CN105592857A - 糖疫苗制剂 - Google Patents
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Abstract
提供基本上稳定的疫苗组合物，以及它们的使用和制造方法。
Description
技术领域
本发明涉及包含带相反电荷的免疫原性分子的糖疫苗的改进制剂。
背景
MAG-Tn3是大小近似11KDa的糖-肽抗原。MAG-Tn3存在于显著比例的人癌症中，且被认为是免疫治疗的候选抗原。
对于免疫治疗，MAG-Tn3可能与免疫刺激剂组合。一种示例性免疫刺激剂是CpG寡脱氧核苷酸。
当制造疫苗时，产生含有一种或多种免疫原性分子的最终液体组合物，通常被称为“最终材料（final bulk）”。为了便于储存，最终材料可以干燥(例如，通过冻干)。干燥疫苗，有时被称为冻干饼，可以重构于药学上可接受的溶剂，诸如水、缓冲液等，并且可以被称为‘最终容器’。
MAG-Tn3/CpG最终材料可能被冻干以产生最终产品以便于储存。该最终产品可能重构于缓冲系统或佐剂系统中用于施用于患者。
当配制分子用于疫苗用途时，不确定所述组合物将是稳定的。例如，分子可以在标准条件下聚集或沉淀。即使克服此类问题，也可以发生一种或多种组分的物理或化学降解。需要克服此类限制的组合物和方法。进一步，当单独配制时稳定的分子在其它分子存在的情况下可以经历共沉淀。
发明概述
提供基本上稳定的疫苗组合物，所述组合物包含精氨酸；平衡离子；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷；所述组合物的特征在于当所述组合物包含水时，(i)所述第一和第二免疫原性分子是基本上稳定的；且(ii)所得溶液的pH小于8.5。在某些方面，所述第一免疫原性分子是Mag-Tn3。在某些方面，所述第二免疫原性分子包含CpG寡核苷酸。在某些方面，一部分精氨酸作为精氨酸单盐酸盐的种类存在。在某些方面，将所述组合物干燥。在某些方面，所述组合物包含水。
在某些方面，所述组合物进一步包含佐剂组合物，所述佐剂组合物包含佐剂MPL和QS21中的一者或两者。在某些方面，所述佐剂组合物任选地进一步包含脂质体。
还提供用于制备基本上稳定的疫苗组合物的工艺，所述工艺包括组合以下的步骤：精氨酸；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷；其中前述组分中的一种或多种与包含水的液体组合，且其中所述组合物的pH为8.5或更小。还提供通过这些工艺产生的组合物。
提供用于治疗患者的方法，所述方法包括将如本文公开的组合物施用于人的步骤。还提供用途，特别是精氨酸单盐酸盐作为基本上稳定的疫苗组合物的添加剂的用途。
还提供包含如本文公开的组合物的容器。
附图简述
图1：分开混合的CpG7909和MAG-Tn3配制程序的流程图。
图2：标准配制流程图。第一步骤中使用的赋形剂列于表2中。
图3：谷氨酸/赖氨酸和谷氨酸/精氨酸和1.0%w/v Empigen制剂在4℃24小时之后的还原SDS-PAGE。MAG-Tn3是在近似15KDa的主要条带。箭头突出沉淀级分中发现的条带，且虚线圆和点线圆突出条带强度的增加；虚线比点线强度更高。在10mM琥珀酸盐pH 5.0缓冲液中稀释的MAG-Tn3 PB中的对照，其被验证为用于单独MAG-Tn3的最稳定缓冲系统。该凝胶使用SilverExpress染色。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分，MW：分子量标记。
图4：Tris-马来酸盐制剂在4℃24小时之后的SDS-PAGE。MAG-Tn3是在近似15KDa的主要条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。箭头突出沉淀级分中发现的条带，且虚线突出条带强度的增加。在10mM琥珀酸盐pH 5.0缓冲液中稀释的MAG-Tn3 PB中的对照，其被验证为用于单独MAG-Tn3的最稳定缓冲系统。该凝胶使用染色CpG7909的Silver Quest进行染色。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分，MW：分子量标记。
图5：精氨酸和组氨酸制剂的还原SDS-PAGE。MAG-tn3是在近似15KDa的主要条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。箭头突出沉淀级分中发现de 条带。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分。
图6：L-精氨酸筛选制剂的还原SDS-PAGE。MAG-Tn3是在近似15KDa的主要条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分。与其它制剂相比，在15mM L-精氨酸制剂的沉淀级分中观察到稍微更强条带(上面圈出)。
图7：15-35mM L-精氨酸制剂的HPLC-SEC荧光色谱叠加。
图8：L-精氨酸单盐酸盐筛选制剂的还原SDS-PAGE。MAG-Tn3是在近似15KDa的主要条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分。从225mM至300mM L-精氨酸单盐酸盐观察到沉淀级分中的稍微更强条带，上面圈出。
图9：100-200mM L-精氨酸单盐酸盐制剂的HPLC-SEC荧光色谱叠加。
图10：剂量范围制剂的还原SDS-PAGE。MAG-Tn3是在近似15KDa的主要条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。箭头表明最高MAG-Tn3浓度的沉淀级分的轻微条带。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分。MAG-Tn3纯化的原料对照已经上样于孔2-4中。
图11：200-900ug/mL MAG-Tn3制剂的大小排阻概况的色谱叠加。
图12：剂量范围制剂的还原SDS-PAGE。MAG-Tn3是在近似15KDa的主要条带；较低条带对应于在近似8KDa的CpG。箭头表明较高MAG-Tn3浓度的沉淀级分中的轻微条带。孔18中存在的较高分子量条带是异常的。NC：未离心，SN：上清液，P：重悬的沉淀级分。
图13：420、270和180ug CpG7909/剂量模拟最终容器在T0的HPLC-SEC色谱叠加。
图14：420ug CpG7909/剂量MAG-Tn3制剂在25℃孵育T0、4和24小时的HPLC-SEC叠加。
图15：180、270和420ug CpG/剂量MAG-Tn3制剂在25℃孵育24小时的HPLC-SEC色谱。
详述
申请人发现，在溶液中组合MAG-Tn3和CpG分子引起瞬时共沉淀，并且当使用标准赋形剂时，当重构冻干的干燥饼时，它是不溶解的。
本发明人已经令人惊讶地发现，在用于与具有净正电荷的第一免疫原性分子组合具有净负电荷的第二免疫原性分子一起使用的制剂中包括精氨酸(包含精氨酸单盐酸盐种类级分)允许合适用作哺乳动物受试者中的可注射疫苗的稳定性和pH的合适组合。
包含精氨酸的组合物
在本文某些方面，本公开提供包含精氨酸、平衡离子、具有净正电荷的第一免疫原性分子和具有净负电荷的第二免疫原性分子的疫苗组合物，所述组合物的特征在于当所述组合物包含药学上可接受的溶剂时，(i)所述第一免疫原性分子和所述第二免疫原性分子是基本上稳定的；且(ii)pH小于8.5。
在某些方面，所述第一免疫原性分子包含碳水化合物基团。在某些方面，所述第一免疫原性分子包含Tn基团。在某些方面，所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3。
在本文某些方面，所述第二免疫原性分子包含寡核苷酸。在某些方面，所述寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸。在某些方面，所述寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸。在某些方面，所述寡核苷酸是CpG7909。
精氨酸
精氨酸可以作为L-或D-形式或两者的混合物存在。L-精氨酸也称为L-(+)-精氨酸2-氨基-5-胍基戊酸；2-氨基-5-胍基戊酸酯；L-a-氨基-d-胍基戊酸酯L-α-氨基-δ-胍基戊酸；L-a-氨基-d-胍基戊酸；N5-(氨基亚氨基甲基)-L-鸟氨酸L-α-氨基-δ-胍基戊酸酯；5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-L-正缬氨酸(S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]戊酸；(S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-戊酸酯(S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]戊酸酯；和(S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-戊酸。
精氨酸由式I代表：
精氨酸可以用盐酸或具有除了氯化物以外的共轭碱的酸中和，导致产生精氨酸•H-X，其中X包括但不限于Cl-、SO4 -2和柠檬酸根。
在本文某些方面，精氨酸的种类包括精氨酸单盐酸盐。
精氨酸单盐酸盐可以作为L-或D-形式或两者的混合物存在。它也称为(2S)-2-氨基-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]戊酸单盐酸盐、精氨酸盐酸盐和精氨酸•HCl。精氨酸单盐酸盐可以通过用盐酸中和精氨酸来制造。精氨酸单盐酸盐由式II代表。
精氨酸和精氨酸•HCl用于细胞培养基和药物开发。氨基酸精氨酸用作溶液添加剂以针对蛋白-蛋白聚集稳定蛋白，特别是在蛋白重折叠的过程中。参见Baynes等人 (2005)Biochemistry 44:4919-4925；Tsumoto等人(2004) Biotechnol. Prog. 20:1301-1308.如Baynes中所解释，聚集是非天然蛋白构象装配成多聚态，经常导致相分离和沉淀。溶液中精氨酸的存在显示在两个模型系统中减缓蛋白-蛋白结合反应：胰岛素与单克隆抗体的结合和碳酸酐酶II (CA)的折叠中间体和聚集体的结合。精氨酸用作人血清白蛋白的替代，以保护治疗性蛋白(包括糖蛋白)免于降解。参见Kim (2009) Biosci Biotechnol Biochem.73:61-6。
因为溶液中的精氨酸是多元酸/碱系统，所以它与四种不同的质子化/电荷状态结合。精氨酸的溶液将包含具有不同的质子化状态的种类的混合物。这些状态如下：
1. “H3B2+”，
当平衡离子为2 Cl-时，式III的质子化状态被称为精氨酸二盐酸盐。
2. “H2B+”，
当平衡离子为Cl-时，式IV的质子化状态被称为精氨酸单盐酸盐，或精氨酸•HCl。
3. “HB”
式V的质子化状态被称为精氨酸碱。
4. “B-”
当平衡离子为Na+或K+时，式VI的质子化状态被称为精氨酸钠或精氨酸钾。
精氨酸的质子化/去质子化根据以下方案进行。
“免疫原性分子”意指能够在受试者中诱导免疫应答的分子。
本文术语“分子”包括但不限于大分子、寡聚体分子和单体。“大分子”意指高相对分子量的聚合分子，其结构基本上包含实际上或概念上衍生自相对低分子量的分子的单元的多重重复，包括多糖、多肽、核酸等，以及具有大分子量的非聚合分子，诸如脂质和大环化合物。“寡聚物分子”意指中间相对分子量的分子，其结构基本上包含实际上或概念上衍生自较低相对分子量的分子的小多个单元。“单体”是指可以经历聚合的分子。
分子的“净电荷”意指在给定pH或pH范围分子上的正电荷和负电荷的算术总和。具有“净正电荷”的分子在给定pH或pH范围将具有多数正电荷；同样，具有“净负电荷”的分子在给定pH或pH范围将具有多数负电荷。适用的pH或pH范围是包含相关分子的溶液的pH或pH范围。
包含Tn基团的碳水化合物基团
在本文某些方面，本公开提供包含碳水化合物基团或碳水化合物抗原的免疫原性分子。
“碳水化合物基团”意指化学连接至分子的另一部分的分子的碳水化合物部分。因此，碳水化合物基团可以结合至另一碳水化合物分子或另一类的分子，诸如蛋白(或肽)。具有碳水化合物基团的示例性分子包括寡糖、多糖、糖肽、糖蛋白等，其中一些可以是碳水化合物抗原。
“碳水化合物抗原”意指基于糖的抗原，包括细菌荚膜多糖、肿瘤相关的碳水化合物抗原等。
在本文某些方面，本公开提供包含Tn基团的免疫原性分子。
“Tn”或“Tn基团”意指如Morrelli (2011) Eur. J. Org. Chem. 5723-5777中描述的血型糖蛋白家族的成员。Tn可以被描述为经由糖苷键连接至丝氨酸或苏氨酸残基的N-乙酰半乳糖胺。因此，包含Tn的分子将具有一个或多个Tn基团。
在本文某些方面，本公开提供包含MAG-Tn3的免疫原性分子。
“MAG-Tn3”公开于EP2500033A1中，且具有以下结构：
因此，MAG-Tn3对应于式IV的碳水化合物肽缀合物B4-T4-M：
其中
-KKK是树枝状聚赖氨酸核心(M)，
-T是具有以下序列的肽CD4+ T细胞表位：QYIKANSKFIGITEL
-Tn3是具有以下序列的三-Tn B细胞表位：(α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thr。
MAG-Tn3具有9.8-10的估计pI，并且因此在中性pH带非常正的电荷。
寡核苷酸
“免疫刺激性寡核苷酸”意指包含免疫刺激性DNA基序的寡核苷酸。免疫刺激性DNA基序描述于Sato等人.(1996) Science 273:352。示例性免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)，其主要诱导Th1应答。此类寡核苷酸是众所周知的并且描述于，例如WO 96/02555、WO 99/33488 和美国专利号6,008,200和5,856,462。
示例性的含有CpG的寡核苷酸包括以下具体序列：
CpG7909是具有近似8 KDa的硫代磷酸酯骨架的合成单链24聚体寡脱氧核苷酸，并且具有在中性pH具有23个负电荷。
术语“基本上稳定的”意欲描述其中溶质不从溶液中沉淀出来的溶液。也就是说，一旦在目的溶质已经溶解于溶液中之后已经经过有限时间段T1，多于70％的溶质将留在溶液中，即多于71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或更多溶质将留在溶液中。
有限时间段T1可以是长于1小时的任何时间段，即1、2、3、5、10、20、20、30、50、75、100、150、200、250、500、750、1000、1500或更多小时。
稳定性可以通过多种方法，包括，例如，通过测量过滤后损失，测定沉淀级分中目的溶质的存在(通过SDS-PAGE或等效方法)，或通过测定目的溶质的聚集概况，进行评价。
在本文某些方面，所述组合物的特征在于，当所述组合物包含水时，所述组合物的pH在这样的范围内，其中上限pH为小于 8.5；小于8.4；小于8.3；小于8.2；小于8.1；小于8.0；小于7.9；小于7.8；小于7.7；小于7.6；或小于7.5，且下限为大于7.4；大于7.5；大于7.6；大于7.7；大于7.8；大于7.9；大于8.0；大于8.1；大于8.2；大于8.3；或大于8.4。本文某些方面，pH为7.4和8.5之间，包括端值；7.5和8.5之间，包括端值；7.6和8.3之间，包括端值；7.7和8.3之间，包括端值；7.8和8.3之间，包括端值；7.9和8.3之间，包括端值；8.0和8.3之间，包括端值，8.1和8.3之间，包括端值。
用于实现组合物的期望pH的方法包括用合适的酸诸如盐酸中和精氨酸溶液，或组合必需量的精氨酸和精氨酸•H-X以产生溶液中期望的pH。在某些方面，精氨酸•H-X是精氨酸单盐酸盐。得到期望pH所必需的精氨酸：精氨酸单盐酸盐的比率可以使用已知的方法诸如Henderson–Hasselbalch方程容易地计算，其中
pH = pKα + log ([去质子化的Arg]/[质子化的Arg]) 方程1。
例如，图表1记载由精氨酸：精氨酸-HCl的各种摩尔比导致的计算pH。
表1. 对于包含各种摩尔比的Arg :ArgHCl的溶液使用方程1计算的pH值(Arg pKa =8.991)。
如所理解，所产生的溶液的实际pH可以通过常规方式诸如pH计进行确认和调整。在本文某些方面，实际pH距计算的pH值不多于± 0.2个pH单位，或者在计算的pH范围之外不多于± 0.2个pH单位。
在本文某些方面，所述组合物的特征在于，当所述组合物包含水时，精氨酸包含下列种类：
和
在某些方面，种类(a)与种类(b)的摩尔比为7:220 (0.032)和71:220 (0.323)之间。在某些方面，种类(a)与种类(b)的摩尔比为1:11 (0.091)和1:5 (0.200)之间。在某些方面，式V为至少14 mM，且种类(a)式V与种类(b)式IV的摩尔比在选自以下的范围内：(a)0.091和0.200之间；(b) 0.032和0.323之间；(c) 0.041和0.323之间；(d) 0.051和 0.256之间；(e) 0.064和 0.256之间；和(f) 0.081和 0.204之间。
冷冻保护剂
在本文某些方面，所述组合物包含冷冻保护剂。
“冷冻保护剂”意指用于保护生物分子免受冷冻条件诸如在冷冻干燥或冻干过程中遇到的条件的影响的物质。示例性冷冻保护剂包括碳水化合物类诸如糖蔗糖，糖醇类诸如甘露糖醇，表面活性剂类诸如聚山梨醇酯，以及甘油和二甲基亚砜。示例性碳水化合物类包括糖类和双糖类。示例性二糖类包括蔗糖和海藻糖。
佐剂
在本文某些方面，所述组合物和方法还包括佐剂组合物，所述佐剂组合物包含一种或多种佐剂。在适于施用于受试者诸如人受试者用于引发免疫应答的目的的免疫原性组合物的背景下，选择所述佐剂组合物以引发偏向Th1的免疫应答。通常选择所述佐剂组合物以增强施用所述组合物的受试者或受试者群体中的偏向Th1的免疫应答。
“Th1”型免疫应答的特征在于诱导产生IL-2和IFN-γ的CD4+ T辅助细胞。
相比之下，“Th2”型免疫应答的特征在于诱导产生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+辅助细胞。
TLR4调节剂
一种合适的佐剂是TLR-4调节剂。一个实例是脂质A的无毒衍生物，是单磷酰脂质A或更具体地3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以名称MPL销售，在本文件全文中称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。3D-MPL可以根据GB2220211 A中公开的方法生产。在化学上，它是具有3、4、5或6个酰基化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL的颗粒大小使它可以通过0.22μm过滤器过滤除菌。WO94/21292中描述了此类制品。
在其它实施方案中，脂多糖可以是如美国专利号6,005,099和欧洲专利号0 729473 B1中描述的β(1-6)葡萄糖胺二糖。本领域技术人员基于这些文献中的教导，能够容易产生各种脂多糖，诸如3D-MPL。不管怎样，这些文献各自通过引用并入本文。除了以上提及的免疫刺激剂(与LPS或MPL或3D-MPL结构相似的)以外，作为以上MPL结构的亚部分的酰基化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其它实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中的一些被描述为TLR-4激动剂，包括但不限于：OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-α-D -吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯) (WO 95/14026)；OM 294 DP (3S，9R)-3--[(R)-十二酰基氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸烷-1，10-二醇1，10-双(二氢磷酸酯)( WO 99/64301 和 WO 00/0462)；和OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰基氧基十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。
皂苷佐剂
可以用于本文免疫原性组合物的其它佐剂，例如其单独或与3D-MPL或本文描述的另一种佐剂组合使用的其它佐剂是皂苷，诸如QS21。
Lacaille-Dubois, M和Wagner H. (1996. A review of the biological andpharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)中教导了皂苷。皂苷是广泛分布在植物和海洋动物界的类固醇或三萜糖苷。皂苷的特点是在水中形成摇动后发泡的胶态溶液且沉淀胆固醇。当皂苷靠近细胞膜时，它们在膜中生成引起膜破裂的孔样结构。红细胞的溶血是该现象的一个实例，这是某些但非所有皂苷的特性。
皂苷已知作为用于全身施用的疫苗中的佐剂。个别皂苷的佐剂和溶血活性在本领域中已有广泛研究(Lacaille-Dubois和Wagner，同上)。例如，Quil A (来源于南美树种莫利那肥皂草皂树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其级分描述于US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug CarrierSyst, 1996, 12 (1-2):1-55；以及EP 0 362 279 B1。包含Quil A的级分的微粒结构，被称为免疫刺激复合物(Immune Stimulating Complexes，ISCOMS)是溶血性的，已被用于疫苗制造中(Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(Quil A的HPLC纯化级分)已被描述为有效的全身性佐剂，且它们的生产方法公开于美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 B1，其通过引用并入本文。已用于全身性疫苗接种研究的其它皂苷包括源自其它植物物种，诸如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的皂苷(Bomford等人，Vaccine, 10(9):572-577, 1992)。
此类包含QS21和胆固醇的制剂已显示当与抗原一起配制时是成功的Th1刺激佐剂。
其它分子
在某些方面，本文组合物中可以包括一种或多种其它分子，包括非离子表面活性剂和乳化剂，诸如聚山梨醇酯80(可得自ICI Americas, Inc.的Tween™ 80)，赋形剂，缓冲剂等，诸如磷酸钠，磷酸钾等。
液体
在某些方面，本文组合物包含水。在某些方面，精氨酸以至少15mM(即16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40mM或更高)的浓度存在。在某些方面，精氨酸单盐酸盐以至少45mM(即50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300mM或更高)的浓度存在。
最终材料
在某些方面，所述组合物包含水，且所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3且以小于或等于900 µg/ml的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3且以60 - 900 µg/mL(包括端值)的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且寡核苷酸以小于1140 µg/ml的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且寡核苷酸以760 – 1140 µg/ml(包括端值)的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且寡核苷酸以950 µg/ml的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且精氨酸以25mM的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且精氨酸单盐酸盐以187.5mM的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水和(i)60 - 900 µg/mL(包括端值)MAG-Tn3；(ii) 950 µg/mL CpG 7909 (SEQID NO:4)；(iii) 25 mM精氨酸；(iv) 187.5 mM精氨酸单盐酸盐；(v) 0.108 % w/v聚山梨醇酯80；和(vi) 5 % w/v蔗糖。
干燥饼
在某些方面，所述组合物是干燥的，且精氨酸：精氨酸单盐酸盐的比率为20:150 (mol:mol)或1.74:15.8 (wt:wt)。在某些方面，干燥的组合物包含380 - 570 µg CpG 7909 (SEQID NO:4)。在某些方面，干燥组合物包含(i) 30 - 450 µg(包括端值) MAG-Tn3；(ii) 475µg CpG 7909 (SEQ ID NO:4)；(iii) 0.87 mg精氨酸；(iv) 7.9 mg精氨酸单盐酸盐；(v)0.216 mg聚山梨醇酯80；和(vi) 10 mg蔗糖。
最终容器
在某些方面，所述组合物包含水，且所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3且以小于720µg/ml的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3且以48 - 720 µg/mL(包括端值)的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且寡核苷酸以608 – 912 µg/ml(包括端值)的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且寡核苷酸以760 µg/ml的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且精氨酸以20mM的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水，且精氨酸单盐酸盐以150mM的浓度存在。在某些方面，所述组合物包含水和(i)48 - 720 µg/mL(包括端值)MAG-Tn3；(ii) 760 µg/mL CpG 7909 (SEQID NO:4)；(iii) 20 mM精氨酸；(iv) 150 mM精氨酸单盐酸盐；(v) 0.0864 % w/v聚山梨醇酯80；和(vi) 4 % w/v蔗糖。在某些方面，所述组合物包含水和(i)48 - 720 µg/mL(包括端值)MAG-Tn3；(ii) 760 µg/mL CpG 7909 (SEQ ID NO:4)；(iii) 20 mM精氨酸；(iv) 150mM精氨酸单盐酸盐；(v) 0.0864 % w/v聚山梨醇酯80；和(vi) 4 % w/v蔗糖；(vii) 150 mMNaCl；(viii) 8mM KH2PO4和2mM Na2HPO4；(ix) 50 µL/mL MPL；(x) 100 µg/mL脂质体；和(xi) 100 µg/mL QS21。
工艺和方法
在某些方面，提供用于制备本文基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括在单一步骤中、或在几个步骤中组合其组分。在某些方面，提供用于制备本文基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合组分的步骤，所述组分包含精氨酸；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷。在某些方面，提供用于制备本文基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括多个组合组分的步骤，所述组分包含精氨酸；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷。在某些方面，精氨酸可以包含具有平衡离子的种类。在某些方面，提供用于制备本文基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合组分的步骤，所述组分包含精氨酸；精氨酸单盐酸盐；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷。在某些方面，提供用于制备本文基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括多个组合组分的步骤，所述组分包含精氨酸；精氨酸单盐酸盐；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷。在某些方面，提供用于制备本文基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括多个组合以下组分的步骤：精氨酸；精氨酸单盐酸盐；包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷。这些组分中的一种或多种与包含水的液体组合。标准方法可以用于组合这些组分。通常，制备包含精氨酸和精氨酸单盐酸盐种类的储备溶液，然后将其与其它组分的储备溶液混合。或者，精氨酸单盐酸盐可以通过用盐酸中和精氨酸来制备。当期望不同的平衡离子时，可以使用利用不同酸的类似方法。
例如，当免疫原性分子分别是MAG-Tn3和CpG时，可以遵循以下配制方案：使用500mM L-精氨酸和1M L-精氨酸单盐酸盐的储备溶液，可以通过将31.3mM L-精氨酸和187.5mM L-精氨酸单盐酸盐添加至注射用水中的5%蔗糖溶液(可得自Thermo-Fisher)而制备制剂。MAG-Tn3和CpG都是商业可得的，且可以遵循制造商的用于制备这些分子的储备溶液的方案。然后将CpG7909(可得自Agilent)以1050µg/mL的浓度添加至溶液。然后将溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将获得自Lonza Braine的MAG-Tn3以范围为250-1125µg/mL的浓度添加至溶液中。然后将该溶液以150 rpm再磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mMNa2HPO4/KH2PO4 150mM NaCl pH 6.1的溶液中稀释1.25倍。参见实施例3和4。
在某些方面，提供用于干燥组合物的工艺。标准技术可用于干燥所述组合物，包括冷冻干燥、冻干等。可以使用标准冻干方案。在一个方面，使用64小时冻干循环，其中在冷冻循环的初级干燥阶段过程中避免低于-34.5℃的产品温度。例如，条件可以包括在-52℃的1小时的初级冷冻，随后初级干燥，其中温度在2.5-3.5小时内增加至-27℃和-37℃之间。然后温度可以保持近似27至37小时。然后，初级干燥温度可以经4.25-5.75小时期间斜变室温直至-23℃和-33℃之间。该温度可以保持4.25-5.75小时。所有初级干燥可以用45µbar(34mTorr)的腔室压力来进行。次级干燥可以在15-75µbar (11-56mTorr)的腔室压力下用在5.4-6.6小时内斜变室温直至32-42℃的温度开始，且在10-45µbar (8-34mTorr)的压力下保持10.8-13.2小时。
在某些方面，提供用于组合组合物与包含水的液体的工艺，其中所述液体进一步包含含有一种或多种佐剂的佐剂组合物，其中所述佐剂中的至少一种选自MPL和QS21。在某些方面，提供用于重构干燥组合物的工艺，其包括组合干燥组合物与包含水的液体的步骤，其中所述液体进一步包含含有一种或多种佐剂的佐剂组合物，所述佐剂选自MPL和QS21。在某些方面，所述佐剂进一步包含脂质体。
在某些方面，提供根据前述工艺的产品。
在某些方面，本文组合物可以存在于一个或多个容器中。例如，第一容器可以包含精氨酸和第一和第二免疫原性分子，而第二个容器可以包含含有一种或多种佐剂的佐剂组合物，所述佐剂选自MPL和QS21。或者，一个容器可以包含精氨酸、第一和第二免疫原性分子和包含一种或多种选自MPL和QS21的佐剂的佐剂组合物。在某些方面，提供包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器包含本文提供的组合物。
在某些方面，提供用于治疗患者的方法，其包括施用本文所述的组合物的步骤。在某些方面，提供诱导免疫原性应答的方法，其包括将组合物施用于人的步骤。施用可以通过注射。
在一些方面，提供精氨酸单盐酸盐作为稳定疫苗组合物的添加剂的用途。
在一些方面，本文提供的组合物用于药物中使用，诸如用于诱导免疫应答中使用。在一些方面，所述组合物用于治疗癌症中使用，其中所述第一免疫原性分子是Mag-Tn3。在一些方面，所述组合物用于治疗乳腺癌中使用，其中所述第一免疫原性分子是Mag-Tn3。
除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。除非上下文明确另有说明，否则单数术语“一个(种)(a)”、“一个(种)(an)”和“该(所述)(the)”)包括复数指示物。类似地，单词“或”意欲包括“和”，除非上下文明确另有说明。术语“多个(种)(plurality)”是指两个(种)或更多个(种)。此外，关于物质的浓度或水平给出的数值，诸如溶液组分浓度或其比率，和反应条件诸如温度、压力和循环时间，意在是近似的。因此，当pH被指示为至少pH 7.5时，意欲pH被理解为至少近似(或“约”或“~”)pH 7.5，即，至少7.5 ± 0.2个pH单位。
本发明将通过参考以下非限制性附图和实施例进一步描述。
实施例
实施例1. 赋形剂筛选 确定用于Mag-Tn3和CpG7909的合适的缓冲系统
将用于MAG-Tn3抗原的目标剂量设定在500µg/剂量。在免疫刺激剂CpG7909存在的情况下，MAG-Tn3抗原瞬时共沉淀。尝试多种缓冲系统以试图增溶该抗原-免疫刺激剂组合。该报告将详述试图增溶MAG-Tn3和CpG7909中尝试的许多缓冲剂和赋形剂组合。
MAG-Tn3是大小近似11KDa的糖-肽抗原。其具有9.8-10的估计pI，并且因此在中性pH带非常正的电荷。该抗原与免疫刺激剂CpG7909组合以配制成冻干疫苗，将冻干疫苗重构于被称为AS01B的佐剂系统中。CpG7909是具有近似8 KDa的硫代磷酸酯骨架的合成单链24聚体寡脱氧核苷酸，并且具有在中性pH具有23个负电荷。这两种分子的不添加赋形剂的组合引起瞬时共沉淀。
在最终材料水平进行增溶MAG-Tn3和CpG7909的初步尝试，其中没有评价与AS01B缓冲系统的相容性。这些实验表明，在最终材料中以18.75mM的浓度添加组氨酸导致产生可溶性制剂。当将该冻干最终产品重构于佐剂缓冲系统中时发现，该制剂不再可溶且共沉淀的问题还没有完全得到解决。
本报告中所述的实验的目的是找到这样的方式，其中MAG-Tn3和CpG7909两者当重构于AS01B缓冲剂中时可以一起配制于可溶性疫苗制剂中。先前实验已经表明有必要从开始就评价佐剂缓冲液中的制剂稳定性，且同样进行本报告中所述的实验。
实验程序.
制剂的制备：进行两种类型的制剂。第一类型的制剂描述于图1。分别配制MAG-Tn3和CpG7909，然后组合。将赋形剂A以如表1中所示的不同浓度添加至注射用水中的5％蔗糖溶液(Thermo-Fisher)中，然后以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将获得自Lonza Braine的MAG-Tn3以2500µg/mL的浓度添加至溶液中，最终剂量为500µg。将该溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。在分开容器中，将赋形剂B添加至注射用水中的5％蔗糖溶液中，且以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将CpG7909 (Agilent)以2100µg/mL的浓度添加至该溶液。然后将该溶液以150rpm磁力搅拌5分钟。然后将两种溶液，MAG-Tn3混合物和CpG混合物，以1:1比率组合，然后以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mM Na2HPO4/KH2PO4 150mM NaCl pH 6.1的溶液(AS01B缓冲液)中稀释1.25倍。然后将该制剂在4℃孵育二十四小时，然后进行分析。
表1：使用图1中概述的分开混合方法测试的缓冲液组合物。
| 制剂目标 | A | B |
| 谷氨酸7mM + 20mM精氨酸 | 谷氨酸17.5mM | 50mM精氨酸 |
| 谷氨酸7mM + 20mM组氨酸 | 谷氨酸17.5mM | 50mM组氨酸 |
| 辛酸钠1.3%w/v + 20mM精氨酸 | 辛酸钠3.25%w/v | 50mM精氨酸 |
| 辛酸钠1.3%w/v + 20mM组氨酸 | 辛酸钠3.25%w/v | 50mM组氨酸 |
| 0.25 , 1.0% w/v Empigen | 0.625 , 2.5% w/v Empigen | 0.625 , 2.5% w/v Empigen |
| 0.25, 1.0% w/v SB3-13 | 0.625, 2.5% w/v SB3-14 | 0.625, 2.5% w/v SB3-15 |
| 10mM谷氨酸- 10mM组氨酸 | 25mM谷氨酸 | 25mM组氨酸 |
| 50mM谷氨酸- 10mM组氨酸 | 125mM谷氨酸 | 25mM组氨酸 |
| 50mM谷氨酸- 50mM组氨酸 | 125mM谷氨酸 | 125mM组氨酸 |
| 10mM谷氨酸- 10mM赖氨酸 | 25mM谷氨酸 | 25mM赖氨酸 |
| 10mM谷氨酸- 50mM赖氨酸 | 25mM谷氨酸 | 125mM赖氨酸 |
| 50mM谷氨酸- 10mM赖氨酸 | 125mM谷氨酸 | 25mM赖氨酸 |
| 50mM谷氨酸- 50mM赖氨酸 | 125mM谷氨酸 | 125mM赖氨酸 |
| 10mM谷氨酸 – 10mM精氨酸 | 25mM谷氨酸 | 25mM精氨酸 |
| 10mM谷氨酸 – 50mM精氨酸 | 25mM谷氨酸 | 125mM精氨酸 |
| 50mM谷氨酸 – 10mM精氨酸 | 125mM谷氨酸 | 25mM精氨酸 |
| 50mM谷氨酸 – 50mM精氨酸 | 125mM谷氨酸 | 125mM精氨酸 |
| 乙酸铵100mM | 乙酸铵100mM | 乙酸铵100mM |
| 10、50mM Tris-马来酸盐 | 10、50mM Tris-马来酸盐 | 10、50mM Tris-马来酸盐 |
| 20、30、40、50、75mM Tris 10mM 马来酸盐 | 25mM 马来酸盐 | 50、75、100、125、187.5mM Tris |
| 10mM Tris-50mM 马来酸盐 | 125mM 马来酸盐 | 25mM Tris |
| 50mM Tris-20、30、40mM 马来酸盐 | 50、75、100mM 马来酸盐 | 125mM Tris |
用于配制的第二种方法是标准流程表(图2)。将所有赋形剂(对于列表参见表2)以不同的浓度添加至注射用水中的5％蔗糖溶液。然后将CpG7909以1050µg/mL的浓度添加至溶液。然后将溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将MAG-Tn3以1250µg/mL的浓度添加至溶液中，最终剂量为500µg。然后将该溶液以150 rpm再磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mMNa2HPO4/KH2PO4 150mM NaCl pH 6.1的溶液中稀释1.25倍。然后将所有制剂在4℃孵育二十四小时，然后进行分析。
表2：在标准流程表中配制的赋形剂的列表。所示浓度是在最终重构容器中发现的浓度。
| 赋形剂 |
| 15mM组氨酸 + 40mM Tris + 0.01%(w/v), 0.1%(w/v) Tween |
| 15mM组氨酸 + 40mM Tris +0.01% (w/v), 0.1% (w/v) Lutrol |
| 15mM组氨酸 + 40mM Tris +0.01% (w/v), 0.1% (w/v) 辛酸钠 |
| 50mM Tris-马来酸盐 |
| 80mM组氨酸 |
| α-环糊精 0.25(w/v),2.5%(w/v) |
| 苯扎氯铵 0.025(w/v), 0.125%(w/v) |
首先目视检查所有样品。如果注意到溶液的任何沉淀或不透明，则不进行其它测试。如果制剂是半透明的，则进行额外分析诸如BCA、HPLC-SEC和SDS-PAGE。进行BCA以评价制剂中的MAG-Tn3含量。使用标准Pierce方案和试剂。使用装备荧光检测器的Waters 2996HPLC(Waters)使用TSKgel G3000PWxl柱(Tosoh Bioscience LLC)和200mM NaCl的流动相(EMD)进行大小排阻色谱以评价所得制剂的聚集概况。使用4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)和MES运行缓冲液(Invitrogen)进行SDS-PAGE分析。使用Invitrogen的SilverExpress或SilverQuest染色凝胶。在凝胶上运行离心和未离心的样品以评价制剂中的沉淀物的存在。以18 000g进行离心15分钟。提取上清液，其后将沉淀重悬浮于1 X LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，且在凝胶上运行两种级分。还进行pH (Orion)和目视检查分析。
大多数制剂是不成功的，且所用赋形剂可以基于目视检查进行排除，经常不开始24个小时孵育。视觉方面分析的结果可见于表3中。
表3：视觉方面和浊度结果的概述表。没有进一步测试沉淀的样品。PPT：沉淀。
| 制剂流程表 | 赋形剂和浓度 | 视觉方面 | pH |
| 标准品 | 15mM组氨酸 + 40mM Tris +0.01%, 0.1% Tween | PPT | - |
| 标准品 | 15mM组氨酸 + 40mM Tris +0.01%, 0.1% Lutrol | PPT | - |
| 标准品 | 15mM组氨酸 + 40mM Tris +0.01%, 0.1% 辛酸钠 | PPT | - |
| 标准品 | 50mM Tris-马来酸盐 | PPT | - |
| 标准品 | 80mM组氨酸 | PPT | - |
| 标准品 | α-环糊精 0.25,2.5%w/v | PPT | - |
| 标准品 | 苯扎氯铵 0.025,0.125%w/v | PPT | - |
| 分开混合 | 谷氨酸7mM + 20mM精氨酸 | 半透明 | 9.08 |
| 分开混合 | 谷氨酸7mM + 20mM组氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 辛酸钠1.3%w/v + 20mM精氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 辛酸钠1.3%w/v + 20mM组氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 0.25% w/v Empigen | PPT | - |
| 分开混合 | 1.0% w/v Empigen | 半透明 | 5.69 |
| 分开混合 | 0.25, 1.0% w/v SB3-13 | PPT | - |
| 分开混合 | 10mM谷氨酸- 10mM组氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 50mM谷氨酸- 10mM组氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 50mM谷氨酸- 50mM组氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 10mM谷氨酸- 10mM赖氨酸 | 半透明 | 8.04 |
| 分开混合 | 10mM谷氨酸- 50mM赖氨酸 | 半透明 | 9.56 |
| 分开混合 | 50mM谷氨酸- 10mM赖氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 50mM谷氨酸- 50mM赖氨酸 | 半透明 | 9.32 |
| 分开混合 | 10mM谷氨酸 – 10mM精氨酸 | 半透明 | 8.16 |
| 分开混合 | 10mM谷氨酸 – 50mM精氨酸 | 半透明 | 9.57 |
| 分开混合 | 50mM谷氨酸 – 10mM精氨酸 | PPT | - |
| 分开混合 | 50mM谷氨酸 – 50mM精氨酸 | 半透明 | 9.25 |
| 分开混合 | 乙酸铵100mM | PPT | - |
| 分开混合 | 10,50mM Tris-马来酸盐 | PPT | - |
| 分开混合 | 20,30,40mM Tris 10mM 马来酸盐 | PPT | - |
| 分开混合 | 50,75mM Tris 10mM 马来酸盐 | 半透明 | 8.16, 8.53 |
| 分开混合 | 10mM Tris-50mM 马来酸盐 | PPT | - |
| 分开混合 | 50mM Tris-20,30,40mM 马来酸盐 | PPT | - |
对于没有沉淀的那些制剂，在4℃24小时孵育之后进行分析。SDS-PAGE结果表明，尽管在目视检查后没有观察到沉淀，但大多数制剂已经轻微沉淀，图3中通过箭头突出。尽管沉淀级分中存在条带，但它似乎不是足以看到上清液级分中的条带强度的相应降低的材料。
以点线或虚线圈出的可能是更大的担忧，因为这突出了仅在对照中轻微存在的降解条带的强度的增加。10mM谷氨酸与10mM赖氨酸或10mM精氨酸似乎具有与对照类似的降解条带的条带强度。这可以是间接由于pH，因为这两种制剂具有近似8的pH，而其它非表面活性剂制剂具有大于9的非常高pH。这得到进一步证实，其中两种tris-马来酸盐制剂几乎不表现出降解条带，而高pH tris制剂具有相当强烈且非常明确的降解条带。参见图4。
来自测定MAG-Tn3含量的BCA测定的结果不是有希望的，参见表4。应当指出的是，BCA测定没有针对所用各缓冲系统进行优化。尽管如此，可以提取有用的数据。有趣的是注意到，具有MAG-Tn3含量的最低损失的两种制剂(除了Empigen制剂)，是10mM谷氨酸与50mM精氨酸或50mM赖氨酸。这两种制剂具有近似9.5的pH和通过SDS-PAGE的强烈降解条带。tris-马来酸盐制剂尽管通过SDS-PAGE有点希望，但通过BCA不是有希望的。对于这两种制剂观察到近似50％的损失。
表4：通过BCA和HPLC-SEC结果测定的MAG-Tn3抗原含量。百分比损失基于826µg/mL的理论MAG-Tn3浓度。基于所用的纯化材料的质量和重构体积，旨在用于这些制剂中的MAG-Tn3浓度为500µg/剂量或1000µg/mL。后来发现，测定浓度中应当使用百分比糖-肽含量以解释水和平衡离子含量。对于该批次的MAG-Tn3，糖-肽含量为82.6％。
Empigen制剂尽管pH低且表现出合适回收率，但在其大小排阻色谱中具有大量高分子量聚集体(数据未显示)。通过峰面积，该聚集体代表近似11％。
尝试许多制剂以尝试增溶MAG-Tn3和CpG7909，但无一是完全成功的。MAG-Tn3似乎在高pH溶解度最高，然而已知大于8.5的pH切割糖类。因为MAG-Tn3是Tn糖作为抗原部分的糖-肽，需要避免高pH。在较高pH，通过SDS-PAGE存在降解条带的增加，尽管该条带的身份还没有确定，它可能是去糖基化的MAG-Tn3或MAG。
有趣的是注意到，当使用相等浓度的阴离子和阳离子缓冲液时，它们表现出相同范围的MAG-Tn3损失，对于10和50mM谷氨酸和赖氨酸制剂为38.6和33.2％。当使用过量的阳离子缓冲剂(在这种情况下赖氨酸)时，蛋白损失少得多，为9.7％。对于谷氨酸-精氨酸组合看到类似的趋势。制剂不稳定性的可能原因可以是竞争离子的存在。如果谷氨酸与精氨酸或赖氨酸相互作用，这则将降低溶液中相互作用且稳定CpG且防止与MAG-Tn3共沉淀的游离的精氨酸或赖氨酸的量。未来实验将探讨该可能性。
实施例2. 组氨酸相比于精氨酸：测定较低剂量目标的缓冲系统。
将用于MAG-Tn3抗原的目标剂量设定在500µg/剂量。在免疫刺激剂CpG7909存在的情况下，MAG-Tn3抗原瞬时共沉淀。尝试多种缓冲系统以试图增溶该抗原-免疫刺激剂组合，然而发现无一是足够的。然而，组氨酸和精氨酸是所探讨系统的最有希望的缓冲剂。在本报告中将描述为确定何种缓冲系统在较低剂量将表现更好而实施的实验。从该实验获得的主要结果是，抗原-免疫刺激剂组合可以配制成可溶性溶液，然而抗原的目标剂量将需要重新考虑。
将MAG-Tn3抗原以500µg/剂量在840µg/mL浓度的免疫刺激剂CpG7909存在的情况下配制为共冻干物。在先前实验中进行缓冲剂相容性研究，其中清楚地表明，MAG-Tn3与CpG7909不相容，因为在将MAG-Tn3添加至CpG溶液后溶液沉淀。MAG-Tn3具有9.8和10之间的理论pI；因此它因此在较低pH带非常正电荷。此外，CpG在较低pH具有23个负电荷。因此，当组合2种组分时，发生共沉淀。尝试许多缓冲系统以试图解决这一点，精氨酸和组氨酸似乎提供一些针对沉淀的帮助，但它是不完全的。
本文的目标是描述用组氨酸和精氨酸进行的实验以帮助在免疫刺激剂CpG7909存在的情况下增溶MAG-Tn3抗原。
在本报告中的实验中，用设置于100µg的其中间剂量量的MAG-Tn3剂量筛选精氨酸和组氨酸的各种浓度，然后监测这些样品的稳定性。
实验程序
制剂的制备：将精氨酸(Sigma-Aldrich)或组氨酸(Sigma-Aldrich)以15.2、31.3、62.5和125mM的浓度添加至注射用水中的5％蔗糖溶液(Thermo-Fisher)中。然后将CpG7909(Agilent)以1050µg/mL的浓度添加至该溶液。然后将溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将获得自Lonza Braine的MAG-Tn3以250µg/mL的浓度添加至溶液中，最终剂量为100µg。然后将该溶液以150 rpm再磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mM Na2HPO4/KH2PO4 150mMNaCl pH 6.1的溶液中稀释1.25倍。然后将所有制剂在4℃孵育二十四小时，然后进行分析。
分析：进行RP-HPLC以评价用0.2µm注射器过滤器过滤之前和之后制剂中的MAG-Tn3含量。使用配备UV检测的Waters 2996 HPLC，其具有来自Applied Biosciences的PorosR 1/10柱和0-100%乙腈/0.1%三氟乙酸梯度。使用装备荧光检测器的Waters 2996 HPLC(Waters)使用TSKgel G3000PWxl柱(Tosoh Bioscience LLC)和200mM NaCl的流动相进行大小排阻色谱以评价所得制剂的聚集概况。使用4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)和MES运行缓冲液(Invitrogen)进行SDS-PAGE分析。使用Invitrogen的SilverQuest染色凝胶。在凝胶上运行离心和未离心的样品以评价制剂中的沉淀物的存在。以18 000g进行离心15分钟。提取上清液，其后将沉淀重悬浮于1 X LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，且在凝胶上运行两种级分。还进行pH (Orion)和目视检查分析。
在4℃储存后，所有制剂都是半透明的且无颗粒。然而，24小时孵育之后，通过目视检查发现组氨酸溶液都是轻微混浊的。pH读数(表5)没有提供关于产品稳定性的任何信息；然而，应当注意的是，组氨酸制剂具有比相同浓度的精氨酸制剂更窄的pH范围。
表 5：制剂的pH。对于所有溶液均取pH读数。
图5中所见的SDS-PAGE结果证实目视观察的结果。组氨酸制剂在沉淀级分中都含有轻微条带，而精氨酸制剂则没有。
HPLC-SEC结果没有提供任何额外数据。发现所有制剂都是单体的，且没有观察到保留时间的显著偏移；因此，表明保持可溶的MAG-Tn3呈单体形式。
表 6：MAG-Tn3抗原含量。用0.2µm注射器过滤器过滤之前和之后通过RP-HPLC测定MAG-Tn3抗原含量以评价不溶性聚集体含量。
图6中所见的RP-HPLC结果证实从SDS-PAGE获得的结果。组氨酸制剂在过滤之后都表现出33％的近似含量损失，这是由于不溶性聚集体。由于用组氨酸制剂的MAG-Tn3含量的显著损失，选择精氨酸作为选择的缓冲系统。
结果
组氨酸和精氨酸缓冲系统两者均帮助在免疫刺激剂CpG7909存在的情况下增溶抗原MAG-Tn3。这些缓冲系统的阳离子性质帮助稳定阴离子CpG，防止其与MAG-Tn3抗原共沉淀。组氨酸的较低pKa将使得其成为更有利的缓冲剂，因为这将导致产生具有较低pH的制剂；然而，其在增溶两种主要组分方面不像精氨酸那样有效，当通过RP-HPLC测定时抗原含量的33％损失表明了这一点。
精氨酸的侧链具有12.48的pKa，使得最终溶液的pH相当高，在pH 8和10之间。该缓冲系统中的MAG-Tn3的长期稳定性可能被破坏，因为它是糖肽且高pH有利于去糖基化。额外缓冲组分将需要被添加至制剂中，以便将pH降低至就抗原的稳定性而言将更有利的范围。
额外缓冲组分的选择将是困难的，如实施例1中所见。似乎阴离子缓冲剂的存在增加阳离子缓冲系统的竞争离子，在该情况下为精氨酸，从而释放CpG，使得其可以进而与MAG-Tn3共沉淀。对于阴离子缓冲剂的理想候选是可以将pH降低至低于8.5、同时不与精氨酸竞争的阴离子缓冲剂，或者对于MAG-Tn3具有的亲和力比CpG对于该抗原具有的亲和力更高的阴离子缓冲剂。
实施例3. MAG-Tn3疫苗制剂中的L-精氨酸、L-精氨酸单盐酸盐浓度。
糖-肽MAG-Tn3可以与L-精氨酸缓冲系统中的300µg/mL剂量的免疫刺激剂CpG7909一起配制于可溶性疫苗中。先前实验已经显示，12.5和100mM之间的L-精氨酸浓度足以增溶疫苗制剂。本报告将详述为测定MAG-Tn3疫苗制剂中的确切L-精氨酸和L-精氨酸单盐酸盐浓度而进行的实验。
将MAG-Tn3疫苗制剂最初针对500µg/500µL注射体积的剂量，其含有420µg的免疫刺激剂CpG7909。该制剂是不稳定的，且导致免疫刺激剂和抗原的共沉淀。通过使用L-精氨酸组合将目标剂量降低至300µgMAG-Tn3而使得疫苗制剂可溶。先前实验中已经显示，L-精氨酸单盐酸盐在将制剂pH降低至8.5时是有效的，所有都同时维持可溶制剂。保持pH低于8.5的需求是由于Tn糖基可能从分子去糖基化。Tn糖是分子的抗原性部分，其损失将对免疫原性具有显著影响。
本报告的目标是描述为了针对最大疫苗稳定性优化L-精氨酸和L-精氨酸单盐酸盐浓度而进行的实验。用变化以便将pH维持在约8.5的L-精氨酸单盐酸盐浓度测试12.5至40mM的L-精氨酸浓度。一旦确立L-精氨酸浓度，则筛选L-精氨酸单盐酸盐浓度以确定最佳pH以确保疫苗制剂的最大稳定性。在两种情况下，将选择提供最佳稳定性的最低浓度作为选择的浓度。
实验程序
制剂的制备：使用500mM L-精氨酸(EMD)和1M L-精氨酸单盐酸盐(Sigma Aldrich)的储备溶液，通过将15.6-40mM L-精氨酸和60-140mM L-精氨酸单盐酸盐添加至注射用水中的5%蔗糖(EMD)溶液(Thermo-Fisher)而制备制剂，用于其中测定L-精氨酸的实验的第一部分。在以下实验中，将25mM L-精氨酸和125-375mM L-精氨酸单盐酸盐添加至注射用水中的5%蔗糖溶液。然后将CpG7909 (Agilent)以1050µg/mL的浓度添加至该溶液。然后将溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将获得自Lonza Braine的MAG-Tn3以750µg/mL的浓度添加至溶液中。然后将该溶液以150 rpm再磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mM Na2HPO4/KH2PO4150mM NaCl pH 6.1的溶液中稀释1.25倍。然后将所有制剂在4℃孵育二十四小时，然后进行分析。化学品由Sigma-Aldrich提供。
分析：进行RP-HPLC以评价用0.2µm注射器过滤器过滤之前和之后制剂中的MAG-Tn3含量。使用配备UV检测的Waters 2996 HPLC，其具有来自Applied Biosciences的PorosR 1/10柱和0-100%乙腈/0.1%三氟乙酸梯度。使用装备荧光检测器的Waters 2996 HPLC(Waters)使用TSKgel G3000PWxl柱(Tosoh Bioscience LLC)和200mM NaCl的流动相进行大小排阻色谱以评价所得制剂的聚集概况。使用4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)和MES运行缓冲液(Invitrogen)进行SDS-PAGE分析。使用Invitrogen的SilverQuest染色凝胶。在凝胶上运行离心和未离心的样品以评价制剂中的沉淀物的存在。以18 000g进行离心15分钟。提取上清液，其后将沉淀重悬浮于1 X LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，且在凝胶上运行两种级分。还进行浊度(HACH)、pH (Orion)和目视检查分析。
通过目视分析发现所有制剂在4℃24小时孵育之后都是半透明的且无颗粒。
图6中显现的SDS-PAGE结果表明12.5至30mM L-精氨酸的所有制剂都是稳定的，除了15mM l-精氨酸制剂，其在其沉淀级分中具有稍微更强的条带。
浊度和pH结果在制剂之间是类似的，且注意到无显著差异，如下表7中所见。
表 7：L-精氨酸筛选。提供来自L-精氨酸筛选的结果的概述。
通过HPLC-SEC在％单体中也没有看到显著差异，所有制剂都是单体的，如图7中所示，其中主要峰在15.9分钟洗脱。选择20mM L-精氨酸以筛选L-精氨酸单盐酸盐浓度。在225mM L-精氨酸单盐酸盐，条带开始在沉淀级分中以更高强度出现，如图8中所见。
浊度结果在制剂之间是非常类似的，如表8中所见。pH都没有表现出很大变化。观察到7.8-8.2的pH范围。
表 8：L-精氨酸单盐酸盐筛选的概述。提供来自L-精氨酸单盐酸盐筛选的结果的概述。
过滤后的％MAG-Tn3含量回收率表明更大的变化。125mM和200mM-250mM的L-精氨酸单盐酸盐浓度表现出30-15％的回收率的显著损失，表明存在不溶性聚集体。在125mM L-精氨酸单盐酸盐的回收率的20％损失可能是错误的，因为在100mM的回收率为93.7％。％回收率在275mM和300mM L-精氨酸单盐酸盐再次改善，还无法理解其解释。
L-精氨酸单盐酸盐制剂的剩余可溶部分是单体的。聚集概况，如图9中所见，指示单体群体。
讨论
17.5mM至40mM的L-精氨酸浓度证明是稳定的。通过RP-HPLC，12.5和15 mM L-精氨酸表现出MAG-Tn3回收率的10-20％损失，表明存在不溶性聚集体。选择20mM L-精氨酸作为缓冲剂浓度，因为15和17.5mM之间的制剂的稳定性是不确定的，因为还没有测试这些制剂。20mML-精氨酸允许可操作性，然而；如果将± 20%规格应用于20mM L-精氨酸，则可接受的浓度范围将变为16-24mM。应当评价16mM的稳定性，因为15mM表现出10％的过滤后MAG-Tn3含量的损失。
L-精氨酸单盐酸盐筛选提供了有趣的结果。尽管使用宽范围的L-精氨酸单盐酸盐，但pH没有偏移很多，然而；所有的pH都小于8.5，这是避免其使Tn糖从MAG-Tn3去糖基化的可能的pH。150mM L-精氨酸单盐酸盐足以将pH降低至8.0，并且维持稳定的制剂。通过SDS-PAGE，在过滤后没有损失，且在沉淀级分中不存在条带，且对于该制剂，聚集概况是单体的。当进行释放测试时赋形剂浓度的接受标准为± 20%，这将使L-精氨酸单盐酸盐的范围处于120mM-180mM。其下限似乎在潜在不稳定的范围内，因为在125mM的% MAG-Tn3回收率为81.7％。该低值可能是异常的，因为在100mM L-精氨酸单盐酸盐的回收率为93.7％。应当进行分析以证实在120mM L-精氨酸单盐酸盐的稳定性。
对于含有CpG7909的300µg/剂量 MAG-Tn3制剂的最终缓冲剂组成是20mM L-精氨酸和150mM L-精氨酸单盐酸盐。
实施例4：确定用于精氨酸缓冲系统中的MAG-Tn3抗原的最大剂量。
将用于MAG-Tn3抗原的目标剂量设定在500µg/剂量。在免疫刺激剂CpG7909存在的情况下，MAG-Tn3抗原在该浓度瞬时共沉淀。在精氨酸缓冲系统中的100µg MAG-Tn3/剂量的较低剂量，可溶性制剂是可能的；然而较高剂量将是优选的。在本报告中将描述为确定最大MAG-Tn3剂量而进行的实验。
将MAG-Tn3疫苗制剂最初针对500µg/500µL注射体积的剂量，其含有420µg的免疫刺激剂CpG7909。该制剂是不稳定的，且导致免疫刺激剂和抗原的共沉淀。添加组氨酸或精氨酸缓冲系统轻微减轻共沉淀。
在先前实验中，通过将MAG-Tn3抗原剂量从500µg/剂量降低至100µg/剂量且使用精氨酸作为缓冲系统而实现可溶性(未沉淀)制剂。然而，较高剂量将是优选的。
本文的目标是描述为确定精氨酸缓冲系统中的糖-肽抗原MAG-Tn3的最大剂量而进行的实验。本报告中使用的精氨酸缓冲系统是L-精氨酸和L-精氨酸单盐酸盐的混合物。添加L-精氨酸单盐酸盐以试图将pH降低至对于产品稳定性和可注射性更有利的范围。
初始实验筛选200µg/mL至900µg/mL的MAG-Tn3的大剂量范围。一旦确立上限，则筛选800µg/mL至900µg/mL的MAG-Tn3剂量的较小范围，且最终选择剂量。
实验程序
制剂的制备：使用500mM L-精氨酸和1M L-精氨酸单盐酸盐的储备溶液，通过将31.3mML-精氨酸和187.5mM L-精氨酸单盐酸盐添加至注射用水中的5%蔗糖溶液(Thermo-Fisher)而制备制剂。然后将CpG7909 (Agilent)以1050µg/mL的浓度添加至该溶液。然后将溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将获得自Lonza Braine的MAG-Tn3以范围为250-1125µg/mL的浓度添加至溶液中。然后将该溶液以150 rpm再磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mMNa2HPO4/KH2PO4 150mM NaCl pH 6.1的溶液中稀释1.25倍。然后将所有制剂在4℃孵育二十四小时，然后进行分析。化学品由Sigma-Aldrich提供。
分析：进行RP-HPLC以评价用0.2µm注射器过滤器过滤之前和之后制剂中的MAG-Tn3含量。使用配备UV检测的Waters 2996 HPLC，其具有来自Applied Biosciences的PorosR 1/10柱和0-100%乙腈/0.1%三氟乙酸梯度。使用装备荧光检测器的Waters 2996 HPLC(Waters)使用TSKgel G3000PWxl柱(Tosoh Bioscience LLC)和200mM NaCl的流动相进行大小排阻色谱以评价所得制剂的聚集概况。使用4-12% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)和MES运行缓冲液(Invitrogen)进行SDS-PAGE分析。使用Invitrogen的SilverQuest染色凝胶。在凝胶上运行离心和未离心的样品以评价制剂中的沉淀物的存在。以18 000g进行离心15分钟。提取上清液，其后将沉淀重悬浮于1 X LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，且在凝胶上运行两种级分。还进行浊度(HACH)、pH (Orion)和目视检查分析。
发现所有制剂在4℃24小时孵育之后都是半透明的且无颗粒。发现pH和浊度结果在制剂之间是类似的；注意到无显著差异，如下表9中所见。
表 9：浊度和pH。来自200-900ug/ml MAG-Tn3剂量筛选的浊度和pH
图10中显现的SDS-PAGE结果表明稳定的制剂，直到900µg/mL的浓度，其中在沉淀级分中存在非常轻微的条带。然而，这没有被检测为不溶性聚集体，因为过滤样品/未过滤样品的％回收率通过RP-HPLC为100.0％，参见表10。
表 10：(A) MAG-Tn3含量。用0.2µm注射器过滤器过滤之前和之后通过RP-HPLC测定的MAG-Tn3抗原含量以评价不溶性聚集体含量和(B)通过替代方法重新计算以校正较高浓度的ug/mL。
大小排阻色谱表明聚集概况在所有测试浓度无变化，因为观察到的保留时间没有偏移，在表明聚集体的存在的较短保留时间也没有出现峰，如下图11中所见。
在800和900µg/mL之间进行较窄剂量筛选，在下图12中可见所得凝胶。在包括对照(纯化的MAG-Tn3原料)的所有沉淀级分中都可看到轻微条带；然而，对于825、850、875、900µg/mL MAG-Tn3剂量，条带稍微更强。沉淀级分中条带的存在不被检测为不溶性聚集体，因为过滤样品/未过滤样品的％回收率为100±10%(表11)。也没有观察到任何可溶性聚集体，因为大小排阻色谱仅观察到单体峰。
表 11：800-900µg/mL的剂量范围。(A)提供800-900µg/mL的剂量范围的结果的概述和(B)通过替代方法重新计算以校正较高浓度的ug/mL。
MAG-Tn3抗原在L-精氨酸-L-精氨酸-单盐酸盐缓冲系统中以最终重构疫苗中的最高达900µg/mL或450µg/剂量的浓度显得可溶。由于MAG-Tn3在CpG7909存在的情况下的稳定性是不稳定的(如增溶两种成分的多次尝试所表明)，所以选择较低剂量。
在产品稳定性和释放测试过程中，将抗原含量的接受标准设定为100± 20%。极端120％值也必须是可溶制剂，因此如果MAG-Tn3溶解度的上限为900µg/mL，居中MAG-Tn3浓度则为750µg/mL。
还必须考虑在配制的原料产品和重构的冻干饼之间观察到的稀释倍数。将500µL配制的原料冻干，然后重构于体积625µL中，导致1.25的稀释倍数。这也必须添加至剂量计算的计算中。如果750µg/ml是可以获得的最大浓度，则这将属于最后原料，300µg的剂量的最终容器浓度则将是600µg/ml。
能够与免疫刺激剂CpG7909配制为共冻干产品的MAG-Tn3的最大剂量为精氨酸缓冲系统中的300µg。基于pH选择这些实验中的精氨酸缓冲系统；然而，这些组分的优化将是必要的。
实施例5：MAG-Tn3疫苗制剂中的免疫增强剂剂量筛选。
糖-肽MAG-Tn3可以与L-精氨酸缓冲系统中的300µg MAG-Tn3和380µg CpG7909/mL的剂量的免疫刺激剂CpG7909一起配制于可溶性疫苗中(出于该讨论的目的，剂量的液体体积被定义为500µL)。在本实验中研究100 ± 20%的接受标准内的可能CpG浓度的范围以确定MAG-Tn3在CpG7909剂量的范围内是否保持可溶。
基于通过NMR定量的标准将CpG7909的量从420μg/剂量降低至380μg/剂量。利用100 ± 20%的接受标准，研究300-460 µg/剂量的CpG剂量范围。
本报告的目标是描述为确保制剂保持稳定而进行的实验。针对稳定性筛选含有180-420µg CpG/剂量的制剂。
实验程序
制剂的制备：使用250mM L-精氨酸(EMD)和1875mM L-精氨酸单盐酸盐(SigmaAldrich)的储备溶液，通过将25mM L-精氨酸-187.5mM L-精氨酸单盐酸盐添加至注射用水中的5%蔗糖(EMD)溶液(Thermo-Fisher)和0.1%聚山梨醇酯80 (NOF)而制备制剂。然后将CpG7909 (Agilent)以365-838µg/mL的浓度添加至该溶液。然后将溶液以150 rpm磁力搅拌5分钟。然后将获得自Lonza Braine的MAG-Tn3以750µg/mL的浓度添加至溶液中。然后将该溶液以150 rpm再磁力搅拌5分钟。然后将该制剂于50mM Na2HPO4/KH2PO4 150mM NaCl pH6.1的溶液中稀释1.25倍。然后将所有制剂都置于在25℃的HPLC自动进样器，用于在T0、4小时和24小时注射。这些制剂被认为是模拟重构的最终容器，因为它们没有经过冻干工艺。
分析：使用装备荧光检测器的Waters 2996 HPLC(Waters)使用TSKgelSupermultipore PW-N保护和分析柱(Tosoh Bioscience LLC)进行大小排阻色谱以评价所得制剂的聚集概况，流速为0.5mL/min，且流动相为20mM L-精氨酸、150mM L-精氨酸-HCl、0.08%聚山梨醇酯80、150mM NaCl、10mM Na/K2磷酸盐缓冲液pH 6.1。用270nm的激发波长和318nm的发射波长进行荧光检测。
结果
大小排阻色谱表明聚集概况在测试的所有CpG 7909浓度无变化，因为对于保留时间为8.573分钟的主要MAG-Tn3单峰观察到的保留时间没有偏移。如下图13中所见，当比较各种CpG7909浓度时，在较短保留时间的峰大小没有变化，表明聚集体的轻微存在。还测试350和230ug CpG7909/剂量，发现具有类似概况，结果未显示。
将样品在25℃孵育4小时和24小时导致聚集概况的演化，如图14中所见。对应于聚集体的5.6分钟的峰的峰面积随着在25℃花费的时间增加。
在测试的所有CpG7909剂量都观察到该现象，如图15中所见。图15中没有包括350和230ug CpG7909/剂量，但表现出相同概况。聚集体峰和单体峰(8.55分钟)两者的峰面积随着CpG7909浓度渐增保持相对恒定，%CV小于10%，如表12中所见。
表 12：在各种CpG 7909剂量浓度的MAG-Tn3单体和聚集体峰面积比较
含有20mM L-精氨酸和150mM L-精氨酸单盐酸盐的制剂为MAG-Tn3抗原和浓度范围为每剂量180至420µg的免疫刺激剂CpG7909生成了合适的基质。使用NMR定量标准测定CpG7909原料浓度。尽管当在25℃孵育时观察到聚集体的增加，但这些聚集体以相同量存在，而无论CpG7909浓度，表明聚集体由于抗原不稳定，而不是与CpG7909浓度不相容。在本实验中没有测试潜在CpG7909浓度的上限；然而，观察到的趋势将表明，含有460µg/mLCpG7909的制剂将是稳定的。
实施例6. pH研究.
将精氨酸和盐酸精氨酸盐的各种混合物的计算的pH值与用pH计测定的值进行比较(表13)。
表 13. 计算的pH相比于观察的pH。
Claims (42)
1.基本上稳定的疫苗组合物，其包含：
(a) 精氨酸；
(b) 平衡离子；
(c) 包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和
(d) 包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷；
所述组合物的特征在于：当所述组合物包含水时，(i)所述第一和第二免疫原性分子是基本上稳定的；且(ii)所得溶液的pH小于8.5。
2.权利要求1的组合物，所述组合物的特征在于：当所述组合物包含水时，pH在选自以下的范围内：
(a) 其中
(i) 上限为小于8.5；小于8.4；小于8.3；小于8.2；小于8.1；小于8.0；小于7.9；小于7.8；小于7.7；小于7.6；或小于7.5；和
(ii) 下限为大于7.4；大于7.5；大于7.6；大于7.7；大于7.8；大于7.9；大于8.0；大于8.1；大于8.2；大于8.3；或大于8.4；的范围；
(b) 7.4和8.5之间，包括端值；7.5和8.5之间，包括端值；7.6和8.3之间，包括端值；7.7和8.3之间，包括端值；7.8和8.3之间，包括端值；7.9和8.3之间，包括端值；8.0和8.3之间，包括端值，8.1和8.3之间，包括端值；的范围；
(c) 其中pH为(a)或(b)的范围之外不超过± 0.2个pH单位的范围。
3.前述权利要求中任一项的组合物，其进一步特征在于，当所述组合物包含水时，所述精氨酸包含下列种类：
和
。
4.权利要求3的组合物，其进一步特征在于：当所述组合物包含水时，(a)式Ⅴ的种类的浓度为至少14 mM，且(a)式V的种类与(b)式IV的种类的摩尔比在选自以下的范围内：
(a) 0.091和0.200之间；
(b) 0.032和0.323之间；
(c) 0.041和0.323之间；
(d) 0.051和0.256之间；
(e) 0.064和0.256之间；和
(f) 0.081和0.204之间。
5.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一免疫原性分子是Mag-Tn3。
6.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第二免疫原性分子包含CpG寡核苷酸。
7.权利要求6的组合物，其中所述寡核苷酸选自：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ IDNO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；和SEQ ID NO:6。
8.前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。
9.权利要求8的组合物，其中所述冷冻保护剂选自蔗糖和海藻糖。
10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述平衡离子是氯离子。
11.权利要求10的组合物，其中一部分精氨酸作为精氨酸单盐酸盐的种类存在。
12.权利要求11的组合物，其中所述组合物是干燥的，且精氨酸：精氨酸单盐酸盐的比率为20:150 (mol:mol)。
13.权利要求12的组合物，其中精氨酸：精氨酸单盐酸盐的比率为1.74:15.8 (wt:wt)。
14.权利要求12-13中任一项的组合物，其包含(i) 30 - 450 µg MAG-Tn3，包括端值；(ii) 475 µg CpG 7909 (SEQ ID NO:4)；(iii) 0.87 mg精氨酸；(iv) 7.9 mg精氨酸单盐酸盐；(v) 0.216 mg聚山梨醇酯80；和(vi) 10 mg蔗糖。
15.权利要求1-11中任一项的组合物，其进一步包含水。
16.权利要求15的组合物，其中所述第一免疫原性分子包含MAG-Tn3且以小于900µg/ml的浓度存在。
17.权利要求15-16中任一项的组合物，其中所述第二免疫原性分子是CpG寡核苷酸且所述CpG寡核苷酸以760 – 1140 µg/ml且包括端值的浓度存在。
18.权利要求15-17中任一项的组合物，其中所述精氨酸以至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40 mM的浓度存在。
19.权利要求15-18中任一项的组合物，其中所述精氨酸以25mM的浓度存在。
20.权利要求15-18中任一项的组合物，其中所述精氨酸以20mM的浓度存在。
21.权利要求15-20中任一项的组合物，其中所述精氨酸单盐酸盐以至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295或300 mM的浓度存在。
22.权利要求15-21中任一项的组合物，其中所述精氨酸单盐酸盐以187.5mM的浓度存在。
23.权利要求15-22中任一项的组合物，其包含(i)60 - 900 µg/mL MAG-Tn3，包括端值；(ii) 950 µg/mL CpG 7909 (SEQ ID NO:4)；(iii) 25 mM精氨酸；(iv) 187.5 mM精氨酸单盐酸盐；(v) 0.108 % w/v聚山梨醇酯80；和(vi) 5 % w/v蔗糖。
24.权利要求15-21中任一项的组合物，其中所述精氨酸单盐酸盐以150mM的浓度存在。
25.权利要求15-21和24中任一项的组合物，其包含(i)48 - 720 µg/mL MAG-Tn3，包括端值；(ii) 760 µg/mL CpG 7909 (SEQ ID NO:4)；(iii) 20 mM精氨酸；(iv) 150 mM精氨酸单盐酸盐；(v) 0.0864 % w/v聚山梨醇酯80；和(vi) 4 % w/v蔗糖。
26.权利要求1-11和15-25中任一项的组合物，其进一步包含
(a) 包含一种或多种佐剂的佐剂组合物，其中所述佐剂中的至少一种选自MPL和QS21；和
(b) 包含脂质体和一种或多种佐剂的佐剂组合物，其中所述佐剂中的至少一种选自MPL和QS21。
27.权利要求26的组合物，其包含(i)48 - 720 µg/mL MAG-Tn3，包括端值；(ii) 760 µg/mL CpG 7909 (SEQ ID NO:4)；(iii) 20 mM精氨酸；(iv) 150 mM精氨酸单盐酸盐；(v)0.0864 % w/v聚山梨醇酯80；和(vi) 4 % w/v蔗糖；(vii) 150 mM NaCl；(viii) 8mMKH2PO4和2mM Na2HPO4；(ix) 50 µL/mL MPL；(x) 100 µg/mL脂质体；和(xi) 100 µg/mLQS21。
28.用于制备权利要求1-11和15-27中任一项的基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合组分，所述组分包含：
(a) 精氨酸；
(b) 包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和
(c) 包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷；
其中(a) – (c)中的一种或多种与包含水的液体组合，且其中所述组合物的pH为8.5或更小。
29.权利要求28的工艺，其进一步包括通过用合适酸中和来调节精氨酸的pH的步骤。
30.用于制备权利要求1-11和15-27中任一项的基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合组分，所述组分包含：
(a) 精氨酸；
(b) 精氨酸单盐酸盐；
(c) 包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和
(d) 包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷；
其中(a)-(d)中的一种或多种与包含水的液体和佐剂组合。
31.用于制备权利要求12-14中任一项的基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合组分，所述组分包含：
(a) 精氨酸；
(b) 精氨酸单盐酸盐；
(c) 包含Tn基团的第一免疫原性分子，其中所述第一免疫原性分子具有净正电荷；和
(d) 包含寡核苷酸的第二免疫原性分子，其中所述第二免疫原性分子具有净负电荷；
其中(a)-(d)中的一种或多种与包含水的液体组合，所述工艺进一步包括干燥所述组合物的步骤。
32.权利要求31的工艺，其中所述干燥步骤包括冻干。
33.用于制备基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合权利要求1-25中任一项的组合物与包含水的液体的步骤。
34.用于制备基本上稳定的疫苗组合物的工艺，其包括组合权利要求1-25中任一项的组合物与包含水的液体的步骤，其中所述液体进一步包含含有一种或多种佐剂的佐剂组合物，其中所述佐剂中的至少一种选自MPL和QS21。
35.权利要求34的工艺，其中所述佐剂组合物进一步包含脂质体。
36.通过权利要求28-35中任一项的工艺生产的组合物。
37.治疗患者的方法，其包括将根据权利要求1-11和15-27的组合物施用于人的步骤。
38.精氨酸单盐酸盐作为稳定疫苗组合物的添加剂的用途。
39.诱导免疫原性应答的方法，其包括将根据权利要求1-11和15-27的组合物施用于人的步骤。
40.权利要求1-27中任一项的组合物，其用于药物中使用，诸如用于在诱导免疫应答中使用。
41.权利要求1-27中任一项的组合物，其中所述第一免疫原性分子是Mag-Tn3，其用于在治疗癌症中使用。
42.容器，其包含根据权利要求1-27和36中任一项的组合物。
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