BE1024188B1 - Composition séchée - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne la formulation de compositions immunogènes ou vaccinales comprenant des adjuvants à base de liposomes de lipides neutres, la composition étant appropriée pour une lyophilisation. En particulier, l’invention concerne les formes lyophilisées de ces compositions immunogènes ou vaccinales, l’immunogène ou l’antigène vaccinal et l’adjuvant étant présents tous les deux dans un seul et même flacon, ainsi que la formulation et la préparation de formes lyophilisées d’une telle composition immunogène ou vaccinale.
Description
COMPOSITION SÉCHÉE
La présente invention concerne la formulation de compositions immunogènes ou vaccinales comprenant des adjuvants à base de liposomes de lipides neutres, la composition étant appropriée pour une lyophilisation. En particulier, l'invention concerne les formes lyophilisées de ces compositions immunogènes ou vaccinales, l'immunogène ou l'antigène vaccinale et l'adjuvant étant présents tous les deux dans un seul et même flacon, ainsi que la formulation et la préparation des formes lyophilisées d'une telle composition immunogène ou vaccinale.
Contexte de l'invention
Christensen et al. (2007) [Biochim. Biophys. Acta
1768(9) : 2120-2129 - Trehalose preserves DDA/TDB liposomes and their adjuvant effect during freezedrying] ont étudié la capacité des disaccharides tréhalose et saccharose à stabiliser un adjuvant liposomique exempt de phospholipide composé de diméthyldioctadécylammonium cationique (DDA) et de 6,6'-dibéhénate de tréhalose (TDB) lors d'une lyophilisation. Le tréhalose à une concentration supérieure ou égale à 211 mM s'est avéré protéger et préserver les liposomes de DDA/TDB lors de la lyophilisation, tandis que le saccharose a dû être utilisé à des concentrations supérieures à 396 mM. L'effet protecteur n'a pas été observé chez les liposomes sans TDB.
Ingvarsson et al. (2013) [J. Controlled Release 167 : 256-264, Designing CAF-adjuvanted dry powder vaccines : Spray drying preserves the adjuvant activity] ont étudié le séchage par atomisation de l'adjuvant liposomique cationique DDA/TDB en utilisant du mannitol, du lactose ou du tréhalose.
Mohammed et al. (2006) [Methods 40(1) : 30-8,
Lyophilisation and sterilisation of liposomal vaccines to produce stable and sterile products] concerne également la lyophilisation de vaccins à adjuvant liposomique cationique. Il est mis en évidence que pour protéger efficacement les liposomes contre une fusion, le cryoprotecteur doit être présent à la fois à l'intérieur du liposome et dans la phase externe, et que les milieux intra- et extra-liposomiques doivent avoir la même osmolarité. À cette fin, le protocole divulgué permet au cryoprotecteur d'être inclus dans les liposomes lors de la formation des liposomes.
Orr et al. (2014) [J. Control Release, 177 : 20-6 (publié en 2013 par voie électronique) Elimination of the cold chain dependence of a nanoemulsion adjuvanted vaccine against tuberculosis by lyophilisation] concerne la co-lyophilisation d'un adjuvant de type émulsion et d'un antigène.
Le document WO 99/65 465 concerne un procédé permettant de piéger un agent dans des liposomes en présence d'un sucre. Résumé de l'invention
Les inventeurs ont découvert de manière inattendue que des adjuvants à base de liposomes de lipides neutres peuvent être lyophilisés avec succès, en conférant ainsi une thermostabilisation à ces composants et en permettant un conditionnement dans un même flacon de l'adjuvant et de l'antigène sous forme sèche. L'invention propose donc des compositions séchées sous pression réduite à partir d'un mélange liquide comprenant un adjuvant qui comprend une saponine dans une formulation liposomique, dans laquelle les liposomes contiennent un lipide neutre et un stérol, et, un cryoprotecteur qui est un sucre amorphe.
De plus, l'invention propose des procédés de préparation de telles compositions. Il a été découvert de manière inattendue que pour obtenir de telles compositions, il n'est pas nécessaire que la formation des liposomes soit réalisée en présence du cryoprotecteur.
Figures
La figure 1-A illustre avec la ligne continue le cycle de lyophilisation utilisé pour les échantillons de l'exemple 1 ; les lignes pointillées délimitent la plage acceptable du procédé pour la lyophilisation d'une composition vaccinale comprenant l'antigène RTS,S.
La figure 1-B illustre un cycle de lyophilisation alternatif utilisé pour la lyophilisation de compositions vaccinales comprenant AS01 et un antigène, comme décrit dans l'exemple 2 ; les lignes pointillées délimitent la plage acceptable du procédé pour la lyophilisation d'une composition vaccinale.
La figure 2 illustre les données d'immunogénicité préclinique obtenues dans l'exemple 1 :A. Réponse immunitaire cellulaire anti-CSP ; B. Anticorps anti-CSP ; I. Mosquirix™ ; II. RTS,S/AS01 co-lyophilisés reconstitués avec 150 mM de NaCl.
La figure 3 illustre les données de néphélométrie obtenues dans l'exemple 1.
La figure 4 illustre la séquence d'acides aminés de la gE du VZV, telle qu'utilisée dans l'exemple 2.
La figure 5 illustre l'analyse SDS-page de l'intégrité de la gE du VZV avant et après lyophilisation dans différentes circonstances dans l'exemple 2 ; NR signifie conditions non réductrices, R signifie conditions réductrices, la légende pour les couloirs 1 à 12 est fournie dans l'exemple 2.
La figure 6 présente les résultats de l'analyse de l'impact de la lyophilisation sur l'activité hémolytique de QS21 dans l'exemple 2 ; FB fait référence à la composition avant la lyophilisation, FC fait référence à la composition après la lyophilisation.
Description détaillée
Bien que la lyophilisation de vaccins contenant des protéines, des virus vivants atténués ou inactivés ou des bactéries ait été rapportée, à ce jour, la lyophilisation réussie (ou un séchage sous pression réduite en général) et la caractérisation de la thermostabilité d'adjuvants à base de liposomes neutres n'ont pas été rapportées. En dehors de l'effet sur la thermostabilité, la lyophilisation d'un tel adjuvant peut permettre le conditionnement dans un même flacon de l'adjuvant et d'un antigène. Le développement de vaccins pouvant réduire le besoin du maintien de la chaîne du froid réduirait les coûts et les obstacles technologiques de mise en œuvre de nouveaux vaccins. Le conditionnement dans un même flacon de l'adjuvant et d'un antigène pourrait permettre de réduire davantage les coûts, la logistique et les obstacles technologiques lors de la distribution des vaccins dans le monde.
La présente invention décrit le séchage sous vide, tel que la lyophilisation, d'une composition comprenant des adjuvants à base de liposomes neutres, la formulation d'une telle composition appropriée pour la lyophilisation, ainsi que des procédés de lyophilisation. Les inventeurs ont découvert qu'un adjuvant comprenant une saponine, des liposomes et facultativement un lipopolysaccharide, dans lequel les liposomes sont à base de lipides neutres, peut être lyophilisé à partir d'un mélange comprenant en outre un cryoprotecteur choisi parmi les sucres amorphes, tels que le saccharose et le tréhalose. La composition peut comprendre en outre un immunogène ou un antigène. En particulier, les inventeurs ont découvert que pour la composition d'adjuvant liposomique revendiquée, il n'est pas nécessaire que les liposomes soient formés en présence d'un cryoprotecteur afin que l'adjuvant conserve son intégrité structurelle et ses propriétés adjuvantes ou de potentialisation de l'immunité lors d'un séchage ou d'une lyophilisation. Un avantage supplémentaire de l'invention est que le séchage confère une thermostabilité à la composition.
Après la lyophilisation telle que décrite dans le présent document, la composition peut être stockée pendant 12, 24 ou 36 mois 30 °C ; pendant 6 mois, ou pendant 12 mois ou 1 an à 37 °C ; ou pendant trois mois 45 °C. L'aptitude au stockage peut être basée sur la rétention de l'immunogénicité et/ou la rétention de l'intégrité structurelle des composants à un niveau acceptable. L'intégrité structurelle des liposomes peut être évaluée grâce à des procédés, tels que la diffusion dynamique de la lumière (DLS), mesurant la taille et la polydispersité des liposomes, ou par microscopie électronique pour analyser la structure des liposomes. Dans un mode de réalisation, la taille moyenne de particules (par spectroscopie de corrélation photonique) est située entre 95 et 120 nm, et/ou l'indice de polydispersité (par spectroscopie de corrélation photonique) n'est pas supérieur à 0,2. D'un point de vue fonctionnel, l'antigénicité de l'antigène peut être mesurée par ELISA. Des essais précliniques sont disponibles pour évaluer l'immunogénicité globale des compositions décrites dans le présent document. Les dosages immunologiques peuvent quantifier une plage de réponses, comme les lymphocytes T CD4 et/ou les lymphocytes T CD8. L'immunogénicité fait référence à l'effet de la composition sur la réponse immunitaire lors de l'administration de la composition à un sujet. L'adjuvant selon l'invention comprend une saponine dans une formulation liposomique et facultativement un agoniste de TLR-4. Définitions « Formulation liposomique » signifie que la saponine (et facultativement un agoniste de TLR-4) est formulée avec des liposomes ou, dit d'une autre manière, présentée dans une composition à base de liposomes. Les liposomes pour la présente invention contiennent un lipide neutre ou sont essentiellement constitués d'un lipide neutre, c'est-à-dire « des liposomes neutres ». « Lipide neutre » signifie que la charge nette globale du lipide est (approximativement) nulle. Le lipide peut donc être globalement non ionique ou peut être zwitterionique. Dans un mode de réalisation, les liposomes comprennent un lipide zwitterionique. Des exemples de lipides appropriés sont les phospholipides, tels que les phosphatidylcholines. Dans un mode de réalisation, les liposomes contiennent une phosphatidylcholine, en tant que lipide formant des liposomes, qui est de manière appropriée non cristalline à température ambiante. Des exemples de tels lipides de type phosphatidylcholine non cristallin comprennent la phosphatidylcholine de jaune d'œuf, la dioléoyl phosphatidylcholine (DOPC) ou la dilauryl phosphatidylcholine (DLPC). Dans un mode de réalisation particulier, les liposomes de la présente invention contiennent de la DOPC ou sont essentiellement constitués de DOPC. Les liposomes peuvent également contenir une quantité limitée d'un lipide chargé qui augmente la stabilité de la structure liposome-saponine pour les liposomes composés de lipides saturés. Dans ces cas, la quantité de lipide chargé est de manière appropriée de 1 à 20 % en poids/poids, de préférence de 5 à 10 % en poids/poids de la composition de liposomes. Des exemples appropriés de tels lipides chargés comprennent le phosphatidyl-glycérol et la phosphatidylsérine. De manière appropriée, les liposomes neutres contiendront moins de 5 % en poids/poids d'un lipide chargé, tel que moins de 3 % en poids/poids ou moins de 1 % en poids/poids.
Les liposomes pour la présente invention comprennent en outre un stérol. Les stérols appropriés comprennent le β-sitostérol, le stigmastérol, l'ergostérol, l'ergocalciférol et le cholestérol. Dans un mode de réalisation particulier, la formulation liposomique comprend du cholestérol en tant que stérol. Ces stérols sont bien connus dans l'art, par exemple le cholestérol est divulgué dans le Merck Index, 11ème édition, page 341, en tant que stérol d'origine naturelle trouvé dans la graisse animale. Le rapport stérol sur phospholipide est de 1 à 50 % (en mole/mole), de manière appropriée de 20 à 25 %.
Quand la fraction active de saponine est QS21, le rapport QS21/stérol sera habituellement de l'ordre de 1/100 à 1/1 (en poids/poids), de manière appropriée entre 1/10 et 1/1 (en poids/poids), et de préférence de 1/5 à 1/1 (en poids/poids). De manière appropriée, le stérol est présent en excès, le rapport QS21/stérol étant au moins de 1/2 (en poids/poids). Dans un mode de réalisation, le rapport QS21/stérol est de 1/5 (en poids/poids). Dans un mode de réalisation, le stérol est le cholestérol.
Le terme « liposome » est bien connu dans l'art et définit une catégorie générale de vésicules qui comprennent une ou plusieurs bicouches lipidiques entourant un espace aqueux. Les liposomes sont donc constitués d'une ou de plusieurs bicouches de lipides et/ou de phospholipides et peuvent contenir d'autres molécules, telles que des protéines ou des glucides, dans leur structure. Comme à la fois une phase lipidique et une phase aqueuse sont présentes, les liposomes peuvent encapsuler ou piéger une substance hydrosoluble, une substance liposoluble et/ou des composés amphiphiles.
Tel qu'utilisé dans le présent document, un « adjuvant à base de liposomes neutres » signifie que l'adjuvant comprend des liposomes neutres pour la présentation des agents de potentialisation de l'immunité inclus.
Tel qu'utilisé dans le présent document, « essentiellement constitué de » signifie que des composants supplémentaires peuvent être présents, à condition qu'ils n'altèrent pas les propriétés globales ou la fonction.
Tel qu'utilisé dans le présent document, un « flacon » fait référence à un récipient approprié pour être utilisé dans le conditionnement, la distribution et l'utilisation de vaccins ou de compositions immunogènes. Un flacon peut être un flacon « à dose unique » (c'est-à-dire un flacon contenant une quantité de composition immunogène ou vaccinale égale à une seule dose, telle qu'une unique dose humaine ; comme le comprendra l'homme du métier, le dosage spécifique variera en fonction de certains facteurs, tels que la composition spécifique et le receveur prévu). En variante, le flacon peut contenir plus d'une dose (flacon « à plusieurs doses »).
Tel qu'utilisé dans le présent document, « conditionnement dans un même flacon » signifie le placement d'au moins deux composants, ingrédients ou compositions différents dans un unique flacon. Le flacon peut être un flacon à dose unique (contenant une unique dose de chaque composant, ingrédient ou composition), un flacon à plusieurs doses.
Tel qu'utilisé dans le présent document, les termes « mélange » et « mixture » sont utilisés de manière interchangeable.
Saponines
Une saponine appropriée utilisable dans la présente invention est le Quil A et ses dérivés. Le Quil A est une préparation de saponines isolée à partir de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja Saponaria Molina et son activité adjuvante a été décrite pour la première fois par Dalsgaard et al. en 1974 (« Saponin adjuvants », Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p 243-254). Il a été isolé par CLHP des fragments purifiés du Quil A qui conservent l'activité adjuvante sans la toxicité associée au Quil A (document EP 0 362 278), par exemple QS7 et QS21 (également connus sous le nom de QA7 et de QA21). Le QS-21 est une saponine naturelle dérivée de l'écorce du Quillaja saponaria Molina, qui induit des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL), des lymphocytes Th1 et une réponse prédominante d'anticorps IgG2a, et est une saponine préférée dans le contexte de la présente invention. Dans une forme appropriée de la présente invention, l'adjuvant de type saponine au sein de la composition immunogène est un dérivé du quil A de saponaria molina, de préférence une fraction immunologiquement active du Quil A, tel que QS-7, QS-17, QS-18 ou QS-21, de manière appropriée QS-21.
La saponine est fournie dans sa composition la moins réactogène, où elle est désactivée avec un stérol exogène, tel que le cholestérol, et telle que fournie dans la formulation liposomique telle que définie ci-dessus dans le présent document. Il existe plusieurs formes particulières de compositions moins réactogènes, dans lesquelles QS21 est désactivée avec un cholestérol exogène. La saponine/stérol est présentée dans une structure de formulation liposomique. Des procédés d'obtention de saponine/stérol dans une formulation liposomique sont décrits dans le document WO 96/33 739, en particulier dans l'exemple 1.
Agonistes de TLR4
Dans un mode de réalisation de la présente invention, l'adjuvant comprend un agoniste de TLR-4. Un exemple approprié d'agonistes de TLR-4 est un lipopolysaccharide, de manière appropriée un dérivé non toxique du lipide A, en particulier le lipide A monophosphorylé, ou plus particulièrement le lipide A 3-désacylé monophosphorylé (3D-MPL).
Le 3D-MPL est vendu sous le nom de MPL par GlaxoSmithKline Biologicals N.A. et est désigné dans tout le document par MPL ou 3D-MPL. Voir, par exemple, les brevets US numéros 4 436 727 ; 4 877 611 ; 4 866 034 et 4 912 094. Le 3D-MPL favorise principalement les réponses de type lymphocytes T CD4+ avec un phénotype IFN-g (Th1). Le 3D-MPL peut être produit selon les procédés décrits dans le document GB 2 220 211 A. Sur le plan chimique, c'est un mélange de lipide A 3-désacylé monophosphorylé avec 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Dans les compositions de la présente invention, de petites particules 3D-MPL peuvent être utilisées pour préparer la composition adjuvante aqueuse. Le 3D-MPL sous forme de petites particules présente une taille de particule telle qu'il peut être stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 μm. De telles préparations sont décrites dans le document WO 94/21 292. De préférence, du 3D-MPL pulvérulent est utilisé pour préparer les compositions adjuvantes aqueuses de la présente invention. D'autres ligands du TLR-4 pouvant être utilisés sont les alkyl glucosaminide phosphates (AGP), comme ceux décrits dans le document WO 98/50 399 ou le brevet US No. 6 303 347 (des procédés de préparation d'AGP sont également décrits), de manière appropriée RC527 ou RC529 ou des sels pharmaceutiquement acceptables d'AGP comme décrit dans le brevet US No. 6 764 840. Certains AGP sont des agonistes du TLR-4, et certains sont des antagonistes du TLR-4. Les deux sont considérés utiles comme adjuvants. D'autres ligands appropriés du TLR-4 sont décrits dans les documents WO 2003/011 223 et WO 2003/099 195, comme le composé I, le composé II et le composé III décrits aux pages 4 et 5 du document WO 2003/011 223 ou aux pages 3 et 4 du document WO 2003/099 195 et en particulier les composés décrits dans le document WO 2003/011 223, tels que ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057m ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 et ER804764. Par exemple, un ligand approprié du TLR-4 est ER804057. D'autres ligands du TLR-4 pouvant être utilisés dans la présente invention comprennent un adjuvant de type lipide glucopyranosylé (GLA), comme décrit dans les documents WO 2008/153 541 ou WO 2009/143 457 ou dans les articles de la littérature Coler RN et al. (2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1) : e16333. doi :10.1371/journal.pone.0016333 et Arias MA et al. (2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promûtes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7) : e41144. doi :10.1371/journal.pone.0041144. Les documents WO 2008/153 541 ou WO 2009/143 457 sont incorporés à la présente à titre de référence dans le but de définir des ligands du TLR-4 pouvant être utilisés dans la présente invention.
Dans un mode de réalisation spécifique, l'adjuvant comprend à la fois une saponine et un agoniste de TLR-4. Dans un exemple spécifique, la composition adjuvante aqueuse comprend du QS21 et du 3D-MPL. Dans un mode de réalisation alternatif, la composition adjuvante aqueuse comprend du QS21 et un GLA.
Un ligand de TLR-4, tel qu'un lipopolysaccharide, comme le 3D-MPL, peut être utilisé en une quantité située entre 1 et 100 μg par dose humaine de la composition adjuvante. Le 3D-MPL peut être utilisé à une teneur d'environ 50 μg, tel qu'au moins 40 μg, au moins 45 μg ou au moins 49 μg, ou, inférieur à 100 μg, inférieur à 80 μg, inférieur à 60 μg, inférieur à 55 μg ou inférieur à 51 μg. Des exemples de plages appropriées sont entre 40 et 60 μg, de manière appropriée entre 45 et 55 μg ou entre 49 et 51 μg ou 50 μg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition adjuvante comprend du 3D-MPL à une teneur d'environ 25 μg, tel qu'au moins 20 μg, au moins 21 μg, au moins 22 μg ou au moins 24 μg, ou, inférieur à 30 μg, inférieur à 29 μg, inférieur à 28 μg, inférieur à 27 μg ou inférieur à 26 μg. Des exemples de plages inférieures sont entre 20 et 30 μg, de manière appropriée entre 21 et 29 μg ou entre 22 et 28 μg ou entre 28 et 27 μg ou entre 24 et 26 μg, ou 25 μg.
Une saponine, telle que le QS21, peut être utilisée en une quantité située entre 1 et 100 μg par dose humaine de la composition adjuvante. Le QS21 peut être utilisé à une teneur d'environ 50 μg, tel qu'au moins 40 μg, au moins 45 μg ou au moins 49 μg, ou, inférieur à 100 μg, inférieur à 80 μg, inférieur à 60 μg, inférieur à 55 μg ou inférieur à 51 μg. Des exemples de plages appropriées sont entre 40 et 60 μg, de manière appropriée entre 45 et 55 μg ou entre 49 et 51 μg ou 50 μg. Dans un autre mode de réalisation, la dose humaine de la composition adjuvante comprend du QS21 à une teneur d'environ 25 μg, tel qu'au moins 20 μg, au moins 21 μg, au moins 22 μg ou au moins 24 μg, ou, inférieur à 30 μg, inférieur à 29 μg, inférieur à 28 μg, inférieur à 27 μg ou inférieur à 26 μg. Des exemples de plages inférieures sont entre 20 et 30 μg, de manière appropriée entre 21 et 29 μg ou entre 22 et 28 μg ou entre 28 et 27 μg ou entre 24 et 26 μg, ou 25 μg.
Quant à la fois un agoniste de TLR-4 et une saponine sont présents dans l'adjuvant, alors le rapport pondéral agoniste de TLR-4 sur saponine est situé de manière appropriée entre 1/5 et 5/1, de manière appropriée de 1/1. Par exemple, quand le 3D-MPL est présent en une quantité de 50 μg ou de 25 μg, alors de manière appropriée le QS21 peut également être présent en une quantité de 50 μg ou de 25 μg par dose humaine de l'adjuvant.
Liposomes
Les formulations liposomiques pour la présente invention sont définies ci-dessus dans le présent document. Le document WO 2013/041 572 (également publié en tant que document US 2014 0 234 403, incorporé à la présente à titre de référence dans sa globalité), en particulier les exemples 3 et 4, décrit des procédés de préparation d'une préparation de liposomes à base de DOPC contenant en outre du cholestérol et facultativement du 3D-MPL, en mélange en outre avec du QS21, pour ainsi obtenir un adjuvant selon la présente invention.
Antigène
La composition de la présente invention peut comprendre en outre un immunogène ou un antigène. L'antigène peut être choisi parmi des antigènes bactériens, viraux ou de cancer. Dans un mode de réalisation, l'antigène est une protéine recombinante, telle qu'une protéine procaryote recombinante. Dans un mode de réalisation, l'antigène et dérivés de Plasmodium falciparum, de Mycobacterium tuberculosis (TB), du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), de Moraxella, de Haemophilus influenzae non typable (ntHi) ou du virus varicelle-zona (VZV). L'antigène peut comprendre ou consister en des préparations dérivées de parasites qui provoquent le paludisme, tels que Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax.
Des antigènes appropriés dérivés de Plasmodium falciparum comprennent la protéine circumsporozoïte (protéine CS), RTS, PfEMP-I, l'antigène Pfs 16, MSP-I, MSP-3, LSA-I, LSA-3, AMA-I et TRAP. D'autres antigènes de P. falciparum comprennent EBA, GLURP, RAPI, RAP2, la séquestrine, Pf332, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 et leurs analogues chez d'autres Plasmodium spp. L'antigène peut être une protéine entière ou un fragment immunogène de celle-ci. En variante, l'antigène peut se présenter sous la forme d'une protéine de fusion.
Un antigène dérivé de la protéine CS de Plasmodium falciparum peut être sous la forme d'une protéine hybride de fusion. La protéine de fusion peut contenir une protéine dérivée de la protéine CS de P. falciparum fusionnée à une autre protéine ou à un fragment de celle-ci. La protéine de fusion peut contenir un fragment N-terminal ou C-terminal provenant de la protéine CS de P. falciparum. En variante, ou en plus, la protéine de fusion peut comprendre un ou plusieurs motifs de répétition (par exemple, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou plus de 9 motifs de répétition) provenant de la région centrale de la protéine CS de P. falciparum. Dans un mode de réalisation, la protéine de fusion est une protéine hybride de fusion comprenant un antigène dérivé de la protéine CS conjointement avec un antigène de surface provenant de l'hépatite B (HBsAg) ou un fragment immunogène de celui-ci. Habituellement, l'antigène de surface provenant de l'hépatite B comprend la protéine majeure de surface connue sous le nom d'antigène S, par exemple l'antigène S dérivé d'un sérotype adw.
En particulier, la protéine de fusion peut comprendre essentiellement la totalité de la partie C-terminale de la protéine CS de P. falciparum, quatre ou plus de quatre répétitions tandem de la région immunodominante de la protéine CS, et l'antigène de surface provenant de l'hépatite B (HBsAg). Dans un aspect, la protéine de fusion comprend une séquence d'au moins 160 acides aminés contigus présentant une similarité des séquences d'au moins 99 %, 98 %, 95 %, 90 % avec la partie C-terminale de la protéine CS (Caspers et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol 35, 185190 ; Gordon et al. J Infect Dis. (1995) juin ; 171(6) : 1576-85). Dans un aspect, la protéine de fusion comprend une séquence contenant « essentiellement la totalité » de la partie C-terminale de la protéine CS. Tel qu'utilisé dans le présent document, « essentiellement la totalité » de la partie C-terminale de la protéine CS inclut la séquence C-terminale dépourvue de la séquence d'ancrage hydrophobe. Dans un aspect, la protéine de fusion comprenant une séquence consistant en la séquence de la protéine CS dépourvue des 12 à 14 derniers (tel que 12) acides aminés provenant de l'extrémité C-terminale est envisagée.
Dans un mode de réalisation, la protéine de fusion utilisable dans l'invention est une protéine qui comprend une séquence d'acides aminés contigus présentant une similarité des séquences d'au moins 99 %, 98 %, 95 %, 90 % avec les acides aminés 207 à 395 du clone 3D7 de P. falciparum, dérivé de la souche NF54 (Caspers et al, voir ci-dessus) fusionnée dans le cadre par l'intermédiaire d'un lieur linéaire à l'extrémité N-terminale de HBsAg. Le lieur peut comprendre une partie ou la totalité de la région preS2 de HBsAg.
Une protéine de fusion particulière utilisable dans l'invention est la protéine de fusion connue sous le nom de RTS, comme décrit dans le document WO 93/10 152 et WO 98/05 355, incorporés à la présente à titre de référence dans leur globalité. Le RTS peut être sous la forme de particules mixtes RTS,S (où « S » représente un monomère non fusionné) ou sous forme de RTS. Les particules de RTS,S comprennent deux polypeptides RTS et S qui peuvent être synthétisés simultanément et qui forment spontanément des structures particulaires composites (RTS,S), par exemple lors de la purification. Ces particules peuvent également être appelées particules pseudo-virales (VLP).
De telles particules peuvent être préparées de plusieurs manières, par exemple par l'expression de la protéine de fusion dans un hôte approprié, tel qu'une levure ou une bactérie.
Il est considéré que la présence de l'antigène de surface provenant de l'hépatite B et que la formation des particules RTS,S renforcent l'immunogénicité de la partie protéine CS de la protéine hybride, facilitent la stabilité et/ou permettent une fabrication reproductible de la protéine.
Les antigènes CS peuvent être utilisés conjointement avec un autre antigène choisi parmi n'importe quel antigène qui est exprimé sur le sporozoïte ou pendant le stade pré-érythrocytaire du cycle de vie du parasite, tel que le stade hépatique, par exemple l'antigène 1 du stade hépatique (LSA-1), l'antigène 3 du stade hépatique (LSA-3), la protéine anonyme apparentée à la thrombospondine (TRAP), la protéine 1 de surface du mérozoïte (MSP1) la protéine majeure de surface du mérozoïte, et l'antigène 1 apical du mérézoïte (AMA-1). D'autres antigènes appropriés utilisables conjointement avec des antigènes CS comprennent PfEMP-I, l'antigène Pfs 16, MSP-3, LSA-3, AMA-I, TRAP, GLURP, RAPI, RAP2, la séquestrine, Pf332, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230.
Des antigènes appropriés provenant de P. vivax comprennent les antigènes à base de la protéine circumsporozoïte (protéine CS) et la protéine de liaison à l'antigène Duffy et ses fragments, tel que PvRII (voir, par exemple, le document WO 02/12 292).
Des antigènes appropriés à base de la protéine CS comprennent une protéine de fusion comprenant des séquences dérivées d'une protéine CS de P. vivax. Dans un mode de réalisation, la protéine de fusion est une protéine hybride de fusion. La protéine hybride peut contenir ici une protéine dérivée de P. vivax de type I et de type II. En particulier, la protéine hybride de fusion peut contenir une protéine dérivée de P. vivax de type I et de type II fusionnée à une autre protéine ou à un fragment de celle-ci.
Dans un aspect, la protéine hybride de fusion comprend une protéine hybride dérivée de la protéine CS de P. vivax (CSV) et un antigène de surface provenant de l'hépatite B, comme la protéine majeure de surface connue sous le nom d'antigène S, telle que l'antigène S dérivé d'un sérotype adw.
De préférence, la protéine de fusion est une protéine hybride de fusion immunogène comprenant : a. au moins un motif répétitif dérivé de la section répétitive centrale d'une protéine circumsporozoïte de type I de P. vivax, b. au moins un motif répétitif dérivé de la section répétitive centrale d'une protéine circumsporozoïte de type II de P. vivax, et c. l'antigène S de surface dérivé du virus de l'hépatite B.
Le composant antigénique dérivé de CSV de l'invention peut être fusionné à l'extrémité aminoterminale de la protéine S. Plus précisément, l'extrémité C-terminale du fragment de CSV est fusionnée à l'extrémité N-terminale dudit antigène S.
Par exemple, une protéine de fusion appropriée est CSV-S, comme décrit dans le document WO 2008/009 652.
Dans les cellules hôtes, une fois exprimée, la protéine hybride de fusion (comprenant l'antigène S) est capable de s'assembler spontanément pour donner une structure/particule de lipoprotéine composée de nombreux monomères desdites protéines (ou des VLP). De telles particules peuvent être préparées par l'expression de la protéine de fusion dans un hôte approprié, tel qu'une levure ou une bactérie.
Quand la souche cellulaire hôte receveuse choisie porte également dans son génome une ou plusieurs copies intégrées d'une cassette d'expression de S de l'hépatite B, la souche résultante synthétise une protéine hybride sous la forme de protéines de fusion, et également l'antigène S non fusionné. Ils peuvent spontanément s'assembler pour donner des particules de lipoprotéine comprenant des monomères de la protéine hybride de fusion et des monomères de l'antigène S. Une cellule hôte appropriée pour l'expression de la protéine de fusion est, par exemple, une levure.
Il est également fourni une VLP comprenant des motifs CSV-S et/ou RTS. La particule peut être essentiellement constituée de motifs CSV-S et RTS. En variante, les particules produites comprennent ou consistent essentiellement en des motifs CSV-S, RTS et S. De telles particules mixtes sont décrites, par exemple, dans le document WO 2008/009 650.
Dans certains modes de réalisation, la composition de l'invention comprend un antigène dérivé de Mycobacterium spp., tel que Mycobacterium bovis ou
Mycobacterium tuberculosis, en particulier Mycobacterium tuberculosis.
Des antigènes d'intérêt dans le cas de la tuberculose comprennent Rv1196 et Rv0125. Rv1196 (décrit, par exemple, par le nom Mtb39a dans Dillon et al Infection and Immunity 1999 67(6) : 2941-2950) est hautement conservé, avec une identité de séquence de 100 % parmi les souches H37Rv, C, Haarlem, CDC1551, 94-M4241A, 98-R604INH-RIF-EM, KZN605, KZN1435, KZN4207, KZNR506, la souche F11 présentant une mutation ponctuelle Q30K (la plupart des autres isolats cliniques présentent une identité de plus de 90 % avec H37Rv). Rv0125 (décrit, par exemple, par le nom Mtb32a dans Skeiky et al Infection and Immunity 1999 67(8) : 3998-4007) est également hautement conservé, avec une identité de séquence de 100 % parmi de nombreuses souches. Rv0125 de pleine longueur comprend une séquence signal N-terminale qui est clivée pour donner la protéine mature.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est dérivé de Rv1196, par exemple comprend, par exemple consiste en, une séquence présentant une identité d'au moins 70 % avec SEQ ID No : 1, tel qu'au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, plus particulièrement au moins 95 %, par exemple au moins 98 %, tel qu'au moins 99 %. Des antigènes typiques apparentés à Rv1196 comprendront (par exemple consisteront en) un dérivé de SEQ ID No : 1 présentant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions. Des exemples sont ceux présentant des délétions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements, des insertions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements et des substitutions allant jusqu'à 20 résidus. D'autres dérivés de Rv1196 sont ceux comprenant (par exemple, consistant en) un fragment de SEQ ID No : 1 d'une longueur d'au moins 200 acides aminés, tel qu'au moins 250 acides aminés, en particulier au moins 300 acides aminés, plus particulièrement au moins 350 acides aminés.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est dérivé de Rv0125, par exemple comprend, par exemple consiste en, une séquence présentant une identité d'au moins 70 % avec SEQ ID No : 2, tel qu'au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, plus particulièrement au moins 95 %, par exemple au moins 98 %, tel qu'au moins 99 %. Des antigènes typiques apparentés à Rv0125 comprendront (par exemple, consisteront en) un dérivé de SEQ ID No : 2 présentant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions. Des exemples sont ceux présentant des délétions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements, des insertions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements et des substitutions allant jusqu'à 20 résidus. D'autres dérivés de Rv0125 sont ceux comprenant (par exemple, consistant en) un fragment de SEQ ID No : 2 d'une longueur d'au moins 150 acides aminés, tel qu'au moins 200 acides aminés, en particulier au moins 250 acides aminé, plus particulièrement au moins 300 acides aminés. Des dérivés particuliers de Rv0125 sont ceux comprenant (par exemple, consistant en) le fragment de SEQ ID No : 2 correspondant aux résidus 1 à 195 de SEQ ID No : 2. D'autres dérivés immunogènes de Rv0125 sont ceux comprenant (par exemple, consistant en) le fragment de SEQ ID No : 2 correspondant aux résidus 192 à 323 de SEQ ID No : 2. Des antigènes apparentés à Rv0125 particulièrement préférés sont des dérivés de SEQ ID No : 2 dans lesquels au moins une (par exemple, une, deux ou même les trois) des triades catalytiques a été remplacée ou supprimée, de façon que l'activité protéase soit réduite et que la protéine soit plus facilement produite - le résidu sérine catalytique peut être supprimé ou remplacé (par exemple, remplacé par une alanine) et/ou le résidu histidine catalytique peut être supprimé ou remplacé et/ou remplacé, le résidu acide aspartique catalytique peut être supprimé ou remplacé. Des dérivés de SEQ ID No : 2 particulièrement intéressants sont des dérivés dans lesquels le résidu sérine catalytique a été remplacé (par exemple, remplacé par une alanine). Des antigènes également intéressants sont les antigènes apparentés à Rv0125 qui comprennent, par exemple consistent en, une séquence présentant une identité d'au moins 70 % avec SEQ ID No : 2, tel qu'au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, plus particulièrement au moins 95 %, par exemple au moins 98 %, tel qu'au moins 99 %, et dans lesquels au moins une des triades catalytiques a été remplacée ou supprimée ou ceux comprenant, par exemple consistant en, un fragment de SEQ ID No : 2 d'une longueur d'au moins 150 acides aminés, tel qu'au moins 200 acides aminés, en particulier au moins 250 acides aminé, plus particulièrement au moins 300 acides aminés et dans lesquels au moins une des triades catalytiques a été remplacée ou supprimée. D'autres dérivés immunogènes Rv0125 sont ceux comprenant (par exemple, consistant en) le fragment de SEQ ID No : 2 correspondant aux résidus 192 à 323 de SEQ ID No : 2 dans lesquels au moins une (par exemple, une, deux ou les trois) des triades catalytiques a été remplacée ou supprimée. Des dérivés immunogènes particuliers de Rv0125 sont ceux comprenant (par exemple, consistant en) le fragment de SEQ ID No : 2 correspondant aux résidus 1 à 195 de SEQ ID No : 2 dans lesquels le résidu sérine catalytique (position 176 de SEQ ID No : 2) a été remplacé (par exemple, remplacé par une alanine).
De manière appropriée, l'antigène comprendra, par exemple consistera en, une séquence présentant une identité d'au moins 70 % avec SEQ ID No : 3, tel qu'au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, plus particulièrement au moins 95 %, tel qu'au moins 98 %, par exemple au moins 99 %. Des antigènes typiques apparentés à M72 comprendront, par exemple consisteront en, un dérivé de SEQ ID No : 3 présentant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions. Des exemples sont ceux présentant des délétions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements, des insertions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements et des substitutions allant jusqu'à 20 résidus. D'autres dérivés de M72 sont ceux comprenant, par exemple consistant en, un fragment de SEQ ID No : 3 d'une longueur d'au moins 450 acides aminés, tel qu'au moins 500 acides aminés, tel qu'au moins 550 acides aminé, tel qu'au moins 600 acides aminés, tel qu'au moins 650 acides aminés ou au moins 700 acides aminés. Comme M72 est une protéine de fusion dérivée des deux antigènes individuels Rv0125 et Rv1196, n'importe quel fragment d'au moins 450 résidus comprendra une pluralité d'épitopes provenant de la séquence de pleine longueur (Skeiky et al J. Immunol. 2004 172 : 7618-7628 ; Skeiky Infect. Immun. 1999 67(8) : 3998-4007 ; Dillon Infect. Immun. 1999 67(6) : 2941-2950).
Un antigène apparenté à M72 comprendra, par exemple consistera en, une séquence présentant une identité d'au moins 70 % avec SEQ ID No : 3, tel qu'au moins 80 %, en particulier au moins 90 %, plus particulièrement au moins 95 %, tel qu'au moins 98 %, par exemple au moins 99 %.
Des antigènes typiques apparentés à M72 comprendront, par exemple consisteront en, un dérivé de SEQ ID No : 3 présentant un petit nombre de délétions, d'insertions et/ou de substitutions. Des exemples sont ceux présentant des délétions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements, des insertions allant jusqu'à 5 résidus au niveau de 0 à 5 emplacements et des substitutions allant jusqu'à 20 résidus.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'antigène apparenté à M72 comprendra les résidus 2 à 723 de SEQ ID No : 3, par exemple comprendra (ou consistera en) SEQ ID No : 3 ou comprendra (ou consistera en) SEQ ID No : 4.
Un autre antigène qui peut être utilisé selon la présente invention est l'antigène Rv1753 de la tuberculose et ses variants, comme décrit dans le document WO 2010 010 180, par exemple une séquence de
Rv1753 choisie parmi les Seq ID No : 1 et 2 à 7 du document WO 2010 010 180, en particulier Seq ID No : 1. Un autre antigène d'intérêt dans le cas de la tuberculose est Rv2386 et ses variants, comme décrit dans le document WO 2010 010 179, par exemple une séquence de Rv2386 choisie parmi les Seq ID No : 1 et 2 à 7 du document WO 2010 010 179, en particulier Seq ID No : 1. D'autres antigènes d'intérêt dans le cas de la tuberculose sont Rv3616 et ses variants, comme décrit dans le document WO 2011 092 253, par exemple une séquence naturelle de Rv3616 choisie parmi les Seq ID No : 1 et 2 à 7 du document WO 2011 092 253 ou une séquence modifiée de Rv3616, comme celles choisies parmi les Seq ID No : 161 à 169, 179 et 180 du document WO 2011 092 253, en particulier Seq ID No : 167. Un antigène d'intérêt supplémentaire est HBHA, comme décrit dans les documents WO 97 044 463, WO 03 044 048 et WO 2010 149 657. D'autres antigènes d'intérêt sont ceux comprenant (ou consistant en) : Rv1174, également appelé DPV, comme représenté par SEQ ID No 8 dans le document WO 2010 010 177 ; Rv1793, également appelé MTI ou Mtb9.9, comme représenté par SEQ ID No 10 dans le document WO 2010 010 177 ; Rv2087, également appelé MSL ou Mtb9.8, comme représenté par SEQ ID No 9 dans le document WO 2010 010 177 ; Rv3616, également appelé HTCC1 or Mtb40, comme représenté par les SEQ ID No 1 et 2 à 7 dans le document WO 2010 010 177 ou les SEQ ID No 161 à 169, 179 ou 180 dans le document WO 2011 092 253 ; et/ou Rv3874, également appelé CFP10 ou Tb38.1, comme représenté par SEQ ID No 9 dans le document WO 2010 010 177 ; ou une partie immunogène (telle qu'au moins 20, 50, 75 ou 100 résidus en provenant) ou un variant de ceux-ci (par exemple, présentant une identité d'au moins 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % avec ceux-ci). (Les documents WO 2010 010 177 et WO 2011 092 253 sont incorporés à la présente à titre de référence dans leur globalité).
Les antigènes de la tuberculose sont utilisés de manière appropriée sous la forme d'un polypeptide, mais peuvent être fournis en variante sous la forme d'un polynucléotide codant pour ledit polypeptide.
Un antigène supplémentaire pouvant être utilisé selon la présente invention est dérivé du virus varicelle-zona (VZV). L'antigène de VZV utilisable dans l'invention peut être n'importe quel antigène approprié du VZV ou un dérivé immunogène de celui-ci, de manière appropriée un antigène purifié du VZV.
Dans un mode de réalisation, l'antigène de VZV est la glycoprotéine gE du VZV (également appelée gp1) ou un dérivé immunogène de celle-ci. La protéine gE de type sauvage ou de pleine longueur est constituée de 623 acides aminés comprenant un peptide signal, la partie principale de la protéine, une région d'ancrage hydrophobe (résidus 546 à 558) et une queue C-terminale. Dans un aspect, une protéine gE tronquée à l'extrémité C-terminale (également appelée gE tronquée) est utilisée, moyennant quoi la troncature élimine 4 à 20 pour cent des résidus totaux d'acide aminé à l'extrémité carboxy-terminale. Dans un autre aspect, la protéine gE tronquée est dépourvue de la région d'ancrage carboxy-terminal (de manière appropriée approximativement les acides aminés 547 à 623 de la séquence de type sauvage). Dans un aspect supplémentaire, la protéine gE est une protéine gE tronquée ayant la séquence de SEQ ID NO. 1. L'antigène gE, ses dérivés sans ancrage (qui sont également des dérivés immunogènes) et leur production sont décrits dans le document EP 0 405 867 et les références qui y sont citées [voir également Vafai A., Antibody binding sites on truncated forms of varicalla-zoster virus gpl(gE) glycoprotein, Vaccine 1994 12 : 1265-9]. Le document EP 192 902 décrit également gE et sa production. Une protéine gE tronquée est également décrite par Haumont et al. Virus Research (1996) vol 40, p 199-204, incorporé à la présente à titre de référence dans sa globalité. Une composition adjuvantée de gE de VZV appropriée pour être utilisée selon la présente invention est décrite dans le document WO 2006/094 756, c'est-à-dire une protéine gE de VZV tronquée à l'extrémité carboxy-terminale en combinaison avec un adjuvant comprenant du QS21, du 3D-MPL et des liposomes contenant en outre du cholestérol. Leroux-Roels I. et al. (J. Infect. Dis. 2012, 206 : 1280-1290) ont rapporté un essai clinique de phase I/II évaluant le vaccin sous-unitaire adjuvanté à base gE tronquée du VZV.
Dans un autre mode de réalisation, les compositions de la présente invention peuvent comprendre un immunogène ou un antigène qui est un dérivé de l'un quelconque des antigènes décrits dans le présent document. Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme « dérivé » fait référence à un antigène qui est modifié par rapport à sa forme d'origine naturelle. Les dérivés de la présente invention sont suffisamment similaires aux antigènes natifs pour conserver les propriétés antigéniques et restent capables de déclencher une réponse immunitaire dirigée contre l'antigène natif. Le fait qu'un dérivé donné déclenche ou non une telle réponse immunitaire peut être mesuré par un dosage immunologique approprié, tel qu'un dosage ELISA ou la cytométrie en flux.
Cryoprotecteur
Un cryoprotecteur approprié pour être utilisé dans la présente invention est un sucre amorphe, tel qu'un sucre choisi parmi le saccharose, le tréhalose, le lactose, le raffinose, et leurs combinaisons. Dans un mode de réalisation, le cryoprotecteur et le saccharose ou le tréhalose ou une combinaison de ceux-ci. Le cryoprotecteur peut comprendre en outre des sucres améliorant la structure du gâteau de lyophilisation, tel que le dextrane.
Dans un mode de réalisation, le mélange liquide pour le séchage, par exemple par lyophilisation, contient au moins 3 % (en poids/volume), au moins 4 % (en poids/volume), au moins 5 % (en poids/volume), au moins 6 % (en poids/volume) du cryoprotecteur. Dans un autre mode de réalisation, le cryoprotecteur est présent dans le mélange liquide en une quantité totale inférieure à 10 %, inférieure à 8 %, inférieure à 7 %, inférieure à 6 % ou inférieure à 5,5 % (% en poids/volume). Exprimé d'une autre manière, le cryoprotecteur est présent dans le mélange liquide en une quantité totale d'au moins 4 %, d'au moins 4,5 % ou d'au moins 5 % (% en poids/volume), mais inférieure à 10 %, inférieure à 8 %, inférieure à 7 % ou inférieure à 6 % (% en poids/volume).
La concentration totale en cryoprotecteur dans le mélange liquide est de manière appropriée de 5 à 10 % (en poids/volume), moyennant quoi au moins 5 % de saccharose, de tréhalose ou d'une combinaison de ceux-ci sont présents. Dans un mode de réalisation, 5 % de saccharose sont utilisés. Dans un mode de réalisation, 5 % de tréhalose sont utilisés. Dans des modes de réalisation spécifiques, le mélange liquide comprend au moins 5 % (% en poids/volume) ou entre 5 et 10 % (% en poids/volume) de saccharose, de tréhalose ou d'une combinaison de ceux-ci.
Dans un autre mode de réalisation, le vaccin reconstitué contient au moins 0,6 % (en poids/volume), au moins 0,8 % (en poids/volume), au moins 1 % (en poids/volume) ou au moins 1,2 % (en poids/volume) du cryoprotecteur. Dans un autre mode de réalisation, le cryoprotecteur est présent dans le vaccin reconstitué en une quantité totale inférieure à 2 %, inférieure à 1.6 %, inférieure à 1,4 %, inférieure à 1,2 % ou inférieure à 1,1 % (% en poids/volume). Exprimé d'une autre manière, le cryoprotecteur est présent dans le vaccin reconstitué en une quantité totale d'au moins 0,8 %, d'au moins 0,9 % ou d'au moins 1 % (% en poids/volume), mais inférieure à 2 %, inférieure à 1.6 %, inférieure à 1,4 % ou inférieure à 1,2 % (% en poids/volume).
La concentration totale en cryoprotecteur dans le vaccin reconstitué est de manière appropriée de 1 à 2 % (en poids/volume), moyennant quoi au moins 1 % de saccharose, de tréhalose ou d'une combinaison de ceux-ci est présent. Dans un mode de réalisation, 1 % de saccharose est utilisé. Dans un mode de réalisation 1 % de tréhalose est utilisé. Dans des modes de réalisation spécifiques, le vaccin reconstitué comprend au moins 1 % (% en poids/volume) ou entre 1 et 2,5 % (% en poids/volume) de saccharose, de tréhalose ou d'une combinaison de ceux-ci.
Dans un autre mode de réalisation, le rapport de la concentration en cryoprotecteur sur celle en lipide de liposomes est de 10 à 20. Dans des modes de réalisation spécifiques, le rapport est de 10, 15 ou 20.
Dans un mode de réalisation alternatif, le sucre amorphe contribue également à la tonicité ou fournit la tonicité dans le vaccin reconstitué, ce qui nécessite une concentration plus élevée du sucre amorphe, tel que 8 à 10 % (par exemple, 9,25 %) de saccharose (en poids/volume) dans le vaccin reconstitué, ou, 8 à 10 % de tréhalose (en poids/volume) (par exemple, 9,25 %), ou d'une combinaison de saccharose et de tréhalose en une quantité totale de 8 à 10 % (en poids/volume).
Excipients supplémentaires
Dans un mode de réalisation, le mélange liquide est un mélange essentiellement aqueux comprenant facultativement d'autres solvants, tels que l'éthanol ou l'isopropanol.
Dans un autre mode de réalisation, un tampon est ajouté à la composition. Le pH du mélange liquide est ajusté en tenant compte des composants thérapeutiques de la composition. De manière appropriée, le pH du mélange liquide est d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 5,5, d'au moins 5,8, d'au moins 6. Exprimé d'une autre manière, le pH du mélange liquide peut être inférieur à 9, inférieur à 8, inférieur à 7,5 ou inférieur à 7. Dans d'autres modes de réalisation, le pH du mélange liquide est situé entre 4 et 9, entre 5 et 8, entre 5,5 et 7,5 ou entre 5,8 et 6,4.
Un tampon approprié peut être choisi parmi l'acétate, le citrate, l'histidine, le maléate, le phosphate, le succinate, le tartrate et le TRIS. Dans un mode de réalisation, le tampon est un tampon phosphate, tel que Na/Na2PO4, Na/K2PO4 ou K/K2PO4.
Le tampon peut être présent dans le mélange liquide en une quantité d'au moins 6 mM, d'au moins 10 mM ou d'au moins 40 mM. Ou, le tampon peut être présent dans le mélange liquide en une quantité inférieure à 100 mM, inférieure à 60 mM ou inférieure à 40 mM.
Selon des modes de réalisation spécifiques, le tampon est un tampon phosphate, présent dans le mélange liquide en une quantité située entre 6 et 40 mM, tel qu'environ 10 mM. De manière appropriée, le tampon est choisi parmi Na/K2PO4, K/K2PO4 ou le succinate. En particulier, K/K2PO4 est utilisé comme tampon.
La formulation d'un antigène protéique à des fins de lyophilisation selon la présente invention peut comprendre un tensioactif. Les tensioactifs particulièrement appropriés pour une utilisation dans la présente invention comprennent les polysorbates, en particulier la polysorbate 80 (PS80), et le poloxamère 188.
Dans un autre mode de réalisation, le mélange liquide ou la composition séchée contient une quantité limitée de NaCl, par exemple inférieure à 60 mM, inférieure à 50 mM, inférieure à 40 mM, inférieure à 30 mM, inférieure à 25 mM ou inférieure à 20 mM de NaCl dans le mélange liquide. Selon des modes de réalisation spécifiques, le mélange liquide contient moins de 10 % de cryoprotecteur, par exemple le saccharose, et moins de 50 mM de NaCl. En variante, le mélange liquide contient moins de 5 % de cryoprotecteur, par exemple le saccharose, et moins de 30 mM de NaCl.
Dans un autre mode de réalisation, le mélange liquide ou la composition séchée contient une quantité limitée de sels, par exemple inférieure à 60 mM, inférieure à 50 mM, inférieure à 40 mM, inférieure à 30 mM, inférieure à 25 mM ou inférieure à 20 mM de NaCl dans le mélange liquide.
La tonicité de la composition après reconstitution peut être ajustée en utilisant des procédés connus de l'homme du métier, par exemple en fournissant suffisamment d'agents d'isotonicité dans la composition séchée, par exemple en reconstituant la composition séchée avec un solvant au moins isotonique. Dans des modes de réalisation particuliers, la tonicité de la composition reconstituée peut être ajustée par l'ajout de quantités appropriées de NaCl lors de la reconstitution, par exemple en reconstituant la composition séchée avec une solution saline, ou en augmentant la quantité initiale de cryoprotecteur jusqu'à des niveaux donnant une isotonicité lors de la reconstitution avec de l'eau pour injection. En variante, la composition séchée est reconstituée avec une solution aqueuse isotonique d'un agent isotonique non ionique, par exemple le sorbitol. Dans un mode de réalisation préféré, la composition lyophilisée est reconstituée avec une solution saline.
Il est bien connu que pour une administration parentérale, les solutions doivent présenter une osmolalité pharmaceutiquement acceptable pour éviter la déformation ou la lyse des cellules. Une osmolalité pharmaceutiquement acceptable signifiera généralement que les solutions ont une osmolalité qui est approximativement isotonique ou légèrement hypertonique. De manière appropriée, les compositions de la présente invention, une fois reconstituées, présenteront une osmolalité située dans la plage allant de 250 à 750 mOsm/kg, par exemple l'osmolalité peut être dans la plage allant de 250 à 550 mOsm/kg, tel que dans la plage allant de 280 à 500 mOsm/kg. L'osmolalité peut être mesurée selon des techniques connues dans l'art, par exemple en utilisant un osmomètre disponible dans le commerce, par exemple l'Advanced® Model 2020 disponible chez Advanced Instruments Inc. (USA).
La présente invention propose en outre une composition telle que décrite dans le présent document pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie, la composition étant une composition immunogène ou une composition vaccinale. Dans un exemple spécifique de ce mode de réalisation, l'invention propose une composition immunogène, telle qu'une composition vaccinale, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie associée à un ou plusieurs antigènes décrits ci-dessus. Dans un mode de réalisation, l'invention propose une composition immunogène telle que décrite dans le présent document pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie choisie parmi le paludisme, la tuberculose, la BPCO, le VIH et l'herpès.
La présente invention propose en outre des procédés de traitement ou de prophylaxie du paludisme, de la tuberculose, de la BPCO, du VIH ou de l'herpès chez un individu en ayant besoin, comprenant l'étape de fourniture audit individu d'une quantité efficace d'une composition immunogène ou vaccinale telle que décrite dans le présent document. L'invention propose également un procédé de production d'une composition séchée telle que décrite dans le présent document, comprenant les étapes suivantes : i. le mélange d'une pluralité de composants pour obtenir un mélange liquide, lesdits composants comprenant : a. une préparation liposomique liquide comprenant des liposomes, lesdits liposomes comprenant un lipide neutre et un stérol ; b. une saponine ; et c. un cryoprotecteur ; et ii. le séchage du mélange sous pression réduite.
Dans un mode de réalisation, la préparation liposomique liquide de l'étape i(a) comprend en outre un lipopolysaccharide. Exprimée d'une autre manière, la préparation liposomique liquide comprend facultativement un lipopolysaccharide. Le lipopolysaccharide est tel que défini ci-dessus dans le présent document.
Dans un autre mode de réalisation, la composition liquide mélangée de l'étape (i) comprend en outre (ou facultativement) un ou plusieurs composants choisis parmi des antigènes, des immunogènes, des tampons et des tensioactifs. Par conséquent, le procédé de production d'une composition séchée telle que décrite dans le présent document peut comprendre les étapes suivantes : i. le mélange d'une pluralité de composants pour obtenir un mélange liquide, lesdits composants comprenant : a. une préparation liposomique liquide comprenant des liposomes, lesdits liposomes comprenant un lipide neutre et un stérol ; b. une saponine ; c. un cryoprotecteur ; et d. un ou plusieurs ingrédients choisis parmi un antigène, un tampon et un tensioactif ; et ii. le séchage du mélange sous pression réduite.
Telle qu'utilisée dans le présent document, une composition liquide mélangée est une composition comprenant de multiples composants, où un composant isolé n'est pas nécessairement liquide, mais la composition mélangée résultante (le mélange) est sous forme liquide, c'est-à-dire que la composition mélangée est amorphe et s'écoule librement, et son volume est constant sous une pression donnée.
Dans un mode de réalisation, la composition liquide mélangée de l'étape (i) comprend deux éléments quelconques ou les trois éléments parmi : un antigène, un tampon et un tensioactif. Exprimée d'une autre manière, la composition liquide mélangée comprend facultativement deux éléments quelconques ou les trois éléments parmi : un antigène, un tampon et un tensioactif.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, les liposomes dans la préparation liposomique liquide ne contiennent aucun cryoprotecteur, par exemple ils n'ont pas été formés en présence d'un cryoprotecteur. Dans un mode de réalisation de la présente invention, la formulation liposomique liquide ne contient aucun cryoprotecteur, par exemple elle ne contient pas de sucre amorphe, tel qu'un sucre amorphe choisi parmi de saccharose, le tréhalose, le lactose, le raffinose et leurs combinaisons.
Dans un mode de réalisation alternatif, les composants de la composition liquide sont mélangés dans un ordre spécifique. Premièrement, une solution du cryoprotecteur dans de l'eau est fournie, à laquelle (s'il est présent) la solution tampon est ajoutée. Deuxièmement, la préparation liposomique liquide est ajoutée. Troisièmement, le constituant saponine est ajouté. Quatrièmement, (s'il est présent) le tensioactif est ajouté et, cinquièmement, l'antigène (s'il est présent) est ajouté. Entre certaines étapes du procédé, le mélange peut être agité pendant un certain temps, par exemple 10 minutes ou plus, 15 minutes ou plus, 30 minutes ou plus, 45 minutes ou plus ou entre 15 et 45 minutes. Dans un mode de réalisation, le mélange est agité après l'ajout de la saponine. Dans un autre mode de réalisation, le mélange est agité pendant au moins 15 minutes après l'ajout du tensioactif. Dans un autre mode de réalisation, le mélange est agité pendant au moins 15 minutes après l'ajout de l'antigène. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le mélange est agité pendant au moins 15 minutes après chacune des étapes d'ajout de la saponine, du tensioactif et/ou de l'antigène.
Dans un mode de réalisation, une partie ou la totalité des activités de l'étape i. est réalisée à température ambiante.
Le séchage sous pression réduite d'un mélange liquide tel qu'obtenu à l'étape ii. peut être réalisé en utilisant différentes méthodologies connues dans l'art. Dans un mode de réalisation, le séchage à l'étape ii. est réalisé par lyophilisation. Les termes « cryodessiccation » ou « lyophilisation » et « lyophilisé » sont utilisés de manière interchangeable et font référence au même procédé de congélation rapide d'une substance humide, puis de déshydratation sous pression réduite. Le cycle de lyophilisation ou de cryodessiccation est habituellement constitué de trois phases de procédé. Dans la première phase du procédé, une solution ou un mélange principalement aqueux est congelé, c'est-à-dire la « congélation de la composition liquide mélangée de l'étape i. ». Ensuite, l'eau est éliminée, c'est-à-dire le « séchage de la composition congelée », tout d'abord par sublimation lors du séchage primaire. Dans la troisième phase, l'eau non congelée est éliminée par diffusion et désorption lors du séchage secondaire.
Afin de définir le procédé décrit, les termes suivants sont utilisés car ils sont connus dans l'art. Le terme « température de transition vitreuse » ou « Tg » est la température à laquelle un solide amorphe se ramollit après chauffage ou devient cassant après refroidissement. Le terme « Tg' » fait référence à la température de transition vitreuse à l'état congelé. Le terme « température d'effondrement » ou « Tc » fait référence à la température appliquée pendant le séchage primaire et à laquelle un matériau amorphe se ramollit jusqu'à un point tel qu'il ne peut plus du tout supporter sa propre structure.
Dans la lyophilisation de l'étape ii., la composition liquide mélangée de l'étape i. est congelée avant le séchage en amenant la température du produit en dessous de la Tg' de la composition. Dans un mode de réalisation, la congélation est réalisée en exposant l'échantillon ou le mélange aqueux à une température constante de conservation à une température de congélation qui est inférieure à Tg'. Dans un mode de réalisation alternatif, le produit peut être congelé en appliquant une congélation à durée de rampe, c'est-à-dire en réduisant progressivement la température de conservation jusqu'à une température de congélation inférieure à Tg'. Selon des modes de réalisation, la température de congélation est une température inférieure de 5 °C par rapport à Tg', inférieure de 7,5 °C par rapport à Tg', ou inférieure de 10 °C par rapport à Tg', telle que de ou inférieure à -50 °C.
Le séchage de la composition congelée sous pression réduite telle qu'envisagée dans la lyophilisation de l'étape ii. décrite dans le présent document sera généralement réalisée en deux phases, c'est-à-dire un séchage primaire et un séchage secondaire. Dans un mode de réalisation, le séchage comprendra : - un séchage primaire à une température inférieure à la Tc du produit, et - un séchage secondaire à une température supérieure à la Tc du produit et inférieure à la Tg du produit.
Dans un mode de réalisation, l'étape ii. de séchage du procédé décrit dans le présent document est terminée en moins de 48 heures, en moins de 36 heures, en moins de 30 heures, en moins de 28 heures. Dans un mode de réalisation spécifique, l'étape ii. est terminée en moins de 28 heures.
Dans un mode de réalisation, l'antigène est RTS,S et le séchage primaire est réalisé à une pression inférieure à 90 μbar et/ou supérieure à 45 μbar. Dans le même mode de réalisation, les conditions du séchage primaire peuvent être appliquées pendant 19 heures et devraient être appliquées pendant au moins 15 heures.
Dans un mode de réalisation alternatif, par exemple quand l'antigène est un dérivé de gE du VZV, un cycle de lyophilisation plus conservateur est utilisé, comme illustré sur la figure 1-B.
La composition séchée obtenue grâce au procédé décrit est capable de déclencher une réponse immunitaire chez un sujet. Ladite réponse immunitaire est en correspondance avec l'adjuvant, et avec n'importe quel antigène présent dans la composition.
Dans un mode de réalisation, le cryoprotecteur (qui peut être sous forme liquide ou sous une autre forme) est mélangé avec la préparation liposomique avant son mélange avec la saponine. Dans un mode de réalisation supplémentaire, le tensioactif est mélangé avant l'antigène. Selon un autre mode de réalisation, l'ordre du mélange est tout d'abord le mélange du cryoprotecteur et du tampon, puis l'ajout de la préparation liposomique liquide, de la saponine, du tensioactif et de l'antigène dans l'ordre respectif.
Dans la description du procédé, chacun des termes a la même signification que celle pour les compositions décrites dans le présent document.
Des procédés d'obtention ou de préparation de la préparation liposomique sont décrits dans le document WO 2013/041 572, qui est incorporé à la présente à titre de référence dans sa globalité. Un procédé approprié décrit dans ce document comprend : (a) la production d'un film lipidique par (i) dissolution d'un mélange de lipides dans l'isopropanol pour former un mélange homogène, et (ii) élimination du solvant du mélange homogène pour former un film lipidique, dans lequel le mélange de lipides comprend le lipide et un stérol ; (b) l'hydratation du film lipidique avec une solution d'hydratation pour former une suspension de gros liposomes ; (c) la réduction de la taille de la suspension de gros liposomes produite à l'étape (b) avec un homogénéisateur à cisaillement élevé et à pression élevée pour former des liposomes ; et facultativement (d) la stérilisation des liposomes. De manière appropriée, l'étape (c) comprend les étapes : (c') d'homogénéisation préalable de la solution de suspension de gros liposomes avec un mélangeur à cisaillement élevé, et (c'') d'homogénéisation de la solution produite à l'étape (c') avec un homogénéisateur à haute pression.
De manière inattendue, pour que la composition séchée conserve sa capacité de potentialisation de l'immunité ou son immunogénicité, il n'a pas été nécessaire que les liposomes de l'adjuvant soient formés et/ou formulés, par exemple pendant la préparation de la préparation liposomique, en présence d'un cryoprotecteur.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemples 1. Exemple 1 - Co-lyophilisation d'un vaccin à base de RTS,S/AS01 (quadridose)
Vaccin à base de RTS,S/AS01
L'antigène RTS,S est constitué de deux chaînes polypeptidiques, RTS et S. Le polypeptide RTS contient une partie (aa 207 à 395) de la protéine CS de P. falciparum fusionnée à l'antigène de surface (S) du virus de l'hépatite B. La protéine de fusion de RTS et le polypeptide S sont co-exprimés dans Saccharomyces cerevisiae et s'assemblent spontanément pour donner des particules pseudo-virales appelées RTS,S. Ces particules purifiées constituent l'antigène RTS,S utilisé dans la formulation du vaccin. De plus amples détails pour obtenir l'antigène RTS,S sont disponibles dans le document WO 93/10 152, incorporé à la présente à titre de référence dans sa globalité. AS01 fait référence à un adjuvant de vaccin comprenant QS21, 3D-MPL dans une formulation liposomique contenant du cholestérol.
Masse concentrée de liposomes
La masse concentrée de liposomes a été préparée comme décrit dans l'exemple 3 du document WO 2013/041 572 (incorporé à la présente à titre de référence dans sa globalité). En bref, la masse concentrée de liposomes a été préparée en 2 étapes. La première étape était la préparation d'un film lipidique. De la DOPC (dioléoyl phosphatidylcholine), du 3D-MPL et du cholestérol ont été dissous de manière séquentielle dans de l'isopropanol. Ensuite, l'isopropanol a été éliminé sous agitation et avec un gradient de pression réduite dans un bain chauffant à 55 °C pour obtenir un résidu de film. La pression a ensuite été progressivement réduite et un séchage final a été appliqué pour obtenir un film lipidique. La seconde étape était la préparation de la masse concentrée de liposomes. À cette fin, le film lipidique a été réhydraté dans du PBS pour former une suspension grossière de liposomes. La suspension de liposomes a ensuite été homogénéisée avec un mélangeur à cisaillement élevé en ligne avec un homogénéisateur à haute pression pour produire les liposomes nanométriques souhaités. La masse concentrée de liposomes résultante est filtrée à travers une membrane de PES de 0,22 μm. La masse concentrée de liposomes utilisable dans l'exemple contenait 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de cholestérol, 2 mg/ml de MPL dans un tampon phosphate à 10 mM (pH 6,1) et 150 mM de NaCl.
Formulation du vaccin L'antigène, c'est-à-dire RTS,S, et l'adjuvant, c'est-à-dire AS01, ont été co-formulés à des fins de lyophilisation dans de l'eau pour injection en ajoutant 1) 30 % de saccharose (ajouter 5 %) 2) 100 mM de tampon, PO4 (K/K2) ou le succinate, pH 6,1 (ajouter 10 mM), 3) 40 mg/ml de masse de liposomes (ajouter 5 mg/ml), 4) 5 mg/ml de QS21 (ajouter 0,25 mg/ml), puis la préparation adjuvante ainsi obtenue a été agitée pendant 15 à 45 minutes à température ambiante. Ensuite, 3 % (en poids/volume) de polysorbate 80 (ajouter 0,0312 %) ont été ajoutés et le mélange a été agité pendant 15 à 45 minutes à température ambiante. L'antigène RTS,S a été ajouté à 0,25 mg/ml et la solution obtenue a été agitée pendant 15 à 45 minutes à température ambiante. Le pH a été mesuré et ajusté à 6,1 si nécessaire.
Des formulations témoins contenant soit l'adjuvant, soit l'antigène ont été également préparées. Les échantillons testés sont les suivants : 1. RTS,S (lot A) PO4 (Na/Na2) pH 6,8 2. RTS,S (lot B) PO4 (Na/Na2) pH 6,8 3. AS01E3 PO4 (K/K2) pH 6,1 4. colyo RTS,S (lot A)/AS succinate 10 mM pH 6,1 5. colyo RTS,S (lot A)/AS PO4 (K/K2) 10 mM pH 6,1 6. colyo RTS,S (lot B)/AS succinate 10 mM pH 6,1 7. colyo RTS,S (lot B)/AS PO4 (K/K2) 10 mM pH 6,1 8. RTS,S (lot A) succinate pH 6,1 9. RTS,S (lot A) PO4 (K/K2) pH 6,1 10. RTS,S (lot B) succinate pH 6,1 11. RTS,S (lot B) PO4 (K/K2) pH 6,1 12. AS01 succinate pH 6,1 13. AS01 PO4 (K/K2) pH 6,1 14. Saccharose 5 %
Lyophilisation
Les formulations ainsi obtenues ont été introduites dans des flacons de verre (volume de remplissage de 0,5 ml) et lyophilisées en appliquant un cycle de lyophilisation de 28 heures, comme présenté sur la figure 1-A.
Evaluation
Plusieurs aspects ont été jugés pour évaluer la stabilité thermique des échantillons pendant 1 an à 4 et 30 °C, 6 mois à 37 °C et 3 mois à 45 °C. 1. Aspect visuel des gâteaux
Les gâteaux avaient une apparence pharmaceutique élégante (similaire à celle de la formulation bidose du Mosquirix) pour tous les groupes de formulation. De manière curieuse, les formulations contenant le RTS,S mais pas l'adjuvant présentaient une légère rétractation. L'apparence des gâteaux s'est avérée être stable pendant 12 mois à 30 °C et 6 mois à 37 °C. Une légère contraction a été observée après 6 mois à 45 °C, ce qui est probablement dû à une diminution de la Tg à cause d'une augmentation de la teneur en humidité du gâteau. 2. Morphologie_des_liposomes_par_microscopie électronique
La structure des liposomes a également été analysée par microscopie électronique à transmission au moyen d'un Zeiss Libra120. Une analyse par coloration négative a été réalisée selon le procédé classique de coloration négative à deux étapes en utilisant du phosphotungstate de sodium comme agent de contraste (Hayat M.A. & Miller S.E., 1990, Negative Staining, Mc
Graw - Hill éd.), en utilisant des grilles de nickel revêtues de carbone-Formvar à décharge lumineuse (200 mesh) et en effectuant l'analyse à 100 kV. Les échantillons ont également été analysés par cryo-microscopie à 80 kV, sans aucun agent de contraste, après vitrification à 107 °K dans les trous d'une maille en plastique revêtue de carbone (Dubochet et al., 1987, dans Cryotechniques in Biological EM ; R.A. Steinbrecht and K. Zierold, éd ; Springer Verlag). L'analyse a montré que dans les solutions tamponnées au phosphate, la morphologie des liposomes était conservée après la co-lyophilisation de RTS,S/AS01 et stable pendant 6 mois à 45 °C. 3. Interactions antigène-adjuvant L'interaction entre l'antigène RTS,S et les composants d'AS01, DOPC et cholestérol, est étudiée par ultracentrifugation dans un gradient de saccharose, puis par la quantification du RTS,S, de la DOPC et du cholestérol dans les fractions collectées. Les échantillons testés reconstitués dans 150 mM de NaCl sont comparés aux Mosquirix™ (RTS,S lyophilisé et reconstitué avec AS01 liquide). Comme pour le
Mosquirix™, aucune interaction n'a été observée entre le RTS,S et les composants de l'adjuvant. 4. Taille de particule des liposomes
La stabilité colloïdale a été évaluée par néphélométrie, qui a montré une stabilité légèrement plus élevée de la formulation tamponnée au phosphate par rapport aux formulations tamponnées au succinate. La taille des liposomes AS01 dans les échantillons co-lyophilisés a été mesurée par DLS, qui a montré un rayon hydrodynamique d'environ 95 nm (le rayon hydrodynamique dans la formulation liquide témoin est de 110 nm). Ceci est très probablement dû à la présence de PS80 dans la formulation (et n'est pas dû à l'étape de lyophilisation, ni à la présence de RTS,S). La taille des liposomes AS01 est restée stable au cours du temps à température élevée. Les résultats de la néphélométrie après incubation à différentes températures sont présentés sur la figure 3.
5. Taille des particules de RTS,S
La taille des particules de RTS,S a été mesurée par SEC-CLHP sur un TSKgel G5000PWXL avec détection par fluorescence (ÀEx : 280 nm/ÀEm : 320 nm) afin d'éviter
les interférences avec les composants de l'adjuvant quand la détection UV est utilisée. Le temps de rétention des particules de RTS,S dans les échantillons où l'adjuvant et l'antigène étaient co-lyophilisés était identique au RTS,S témoin purifié en vrac et est resté stable pendant 1 an à 4 et 30 °C, 6 mois à 37 °C et 3 mois à 45 °C.
6. Protéines RTS et S L'intégrité des protéines RTS et S a été démontrée par SDS-PAGE et ELISA. Les profils de SDS-PAGE n'ont pas changé pendant 1 an à 4 et 30 °C, 6 mois à 37 °C. A 45 °C, de légères traînées étaient visibles après 3 mois de stockage. Cependant, l'antigénicité par ELISA est restée stable pendant 1 an à 4 et 30 °C, 6 mois à 37 °C et 3 mois à 45 °C. L'antigénicité de RTS,S a été mesuré par un dosage ELISA à capture sandwich de mélange CS-S (revêtement avec un anti-CSP monoclonal et révélation avec un anti-S polyclonal). 7. Intégrité chimique des composants de l'adjuvant L'intégrité chimique des composants de l'AS01 (QS21 et MPL) a été évaluée, car il est connu que les deux composants sont sensibles à l'hydrolyse. Les congénères hydrolysés de QS21 (QS21H) et MPL sont quantifiés par des procédés CLHP. La concentration et l'hydrolyse de QS21 (QS21H) ont été déterminées par CLHP en phase inversée sur une colonne RP18 Symetry, avec détection UV à 214 nm. Les congénères du MPL ont été déterminés après dérivatisation avec du DNBA et par RP-CLHP sur une colonne C18 Waters Symmetry et détection de fluorescence (excitation à 345 nm et émission à 515 nm).
Le QS21H est resté en dessous de 3 % dans tous les échantillons lyophilisés. Au contraire, la teneur en QS21H dans la formulation adjuvante liquide de référence (1 mg/ml de DOPC, 0,25 mg/ml de cholestérol, 50 μg/ml de QS21, 50 μg/ml de MPL dans 10 mM de tampon au phosphate (pH 6,1), 150 mM de NaCl) a rapidement augmenté à température élevée (valeur supérieure à 3 % après 1 mois à 37 °C et après 3 mois à 30 °C).
Les congénères du MPL sont également restés stables pendant 12 mois à 30 °C et pendant 6 mois à 45 °C dans toutes les formulations lyophilisées. Au contraire, la formulation adjuvante liquide de référence n'est pas stable à température élevée, comme l'indique la désacylation du MPL (diminution de la proportion des congénères penta et hexa, conjointement avec une augmentation de la proportion des congénères tétra). La proportion est supérieure à 35 % après 1 mois à 45 °C, après 3 mois à 37 °C ou après 6 mois à 30 °C. 8. Immunogénicité préclinique L'immunogénicité des échantillons co-lyophilisés a été comparée à l'immunogénicité du Mosquirix™ chez un modèle murin. Les réponses de type anticorps et les réponses de type lymphocyte T CD8 dirigées à la fois contre l'antigène S et l'antigène CS ont été évaluées, et les réponses CD4 dirigées contre l'antigène S ont été évaluées chez des souris CB6F1.
Des groupes frais de leucocytes collectés à différents moments temporels ont été stimulés pendant 6 heures avec des pools de peptides 15-mère recouvrent la séquence CSP ou HBs. Les réponses cellulaires spécifiques de CSP et de HBs ont été évaluées par ICS qui mesure la quantité de lymphocyte T CD4+ et CD8 + exprimant l'IFN-γ et/ou l'IL-2 et/ou le TNFœ. Toutes les analyses ICS ont été réalisées en utilisant le logiciel FlowJo.
Les résultats de l'étude montrent que la colyophilisation de RTS,S et d'AS01 n'a pas d'impact sur l'immunogénicité (réponses cellulaires et humorales identiques à la fois pour RTS et S à T0, par rapport au Mosquirix™ actuel.
En outre, la co-lyophilisation RTS,S/AS01 s'est avérée stable pendant 1 an à 30 °C (et pendant 1 an à 30 °C plus 1 mois à 45 °C), 6 mois à 37 °C et 3 mois à 45 °C (sauf une légère augmentation des réponses de type lymphocyte T CD8+ spécifiques de Hbs observées après 3 mois à 37 °C, mais pas à 45 °C). Après reconstitution du RTS,S lyophilisé dans la formulation adjuvante liquide de référence préalablement mise en incubation pendant 3 mois à 37 °C, une légère augmentation des réponses de type lymphocyte T CD4+ spécifiques de CSP a été observée). La formulation adjuvante liquide de référence mise en incubation pendant 3 mois à 45 °C n'a pas pu être injectée car elle s'est avérée être hémolytique. La réponse immunitaire est illustrée sur la figure 2. 2. Exemple 2 - Co-lyophilisation d'un vaccin à base de gE de VZV/AS01 (unidose) L'antigène gE de VZV (également appelée gE dans le présent document) est une forme tronquée de la glycoprotéine E du virus varicelle-zona, possède la séquence divulguée sur la figure 4 et est obtenu comme divulgué dans l'exemple 2 du document WO 2006/094 756. AS01 fait référence à l'adjuvant du vaccin, comprenant du QS21, du 3D-MPL dans une formulation liposomique contenant du cholestérol.
La masse concentrée de liposomes utilisée est la même que celle décrite dans l'exemple 1. L'antigène, c'est-à-dire gE du VZV, et un adjuvant, c'est-à-dire AS01, ont été co-formulés à des fins de lyophilisation dans de l'eau pour injection en mélangeant : 1) 30 % de saccharose (ajouter 5 %) 2) 100 mM de tampon, PO4 (K/K2), pH 6,1 (ajouter 10 mM), 3) 40 mg/ml de masse de liposomes (ajouter 2,5 mg/ml), et 4) 5 mg/ml de QS21 (ajouter 0,125 mg/ml), puis la préparation adjuvante ainsi obtenue a été agitée pendant 15 à 45 minutes à température ambiante. Ensuite, 3 % (en poids/volume) de polysorbate 80 (ajouter 0,02 %) ont été ajoutés et le mélange a été agité pendant 15 à 45 minutes à température ambiante. L'antigène gE du VZV a été ajouté à 0,125 mg/ml et la solution obtenue a été agitée pendant 15 à 45 minutes à température ambiante. Le pH a été mesuré et ajusté à 6,1 si nécessaire.
Des formulations témoins contenant soit l'adjuvant, soit l'antigène ont été également préparées. Les échantillons testés étaient les suivants : 1) gE du VZV/AS01
2) gE du VZV 3) AS01.
Lyophilisation
Les formulations ainsi obtenues ont été introduites dans des flacons de verre (volume de remplissage de 0,5 ml) et lyophilisées en appliquant un cycle de lyophilisation de 40 heures, comme représenté sur la figure 1-B.
Evaluation
Le but de cette expérience était d'évaluer la faisabilité d'une co-lyophilisation d'un autre antigène (gE du VZV) avec l'adjuvant AS01. L'intégrité à la fois de l'antigène et de l'adjuvant a été évaluée directement après la co-lyophilisation.
La substance lyophilisée a été analysée après reconstitution avec 150 mM de NaCl et comparée à un vaccin témoin à base de gE du VZV (gE du VZV lyophilisé et reconstitué dans l'AS01 liquide ou dans une solution saline tamponnée (10 mM de phosphate, 150 mM de NaCl, pH 6,1). 1. Aptitude à l'injection
Les pH mesurés dans les différents groupes sont légèrement inférieurs (par exemple, environ de 0,4 unité) à celui du vaccin Shingrix témoin, bien que le pH ait été fixé à 6,1 dans les masses finales correspondantes (avant lyophilisation). L'osmolalité déterminée dans les 3 groupes est similaire à celle du témoin.
2. Morphologie_des_liposomes_par_microscopie électronique
La structure des liposomes a également été analysée par microscopie électronique à transmission avec coloration négative, en utilisant le même protocole que celui de l'exemple 1. L'adjuvant présentait la morphologie caractéristique du profit structurel d'AS01 au niveau EM, c'est-à-dire des liposomes de diverses tailles et formes, avec des perforations clairement visibles dans les membranes. Les antigènes gE putatifs ont été observés sous la forme d'une matière amorphe très petite dispersée entre les liposomes.
Le même profil a été observé dans l'échantillon gE/AS01 avant et après la lyophilisation, et dans le gâteau gE témoin reconstitué dans l'adjuvant AS01, ce qui indique que la morphologie des liposomes est conservée après la co-lyophilisation de gE/AS01. 3. Taille de particule des liposomes
La taille des liposomes AS01 dans les échantillons a été mesurée par DLS (dans les groupes contenant AS01), en montrant un rayon hydrodynamique d'environ 90 nm similaire au rayon hydrodynamique dans la formulation liquide témoin. La valeur obtenue était proche de la valeur attendue pour le liposome AS01
4. Taille de gE en solution
La taille de l'antigène gE a été mesurée par SEC-CLHP sur un TSKgel G4000PWXL avec détection par fluorescence (ÀEx : 280 nm/ÀEm : 320 nm) afin d'éviter les interférences avec les composants de l'adjuvant quand la détection UV est utilisée. Le temps de rétention du gE de VZV dans les échantillons où l'adjuvant et l'antigène étaient co-lyophilisés était identique au gE témoin purifié en vrac, ce qui indique le procédé de co-lyophilisation n'a aucun impact sur la taille de gE en solution.
5. Intégrité de la protéine gE L'intégrité de la protéine gE du VZV a été démontrée par une analyse SDS-PAGE des échantillons avant et après lyophilisation. Les profils de SDS-PAGE (voir la figure 5) étaient similaires pour les échantillons co-lyophilisés et le gE témoin du VZV (masse purifiée et produit médicamenteux), à la fois en condition réductrice (R) et en condition non réductrice (NR). Une petite bande de poids moléculaire plus élevé a été observée dans l'échantillon co-lyophilisé, qui correspond probablement à une agrégation, mais qui ne représente pas une quantité importante de protéines. Légende pour la figure 5
6. Activité_thérapeutique_in_vitro_(activité antigénique par ELISA) L'activité thérapeutique in vitro a été mesurée par ELISA dans les échantillons contenant le gE du VZV. Le test est un dosage ELISA par l'inhibition basé sur des anticorps polyclonaux humains dirigés contre des antigènes de la varicelle et du zona (VARITECT®).
En bref, des dilutions en série des échantillons contenant l'antigène gE du VZV sont mises en incubation avec une quantité fixée de VARITECT®. Après l'incubation, des anticorps humains anti-gE, qui ne réagissent pas avec les échantillons d'antigènes gE du VZV, sont détectés par incubation sur une microplaque revêtue de l'antigène gE. Le complexe antigène/anticorps est révélé par l'ajout d'un anticorps de lapin anti-IgG humaine marqué à la peroxydase, puis par l'ajout de tétraméthylbenzidine. L'activité antigénique du gE du VZV est obtenue en divisant la teneur en gE du VZV par la teneur en protéines (mesurée par Lowry). L'activité thérapeutique, qui peut seulement être appliquée aux récipients finaux, est obtenue en divisant la teneur en gE du VZV par le titre de l'étalon qui a été utilisé pour la validation du procédé.
Le rapport entre l'activité thérapeutique in vivo et la teneur en gE du VZV était proche de 1 dans tous les groupes testés, comme dans le témoin. Ces résultats confirment encore l'intégrité de l'antigène gE du VZV après lyophilisation en présence d'AS01.
7. Intégrité chimique des composants de l'adjuvant
Comme dans l'exemple 1, l'intégrité chimique des composants de l'AS01 (QS21 et MPL) a été évaluée dans les échantillons contenant AS01. Les congénères hydrolysés de QS21 (QS21H) et MPL sont quantifiés par des procédés CLHP. QS21H est resté sous 3 % dans tous les échantillons lyophilisés. Il n'y a eu aucun impact du procédé de lyophilisation sur l'intégrité chimique du MPL, comme l'indiquent les proportions similaires de congénères tétra, penta et hexa avant et après la lyophilisation dans les deux groupes.
QS21 déclenche une activité hémolytique quand il n'est pas désactivé avec du cholestérol au sein de la membrane liposomique. L'activité hémolytique a donc été évaluée dans les formulations contenant AS01, avant et après lyophilisation. Quelles que soient les conditions testées, le taux hémolytique est resté sous la ligne de base acceptable fixée à 1 % (voir la figure 6). Aucune d'entre elles n'a été responsable de la suppression de la désactivation de QS21.
Claims (44)
- REVENDICATIONS1. Composition séchée sous pression réduite à partir d'un mélange liquide comprenant un adjuvant qui comprend une saponine dans une formulation liposomique dans laquelle les liposomes contiennent un lipide neutre et un stérol, et, un cryoprotecteur qui est un sucre amorphe.
- 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle le séchage sous pression réduite est réalisé par lyophilisation.
- 3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le mélange liquide est un mélange aqueux.
- 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le lipide neutre est une phosphatidylcholine choisie parmi la phosphatidylcholine de jaune d'œuf, la dioléoyl phosphatidylcholine (DOPC) ou la dilauryl phosphatidylcholine, de préférence la DOPC.
- 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la saponine est QS21.
- 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le stérol est le cholestérol.
- 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'adjuvant comprend en outre un agoniste de TLR-4.
- 8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle l'agoniste de TLR-4 est un lipopolysaccharide.
- 9. Composition selon la revendication 7 ou 8, dans laquelle l'agoniste de TLR-4 ou le lipopolysaccharide est le 3D-MPL.
- 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un antigène.
- 11. Composition selon la revendication 10, dans laquelle l'antigène est une protéine, telle qu'une protéine recombinante.
- 12. Composition selon la revendication 10 ou 11, dans laquelle l'antigène est dérivé de Plasmodium falciparum, de Mycobacterium tuberculosis, du VIH, de Moraxella, de ntHi ou du virus varicelle-zona.
- 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans laquelle l'antigène est choisi parmi RTS,S, M72, UpsA, PiLa, PE-Pila et gE du VZV ou une forme tronquée de ceux-ci.
- 14. Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, contenue dans un unique flacon.
- 15. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est un sucre amorphe ou un mélange de sucres amorphes.
- 16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est choisi dans le groupe des sucres amorphes consistant en le saccharose, le tréhalose, le lactose, le raffinose et leurs combinaisons.
- 17. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est présent en une quantité suffisante pour permettre un stockage pendant 12 à 24 à 36 mois à 30 °C, 6 à 12 mois à 37 °C, ou, 6 mois à 45 °C.
- 18. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est présent en une quantité de 3 à 10 % (en poids/volume) du mélange liquide.
- 19. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur comprend du saccharose.
- 20. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur comprend du tréhalose.
- 21. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est une combinaison d'au moins deux cryoprotecteurs choisis parmi le saccharose, le tréhalose et le dextrane.
- 22. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est présent dans le mélange en une quantité totale d'au moins 3 %, d'au moins 4 %, d'au moins 5 % ou d'au moins 6 % (% en poids/volume).
- 23. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est présent dans le mélange en une quantité totale inférieure à 10 %, inférieure à 8 %, inférieure à 7 %, inférieure à 6 % ou inférieure à 5,5 % (% en poids/volume).
- 24. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le cryoprotecteur est présent dans le mélange en une quantité totale d'au moins 4 %, d'au moins 4,5 % ou d'au moins 5 %, et, inférieure à 10 %, inférieure à 8 %, inférieure à 7 % ou inférieure à 6 % (% en poids/volume).
- 25. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le mélange liquide comprend au moins 5 % ou entre 5 et 10 % (% en poids/volume) de saccharose, de tréhalose ou d'une combinaison de ceux-ci.
- 26. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un tampon.
- 27. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant un pH d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 5,5, d'au moins 5,8, d'au moins 6.
- 28. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant un pH inférieur à 9, inférieur à 8, inférieur à 7,5, ou inférieur à 7.
- 29. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, ayant un pH entre 4 et 9, entre 5 et 8, entre 5,5 et 7,5 ou entre 5,8 et 6,4.
- 30. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un tampon choisi parmi l'acétate, le citrate, l'histidine, le maléate, le phosphate, le succinate, le tartrate et le TRIS.
- 31. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un tampon qui est un phosphate, tel que Na/Na2PO4, Na/K2PO4 ou K/K2PO4.
- 32. Composition selon l'une quelconque des revendications 25 à 30, dans laquelle le tampon est présent dans le mélange liquide en une quantité d'au moins 6 mM, d'au moins 10 mM ou d'au moins 40 mM.
- 33. Composition selon l'une quelconque des revendications 25 à 31, dans laquelle le tampon est présent dans le mélange liquide en une quantité inférieure à 100 mM, inférieure à 60 mM ou inférieure à 40 mM.
- 34. Composition selon l'une quelconque des revendications 25 à 32, dans laquelle le tampon est un phosphate présent dans le mélange liquide en une quantité située entre 6 et 40 mM, tel qu'environ 10 mM.
- 35. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un tensioactif.
- 36. Composition selon la revendication 34, dans laquelle le tensioactif est le polysorbate 80 ou le poloxamère 188.
- 37. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une reconstitution/reconstituée avec une solution isotonique, telle qu'une solution saline, avant administration à un mammifère.
- 38. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation en vaccination.
- 39. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la composition comprend de multiples doses, tel qu'au moins 4 doses, pour vacciner des sujets en ayant besoin.
- 40. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 39, comprenant les étapes suivantes : i. le mélange : a. d'une préparation liposomique liquide comprenant des liposomes contenant un lipide neutre et un stérol, et facultativement le lipopolysaccharide ; b. la saponine ; c. le cryoprotecteur ; d. facultativement l'antigène ; e. facultativement le tampon ; f. facultativement un tensioactif ; et, ii. le séchage du mélange liquide obtenu à l'étape (i) sous pression réduite.
- 41. Procédé selon la revendication 40, dans lequel la préparation liposomique liquide ne contient pas de cryoprotecteur.
- 42. Procédé selon l'une quelconque des revendications 40 à 41, dans lequel le séchage à l'étape ii est réalisé par lyophilisation.
- 43. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la durée du cycle de lyophilisation est inférieure à 48 heures, telle qu'inférieure à 30 heures.
- 44. Procédé selon l'une quelconque des revendications 40 à 43, dans lequel l'ordre pour le mélange est tout d'abord le mélange du cryoprotecteur (i.c.) et du tampon (i.e.), suivi par l'ajout de la préparation liposomique liquide (i.a.), de la saponine (i.b.), du tensioactif (i.f.) et de l'antigène (i.d.) respectivement.
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