BE1022254B1 - Formulation de vaccin saccharidique - Google Patents
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Abstract
La présente invention propose des compositions vaccinales essentiellement stables, ainsi que des méthodes pour leur utilisation et fabrication.
Description
FORMULATION DE VACCIN SACCHARIDIQUE Domaine technique
La présente invention concerne des formulations améliorées pour des vaccins saccharidiques comprenant des molécules immunogènes de charges opposées.
Contexte MAG-Tn3 est un antigène glyco-peptidique d'une taille approximative de 11 kDa. MAG-Tn3 est présent dans une proportion substantielle dans les cancers humains et il est considéré comme un antigène candidat pour une immunothérapie.
Pour une immunothérapie, MAG-Tn3 pourra être potentiellement combiné avec un immunostimulant. Un exemple d'immunostimulant est un oligodésoxynucléotide CpG.
Lors de la fabrication de vaccins, il est produit une composition liquide finale contenant une ou plusieurs des molécules immunogènes, couramment appelée le « vrac final ». Pour des facilités de stockage, le vrac final peut être séché (par exemple, par lyophilisation). Le vaccin séché, parfois appelé le gâteau de lyophilisation, peut être reconstitué dans un solvant pharmaceutiquement acceptable, comme l'eau, un tampon, etc., et peut être nommé le « récipient final ».
Un vrac final de MAG-Tn3/CpG pourra être potentiellement lyophilisé pour produire un produit final pour des facilités de stockage. Ce produit final pourra être potentiellement reconstitué dans un système tampon ou un système adjuvant pour une administration au patient.
Lors de la formulation des molécules pour une utilisation vaccinale, il n'est pas certain que la composition soit stable. Par exemple, les molécules peuvent s'agréger ou précipiter dans des conditions classiques. Même si de tels problèmes sont surmontés, une dégradation physique ou chimique d'un ou de plusieurs composants peut survenir. Des compositions et des méthodes qui surmontent de telles limitations sont nécessaires. En outre, des molécules qui sont stables lorsqu'elles sont formulées seules peuvent subir une coprécipitation en présence d'autres molécules. Résumé de 1'invention
Il est proposé des compositions vaccinales essentiellement stables, les compositions comprenant de 1'arginine ; un contre-ion ; une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative ; la composition caractérisée en ce que lorsque ladite composition comprend de l'eau (i) lesdites première et seconde molécules immunogènes sont essentiellement stables ; et (ii) le pH de la solution résultante est inférieur à 8,5. Dans certains aspects, la première molécule immunogène est Mag-Tn3. Dans certains aspects, la seconde molécule immunogène comprend un oligonucléotide CpG. Dans certains aspects, une partie de l'arginine est présente sous la forme de l'espèce monochlorhydrate d'arginine. Dans certains aspects, la composition est séchée. Dans certains aspects, la composition - comprend de l'eau.
Dans certains aspects, la composition comprend en outre une composition d'adjuvant comprenant l'un ou les deux des adjuvants MPL et QS21. Dans certains aspects, la composition d'adjuvant comprend éventuellement en outre des liposomes.
Il est également proposé des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, les procédés comprenant les étapes de combinaison : de l'arginine ; d'une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et d'une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative ; où un ou plusieurs des composants précédents sont combinés avec un liquide comprenant de l'eau et où le pH de ladite composition est de 8,5 ou inférieur. Il est également proposé des compositions produites par ces procédés.
Il est proposé des méthodes de traitement d'un patient, les méthodes comprenant les étapes d'administration d'une composition telle que décrites ici à un être humain. Il est également proposé des utilisations, en particulier l'utilisation de monochlorhydrate d'arginine en tant qu'additif dans une composition vaccinale essentiellement stable.
Il est également proposé des récipients comprenant les compositions telles que décrites ici.
Brève description des figures
Figure 1 - Organigramme de la procédure de formulation de CpG7909 et de MAG-Tn3 mélangés séparément.
Figure 2 - Organigramme d'une formulation classique. Les excipients utilisés dans la première étape sont énumérés dans le tableau 2. .
Figure 3 - SDS-PAGE dans des conditions réductrices de formulations d'acide glutamique/lysine et d'acide glutamique/ arginine et de 1,0 % p/v d'Empigen après 24 heures à 4 °C. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa. Les flèches indiquent les bandes trouvées dans les fractions des culots, et les cercles en pointillés ou en points indiquent l'augmentation de l'intensité de la bande ; les lignes en pointillés étant d'une intensité supérieure aux lignes en points. Le témoin dans le MAG-Tn3 PB a été dilué dans 10 mM de tampon succ’inate pH 5,0, qui a été vérifié comme étant le système tampon le plus stabilisant pour MAG-Tn3 seul. Ce gel a été coloré en utilisant du SilverExpress. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension, MM : marqueur de masse moléculaire.
Figure 4 - SDS-PAGE de formulation de Tris-Maléate après 24 heures à 4 °C. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa ; la bande inférieure correspond au CpG à approximativement 8 kDa. Les flèches indiquent les bandes trouvées dans les fractions des culots, et les pointillés indiquent l'augmentation de l'intensité de la bande. Le témoin dans le MAG-Tn3 PB a été dilué dans 10 mM de tampon succinate pH 5,0, qui a été vérifié comme étant le système tampon le plus stabilisant pour MAG-Tn3 seul. Ce gel a été coloré en utilisant du Silver Quest qui colore CpG7909. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension, MM : marqueur de masse moléculaire.
Figure 5 - SDS-PAGE dans des conditions réductrices d'une formulation d'arginine et d'histidine. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa ; la bande inférieure correspond au CpG à approximativement 8 kDa. Les flèches indiquent les bandes trouvées dans les fractions des culots. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension.
Figure 6 - SDS-PAGE dans des conditions réductrices d'une formulation de criblage de L-arginine. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa ; la bande inférieure correspond au CpG à approximativement 8 kDa. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension. Une bande légèrement plus intense (encerclée) est observée dans la fraction du culot de la formulation de 15 mM de L-arginine, par rapport aux autres formulations.
Figure 7 - Superposition chromatographique de fluorescence en HPLC-SEC de formulations de L-arginine de 15 à 35 mM.
Figure 8 - SDS-PAGE dans des conditions réductrices d'une formulation de criblage de monochlorhydrate de L-arginine. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa ; la bande inférieure correspond au CpG à approximativement 8 kDa. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension. Des bandes légèrement plus intenses dans les fractions des culots sont observées de 225 mM à 300 mM de monochlorhydrate de Larginine, encerclées.
Figure 9 - Superposition chromatographique de fluorescence en HPLC-SEC de formulations de monochlorhydrate de L-arginine de 100 à 200 mM.
Figure 10 - SDS-PAGE dans des conditions réductrices des formulations des plages de doses. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa ; la bande inférieure correspond au CpG à approximativement 8 kDa. La flèche indique une légère bande dans la fraction du culot de la concentration la plus élevée de MAG-Tn3. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension. Le contrôle dans le vrac purifié de MAG-Tn3 a été chargé dans les puits 2 à 4.
Figure 11 - Superposition chromatographique des profils d'exclusion de taille de formulations de MAG-Tn3 de 200 à 900 μq/ml.
Figure 12 - SDS-PAGE dans des conditions réductrices des formulations des plages de doses. MAG-Tn3 constitue la bande principale à approximativement 15 kDa ; la bande inférieure correspond au CpG à approximativement 8 kDa. La flèche indique une légère bande dans les fractions des culots des concentrations plus élevées de MAG-Tn3. Les bandes de masse moléculaire supérieure présentes dans le puits 18 sont anormales. NC : non centrifugé, SN : surnageant, P : fraction du culot remis en suspension.
Figure 13 - Superposition des chromatogrammes de HPLC-SEC de 420, 270 et 180 μg de CpG7909/dose des récipients finals d'étalons à T0.
Figure 14 - Superposition de HPLC-SEC de 420 μρ de CpG7909/dose de formulation de MAG-Tn3 à T0, 4 et 24 heures d'incubation à 25 °C.
Figure 15 - Superposition des chromatogrammes de HPLC-SEC de 180, 270 et 420 μρ de CpG7909/dose des formulations de MAG-Tn3 après une incubation de 24 heures à 25 °C.
Description détaillée
Les demandeurs ont découvert que la combinaison des molécules de MAG-Tn3 et de CpG en solution provoque une coprécipitation instantanée et que lorsqu'un gâteau sec lyophilisé a été reconstitué, il n'était pas soluble en utilisant des excipients classiques.
Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que l'inclusion d'arginine, comprenant une fraction d'espèce monochlorhydrate d'arginine, dans une formulation pour une utilisation avec une première molécule immunogène ayant une charge nette positive, en combinaison avec une seconde molécule immunogène ayant une charge nette négative, permet une combinaison appropriée de stabilité et de pH pour une utilisation sous la forme d'un vaccin injectable chez des sujets mammifères.
Compositions comprenant de l'arginine
Dans certains aspects, la description propose des compositions vaccinales comprenant de l'arginine, un contre-ion, une première molécule immunogène ayant une charge nette positive, et une seconde molécule immunogène ayant une charge nette négative, la composition étant caractérisée en ce que lorsque ladite composition comprend un solvant pharmaceutiquement acceptable (i) ladite première molécule immunogène et ladite seconde molécule immunogène sont essentiellement stables ; et (ii) le pH est inférieur à 8,5.
Dans certains aspects, la première molécule immunogène comprend un groupe glucidique. Dans certains aspects, la première molécule immunogène comprend un groupe Tn. Dans certains aspects, la première molécule immunogène comprend MAG-Tn3.
Dans certains aspects, la seconde molécule immunogène comprend un oligonucléotide. Dans certains aspects, l'oligonucléotide est un oligonucléotide immunostimulant. Dans certains aspects, l'oligonucléotide est un oligonucléotide contenant des CpG. Dans certains aspects, l'oligonucléotide est CpG7909.
Arginine L'arginine peut être présente sous les formes L ou D, ou un mélange des deux. La L-arginine est également connue sous les noms d'acide 2-amino-5-guanidino-valérique ; 2-amino-5-guanidinovalérate ; L-a-Amino-d-guanidino-valérate ; acide L-alpha-Amino-delta-guanidino-valérique ; acide L-a-Amino-d-guanidinovalérique ; N5-(aminoiminométhyl)-L-OrnithineL-alpha-
Amino-delta-guanidino-valérate ; acide 5- [(aminoiminométhyl)amino]-L-Norvaline(S)-2-Amino-5-[(aminoiminométhyl)amino]pentanoïque ; (S)-2-amino-5- [(aminoiminométhyl)amino]-Pentanoate ; (S)-2-Amino-5-[(amino iminométhyl ) amino] pentanoate ; et acide(S)-2-amino-5-[(aminoiminométhyl )amino]-Pentanoïque. L'arginine est représentée par la formule I :
Formule I L'arginine peut être neutralisée avec de l'acide chlorhydrique ou des acides ayant une base conjuguée autres que des chlorures, produisant 1'Arginine·Η-Χ, où X comprend sans limitation Ci“, SO4“2, et citrate.
Dans certains aspects, l'espèce d'arginine comprend le monochlorhydrate d'arginine.
Le monochlorhydrate d'arginine peut être présent sous les formes L ou D, ou un mélange des deux. Il est également connu sous les noms de monochlorhydrate d'acide (2S)-2-Amino-5-[(aminoiminométhyl)amino]pentanoïque, chlorhydrate d'arginine, et arginine·HCl. Le monochlorhydrate d'arginine peut être fabriqué par neutralisation de l'arginine avec de l'acide chlorhydrique. Le monochlorhydrate d'arginine est représenté par la formule II.
Formule II L'arginine et 1'arginine»HCl sont utilisés dans des milieux de culture cellulaire et le développement de médicaments. L'acide aminé arginine est utilisé sous la forme d'un additif de solution pour stabiliser les protéines contre l'agrégation protéine-protéine, spécialement dans le procédé de repliement des protéines. Voir Baynes et al. (2005) Biochemistry 44: 4919-4925 ; Tsumoto et al. (2004) Biotechnol. Prog. 20: 1301-1308. Comme il est expliqué dans Baynes, l'agrégation est l'assemblage de conformations de protéines non natives dans des états multimères, menant souvent à une séparation de phase et une précipitation. Il a été montré que la présence d'arginine en solution ralentit les réactions d'association protéine-protéine dans deux systèmes modèles : l'association de l'insuline avec un anticorps monoclonal et l'association d'intermédiaires de repliement et d'agrégats de l'anhydrase carbonique II (CA). L'arginine a été utilisée comme remplacement de la sérumalbumine humaine pour protéger les protéines thérapeutiques, y compris les glycoprotéines, contre la dégradation. Voir Kim (2009) Biosci Biotechnol Biochem. 73: 61-6.
Parce que l'arginine en solution est un système acide polyprotique/base, elle est associée à quatre états différents de protonation/charge. Une solution d'arginine comprendra un mélange d'espèces ayant des états différents de protonation. Ces états sont les suivants : 1. « H3B2+ »,
Formule III
Lorsque le contre-ion est 2 Cl-, l'état de protonation de la formule III est connu sous le nom de dichlorhydrate d'arginine. 2 . « H2B+ »,
Formule IV
Lorsque le contre-ion est Cl-, l'état de protonation de la formule IV est connu sous le nom de monochlorhydrate d'arginine, ou arginine»HC1. 3. « HB »
Formule V L'état de protonation de la formule V est connu sous le nom d'arginine base. 4. « B’ »
Formule VI
Lorsque le contre-ion est Na+ ou K+, l'état de protonation de la formule VI est connu sous le nom d'arginate de sodium ou de potassium.
La protonation/déprotonation de l'arginine se déroule selon le schéma suivant.
Schéma I
pÀ"aj - 1.823 ph',2 8 «‘ί I pA.'a3 - 12.1 pâM : 12.2 pKb, 5 0 pKhi ---1.9 III '
IV V VI
Par « molécule immunogène », on entend une molécule capable d'induire une réponse immunitaire chez un sujet.
Le terme « molécules » ici comprend sans limitation des macromolécules, des molécules d'oligomères, et des monomères. Par « macromolécule », on entend des molécules polymères de masse moléculaire relative élevée, dont la structure comprend essentiellement la répétition multiple d'unités dérivées, véritablement ou de façon conceptuelle, de molécules de masse moléculaire relative basse, incluant des polysaccharides, des polypeptides, des acides nucléiques, et analogues, ainsi que des molécules non polymériques avec une masse moléculaire importante comme des lipides et des macrocycles. Par « molécule d'oligomère », on entend une molécule de masse moléculaire relative intermédiaire, dont la structure comprend essentiellement une petite pluralité d'unités dérivées, véritablement ou de façon conceptuelle, de molécules de masse moléculaire relative plus basse. Par « monomère », on entend une molécule qui peut subir une polymérisation.
Par « charge nette » d'une molécule, on entend la somme arithmétique des charges positives et négatives sur la molécule à un pH donné ou dans une plage de pH donnée. Une molécule ayant une « charge nette positive » comportera une majorité de charges positives à un pH donné ou dans une plage de pH donnée ; de la même manière, une molécule avec une « charge nette négative » comportera une majorité de charges négatives à un pH donné ou dans une plage de pH donnée. Le pH ou la plage de pH applicable est le pH ou la plage de pH de la solution comprenant la molécule pertinente.
Groupes glucidiques comprenant un groupe Tn
Dans certains aspects, la description propose des molécules immunogènes comprenant des groupes glucidiques ou des antigènes glucidiques.
Par « groupe glucidique », on entend une partie glucidique d'une molécule chimiquement liée à une autre partie de la molécule. Ainsi, un groupe glucidique peut être fixé à une autre molécule de glucide ou à une autre catégorie de molécule, comme une protéine (ou un peptide). Les exemples de molécules ayant des groupes glucidiques comprennent des oligosaccharides, des polysaccharides, des glycopeptides, des glycoprotéines, et analogues, dont certains peuvent être des antigènes glucidiques.
Par « antigène glucidique », on entend un antigène à base de saccharide, y compris des polysaccharides capsulaires bactériens, des antigènes glucidiques associés à des tumeurs, et analogues.
Dans certains aspects, la description propose des molécules immunogènes comprenant un groupe Tn.
Par « Tn » ou « groupe Tn », on entend un membre de la famille des glycophorines telles que décrites dans Morrelli (2011) Eur. J. Org. Chem. 5723-5777. Tn peut être décrit comme une N-acétylgalactosamine liée à un résidu soit de sérine soit de thréonine par l'intermédiaire d'une liaison glycosidique.
Ainsi, une molécule comprenant Tn comportera un ou plusieurs groupes Tn.
Dans certains aspects, la description propose des molécules immunogènes comprenant MAG-Tn3. « MAG-Tn3 » est décrit dans le document EP2500033A1 et a la structure suivante :
MAG-Tn3 Formule VII
Ainsi, MAG-Tn3 correspond à un conjugué glucide peptide B4-T4-M de formule VIII :
Formule VIII dans laquelle - KKK représente le noyau polyLysine dendritique (M),
- T représente l'épitope peptidique des lymphocytes T CD4+ ayant la séquence suivante : QYIKANSKFIGITEL - Tn3 représente l'épitope tri-Tn des lymphocytes B ayant la séquence suivante : (a-GalNAc)Ser-(a-GalNAc)Thr-(a-
GalNAc)Thr. MAG-Tn3 a un pi estimé de 9,8 à 10, et est donc chargé très positivement à pH neutre.
Oligonucléotides
Par « oligonucléotide immunostimulant », on entend un oligonucléotide qui comprend un motif d'ADN immunostimulant. Des motifs d'ADN immunostimulants sont décrits dans Sato et al. (1996) Science 273: 352. Les exemples d'oligonucléotides immunostimulants comprennent des oligonucléotides contenant des CpG (dans lesquels le dinucléotide CpG est non méthylé), qui induisent une réponse principalement Thl. De tels oligonucléotides sont bien connus et sont décrits, par exemple, dans les documents WO 96/02555, WO 99/33488 et les brevets US No. 6 008 200 et 5 856 462.
Les exemples d'oligonucléotides contenant des CpG comprennent les séquences spécifiques suivantes :
CpG7909 est un oligodésoxynucléotide simple brin 24-mer de synthèse avec un squelette phosphorothioate d ' approximativement 8 kDa et il a 23 charges négatives à pH neutre.
Le terme « essentiellement stable » est censé décrire une solution dans laquelle le soluté ne précipite pas dans la solution. C'est-à-dire qu'une fois une période de temps limitée est passée après que le soluté d'intérêt s'est dissous dans la solution, Tl, plus de 70 % du soluté demeurera en solution, c'est-à-dire, plus de 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % ou plus du soluté demeurera en solution.
La période de temps limitée, Tl, peut être toute période de temps supérieure à 1 heure, c'est-à-dire, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500 heures ou plus .
La stabilité peut être estimée par de nombreuses méthodes y compris, par exemple, par la mesure de perte après filtration, la détermination de la présence du soluté d'intérêt dans une fraction de culot (par SDS-PAGE ou une méthode équivalente) ou par la détermination du profil d'agrégation pour le soluté d'intérêt.
Dans certains aspects, la composition est caractérisée en ce que lorsque la composition comprend de l'eau, le pH de la composition se situe au sein d'une plage où la limite supérieure de pH est inférieure à 8,5 ; inférieure à 8,4 ; inférieure à 8,3 ; inférieure à 8,2 ; inférieure à 8,1 ; inférieure à 8,0 ; inférieure à 7,9 ; inférieure à 7,8 ; inférieure à 7,7 ; inférieure à 7,6 ; ou inférieure à 7,5 et la limite inférieure est supérieure à 7,4 ; supérieure à 7,5 ; supérieure à 7,6 ; supérieure à 7,7 ; supérieure à 7,8 ; supérieure à 7,9 ; supérieure à 8,0 ; supérieure à 8,1 ; supérieure à 8,2 ; supérieure à 8,3 ; ou supérieure à 8,4. Dans certains aspects, le pH se situe entre 7,4 et 8,5, compris ; entre 7,5 et 8,5, compris ; entre 7,6 et 8,3, compris ; entre 7,7 et 8,3, compris ; entre 7,8 et 8,3, compris ; entre 7,9 et 8,3, compris ; entre 8,0 et 8,3, compris ; entre 8,1 et 8,3, compris.
Les méthodes pour obtenir le pH souhaité de la composition comprennent la neutralisation de la solution d'arginine avec un acide approprié, comme l'acide chlorhydrique, ou la combinaison d'une quantité nécessaire d'arginine et d'arginine·H-X pour produire le pH souhaité dans la solution. Dans certains aspects, 1'arginine·Η-Χ est le monochlorhydrate d'arginine. Le rapport arginine/ monochlorhydrate d'arginine nécessaire pour produire un pH souhaité peut être facilement calculé en utilisant des méthodes connues, comme l'équation de Henderson-Hasselbalch, dans laquelle pH = pKa + log ([Arg déprotonée ] / [Arg protonée] ) Equation 1.
Par exemple, le tableau 1 indique le pH calculé résultant de divers rapports molaires d'arginine/arginine-HCl.
Tableau 1. Valeurs de pH calculées en utilisant l'équation 1 pour des solutions comprenant divers rapports molaires Arg/Arg-HCl (pKa Arg = 8,991).
Comme on le comprendra, le pH véritable des solutions produites peut être confirmé et ajusté par des moyens de
routine, comme un pH-mètre. Dans certains aspects, le pH véritable n'est pas à plus de ± 0,2 unité de pH de la valeur de pH calculée ou n'est pas à plus de ±0,2 unité de pH en dehors de la plage de pH calculée.
Dans certains aspects, la composition est caractérisée en ce que lorsque ladite composition comprend de l'eau, l'arginine comprend les espèces suivantes : (a)
Formule V et (b)
Formule IV.
Dans certains aspects, le rapport molaire de l'espèce (a) sur l'espèce (b) se situe entre 7/220 (0,032) et 71/220 (0,323). Dans certains aspects, le rapport molaire de l'espèce (a) sur l'espèce (b) se situe entre 1/11 (0,091) et 1/5 (0,200). Dans certains aspects, la formule V est d'au moins 14 mM, et le rapport molaire de l'espèce de (a) Formule V sur l'espèce de (b) Formule IV se situe au sein d'une plage choisie dans le groupe constitué de : (a) entre 0,091 et 0,200 ; (b) entre 0,032 et 0,323 ; (c) entre 0,041 et 0,323 ; (d) entre 0,051 et 0,256 ; (e) entre 0,064 et 0,256 ; et (f) entre 0,081 et 0,204.
Cryoprotecteurs
Dans certains aspects, la composition comprend un cryoprotecteur.
Par « cryoprotecteur », on entend une substance utilisée pour protéger les biomolécules contre les conditions de congélation, comme celles rencontrées durant la cryodessiccation ou lyophilisation. Les exemples de cryoprotecteurs comprennent des glucides, comme le saccharide saccharose, des alcools de sucre comme le mannitol, des agents tensioactifs comme les polysorbates, ainsi que le glycérol et le sulfoxyde de diméthyle. Les exemples de glucides comprennent des saccharides et des disaccharides. Les exemples de disaccharides comprennent le saccharose et le tréhalose.
Adj uvants
Dans certains aspects, les compositions et les méthodes comprennent également une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants. Dans le contexte d'une composition immunogène appropriée pour une administration à un sujet, comme un sujet humain, dans l'objectif de déclencher une réponse immunitaire, la composition d'adjuvant est choisie pour déclencher une réponse immunitaire à tendance Thl. La composition d'adjuvant est généralement choisie pour amplifier une réponse immunitaire à tendance Thl chez le sujet, ou la population de sujets, auquel/à laquelle la composition est administrée.
Une réponse immunitaire de type « Thl » est caractérisée par l'induction de lymphocytes T auxiliaires CD4+ qui produisent de 1'IL-2 et de l'IFN-γ. Au contraire, une réponse immunitaire de type « Th2 » est caractérisée par l'induction de cellules auxiliaires CD4 + qui produisent de l'IL-4, de l'IL-5 et de l'IL-13.
Modulateurs du TLR4
Un adjuvant approprié est un modulateur du TLR4. Un exemple est un dérivé non toxique du lipide A, le monophosphoryl-lipide A ou plus particulièrement, le monophosphoryl-lipide A 3-désacylé (3D-MPL). Le 3D-MPL est vendu sous le nom de MPL par GlaxoSmithKline Biologicals N.A., et il est cité dans tout le document comme le MPL ou le 3D-MPL. Voir, par exemple, les brevets US No. 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094. Le 3D-MPL favorise principalement les réponses des lymphocytes T CD4+ avec un phénotype IFN-y (Thl). Le 3D-MPL peut être produit selon les méthodes décrites dans le document GB2220211 A. Du point de vue chimique, il s'agit d'un mélange de monophosphoryl-lipide A 3-désacylé avec 3, 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Dans les compositions de la présente invention, du 3D-MPL à petites particules peut être utilisé. Le 3D-MPL à petites particules présente une taille de particule telle qu'il peut être stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 μπι. De telles préparations sont décrites dans le document W094/21292.
Dans d'autres modes de réalisation, le lipopolysaccharide peut être un disaccharide de β(1 — 6) glucosamine, comme il est décrit dans le brevet US No. 6 005 099 et le brevet EP No. 0 729 473 Bl. L'homme du métier pourra facilement produire divers lipopolysaccharides, comme le 3D-MPL, en se basant sur les enseignements de ces références. Néanmoins, chacune de ces références est incorporée ici par référence. En plus des immunostimulants susmentionnés (qui sont similaires en structure à celle du LPS ou du MPL ou du 3D-MPL) , des dérivés acylés de monosaccharides et de disaccharides qui constituent une sous-partie de la structure ci-dessus du MPL sont également des adjuvants appropriés. Dans d'autres modes de réalisation, l'adjuvant est un dérivé synthétique du lipide A, dont certains sont décrits comme des agonistes du TLR-4, et ils comprennent, mais sans y être limités : OM174 (2-désoxy-6-o-[2-désoxy-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétra-décanoylamino]-4-o-phosphono-ß-D-glucopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl-amino]-a-D-glucopyranosyldihydrogénophosphate), (WO 95/14026) ; OM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodécanoyloxytétra-décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl-amino]décane-1,10-diol,1,10-bis(dihydrogénophosphate) (WO 99/64301 et WO 00/0462) ; et OM 197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]décane-1,10-diol,1-dihydrogéno-phosphate 10-(6-aminohexanoate) (WO 01/46127).
Adjuvants à base de saponines D'autres adjuvants qui peuvent être utilisés dans des compositions immunogènes ici, par exemple, par eux-mêmes ou en combinaison avec du 3D-MPL, ou un autre adjuvant décrit ici, sont des saponines, comme le QS21.
Des saponines sont décrites dans : Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Les saponines sont des glycosides stéroïdiens ou triterpéniques largement distribués dans le règne végétal et le règne des animaux marins. Les saponines sont connues pour former des solutions colloïdales dans l'eau qui moussent lors d'une agitation, et pour précipiter le cholestérol. Lorsque les saponines sont proches des membranes cellulaires, elles créent des structures de type pores dans la membrane qui provoquent l'éclatement de la membrane. L'hémolyse des érythrocytes est un exemple de ce phénomène, qui est une propriété de certaines, mais pas de la totalité des, saponines. '
Les saponines sont connues en tant qu'adjuvants dans des vaccins pour une administration systémique. L'activité adjuvante et hémolytique de saponines individuelles a été intensément étudiée dans l'art (Lacaille-Dubois and Wagner, ci-dessus). Par exemple, Quil A (dérivé de l'écorce de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja Saponaria Molina), et ses fractions, sont décrits dans le document US 5 057 540 et "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55 ; et le document EP 0 362 279 Bl. Des structures particulaires, nommées complexes immunostimulants (ISCOM), comprenant des fractions de Quil A sont hémolytiques et ont été utilisées dans la fabrication de vaccins (Morein, B., EP 0 109 942 Bl ; WO 96/11711 ; WO 96/33739). Les saponines hémolytiques QS21 et QS17 (fractions purifiées par CLHP de Quil A) ont été décrites comme des adjuvants systémiques puissants, et leur méthode de production est divulguée dans le brevet US No. 5 057 540 et le document EP 0 362 279 Bl, qui sont incorporés ici par référence. D'autres saponines qui ont été utilisées dans des études de vaccination systémique comprennent celles dérivées d'autres espèces végétales telles que Gypsophila et Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992).
Il a été montré que de telles formulations comprenant du QS21 et du cholestérol sont des adjuvants efficaces stimulant la réponse Thl lorsqu'elles sont formulées conjointement avec un antigène.
Autres molécules
Dans certains aspects, une ou plusieurs autres molécules peuvent être incluses dans les compositions, y compris des tensioactifs non ioniques et des émulsifiants, comme le polysorbate 80 (Tween™ 80, disponible chez ICI Americas, Inc.), des excipients, des tampons, et analogues, comme le phosphate de sodium, le phosphate de potassium, etc.
Liquides
Dans certains aspects, les compositions selon l'invention comprennent de l'eau. Dans certains' aspects, l'arginine est présente à une concentration d'au moins 15 mM, c'est-à-dire, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 mM, ou supérieure. Dans certains aspects, le monochlorhydrate d'arginine est présent à une concentration d'au moins 45 mM, c'est-à-dire, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 mM, ou supérieure.
Vrac final
Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et la première molécule immunogène comprend du MAG-Tn3 et est présente à une concentration inférieure ou égale à 900 μg/ml. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et la première molécule immunogène comprend du MAG-Tn3 et est présent à une concentration entre 60 et 900 μρ/πιΐ compris. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'oligonucléotide est présent à une concentration inférieure à 1140 μρ/ml. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'oligonucléotide est présent à une concentration de 760 à 1140 μΐ/ml, compris. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'oligonucléotide est présent à une concentration de 950 μρ/ml. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'arginine est présente à une concentration de 25 mM. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et le monochlorhydrate d'arginine est présent à une concentration de 187,5 mM. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et (i) entre 60 et 900 μρ/ml de MAG-Tn3, compris ; (ii) 950 μρ/ml de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 25 mM d'arginine ; (iv) 187,5 mM de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,108 % p/v de
Polysorbate 80 ; et (vi) 5 % p/v de saccharose. Gâteau séché
Dans certains aspects, la composition est séchée, et le rapport arginine/monochlorhydrate d'arginine est de 20/150 (mol/mol) ou de 1,74/15,8 (p/p) . Dans certains aspects, la composition séchée comprend entre 380 et 570 μρ de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) . Dans certains aspects, la composition séchée comprend (i) entre 30 et 450 μq de MAG-Tn3, compris ; (ii) 475 μρ de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 0,87 mg d'arginine ; (iv) 7,9 mg de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,216 mg de Polysorbate 80 ; et (vi) 10 mg de saccharose. Récipient final
Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et la première molécule immunogène comprend du MAG-Tn3 et est présente à une concentration inférieure à 720 μρ/ml. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et la première molécule immunogène comprend du MAG-Tn3 et est présente à une concentration entre 48 et 720 μg/ml, compris. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'oligonucléotide est présent à une concentration de 608 à 912 μς/ιη!, compris. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'oligonucléotide est présent à une concentration de 760 μρ/ιηΐ. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et l'arginine est présente à une concentration de 20 mM. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et le monochlorhydrate d'arginine est présent à une concentration de 150 mM. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et (i) entre 48 et 720 μρ/ml de MAG-Tn3, compris ; (ii) 760 μρ/ml de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 20 mM d'arginine ; (iv) 150 mM de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,0864 % p/v de Polysorbate 80 ; et (vi) 4 % p/v de saccharose. Dans certains aspects, la composition comprend de l'eau et (i) entre 48 et 720 μρ/πιΐ de MAG-Tn3, compris ; (ii) 760 μρ/ιηΐ de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 20 mM d'arginine ; (iv) 150 mM de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,0864 % p/v de Polysorbate 80 ; et (vi) 4 % p/v de saccharose ; (vii) 150 mM de NaCl ; (viii) 8 mM de KH2PO4 et 2 mM de Na2HP04 ; (ix) 50 μΐ/ml de MPL ; (x) 100 μρ/ml de liposomes ; et (xi) 100 μρ/ml de QS21.
Procédés et méthodes
Dans certains aspects, il est proposé ici des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, comprenant la combinaison de leurs composants en une seule étape, ou en plusieurs étapes. Dans certains aspects, il est proposé ici des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, comprenant une étape de combinaison des composants comprenant de l'arginine ; une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative. Dans certains aspects, il est proposé ici des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, comprenant les étapes de combinaison des composants comprenant de 1'arginine ; une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative. Dans certains aspects, l'arginine peut comprendre une espèce ayant un contre-ion. Dans certains aspects, il est proposé des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, comprenant une étape de combinaison des composants comprenant de l'arginine ; du monochlorhydrate d'arginine ; une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative. Dans certains aspects, il est proposé des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, comprenant les étapes de combinaison des composants comprenant de l'arginine ; du monochlorhydrate d'arginine ; une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative. Dans certains aspects, il est proposé des procédés de fabrication des compositions vaccinales essentiellement stables, comprenant les étapes de combinaison des composants d'arginine ; de monochlorhydrate d'arginine ; d'une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et d'une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative. Un ou plusieurs de ces composants sont combinés avec un liquide comprenant de l'eau. Des méthodes classiques peuvent être utilisées pour combiner ces composants. De manière générale, il est préparé une solution mère comprenant l'arginine et l'espèce monochlorhydrate d'arginine, qui est ensuite combinée avec des solutions mères des autres composants. En variante, le monochlorhydrate d'arginine peut être préparé par neutralisation de l'arginine avec de l'acide chlorhydrique. Lorsqu'un contre-ion différent est souhaité, il est possible d'utiliser des approches similaires qui utilisent un acide différent.
Par exemple, lorsque les molécules immunogènes sont MAG-Tn3 et CpG, respectivement, le protocole de formulation suivant peut être suivi : en utilisant des solutions mères de 500 mM de L-arginine et de 1 M de monochlorhydrate de Larginine, des formulations peuvent être constituées en ajoutant 31,3 mM de L-arginine et 187,5 mM de monochlorhydrate de L-arginine à une solution de saccharose à 5 % dans de l'eau pour injection (disponible chez Thermo-Fisher). MAG-Tn3 et CpG sont tous les deux disponibles dans le commerce et le protocole du fabricant pour la préparation des solutions mères de ces molécules peut être suivi. Du CpG7909 (disponible chez Agilent) est ensuite ajouté à la solution à une concentration de 1050 μρ/ιηΐ. La solution est ensuite agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 obtenu chez Lonza Braine est ensuite ajouté aux solutions à des concentrations situées dans la plage de 250 à 1125 μg/ml. Les solutions sont ensuite agitées magnétiquement pendant encore 5 minutes à 150 tr/min. Les formulations sont ensuite diluées 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HP04/KH2P04, 150 mM de NaCl pH 6,1. Voir les exemples 3 et 4.
Dans _ certains aspects, il est proposé des procédés de séchage de la composition. Des techniques classiques peuvent être utilisées pour sécher la composition, y compris la cryodessiccation, la lyophilisation, et analogues. Des protocoles classiques de lyophilisation peuvent être utilisés. Dans un aspect, un cycle de lyophilisation de 64 heures est utilisé, dans lequel une température de produit inférieure à -34,5 °C est évitée durant la phase primaire de séchage du cycle de congélation. Par exemple, les conditions peuvent comprendre une congélation initiale de 1 heure à -52 °C, suivie d'un séchage primaire où la température est augmentée entre -27 °C et -37 °C en 2,5 à 3,5 heures. La température peut être ensuite maintenue pendant approximativement 27 à 37 heures. La température du séchage primaire peut être ensuite augmentée de façon progressive entre -23 °C et -33 °C sur une période de 4,25 à 5,75 heures. Cette température peut être maintenue pendant 4,25 à 5,75 heures. Tout le séchage primaire peut être effectué avec une pression de chambre de 45 pbar (34 mTorr). Le séchage secondaire peut débuter avec la température augmentée de façon progressive entre 32 et 42 °C en 5,4 à 6,6 heures à une pression de chambre de 15 à 75 pbar (11 à 56 mTorr) et maintenue pendant 10,8 à 13,2 heures à une pression de 10 à 45 pbar (8 à 34 mTorr).
Dans certains aspects, il est proposé des procédés pour la combinaison des compositions avec un liquide comprenant de l'eau, où le liquide comprend en outre une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants, où au moins l'un des adjuvants est choisi dans le groupe constitué de MPL et de'QS21. Dans certains aspects, il est proposé des procédés pour la reconstitution des compositions séchées, comprenant les étapes de combinaison de la composition séchée avec un liquide comprenant de l'eau, où le liquide comprend en outre une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants choisis dans le groupe constitué de MPL et de QS21. Dans certains aspects, l'adjuvant comprend en outre des liposomes.
Dans certains aspects, il est proposé des produits selon les procédés précédents.
Dans certains aspects, les compositions peuvent être présentes dans un ou plusieurs récipients. Par exemple, un premier récipient peut comprendre de l'arginine et les première et seconde molécules immunogènes, alors qu'un second récipient peut comprendre une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants choisis dans le groupe constitué de MPL et de QS21. En variante, un récipient peut comprendre de l'arginine, les première et seconde molécules immunogènes, et une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants choisis dans le groupe constitué de MPL et de QS21. Dans certains aspects, il est proposé des kits comprenant un ou plusieurs récipients comprenant les compositions.
Dans certains aspects, il est proposé des méthodes de traitement d'un patient comprenant les étapes d'administration d'une composition décrite ici. Dans certains aspects, il est proposé des méthodes d'induction d'une réponse immunogène comprenant les étapes d'administration d'une composition à un être humain. L'administration peut être réalisée par inj ection.
Dans certains aspects, il est proposé l'utilisation de monochlorhydrate d'arginine en tant qu'additif pour stabiliser une composition vaccinale.-
Dans certains aspects, les compositions proposées ici sont pour une utilisation en médecine, comme pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire. Dans certains aspects, les compositions sont pour une utilisation dans le traitement du cancer, où la première molécule immunogène est Mag-Tn3. Dans certains aspects, les compositions sont pour une utilisation dans le traitement du cancer du sein, où la première molécule immunogène est Mag-Tn3.
Sauf indication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle comprise de manière courante par une personne de compétence moyenne dans le domaine auquel cette invention appartient. Les termes au singulier « un », « une », « le » et « la » comprennent les articles au pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire. De façon similaire, le terme « ou » est censé inclure « et » sauf si le contexte indique clairement le contraire. Le terme « pluralité » se rapporte à deux ou plus. En outre, les limitations numériques données par rapport aux concentrations ou aux taux d'une substance, comme les concentrations des composants dans les solutions ou leurs rapports, et les conditions réactionnelles comme les températures, les pressions et les temps de cycle sont censées être approximatives. Ainsi, lorsqu'un pH est indiqué comme étant au moins pH 7,5, il est prévu que le pH soit compris comme étant au moins approximativement (ou « environ » ou « ~ ») pH 7,5, c'est-à-dire, au moins 7,5 ± 0,2 unité de pH. L'invention sera en outre décrite en référence aux figures et aux exemples non limitatifs qui suivent.
Exemples
Exemple 1 - Criblage des excipients : détermination d'un système de tampon approprié pour Mag-Tn3 et CpG7909
La dose ciblée pour l'antigène MAG-Tn3 a été fixés à 500 μg/dose. En présence de 1'immunostimulant CpG7909, l'antigène MAG-Tn3 coprécipite instantanément. Une multitude de systèmes de tampons ont été essayés dans un effort de solubilisation de cette combinaison antigène -immunostimulant. Ce rapport détaillera les nombreuses combinaisons de tampons et d'excipients essayées dans une tentative de solubilisation de MAG-Tn3 et de CpG7909. MAG-Tn3 est un antigène glyco-peptidique d'une taille approximative de 11 kDa. Il a un pi estimé de 9,8 à 10, et il est par conséquent chargé très positivement à pH neutre. Cet antigène doit être combiné avec 1'immunostimulant CpG7909 pour être formulé sous la forme d'un vaccin lyophilisé qui devra être reconstitué dans le système d'adjuvant connu comme AS01B. Le CpG7909 est un oligodésoxynucléotide simple brin 24-mer de synthèse avec un squelette phosphorothioate d' approximativement 8 kDa et il a 23 charges négatives à pH neutre. La combinaison de ces deux molécules sans l'addition d'excipients provoque une coprécipitation instantanée.
Les tentatives initiales de solubilisation de MAG-Tn3 et de CpG7909 ont été effectuées au niveau du vrac final, où la compatibilité avec le système de tampon AS01B n'a pas été estimée. Ces expériences ont indiqué qu'avec l'addition d'histidine à une concentration de 18,75 mM dans le vrac final, il a été obtenu une formulation soluble. Il a été découvert, lorsque ce produit final lyophilisé a été reconstitué dans le système de tampon de l'adjuvant, que la formulation n'était plus soluble et que le problème de coprécipitation n'avait pas été entièrement résolu. L'objectif des expériences décrites dans ce rapport a été de trouver un moyen par lequel à la fois MAG-Tn3 et CpG7 909 pourront être formulés ensemble dans une formulation vaccinale soluble lors d'une reconstitution dans du tampon AS01B. Les expériences précédentes avaient démontré le besoin d'estimer la stabilité de la formulation dans le tampon de l'adjuvant dès le départ et les expériences décrites dans ce rapport ont été effectuées comme telles.
Procédure expérimentale
Préparation des formulations. Deux types de formulations ont été réalisés. Le premier type de formulation est illustré sur la figure 1. MAG-Tn3 et CpG7909 sont formulés séparément et ensuite combinés. L'excipient A est ajouté à une solution à 5 % de saccharose dans de l'eau pour injection (Thermo-Fisher) à des concentrations variables comme il est indiqué dans le tableau 1, et ensuite agité magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 obtenu chez Lonza Braine est ensuite ajouté à la solution à une concentration de 2500 μg/ml pour une dose finale de 500 μg. Cette solution est agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Dans un récipient séparé, l'excipient B est ajouté à une solution à 5 % de saccharose dans de l'eau pour injection et agité magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le CpG7909 (Agilent) est ensuite ajouté à cette solution à une concentration de 2100 μρ/ιηΐ. La solution est ensuite agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Les deux solutions, le mélange de MAG-Tn3 et le mélange de CpG, sont ensuite combinées dans un rapport de 1/1 et ensuite agitées magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Cette formulation est ensuite diluée 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HP04/KH2P04, 150 mM de NaCl pH 6,1 (tampon AS01B) .
Les formulations sont ensuite incubées pendant vingt-quatre heures à 4 °C avant d'être analysées.
Tableau 1
Compositions de tampons testées en utilisant le procédé de mélange séparé représenté sur la figure 1
La seconde méthode utilisée pour la formulation a été un organigramme classique (figure 2) . Tous les excipients, voir le tableau 2 pour la liste, sont ajoutés à une solution à 5 % de saccharose dans de l'eau pour injection à des concentrations variables. Le CpG7909 est ensuite ajouté à la solution à une concentration de 1050 pg/ml. La solution a été ensuite agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 est ensuite ajouté aux solutions à une concentration de 1250 μρ/ιηΐ pour une dose finale de 500 μg. Les solutions sont ensuite agitées magnétiquement pendant encore 5 minutes à 150 tr/min. Les formulations sont ensuite diluées 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HP04/KH2PC>4, 150 mM de NaCl pH 6,1. Toutes les formulations ont été ensuite incubées pendant vingt-quatre heures à 4 °C avant d'être analysées.
Tableau 2
Liste des excipients formulés dans l'organigramme classique.
Les concentrations indiquées sont les concentrations trouvées dans le récipient reconstitué final
Tous les échantillons ont été d'abord inspectés visuellement. Si une précipitation ou une opacité quelconque de la solution a été notée, il n'a été réalisé aucune autre analyse. Si la formulation était translucide, des analyses supplémentaires ont été réalisées comme les techniques BCA, HPLC-SEC, et SDS-PAGE. Un test BCA a été effectué pour estimer la teneur en MAG-Tn3 dans les formulations. Le protocole et les réactifs classiques de Pierce ont été utilisés. Une chromatographie d'exclusion a été réalisée en utilisant un instrument de CLHP Waters 2996 équipé d'un détecteur de fluorescence (Waters) pour estimer les profils d'agrégation des formulations résultantes en utilisant une colonne TSKgel G3000PWxl (Tosoh Bioscience LLC) et une phase mobile de 200 mM de NaCl (EMD). L'analyse SDS-PAGE a été réalisée en utilisant des gels de 4 à 12 % de Bis-Tris (Invitrogen) et du tampon de migration MES (Invitrogen). Les gels ont été colorés en utilisant le SilverExpress ou le SilverQuest de Invitrogen. Les échantillons centrifugés et non centrifugés ont été passés sur gel pour estimer la présence de précipité dans les formulations. Une centrifugation a été effectuée pendant 15 minutes à 18 000 g. Le surnageant a été extrait, après quoi le culot a été remis en suspension dans du tampon d'échantillon LDS IX (Invitrogen) et les deux fractions ont été passées sur des gels. Des analyses de pH (Orion) et d'inspection visuelle ont été également effectuées.
La plupart des formulations n'ont pas été réussies et l'excipient utilisé a pu être exclu sur la base de l'inspection visuelle, souvent sans débuter l'incubation de 24 heures. Les résultats de l'analyse de l'aspect visuel peuvent être consultés dans le tableau 3.
Tableau 3
Tableau résumant les résultats de l'aspect visuel et de la turbidité. Les échantillons qui ont précipité n'ont pas été en outre testés. PPT : précipitation.
Pour ces formulations qui n'ont pas précipité, les analyses ont été effectuées après l'incubation de 24 heures à 4 °C. Les résultats de la SDS-PAGE ont indiqué que bien qu'il n'ait pas été observé de précipitation à l'inspection visuelle, la plupart des formulations avaient légèrement précipité comme il est indiqué sur la figure 3 par les flèches. Bien qu'une bande soit présente dans la fraction du culot, il ne semble pas y avoir suffisamment de matériau pour observer une diminution correspondante de l'intensité de la bande dans les fractions des surnageants.
Ce qui est potentiellement plus inquiétant est entouré d'une ligne soit en points soit en pointillés, car ceci indique une augmentation de l'intensité de la bande de dégradation qui est seulement légèrement présente dans le témoin. 10 mM d'acide glutamique avec soit 10 mM de lysine soit 10 mM d'arginine semblent présenter une intensité de bande similaire de la bande de dégradation par rapport au témoin. Ceci peut être dû indirectement au pH, car ces deux formulations ont un pH d ' approximativement 8, tandis que les autres formulations non tensioactives ont un pH très élevé supérieur à 9. Ceci est en outre confirmé lorsque les deux formulations de tris-maléate présentent à peine un bande de dégradation, tandis que la formulation de tris à pH élevé présente une bande de dégradation plutôt intense et bien définie. Voir la figure 4.
Les résultats du test BCA pour déterminer la teneur en MAG-Tn3 n'ont pas été prometteurs, voir le tableau 4. Il faudra noter que le test BCA n'a pas été optimisé pour chaque système de tampon utilisé. Malgré ceci, des données utiles peuvent être extraites. Il est intéressant de noter que les deux formulations qui présentent la perte la plus faible de teneur en MAG-Tn3, à l'exception de la formulation d'Empigen, sont 10 mM d'acide glutamique avec soit 50 mM d'arginine soit
50 mM de lysine. Ces deux formulations ont des pH d'approximativement 9,5 et des bandes de dégradation intenses par SDS-PAGE. Les formulations de tris-maléate bien que quelque peu prometteuses par SDS-PAGE ne le sont pas par le test BCA. Des pertes d'approximativement 50 % sont observées pour ces deux formulations.
Tableau 4 Résultats de la teneur en antigène MAG-Tn3 par les techniques BCA et HPLC-SEC. Le pourcentage de perte est basé sur une concentration théorique de MAG-Tn3 de 826 μρ/ιηΐ. La concentration de MAG-Tn3 visée dans ces formulations était de 500 μρ/άοεθ ou de 1000 μρ/πιΐ en se basant sur la masse du vrac purifié utilisé et le volume de reconstitution. Il a été découvert ultérieurement que le pourcentage de teneur en glycopeptide devra être utilisé dans la détermination de la concentration afin de prendre en compte la teneur en eau et en contre-ion. Pour ce lot de MAG-Tn3, la teneur en glycopeptide était de 82,6 %.
Concentration de MAG-Tn3 % de monomère
Excipient et concentrations par BCA (pg/ml)
- par HPLC-SEC
Totale % de perte
Acide glutamique 7 mM + 20 mM d'arginine 542,4 34,3 100 1,0 % p/v d'Empigen 957,9 0,0 88,6 10 mM d'acide glutamique -10 mM de lysine 507,3 38,6 100 10 mM d'acide glutamique - 50 mM de lysine 746,2 9,7 100 50 mM d'acide glutamique - 50 mM de lysine 551,9 33,2 100 10 mM d'acide glutamique -10 mM d'arginine 454,7 45,0 100 10 mM d'acide glutamique - 50 mM d'arginine 808,7 2,1 100 50 mM d'acide glutamique - 50 mM d'arginine 537,7 34,9 100 50 mM de Tris -10 mM de Maléate 406,8 50,8 - 75 mM de Tris -10 mM de Maléate 433,5 47,5 -
La formulation d'Empigen bien que basse en pH et affichant des récupérations décentes, présente un agrégat important de masse moléculaire élevée sur son Chromatogramme d'exclusion de taille (données non présentées). Cet agrégat représente approximativement 11 % de la surface du pic.
De nombreuses formulations ont été essayées dans un effort de solubiliser MAG-Tn3 et CpG7909, cependant aucune n'a été totalement efficace. Le MAG-Tn3 semble être le plus soluble à pH élevé, toutefois les pH supérieurs à 8,5 sont connus pour cliver les sucres. Puisque MAG-Tn3 est un glycopeptide avec le sucre Tn étant la partie antigénique, les pH élevés doivent être évités. A un pH supérieur, il y a une augmentation de la bande de dégradation par SDS-PAGE, bien que l'identité de cette bande doive être encore déterminée, il peut s'agir d'un MAG-Tn3 déglycosylé ou de MAG.
Il est intéressant de noter que lorsque des concentrations égales de tampons anioniques et cationiques sont utilisées, elles présentent la même plage de perte de MAG-Tn3, 38,6 et 33,2 % pour les formulations de 10 et 50 mM d'acide glutamique et de lysine. La perte en protéine est de beaucoup inférieure, 9,7 %, lorsqu'un excès de tampon cationique, dans ce cas la lysine, est utilisé. Une tendance similaire est observée pour les combinaisons d'acide glutamique - arginine. Une raison possible pour les instabilités des formulations peut être la présence d'ions en compétition. Si l'acide glutamique interagit avec l'arginine ou la lysine, il réduira alors la quantité d'arginine ou de lysine libre dans la solution interagissant et stabilisera le CpG et préviendra la coprécipitation avec le MAG-Tn3. Des expériences futures exploreront cette possibilité.
Exemple 2 - Histidine contre arginine. Détermination d'un système de tampon à une dose cible inférieure
La dose ciblée pour l'antigène MAG-Tn3 a été fixée à 500 μς/άοεε. En présence de 1'immunostimulant CpG7909, l'antigène MAG-Tn3 coprécipite instantanément. Une multitude de systèmes de tampon ont été essayés dans un effort de solubilisation de cette combinaison antigène -immunostimulant, toutefois, aucun n'a été adéquat. Toutefois, l'histidine et l'arginine ont été les tampons les plus prometteurs parmi les systèmes explorés. Dans ce rapport, il sera décrit les expériences réalisées pour déterminer quel système de tampon fonctionnera mieux à une dose inférieure. Les résultats essentiels obtenus à partir de cette expérience ont été que la combinaison antigène-immunostimulant pourra être formulée sous la forme d'une solution soluble, toutefois, la dose ciblée d'antigène devra être reconsidérée. L'antigène MAG-Tn3 a dû être formulé à 500 μg/dose en présence de 1'immunostimulant CpG7909 à une concentration de 840 μρ/πιΐ sous la forme d'une colyophilisation. Une étude de compatibilité des tampons a été effectuée dans une expérience préalable, dans laquelle il a été clairement démontré que le MAG-Tn3 était incompatible avec le CpG7909 car la solution a précipité après l'addition du MAG-Tn3 à la solution de CpG. Le MAG-Tn3 a un pi théorique situé entre 9,8 et 10 ; par conséquent, il est donc chargé très positivement à un pH inférieur. En outre, le CpG a 23 charges négatives à un pH inférieur. Par conséquent, lorsque les 2 composants sont combinés, il se produit une coprécipitation. De nombreux systèmes de tampons ont été essayés dans une tentative de résoudre ceci, l'arginine et l'histidine ont semblé fournir une certaine aide contre la précipitation, mais pas de manière complète. ‘ L'objectif de cet article est de décrire les expériences effectuées avec l'histidine et l'arginine pour aider à solubiliser l'antigène MAG-Tn3 en présence de 1'immunostimulant CpG7909.
Dans l'expérience dans ce rapport, diverses concentrations d'arginine et d'histidine ont été criblées avec la dose de MAG-Tn3 fixée à une quantité de dose médiane de 100 μg et la stabilité de ces échantillons a été ensuite contrôlée.
Procédure expérimentale
Préparation des formulations : de l'arginine (Sigma-
Aldrich) ou de l'histidine (Sigma-Aldrich) a été ajoutée à une solution à 5 % de saccharose dans de l'eau pour injection (Thermo-Fisher) à des concentrations de 15,2, 31,3, 62,5, et 125 mM. Le CpG7909 (Agilent) a été ensuite ajouté à la solution à une concentration de 1050 μρ/ιηΐ. La solution a été ensuite agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 obtenu chez Lonza Braine a été ensuite ajouté aux solutions à une concentration de 250 μρ/ιηΐ pour une dose finale de 100 μρ. Les solutions ont été ensuite agitées magnétiquement pendant encore 5 minutes à 150 tr/min. Les formulations ont été ensuite diluées 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HP04/KH2PC>4, 150 mM de NaCl pH 6,1. Toutes les formulations ont été ensuite incubées pendant vingt-quatre heures à 4 °C avant d'être analysées.
Analyses : une RP-HPLC a été effectuée pour estimer la teneur en MAG-TN3 dans les formulations avant et après filtration avec un filtre de seringue de 0,2 μη. Un instrument de CLHP Waters 2996 équipé d'une détection UV a été utilisé avec une colonne Poros R 1/10 de Applied Biosciences et un gradient de 0 à 100 % d'acétonitrile dans 0,1 % d'acide trifluoroacétique. Une chromatographie d'exclusion a été réalisée en utilisant un instrument de CLHP Waters 2996 équipé d'un détecteur de fluorescence (Waters) pour estimer les profils d'agrégation des formulations résultantes en utilisant une colonne TSKgel G3000PWxl (Tosoh Bioscience LLC) et une phase mobile de 200 mM de NaCl. Une analyse SDS-PAGE a été réalisée en utilisant des gels de 4 à 12 % de Bis-Tris (Invitrogen) et le tampon de migration MES (Invitrogen) . Les gels ont été colorés en utilisant le SilverQuest de
Invitrogen. Les échantillons centrifugés et non centrifugés ont été passés sur gel pour estimer la présence de précipité dans les formulations. Une centrifugation a été effectuée pendant 15 minutes à 18 000 g. Le surnageant a été extrait, après quoi le culot a été remis en suspension dans du tampon d'échantillon LDS IX (Invitrogen) et les deux fractions ont été passées sur des gels. Des analyses de pH (Orion) et d'inspection visuelle ont été également effectuées.
Toutes les formulations étaient translucides et dépourvues de particules après stockage à 4 °C. Toutefois après l'incubation de 24 heures, les solutions d'histidine ont toutes été trouvées légèrement turbides à l'inspection visuelle. Les lectures de pH, tableau 5, n'ont fourni aucune information en ce qui concerne la stabilité du produit ; toutefois, il faudra noter que les formulations d'histidine présentent une plage de pH plus étroite que les formulations d'arginine avec les mêmes concentrations.
Tableau 5 pH des formulations. Des lectures de pH ont été prises pour toutes les solutions. _PH_ _Arginine_Histidine_ 12,5 mM 8,4 6,7 25 mM 9,4 6,9 50 mM 9,8 7,1 _100 mM_10,1_7_13_
Les résultats de SDS-PAGE, observés sur la figure 5, confirment les résultats observés visuellement. Les formulations d'histidine contiennent toutes de légères bandes dans les fractions des culots, tandis que les formulations de d'arginine' n'en contiennent pas.
Les résultats de HPLC-SEC n'ont pas fourni de données supplémentaires. Toutes les formulations ont été trouvées être monomères et aucun décalage significatif dans le temps de rétention n'a été observé ; ainsi, suggérant que le MAG-TN3 qui était demeuré soluble était sous forme monomère.
Tableau 6
Teneur en antigène MAG-Tn3. La teneur en antigène MAG-Tn3 a été déterminée par RP-HPLC avant et après filtration avec un filtre de seringue de 0,2 μιη pour estimer la teneur en agrégats insolubles.
Concentration de MAG-Tn3 par RP-HPLC (pg/ml)
Arginine Histidine
Après % de Après % de
Totale Totale filtration récupération filtration récupération
12,5 mM 202,9 Ï88J 92J 209,3 138,4 66/I 25 mM 209,1 183,2 87,6 197,6 130,7 66,2 50 mM 207,9 184,1 88,5 198,4 131,5 66,3 100 mM 204,9 197,4 96,3 202,1 131,9 65,3
Les résultats de RP-HPLC, observés dans le tableau 6, ont confirmé les résultats obtenus par SDS-PAGE. Les formulations d'histidine présentent toutes une perte approximative de teneur de 33 % après filtration, comme conséquence d'agrégats insolubles. A cause de la perte significative de teneur en MAG-Tn3 avec les formulations d'histidine, l'arginine a été choisie comme système de tampon de choix. Résultats
Les systèmes de tampons à la fois d'histidine et d'arginine aident à solubiliser le MAG-Tn3 en présence de 1'immunostimulant CpG7909. La nature cationique de ces systèmes de tampons aide à stabiliser le CpG anionique, l'empêchant de coprécipiter avec l'antigène MAG-Tn3. Le pKa inférieur de l'histidine en fera un tampon plus favorable car il produira des formulations avec un pH inférieur ; toutefois, il n'est pas aussi efficace que l'arginine pour la solubilisation des deux composants principaux, ce qui a été démontré par la perte de 33 % de teneur en antigène lors de l'analyse par RP-HPLC.
La chaîne latérale de l'arginine a un pKa de 12,48 rendant le pH des solutions finales plutôt élevé, entre pH 8 et 10. La stabilité à long terme du MAG-Tn3 dans ce système de tampon peut être gênée, car il s'agit d'un glycopeptide et un pH élevé favorise la déglycosylation. Un composant de tampon supplémentaire devra être ajouté à la formulation afin d'abaisser le pH dans une plage qui sera plus favorable en ce qui concerne la stabilité de l'antigène.
Le choix d'un composant de tampon supplémentaire sera difficile comme il est observé dans l'exemple 1. Il semblerait que la présence d'un tampon anionique ajoute un ion de compétition pour le système de tampon cationique, dans ce cas l'arginine, libérant de cette manière le CpG si bien qu'il peut à son tour coprécipiter avec le MAG-Tn3. Un candidat idéal pour un tampon anionique serait un tampon qui peut abaisser le pH au-dessous de 8,5, tout en n'entrant pas en compétition avec l'arginine ou un tampon anionique qui présenterait plus d'affinité pour le MAG-Tn3 que le CpG n'en présente pour l'antigène.
Exemple 3 -_Concentrations_de_L-arginine_et_de monochlorhydrate de L-arginine dans la formulation vaccinale de MAG-Tn3
Le glycopeptide MAG-Tn3 peut être formulé dans un vaccin soluble avec 1 ' immunostimulant CpG7909 à une dose de 300 μρ/ml dans un système de tampon de L-arginine. Des expériences précédentes ont montré que des concentrations de L-arginine entre 12,5 et 100 mM étaient suffisantes pour solubiliser la formulation vaccinale. Ce rapport détaillera les expériences effectuées pour déterminer les concentrations exactes de Larginine et de monochlorhydrate de L-arginine utilisées dans la formule vaccinale de MAG-Tn3.
La formulation vaccinale de MAG-Tn3 a été initialement ciblée pour une dose de 500 μρ dans un volume d'injection de 500 μΐ contenant 420 μρ d' immunostimulant CpG7909. Cette formulation n'était pas stable et a entraîné une coprécipitation de 1'immunostimulant et de l'antigène. La formulation vaccinale a été rendue soluble avec l'utilisation de L-arginine en combinaison avec un abaissement de la dose ciblée à 300 μρ de MAG-Tn3. Il a été montré dans des expériences précédentes que le monochlorhydrate de L-arginine était efficace pour abaisser le pH de la formulation à 8,5 tout en maintenant une formulation soluble. Le besoin de maintenir le pH au-dessous de 8,5 est dû à la déglycosylation potentielle du groupe du sucre Tn à partir de la molécule. Le sucre Tn est la partie antigénique de la molécule, sa perte aurait un impact significatif sur l'immunogénicité. L'objectif de ce rapport est de décrire les expériences effectuées afin d'optimiser les concentrations de L-arginine et de monochlorhydrate de L-arginine pour une stabilité maximale du vaccin. Des concentrations de L-arginine de 12,5 à 40 mM ont été testées avec des concentrations variables de monochlorhydrate de L-arginine afin de maintenir un pH autour de 8,5. Une fois que la concentration de L-arginine a été établie, les concentrations de monochlorhydrate de L-arginine ont été criblées pour déterminer le pH optimal assurant une stabilité maximale de la formulation vaccinale. Dans les deux cas, la concentration la plus basse qui fournit la meilleure stabilité sera choisie comme concentration de choix.
Procédures expérimentales
Préparation des formulations : en utilisant des solutions mères de 500 mM de L-arginine (EMD) et de 1 M de monochlorhydrate de L-arginine (Sigma Aldrich), des formulations ont été constituées en ajoutant 15,6 à 40 mM de L-arginine et 60 à 140 mM de monochlorhydrate de L-arginine à une solution à 5 % de saccharose (EMD) dans de l'eau pour injection (Thermo-Fisher) pour la première partie de l'expérience dans laquelle la L-arginine a été déterminée. Dans l'expérience suivante, 25 mM de L-arginine et 125 à 375 mM de monochlorhydrate de L-arginine ont été ajoutées à une solution à 5 % de saccharose dans de l'eau pour injection. Le CpG7909 (Agilent) a été ensuite ajouté à la solution à une concentration de 1050 μρ/ιηΐ. La solution a été ensuitë agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 obtenu chez Lonza Braine a été ensuite ajouté aux solutions à une concentration de 750 μρ/ιηΐ. Les solutions ont été ensuite agitées magnétiquement pendant encore 5 minutes à 150 tr/min. Les formulations ont été ensuite diluées 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HPC>4/KH2P04, 150 mM de NaCl pH 6,1. Toutes les formulations ont été ensuite incubées pendant vingt-quatre heures à 4 °C avant d'être analysées. Les agents chimiques ont été fournis par Sigma-Aldrich.
Analyses : une RP-HPLC a été effectuée pour estimer la teneur en MAG-Tn3 dans les formulations avant et après filtration avec un filtre de seringue de 0,2 μπι. Un instrument de CLHP Waters 2996 équipé d'une détection ÜV a été utilisé avec une colonne Poros R 1/10 de Applied Biosciences et un gradient de 0 à 100 % d'acétonitrile dans 0,1 % d'acide trifluoroacétique. Une chromatographie d'exclusion a été réalisée en utilisant un instrument de CLHP Waters 2996 équipé avec un détecteur de fluorescence (Waters) pour estimer les profils d'agrégation des formulations résultantes en utilisant une colonne TSKgel G3000PWxl (Tosoh Bioscience LLC) et une phase mobile de 200 mM de NaCl. Une analyse SDS-PAGE a été effectuée en utilisant des gels de 4 à 12 % de Bis-Tris (Invitrogen) et le tampon de migration MES (Invitrogen). Les gels ont été colorés en utilisant le SilverQuest de Invitrogen. Les échantillons centrifugés et non centrifugés ont été passés sur gel pour estimer la présence de précipité dans les formulations. Une centrifugation a été effectuée pendant 15 minutes à 18 000 g. Le surnageant a été extrait, après quoi le culot a été remis en suspension dans du tampon d'échantillon LDS IX (Invitrogen) et les deux fractions ont été passées sur des gels. Des analyses de turbidité (HACH), de pH (Orion), et d'inspection visuelle ont été également effectuées.
Toutes les formulations ont été trouvées translucides et dépourvues de particules après l'incubation de 24 heures à 4 °C par analyse visuelle.
Les résultats de SDS-PAGE, visualisées sur la figure 6, indiquent que toutes les formulations de 12,5 à 30 mM de Larginine sont stables, à l'exception de la formulation de 15 mM de L-arginine qui présente une bande légèrement plus intense dans sa fraction de culot.
Les résultats de turbidité et de pH sont similaires entre les formulations et aucune différence significative n'a été notée, comme on peut le voir ci-dessous dans le tableau 7.
Tableau 7 -
Criblage de la L-arginine. Il est proposé un résumé des résultats du criblage de la L-arginine.
Concentration de MAG-Tn3 par RP- % de
Concentration „
Turbidité HPLC (pg/ml) monomère de L-arginine pH - , (NTU) Après % de parHPLC- (mM) Totale
filtration récupération SEC 12^5 0,465 8^0 736,9 583,6 79^2 94~4 15.0 0,836 8,2 871,0 782,8 89,9 94,0 17.5 0,442 8,2 782,6 804,4 102,8 94,3 20.0 0,417 8,3 755,3 792,0 104,9 94,4 22.5 0,468 8,4 824,2 826,1 100,2 94,7 25.0 0,488 8,4 783,9 784,5 100,1 94,9 27.5 0,558 8,5 849,6 781,6 92,0 95,1 30.0 0,439 8,5 933,4 845,8 90,6 95,5 32.5 0,472 8,5 900,8 839,7 93,2 95,6 35.0 0,513 8,6 870,2 851,6 97,9 95,5 37.5 0,450 8,6 869,3 896,3 103,1 96,0 40.0 0,509 8,6 868,8 790,9 91,0 95,9
Il n'y a pas non plus de différence significative observée du % de monomère par HPLC-SEC, toutes les formulations sont monomères comme il est illustré sur la figure 7, avec le pic principal s'éluant à 15,9 minutes. Il a été choisi 20 mM de L-arginine pour cribler les concentrations de monochlorhydrate de L-arginine. Des bandes commencent à apparaître avec plus d'intensité dans les fractions des culots à 225 mM de monochlorhydrate de L-arginine, comme il est observé sur la figure 8.
Les résultats de la turbidité sont très similaires entre les formulations, comme il est observé dans le tableau 8. Le pH ne présente pas non plus beaucoup de variation. Une plage de pH de 7,8 à 8,2 est observée.
Tableau 8 Résumé du criblage du monochlorhydrate de L-arginine. Il est proposé un résumé des résultats du criblage du monochlorhydrate de L-arginine
Concentration de Concentration de MAG-Tn3 par RP- % de monochlorhydrate Turbidité HPLC (pg/ml) monomère de L-arginine (NTU) ^ Après % de par HPLC-
Totale
(mM) filtration récupération SEC ÏÖÖ 0,434 8^2 870,8 816,2 93J 94^0 125 0,386 8,2 868,0 709,4 81,7 95,3 150 0,394 8,0 776,9 864,4 111,3 95,2 175 0,429 8,0 800,2 829,8 103,7 95,3 200 0,367 8,0 914,9 669,1 73,1 95,0 225 0,410 7,9 877,5 752,4 85,7 94,9 250 0,374 7,8 876,7 699,0 79,7 95,2 275 0,339 7,8 792,3 777,1 98,1 95,2 300 0,439 7,8 866,5 839,9 96,9 94,9
Le % de récupération de la teneur en MAG-Tn3 après filtration démontre plus de variabilité. Les concentrations de monochlorhydrate de L-arginine de 125 mM et de 200 mM à 250 mM présentent une perte significative de récupération de 30 à 15 % indiquant la présence d'agrégats non solubles. La perte de récupération de 20 % à 125 mM de monochlorhydrate de Larginine est potentiellement erronée, puisque la récupération à 100 mM est de 93,7 %. Le % de récupération s'améliore à nouveau à 275 mM et 300 mM de monochlorhydrate de L-arginine, une explication pour ceci doit être encore comprise.
La partie soluble restante des formulations de monochlorhydrate de L-arginine est monomère. Les profils d'agrégation, tels qu'illustrés sur la figure 9, indiquent une population monomère.
Discussion
Les concentrations de L-arginine de 17,5 mM à 40 mM se sont révélées être stables. A la fois 12,5 et 15 mM de Larginine présentent une perte de 10 à 20 % de la récupération de MAG-Tn3 par RP-HPLC, suggérant la présence d'agrégats insolubles. Il a été choisi 20 mM de L-arginine comme concentration du tampon puisque la stabilité de la formulation entre 15 et 17,5 mM est incertaine car ces formulations n'ont pas été testées. 20 mM de L-arginine permet une certaine maniabilité, toutefois, si les spécifications de ± 20 % sont appliquées à 20 mM de L-arginine, la plage de concentrations acceptable deviendra 16 à 24 mM. La stabilité de 16 mM devra être estimée car 15 mM présente une perte de teneur en MAG-Tn3 après filtration de 10 %.
Le criblage du monochlorhydrate de L-arginine a fourni des résultats intéressants. Le pH ne s'est pas beaucoup décalé en dépit d'une plage large de monochlorhydrate de L-arginine utilisée, toutefois, tous les pH ont été inférieurs à 8,5, qui est le pH à éviter pour son potentiel de déglycosylation des sucres Tn à partir du MAG-Tn3. 150 mM de monochlorhydrate de L-arginine suffisent pour abaisser le pH à 8,0 et maintenir une formulation stable. Il n'y a aucune perte après filtration, aucune bande présente dans la fraction du culot par SDS-PAGE et le profil d'agrégation est monomère pour cette formulation. Les critères d'acceptation pour les concentrations des excipients lors de la soumission à une analyse de libération sont de ± 20 %, ce qui placera la plage pour le monochlorhydrate de L-arginine entre 120 mM et 180 mM. La valeur inférieure de celle-ci semblerait être dans une plage d'instabilité potentielle parce que le % de récupération de MAG-Tn3 à 125 mM est de 81,7 %. Cette valeur basse peut être anormale, puisque la récupération à 100 mM de monochlorhydrate de L-arginine est de 93,7 %. Des analyses devront être effectuées pour confirmer la stabilité à 120 mM de monochlorhydrate de L-arginine.
La concentration finale de tampon pour la formulation de 300 μρ/dose de MAG-Tn3 avec du CpG7909 est de 20 mM de Larginine et de 150 mM de monochlorhydrate de L-arginine.
Exemple 4 - Détermination d'une dose maximale pour l'antigène MAG-Tn3 dans un système de tampon d'arginine
La dose ciblée pour l'antigène MAG-Tn3 a été fixée à 500 μg/dose. En présence de 1'immunostimulant CpG7909, l'antigène MAG-Tn3 coprécipite instantanément à cette concentration. Une formulation soluble est possible à une dose inférieure de 100 μρ de MAG-Tn3/dose dans un système de tampon d'arginine ; toutefois, une dose supérieure serait préférable. Dans ce rapport, il sera décrit les expériences réalisées pour déterminer la dose maximale de MAG-Tn3.
La formulation vaccinale de MAG-Tn3 a été ciblée initialement pour une dose de 500 μρ dans un volume d'injection de ,500 μΐ contenant 420 μρ de 1 ' immunostimulant CpG7909. Cette formulation n'était pas stable et a entraîné une coprécipitation de 1 ' immunostimulant et de l'antigène. La coprécipitation a été légèrement mitigée avec l'addition des systèmes de tampons histidine ou arginine.
Dans l'expérience précédente, une formulation soluble (non précipitée) a été obtenue en abaissant la dose de l'antigène MAG-Tn3 de 500 μρ/dose à 100 μρ/dose et en utilisant de l'arginine en tant que système de tampon. Toutefois, une dose supérieure serait préférable. L'objectif de cet article est de décrire des expériences réalisées pour déterminer la dose maximale de l'antigène glycopeptidique, MAG-Tn3, dans un système de tampon d'arginine. Le système de tampon d'arginine utilisé dans ce rapport est un mélange de L-arginine et de monochlorhydrate de L-arginine. Le monochlorhydrate de L-arginine est ajouté dans une tentative d'abaisser le pH jusqu'à une plage plus favorable pour la stabilité et 1'injectabilité du produit. L'expérience initiale a criblé une grande plage de doses de MAG-Tn3 de 200 μg/ml à 900 μg/dose. Une fois que la limite supérieure a été établie, une plage plus petite de doses de MAG-Tn3 a été criblée de 800 μρ/ιηΐ à 900 μρ/πιΐ et finalement une dose a été choisie.
Procédures expérimentales
Préparation des formulations : en utilisant des solutions mères de 500 mM de L-arginine et de 1 M de monochlorhydrate de L-arginine, des formulations ont été constituées en ajoutant 31,3 mM de L-arginine et 187,5 mM de monochlorhydrate de Larginine à une solution de saccharose à 5 % dans de l'eau pour injection (Thermo-Fisher). Le CpG7909 (Agilent) est ensuite ajouté à la solution à une concentration de 1050 μρ/πιΐ. La solution a été ensuite agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 obtenu chez Lonza Braine a été ensuite ajouté aux solutions à des concentrations situées dans la plage de 250 à 1125 μg/ml. Les solutions sont ensuite agitées magnétiquement pendant encore 5 minutes à 150 tr/min. Les formulations sont ensuite diluées 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HPC>4/KH2P04, 150 mM de NaCl pH 6,1. Toutes les formulations ont été ensuite incubées pendant vingt-quatre heures à 4 °C avant d'être analysées. Les agents chimiques ont été fournis par Sigma-Aldrich.
Analyses : une RP-HPLC a été effectuée pour estimer la teneur en MAG-Tn3 dans les formulations avant et après filtration avec un filtre de seringue de 0,2 μιη. Un instrument de CLHP Waters 2996 équipé d'une détection UV a été utilisé avec une colonne Poros R 1/10 de Applied Biosciences et un gradient de 0 à 100 % d'acétonitrile dans 0,1 % d'acide trifluoroacétique. Une chromatographie d'exclusion a été réalisée en utilisant un instrument de CLHP Waters 2996 équipé avec un détecteur de fluorescence (Waters) pour estimer les profils d'agrégation des formulations résultantes en utilisant une colonne TSKgel G3000PWxl (Tosoh Bioscience LLC) et une phase mobile de 200 mM de NaCl. Une analyse SDS-PAGE a été effectuée en utilisant des gels de 4 à 12 % de Bis-Tris (Invitrogen) et le tampon de migration MES (Invitrogen). Les gels ont été colorés en utilisant le SilverQuest de Invitrogen. Les échantillons centrifugés et non centrifugés ont été passés sur gel pour estimer la présence de précipité dans les formulations. Une centrifugation a été effectuée pendant 15 minutes à 18 000 g. Le surnageant a été extrait, après quoi le culot a été remis en suspension dans du tampon d'échantillon LÖS IX (Invitrogen) et les deux fractions ont été passées sur des gels. Des analyses de turbidité (HACH), de pH (Orion), et d'inspection visuelle ont été également effectuées.
Toutes les formulations ont été trouvées translucides et dépourvues de particules après l'incubation de 24 heures à 4 °C. Il a été trouvé que les résultats de pH et de turbidité sont similaires entre les formulations ; il n'a été noté aucune différence significative, comme on peut l'observer ci-dessous dans le tableau 9.
Tableau 9
Turbidité et pH. Résultats de turbidité et de pH issus d'un criblage de doses de 200 à 900 μg/ml de MAG-Tn3 MAG-Tn3 (pg/ml) 200 300 400 500 600 700 800 900
Turbidité (NTU) 0,389 0,433 0,421 0,528 0,347 0,402 0,430 0,343 pH 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5
Les résultats de SDS-PAGE, visualisés sur la figure 10, indiquent une formulation stable jusqu'à une concentration de 900 pg/ml où il y a la présence d'une très légère bande dans la fraction du culot. Toutefois, celle-ci n'est pas détectée comme un agrégat insoluble car le % de récupération de l'échantillon filtré contre non filtré est de 100,0 % par RP-HPLC, voir le tableau 10.
Tableau 10
Teneur en MAG-Tn3. Teneur en antigène MAG-Tn3 déterminée par RP-HPLC avant et après filtration avec un filtre de seringue de 0,2 pm pour estimer la teneur en agrégats insolubles
Concentration de MAG-Tn3 par RP-HPLC (pg/ml)
Concentration ciblée de _ % de MAG-Tn3 (pg/ml) Totale Après filtration récupération 2ÖÖ 214,1 206,5 96^5 300 327,5 294,2 89,8 400 423,7 408,1 96,3 500 528,1 520,7 98,6 600 655,6 621,9 94,9 700 757,7 689,2 91,0 800 844,7 808,4 95,7 900 1007,2 963,7 95,7
La chromatographie d'exclusion n'a indiqué aucun changement dans le profil d'agrégation pour toutes les concentrations testées, car il n'y a aucun décalage dans le temps de rétention observé, ni l'apparition de pics à des temps de rétention plus courts indiquant la présence d'agrégats, comme on peut le voir à la figure 11.
Le criblage de doses plus étroites a été effectué entre 800 et 900 pg/ml, le gel résultant peut être visualisé sur la figure 12. Deux légères bandes peuvent être observées dans toutes les fractions des culots y compris le témoin (vrac purifié de MAG-Tn3) ; toutefois, les bandes sont légèrement plus intenses pour les doses de 825, 850, 875, 900 pg/ml de MAG-Tn3. La présence des bandes dans les fractions des culots n'est pas détectée comme des agrégats insolubles puisque le % de récupération des échantillons filtrés contre non filtrés est de 100 ± 10 % (tableau 11) . Il n'est pas observé non plus d'agrégats solubles quelconques sous forme de seul pic de monomère par la chromatographie d'exclusion.
Tableau 11
Plage des doses de 800 à 900 μg/ml. Il est proposé un résumé des résultats de plage des doses de 800 à 900 μg/ml
Concentration Concentration de MAG-Tn3 (pg/ml)
Turbidité % de monomère
Ciblée de MAG- pH ΑηΦ* % Hp
(NTU) Tota|e Apres /o ae par HPLC-SEC
Tn3 (pg/ml) filtration récupération
8ÖÖ 0,474 §1 793,9 857,6 108,0 95J 825 0,382 8,5 870,9 851,3 97,8 100,0 850 0,392 8,5 1044,5 991,3 94,9 100,0 875 0,395 8,5 960,2 946,4 98,6 100,0 900 0,383 8,5 968,7 973,2 100,5 100,0 _ L'antigène MAG-Tn3 semble soluble dans le système de tampon L-arginine - monochlorhydrate de L-arginine jusqu'à une concentration de 900 μg/ml dans le vaccin reconstitué final ou 450 μg/dose. Du fait que la stabilité du MAG-Tn3 en présence de CpG7909 est précaire comme il a été démontré par la multitude de tentatives pour solubiliser les deux ingrédients, une dose inférieure a été choisie.
Durant l'analyse de la stabilité et de la libération du produit, les critères d'acceptation pour la teneur en antigène sont fixés à 100 ± 20 %. La valeur extrême de 120 % doit être également une formulation soluble, par conséquent si la limite supérieure de la solubilité de MAG-Tn3 est de 900 μς/ΐαΐ, la concentration centrée de MAG-Tn3 sera alors de 7 50 μς/ιηΐ.
On doit également prendre en considération le facteur de dilution observé entre le produit en vrac formulé et le gâteau lyophilisé reconstitué. 500 μΐ de vrac formulé sont lyophilisés puis reconstitués dans un volume de 625 μΐ, entraînant un facteur de dilution de 1,25. Celui-ci doit être également ajouté au calcul de la dose. Si 750 μg/ml représente la concentration maximale qui peut être obtenue, elle concernera le vrac final, la concentration du récipient final sera alors de 600 μρ/πιΐ pour une dose de 300 μς.
La dose maximale de MAG-Tn3 qui peut être formulée sous la forme d'un produit colyophilisé avec 1'immunostimulant CpG7909 est de 300 μg dans un système de tampon d'arginine. Le système de tampon d'arginine dans ces expériences a été choisi en se basant sur le pH ; toutefois, l'optimisation de ces composants sera nécessaire.
Exemple 5 - Criblage des doses d'immunostimulant dans la formulation vaccinale de MAG-Tn3
Le glycopeptide MAG-Tn3 peut être formulé dans un vaccin soluble avec 1'immunostimulant CpG7909 à une dose de 300 μς de MAG-Tn3 et de 380 μρ de CpG7909/ml dans un système de tampon de L-arginine (pour les objectifs de cette discussion, le volume de liquide d'une dose est défini comme étant de 500 μΐ) . Une plage de concentrations possibles de CpG au sein d'un critère d'acceptation de 100 ± 20 % a été étudiée dans cette expérience pour déterminer si le MAG-Tn3 demeure soluble dans une plage de doses de CpG7909.
La quantité de CpG7909 a été abaissée de 420 μρ^οΞβ à 380 en se basant sur un étalon quantifié par RMN. En utilisant les critères d'acceptation de 100 + 20 %, une plage de doses de CpG de 300 à 460 μςΜοΞθ a été étudiée. L'objectif de ce rapport est de décrire l'expérience réalisée pour s'assurer que la formulation est demeurée stable. Des formulations contenant 180 à 420 μς de CpG/dose ont été criblées pour la stabilité.
Procédures expérimentales
Préparation des formulations : en utilisant des solutions mères de 250 mM de L-arginine (EMD) et de 1875 mM de monochlorhydrate de L-arginine (Sigma Aldrich), des formulations ont été constituées en ajoutant 25 mM de Larginine - 187,5 mM de monochlorhydrate de L-arginine à une solution de saccharose à 5 % (EMD) dans de l'eau pour injection (Thermo-Fisher) et 0,1 % de Polysorbate 80 (NOF). Le CpG7909 (Agilent) a été ensuite ajouté à la solution à une concentration de 365 à 838 μρ/πιΐ. La solution a été ensuite agitée magnétiquement pendant 5 minutes à 150 tr/min. Le MAG-Tn3 obtenu chez Lonza Braine a été ensuite ajouté aux solutions à une concentration de 750 μρ/ιηΐ. Les solutions ont été ensuite agitées magnétiquement pendant encore 5 minutes à 150 tr/min. Les formulations ont été ensuite diluées 1,25 fois dans une solution de 50 mM de Na2HPC>4/KH2P04, 150 mM de NaCl pH 6,1. Toutes les formulations ont été ensuite placées dans 1 ' auto-échantillonneur de CLHP à 25 °C pour des injections à T0, 4 heures et 24 heures. Ces formulations sont considérées comme étant des récipients finals reconstitués d'étalons du fait qu'ils ne sont pas passés par le procédé de lyophilisation.
Analyses : une chromatographie d'exclusion a été réalisée en utilisant un instrument de CLHP Waters 2996 équipé d'un détecteur de fluorescence (Waters) pour estimer les profils d'agrégation des formulations résultantes en utilisant une colonne de garde et analytique TSKgel Supermultipore PW-N (Tosoh Bioscience LLC) avec un débit de 0,5 ml/min et une phase mobile de 20 mM de L-arginine, 150 mM de L-arginine-HCl, 0,08 % de polysorbate 80, 150 mM de NaCl, 10 mM de tampon phosphate de Na/K2 pH 6,1. La détection de fluorescence a été effectuée avec une longueur d'onde d'excitation de 270 nm et une longueur d'onde d'émission de 318 nm. Résultats
La chromatographie d'exclusion n'a indiqué aucun changement dans le profil d'agrégation pour toutes les concentrations de CpG 7909 testées, car il n'y a eu aucun décalage dans le temps de rétention observé pour le pic principal de MAG-Tn3 monomère à un temps de rétention de 8,573 minutes. Il n'y a aucun changement de taille des pics à des temps de rétention plus courts, indiquant la légère présence d'agrégats, comparativement aux diverses concentrations de CpG7909 comme on peut le voir sur la figure 13. 350 et 230 μg de CpG7909/dose ont été également testés et trouvés avoir un profil similaire, les résultats ne sont pas présentés. L'incubation des échantillons pendant 4 et 24 heures à 25 °C entraîne une évolution du profil d'agrégation comme on peut le voir sur la figure 14. Le pic à 5,6 minutes, correspondant à des agrégats, augmente en surface de pic par rapport au temps passé à 25 °C.
Ce phénomène est observé à toutes les doses de CpG7909 testées comme on peut le voir sur la figure 15. 350 et 230 μg de CpG7909/dose ne sont pas inclus sur la figure 15, mais présentent le même profil. Les surfaces des pics à la fois du pic des agrégats et du pic du monomère (8,55 minutes) demeurent relativement constantes, le % de CV est inférieur à 10 %, avec des concentrations croissantes de CpG7909, comme on peut le voir dans le tableau 12.
Tableau 12
Comparaison des surfaces des pics du MAG-Tn3 monomère et des agrégats à diverses concentrations de doses de CpG 7909 Concentration de
Monomère Agrégats
CpG 4hà 24 h à 4hà 24 h à
(pg/dose) TO TO
25 °C 25 °C 25 °C 25 °C 420 4389470 4312017 4170588 52262 105071 251364 350 4511361 4430311 4322682 47834 106801 256292 270 4611544 4503391 4389977 46794 112739 250982 230 4700524 4569933 4449942 44161 115236 252104 180 4882667 4719013 4601093 44244 126648 267041
Et! 187412 152334 158727 3319 8547 6761 CV% 4,06 3,38 3,62 7,05 7,54 2,65
La formulation contenant 20 mM de L-arginine et 150 mM de monochlorhydrate de L-arginine crée une matrice appropriée pour l'antigène MAG-Tn3 et 1'immunostimulant CpG7909 à des concentrations situées dans la plage de 180 à 420 pg par dose. La concentration du vrac de CpG7 909 est déterminée en utilisant un étalon quantifié par RMN. Bien qu'une augmentation des agrégats soit observée lors de l'incubation à 25 °C, ces agrégats sont présents dans les mêmes quantités indépendamment de la concentration du CpG7909, suggérant que les agrégats sont dus à l'instabilité de l'antigène par opposition à une incompatibilité avec la concentration de CpG7909. La limite supérieure des concentrations potentielles de CpG7909 n'a pas été testée dans cette expérience ; toutefois, la tendance observée indique qu'une formulation contenant 460 μς/ιπΐ de CpG7909 sera stable.
Exemple 6 - Etude du pH
Les valeurs de pH calculées pour divers mélanges d'arginine et de chlorhydrate d'arginine ont été comparées aux valeurs déterminées avec un pH-mètre (tableau 13).
Tableau 13 pH calculé contre observé
Claims (42)
- REVENDICATIONS1. Composition vaccinale essentiellement stable comprenant : (a) de l'arginine ; (b) un contre-ion ; (c) une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et (d) une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative ; ladite composition caractérisée en ce que lorsque ladite composition comprend de l'eau (i) lesdites première et seconde molécules immunogènes sont essentiellement stables ; et (ii) le pH de la solution résultante est inférieur à 8,5.
- 2. Composition selon la revendication 1, ladite composition caractérisée en ce que lorsque ladite composition comprend de l'eau, le pH se situe au sein d'une plage choisie dans le groupe constitué de : (a) une plage où (i) la limite supérieure est inférieure à 8,5 ; inférieure à 8,4 ; inférieure à 8,3 ; inférieure à 8,2 ; inférieure à 8,1 ; inférieure à 8,0 ; inférieure à 7,9 ; inférieure à 7,8 ; inférieure à 7,7 ; inférieure à 7,6 ; ou inférieure à 7,5 ; et (ii) la limite inférieure est supérieure à 7,4 ; supérieure à 7,5 ; supérieure à 7,6 ; supérieure à 7,7 ; supérieure à 7,8 ; supérieure à 7,9 ; supérieure à 8,0 ; supérieure à 8,1 ; supérieure à 8,2 ; supérieure à 8,3 ; ou supérieure à 8,4 ; (b) une plage entre 7,4 et 8,5, compris ; entre 7,5 et 8,5, compris ; entre 7,6 et 8,3, compris ; entre 7,7 et 8,3, compris ; entre 7,8 et 8,3, compris ; entre 7,9 et 8,3, compris ; entre 8,0 et 8,3, compris ; entre 8,1 et 8,3, compris. (c) une plage où le pH n'est pas à plus de ± 0,2 unité de pH en dehors de la plage de (a) ou (b).
- 3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en outre en ce que lorsque ladite composition comprend de l'eau, l'arginine comprend les espèces suivantes : (a)Formule V et '(b) Formule IV.
- 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en outre en ce que lorsque ladite composition comprend de l'eau, la concentration de l'espèce de (a) formule V est au moins de 14 mM, et le rapport molaire de l'espèce de (a) Formule V sur l'espèce de (b) Formule IV se situe au sein d'une plage choisie dans le groupe constitué de : (a) entre 0,091 et 0,200 ; (b) entre 0,032 et 0,323 ; (c) entre 0,041 et 0,323 ; (d) entre 0,051 et 0,256.; (e) entre 0,064 et 0,256 ; et (f) entre 0,081 et 0,204.
- 5. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la première molécule immunogène est Mag-Tn3.
- 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la seconde molécule immunogène comprend un oligonucléotide CpG.
- 7. Composition selon la revendication 6, dans laquelle l'oligonucléotide est choisi dans le groupe constitué de : SEQ ID NO : 1 ; SEQ ID NO : 2 ; SEQ ID NO : 3 ; SEQ ID NO : 4 ; SEQ ID NO : 5 ; et SEQ ID NO : 6.
- 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un cryoprotecteur.
- 9. Composition selon la revendication 8, dans laquelle le cryoprotecteur est choisi dans le groupe constitué de saccharose et de tréhalose.
- 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le contre-ion est le chlorure.
- 11. Composition selon la revendication 10, dans laquelle une partie de l'arginine est présente sous la forme de l'espèce monochlorhydrate d'arginine.
- 12. Composition selon la revendication 11, où la composition est séchée, et le rapport arginine/ monochlorhydrate d'arginine est de 20/150 (mol/mol).
- 13. Composition selon la revendication 12, dans laquelle le rapport arginine/monochlorhydrate d'arginine est de 1,74/15,8 (p/p).
- 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13 comprenant (i) entre 30 et 450 μg de MAG-Tn3, compris ; (ii) 475 μg de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 0,87 mg d'arginine ; (iv) 7,9 mg de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,216 mg de Polysorbate 80 ; et (vi) 10 mg de saccharose.
- 15. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, comprenant en outre de l'eau.
- 16. Composition selon la revendication 15, dans laquelle la première molécule immunogène comprend du MAG-Tn3 et est présente à une concentration inférieure à 900 μg/ml.
- 17. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16, dans laquelle la seconde molécule immunogène est un oligonucléotide CpG et l'oligonucléotide CpG est présent à une concentration entre 760 et 1140 μg/ml, compris.
- 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, dans laquelle l'arginine est présente à une concentration d'au moins 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, ou 40 mM.
- 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, dans laquelle l'arginine est présente à une concentration de 25 mM.
- 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, dans laquelle l'arginine est présente à une concentration de 20 mM.
- 21. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 20, dans laquelle le monochlorhydrate d'arginine est présent à une concentration d'au moins 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 18Ö, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, ou 300 mM.
- 22. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, dans laquelle le monochlorhydrate d'arginine est présent à une concentration de 187,5 mM.
- 23. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 22, comprenant (i) entre 60 et 900 μg/ml de MAG-Tn3, compris ; (ii) 950 μρ/πιΐ de CpG 7 90 9 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 25 mM d'arginine ; (iv) 187,5 mM de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,108 % p/v de Polysorbate 80 ; et (vi) 5 % p/v de saccharose.
- 24. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, dans laquelle le monochlorhydrate d'arginine est présent à une concentration de 150 mM.
- 25. Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 21 et 24, comprenant (i) entre 48 et 72 0 μς/ιτί de MAG-Tn3, compris ; ( i i ) 7 60 μς/ιτιΐ de CpG 7 90 9 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 20 mM d'arginine ; (iv) 150 mM de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,0864 % p/v de Polysorbate 80 ; et (vi) 4 % p/v de saccharose.
- 26. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 15 à 25, comprenant en outre (a) une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants, où au moins l'un desdits adjuvants est choisi dans le groupe constitué de MPL et de QS21 ; et (b) une composition d'adjuvant comprenant des liposomes et un ou plusieurs adjuvants, où au moins l'un desdits adjuvants est choisi dans le groupe constitué de MPL et de QS21.
- 27. Composition selon la revendication 26, comprenant (i) entre 48 et 720 μρ/ιηΐ de MAG-Tn3, compris ; (ii) 760 μρ/ml de CpG 7909 (SEQ ID NO : 4) ; (iii) 20 mM d'arginine ; (iv) 150 mM de monochlorhydrate d'arginine ; (v) 0,0864 % p/v de Polysorbate 80 ; et (vi) 4 % p/v de saccharose ; (vii) 150 mM de NaCl ; (viii) 8 mM de KH2PO4 et 2 mM de Na2HP04 ; (ix) 50 μΐ/ml de MPL ; (x) 100 μρ/ml de liposomes ; et (xi) 100 μρ/ml de QS21.
- 28. Procédé de fabrication de la composition vaccinale essentiellement stable selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 15 à 27, comprenant la combinaison des composants comprenant : (a) de l'arginine ; (b) une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et (c) une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative ; dans lequel un ou plusieurs de (a) à (c) sont combinés avec un liquide comprenant de l'eau et où le pH de ladite composition est de 8,5 ou inférieur.
- 29. Procédé selon la revendication 28, comprenant en outre une étape d'ajustement du pH de l'arginine par neutralisation avec un acide approprié.
- 30. Procédé de fabrication de la composition vaccinale essentiellement stable selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 15 à 27, comprenant la combinaison des composants comprenant : (a) de l'arginine ; (b) du monochlorhydrate d'arginine ; (c) une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et (d) une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative ; dans lequel un ou plusieurs de (a) à (d) sont combinés avec un liquide comprenant de l'eau et un adjuvant.
- 31. Procédé de fabrication de la composition vaccinale essentiellement stable selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, comprenant la combinaison des composants comprenant : (a) de l'arginine ; (b) du monochlorhydrate d'arginine ; (c) une première molécule immunogène comprenant un groupe Tn, où la première molécule immunogène a une charge nette positive ; et (d) une seconde molécule immunogène comprenant un oligonucléotide, où la seconde molécule immunogène a une charge nette négative ; dans lequel un ou plusieurs de (a) à (d) sont combinés avec un liquide comprenant de l'eau, comprenant en outre une étape de séchage de la composition.
- 32. Procédé selon la revendication 31, dans lequel l'étape de séchage comprend une lyophilisation.
- 33. Procédé de fabrication d'une composition vaccinale essentiellement stable comprenant les étapes de combinaison de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 avec un liquide comprenant de l'eau.
- 34. Procédé de fabrication d'une composition vaccinale essentiellement stable comprenant les étapes de combinaison de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 avec un liquide comprenant de l'eau, où le liquide comprend en outre une composition d'adjuvant comprenant un ou plusieurs adjuvants, où au moins l'un desdits adjuvants est choisi dans le groupe constitué de MPL et de QS21.
- 35. Procédé selon la revendication 34, dans lequel la composition d'adjuvant comprend en outre des liposomes.
- 36. Composition produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 28 à 35.
- 37. Méthode de traitement d'un patient comprenant les étapes d'administration d'une composition selon les revendications 1 à 11 et 15 à 27 à un être humain.
- 38. Utilisation de monochlorhydrate d'arginine en tant qu'additif pour stabiliser une composition vaccinale.
- 39. Méthode d'induction d'une réponse immunogène comprenant les étapes d'administration d'une composition selon les revendications 1 à 11 et 15 à 27 à un être humain.
- 40. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 27 pour une utilisation en médecine, comme pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire.
- 41. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, dans laquelle la première molécule immunogène est Mag-Tn3, pour une utilisation dans le traitement du cancer.
- 42. Récipient comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 27 et 36.
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