 1550
<tb>
EMI6.5
J 9 '1621J ¯¯¯¯¯¯ ô 1J.F.0 c .t, JS "
EMI6.6
<tb>
<tb> Oil <SEP> of <SEP> but <SEP>: <SEP> 3 <SEP>% <SEP> ¯¯¯a. <SEP>
<tb>
0.25 <SEP> 1450 <SEP> 1400 <SEP> 1360
<tb> 0 <SEP>, 50 <SEP> 1450 <SEP> 1500 <SEP> 1300
<tb> 1.0 <SEP> 1600 <SEP> 1550 <SEP> 1420
<tb> 2.0 <SEP> 2280 <SEP> 1480 <SEP> 1880
<tb>
EMI6.7
3, o 1300 16oxo 1800
Table VI gives the results of a series of tests aimed at comparing the yields possible when using various lipids.
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your assimilable. The fermentation medium for these tests consisted of plain water, 3% corn liquor by volume, 2% liquid peptone by volume.
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volume, and: the indicated voluwétriqle percentage of the specified lipid TABLE VI.
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Lipid z Bacon oil 17g0 ml. l7ga
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<tb>
<tb> <SEP> oil from <SEP> but <SEP> refined <SEP> 1640 <SEP> 1840
<tb> Crude <SEP> soybean <SEP> oil <SEP> 1580 <SEP> 1780
<tb>
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#######################################, ########## ##
The tests reported above show that the new process of this invention achieves yields of riboflavin higher than those previously reported for processes employing Asbhya gossypiil. The yields indicated above are well characteristic and n 'were not chosen to show maximum values. In fact, the new process of the invention often gives yields exceeding
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2000 gammasf c3