BE1014638A6

BE1014638A6 - Methode de preparation de derives de la paroi cellulaire a partir de biomasse.

Info

Publication number: BE1014638A6
Application number: BE2002/0093A
Authority: BE
Inventors: Marie-France Versali; Fabienne Clerisse
Original assignee: Univ Liege
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2002-02-12
Publication date: 2004-02-03
Also published as: CA2475258C; DE60307603D1; ES2271605T3; AU2003215555B2; CA2475258A1; EP1483299A1; WO2003068824A1; DE60307603T2; US7556946B2; CN1642986A; AU2003215555A1; EP1483299B1; JP2005529191A; DK1483299T3; ATE336516T1; US20050130273A1

Abstract

L'invention concerne une méthode d'extraction de dérivés de la paroi cellulaire à partir de biomasse fongique ou de levure. Plus particulièrement l'invention concerne une méthode d'extraction de polymères de chitine purs, n'entraînement pas la dégradation ni la transformation de la chitine. La présente invention concerne également une méthode de préparation de chitosane à partir de chitine obenue. En outre , l'invention concerne des polymères de chitine ou du chitosane et leur utlisation dans des applications industrielles ou pharmaceutiques.

Description

Méthode de préparation de dérivés de la paroi cellulaire à partir de biomasse
La présente invention concerne une méthode de préparation de dérivés de la paroi cellulaire. En particulier, l'invention décrit une méthode de préparation de polymères de chitine et du chitosane à partir de biomasse fongique ou de levure. L'invention concerne également les polymères de chitine ou du chitosane et leur utilisation dans des applications pharmaceutiques, agricoles, alimentaires, cosmétiques, industrielles et/ou environnementales.

Les polysaccharides d'origine naturelle tels que l'amidon, la cellulose ou la chitine, ont une importance technologique considérable, car ces polysaccharides sont aisément disponibles et possèdent de caractéristiques uniques qu'on ne retrouve pas auprès des polymères de fabrication artificielle. Par exemple, les parois des champignons sont constituées d'une association de polysaccharides, protéines et lipides. Parmi les polysaccharides, on trouve des glucans et de la chitine.

La chitine est un polymère naturel largement distribué dans le règne vivant. La chitine peut être définiée comme substance organique de structure semblable à celle de la cellulose (polysaccharide), constituant de la cuticule des insectes et des crustacés, et de la membrane de certains champignons. Sa production annuelle est estimée à plusieurs milliards de tonnes.

La chitine est un polymère de haut poids moléculaire, non toxique et biodégradable. C'est après la cellulose, le polysaccharide le plus répandu dans la nature. Le chitosane est obtenu après une modification chimique de la chitine. La chitine et le chitosane sont des polysaccharides appartenant à la famille des glycosaminoglycanes (GAG).

La chitine est constituée d'une chaîne linéaire de groupes acetylglucosamine est peut être représentée par la formule générale I. Plus particulièrement, la chitine est un polymère N-acétylé de P-1,4-(D)-glucosamine fortement insoluble.

Comme la cellulose la chitine est une fibre mais elle a en plus des caractéristiques chimiques et biologiques exceptionnelles utilisables dans de nombreuses applications industrielles et médicales. Néanmoins, il est plus difficile d'obtenir de la chitine que par exemple de la cellulose, dû à sa présence dans des complexes avec des substances indésirables, desquelles elle doit être isolée et purifiée.

Formule 1 : chitine
EMI2.1

Le chitosane est obtenu en enlevant suffisamment de groupes acéthyl (CH3-CO) pour permettre à la molécule d'être soluble dans la plupart des acides dilués. Le chitosane est représenté par la structure générale II. Le chitosane est dérivé d'un produit naturel issu de la biomasse, la chitine. Le chitosane est caractérisé par deux facteurs principaux : viscosité et son degré de déacétylation.

Structure Il : le chitosane
EMI2.2

Pour obtenir de la chitine et du chitosane utilisables industriellement, la chitine et le chitosane sont actuellement produis généralement à partir de déchets de carapaces de crustacés, tels que des crevettes et/ou des crabes, par une décalcification et une déprotéination afin d'isoler la chitine, suivi par une déacétylation utilisant une solution alcaline chaude et concentrée. Cependant, cette matière première de chitine présente des désavantages notamment liés à un contenu élevé en minéraux et une variabilité saisonnière et interspécifique de la composition de la matière. Par conséquence, le fournissement régulier de cette matière première ayant une qualité fixe est particulièrement difficile.

De plus, en stockant cette matière pendant une longue période afin d'éliminer un tel inconvénient, elle

se décompose donnant une mauvaise odeur et résultant en une diminution du poids moléculaire. En outre, la méthode d'extraction livre un produit de qualité hétérogène et de composition chimique variable (variabilité de la longueur de chaîne), deux caractéristiques pourtant essentielles aux yeux des utilisateurs potentiels. Aussi, cette méthode exige une énergie calorifique considérable et l'utilisation d'alkali caustique, ce qui présente des risques de santé potentiels. De plus, les frais de production sont élevés dû au traitement acide exigé pour l'isolement de la chitine des quantités régnantes de carbonate de calcium atteignant jusqu' à 90% du poids sec.

Donc, cette méthode produit également des grandes quantités de déchets pour lesquelles des installations de traitement coûteuses sont nécessaires.

Il existe cependant des sources alternatives d'exploitation de la chitine et du chitosane. C'est le cas notamment des champignons qui possèdent pour la plupart de la chitine dans leurs parois, jusqu'à 40% du poids sec des parois pour certaines espèces. Le mycélium fongique est formé par des cellules, assemblées en filaments organisés qui forment un réseau complexe. La paroi du mycélium est composée d'hémicellulose, de chitine et de glucans. Des champignons, ayant de la chitine dans leurs parois peuvent donc être cultivés pour l'extraction de cette chitine et du chitosane.

En outre, des résidus de procédés de fermentation industrielles tels que la biomasse récupérée après la fermentation conditionnée de champignons ou de levures contiennent également de la chitine accompagnée d'autres biopolymères, principalement des glucans, des mannans, des protéines et des lipides. Ces résidus sont généralement incinérés immédiatement après séparation des milieux de culture ou des cuves de fermentation leur stockage étant peu économique. Ils pourraient également être utilisés comme source de chitine et ses dérivés.

Afin de permettre l'utilisation de chitine et de chitosane dans plusieurs domaines industriels, la chitine et le chitosane doivent être d'une qualité uniforme et pure et le chitosane doit avoir un taux de déacétylation très élevé. C'est pourquoi la préparation de chitosane à partir d'une source de chitine extrêmement pure serait préférable afin obtenir du chitosane très pure, uniforme, d'une qualité supérieure et avec un taux de déacétylation particulièrement élevé ( > 90%). De plus, si la chitine utilisée comme source de préparation de chitosane est très pures, ceci facilitera la préparation du chitosane et permettra également d'obtenir un chitosane de qualité très pure.

Plusieurs documents, par exemple US pat. No. 4,960,413, US pat. No. 6,255,085, US pat. No. 4,195,175, US pat. No. 4,368,322, US pat. No. 4,806,474, US pat. No. 5,232,842, US pat. No. 6,333,399, WO-A-0,168,714, GB-A-458,839, GB-A-2,026,516, GB-A-2,259,709, DE-A-2,923,802 et RU-C-2,043,995, font référence à l'utilisation de mycélium comme source

de chitine. Ces documents réfèrent à des méthodes permettant d'obtenir du chitosane ou un complexe chitosane-glucan à partir de mycélium fongique. En plus, les travaux décris dans ces documents portent sur une transformation directe in situ de la chitine contenue dans les parois des champignons sans passer par une étape d'extraction de la chitine seule permettant de l'obtenir sous une forme isolée.

Donc, suivant les méthodes décrites par ces documents, il n'est pas possible d'obtenir des polymères de chitine, qui pourraient être utilisés comme source pour la production de chitosane. De ce fait, les méthodes décrites utilisent des solutions alcalines dans des conditions sévères de concentration, durée et température. Il est également important de noter que ces méthodes utilisent des procédés très polluants, notamment due à l'utilisation de solutions alcalines concentrées et de solutions acides. En outre, même si ces méthodes décrivent des moyen de production de chitosane, elles ne parviennent pas à obtenir du chitosane ayant une pureté souhaitable.

D'autres publications concernent des études de la paroi de champignons et mentionnent l'analyse de la fraction alkali-insoluble extraite du mycélium (Hartland et al.

1994, Yeast, 10, 1591-1599; Hong et al. 1994, Yeast, 10, 1083-1092; Hearn et al. 1994, Microbiology, 140, 789-795; Fontaine et al. 2000, Journal of Biological Chemistry, 275, 27594-27607). Ces analyses portent soit sur un complexe chitine-glucans dans lequel l'association entre les deux composants est toujours présente. Soit certains travaux mentionnent l'utilisation d'enzymes pour dégrader les composants, notamment des glucanases mais en association avec la chitinase ce qui entraîne une hydrolyse à la fois des glucans et de la chitine. Mais dans ce cas, la chitine ne peut plus être récupérée sous la forme d'un polymère, ce qui est souhaitable afin d'être utilisé comme source pour la production de chitosane.

Comme on le comprendra, les méthodes décrites dans les documents mentionnés ci- dessus ont plusieurs inconvénients considérables. La chitine extraite selon ces méthodes est principalement obtenue comme substance de monomère et non pas comme une substance polymère intacte. En plus, la chitine et le chitosane obtenus ne sont pas d'une pureté souhaitable. Enfin, tous ces documents impliquent des méthodes de préparation de chitine ou de chitosane peu économique au point de vu énergétique et environnemental, dû à l'application de conditions de réactions agressives comprenant l'utilisation de solutions alcalines fortement concentrées et de solutions acides et le maintien de haute températures pendant le procédé d'extraction.

La présente invention fournit une méthode d'extraction de chitine à partir de biomasse fongique ou de levure afin d'obtenir des polymères de chitine pures, qui ensuite peuvent être

employés dans la préparation de chitosane pure ayant un taux de déacétylation élevé et controlé. Dans un aspect important la présente invention a pour but de fournir une méthode de préparation de chitine qui en premier lieu évite les inconvénients cités ci-dessus. Plus particulièrement, I' invention a pour but de permettre d'obtenir à rendement élevé des polymères purs de chitine, ayant une qualité uniforme.

D'autant plus, vu que la chitine est associée de façon covalente aux glucans dans le mycélium fongique, la présente invention procure une méthode qui hydrolyse cette liaison entre les glucans et la chitine sans toutefois dégrader ni transformer la chitine.

En plus, la présente invention a pour objectif de produire du chitosane d'une qualité extrêmement pure à partir des polymères de chitine pures obtenus. La méthode de production de chitosane permet d'obtenir une substance avec une longueur de la chaîne moléculaire et un taux de déacétylation parfaitement maîtrisé. Du plus, l'invention a pour objectif de produire du chitosane selon une méthode non-polluante.

Un autre objectif de la présente invention comprend la production rapide de la chitine et du chitosane en utilisant un processus qui évite des consommations d'énergie importantes.

En outre, la méthode de l'invention doit fournir une méthode alternative de production de chitine et de chitosane sans devoir se lier à l'utilisation de produits chimiques étant nocifs pour l'environnement.

Un autre aspect important de l'invention est de suivre la méthode d'extraction la plus extensive possible afin de permettre l'utilisation des produits finaux, c'est à dire les polymères purs de chitine et du chitosane, dans différentes applications techniques ou médicales.

Dans un premier aspect la présente invention concerne une méthode de préparation de dérivés de la paroi cellulaire à partir de biomasse fongique ou de levure comprenant les étapes de - extraire de la biomasse à l'aide d'une première solution alcaline, par laquelle une fraction alkali-insoluble est obtenue; - réagir la fraction alkali-insoluble après acidification en présence d'une ss-1,3-glucanase, par laquelle une fraction alkali-insoluble non-hydrolysée est obtenue; réagir la fraction alkali-insoluble non-hydrolysée en présence d'une deuxième solution alcaline par laquelle des dérivés de la paroi cellulaire sont obtenus.

Plus particulièrement, la méthode de l'invention décrit une méthode d'extraction pour obtenir des polymères de chitine.

Dans un deuxième aspect la présente invention concerne une méthode de préparation de chitosane à partir de la chitine obtenue selon la méthode de l'invention comprenant les étapes de - hydrater la chitine à l'aide d'une solution alcaline, par laquelle la chitine devient partiellement déacétylée ; - réagir la fraction alkali-insoluble après acidification en présence d'une chitine déacetylase, par laquelle du chitosane est obtenu; précipiter le chitosane; et - recycler la solution alcaline après concentration.

L'invention fournit une production industrielle écologique de chitine et de chitosane à partir du biomasse fongique ou de levure par un procédé non-polluant afin d'obtenir de la chitine extrêmement pure et du chitosane ayant une masse molaire élevée et un taux de déacétylation supérieure à 90%.

Dans un autre aspect important, l'invention concerne des polymères de chitine ou du chitosane obtenus par les méthodes selon l'invention.

De plus, la présente invention concerne l'utilisation des polymères de chitine ou du chitosane dans des applications pharmaceutiques, biomédicales, agricoles, alimentaires, cosmétiques, industrielles et/ou environnementales.

L'invention concerne une méthode de préparation de dérivés de la paroi cellulaire à partir de biomasse fongique ou de levure comprenant les étapes de extraire de la biomasse à l'aide d'une première solution alcaline, par laquelle une fraction alkali-insoluble est obtenue; - réagir la fraction alkali-insoluble après acidification en présence d'une ss-1,3-glucanase, par laquelle une fraction alkali-insoluble non-hydrolysée est obtenue; réagir la fraction alkali-insoluble non-hydrolysée en présence d'une deuxième solution alkaline par laquelle les dérivés de la paroi cellulaire sont obtenus.

Plus particulièrement, l'invention décrit une méthode d'extraction afin d'obtenir des polymères de chitine. Sous le terme 'polymères' on comprend une substance de haute masse moléculaire caractérisées par une chaîne d'une ou de plusieurs types d'unités monomères. Généralement, les polymères sont constitués d'au moins trois unités monomères liées par liaison covalente à au moins une autre unité monomère ou une autre substance réactive. Au sens de la présente définition, on entend par unité monomères la forme réagie d'un monomère dans un polymère.

Comme la chitine est un polymère de ss-1,4-(D)-glucosamine le terme 'polymères de chitines' réfère à la chitine comprenant plus de trois monomères de beta-1,4-(D)-glucosamine et de préférence, plus de 10 monomères de glucosamine, ou encore plus souhaitable de plus de 20 monomères de glucosamine. Il est important de remarquer que les polymères de chitine, décris dans la présente invention concernent des polymères établie par des liaisons des éléments monomères (glucosamines) par une liaison covalente de C1 à C4.

La présente invention permet l'exploitation de la chitine contenue dans le mycélium de champignons et la mise au point d'une méthode permettant d'extraire de la chitine des parois de champignons. Il a été démontré que la chitine et les glucans sont associés de façon covalente. C'est pourquoi la difficulté d'extraction de la chitine en état pure des ces sources fongiques réside dans l'hydrolyse de la liaison entre les glucans et la chitine sans toutefois dégrader ni hydrolyser la chitine. La présente invention procure une méthode qui permet de résoudre cette difficulté.

Sous la méthode d'extraction on comprend l'utilisation d'un premier traitement alcalin dans des conditions définiées par une solution à concentration alcaline de moins de 2% et des températures ambiantes, de préférence de moins de 20 C. Ce traitement permet d'éliminer les composés alkali-solubles, y compris des pigments, protéines, lipides, et certains glucans, mais n'entraîne pas de dégradation ni de transformation de la chitine. De plus, la fraction alkali-soluble, obtenue après une première réaction dans une solution alcaline et comprenant essentiellement des protéines et des lipides, peut être employée après neutralisation comme additif alimentaire, en particulier dans l'alimentation animale. Ce premier traitement alcalin est suivi d'un traitement enzymatique en présence de glucanases afin d'hydrolyser la liaison covalente chitine-glucans.

Ensuite, ce traitement enzymatique est suivi d'un deuxième traitement alcalin pour achever la séparation complète des deux composés, chitine et glucans, et isoler ainsi la chitine. La méthode selon l'invention concerne une méthode qui est caractérisée en ce que la deuxième solution alcaline a une concentration de 2 à 4% et est ajoutée à la biomasse à une température de 50-70 C.

Différents avantages de cette méthode peuvent être mis en avant. La technique permet d'extraire de la chitine avec un grand degré de pureté alors que les autres méthodes connues fournissent du chitosane ou un complexe chitine-chitosane-glucans. La méthode d'extraction est une méthode qui ne dégrade pas la chitine, contrairement à d'autres méthodes renseignées qui emploient soit des alkalis dans des conditions sévères, soit une chitinase qui est une hydrolase dépolymérisant la chitine. De plus, la méthode décrite ici n'emploie pas de détergent agressif, ni d'acide. La méthode permet de produire de la chitine

à partir d'une source alternative non-animale, comme du mycélium fongique. Enfin, les solutions alcalines utilisées dans cette méthode peuvent également être recyclées et réutilisées dans le procédé d'extraction.

La chitine obtenue peut éventuellement, si nécessaire, subir un traitement de blanchiment en présence par exemple de chlorite de sodium.

De la chitine peut être extraite et produite à partir de mycélium provenant de la culture de champignons appartenant à différents groupes y compris aux Zygomycètes, aux Ascomycètes, aux Plectomycètes, aux Streptomycètes, aux Pyrenomycètes, ou aux Discomycètes. En outre aussi des levures comme Saccharomyces peuvent également être utilisées comme source de chitine. Le mycélium peut également provenir de cultures de champignons réalisées pour la production d'autres composés comme l'acide citrique, des enzymes, des antibiotiques. Les résidus provenant de tels procédés de fermentation peuvent ainsi être utilisés pour la préparation de chitine. La méthode ne nécessite donc pas de réaliser une culture de champignons pour obtenir la matière première puisqu'elle peut être fournie par des résidus de fermentation industrielle.

Plus particulièrement, la méthode selon l' invention concerne l'extraction de chitine de biomasse qui est choisie parmi le groupe comportant des espèces d' Aspergillium, Penicillium, Trichoderma, Saccharomyces, et/ou des mélanges. Un caractéristique commun de ces champignons ou levures est la présence de chitine dans leurs parois cellulaires.

Par exemple, le mycélium peut provenir de résidus d'Aspergillus niger résultant de la production d'acide citrique. Le mycélium contient 70 à 80% d'eau et au total de 10 à 20% de chitine (estimation par rapport au poids sec de matériel). La mesure du contenu en chitine est réalisée sur base du dosage de la N-Acetyl glucosamine (méthode de Reissig et al, 1955, J.

Biol. Chem., 217, 959) libérée après incubation du matériel en présence de chitinase et de chitobiase (méthode de Jeuniaux, 1963, In : Chitine et chitinolyse : un chapitre de biologie moléculaire. Masson éd., Paris, p181).

La biomasse humide (70 à 80% d'eau) est traitée en présence d'une solution d'alkali, par exemple NaOH, faiblement concentré, 1 à 2% (w/v), pendant 24 heures sous agitation douce, à une température comprise entre 4 C et 20 C maximum. Le rapport entre la biomasse et la solution d'alkali est de 1 : 2 à 1 :4 (w : v). Ce traitement permet d'éliminer les composés alkali-solubles comme les pigments, les protéines, des glucans, des lipides. Le fait de réaliser cette étape dans des conditions de faible concentration d'alkali et de basse température est important. Cette précaution évite non seulement toute dégradation de la

chitine, hydrolyse ou transformation, mais favorise également le traitement enzymatique suivant en entraînant un gonflement de la matrice fibrillaire.

Les conditions appliquées ici sont très différentes de ce qui figure dans les autres brevets ou publications dans lesquels on renseigne l'utilisation d'une forte concentration en alkali et/ou une température élevée. Dans ces conditions, on obtient généralement la transformation de chitine en chitosane sans toutefois obtenir une séparation de la chitine et des glucans associés. En utilisant telles conditions, une dégradation de la chitine et une nette diminution du rendement final d'extraction de la chitine peut être observé. Le traitement enzymatique par les glucanases se révèle également nettement moins efficace.

Après traitement du mycélium avec la solution alcaline, le matériel est filtré et ensuite lavé en présence d'eau. Les lavages sont poursuivis jusqu'à élimination des composés alkali- solubles et de toute trace d'alkali. En fin de lavage, le matériel affiche un pH neutre. Afin de diminuer le nombre de lavages, le mélange contenant le matériel en solution alcaline peut être préalablement neutralisé par ajout d'une solution d'acide dilué, par exemple HCI 0. 5 N. A ce stade, le matériel résiduel est composé essentiellement de chitine et de ss-glucans associés de façon covalente.

Le matériel résiduel est ensuite soumis à un traitement enzymatique en présence d'une préparation riche en ss-glucanases. Les préparations utilisées contiennent principalement des endo-1,3-(3-glucanases mais doivent être dépourvues de toute activité de type chitinase. Des préparations commerciales comme Zymolyase 20T (ICN biomedicals), Finizym (Novo Nordisk), Quantazym (Quantum Biotechnologies) peuvent être utilisées. Des préparations " maison " de ss-glucanases d'origine microbienne peuvent aussi être utilisées.

L'absence de chitinase dans ces préparations doit être vérifiée. Si nécessaire, il convient de procéder à une purification préalable afin d'éliminer toute trace de chitinase. Cette précaution est essentielle pour garantir l'efficacité de la méthode et le rendement d'extraction de la chitine.

Le traitement est réalisé dans du tampon citrate sodique à pH 5. 5 de manière à favoriser l'activité de type glucanase, pendant 1 à 5 jours, à 37 C sous une agitation modérée. L'incubation peut éventuellement être répétée une seconde fois afin d'augmenter l'efficacité de l'hydrolyse enzymatique des glucans.

Le matériel est ensuite filtré et lavé à l'eau afin d'éliminer l'enzyme et les produits d'hydrolyse. Il est ensuite soumis à un traitement alcalin afin d'achever l'hydrolyse des glucans associés à la chitine. Le traitement est réalisé en présence d'une solution alcaline, NaOH par exemple, faiblement concentrée, 2 à 4%, à une température comprise entre 50 C

et 70 C, pendant une durée de 15 à 60 minutes. Le matériel est ensuite filtré et lavé en présence d'eau jusqu'à élimination complète des produits d'hydrolyse et des résidus d'alkalis.

Afin de limiter le nombre de lavages, le mélange peut être préalablement neutralisé par ajout d'une solution d'acide dilué, par exemple HCI 0. 5 N.

Selon un autre aspect de la méthode la chitine est obtenu à un rendement d'extraction de 80 à 100 %, de préférence de 90 à100%.

Grâce a cette méthode il est possible d'obtenir de la chitine de qualité extrêmement pure. La chitine obtenu peut ensuite être utilisée telle quelle ou transformée en un de ses dérivés, du chitosane par exemple.

Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de préparation de chitosane à partir de la chitine obtenue selon la méthode décrite ci-dessus, comprenant les étapes de hydrater la chitine à l'aide d'une solution alcaline, par laquelle la chitine devient partiellement déacétylée ; - réagir la fraction alkali-insoluble après acidification en présence d'une chitine déacetylase, par laquelle du chitosane est obtenu; précipiter le chitosane; et - recycler la solution alcaline après concentration.

Selon cette méthode, la chitine pure obtenu selon la méthode décrite ci-dessus est traitée dans une solution très concentrée de 40-50% de NaOH à une température de 30-70 C, de préférence de 50 à 70 C, pour hydrater ou rendre accessible les sites fonctionnels de la chitine. Pour éviter l'hydrolyse de la chitine il faut diminuer l'activité d'eau et travailler dans un milieu très concentré de NaOH. Le produit est dilué à 10% de NaOH filtré et lavé par l'eau distillé. Les eaux-mères sont récoltées, concentrées par l'évaporation de l'eau jusqu'à une concentration de 50% et ensuite recyclées dans les traitements chimiques. Le résidu de filtration est ensuite lavé jusqu'à pH neutre, mis en suspension à 1% de matière sèche.

La suspension de la chitine, partiellement déacétylée, est acidifiée jusqu'à pH 5-5,5 et on y ajoute l'enzyme chitine déacétylase. La réaction enzymatique est maintenue pendant 48 heures pour compléter la déacétylation jusqu'à minimum 90%. Après neutralisation jusqu'à pH 7-7,5 le produit précipité est filtré, lavé et séché.

En réagissant la chitine en présence d'une solution alcaline concentrée, il est possible d'obtenir du chitosane selon un procédé de déacétylation. Cette méthode de préparation de chitosane à partir de chitine très pure et avec une masse moléculaire très élevée permet d'obtenir également du chitosane extrêmement pure. De plus, la méthode de production de chitosane fournit du chitosane avec une masse molaire très élevée, et avec une longueur de

la chaîne moléculaire et un taux de déacétylation parfaitement maîtrisé. De préférence, le taux de déacétylation comprend plus de 90 %. En outre, la pureté de la chitine permet le recyclage de NaOH ce qui rend le procédé non-polluant.

Suivant cette méthode il est également possible d' éliminer ou de recycler des quantités de solutions alcalines ayant des concentrations considérables et étant très polluantes.

Selon un autre aspect de l'invention une fraction alkali-soluble, comprenant essentiellement des protéines et des lipides, peut être éliminée après réaction avec une solution alcaline. Après neutralisation cette fraction alkali-soluble peut éventuellement être employée comme additif alimentaire, en particulier dans l'alimentation animale.

Selon un autre aspect l'invention fournit des polymères de chitine ou du chitosane.

Des perspectives s'offrent à des polymères de chitine et du chitosane très pures dont la longueur de la chaîne moléculaire et le taux de déacétylation sont parfaitement maîtrisés. En effet, la médecine, l'alimentation, la nutrition, la cosmétologie, l'agriculture, l'environnement, le textile et sans doute bien d'autres secteurs sont concernés par ces substances aux multiples vertus y compris leur effet cationique, leur caractère biodégradable, non toxique, non allergénique, antifongique, antibactérien ou antiviral. C'est pourquoi, l'invention fournit des polymères de chitine et du chitosane qui peuvent être employés comme médicaments. La méthode selon l'invention concerne également l'utilisation des polymères de chitine ou du chitosane dans la préparation d'un médicament.

Selon un autre aspect l'invention fournit une composition pharmaceutique comprenant des polymères de chitine ou du chitosane obtenus selon les méthodes de l'invention et un agglomérant approprié.

Les utilisations commerciales utilisant des polymères de chitine ou ces dérivés comme le chitosane incluent des usages pharmaceutiques. La chitine et le chitosane, biopolymères naturels, n'ont aucun caractère antigénique et de ce fait sont parfaitement compatibles avec les tissus vivants. Leur caractère antithrombogène et hémostatique confirme leur possibilité d'emploi dans tous les domaines de la biologie. La chitine et le chitosane ont des capacités cicatrisantes. Le chitosane forme des films perméables à l'air. Il favorise la régénération cellulaire tout en protégeant les tissus des agressions microbiennes.

Par exemple, en empêchant la formation des brins de fibrine dans des blessures, le chitosane empêche la formation de cicatrices. En raison de leurs caractéristiques, la chitine et le chitosane peuvent être utilisé pour former des sutures, des pansement, et d'autres agents curatifs avec des caractéristiques qu'on ne retrouve pas dans d'autres produits. En outre, puisque le lysozyme présent dans des blessures dégrade la chitine, on peut faire des sutures et des pansements qui se décomposent au lieu de devoir être retirés. On a reconnu,

de plus, au chitosane une activité biostimulante sur la reconstitution de tissus.

Cette propriété a permis la fabrication d'une peau artificielle utilisée pour les greffes aux grands brûlés et des applications en chirurgie comme les fils de suture en chitine, qui se résorbent naturellement après cicatrisation. De par sa biocompatibilité avec les tissus du corps humain, les propriétés cicatrisâtes de la chitine et du chitosane ont démontré leur efficacité pour toute forme de pansements mais aussi dans la réparation osseuse ou en chirurgie dentaire dans les implants ou la cicatrisation des gencives. Parmi les réalisations, citons aussi les lentilles de contact bien tolérées. Dans les crèmes dentifrices, il garde la pâte saine et revivifie les gencives en mauvais état. Enfin le chitosane est un excellent support pour le transport et le relargage lent, de principes actifs médicamenteux, chez lez végétaux, animaux et les hommes.

Non digéré par l'estomac, il est par exemple un bon retardateur dans la délivrance de produits encapsulés devant arriver sans transformation dans l'intestin.

La chitine et le chitosane sont biodégradables. Des enzymes, la chitinase et la chitosanase scindent ces biopolymères en oligopolymères pris en charge par le métabolisme.

C'est dans ce domaine que les propriétés bactériostatique, immunologique, antitumorale, cicatrisante, hémostatique, anticoagulante de la chitine et ses dérivés ont apporté le plus.

La présente invention concerne également l'utilisation des polymères de chitine ou le chitosane dans des applications agricoles, alimentaires, cosmétiques, industrielles et/ou environnementales.

Les chitosans et ses dérivés ont des propriétés phytosanitaires et antifongiques. Ils sont capables de déclencher chez les plantes des mécanismes de défense contre les infections et les agressions parasitaires et ceci avec des doses extrêmement faibles, de l'ordre de quelques milligrammes par mètre cube d'eau. Ils peuvent être utilisés en solution, en poudre ou en enrobage de semences. Ainsi, aux USA, dans une région où les attaques fongiques sont importantes, les rendements de récolte supérieurs à 20% ont été obtenus lors d'essais avec des semences enrobées en comparaison avec des semences qui ne l'étaient pas. Le mode d'action du chitosane se situe d'ailleurs à plusieurs niveaux. Outre son action anti-fongique propre, il renforce le système racinaire et l'épaississement de la tige.

Certaines études montrent également que le chitosane stimule la synthèse d'agents protecteurs par la plante. Dans des domaines voisins, le chitosane se comporte comme un engrais en accélérant la germination et la croissance des plants.

Le chitosane est déjà un de nos aliments quotidiens. Nous l'absorbons à l'état naturel dans les coquillages, crustacés et champignons. C'est déjà un ingrédient alimentaire courant au Japon et en cours d'homologation en Europe où il a fait, en tant que pièges à lipides, une

percée importante en diététique. Le chitosane n'étant pas digéré par le corps humain, il se comporte comme une fibre, élément important dans un régime alimentaire. De plus, la chitine et le chitosane sont des anticholestémiants. Le chitosane est capable de piéger les lipides à leur pH d'insolubilisation dans le tube digestif. Ils les précipitent à leur arrivée dans l'intestin, diminuant de 20 à 30% le taux de cholestérol absorbé par le corps humain. Il est devenu le numéro 1 des produits amincissants naturels.

Un des intérêts majeurs du chitosane en matière alimentaire et son interactivité avec les protéines qui lui confère des propriétés moussantes. Ainsi un chitosane de faible viscosité rehausse de façon spectaculaire les propriétés de moussage des protéines, tels que le blanc d'oeuf ou le petit lait. Ce moussage se produit même lorsque des lipides sont présents. Comme le savent les cuisiniers, une faible quantité de jaune d'oeuf peut faire rater une meringue. Un chitosane de faible viscosité en empêchant cela, peut simplifier les processus de fabrication, augmenter considérablement les performances et le développement des produits alimentaires aérés contenant de faible quantité de matières grasses. Les crèmes desserts en sont l'exemple.

En solution, le chitosane devient un épaississant, un stabilisateur, deux qualités intéressantes pour une belle tenue des sauces, pour ne citer que cette application. C'est un agent dont le pouvoir floculant est utilisé pour la clarification des boissons, ou comme capteur de métaux lourds toxiques et autres tanins pour purifier l'eau. Enfin, de par ses propriétés phytosanitaires, il peut être pulvérisé sur la nourriture pour permettre la prolongation de leur fraîcheur. On peut également l'utiliser dans les films et les emballages moulés.

La chitine s'avère être un excellent produit de cosmétologie remarquablement bien toléré par la peau. La structure chimique de la chitine, polymère naturel, est très voisine de celles des mucopolysacharides (héparine, acide hyaluronique), dont la tolérance biologique est démontrée depuis longtemps. De plus, c'est un capteur efficace de métaux lourd, responsables d'un grand nombre d'allergies de contacts, ce qui le rend réellement intéressant vis-à-vis des peaux allergiques. La chitine est un agent hydratant particulièrement efficace.

Son avantage est double : elle apporte de l'eau et évite la déshydratation. De plus, le grand avantage de la chitine et de ses dérivés est la persistance de ce pouvoir hydratant dans le temps. Enfin le chitosane forme à la surface de la peau un film protecteur et tenseur, capable de fixer d'autres principes actifs pour la peau. Ainsi d'autres agents hydratants, filtres solaires, des acides organiques ou d'autres principes actifs peuvent être associés aux dérivés de chitine. La chitine favoriserait leurs effets. Cette capacité de la chitine et de ses dérivés à pouvoir mettre au contact intime de la peau des principes actifs grâce à un support qui est de plus, filmogène, tenseur et surtout hydratant est une dualité nouvelle qui donne au chitosane

un intérêt majeur en cosmétologie.

De fait, la chitine et le chitosane entrent aujourd'hui dans la composition de crèmes de soin, shampoings, laques, vernis,....

La chitine et ses dérivés présentent deux intérêts majeurs pour l'industrie et la protection de la nature. Ce sont des agents de chélation et des piégeurs de métaux lourds remarquables. Le chitosane est utilisé aussi bien comme support de chromatographie que le piégeage des métaux lourds et l'épuration des eaux usées. Utilisés comme agent de chélation, la chitine et ses dérivés servent au traitement des eaux potables en séparant les composés organiques et les métaux lourds et des eaux usées en précipitant certains déchets anioniques et en capturant des polluants comme le DDT et les PCB (polychlorobenzène).

De plus, le chitosane entre déjà dans la fabrication du papier car les molécules de chitosane ressemblent beaucoup aux molécules de cellulose, principal constituant des parois végétales. Il remplace les subtituants aminés comme la gomme gouar ainsi que les polysacharrides polysynthétiques. Il permet également d'économiser les additifs chimiques et augmente les rendements. Enfin, le papier produit avec l'apport de chitosane possède une surface plus lisse et résiste mieux à l'humidité. En outre, le chitosane est de grande valeur pour la production de papier sanitaire ainsi que pour le papier d'emballage et le carton.

Outre les qualités déjà mentionnées, ajoutons que les polymères de chitine et le chitosane présentent des qualités structurantes qui en font des agents de texture coagulants, floculants, gélifiants et filmogènes. De surcroît, ils peuvent fixer de nombreux radicaux différents et former ainsi des dérivés particuliers pour des applications ciblées.

La méthode décrite ci-dessus est illustrée à base d'un exemple concret de production de chitine à partir de biomasse fongique d'Aspergillus niger. Le matériel utilisé consiste en un résidu de mycélium d' Aspergillus niger récolté après fermentation pour une production d'acide citrique. L'analyse de ce matériel, par la méthode de Jeuniaux (1963), révèle 12.5% de chitine (exprimé par rapport au poids sec de mycélium).

A 200 g de résidu de mycélium d'Aspergillus niger, contenant 75 % d'eau, 800 ml d'une solution de NaOH 2% est ajoutée. Le mélange est agité doucement à température ambiante pendant 24 heures.

Le mélange est ensuite filtré et le matériel résiduel est lavé à l'eau afin d'éliminer les produits d'hydrolyse comportant principalement des pigments, protéines et glucans alkali- solubles. Les lavages à l'eau sont poursuivis jusqu'à ce que le matériel résiduel affiche un pH neutre. A ce stade, le matériel résiduel représente 45% du matériel de départ. Le contenu en chitine de ce matériel traité par la solution alcaline est de 30% (exprimé par rapport au poids sec de matériel).

Au matériel résiduel essoré par filtration, on ajoute 100 ml de tampon acétate sodique 100mM pH 5.4 dans lequel on a solubilisé au préalable 1.000 unités de Zymolyase 20 T (ICN Biomedicals) et ajouté de l'azide de sodium à une concentration finale de 0.01% afin de prévenir tout développement bactérien. Le mélange est agité doucement à 37 C pendant 5 jou rs.

Le mélange est ensuite centrifugé. Le matériel résiduel insoluble est lavé deux fois avec de l'eau et à chaque fois centrifugé. A ce stade, le matériel résiduel représente 21 % du matériel de départ (estimation basée sur le poids sec de matériel) et contient 84% de chitine.

Au matériel résiduel, on ajoute ensuite 100 ml d'une solution de NaOH 4%. Le mélange est placé au bain-marie à 60 C pendant 30 minutes. Le mélange est ensuite centrifugé et le surnageant contenant les produits alkali-solubles est éliminé.

Le matériel résiduel est lavé à l'eau jusqu'à obtention d'un pH neutre et les surnageants de lavage sont écartés par centrifugation. Le matériel résiduel représente 18% du matériel de départ (estimation basée sur le poids sec de matériel) et son contenu en chitine est de 94%.

En se basant sur cet exemple, le rendement d'extraction de chitine peut être estimé à 17% du poids sec du mycélium de départ.

Comme on le comprendra, l'exemple décrit ci-dessus n'est pas donnée à titre limitatif, car beaucoup de variations pourraient aisément être réalisé par une personne familière au sujet, sans toutefois s'éloignant des objectifs de l'invention, décris notamment par les revendications.

Claims

Revendications 1.Méthode de préparation de dérivés de la paroi cellulaire à partir de biomasse fongique ou de levure comprenant les étapes de - extraire de la biomasse à l'aide d'une première solution alcaline, par laquelle une fraction alkali-insoluble est obtenue; - réagir la fraction alkali-insoluble après acidification en présence d'une ss-1,3-glucanase, par laquelle une fraction alkali-insoluble non-hydrolysée est obtenue; réagir la fraction alkali-insoluble non-hydrolysée en présence d'une deuxième solution alkaline par laquelle des dérivés de la paroi cellulaire sont obtenus.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites dérivés de la paroi cellulaire sont des polymères de chitine.
3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que ladite première solution alcaline a une concentration de 1 à 2%.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la réaction en présence de la première solution alcaline est exécutée à une température ambiante.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite deuxième solution alcaline a une concentration de 2 à 4%.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que la réaction en présence d'une deuxième solution alcaline est exécutée à une température de 50-70 C.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ladite biomasse est soit choisie parmi le groupe comportant des espèces d' Aspergillium, Penicillium, Trichoderma, Saccharomyces, et/ou des mélanges.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce la chitine est obtenu à un rendement d'extraction de 80 à 100 %, de préférence de 90 à 100%. <Desc/Clms Page number 17>
9. Méthode de préparation de chitosane à partir de chitine obtenue selon l'une quelconque des revendications de 1 à 8 comprenant les étapes de hydrater la chitine à l'aide d'une solution alcaline, par laquelle la chitine devient partiellement déacétylée; réagir la fraction alkali-insoluble après acidification en présence d'une chitine déacétylase, par laquelle du chitosane est obtenu; précipiter le chitosane; et recycler la solution alcaline après concentration.
10. Méthode selon la revendication 9 caractérisée en ce que ladite solution alcaline a une concentration de 40 à 50 %.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 10 caractérisée en ce que la réaction en présence de la solution alcaline est exécutée à une température de 50 à 70 C.
12. Polymères de chitine ou du chitosane obtenus par la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Polymères de chitine ou du chitosane selon la revendication 12 pour l'emploi comme médicament.
14. Utilisation des polymères ou du chitosane selon la revendication 12 dans la préparation d'un médicament.
15. Composition pharmaceutique comprenant des polymères de chitine ou du chitosane dérivés selon la revendication 12 et un agglomérant approprié.
16. Utilisation des polymères de chitine ou du chitosane selon la revendication 12 dans des applications biomédicales, agricoles, alimentaires, cosmétiques, industrielles et/ou environnementales.