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Description DERIVES CHIMIOLUMINESCENTS HETEROCYCLIOUES.
Objet de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés chimioluminescents d'acridinium ainsi qu'un conjugué comprenant un de ces dérivés, lié à un composant biologique spécifique.
Un autre aspect de l'invention concerne la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant ce conjugué ou un de ces dérivés, et l'utilisation du conjugué ou d'un de ces dérivés chimioluminescents pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention.
La chimioluminescence est une formation de lumière obtenue par une réation chimique. Le mécanisme général de cette réaction a été notamment décrit par
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Schuster et al (Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)) par la réaction suivante : A- B*-B + hv
Le composé A, par une réaction chimique, physique ou biochimique (le plus souvent par une oxydation avec un peroxyde) donne un produit à un état excité ("B*") qui revient à l'état fondamental par l'émission de lumière (hv).
Ce procédé de chimioluminescence est largement utilisé en chimie analytique et en biologie clinique, notamment pour les immunodosages (chemoluminescence immuno
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assay ou"CLIA").
Les demandes de brevet EP-A-273115, EP-A-257541 et EP-A-263657 décrivent des composés chimioluminescents hétérocycliques dérivés d'acridinium, de phénantridiniumn de quinolénium et d'isoquinolénium et leurs isomères, eventuellement conjugués à des antigènes, des anticorps ou des acides nucléiques pour être utilisés dans des tests de chimioluminescence.
Le pouvoir chimioluminescent de ces dérivés est calculé par l'émission de lumière engendrée au contact de l'eau oxygénée en milieu alcalin. Des études réalisées par F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9,6, p. 201-209) ont permis d'établir un mécanisme de chimioluminescence des composés d'acridinium. Il postule
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la formation d'un intermédiaire réactionnel excité (dioxétane) qui se décompose en CO, et en méthylacridone. Il implique également le déplacement par HO, dun groupement partant Y. Ce déplacement serait, selon la théorie généralement admise, possible pour des dérivés présentant un groupement Y possédant un pKa inférieur à celui de l'eau oxygénée (pKa < 12).
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La demande de brevet W095/l9976 décrit des dérivés hétérocycliques d'acridinium, de phénantridinium, de quinoléinium et d'isoquinolénium ainsi que leurs isomères et dérivés quelconques obtenus par substitution, améliorés, en particulier des dérivés stables et/ou présentant une chimioluminescence élevée, notamment lorsque la valeur du pKa du groupement partant est élevée, de préférence lorsque le pKa est supérieur à 12.
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Buts de l'invention.
La présente invention a pour but d'obtenir des dérivés d'acridinium apparentés chimiquement à ceux décrits dans la demande de brevet W095/19976 précitée, de synthèse aisée, qui offrent en outre de nombreuses possibilités d'adaptation comportant notamment une série de modifications chimiques telles que le greffage d'un bras (spacer), le but étant entre autres d'orienter le couplage
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vers des fonctions habituellement peu accessibles lors du marquage de protéines telles que les groupements phénols et thiols.
La présente invention a également pour but d'obtenir des dérivés chimioluminescents caractérisés par une courbe dose-réponse permettant leur utilisation dans le dosage et/ou le diagnostic sur une large plage de concentration.
Un dernier but de la présente invention est d'obtenir une trousse de diagnostic comprenant ledit dérivé chimioluminescent actif et/ou stable.
Elements caractéristiques de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés d'acridinium chimioluminescents de formule :
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dans laquelle R1 à Ru sont des substituants n'empêchant pas l'expression de la chimioluminescence, étant entendu que l'un au moins des substi tuants R12 et R comporte, comme élément unique ou comme élément de liaison au dérivé d'acridinium, un atome autre que la carbone.
De préférence, dans les dérivés chimioluminescents selon l'invention, A est un ion complémentaire choisi parmi les ions halogéno, nitrate, sulfate, iodomercurate, trifluorométhanesulfonate, tartrate et phtalate, R1 à Ru sont 1'hydrogène ou des radicaux de
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type Ru ou B-R14 où B représente un groupe ou un atome de liaison et R14 représente un radical hydrocarboné pouvant contenir un ou plusieurs hétéroatomes, Ru et Ru sont des substituants identiques ou différents dont la fonction porte sur la chimioluminescence et sur le couplage,
l'un des substi tuants R12 et R13 comportant comme élément unique un atome d'halogène ou comportant comme élément de liaison au dérivé d'acridinium un atome choisi parmi les azotides et les chalcogènes, tandis que l'autre des substituants R12 et R13 est semblable aux substi tuants R1 à Ru, à l'exception de l'hydrogène.
De préférence, dans les dérivés chimioluminescents selon l'invention, B représente dans la formule B-R, un groupe - (CH2) n - où n représente un nombre entier de 1 à 5, B représente également un groupe contenant un azotide ou représente un chalcogène, de préférence un groupe azoté ou l'oxygène deux fois liés, R14 étant tel que défini précédemment. Et plus particulièrement, R14 est un radical choisi parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylkyle éventuellement substitués.
Plus particulièrement encore, dans ces dérivés chimiol uminescents, R1 et Ru sont l'hydrogène, l'un des substi tuants R12 et R13 est un substituant choisi parmi les halogènes et les groupes B-R14, l'autre des substituants R12 et Ri étant semblable à B-R ou à Ru, B et Ru étant tels que définis précédemment.
Selon une forme d'exécution préférée, de l'invention, les dérivés chimioluminescents sont les composés ; [1-éthoxy-1-(4-carboxyphényl)-1-iminométhane]-10méthylacridinium-9-carboxylate ou [1-éthoxy-1-[4-(2-bromoéthoxy)-phényl]-1iminométhane)-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
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(l-chloro-l-phényl-l-iminométhane)-lO- méthylacridinium-9-carboxylate ou
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[l-benzyloxy-l- (4-carboxyphényl)-l-iminométhane]- lO-méthylacridinium-9-carboxylate ou [1-chloro-l- (3-cyanophényl)-1-iminométhane]-10méthylacridinium-9-carboxylate ou [1-chloro-l- (2,4, 5,-trifluorophényl)-l- iminométhane]-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
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(l-chloro-l-perfluorophényl-l-iminométhane)-lOméthylacridinium-9-carboxylate.
Ces dérivés sont désignés par les références OX1 à OX, respectivement et leurs formules de structure sont reprises au tableau 1 qui suit.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1 <SEP> : <SEP> dérivés <SEP> de
<tb> type <SEP> OX <SEP> synthétisés <SEP> Dérivé <SEP> R12 <SEP> R13
<tb> # <SEP> OX1 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> CH3
<tb> OX2 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> CH3
<tb> OX3 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX4 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> I <SEP> 1
<tb> # <SEP> #
<tb> OX5 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX6 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX7 <SEP> #
<tb> CI
<tb> F
<tb>
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Un autre aspect de l'invention concerne le conjugué comprenant un dérivé chimioluminescent selon l'invention lié à un composant biologique spécifique.
On entend par"composé biologique spécifique", toute molécule biologique (lipide, saccharide, protéine, peptide, acide nucléique,...) ou ensemble de molécules biologiques, spécifiques d'une espèce (virale, bactérienne, végétale, animale ou autre), d'un individu, d'une pathologie (telle que le cancer ou causée par un agent viral, bactérien ou autre), d'une activité ou d'un système biochimique (telle qu'une réaction enzymatique,...).
Ledit composant biologique est susceptible d'être détecté et/ou dosé, ou susceptible de servir au dosage et/ou à la détection d'un composant biologique spécifique.
De préférence, ce composé biologique spécifique est choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptènes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
La présente invention concerne également la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugué ou un des dérivés chimioluminescents selon l'invention et l'utilisation du conjugué et/ou d'un dérivé chimioluminescent selon l'invention pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique.
Brève description des Figures.
La figure 1 représente un schéma général de préparation des dérivés OX.
La figure 2 représente le schéma de synthèse du dérivé OX7.
La figure 3 illustre la cinétique des Ac (anticorps) marqués par OX3, OX5, OX6 et OX7.
Les figures 4 à 6 illustrent la stabilité des Ac marqués par OX6, OX7 et OX5 respectivement.
Dans les figures 3 à 6, le signal est exprimé par le rapport entre l'intensité (en RLU) mesurée au temps t et l'intensité (en RLU) mesurée au temps t=0.
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La figure 7 représente l'évolution de la concentration en produit OX7 en fonction du temps dans un tampon à pH 8.
La figure 8 représente un exemple de dosage de TSH avec Ac marqué par OX7.
La figure 9 représente le spectre infrarouge du pentafluorobenzaldéhyde.
La figure 10 représente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime.
La figure 11 représente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime chlorée.
La figure 12 représente le spectre infrarouge du produit de couplage de la pentafluorobenzaldoxime chlorée avec le chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique, étant le 9-acridine carboxylate de 1-chloro-1-perfluorophényl-1- iminométhane.
Les figures 13 à 15 représentent les spectres infrarouge des marqueurs OX7, OX5 et OX6.
Les figures 16 à 18 représentent les spectres de masse des marqueurs OX5, OX6 et OX7.
Les composés OX dont les formules sont reprise au tableau 1, ont tous été préparés en suivant le schéma général de préparation décrit dans la figure 1. Leurs synthèses ont nécessité la synthèse de l'aldéhyde de départ (II) lorsque celui-ci n'était pas directement disponible.
La première étape consiste à former l'oxime (III) par réaction entre l'aldéhyde (II) et de l'hydroxylamine.
La réaction est réalisée dans un tampon à pH 4,5-5.
La chloroxime (IV) est préparée par barbotage de chlore dans une solution d'oxime.
Les chloro-dérivés ont été obtenus directement par couplage de la chloroxime au noyau acridine. Les 3 autres dérivés ont été préalablement traités par un équivalent d'alcoolate sodique avant l'étape de couplage au noyau acridine. L'alcoolate est préparé à partir de sodium et de l'alcool correspondant.
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Les composés IV ou IVb sont couplés au chlorure d'acide carboxylique dans un solvant organique additionné de NET3.
Les produits V ou Vb sont méthylés par le couple de réactifs CH3I/HgCI2 ou le triflate de méthyle.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : MODES OPERATOIRES COMMUNS A CERTAINS DERIVES (FIG. 1).
1. Synthèse de l'aldéhyde II (pour les dérivés
OX6 et OX7).
Les aldéhydes employés dans la synthèse des dérivés OX6 et OX7 ont été réalisés par réduction des chlorures d'acides correspondants (chlorure d'acide 2,4, 5trifluorobenzoïque ou 2,3, 4,5, 6-pentafluorobenzoïque). Le protocole utilisé est le suivant : un équivalent de chlorure d'acide est mis en présence d'l, l équivalents de Bu3SnH dans du THF. Après réaction, le THF est évaporé sous vide et le résidu traité par de l'eau. Ce dernier est ensuite extrait par de l'éther de pétrole (Eb 400 C) puis passé sur charbon. L'aldéhyde est obtenu par évaporation sous vide.
2. Formation de l'oxime III (pour tous les dérivés).
Un équivalent d'aldéhyde dissous dans le l'éthanol est additionné d'eau et de cinq équivalents de chlorhydrate d'hydroxylamine. Le pH est ajusté à une valeur de 5 par ajout de Na OH à 5 %. Le solvant organique est évaporé et l'oxime formée est extraite au toluène. La solution organique est séchée sur NaSO et passée sur charbon. ELle est ensuite concentrée sous vide et additionnée de pétroléine 400 C. Le refroidissement de la solution à -200 C provoque la cristallisation de l'oxime.
3. Transformation en chloroxime IV (pour tous les dérivés).
La chloroxime est préparée par barbotage de chlore dans une solution d'oxime dans un mélange CHCI3/dioxane préalablement refroidi à 00 C. La réaction est complète et la chloroxime (III) est directement obtenue par évaporation des solvants suivie, lorsque la chloroxime
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est solide à température ambiante, d'une recristallisation par ajout de pétroléine 400 C. (la chloroxime des dérivés OX6 et OX7 est liquide).
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4. Etape de réaction avec un alcoolate (pour dérivés OXI, OX2 et OX4).
Obtention du produit IVb.
L'alcoolate est préparé par réaction entre un équivalent de sodium et d'un équivalent d'alcool (éthanol ou phénol). La réaction est effectuée dans l'alcool lorsque c'est possible (éthanol) ou dans l'acétone (phénol).
Un équivalent de chloroxime dissous dans l'acétone est directement mis en réaction avec un équivalent d'alcoolate. Le pH du milieu est ajusté à 4,5 par ajout de HCI concentré et le précipité formé (NaCI) est éliminé par filtration ou par centrifugation. La solution est additionnée d'eau. L'évaporation des solvants organiques provoque la cristallisation du produit.
5. Couplage à l'acridine (pour tous les dérivés).
Obtention du produit VIb.
L'acide acridine carboxylique est transformé en chlorure d'acide dans du chlorure de thionyle porté à reflux. Après transformation complète de l'acide, le chlorure de thionyle est évaporé sous vide.
Un équivalent des composés préparés aux étapes 3
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(OX3, OX5, OX6 et OX7) ou 4 (OX1, OX2 et OX4) sont couplés avec un équivalent de chlorure d'acide acridine carboxylique dans du THF additionné d'un excès de pyridine.
Le THF est évaporé sous vide et le résidu repris dans du toluène. On lave la phase toluénique à l'eau puis on la sèche sur du sulfate sodique anhydre. Le produit formé est soit cristallisé par ajout d'éther de pétrole (Eb 400 C) à la solution (OX1, OX2, OX3, OX4 et OX5) ou chromatographié sur une colonne de silice en utilisant une phase toluène /acétate d'éthyle/acide acétique en propotions 2/1/0, 01 (OX6 et OX7). Les fractions correspondant au premier produit qui sort de la colonne sont récupérées et
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concentrées sous vide. L'addition d'éther de pétrole (Eb 400 C) provoque la cristallisation du produit.
6. Méthylation des composés (pour tous les dérivés).
Les produits obtenus à l'étape 5 sont méthylés par le couple de réactifs CH3I/HgCI2. La réaction est réalisée sur un mélange intime de 50 mg de produit avec 50 mg de HgCl2 additionné de 1 ml de CH3I. Elle se déroule dans une bombe portée à 1100 C durant 2h30. Après réaction, la bombe est réfrigérée à -200 C. Après refroidissement et décantation du contenu de la bombe, le surnageant est éliminé et les cristaux de produit méthylé sont lavés successivement par du CH31 puis par de l'éther diéthylique. Le produit méthylé peut éventuellement être recristallisé dans un mélange acétone/éther diéthylique.
EXEMPLE 2 : SYNTHESE DE LA SONDE OX7 (FIG. 2) OU
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(l-CHLORO-l-PERFLUOROPHENYL-l-IMINOMETHANE)-lOMETHYLACRIDINIUM-9-CARBOXYLATE.
1. Préparation de la pentafluorobenzaldoxime (I).
20 g de pentafluorobenzaldéhyde sont mis en solution dans 400 ml d'éthanol. D'autre part, 25 g de chlorhydrate d'hydroxylamine sont solubilisés dans 200 ml d'eau. La solution aqueuse est ajoutée à la solution alcoolique et le pH de la solution résultante est amené à 5 par addition de NaOH 2N. Après transformation complète (CCM), on cristallise l'oxime par évaporation de l'éthanol de la solution. Le produit est isolé par filtration et lavé abondamment à l'eau. 17,8 g de pentafluorobenzaldoxime sont récupérés après séchage du précipité (rendement 82 %).
2. Préparation de la chloropentafluorobenzaldoxime (II).
1 g de pentafluorobenzaldoxime est mis en solution dans 15 ml d'un mélange dioxanne-chloroforme (1 : 1). Cette solution est refroidie à 00 C et saturée par du chlore. Après 90 minutes de réaction, la transformation est complète (CCM). Les solvants et l'excès de chlore sont éliminés sous pression réduite et le résidu est utilisé tel quel dans l'étape suivante.
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3. Couplage de la chloropentafluorobenzaldoxime (II) au chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique (III).
1,05 g d'acide 9-acridine carboxylique est transformé en chlorure d'acide par traitement au chlorure de thionyle (10 ml) contenant une trace de N, Ndiméthylformamide pendant 90 minutes à 850 C. L'excès de chlorure de thionyle est éliminé sous dépression. Le chlorure d'acide (III) obtenu sous forme de chlorhydrate est mis en suspension dans 20 ml de tetrahydrofurane et neutralisé par 5 équivalents (2400 Ml) de triéthylamine.
Le produit obtenu à l'étape précédente est dilué dans 10 ml de tétrahydrofurane et additionné à la solution de chlorure d'acide. Après 30 minutes de réaction, le solvant est éliminé sous dépression et le résidu est solubilisé dans un minimum de chloroforme. La phase organique est lavée trois fois par 40 ml d'eau, décantée et séchée sur sulfate sodique anydre. Le solvant est éliminé au rotavapor et le résidu est dilué par un minimum de toluène et abandonné à la cristallisation à 00 C pendant une nuit. Le produit est filtré, lavé par du toluène froid puis par de l'éther de pétrole. Il est ensuite séché sous vide en présence d'un desséchant. 1,8 g de produit (IV) sont récupérés après séchage (rendement 85 %).
4. N-méthylation du produit (IV) et obtention du traceur chimioluminescent OX7 (V).
50 mg du produit (IV) sont mis en solution dans 2 ml de dichlorométhane anhydre et traités par 800 Ml d'une solution à 10% de trifluorométhanesulfonate de méthyle dans le dichlorométhane. Après 4h de réaction, le produit désiré est précipité par addition modérée d'éther dans le milieu réactionnel. Le traceur est isolé par filtration et lavé successivement par de l'éther diéthylique puis par de l'éther de pétrole. 50 mg de produit (V) sont récupérés (rendement 73%).
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Points de Fusion et données chromatographiques.
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<tb>
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Composé <SEP> NO <SEP> Point <SEP> de <SEP> fusion <SEP> ( C) <SEP> Rf <SEP> CCM <SEP> Rf <SEP> CCM <SEP> SIL
<tb> SIL <SEP> G/UVRPISW/UV
<tb> 1 <SEP> 131 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 70
<tb> IV <SEP> 206-207 <SEP> 0,77 <SEP> 0,31
<tb> V <SEP> 210-213 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb>
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Phases Mobiles CCM SIL GfUV254 : toluène/acétate d'éthyle/acide acétique (2 :
1 : 0, 04).
CCM DIL RP18WfUV254 : acétonitrile/tampon phosphate 0,1 M pH=3 (60 : 40 heptanesulfonate sodique : 0,1 %).
EXEMPLE 3 : ESSAIS EXPERIMENTTAUX SUR LES SONDES OX.
1. Rendement de chimioluminescence
Le rendement de chimioluminescence des dérivés OX ne peut pas être déterminé lorsque les molécules sont à l'état libre. Il est mesuré après couplage de ces produits à une protéine. A titre d'exemple, pour les dérivés OX5,
OX6 et OX7, le taux d'incorporation sur la protéine est mesuré par une méthode fluorescente.
Pour OX7, on peut aussi quantifier la fluorescence émise par un dérivé de dégradation : l'acridone. Le rendement quantique de la molécule de OX7 conjuguée à un anticorps anti-hCG a été évalué à 1, 1019 RLU/mole.
2. Cinétique d'émission
Toutes les cinétiques d'émission enregistrées avec des dérivés OX sont très rapides. Plus de 95 % du signal est émis dans la seconde suivant l'injection du réactif déclenchant la réaction chimioluminescente. Même couplés, les dérivés de chloroximes conservent cette cinétique particulièrement rapide. A titre d'exemple, la figure 3 reprend les cinétiques observées sur des anticorps (Ac) marqués par les chloro-dérivés.
3. Etude de stabilité
De tous les oximes synthétisés, les chloroximes apparaissent de loin les plus stables en présence de
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protéines. Des mesures réalisées par spectrométrie de masse sur OX7 ne montrent aucune variation significative du spectre de la molécule après une incubation de 45 minutes dans un mélange acétonitrile/eau (proportions 50/50).
Cette stabilité chimique permet d'envisager le couplage de la sonde aux protéines via la fonction halogénée de la molécule. Toutes les mesures de stabilité effectuées montrent que les oximes OX5, OX6 et OX7 augmentent fortement leur stabilité en milieu aqueux après couplage aux protéines. Les premiers résultats d'une étude de stabilité sur des anticorps marqués par ces sondes sont donnés dans les figures 4,5 et 6. Cette étude est réalisée à 25 C dans des tampons (0,1 M phosphate, 0, 15 M NaCl, 0,1 % NaN3, 0,1 % BSA) à pH 5,6 et 7.
Dans les conditions expérimentales décrités ciaprès, les premiers résultats montrent que la stabilité des traceurs diminue avec la basicité du milieu, ce qui est lié à la nature des sondes. Ils montrent également que le traceur OX5 est nettement moins stable que les traceurs OX6 et OX7. Les cassures observées entre t=470 et t=560 heures sur les courbes des figures 4 et 5 à pH 5 et 6 permettent difficilement de conclure sur la stabilité exacte des traceurs OX6 et OX7 à pH 5 et 6. Toutefois, le traceur OX7 apparaît comme étant le plus stable des trois, et ce plus particulièrement a pH 5. Cette importante stabilité à pH 5 permet d'envisager une longue conservation du traceur à 40 C. D'un autre côté, la stabilité de celui-ci à pH 7 permet d'envisager tous les immunodosages possible à ce pH.
La stabilité de la sonde OX7 est très sensible au pH. En milieu acide (pH 5) la stabilité du composé est nettement plus élevée qu'en milieu basique (pH 8). Lorsque la sonde est fixée à une protéine, sa stabilité augmente fortement et ce quelque soit le pH testé.
3.1 STABILITE DE LA SONDE OX7 NON COUPLEE A PH 8.
La stabilité de la sonde libre a été testée à 250 C dans un milieu identique à celui employé dans les
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réactions de marquage (pH du milieu : 8). La dégradation du produit a été suivie par analyse HPLC en utilisant comme support chromatographique une colonne (4x125 mm) des Lichrosphères RP-18 (5 Mm) et comme phase mobile un mélange acétonitrile/eau additionné d'acide décane sulfonique, d'hydroxyde de tétraméthyle ammonium et d'acide trifluoroacétique (pH final : 2,5).
La figure 7 présente l'évolution de la concentration en produit OX7 en fonction du temps dans un tampon à pH 8.
L'ajustement paramétrique des données présentées par une fonction de type : Y = A* exp (-B*X) + C a conduit aux résultats suivants :
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<tb>
<tb> Paramètre <SEP> Valeur <SEP> Approx. <SEP> SE <SEP> 95% <SEP> intervalle <SEP> de <SEP> coif <SEP> iarceA <SEP> 633 <SEP> constant
<tb> B <SEP> 0,0415 <SEP> 1,96 <SEP> E-03 <SEP> 0,036 <SEP> à <SEP> 0,046
<tb> C <SEP> 0 <SEP> constant
<tb>
R2=0,992 ; Sy. x= 18,42 @
Le temps de demi-vie de la sonde libre obtenu en utilisant l'ajustement paramétrique est de 17 minutes.
3.2 STABILITE DE LA SONDE OX7 COUPLEE A UN ANTICORPS.
La stabilité de la sonde OX7 couplée à un anticorps a été testée à pH 5,6 et 7. Elle a été évaluée par mesure de l'activité chimioluminescente d'échantillons de protéine marquée vieillis dans des tampons phosphate/NaCl additionnés de protéines. L'ajustement paramétrique des données recueillies à pH 6 et 7 conduit à des temps de demi-vie de l'ordre de 600 et 375 heures. Par contre à pH 5, le temps de demi-vie est nettement plus important (les faibles variations de signal enregistrées sur une période d'environ 2 mois ne permettent pas un ajustement paramétrique valable).
4.1 MARQUAGE D'ANTICORPS ANTI-TSH PAR LA SONDE OX7
25 ig d'anticorps en solution dans 100 J. de tampon de marquage (solution 0, 1 M phosphate de sodium, 0,15 M NaCl ajustée à pH 8,0) sont additionnés de 10 pl
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d'une solution de OX7-méthyltriflate dans l'acétonitrile (solution 0,5 mg/ml). Après homogénéisation, le mélange réactionnel est incubé durant 15 minutes à température ambiante. L'excès de sonde OX7 est neutralisé par ajout de 100 Ml d'une solution de lysine dans le tampon de marquage (solution 1,5 mg/ml). Après une nouvelle incubation de 5 minutes à température ambiante, le milieu est chromatographié sur une colonne (50x1 cm) de séphadex G25.
La colonne chromatographique est équilibrée et éluée avec un tampon 0,1 M phosphate, 0,15 M NaCl. 0,1 % NaN3 contenant de la BSA (lg/1) et ajusté à p 5,0. Les fractions chromatographiques sont lues par mesure de chimioluminescence. Les fractions correspondant au pic
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d'anticorps sont rassemblées et conservés dans le tampon de purification à une température de 4 C.
4.2 DOSAGE DE TSH AVEC LES ANTICORPS MARQUES PAR OX7.
Un dosage non optimisé de la TSH a été réalisé en suivant un protocole identique à un dosage IRMA commercial avec des anticorps anti-TSH marqués par la sonde OX7. Le protocole utilisé comporte les étapes suivantes : 'préparation du traceur par dilution du pic d'anticorps marqués dans un tampon traceur à pH 7,0 (dilution 50x) ; 'remplissage des différents tubes coatés avec 200 gl de
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standards (0, 0, 15, 0, 5, 1. 5, 4, 15, 50 et 85 Ml/ml) ; 'agitation durant 2h à température ambiante ; . aspiration du contenu de chaque tube ; 'rinçage des tubes avec un tampon de lavage (opération réalisée 2 fois) et élimination de la phase liquide par aspiration ; 'lecture de la chimioluminescence des différents tubes.
La courbe de calibration obtenue (Fig. 8) montre que des anticorps marqués par la sonde OX7 peuvent parfaitement convenir comme traceur chimioluminescent dans le cadre d'un dosage nécessitant une grande sensibilité.